-
BEZUGNEHMEND AUF DIE VORLIEGENDE
ANMELDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie. Im Besonderen
wird ein Verfahren bereitgestellt. Dieses Verfahren beinhaltet die
Verwendung von Methoden und Abläufen
sowie eines Reagenzkits für die
schnelle Typisierung von Mikroorganismen. Die zu typisierenden Mikroorganismen
können
sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien sein. Die
Typisierung der Mikroorganismen erfolgt durch Pulsfeld-Minigelelektrophorese,
die in Miniapparaturen des CHEF- oder des TAFE-Systems durchgeführt werden.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Im
Verlauf der letzten Jahre haben Infektionserkrankungen zugenommen
und sind mehrfach-arzneimittelresistente Mikroorganismen aufgetreten
(Acar J. und Courvalein P., S. 50–53; Aubry-Damon H. und Andremot
A., S. 54–55;
Trieu-Cout P. und Poyart C., S. 62–66, in "La Recherche", Bd. 314, 1998).
-
Ausbrüche von
Infektionserkrankungen riefen das Bedürfnis nach der Typisierung
der ursächlichen
Mikroorganismen hervor. Typisierung ist das Verfahren, durch das
verschiedene Spezies von Mikroorganismen einer bestimmten Gattung
in verschiedene Untergruppen oder Subtypen klassifiziert werden
(Busch U. und Nitschko H., J. Chromatogr. B. 1999, 722: 263–278). Typisierung
ist aus epidemiologischem Blickwinkel wichtig für das Erkennen von Infektionsausbrüchen, für das Bestimmen
des Übertragungsweges
von nosocomialen Pathogenen in Gesundheitszentren und für das Nachweisen
von Infektionsherden. Es ist darüber
hinaus hilfreich zum Identifizieren neuer virulenter Stämme und
zum Überwachen
von Vakzinierungsprogrammen. Ein Typisierungsverfahren wird als
geeignet erachtet, wenn es die folgenden Kriterien erfüllt (Maslow
J.N. et al., Clin. Infect. Dis. 1993, 17: 153–164):
- 1.
Liefern von eindeutigen Ergebnissen für jedes analysierte Isolat.
- 2. Liefern von reproduzierbaren Ergebnissen.
- 3. Ermöglichen
der Differenzierung nicht-verwandter Stämme innerhalb einer Spezies
-
Es
existieren mehrere Verfahren zum Typisieren von Mikroorganismen.
Einige davon basieren auf der Analyse von phänotypischen Eigenschaften (phänotypische
Verfahren) und andere auf der Analyse genotypischer Eigenschaften
(genotypische Verfahren). Phänotypische
Verfahren weisen von den Mikroorganismen exprimierte Merkmale nach,
während
genotypische Unterschiede in der DNA der Mikroorganismen nachweisen.
Folglich haben phänotypische
Verfahren den Nachteil, dass sie eine indirekte Messung von Veränderungen
im genetischen Hintergrund widerspiegeln. Dieser Nachteil tritt
bei Verwendung von genotypischen Verfahren nicht auf.
-
Eines
der am weitesten verbreiteten Typisierungsverfahren ist die Pulsfeld-Gelelektrophorese
(PFGE). Dieses Verfahren gilt als der Goldstandard für die molekulare
Typisierung von Mikroorganismen. PFGE-Typisierung wird ausgeführt, indem
DNA-Moleküle,
die elektrischen Pulsen ausgesetzt werden, in Gelen in zwei unterschiedliche
Richtungen aufgetrennt werden. Nach der Elektrophorese sind die
Bandenmuster, die durch DNA-Moleküle eines isolierten Mikroorganismus
entstehen, gut reproduzier- und unterscheidbar und charakterisieren
seine DNA eindeutig (Oliver D.M. und Bean P., J. Clin, Microbiol.
1999, 37(6): 1661–1669). Darüber hinaus
können
die gesamten Genome zahlreicher Isolate in einem einzigen Gel miteinander
verglichen werden. Folglich wurde PFGE als das optimale Typisierungsverfahren
vorgeschlagen (Maslow J.N., Mulligan M.E. und Arbeit R.D., Clin.
Infect. Dis. 1993 (171: 153–164;
Busch U. und Nitschko H., J. Chromatogr. B., 1999 (722): 263–278). Die
Ergebnisse, die durch PFGE erzielt wurden, hängen von den experimentellen Bedingungen
ab, die auf die DNA-Trennung angewandt werden, sowie von der Gattung
und der Spezies des untersuchten Mikroorganismus. Demnach:
- a) Wenn der Mikroorganismus mehrere lineare
Chromosomen mit Größen von
weniger als 10 Mb (1 Megabase = 1000000 Basenpaare) aufweist, wird
das durch seine Chromosomen vorgegebene Bandenmuster erhalten. Dieses
Bandenmuster wird als der "elektrophoretische
Karyotyp" bezeichnet.
Die Mikroorganismen können
zum Beispiel Hefe, einzellige Parasiten und dergleichen sein.
- b) Wenn der Mikroorganismus ein einzelnes, großes zirkuläres Chromosom
besitzt, wird das Bandenmuster erhalten, das durch die Makrorestriktionsfragmente
der genannten zirkulären
DNA vorgegeben ist. Diese Muster werden Pulstypen genannt, da sie
unter bestimmten experimentellen Bedingungen erzielt werden. Entsprechende
Mikroorganismen können
Bakterien sein, wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, usw.
-
Der
Vergleich der elektrophoretischen Karyotypen verschiedener Stämme erlaubt
ihre Charakterisierung und Differenzierung. Entsprechendes ist mit
Restriktionsfragmenten der bakteriellen DNA möglich. Folglich werden sowohl
molekulare Karyotypen als auch Pulstypen in vergleichenden Studien
von Pilzen, Bakterien und Parasiten verwendet. Die routinemäßige Verwendung
von PFGE in der medizinischen Mikrobiologie hat das Bedürfnis nach
Verbesserung der Verfahren zur Probenaufbereitung hervorgerufen.
-
Es
ließ ebenso
das Bedürfnis
nach a priori entworfenen Laufbedingungen entstehen, um die Moleküle angemessen
aufzutrennen und die daraus resultierenden Elektrophoresemuster
zu analysieren.
-
Grundsätzlich umfasst
das Verfahren der Typisierung von Mikroorganismen durch PFGE die
folgenden Schritte und Abläufe:
- 1) Aufbereiten der Proben: Kultur der Mikroorganismen
in Nährbouillon,
Einbetten der Zellen in Gele und Erhalten immobilisierter und deproteinisierter
intakter DNA-Moleküle.
- 2) Gestaltung des Elektrophoreselaufs: Auswählen der experimentellen Bedingungen,
die an die PFGE-Ausrüstung
angelegt werden sollen, um die optimale Auftrennung zwischen den
Molekülen
zu erhalten.
- 3) Laden der Proben in die Gele und Durchführung der Pulsfeld-Gelelektrophorese,
um die DNA-Moleküle aufzutrennen.
- 4) Analysieren der Bandenmuster, die nach der Elektrophorese
erhalten werden, und Vergleichen der Ergebnisse, die durch verschiedene
Isolate von Mikroorganismen erzielt werden. Im Folgenden werden
Apparaturen und Abläufe
analysiert, die derzeit bei der Typisierung von Mikroorganismen
durch PFGE verwendet werden.
-
Pulsfeld-Gelelktrophorese
-
Pulsfeld-Gelelektrophorese
(PFGE) geht zurück
auf das Jahr 1984, als Schwartz und Cantor (Cell, 37, 67–75, 1984;
US-Patent Nr. 4,473,452) beobachteten, dass beim Anlegen elektrischer
Pulse, welche in einem bestimmten Winkel im Verhältnis zum Agarosegel periodisch
ihre Orientierung änderten,
große
intakte DNA-Moleküle
als Bandenmuster aufgelöst
wurden.
-
Die
Autoren ermittelten ferner, dass die Auftrennung der Moleküle im Wesentlichen
von der Dauer der elektrischen Pulse abhing. Später wurden der Winkel, der
durch die Kraftfeldlinien gebildet wurde, die elektrische Feldstärke, die
experimentelle Temperatur, die Ionenstärke der Pufferlösung, die
Konzentration des Agarosegels und Dicke der Agaroseblöckchen,
in die die Proben eingebettet wurden, als die wichtigsten Faktoren bestimmt,
die die Auflösung
der DNA-Moleküle
beeinflusste (Birren B. und Lai E., Pulsed Field Gel Electrophoresis:
a practical guide. Academic Press. New York, 1993, S. 107, 111,
129, 131, 135; López-Cánovas
L. et al., J. of Chromatogr. A, 1998, 806, 123–139; López-Cánovas L. et al., J. of Chromatogr.
A, 1998, 806, 187–197).
-
Es
wurden unterschiedliche Systeme zur Durchführung der PFGE entwickelt.
Sie weisen charakteristische Kammern mit Elektroden auf, welche
in unterschiedlichen Arrangements angeordnet sind. Unter diesen Kammern befinden
sich die OFAGE-(Orthogonal Field Alternating Gel Electrophoresis,
Carle C.F. und Olson M.V., Nucleic Acids Res. 1984, 12, 5647–5664),
CHEF-("Contour Clamped Homogeneous
Electric Field",
Chu G., Science 234, 1986, 1582–1585),
TAFE-("Transversal
Alternating Field Electrophoresis", US-Patent Nr. 4,740,283), FIGE-("Field Inversion Gel
Electrophoresis",
US-Patent Nr. 4,737,251 von Carle G.F. und Olson M.V.) Anordnungen
von Elektroden sowie die Minikammern MiniTAFE und MiniCHEF (Riverón, A.M.
et al., Anal. Lett. 1995, 28, 1973–1991; europäische Patentanmeldung
EP 0 745 844 , Amtsbl. 1996/49;
US-Patentanmeldung 08/688,607, 1995, kubanisches Patent RPI Nr.
02/95, 1995).
-
Häufig verwendete Systeme zum
Typisieren von Mikroorganismen durch PFGE
-
Die
am häufigsten
verwendeten Systeme zum Typisieren von Mikroorganismen basierend
auf DNA-Analyse durch PFGE sind CHEF und TAFE. Sie stellen gleichmäßige Bandenmuster
in jeder Spur des Gels bereit und erlauben folglich den Vergleich
von Ergebnissen, die in einem einzigen Lauf oder in verschiedenen
Elektrophoreseläufen
erzielt wurden.
-
Die
Elektroden des CHEF-Systems werden in hexagonaler Anordnung rund
um das Gel angebracht und die Spannungen angelegt, um ein homogenes
elektrisches Feld innerhalb des gesamten Gels zu gewährleisten.
Die Erzeugung des homogenen elektrischen Feldes innerhalb der Kammer
erlaubt den Erhalt gleichmäßiger Banden
und reproduzierbarer Migrationen in den Gelspuren. Die entgegengesetzt
gepolten Elektroden sind in den CHEF-Kammern 33,5 cm voneinander
entfernt. Es verwendet submarine Gele, die eine Breite und Länge von
bis zu 21 × 14
cm aufweisen können.
Die Gele werden horizontal platziert (CHEF Mapper XA Pulsed Field
Electrophoresis System. Bedienungsanleitung und Anwendungshinweise,
Katalognummern 170-3670 bis 170-3673. Bio-Rad, S. 11, 1995). Wie
erwähnt,
wurden CHEF-Systeme häufig
für die
Typisierung von Mikroorganismen verwendet. Beispielsweise für Bakterien
(Beverly S., Anal. Biochem. 1989, 177: 110–114; Dingwall A. und Shapiro
L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 119–123; Ferdows M.S. und Barbour
A.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 5960–5973; Kohara Y., Akiyma K.
und Isono K., Cell, 1987, 50: 495–508; Ohki M. und Smith C.I.,
Nucleic Acids Res. 1989, 17: 3479–3490; Schoenline P.V., Gallman
L.M und Ely B., Gene, 1989, 70: 321–329; Ventra L. und Weiss A.S.,
Gene, 1989, 78: 29–361,
Pseudomonas (Bautsch W., Grothues D. und Tummler B., FEMS Microbiol.
Lett. 1988, 52: 255–258;
Romling U. und Tummler B., J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11: 464–465), S.
cerevisiae (Albig W. und Entian K.D., Gene, 1988, 73: 141–152; Zerva
L. et al., J. Clin. Microbiol. 1996, 34(12): 3031–3034),
E. histolytica (Petter R. et al., Infect. Immun. 1993, 61(81: 3574–3577),
S. pneumoniae (McEllistrem M.C. et al., J. Clin. Microbiol. 2000,
38(11: 351–353),
S. aureus (Wichelhaus T.A. et al., J. Clin. Microbiol. 1999, 3713):
690–693),
M. tuberculosis (Singh S.P. et al., J. Clin. Microbiol. 1999, 37(61:
1927–1931),
P. haemolytica (Kodjo A. et al., J. Clin. Microbiol. 1999, 37(21:
380–385) etc.
-
Aufgrund
der umfangreichen Dimensionen der CHEF-Kammer wird eine große Menge
an Pufferlösung
benötigt,
um die Elektrodenplattform zu bedecken. Folglich kann die Stromstärke in der
Kammer hohe Werte erreichen, selbst wenn niedrige elektrische Feldstärken angelegt
werden. Entsprechend benötigen CHEF-Experimente Netzteile
mit hoher Nennleistung. Davon abgesehen wird in den Kammern große Hitze
erzeugt, die der Verkürzung
der Laufzeit durch Erhöhen
der elektrischen Feldstärke
entgegenwirkt. CHEF-Kammern benötigen
eine mindestens 20-stündige
Elektrophorese, um Saccharomyces cerevisiae-Chromosomen (Moleküle kleiner als 1,6 Mb. 1 Mb
= 106 Basenpaare) in das charakteristische
Muster von 11 Banden aufzutrennen und verschiedene Stämme dieser
Hefe zu typisieren (Zerva L. et al., J. Clin. Microbiol. 1996, 34(12): 3031–3034).
Die CHEF-Kammer benötigt
mit 20 Stunden oder mehr viel Zeit für die Auftrennung der Makrorestriktionsfragmente
bakterieller DNA-Moleküle
(van Belkum A. et al., J. Clin. Microbiol. 1998, 36(6): 1653–1659);
Marchadin H. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44(1):
213–216;
Romling U. und Tummler B., J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11: 464–465). Ebenso
werden lange Laufzeiten benötigt,
um Parasiten wie Entamoeba histolytica zu untersuchen. Um deren
Chromosomen aufzutrennen, werden mindestens 24 Stunden benötigt (Petter
R. et al., Infect. Immun. 1993, 61(8): 3574–3577).
-
Der
Vorteil der derzeit verwendeten CHEF-Apparaturen besteht in der
Möglichkeit,
40 Proben in einem einzigen Lauf zu analysieren. Dieses Hochdurchsatzprobenformat
erleichtert die vergleichende Analyse von Gelelektrophoresemustern,
die durch Proben zahlreicher Isolate vorgegeben sind.
-
Das
TAFE-System wurde von K.J. Gardiner, W. Laas und D. Patterson in
ihrem in Somatic Cell Mol. Genet. 1986(12): 185 publizierten Paper
vorgeschlagen. Sie bezeichneten das System ursprünglich als "Vertikale Pulsfeld-Gelelektrophorese" (VPFE) und entwickelten die Apparatur,
die durch das US-Patent
4,740,283 vom 26. April 1988 geschützt wurde.
-
Im
TAFE-System werden zwei Elektrodenpaare parallel zueinander an beiden
Seiten des submarinen Gels (10 × 7,6 × 0,64 cm,
Länge × Breite × Dicke)
angebracht, welches vertikal in der Kammer platziert ist. Diese
Elektrodenanordnung erzeugt elektrische Kraftfeldlinien, die das
Gel transversal durchkreuzen, und die Moleküle zwingen, während eines
jeden Pulses durch das Gel zu wandern. In TAFE legen einheitlich
große Moleküle gleiche
Strecken zurück
und wandern im Gel auf gleicher Höhe, wobei sie gleichmäßige Spuren
hinterlassen, ungeachtet der Position der Wells in dem Gel (in die
die Proben geladen wurden). Folglich ist dieses System hilfreich
für die
Typisierung von Mikroorganismen, da es die vergleichende Analyse
der Elektrophoresemuster erleichtert, die durch die Proben der zahlreichen
Isolate vorgegeben werden.
-
Basierend
auf diesen Prinzipien, stellten Beckman Instruments eine als "Geneline I, or Transverse
Alternating Field Electrophoresis System" bezeichnete Apparatur her (Beckman,
The Geneline System Bedienungsanleitung, Hrsg. Spinco-Abteilung
von Beckman Instruments Inc., 1988), die ebenso als TAFE bekannt ist.
Dieses System verwendet ein Gel (11 × 7,2 × 0,6 cm, Länge × Breite × Dicke), in das 20 Proben
geladen werden können.
Nichtsdestotrotz benötigt
TAFE ebenso große
Mengen an Pufferlösung
(3,5 Liter) und biologischer Probe. Die Apparatur benötigt mindestens
20 Stunden, um die Chromosomen von E. histolytica aufzulösen (Báez-Camargo
M. et al., Mol. Gen. Genet. 1996, 253: 289–296). Entsprechend teilt TAFE
mit CHEF die Vor- und Nachteile bei der Typisierung von Mikroorganismen.
-
Zusammenfassend
kann festgestellt werden, dass die kommerziell erhältlichen
Apparaturen, die zum Charakterisieren des Genoms von Mikroorganismen
und Parasiten am häufigsten
verwendet werden zum Auftrennen großer DNA-Moleküle in ihre
Bandenmuster, eine lange Laufzeit und große Mengen an Reagenzien und
biologischen Proben benötigen.
-
Das
FIGE-System wird (has been = reicht bis in die Gegenwart) für die schnelle
Typisierung von Bakterien verwendet (Goering R.V. und Winters M.A.,
J. Clin. Microbiol. 30(3): 577–580,
1992; Grothues D. et al., J. Clin. Microbiol. 26(101: 1973–1977, 1988).
Dennoch wurde in den FIGE-Experimenten die Umkehr der elektrophoretischen
Mobilität
der DNA festgestellt. Mobilitätsumkehr
der DNA verhindert eine korrekte Größenbestimmung und erschwert
die Interpretation und den Vergleich der Muster, die durch verschiedene
Proben erzeugt werden. Die Unmöglichkeit
der Vorhersage des Zeitpunkts, an dem die DNA-Mobilitätsumkehr
auftritt, ist eines der Probleme, die mit diesem Phänomen assoziiert
sind (Birren B. und Lai E., Pulsed Field Gel Electrophoresis: a
practical guide, S. 10, Academic Press Inc. San Diego, California,
1993). Der Hauptnachteil der Mobilitätsumkehr besteht in der Unmöglichkeit,
diejenigen Moleküle,
die in den erzeugten Banden vorhanden sind, eindeutig zu identifizieren.
Um dies zu tun, sollten die Banden transferiert und mit spezifischen
Sonden hybridisiert werden. Hybridisierung erhöht vor allem die Preise des
Assays und kostet Zeit und das Typisierungsverfahren ist entsprechend
teurer und zeitaufwändiger.
-
Die
Versuche, um die Elektrophoresezeit in aktuellen CHEF-Apparaturen
wie GeneNavigator (Amersham-Pharmacia-LKB, Pharmacia Molecular and
Cell Biology-Katalog, Pulsed Field Gel Electrophoresis, Nucleic
Acids Electrophoresis, 1998, S. 77–79), CHEF DRII und CHEF Mapper
(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System. Bedienungsanleitung
und Anwendungshinweise, Katalognummern 170-3670 bis 170-3673, Bio-Rad,
S. 11, 1995) durch Erhöhen
der an den Elektroden angelegten Spannung zu verkürzen, ist
nahezu unmöglich.
Dies ist auf die Beschränkung
der Nennleistung des Netzteils und des Kühlungssystems zurückzuführen. Demzufolge
empfehlen die Hersteller 9 V/cm als das in diesen Apparaturen anzulegende
maximale elektrische Feld (CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis
System, Bedienungsanleitung und Anwendungshinweise, Katalognummern
170-3670 bis 170-3673, Bio-Rad, S. 2, 1995). Entsprechend wird im CHEF-System
die Verkürzung
der Elektrophoresedauer durch Erhöhen der elektrischen Feldstärke verhindert. Aktuelle
TAFE-Apparaturen haben ähnliche
Probleme.
-
PFGE-Miniapparaturen
-
Über Mini-PFGE-Apparaturen,
Mini-CHEF- und Mini-TAFE-Versionen wurde 1995 berichtet (Riverón A.M.
et al., Anal. Lett. 1995, Bd. 28, S. 1973–1991; europäische Patentanmeldung
EP 0 745 844 , Amtsbl. 1996/49;
US-Patentanmeldung
08/688,607, 1995; kubanisches Patent RPI 02/95, 1995). Miniapparaturen überwinden
die meisten der erwähnten
Nachteile der PFGE-Apparaturen.
Pulsfeld-Elektrophoreseexperimente werden in einem Minigel (4 × 4 × 0,5 cm;
Länge × Breite × Dicke),
beladen mit 7 Proben, in 4 bis 6 Stunden durchgeführt. Elektrische
Feldstärken,
die 16 V/cm erreichen, können
in die Mini-CHEF-Kammer mit einem Abstand von 11,6 cm zwischen den
entgegengesetzt gepolten Elektroden angelegt werden, wodurch eine
gute Auflösung
des Elektrophorese-Bandenmusters in 2,7 Stunden erreicht wird. Der
kurze Abstand zwischen den Elektroden mit entgegengesetzten Polaritäten erlaubt
die Konstruktion kleiner Kammern und die Verwendung kleiner Puffervolumina
zum Bedecken der Elektroden. Durch Anlegen einer bestimmten Spannung
an die Mini-CHEF und CHEF-Kammern (bestimmter elektrischer Feldstärkenwert "E") war die in der Minikammer erzeugte
Hitze immer geringer als die Hitze, die in der kommerziell erhältlichen
CHEF erzeugt wurde (Riverón A.M.
et al., Anal. Lett. 1995, Bd. 28, S. 1973–1991).
-
Mini-TAFE-Apparaturen
gestatten 22 V/cm, wodurch Auflösung
zwischen den Banden erreicht wird (Riverón A.M. et al., Anal. Lett.
1995, Bd. 28, S. 1973–1991).
Mini-TAFE ermöglicht
den Erhalt des elektrophoretischen Karyotyps von S. cerevisiae in
5 Stunden. Mini-TAFE-Kammern mit kurzer Auftrennung (7,8 cm) zwischen
den sich gegenüber
liegenden Elektroden sind klein und verwenden kleine Mengen an Pufferlösung.
-
Werden
allerdings Proben, die dicker als 0,1 cm sind, in die Minigele geladen,
werden längere
Laufzeiten benötigt,
um eine gute Auflösung
der Elektrophoresemuster zu erzielen. Früheren Berichten zufolge beeinflusst
die Dicke der Proben die Laufzeit der Elektrophorese (López-Cánovas
et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806, S. 187–1971. Sind die Proben dicker,
werden längere
Gele benötigt,
um die gleichen Bandenmuster zu erzielen. Allerdings sehen die erwähnten Mini-CHEF-Minigele
nur 7 Proben vor, während
die Mini-TAFE 13 Proben erlauben. Diese sind Niedrigdurchsatzprobenformate
zum Typisieren von Mikroorganismenisolaten in klinischen Laboratorien.
-
Obwohl
Mini-PFGE-Apparturen Vorteile gegenüber derzeit verwendeten Systemen
aufweisen, werden weder Mini-CHEF, noch Mini-TAFE zum Typisieren
von Mikroorganismen verwendet. Möglicherweise
liegt es daran, dass versucht wurde, Proben zu verwenden, die so
dick waren wie die in konventionellen Gelen verwendeten. Darüber hinaus
sind keine einfachen Verfahren zum Auswählen der Laufparameter für Miniapparaturen
erhältlich.
-
Präparation immobilisierter DNA
-
Das
Verfahren zum Präparieren
intakter DNA-Moleküle
ist essentiell für
die Typisierung von Mikroorganismen durch PFGE in gängigen Apparaturen
oder Miniapparaturen. Vorstehend erwähnte Verfahren zum Isolieren
und Reinigen von DNA in Lösung
führen
zum Scheren dieser Moleküle
(Schwartz D.C. und Cantor C.R., Cell, 1984, 37, S. 66–75). Schwartz
und Cantor schlugen eine Methodik zum Präparieren von Proben für PFGE vor
und nahmen lediglich Moleküle
mit einer Größe von weniger
als 1 Mb (106 Basenpaare) davon aus. Die
Methodik besteht im Ernten der kultivierten Zellen, Waschen der
Zellen und Einbetten derselben in Agaroseblöckchen. In weitergehenden Schritten
werden (sofern eine Zellwand vorhanden ist) "in situ" Spheroplasten gebildet und in den genannten
Blöckchen
weiter verdaut. Schließlich
werden die immobilisierten DNA-Moleküle unter Verwendung von Proteinase
K deproteinisiert. Das Verfahren hat sich als wirksam beim Herstellen
von Proben von Mikroorganismen verschiedener Gattung, Spezies und
Ursprung erwiesen. Sofern diese Mikroorganismen eine Zellwand besitzen,
müssen
allerdings Spheroplasten gebildet werden, wobei die Enzyme, die benötigt werden,
um Spheroplasten herzustellen, sowie die Proteasen teuer sind. Das
geschilderte Verfahren erfordert, dass die Proben zweimal über Nacht
inkubiert werden, wodurch die Probenaufbereitung 32 Stunden beansprucht
(US-Patent Nr. 4,473,452, 25. Sept. 1984).
-
In
jüngerer
Zeit erzielte Gardner (Gardner D.C.J. et al., Yeast, 1993, 9, 1053–1055) Bandenmuster
von S. cerevisiae-Chromosomen aus Zellen, die keine Spheroplasten
bildeten. Gleichzeitig zeigten Higginson et al. (Higginson D. et
al., Anal. Lett. 1994, 27: 7, 1255–1264), dass S. cerevisiae-DNA
unter Verwendung von 8 M Harnstoff anstelle von Proteinase K deproteinisiert
werden kann. Allerdings ist das von Gardner beschriebene Verfahren
nach wie vor teuer, da er Proteasen verwendete, um die DNA zu deproteinisieren,
während das
von Higginson beschriebene Verfahren preisgünstig ist, jedoch eine 72-stündige Inkubation
erfordert, was eine lange Zeit ist. Später wurden S, cerevisiae-Proben
ohne Verwendung von Enzymen präpariert:
Die Blöckchen
wurden sequenziell inkubiert mit LETK (10 mM Tris, 500 mM EDTA,
600 mM KCl, pH 7,5) für
4 Stunden, NDS (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1 % Sarkosyl, pH 9,5) für 2 Stunden
und NDS plus 4 M Harnstoff (NDSU) für 2 Stunden. Dieses Verfahren
erforderte eine 10-stündige
Probenpräparation
(López-Cánovas
L., et al., Anal. Lett. 1996, 29:12, 2079–2084). Schnelle Verfahren
für die
Präparation
immobilisierter DNA wurden ebenso beschrieben, allerdings verwenden
diese Enzyme (zum Beispiel in Guidet F. und Langridge P., Biotech, 1992,
12: 2, 222–223).
-
Als
Grundsatzregel bedarf die immobilisierte DNA für PFGE-Experimente der Bildung
von Spheroplasten und der unter Verwendung von Proteasen erfolgenden
Deproteinisierung. Diese Erfordernisse sind unabhängig vom
untersuchten Zelltyp (Bakterien, Hefe etc.) (Maule J. Mol. Biotech.
1998, 9:107–126;
Olive D.M. und Bean P., J. Clin. Microbiol. 1996, 37:6, 1661–1669).
Beispielsweise wurde berichtet, dass immobilisierte Staphylococcus
aureus-DNA innerhalb von 2 Stunden durch Immobilisieren der Zellen
mit Lysostaphin und Inkubieren der Blöckchen mit Detergenzien präpariert
werden kann, während
Streptococcus fecalis-Zellen vor der Immobilisierung eine Inkubation
mit Lysozym und Mutanolysin erfordern (Goering R.V. und Winter M.A.,
J. Clin. Microbiol. 1992, 30:3, 577–580). In den erwähnten Arbeiten
inkubierten die Autoren die Proben nicht mit Proteinase K. Allerdings
berichteten Matushek et al. (Matushek M.G. et al., J. Clin. Microbiol.
1996, 34:10, 2598–2600),
dass sie nicht in der Lage waren, Bandenmuster zu erzielen, wenn
die Proben nicht mit Proteinase K inkubiert wurden. Alternativ schlugen
sie ein schnelles Verfahren zum Präparieren immobilisierter DNA-Proben
unter Verwendung von Proteinase K vor. Kürzlich berichteten McEllistrem
et al. (McEllistrem M.C. et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:1,
351–353)
ein vollständig
nicht-enzymatisches Verfahren zum Präparieren immobilisierter DNA
von Streptococcus pneumoniae. Es beansprucht allerdings 6 Stunden,
und die Autoren schrieben den Erfolg des Protokolls der Aktivierung
eines Autolysins des Streptococcus zu. Derzeit sind die Spheroplasten-bildenden
Enzyme und die Proteasen lediglich aus den Protokollen der Präparation
intakter DNA-Moleküle
von S. cerevisiae und Streptococcus pneumoniae gestrichen worden,
wobei jedoch die Zeiträume,
die für
die Vervollständigung
dieser Präparationen
benötigt
wurden, 10 bzw. 6 Stunden betrugen, was lange Zeiträume sind.
Keine Einigkeit herrscht hinsichtlich der Ausführbarkeit, die Protoplasten
bildenden Enzyme und Proteinase K in der Probenpräparation
von Mikroorganismen zu streichen. Folglich sind die gängigen Verfahren
kostspielig und benötigen
viel Zeit.
-
Die
meisten der oben genannten Verfahren beruhen auf der Annahme, dass
Mikroorganismen mit Zellwänden
vor der enzymatischen Behandlung zu immobilisieren sind. Eine Ausnahme
wird in dem von Goering und Winter (Goering R.V. und Winter M.A.,
J. Clin. Microbiol. 1992, 30:3, 577–580) publizierten Artikel
vorgestellt. Die Autoren lösen
Zellen vor ihrer Immobilisierung in einer Lösung, die Lysozym und Mutanolysin
(zwei Enzyme zum Bilden von Spheroplasten) enthält. Ein allgemein gültiges nicht-enzymatisches
Verfahren zum Behandeln von Mikroorganismen mit Zellwänden vor
deren Einbettung in Agarosegele wurde allerdings noch nicht beschrieben.
Ein entsprechendes Verfahren würde
verglichen mit gängigen
Protokollen zur Probenaufbereitung kostengünstiger und einfacher sein.
-
Beschrieben
wurden Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren in Lösung, ausgehend von Zellen,
die in der Anwesenheit von Agenzien erhitzt wurden, welche die Permeabilität der Zellwand
der Mikroorganismen hervorrufen (europäisches Patent 0 657 530, 1994,
Amtsblatt 95/24; US-Patent 158,940, 19931. Das Verfahren führte zu
großen
Fragmenten nicht-degradierter Nukleinsäuren von Mikroorganismen, ohne
die gesamte Zellwand physikalisch aufzubrechen. Dieses Verfahren
benötigt
keine lytischen Enzyme. Es wurden allerdings keine intakten DNA-Moleküle erzielt,
da die DNA in Lösung
isoliert wurde; darüber
hinaus schlugen die Autoren das Verfahren nicht im Zusammenhang
mit dem Erzielen molekularer Karyotypen oder Pulstypen der erwähnten Mikroorganismen
vor. Die Autoren berichteten, dass die erzielte DNA zum Hybridisieren
geeignet ist, jedoch gingen sie nicht auf die Möglichkeit des DNA-Verdaus mit
Endonukleasen ein. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass
dieses Verfahren nicht den Erhalt intakter DNA-Moleküle garantiert,
während
die Möglichkeit,
diese mit Restriktionsenzymen zu verdauen, unbekannt bleibt.
-
Folglich
wurde bislang keine allgemein gültige
Vorgehensweise für
die Aufbereitung immobilisierter intakter DNA aus Hefe, Gram-positiven
und Gramnegativen Bakterien sowie Parasiten durch nicht-enzymatische
Verfahren in kurzen Zeiten vorgeschlagen.
-
Die
Aufbereitung immobilisierter DNA-Proben erfordert Förmchen,
um diese Proben zu Formen. Diese Formen können wiederverwendbar oder
ein Einwegartikel sein. Die wiederverwendbaren Formen sollten sterilisierbar
sein. Dies ist wichtig zur Handhabung von Proben pathogener Mikroorganismen.
Die Verwendung von Einwegformen erfordert einen Dauervorrat, was
in Laboratorien mit niedrigem Budget ein limitierender Aspekt sein
kann.
-
Folgende
sind bekannte Formen:
- a) Formen, die unabhängige und
einzelne Blöckchen
formen (US-Patent 4,473,452, 25. Sept. 1984; US-Patent 4,861,448,
29. Aug. 19891;
- b) Formen, die lange Bänder
formen, die zur Bildung einzelner Blöckchen geschnitten werden (López-Cánovas
L., et al., Anal. Lett. 1996, 29:12, 2079–2084);
- c) Formen, die lange quadratische "Nudel-" oder lange Agarosestäbe formen,
die zur Bildung einzelner Blöckchen
geschnitten werden (Birnen B. und Lai E., Pulsed Field Gel Electrophoresis:
a practical guide, Academic Press Inc., San Diego, California, 1993,
S. 29–30).
-
Grundsätzlich werden
in diesen Formen Proben erzeugt, deren Dimensionen größer als
die Gelslots sind. Um Blöckchen
zu erhalten, deren Ausmaße
denen der Slots entsprechen, müssen
die Bänder,
Nudeln etc. mit einer Rasierklinge oder anderen Geräten geschnitten
werden (CHEF Mappen XA Pulsed Field Electrophoresis System, Bedienungsanleitung
und Anwendungshinweise, S. 40, Abschnitt 7, Katalognummern 170-3670
bis 170-3673, Bio-Rad. 1995). Das Schneiden der Bänder oder
Nudeln führt
allerdings zu Blöckchen von
uneinheitlicher Größe und Ausmaß, welche
wiederum die Qualität
der Elektrophoresemuster beeinflussen. Die Auflösung der DNA-Moleküle im Gel
hängt von
der Dicke der Probe ab. Folglich gestaltet sich der Vergleich der
in den unterschiedlichen Spuren des Gels erzielten Muster schwierig.
Schwierigkeiten beim Vergleich der Bandenmuster stellen einen Nachteil
bei der Typisierung von Mikroorganismen dar.
-
Eine
Form zum Einbetten von Zellen in Agarosegel und zum Behandeln der
Blöckchen
wurde im US-Patent 5,457,050, 10. Okt. 1995, offenbart. Die Form
kann, je nach dem zu ihrer Herstellung verwendeten Material, ein
Einwegartikel oder wiederverwendbar sein. Beansprucht wird, dass
die Erleichterung durch die Form darin besteht, dass die Proben
innerhalb dieser Form abgeformt und behandelt werden. Dies ist jedoch ein
Nachteil: Wenn die Blöckchen
während
der Inkubationen in der Form behalten werden, verlängert sich
dadurch die Zeit, die erforderlich ist, um die Proben für die PFGE-Analyse
aufzubereiten, merklich. Die Effektormoleküle für die Lyse und die Deproteinisierungslösungen können nur
schwer die Zielmoleküle
innerhalb der Zellen erreichen, da der Kontaktbereich zwischen den
Blöckchen
und den Inkubationslösungen
um mindestens die Hälfte
verringert ist.
-
Die
Formen, die unabhängige
und einzelne Blöckchen
formen und in US-Patent
4,473,452 vom 25. Sept. 1984 und in US-Patent 4,861,448 vom 29.
Aug. 1989 offenbart sind, werden aus zwei Teilen eines festen Materials
hergestellt, welche durch Schrauben zusammengehalten werden. Der
Hauptnachteil dieser Formen besteht darin, dass sie vor der Verwendung
zusammengebaut und nach der Verwendung wieder auseinandergebaut
werden müssen.
Folglich ist die Entfernung der Gelblöckchen eine arbeitsaufwändige Aufgabe.
-
Die
Formen, die lange Bänder
bilden, welche zum Bilden unabhängiger
Blöckchen
geschnitten werden (López-Cánovas
L. et al., Anal. Lett. 1996, 29:12, 2079–2084), werden aus Acrylmaterial
hergestellt und können
somit nicht autoklaviert werden. Dies stellt einen erheblichen Nachteil
dar, wenn die Proben aus pathogenen Mikroorganismen präpariert
werden.
-
Zusammenfassend
lässt sich
feststellen, dass Formen, die zum Gießen unabhängiger und einheitlich großer Miniblöckchen einfach
zusammen- und auseinandergebaut werden können, sowie nach Sterilisierung durch
Autoklavieren wiederverwendet werden können, bislang noch nicht beschrieben
oder offenbart worden sind.
-
Auswahl der PFGE-Versuchsbedingungen
-
Die
Auswahl der Versuchsbedingungen ist komplex. Verfahren zum Auswählen der
PFGE-Laufbedingungen sind beschrieben worden. Beispielsweise weist
der CHEF Mappen von Bio-Rad eine Wahlmöglichkeit zwischen Auto-Algorithmus
und einem anderen interaktiven Algorithmus auf (CHEF Mappen XA Pulsed
Field Electrophoresis System, Bedienungsanleitung und Anwendungshinweise,
S. 31–40,
Katalognummern 170-3670 bis 170-3673, Bio-Rad, 1995). Beide Möglichkeiten erlauben die Berechnung
der Pulszeiten, der Pulsrampendauern, der Neuorientierungswinkel,
des elektrisches Felds und der optimaler Laufzeit zum Trennen von
DNA-Molekülen
einer bestimmten Probe. Im Gegensatz zum Auto-Algorithmus, in dem
festgelegte Versuchsbedingungen angenommen werden, erlaubt der interaktive
Algorithmus bei Eingabe die Variation des Puffertyps, der Temperatur
und Konzentration und des Agarosetyps und -konzentration. Beide
Algorithmen arbeiten basierend auf empirischen und theoretischen
Daten, die im Laufe von 5 Versuchsjahren gesammelt wurden (Bio-Rad-Katalog,
Life Science Research Products, Bio-Rad-Laboratorien, S. 185, 1998/99). Die
Hersteller empfehlen jedoch, den Auto-Algorithmus mit DNA-Größen zu füttern, die
kleiner und größer als
die erwarteten Größen der
Probenmoleküle
sind. Darüber
hinaus können
fehlerhafte Ergebnisse wie Bandenumkehr im mittleren Bereich des
Gels erzeugt werden, wenn extrem weite Größenbereiche sowohl vom Auto-Algorithmus
als auch vom interaktiven Programm erfasst werden.
-
Ein
anderer vorgeschlagener empirischer Ansatz bestand darin, die elektrische
Pulsdauer vorzugeben, welche die Gruppe von Molekülen auftrennt,
deren Größe zwischen
einem bestimmten Wert und einem höheren Wert, genannt RSL (Resolution
Size Limit) lagen (Smith, D.R., Methods 1, 1990, 195–203). Allerdings ist
dieser Ansatz nur für
bestimmte experimentelle Bedingungen gültig und erlaubt nicht die
Vorhersage der Auflösung
zwischen zwei beliebigen Molekülen.
Eine andere Funktion wurde vorgeschlagen. Sie stellt die annähernden
Bedingungen des elektrischen Feldes und der Pulszeit bereit, die
benötigt
werden, um eine bestimmte Gruppe von Molekülen aufzutrennen (Gunderson
K. und Chu G., Mol. Cell. Biol. 1991, 11: 3348–3354). Trotzdem erlaubt diese
Funktion nur die grobe Schätzung
der beiden genannten Variablen und erlaubt nicht die Vorhersage
der Molekülmigrationen
bei beliebigen experimentellen Bedingungen.
-
Trotz
der Durchführung
verschiedener theoretischer Studien über molekulare Neuorientierung
von DNA während
PFGE (Noolandi J., Adv. Electrophoresis, 1992, 5: 1–57; Maule
J. Mol. Biotech. 1998, 9: 107–126),
erzielten diese noch immer keine Studien in den Laboratorien durchführbaren
und hilfreichen Ergebnisse. Sie erzeugten keine Verfahren, die es
dem PFGE-Anwender
ermöglichten,
diejenigen experimentellen Bedingungen auszuwählen und einzustellen, die
benötigt
werden, um die zu analysierenden Moleküle aufzutrennen.
-
Die
Gleichungen, die von López-Cánovas
et al. (López-Cánovas
L. et al., J. Chromatogr. A, 1998, 806: 123–139) vorgeschlagen wurden,
um DNA-Migration in PFGE zu beschreiben, sind nicht verwendet worden, um
die Bandenmuster vorauszuberechnen, die bei Variation von Pulszeitrampen,
elektrischem Feld, Temperatur und Laufzeit erzielt werden sollten.
Diese Variablen werden üblicherweise
bei der Typisierung von Mikroorganismen modifiziert.
-
PFGE-Bandenmusteranalyse
-
Es
sind Computer-unterstützte
Systeme zur Aufnahme von Bilddaten von PFGE-Gelen für Bandenmusteranalysen
erhältlich
(Gerner-Smidt P. et al., J. Clin. Microbiol. 1998, 37(31: 876–877; Tenover
F. et al., J. Clin. Microbiol. 1995, 33(9): 2233–2239; van Belkum A. et al.,
J. Clin. Microbiol. 1998, 36(6): 1653–1659). Dennoch bleibt der
Vergleich der Restriktionsmuster ein subjektiver Prozess, der nicht
vollständig
auf starre Algorithmen reduziert werden kann (Tenover F. et al.,
J. Clin. Microbiol. 1995, 33(9), 2233–2239). Obwohl Computer-basierte
Analysen durchgeführt
werden, muss die abschließende
Interpretation der Muster einer vorherigen visuellen Inspektion
unterworfen werden.
-
Automatische
und nicht-automatische Bandenmusteranalysen ergeben als Ergebnis
die Anzahl der Banden und die Größe der Moleküle in den
Banden. Dies wird üblicherweise
durchgeführt,
indem Migrationen unbekannter DNA mit den Migrationen von Molekulargewichtsmarkern
verglichen werden. Dennoch ist PFGE verhältnismäßig neu, und es sind nicht
immer Größenmarker
für weite
DNA-Größenbereiche
erhältlich.
Infolgedessen bestehen die Kriterien, die für das auf der Interpretation
von PFGE-Bandenmustern beruhende Typisieren von Bakterien benutzt
werden, in der Bestimmung der Anzahl verschiedener Restriktionsfragmente, die
im Vergleich beim Verdauen der DNA der Mikroorganismen gefunden
werden.
-
Anhand
von Elektrophoresedaten, die in Experimenten mit 1,5 % Agarose,
Lachema und 0,5 X TBE, 1 X TBE: 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM
EDTA erzielt wurden, wurden Gleichungen vorgeschlagen, um die Migration
von DNA-Molekülen unter
einer einzelnen Pulsrampe, verschiedenen elektrischen Feldstärken und
verschiedenen Temperaturen zu beschreiben (López-Cánovas L. et al., J. Chromatogr.
A, 1998, 806: 123–139).
Allerdings existiert noch kein Verfahren, um diese Gleichungen zu
erweitern und auf die Analyse von Bandenmustern nach dem Anlegen
von Pulszeitrampen anzuwenden. Das Anlegen von Pulszeitrampen wird üblicherweise
in vergleichenden Studien über
Mikroorganismen angewandt.
-
Gängige Verfahren zum Typisieren
von Mikroorganismen durch PFGE.
-
Das
gesamte Verfahren zum Typisieren von Mikroorganismen erfordert lange
Zeit und viele Ressourcen. Die Elektrophorese erfordert etwa 20
Stunden, die Verfahren zum Aufbereiten der Proben, empfohlen durch
die Hersteller oder beschrieben in der Literatur, erfordern die
Verwendung großer
Mengen an Enzymen (zum Beispiel 80 mg/ml Proteinase K) sowie lange
Inkubationszeiten (CHEF Mappen X Pulsed Field Electrophoresis System,
Bedienungsanleitung und Anwendungshinweise, S. 40–43, Katalognummern
170-3670 bis 170-3673, Bio-Rad,
1995). Ein Faktor, der die Verwendung von PFGE für die Typisierung von Mikroorganismen
beschränkt,
ist die Zeit, die benötigt
wird, um die Analyse von Isolaten zu vervollständigen. Dies dauert 2–3 Tage
und vermindert somit die Kapazität
der Laboratorien, viele Proben zu analysieren (Olive D.M. und Bean
P., J. Clin. Microbiol. 1999, 37:6, 1661–1669).
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren sowie ein Reagenzkit
zum Typisieren von Mikroorganismenisolaten an einem einzigen Arbeitstag
(zwischen 7 und 13 Stunden) bereit. Die Typisierung erfolgt durch das
Erzielen typischer Bandenmuster, die aus der Auftrennung von DNA-Molekülen resultieren,
die in Miniapparaturen einer Pulsfeld-Gelelektrophorese unterzogen
werden. Im Einzelnen:
- i) Hierin wird ein Verfahren
und das dazugehörige
Reagenzkit bereitgestellt, um in höchstens 60 Minuten intakte
DNA-Proben herzustellen, eingebettet in Miniblöckchen eines Gels. Das Verfahren
basiert auf der Behandlung der Zellen mit Lösungen, die keine lytischen
Enzyme enthalten. Diese Behandlung kann vor oder nach dem Einbetten
dieser Zellen in das Gel durchgeführt werden. Die Zellen können Gram-positive sowie
Gramnegative Bakterien sein. Die Zellen werden mittels einer Form,
die aus einem flexiblen, sterilisierbaren Material hergestellt ist,
eingebettet. Diese ergibt Miniblöckchen
von einheitlicher Größe. Die
Dicke der Miniblöckchen
variiert abhängig
von den verwendeten Ausmessungen der Form von 0,03 bis 0,1 cm.
- ii) Verfahren zum Vorhersagen der Migrationen linearer DNA werden
bereitgestellt. Die Verfahren basieren auf theoretischen Gleichungen,
die die Berechnung der Migrationen von linearen DNA-Molekülen bei
beliebigem Zustand des elektrischen Felds, der Temperatur, der Pulszeitrampen
sowie der Elektrophoresezeiten im CHEF-System erlauben. Diese Verfahren
erlauben das Auswählen
der optimalen Elektrophoresebedingung, die an die Gele angelegt
werden muss, um eine graphische Darstellung der von der linearen DNA
zurückgelegten
Strecken zu erhalten.
- iii) Hierin werden Abläufe
für die
Auftrennung und Analyse von DNA-Molekülen von
Mikroorganismen bereitgestellt. Die Auftrennungen erfolgen in Miniapparaturen
für Pulsfeld-Gelelektrophorese.
Die MiniCHEF-Miniapparaturen
ergeben die Bandenmuster in 2,5 bis 5 Stunden und die MiniTAFE in
5 bis 7 Stunden. Der Ablauf erlaubt die Untersuchung von bis zu
27 Proben immobilisierter DNA von Mikroorganismen. Diese Proben
werden: a) wie in Abschnitt i) aufbereitet; b) unter optimalen Elektrophoresebedingungen
in Minigelen von Miniapparaturen aufgetrennt, wobei die Bedingungen
mithilfe der vorhersagenden Verfahren ausgewählt wurden.
-
Das
mit dieser Erfindung bereitgestellte Verfahren zur Probenaufbereitung
beansprucht höchstens
60 Minuten und ist einfach und kostengünstig, erfordert weder lytische
Enzyme noch Proteasen in den Lösungen zum
Inkubieren der Mikroorganismenzellen und erbringt immobilisierte
intakte DNA. Die intakten DNA-Moleküle können mit Restriktionsenzymen
verdaut werden und, sofern sie der Pulsfeld-Gelelektrophorese ausgesetzt
werden, wandern die intakten DNA-Moleküle oder
ihre Restriktionsfragmente in den Minigelen, wobei sie Bandenmuster
entsprechend der molekularen Karyotypen oder Pulstypen der Mikroorganismen
bilden.
-
Das
Verfahren basiert auf der chemischen Modifikation der Bakterienzellwand,
um die Lyse der Mikroorganismen oder die Diffusion kleiner Effektormoleküle hin zu
den Zielmolekülen
in den Zellen zu erlauben. Ebenso werden während der Aufbereitung unerwünschte intrazelluläre Komponenten
durch Dialyse eliminiert. Im Ergebnis werden in den Miniblöckchen,
in denen die Zellen eingebettet wurden, intakte DNA-Moleküle erzielt.
-
Das
Verfahren umfasst die folgenden Hauptschritte:
- 1)
Die Mikroorganismenzellen werden zunächst aus den Fluiden hospitalisierter
Personen oder aus einer biotechnologischen Sammlung oder aus den
Experimenten isoliert, die in einem üblichen Labor für Molekularbiologie,
Genetik oder dergleichen durchgeführt wurden.
- 2) Die Zellen werden in Bouillonkultur oder auf festen Medien
mit der für
jeden Mikroorganismus geeigneten Zusammensetzung kultiviert.
- 3) Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und anschließend gewaschen.
- 4) Die Zellen werden a) in das Gel eingebettet und mit den nicht-enzymatischen Lösungen inkubiert
oder b) mit dieser/diesen Lösungen)
inkubiert und anschließend
in Gel eingebettet. Im Fall "a" werden die immobilisierte
Zellen enthaltenden Miniblöckchen
zuerst in der nicht-enzymatischen
Lösung
für 5 bis
30 Minuten bei 50°C
inkubiert. Im Fall "b" werden Zellen mit
der nicht-enzymatischen Lösung
für 5 bis
30 Minuten bei 50°C
inkubiert und anschließend
in die Agarose-Miniblöckchen
eingebettet.
- 5) Wenn die Elektrophorese durchgeführt werden soll, werden die
Zellen enthaltenden Miniblöckchen
gegen Elektrophoresepuffer dialysiert; oder gegen Konservierungspuffer,
wenn die Miniblöckchen
gelagert werden sollen; oder gegen Restriktionsendonukleasepuffer,
wenn DNA-Moleküle
verdaut werden sollen.
-
Staphylococcus
aureus kann vor der Immobilisierung mit nicht-enzymatischen Lösungen inkubiert werden, während Pseudomonas
aeruginosa und Escherichia coli zuerst immobilisiert und anschließend mit den
nicht- enzymatischen
Lösungen
inkubiert werden sollten. Die effektivsten Waschlösungen für Zellen
sind in Tabelle I dargestellt.
-
Tabelle
I. Die effektivsten Waschlösungen
für Zellen
zum Präparieren
immobilisierter DNA
-
Nicht-enzymatische
Lösungen
zum Inkubieren der Zellen oder der Zellen enthaltenden Miniblöckchen beinhalten
anionische Detergenzien, ein Metallchelatisierendes Agens, ein Agens,
das zum Kompetieren um die Bildung von Hydrogenbindungen geeignet
ist, sowie Tris-Puffer. Der effizienteste enthält: 1 % Sarkosyl, 0,1 M EDTA,
0,01 M Tris-Base, 4 M Harnstoff, und sein pH-Wert beträgt 9,5 (NDSU).
Um Zellen Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien zu inkubieren,
wird Nonidet P-40 zugesetzt (NDSUPlus).
-
Einige
Mikroorganismen, zum Beispiel Escherichia coli, sollten zunächst für 10 Minuten
bei 37°C
in einer nicht-enzymatischen Lyselösung inkubiert werden. Diese
enthält
1 % Sarkosyl, 1 % Nonidet P-40, 0,1 M EDTA, 0,01 M Tris-Base, und
ihr pH beträgt
8,0. Anschließend
werden sie für
eine halbe Stunde in der NDSUPlus-Lösung inkubiert.
-
Der
Puffer zum Lagern der immobilisierte DNA enthaltenden Miniblöckchen ist
TE-100 (0,01 M Tris-Base, 0,1 M EDTA, pH 8,0).
-
Das
Verfahren zum Einbetten der Zellen in Agaroseblöckchen beinhaltet das Verwenden
einer Form, die aus flexiblem, sterilisierbarem Material hergestellt
ist. Die Form ist eine Platte aus Silikon, Gummi oder anderem flexiblem
Material von bis zu 0,5 cm Dicke (siehe in den Beispielen Beispiel
1). In die Platte sind mehrere quadratische Vertiefungen eingestanzt.
Die Vertiefungen können
eine Breite von bis zu 0,3 cm und eine Tiefe von 0,03 bis 0,1 cm
aufweisen. Zum Gießen
der Agarose-Zell-Suspension wird die Form durch Auflegen auf eine
auf diese Temperatur aufgeheizte Oberfläche auf 42°C vorgewärmt, anschließend wird
die Suspension auf die Form gegossen und mithilfe eines Spatels
gleichmäßig in die
Vertiefungen verteilt. Anschließend
wird die Form mit einem Deckel bedeckt (dieser kann hergestellt
sein aus Glas, Acryl, Plastik oder einem anderen Material) und bei
4–15°C inkubiert,
bis die Miniblöckchen
ausgehärtet
sind. Die gleichmäßig großen Miniblöckchen werden
aus der flexiblen Gussform extrahiert, indem ihre umgebenden Seiten
gehalten werden und das Innere der Form auf einem Empfänger, der
die nicht-enzymatische Lösung
für die
Behandlung der Miniblöckchen
enthält,
gebogen wird. Die Suspension wird derart präpariert, dass 0,12 bis 3 × 108 Bakterienzellen in jedes Miniblöckchen vom
Ausmaß 0,3 × 0,07 cm
eingebettet werden. Alle genannten Mikroorganismen können unter
Verwendung dieses Gießformtyps
präpariert
werden. Insgesamt kann dieser Gießformtyp verwendet werden,
um Miniblöckchen
zu präparieren,
die jeden anderen Zelltyp enthalten.
-
In
der vorliegenden Erfindung basiert das Verfahren zum Auswählen der
optimalen Elektrophoresebedingungen, die an die Miniapparaturen
angelegt werden müssen,
auf der Berechnung der Migrationen linearer DNA-Moleküle. Die
Berechnung wird unter Verwendung einer Gruppe bekannter theoretischer
Gleichungen durchgeführt,
welche die Migration, die Neuorientierungszeiten und die Migrationsgeschwindigkeiten
der linearen DNA-Moleküle
in dem MiniCHEF-Minigel
beschreiben. Die Gleichungen werden mit den Werten des elektrischen
Felds und der Temperatur gefüttert
und sollten zwischen 1–20
V/cm bzw. 4–30°C erfassen.
Um die Gleichungen anzuwenden, wird angenommen, dass die Elektrophorese
in 1,5 % Agarose durchzuführen
ist und der Elektrophoresepuffer 44,5 mM Tris, 44,5 mM Borsäure, 1 mM
EDTA, pH 8,3 (TBE 0,5X) enthalten sollte. Die theoretischen Gleichungen,
welche die DNA-Migration
beschreiben, lauten wie folgt:
vr = 0,0207[QE1,45/(8πηL1 ,35)] Gleich. 2 vm = 0,665[QE1,76/(8πηL1,08)] Gleich.
3 tr = 0,134(L1,14/vr)0,926 Gleich.
4 Γr(tpr – tr) =
1, wenn (tpr – tr) ≤ 0 und Γr(tpr – tr)
= 0, wenn (tpr – tr) > 0 Gleich.
5wobei
- tr:
- Neuorientierungszeit
(s),
- vr:
- Migrationsgeschwindigkeit
während
Neuorientierung (cm/s),
- vm:
- Migrationsgeschwindigkeit
nach Neuorientierung (cm/s),
- Q:
- 1e × bp (DNA-Netzladung,
e: Elektronenladung in Statcoulomb),
- L:
- 0,34 nm × bp (DNA-Konturlänge, in
cm),
- E:
- elektrische Feldstärke in Statvolt/cm
- η:
- Viskosität der Pufferlösung in
Poise, und η wurde
durch Interpolieren der experimentellen Temperatur(°C) in einer
polynominalen Funktion berechnet, welche die Viskosität des Wassers
in Beziehung zur Temperatur setzt.
- D:
- Gesamtmigration eines
DNA-Moleküls
im CHEF-Minigel (cm),
- d:
- Migration pro Puls
(cm)
- n:
- Anzahl der Pulszeitrampen,
- Npr:
- Anzahl von Pulsen
in der Rampe "r",
- tpr:
- Pulsdauer in der Rampe "r" (s).
-
Das
Verfahren zum Auswählen
der optimalen Elektrophoresebedingungen beinhaltet die folgenden Schritte:
- I. Berechne die Dauer der Pulse (tpr), die in den Rampen verwendet werden. Um
es durchzuführen:
1)
Die Neuorientierungszeiten ("tr") der zu analysierenden
kleinsten und längsten
linearen DNA-Moleküle werden
in diesem Schritt erfasst, "tr"-Werte, die erzielt werden durch Austauschen
der DNA-Größen solcher Moleküle, des
elektrischen Felds und der Temperatur des Elektrophoresepuffers
in der Gleichung 4.
2) Der Mittelwert der beiden Neuorientierungszeiten
(a einfaches tpr oder tp1)
wird berechnet, wenn es gewünscht
wird, dass DNA-Moleküle
mit einer Größe zwischen
der der größten und
der der kleinsten Moleküle
in einem einzelnen Muster umfasst sein sollen.
3) Eine numerische
Folge an Pulsdauern wird berechnet (tpr).
Sie beginnt mit einer Pulsdauer, die 1,5-mal kürzer ist als die Neuorientierungszeit
des kleinsten Moleküls
und endet mit dem 1,5-fachen der Neuorientierungszeit des größten Moleküls. Lineare
Zunahmen in der Pulsdauer werden in der numerischen Folge des berechneten
tpr verwendet.
4) Um die Elektrophorese
durchzuführen,
könnte
die in Schritt (2) berechnete tp verwendet werden, andererseits
wird die in Schritt (3) berechnete numerische Folge von
tpr verwendet.
- II. Kalkuliere die Gesamtlaufzeit. Die Gesamt-Elektrophoreselaufzeit
wird anhand der Berechnung der Migration des kleinsten linearen
DNA-Moleküls
geschätzt.
Dies wird wie folgt durchgeführt:
1)
Festlegen der Neuorientierungszeit und der Migrationsgeschwindigkeiten
für diesen
Schritt während
und nach der Neuorientierung des kleinsten linearen DNA-Moleküls, der
Werte, die durch Austauschen der DNA-Größe solcher Moleküle erzielt
werden, des elektrischen Felds und der Temperatur des Elektrophoresepuffers
in den Gleichungen 2–3.
Gleichung 1 wird gefüttert
mit den in Schritt 1 geschätzten
Dauern der elektrischen Pulse (tpr). Die
Anfangswerte der Anzahl an Pulsen werden festgelegt.
2) Die
Anzahl an Pulsen jeder Rampe "r" wird um jeweils
einen erhöht,
und jedes Mal wird die Migration des kleinsten Moleküls unter
Verwendung der Gleichungen 1 und 5 geschätzt. Die Schritte werden so
lange wiederholt, bis das Molekül
die Position erreicht, die 0,1 bis 1 cm weit vom unteren Ende des
Minigels entfernt ist.
- III. Unter Verwendung der Gleichungen 1–5 werden die Migrationen der
Moleküle,
deren Auftrennung gewünscht
wird, für
die "n" Rampen berechnet,
und anschließend
werden die sich aus diesen Molekülen
in den Minigelen von MiniCHEF ergebenden Bandenmuster für die Bedingungen,
die für
das elektrische Feld, die Temperatur, die Anzahl von Rampen "r", Dauern der elektrischen Pulse und
Anzahl der Pulsen (Npr) ausgewählt wurden,
vorhergesagt. Diese Berechnung beinhaltet die folgenden Schritte:
1)
Es wird davon ausgegangen, dass die Elektrophorese in einem 1,5
%igen Agarosegel und in 0,5 X TBE-Puffer durchgeführt wird.
2)
Das Datenset für "tr", "vr" und "vm" der zu analysierenden
Moleküle
wird von diesem Schritt erfasst, ebenso das Set an Werten, die durch
Definieren aus den Gleichungen 2–3 erhalten werden, die Größen der
DNA-Moleküle
und das elektrische Feld sowie die Puffertemperatur (die im eigentlichen
Experiment verwendet wird).
3) In Übereinstimmung mit den Werten,
die in den vorhergehenden Schritten geschätzt werden, wird die Gesamtanzahl
der Rampen (n), die Anzahl an Pulsen, die an jede Rampe angelegt
werden (Npr) sowie die Dauer der Pulse in
jeder Rampe (tpr) für die Gleichung 1 definiert.
4)
Mittels der Verwendung der Gleichungen 1–5 werden die Strecken, die
die (wünschenswerter
Weise zu analysierenden) DNA-Moleküle migrieren sollen, für die vorgegebenen
Elektrophoresebedingungen berechnet.
5) Die für die linearen
DNA-Moleküle
berechneten Migrationen werden in einem numerischen oder graphischen
Format dargestellt.
6) Die Schritte 2–5 werden wiederholt, bis das
vorhergesagte Muster die optimale Auftrennung zwischen den linearen
DNA-Molekülen
zeigt.
- IV. Basierend auf den vorhergehenden Ergebnissen wird diejenige
experimentelle Bedingung ausgewählt, welche
die optimale Auftrennung zwischen den linearen DNA-Molekülen ergibt.
-
Das
bevorzugte Mittel zum Umsetzen dieses Verfahrens könnte ein
Computerprogramm sein, welches die Simulation der Auftrennung der
DNA-Moleküle verschiedener
Größen in MiniCHEF
erleichtern würde.
-
Dieses
Programm würde
die optimalen experimentellen Bedingungen für die DNA-Auftrennungen berechnen.
-
Das
Programm würde
ebenso ein schnelles Mittel bereitstellen, um die erwünschten
Berechnungen zum Umsetzen dieses Teils der vorliegenden Erfindung
durchzuführen.
-
Es
wurde ein Programm zum Simulieren der Bandenmuster entworfen. Das
Programm erlaubt dem Anwender die Änderung folgender Variablen:
- 1- Die Größe der DNA-Fragmente
oder der intakten DNA-Moleküle,
deren Auftrennung im Gel gewünscht wird.
- 2- Die Puffertemperatur.
- 3- Die Spannung.
- 4- Die Pulszeit und die Anzahl an elektrischen Pulsen, die an
jede Rampe angelegt werden.
- 5- Die Anzahl der Pulszeitrampen. Sie beträgt zwischen 1 und 1000 Rampen.
Gefüttert
mit den genannten Werten, stellt das Programm die folgenden
-
Ergebnisse
bereit:
- 1- DNA-Molekül-Geschwindigkeiten (in cm/s)
während
und nach der DNA-Neuorientierung.
- 2- Die Neuorientierungszeit jedes DNA-Moleküls (in Sekunden).
- 3- Die Migration jedes Moleküls
im Gel für
die ausgewählte
Laufdauer.
- 4- Die Migration jedes Moleküls
und das Schema des Elektrophoresemusters.
-
Die
graphische Darstellung der Strecken, die lineare DNA-Moleküle unter
den vorgegebenen Elektrophoresebedingungen migrieren sollten, wurde
wie folgt durchgeführt:
- i) Zeichnen eines Minigels mit den gleichen
Ausmaßen
des eigentlichen Minigels und Zeichnen der Wells, in welche die
Proben hypothetisch geladen werden.
- ii) Platzieren von Linien unter jedes Well. Sie würden die
Banden repräsentieren,
die durch DNA-Moleküle verschiedener
Größen nach
der Auftrennung gebildet werden. Jede Linie hat die Breite des Wells.
Diese Linien werden in solchen Abständen von den Wells gezeichnet,
die wiederum den Distanzen entsprechen, welche die DNA-Moleküle in dem
eigentlichen Minigel migrieren würden.
- iii) Jeder Linie oder hypothetischen Bande wird eine Farbe zugewiesen.
Die Farbe variiert mit der Größe der in
der Bande beinhalteten Moleküle.
Dies ist die Verwendung eines Farbcodes, der die Moleküle einer bestimmten
Größe identifiziert.
-
Dieses
Programm begründet
ein Verfahren zum Auswählen
der geeigneten experimentellen Bedingungen, um intakte DNA-Moleküle der Größe eines
Chromosoms oder große
DNA-Fragmente durch Pulsfeld-Gelelektrophorese in der MiniCHEF aufzutrennen.
Wenn das Programm mit bestimmten Werten der experimentellen Variablen
gefüttert
wird, werden unterschiedliche Elektrophoresemuster erzeugt und dies
erlaubt die Identifizierung der experimentellen Bedingungen, welche
die Moleküle
von Interesse in CHEF und MiniCHEF auftrennen. Dieser Ansatz verbraucht
keine Reagenzien oder biologischen Proben. Er basiert auf den theoretischen
Gleichungen, die lineare DNA-Migration in MiniCHEF beschreiben.
Diese Gleichungen wurden unter Verwendung von Migrationsdaten linearer
DNA, erzielt in tatsächlichen
MiniCHEF-Experimenten, angeglichen. Folglich beschreiben sie die
Migration dieser Moleküle,
wenn sie der Elektrophorese ausgesetzt sind, korrekt. Darüber hinaus
erzeugen sie keine anomalen Ergebnisse der Mobilitätsumkehr
im Zentrum des Gels.
-
In
der vorliegenden Erfindung wird die schnelle Mikroorganismen-Typisierung anhand
der elektrophoretischen Auftrennung von DNA in den Miniapparaturen
MiniCHEF und MiniTAFE vorgeschlagen. Die MiniCHEF-Miniapparaturen ergeben
die Bandenmuster in 2,5 bis 5 Stunden, und die MiniTAFE in 5 bis
7 Stunden. Proben von Pseudomonas aeruginosa-, Escherichia coli-
und Staphylococcus aureus-Zellen, präpariert unter Verwendung dieses
Verfahrens und des dazugehörigen
Reagenzkits, werden in die Minigele der Miniapparaturen geladen
und in einer elektrischen Feldintensität von bis zu 20 V/cm in MiniCHEF
oder 22 V/cm in MiniTAFE aufgetrennt.
-
Die
elektrische Feldstärke,
Puffertemperatur, Pulszeitrampen, Elektrophoresezeit und Anzahl
der elektrischen Pulse, die in jeder Rampe gesetzt werden, stammen
aus den Ergebnissen des Simulators (oder dem Verfahren zum Auswählen der
optimalen Bedingungen zum Auftrennen der Moleküle). In einem solchen Fall sollte
die Konzentration des Puffers 0,5 X TBE [1 X TBE-Puffer entspricht
0,089 M Tris-Base, 0,089 M Borsäure und
0,002 M EDTA (Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure)], die
Agarose (Lachema)-Gelkonzentration
hat 1,5 % zu betragen, das elektrische Feld muss bis zu 20 V/cm
sein, die Temperatur muss zwischen 4 und 30°C betragen, und die Kammer hat
die MiniCHEF zu sein. Wenn der Simulator angewandt wird, aber die Verwendung
von MiniTAFE gewünscht
wird, können
die gleichen Bedingungen des elektrischen Felds und der Temperatur,
die durch den Simulator vorgegeben werden, verwendet werden, allerdings
sollte die Anzahl an Pulsen jeder Rampe um 1,5 Mal erhöht werden
und die Dauer der Pulse um den Faktor 1,2.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1. Sterilisierbare
Form für
die Präparation
von Proben-Miniblöckchen.
-
Ein
Beispiel einer zum Sterilisieren geeigneten und aus einem flexiblen
Material (Silikon, Gummi oder jedes andere Material) hergestellten
Form ist im Schema der 1 gezeigt. Die Form wird verwendet,
um in Agarose eingebettete DNA-Proben zu präparieren. Die Platte (1)
weist 49 Vertiefungen (2) auf. Die Agarose-Zell-Suspension
wird auf die Form oder die Platte gegossen und mit dem speziellen
Spatel (4) in der Form verteilt. Anschließend wird
die Platte (1) mit dem Deckel (3) bedeckt, wodurch
die die eingebetteten Zellen enthaltenden Miniblöckchen (5) erzeugt
werden. Die Platte der eigentlichen Form wurde aus geschmolzenem
Silikon hergestellt. Dieses wurde in eine andere Form gegossen,
bis die Platte (1) geformt wurde. Im Beispiel betragen
die Ausmaße
der Miniblöckchen
3 × 3 × 0,7 mm
(Länge,
Breite × Dicke).
Um die Miniblöckchen
(5) aus der Platte (1) herauszulösen, wird
die Platte an ihren Enden gehalten und über einem Gefäß mit einer
Lösung
gebogen. Somit werden die Miniblöckchen
aus der Platte freigesetzt und fallen in die Lösung.
-
In
einer anderen Variante der Form kann die Breite der Vertiefungen
von 1,5 mm bis zur Breite des Minigels variieren, wobei die Dicke
von 0,5 mm bis 1,5 mm variieren kann. Die Anzahl der in die Platte
gestanzten Vertiefungen kann ebenso variieren.
-
Beispiel 2. Nicht-enzymatische
Präparation
von in Agarose eingebetteter intakter DNA aus Pseudomonas aeruginosa,
gewachsen in Bouillon oder auf soliden Medien
-
Zwei
Kolonien von P. aeruginosa wurden von einer Blut-Agar-Platte isoliert.
Eine davon wurde in 5 ml LB-Medium inokuliert (10 g Hefeextrakt,
5 g Natriumchlorid und 10 g Bactotripton pro Liter destilliertem
Wasser), während
die andere auf einer LB-Platte (LB plus 1,2 % bakteriologischem
Agar) ausgestrichen wurde.
-
Beide
Kulturen wurden über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Die Bouillonkultur wurde unter Schütteln inkubiert, während die
Platte wurde statisch gehalten wurde. Die in der Bouillon gewachsenen
Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, während die Platten mit der geeigneten
Waschlösung
(gezeigt in Tabelle I) gewaschen und anschließend durch Zentrifugation geerntet
wurden.
-
Die
in Bouillon oder festen Medien gewachsenen Zellen wurden in der
in Tabelle I gezeigten Lösung gewaschen,
durch Zentrifugation geerntet und mit einer Konzentration von 2 × 109 Zellen pro Milliliter einer 1,5 %-igen
low melting Agarose, gelöst
in 0,15 M NaCl, resuspendiert. Das Agarose-Zell-Gemisch wurde auf
die Platte 11) der in 1 gezeigten
Form gegossen, anschließend
wurde die Platte mit dem Deckel (3) bedeckt, und es wurde
der Agarose erlaubt, fest zu werden, bis die Blöckchen (5) geformt
waren. Die Miniblöckchen wurden
für eine
halbe Stunde bei 50°C
mit NDSUPlus inkubiert. Später
wurden die Miniblöckchen
zweimal für 10
Minuten bei 50°C
in TE-100 gewaschen und in frischem TE-100 bei 4°C gelagert. Vor dem Restriktionsenzymverdau
wurden die Miniblöckchen
gewaschen und für
10 Minuten in Xba I Restriktionsenzympuffer inkubiert. Jedes Miniblöckchen wurde
mit 20 E Xba I für
2 Stunden bei 37°C
verdaut. Die Restriktionsfragmente wurden in der MiniCHEF bei 10
V/cm, 20°C,
1,5 % Agarose und 0,5 X TBE aufgetrennt, wobei eine Pulsrampe von
20, 15, 10,5 und 3 Sekunden bzw. 5, 15, 320, 1020 und 100 Pulse
angelegt wurde.
-
Die
Bandenmuster (26), die in dem MiniCHEF-Minigel (25)
aufgetrennt wurden, sind in 2 dargestellt.
P. aeruginosa-Miniblöckchen
(27) wurden aus Kulturen in Flüssig-LB-Medien präpariert,
während
die Miniblöckchen
(28) aus von LB-Platten stammenden Kulturen präpariert
wurden. Die Größen der
aufgetrennten DNA-Fragmente sind ebenfalls in der Figur dargestellt.
-
Beispiel 3. Nicht-enzymatische
Präparation
von in Agarose ein ebetteter intakter DNA von Staphylococcus aureus,
gewachsen auf festen Medien
-
Eine
Kolonie von S. aureus wurde aus Blut-Agar-Medium isoliert und auf
einer Mueller-Hinton-Platte (Oxoid) ausgestrichen. Die Platte wurde über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Die Plattenoberfläche
wurde mit Waschlösung
(0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, pH 8,0, Tabelle I) abgewaschen und die
Zellen durch Zentrifugation geerntet.
-
Die
in Agarose eingebettete intakte DNA wurde unter Durchführung einer
der zwei folgenden Varianten präpariert:
Variante
1: Die Zellen wurden vor ihrem Einbetten in Agarose-Miniblöckchen inkubiert.
Variante
2: Die Zellen wurden in Agarose-Miniblöckchen eingebettet und anschließend inkubiert.
-
In
beiden Varianten wurden die Zellen durch Präparieren einer Zellsuspension
mit einer Konzentration von 4 × 1010 Zellen/ml in 1,5 %-ige low melting Agarose,
gelöst
in Waschlösung
(Tabelle I) eingebettet. Die Zellsuspension wurde auf die Platte
(1) der in 1 gezeigten Form gegossen, anschließend wurde
die Platte mit dem Deckel (3) bedeckt, und es wurde der
Agarose erlaubt, fest zu werden, bis die Miniblöckchen (5) abgeformt
waren.
-
In
Variante 1 wurden die Zellpellets in 3 ml NDSUPlus resuspendiert
und für
30 Minuten bei 50°C
inkubiert. Anschließend
wurde die Suspension fünffach
in TE-100 verdünnt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Agarose-Miniblöckchen eingebettet.
-
In
Variante 2 wurden die Zellen geerntet, gewaschen und anschließend in
Agarose-Miniblöckchen
eingebettet. Die Agarose-Miniblöckchen
wurden mit NDSUPlus für
eine Stunde bei 50°C
inkubiert.
-
Nach
der Behandlung durch eine der beiden Varianten wurden die Miniblöckchen zweimal
für jeweils 10
Minuten bei 50°C
in TE-100 gewaschen. Vor dem Restriktionsenzymverdau wurden die
Miniblöckchen
gewaschen und mit Sma I Restriktionsenzympuffer für 10 Minuten
auf Eis stehend inkubiert. Jedes Miniblöckchen wurde mit 20 E Sma I
für 2 Stunden
bei 37°C
verdaut. S. aureus-DNA-Makrorestriktionsfragmente,
aufgetrennt im Bandenmuster (31) des Minigels (30),
sind in 3 dargestellt. Miniblöckchen (32)
wurden gemäß Variante 2
präpariert,
während
die (331 durch Variante 1 präpariert
wurden. Laufbedingungen waren 10 V/cm, 20°C, 1,5 % Agarose, 0,5 X TBE
und die Pulsrampen 1, 5, 9, 13, 17 und 21. In sämtlichen Rampen wurden 130
Pulse angelegt. Die Größen der
aufgetrennten DNA-Fragmente sind ebenso in der Figur dargestellt.
-
Beispiel 4. Entwerfen
der Elektrophorese-Laufbedingungen in der MiniCHEF. Festlegen der
experimentellen Bedingungen unter Verwendung des Simulators (Verfahren
zum Auswählen
der optimalen Bedingungen für
die DNA-Auftrennung)
-
Es
wurden die Pulszeitrampen simuliert, die benötigt werden, um S. cerevisiae-Chromosomen
in der MiniCHEF-Kammer mit einem Abstand von 11,6 cm zwischen den
entgegengesetzt gepolten Elektroden aufzutrennen. Ziel war es, ein
Muster zu erhalten, das die von allen S, cerevisiae-Chromosomen
gebildeten 11 Banden darstellt. Für die Elektrophorese wurde
angenommen, dass sie in einem 1,5 %-igen Agarosegel und 0,5 X TBE
als Laufpuffer durchzuführen
ist. Es wurden die durch Goffeau beschriebenen Größenwerte
der S. cerevisiae-Chromosomen
verwendet (Goffeau A. et al., Science, 1996, 274: 546): 230 kb (Chrom.
I), 270 kb (Chrom. VI), 315 kb (Chrom. III), 440 kb (Chrom. IX),
589 kb (Chrom. VIII), 577 kb (Chrom. V), 667 kb (Chrom. XI), 745
kb (Chrom. X), 784 kb (Chrom. XIV), 813 kb (Chrom. II), 924 kb (Chrom.
XIII), 948 kb (Chrom. XVI), 1091 kb (Chrom. VII und Chrom. XV),
1554 kb (Chrom. IV) und 2352 kb (Chrom. XIII.
-
Um
die optimale Auftrennung von S, cerevisiae-Chromosomen in einem
einzigen Muster bei einer Feldstärke
von 10 V/cm und 20°C
zu erreichen, sagte der Simulator vier Pulszeitrampen mit Pulszeiten
von 5, 40, 75 und 1 10 s und 42 Pulse in jeder Rampe voraus. Die
Ergebnisse der Migration, Neuorientierungszeiten, Migrationsgeschwindigkeiten
und des zum Identifizieren der einzelnen Chromosome verwendeten
Farbcodes sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle
II. Unter Verwendung des Simulators erzielte quantitative Ergebnisse.
Größen (kb)
und Farben der S. cerevisiae-Chromosomen gemäß dem Farbcode des Simulators
- D,
experimentell: Strecke, migriert von den Molekülen im Minigel (40)
von 4.
- D, vorhergesagt: Strecke, migriert von den Molekülen, gemäß der Simulator-Vorhersagen
für die
im Experiment von 4 verwendeten Laufbedingungen.
- vr: Migrationsgeschwindigkeit der Moleküle während Neuorientierung.
- vm: Migrationsgeschwindigkeit der Moleküle nach Neuorientierung.
- tr: Neuorientierungszeit der Moleküle.
-
Die
Photographie des eigentlichen Minigels (40) mit den Bandenmustern
der Chromosomen von S. cerevisiae 196-2 (41), die im MiniCHEF
bei den vom Simulator vorhergesagten Bedingungen erhalten werden, ist
in 4 gezeigt. Das Bandenmuster, simuliert
im hypothetischen Minigel (42) und dargestellt durch den
Simulator, ist ebenfalls gezeigt. Beide Muster sind ähnlich.
In Agarose eingebettete intakte DNA-Moleküle von S. cerevisiae 196-2,
aufgetrennt im eigentlichen Experiment, wurden unter Immobilisieren
von Zellen in Agaroseblöckchen
präpariert.
Die Blöckchen
wurden nacheinander inkubiert mit LETK (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 600
mM KCl, pH 7,5) für
4 Stunden, NDS (10 mM Tris, 500 mM EDTA, 1 % Sarkosyl, pH 9,5) für 2 Stunden und
NDS plus 4 M Harnstoff (NDSU) für
2 Stunden (López-Cánovas
L. et al., Anal. Lett. 1996, 29:12, 2079–2084).
-
Das
Flussdiagramm eines Teils des in dieser Erfindung offenbarten Simulators
ist in 5 dargestellt. Das Berechnungsverfahren
zum Schätzen
der Pulsrampen ist in diesem Flussdiagramm dargestellt.
-
Das
Kriterium zum Beenden der Zunahme in der Anzahl der Pulse ist die
Anzahl der Pulsen, die das kleinste Molekül veranlassen, 2,5 cm weit
zu migrieren.
-
Schließlich stellt
der Simulator die Ergebnisse bereit, die der Anwender im Gel für die durch
das Programm berechneten und auf die vom Anwender bestimmten Molekülgruppen
angewandten Pulszeitrampen, beobachten sollte (siehe die eigentlichen
Bandenmuster im Minigel 43 und die simulierten im hypothetischen Minigel
42 von 4). Das Programm liefert ebenso
quantitative Daten. Dieser Teil des Diagramms ist nicht dargestellt,
da die Lösung
trivial ist.
-
Beispiel 5. MiniCHEF-Typisierung
von Escherichia coli-Isolaten
-
Eine
einzelne Kolonie von jedem Isolat (INN3 und INN7), auf phänotypischem
Niveau als Escherichia coli charakterisiert, wurde von Blut-Agar-Platten entnommen.
Anschließend
wurden sie in 5 ml LB-Medium (10 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid,
10 g Bactotripton pro Liter destilliertem Wasser) subkultiviert.
Jede Kultur wurde über
Nacht bei 37°C
unter Schütteln
inkubiert.
-
Die
Zellen jeder Kultur wurden gewaschen (siehe Waschlösung in
Tabelle I), zentrifugiert und das Pellet in einem Verhältnis von
2 × 109 Zellen pro Milliliter in 1,5 %-iger low
melting point Agarose, gelöst
in 0,15 M NaCl, resuspendiert. Jedes Agarose-Zell-Gemisch wurde
auf die Platte (1) der in 1 gezeigten
Form gegossen. Die Platte wurde mit dem Deckel (3) bedeckt,
und es wurde der Agarose ermöglicht,
auszuhärten,
bis die Miniblöckchen
abgeformt waren (51). Beide Gruppe von Miniblöckchen wurden
mit NDSUPlus für
eine halbe Stunde bei 50°C
inkubiert. Anschließend
wurden die Miniblöckchen
gewaschen und für
10 Minuten mit Xba I Restriktionsenzymverdaupuffer inkubiert und
jedes Miniblöckchen
wurde mit 20 E Xba I für
2 Stunden bei 37°C
verdaut.
-
Die
im Minigel (86) der MiniCHEF aufgetrennten Bandenmuster
(87) sind in 6 dargestellt.
Die in der MiniCHEF erzielten Auftrennungen der Xba I verdauten
Gesamt-DNA der INN3 (88) und INN7 (89) E. coli-Isolate
erlaubten die Identifizierung von sechs gemeinsamen Fragmenten (90).
Anschließend
wurden in Übereinstimmung
mit Tenover (Tenover F. et al., J. Clin. Microbiol. 1995, 33:9,
2233–2239)
INN3- und INN7-Isolate als zwei verschiedene E. coli-Subtypen klassifiziert.
Die DNA-Restriktionsfragmente wurden in der MiniCHEF bei 10 V/cm,
20°C, 1,5
% Agarose und 0,5 X TBE unter Anlegen von Pulsrampen mit 25, 20.
15 und 5 Sekunden bzw. 35, 40, 50, 140 und 800 Pulsen aufgetrennt.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN:
-
1.
Schema der Formen zum Gießen
der Miniblöckchen.
Die Platte mit den ausgestanzten Vertiefungen zum Hineingießen der
Agarose-Zell-Suspension, ist unten in der Figur gezeigt. Oben sind
der Deckel der Form und ein Miniblöckchen dargestellt. Ebenso
ist rechts der Spatel zum Verteilen der Agarose-Zell-Suspension
gezeigt.
-
2. Bandenmuster, erzielt in der MiniCHEF
für die
Xba I-Makrorestriktions-DNA-Fragmente
von P- aeruginosa. Links wurden P. aeruginosa-Miniblöckchen aus
Zellen präpariert,
die in flüssigem
LB-Medium gewachsen waren, während
rechts die Miniblöckchen
aus Zellen präpariert
wurden, die auf LB-Platten gewachsen waren. MiniCHEF wurde bei 10
V/cm, 20°C,
1,5 % Agarose und 0,5 X TBE verwendet und es wurden Pulsrampen mit
20, 15, 10, 5 und 3 Sekunden bzw. 5, 15, 320, 1020 und 100 Pulsen
angelegt.
-
3. Bandenmuster, das sich aus MiniCHEF
für Sma
I-Makrorestriktions-DNA-Fragmente
von S. aureus ergibt. Links sind Bandenmuster von Proben gezeigt,
die durch Inkubieren der Zellen enthaltenden Miniblöckchen mit
NDSUPlus präpariert
wurden. Rechts sind Bandenmuster von Proben gezeigt, die durch Inkubieren
der Zellen mit NDSUPlus und anschließendem Einbetten derselben
in Agarose-Miniblöckchen
präpariert
wurden. In beiden Probenpräparationen
wurden die Zellen auf Platten kultiviert. Laufbedingungen waren 10
V/cm, 20°C,
1,5 % Agarose, 0,5 X TBE, Pulszeiten von 1, 5, 9, 13, 17 und 21.
In jeder Rampe wurden 130 Pulse angelegt.
-
4. Photographie des eigentlichen MiniCHEF-Minigels
(40), welches zum Erzeugen eines Bandenmusters von S, cerevisiae
196-2-Chromosomen (links) verwendet wurde und Graphik des durch
den Simulator (rechts) vorausgesagten hypothetischen Minigels (42).
Die eigentliche Elektrophorese wurde unter den vom Simulator vorhergesagten
Bedingungen durchgeführt.
Immobilisierte DNA-Moleküle
von S. cerevisiae 196-2, die in in diesem Elektrophoreselauf analysiert
wurden, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben präpariert. Für die elektrische Feldstärke von
10 V/cm und 20°C
Puffertemperatur betrugen die vom Simulator vorhergesagten Laufbedingungen
vier Pulsrampen von 5, 40, 75 und 110 Sekunden und 42 Pulsen in
jeder Rampe. Die Migrationsdaten und der zum Identifizieren der
Größen der
Moleküle
verwendete Farbcode sind in Tabelle II dargestellt.
-
5. Flussdiagramm des Verfahrens zum Simulieren
der DNA-Bandenmuster
in den Minigelen der MiniCHEF. Die folgenden Parameter und Variablen
wurden im Diagramm verwendet: DNA-Größe (kb), DNA-Neuorientierungszeiten
(tr), DNA-Migrationsgeschwindigkeit während Neuorientierung (vr)
und nach Neuorientierung (vm) in der MiniCHEF. Darüber hinaus,
tpr: Pulszeit in jeder Rampe, Npr: Anzahl der Pulse in jeder Rampe, g0-,
g1-. g2-. g3-. g4-Koeffizienten, erzielt, um die Viskosität (η) als Funktion
der experimentellen Temperatur (T) zu beschreiben,. Dt: theoretische
Strecke, vorhergesagt durch das Verfahren, n: Anzahl der Rampen,
E: elektrisches Feld, L: DNA-Konturlänge, bp: Basenpaare, Q: DNA-Netzspannung.
-
6. MiniCHEF-Typisierung von INN3- und
INN7- E.coli-Isolaten nach Xba I-Restriktionsverdau ihrer DNA-Moleküle. Es wurde
das Verfahren und das dazugehörige
Reagenzkit zum Präparieren
der Proben verwendet. Laufzeitbedingungen waren: 10 V/cm, 20°C, 1,5 %
Agarosegel und 0,5 X TBE, angelegte Pulsrampen von 25, 20, 15, 10
und 5 Sekunden bzw. 35, 40, 50, 140 und 800 Pulsen. Die Punkte (90)
markieren die Restriktionsfragmente, die beide Isolate gemeinsam
haben.
-
VORTEILE DER OFFENBARTEN
LÖSUNGEN
-
- 1- Präparation
intakter DNA-Moleküle
von Mikroorganismen, eingebettet in dünne Miniblöckchen eines beliebigen Gels,
ist mit einem Zeitaufwand von 5 Minuten bis zu 1 Stunde auszuführen. Die
Präparation
erfordert keine Verwendung von Enzymen und ist folglich schnell
und mit geringen Kosten durchzuführen.
- 2- Nicht-enzymatische Präparation
von DNA-Proben für
PFGE ist effizient unter Verwendung von Zellen, die in flüssigen oder
festen Medien kultiviert wurden. Einige Zelltypen können vor
ihrem Einbetten in den nicht-enzymatischen Lösungen inkubiert werden. Diese
Modifikation reduziert die Zeit, die zum Präparieren der Proben nötig ist.
- 3- In Gel eingebettete DNA-Moleküle, präpariert durch die offenbarte
Vorgehensweise, sind frei von Restriktionsendonuklease-Inhibitoren.
Diese Moleküle
werden durch Restriktionsenzyme in 2 Stunden verdaut und liefern
in den in Miniapparaturen durchgeführten Pulsfeld-Gelelektrophorese-Experimenten
dadurch ihre typischen Bandenmuster.
- 4- Es wurden Miniblöckchen
homogener Größe erzeugt,
die immobilisierte DNA von Mikroorganismen enthalten und daher vor
der Elektrophorese nicht geschnitten werden müssen. Identische Miniblöckchen gewährleisten
die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
- 5- Die Bandenmuster können
vor der Durchführung
der Experimente im Computer so oft wie nötig simuliert werden. Die Simulation
erlaubt das Auswählen
des elektrischen Felds, der Temperatur sowie der Pulszeitrampen,
die zur besten Auftrennung zwischen den Molekülen führt, ohne Unkosten durch Reagenzien
und biologische Proben zu erzeugen.
- 6- Die Auswahl der Pulsrampen wird mithilfe eines Verfahrens
durchgeführt,
das auf Gleichungen basiert, welche die Migration der DNA-Moleküle in den
CHEF-Minigelen beschreiben. Anschließend liefert das Verfahren
zum Auswählen
der Rampen das Bild des optimalen Auftrennungsmusters der Moleküle.
- 7- Die hierin offenbarte Vorgehensweise spart Zeit, chemische
Reagenzien und biologische Proben.
- 8- Bereitgestellt wird ein Reagenzki zum Vereinfachen der Präparation
intakter DNA aus Mikroorganismen.
