ES2268776T3

ES2268776T3 - Neoglicoproteinas.

Info

Publication number: ES2268776T3
Application number: ES98924125T
Authority: ES
Inventors: Rudolf Duthaler; Andreas Katopodis; Willy Kinzy; Reinhold Ohrlein; Gebhard Thoma
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: CA2284729A1; DE69835201T2; CN1252807A; EP0970114A1; JP3474583B2; JP2001500528A; US6723831B2; EP0970114B1; DE69835201D1; CN1185253C; IL132156A0; WO1998047915A1; US20020164347A1; ATE332918T1; AU7643998A; PT970114E; US6399071B1; AU733282B2

Abstract

Conjugados de poliamidas que comprenden (a) un grupo xenoantigénico; o (b) un grupo biológicamente activo y una entidad macromolecular, macroscópica o microscópica, unida al esqueleto de poliamida, procedimientos para su preparación y el uso de estos conjugados en composiciones terapéuticas

Description

Neoglicoproteínas.

La presente invención se relaciona con novedosos conjugados de poliamida, procesos para su preparación y el uso de estos conjugados en composiciones terapéuticas.

La escasez creciente de donantes de órganos para transplantes de humano a humano ha conducido a un gran interés en las posibilidades de los xenotransplantes (transplante de no-humano a humano). En la presente investigación se fija la atención en animales accesibles fácilmente, tal como cerdos, como la fuente de órganos. Sin embargo, el xenotransplante de cerdo a humano tiene que vencer una serie de obstáculos, el más inmediato y notable de ellos es el rechazo hiperagudo (HAR). El HAR se causa por anticuerpos policlonales pre-fabricados "natural" que son en su mayoría dirigidos contra epitopes de la superficie celular de carbohidratos que contienen estructuras Gal \alpha1, 3Gal terminal (anti-\alphaGal). En adición, otros anticuerpos también pueden ser dirigidos contra las estructuras de ácido neuramínico N-glicolil también presentes en el endotelio del cerdo.

Para alcanzar la supervivencia a largo plazo del injerto, son necesarias estrategias que dirigen los anticuerpos xenoreactivos. Un acercamiento se extrae de los anticuerpos mediante la inyección de ligandos de alta afinidad que pueden actuar como inhibidores de la deposición del anticuerpo sobre el tejido transplantado. Otro acercamiento es la inmunoaféresis, un desarrollo posterior de plasmaféresis, un procedimiento establecido clínicamente similar a la diálisis. La inmunoaféresis involucra el tratamiento extracorporal de la sangre primero por la separación de las células sanguíneas, luego se pasa el plasma a través de columnas de inmunoafinidad, re-mezclando las células sanguíneas con el plasma agotado de anticuerpos y volviendo a introducir la sangre en el paciente.

Los conjugados portadores de péptidos son comúnmente utilizados como inmunógenos o como antígenos de ensayo. Por ejemplo, WO92/22318A1 revela los péptidos que contienen únicamente un solo residuo de lisina que tiene una cadena lateral bromoacetilada, que pueden ser utilizados para adherir el péptido a cualquier tiol que contiene el compuesto, por ejemplo grupos antigénicos tal como péptidos, azúcares o macromolecular como polímeros.

De esa manera, hay una necesidad de ligandos capaces de unir de manera intracorporal y para el material de una columna capaz de unir de manera extracorporal los anticuerpos xenoreactivos policlonales con afinidad mejorada.

La presente invención se relaciona con un conjugado de poliamida que comprende un grupo xenoantigénico; unido a un esqueleto de poliamida

en donde el esqueleto de poliamida comprende al menos un elemento estructural de fórmula Iaa

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en la cual -Y-R^{03a} es un grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve o Vf.

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El conjugado de poliamida puede comprender adicionalmente al menos un elemento estructural de fórmula II, y una entidad macromolecular o macroscópica unida al esqueleto de poliamida vía y' del elemento estructural de fórmula II.

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en la cual

A' es un grupo de puente trivalente;

R^{1}' es un enlace directo o alquiloeno C_{1}-C_{6};

X^{1}' es -C(O)O-, -C(O)NR-, -NR-, -S- o -O-;

R^{2}' es un enlace directo o un grupo de puente bivalente;

X^{2}' es un enlace directo o -O- o -NR-; en donde R es hidrógeno, OH, alquilo C_{1}-C_{12}, alquenil C_{2}-C_{12}, cicloalquilo C_{3}-C_{8}, cicloalquenil C_{3}-C_{8}, heterocicloalquilo C_{2}-C_{7}, heterocicloalquenil C_{2}-C_{11}, aril C_{6}- o C_{10}, heteroaril C_{5}-C_{9}, aralquilo C_{7}-C_{16}, aralquenil C_{8}-C_{16} con alquenileno C_{2}-C_{6} y aril C_{6}- o C_{10}, o di-aril C_{6}- o C_{10}-C_{1}-C_{6}-alquilo; y

Y' es un enlace directo o un grupo de puente bivalente; con la condición de que X^{1}' no sea -NR-, -S- o -O- cuando R^{1}' es un enlace directo.

Cuando el esqueleto de poliamida de la invención comprende más de un elemento estructural de fórmula Iaa y opcionalmente II, estos elementos pueden ser idénticos o diferentes. Pueden ser homopoliméricos o copoliméricos, o adicionalmente copoliméricos que tienen unidades de comonómero de por ejemplo otros ácidos aminocarboxílicos. Los esqueletos copoliméricos pueden ser bloqueados o polímeros estadísticos. Cuando el grupo de puente trivalente es quiral, los esqueletos de poliamida homogéneamente pueden tener la configuración L- o D- o contener elementos estructurales de ambas configuraciones, como bloques homogéneos o como mezclas estadísticas que incluyen racematos (mezclas 1:1).

La suma media de los elementos estructurales del esqueleto de poliamida [n] puede estar en el rango desde 10 a 10,000, preferiblemente desde 50 a 1,500, más preferiblemente desde 250 a 1,200, más preferiblemente desde 900 a 1200. La polidispersidad puede oscilar entre 1.001 a 2.0, preferiblemente entre 1.1 a 1.5, más preferiblemente entre 1.15 a 1.2.

Cualquier radical o fracción alquilo y alquileno puede ser lineal o ramificada. Preferiblemente el alquilo es alquilo C_{1}-C_{18}, más preferiblemente alquilo C_{1}-C_{4}, y puede ser por ejemplo metil, etil, n- o i-propil, o n-, i- o t-butil. Preferiblemente el alquenil puede contener de 2 a 7 átomos de C. El aril o heteroaril puede ser un anillo de 5 o 6 miembros o un radical bicíclico de dos anillos fundidos, uno o más heteroátomos seleccionados del grupo de átomo O-, N- y S- están presentes en el heteroaril. Ejemplos incluyen fenil, naftil, furanil, pirrolil, etc. El aralquilo preferiblemente tiene de 7 a 12 átomos de C y puede ser fenil- alquilo C_{1}-C_{6}, por ejemplo bencil o fenetil. Un ejemplo para aralquenil es cinnamil.

A' puede ser un átomo solo con al menos tres valencias, por ejemplo C, N o Si; en particular

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en donde R^{aa} es H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenil C_{2}-C_{6}, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, fenil o bencil.

R^{2}' como un grupo de puente bivalente puede contener de 1 a 35, preferiblemente de 1 a 20, particularmente de 1 a 16 átomos de C, por ejemplo alquiloeno C_{1}-C_{35}, alquenileno C_{2}-C_{8}, alquinileno C_{2}-C_{8}, cicloalquiloeno C_{3}-C_{12}, arileno C_{6}-C_{10} o aralquiloeno C_{7}-C_{35} en donde los radicales o fracciones de alquileno, alquenileno y alquinileno pueden ser interrumpidos por uno o más grupos seleccionados de -O-, -S-, -C(O)-, -SO_{2}- y -HN-.

El grupo puente R^{2}' puede, por ejemplo, conformar la fórmula III

(III)-R^{5}-X^{5}-R^{6}-X^{4}-R^{7}-

en la cual

cada uno de X^{5} y X^{4}, independientemente, es un enlace directo, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -SO_{2}O-, -OSO_{2}-, -OSO_{2}O-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH-, -NHC(O)NH-, -NHSO_{2}-, -SO_{2}NH-, -NHSO_{2}O-, -OSO_{2}NH- o -NHSO_{2}NH-;

cada uno de R^{5} y R^{7}, independientemente, es un enlace directo, alquiloeno C_{1}-C_{20}, C_{5}- o C_{6}-cicloalquiloeno, C_{6}-Cloarileno o aralquiloeno C_{7}-C_{l2}; y

R^{6} es un enlace directo o alquiloeno C_{1}-C_{20} que es opcionalmente interrumpido por uno o más, preferiblemente 2 átomos de O; con la condición de que cuando R^{6} sea un enlace directo X^{4} sea también un enlace directo.

Preferiblemente R^{2}' puede ser oxialquiloeno o poloxialquiloeno, más preferiblemente que tiene de 2 a 4 átomos de C, particularmente 2 o 3 átomos de C, en el alquileno y de 2 a 20, preferiblemente de 2 a 10, unidades de alquileno, especialmente oxipropileno y polioxipropileno, por ejemplo polioxipropileno que tiene de 2 a 20 preferiblemente de 2 a 10, unidades de oxipropileno.

Un conjugado de poliamida que comprende un grupo xenoantigénico y una entidad no macromolecular, macro-o microscópica a partir de este momento será referido como un "conjugado Tipo I" y un conjugado de poliamida que comprende un grupo xenoantigénico y una entidad macromolecular o macroscópica a partir de este momento será referido como un "conjugado Tipo II".

En los conjugados Tipo I el grupo xenoantigénico se conjuga al esqueleto de poliamida vía Y de un elemento estructural de fórmula I^{aa}. Los conjugados Tipo I pueden comprender uno o más grupos xenoantigénicos idénticos o diferentes.

Un grupo xenoantigénico puede ser cualquier grupo identificable por métodos conocidos, por ejemplo como se revela en US 5, 695,759, que comprende los xenoanticuerpos aislados de sangre humana por perfusión de la sangre sobre material heterólogo injerto, por ejemplo la extracción de anticuerpos unidos del injerto heterólogo y utilizando aquellos anticuerpos para seleccionar los epitopes candidatos, por ejemplo por un inmunoensayo apropiado.

Preferiblemente, el grupo xenoantigénico puede ser derivado de un oligosacárido que termina con una Dgalactopiranosa \alpha-ligada o un N-glicol-ácido neuramínico en su terminal reductor.

Típicamente (y con respecto a los conjugados Tipo I y II) el oligosacárido puede consistir desde 1 a 20, preferiblemente 1 a 15, particularmente 1 a 10 monómeros de azúcar seleccionados de los monómeros de azúcar que ocurren naturalmente y modificados. Alguien de habilidad es familiar con los monómeros de azúcar y oligosacáridos que ocurren naturalmente y modificados que comprenden estos monómeros de azúcar de los trabajos estándar de química orgánica o bioquímica, por ejemplo los Reportes Periódicos de Especialistas editados en el inicio por The Chemical Society y ahora por The Royal Society of Chemistry London, por ejemplo Ferrier et al. Carbohydrate Chemistry 29 The Royal Society of Chemistry London (1997).

Ejemplos de monómeros de azúcar incluyen D- y L-aldopiranosas y D- y L-aldofuranosas, por ejemplo gliceraldehído, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, allosa, altrosa, glucosa, mannosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa, D- y L-ketopiranosas y D- y L-ketofuranosas, por ejemplo dihidroxiacetona, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa, y también D- y L-diketopiranosas, por ejemplo pentodiulosa y hexodiulosa.

El término monómeros de azúcar también incluye aquellos monómeros de azúcar que son modificaciones de los ejemplos listados, por ejemplo, desoxiosa protegida, parcialmente protegida o desprotegida de las D- y L-configuraciones, preferiblemente 2-, 3-, 4-, 5- y 6-deoxialdosas, tal como fucosa, ramnosa y digitoxosa, 1,2-dideoxialdosas, tal como glucal, galactal y fucal, y 1-, 3-, 4-, 5- y 6-deoxiquetosas, 2-, 3-, 4-, 5- y 6-desoxiaminoazúcares de las D y L configuraciones, tal como glucosamina, mannosamina, galactosamina y fucosamina, y deoxi-acilaminoazúcares, tal como N-acilglucosamina, N-acilmannosamina, N-acilgalactosamina y N-acil-fucosamina, preferiblemente sus ésteres alquilo C_{1}-C_{4}. En adición, estas modificaciones se entienden por significar ácidos aldónicos, aldáricos y urónicos, tal como ácido glucónico o ácido glucurónico, y también ácido ascórbico y monómeros de azúcar que tienen un ácido amino. Los monómeros de azúcar modificados también se entienden por significar aquellos que tienen una cadena de carbono la cual es mayor de 6 átomos de C, tal como heptosas, octosas, nonosas, heptulosas, octulosas y nonulosas, y también sus representantes que son sustituidos en conformidad con el criterio de los listados arriba, tal como ácido ketodeoxioctánico, ácido ketodeoxinonánico, ácidos N-acilneuramínicos y ácidos N-acilmuraminico.

Si dos, tres, cuatro o cinco de los monómeros idénticos o diferentes, mencionados anteriormente se ensamblan a los sacáridos resultantes se indican como di-, tri-, tetra- o pentasacáridos. El enlace es preferiblemente \alpha-O-glucosídico o \beta-O-glucosídico, por ejemplo enlaces (1\rightarrow2)-, (1\rightarrow3)-, (1\rightarrow4)-, (1\rightarrow5)-, (1\rightarrow6)-, (2\rightarrow3)- y (2\rightarrow6)-glucosídico. Ejemplos de disacáridos son por ejemplo trehalosa, soforosa, coibiosa, laminaribiosa, maltosa, cellobiosa, isomaltosa, gentibiosa, sucrosa y lactosa, y sus derivados. Ejemplos de trisacáridos son raffinosa y melicitosa. Adicionalmente, los oligosacáridos pueden ser ligados vía enlaces S-, N- y C-glucosídico, por ejemplo -S-, -NR^{12}-, -NR^{12}C(O)- o
-CR^{13}R^{14}-, en donde R^{12}, R^{13} y R^{14} independientemente de cada otro son H, alquilo C_{1}-C_{12}, cicloalquilo C_{5}- o C_{6}, o cicloalquilometil C_{5}-C_{6} o -etil, fenil, bencil o fenetil.

De acuerdo con la invención el esqueleto de poliamida adicionalmente puede comprender al menos un elemento estructural de fórmula VIb

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Más preferidos son los conjugados Tipo I que comprenden al menos un elemento estructural de fórmula Iaa en donde -Y^{R03a} es un grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve o Vf y al menos un elemento estructural de fórmula VIb.

En los conjugados Tipo I novedosos el contenido de los elementos estructurales de fórmulas Iaa y VIb pueden estar por ejemplo entre 0.1 a 99.9 mol %, los valores adicionados al 100% en el caso de los conjugados Tipo I que consisten únicamente de elementos estructurales de fórmulas Iaa y VIb. En el caso de elementos estructurales de fórmula Iaa el contenido por ejemplo puede estar dentro de 1 a 50%, preferiblemente de 10 a 30%. En el caso de los elementos estructurales de fórmula VIb el contenido puede estar dentro de 0 a 99%, preferiblemente de 70 a 90%.

Los conjugados Tipo I preferidos son aquellos en donde la suma media de elementos estructurales [n] está en el rango desde 200 a 300 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2 y la relación de los elementos estructurales de fórmula laa [x] está entre 5 a 30% o aquellos en donde [n] está en el rango desde 900 a 1200 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2 y [x] es 5 a 50%; con una relación de elementos estructurales de fórmula VIb [z] fluctuando entre 45 a 94%; siendo R^{03a}-Y- idéntico o diferente y seleccionado de los grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve y Vf.

Ejemplos de conjugados Tipo I preferidos son aquellos en donde

(a): n es 250, [x] es 25% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vb; + 75% [z];

(b): n es 250, [x] es 8% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 92% [z];

(c): n es 250, [x] es 16% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 84% [z];

(d): n es 250, [x] es 41% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 59% [z];

(e): n es 250, [x] es 61% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 39% [z];

(f): n es 250, [x] es 2% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vd; + 77% [z];

(g): n es 250, [x] es 22% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vf; + 78% [z];

(h): n es 1000, [x] es 24% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 76% [z];

(i): n es 1050, [x] es 21% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vb; + 79% [z];

(j): n es 1050, [x] es 28% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vc; + 72% [z];

(k): n es 1050, [x] es 25% cuando R^{3a}-Y- es un grupo de fórmula Vf; + 75% [z]; y

(l): n es 1050, [x] es 27% cuando R^{3a}-Y- en un tercer de los elementos estructurales de fórmula Iaa es un grupo de fórmula Vb, en otro tercer es un grupo de fórmula Vc y en un otro tercer es un grupo de fórmula Vf; + 73% [z]; particularmente los ejemplos (i) a (I).

Los conjugados Tipo I novedosos se obtienen por un proceso que comprende la reacción de una poliamida que comprende al menos un elemento estructural de fórmula VII

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en la cual X^{3} es halógeno, obtenible por ejemplo como se revela en WO 97/19105, con un tiol de fórmula VIIIa'

(VIIIa'),R^{3a}-Y-SH

en la cual R^{3a} -Y es como se define anteriormente.

Los tioles son conocidos o pueden ser preparados en conformidad con métodos conocidos, por ejemplo por la reacción de un xenoantígeno aminofuncionalizado, por ejemplo el oligosacárido, con una tiolactona.

Cuando el xenoantígeno es un sacárido se puede preparar de acuerdo con procedimientos químicos convencionales, utilizando enzimas o siguiendo con un acercamiento mixto. El uso de enzimas para la preparación de derivados de oligosacáridos se revela por ejemplo en WO 97/28173 y WO 97/28174.

Los conjugados Tipo I que adicionalmente comprenden al menos un elemento estructural de fórmula VIb se obtienen mediante un proceso que comprende la reacción de una poliamida que comprende al menos dos elementos estructurales de fórmula VII, con uno o más compuestos seleccionados del grupo de un tiol de fórmula VIIIa' y un tiol de fórmula IX

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Preferiblemente la reacción puede ser realizada en la presencia de una base, no-nucleofílica, fuerte preferiblemente una base orgánica que tiene al menos un átomo de N terciario; particularmente aminas bicíclicas o policíclicas. Ejemplos son la quinuclidina y el 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-ene (1,5-5) (DBU). La base puede ser empleada en al menos cantidades equimolares, preferiblemente en leves excesos.

La reacción también se puede realizar utilizando tiolatos del metal alcalino R^{3a}SM en donde M es un metal alcalino, por ejemplo Li o Na.

Un solvente, aprótico, preferiblemente, una carboximida nitrógeno-dialquilado, lactama, sulfóxido o sulfona, por ejemplo, puede ser utilizada la dimetilformamida. La reacción se puede efectuar sin o con la adición de agua, por ejemplo hasta las cantidades en las cuales el polímero permanece en solución. Los detalles no-limitados para la preparación de los conjugados Tipo I se revelan en los Ejemplos A a C1.

Los conjugados Tipo I novedosos tienen interesantes propiedades. En particular tienen afinidad por anticuerpos xenoreactivos policlonales humanos presentes en los fluidos corporales, por ejemplo sangre, y son útiles como ligandos o agentes de depleción. Preferiblemente los conjugados Tipo I se utilizan para la depleción intracorporal de xenoanticuerpos, que comprende la administración, por ejemplo por inyección, infusión o perfusión, en un recipiente de injerto heterólogo previo a y/o después del transplante del injerto heterólogo de un conjugado Tipo I. La dosificación puede ser desde 0.0001 a 10, preferiblemente desde 0.01 a 5, más preferiblemente desde 0.2 a 2 mg por kg de peso corporal por inyección. La administración puede ser repetida como sea antes del transplante y/o después del transplante mientras que el retiro de anticuerpos sea de ventaja terapéutica.

Los conjugados Tipo I novedosos también pueden ser utilizados como un medicamento para inducir la tolerancia o anergia hacia los epitopes xenoantigénicos o para apuntar específicamente a las células B con los receptores xenoantigénicos. Cuando se administran, por ejemplo por inyección, en un recipiente de injerto heterólogo previo al transplante del injerto heterólogo la dosificación de un conjugado Tipo I puede ser desde 0.0001 a 10, preferiblemente desde 0.001 a 5, más preferiblemente desde 0.02 a 2 mg por kg de peso corporal por inyección. La administración puede ser repetida según se requiera para alcanzar la tolerancia.

Los conjugados Tipo I pueden ser administrados como un solo conjugado o como una mezcla de diferentes conjugados Tipo I tal como o en la forma de una composición adaptada para administración intravenosa, por ejemplo juntos con uno o más excipientes o diluentes farmacéuticamente aceptables por esto. Tal mezcla puede comprender conjugados Tipo I que difieren con respecto al esqueleto de poliamida y/o al grupo xenoantigénico.

Preferidas son las composiciones en donde el conjugado Tipo I comprende grupos xenoantigénicos o composiciones idénticas o diferentes que comprenden una mezcla de conjugados Tipo I, cada conjugado que comprende grupos xenoantigénicos idénticos o diferentes, siendo los grupos xenoantigénicos derivados de un disacárido, preferiblemente un grupo de fórmula Vb, de un trisacárido, preferiblemente un grupo de fórmula Vc o Vd, o de un pentasacárido, preferiblemente un grupo de fórmula Ve o Vf. Preferiblemente la composición puede comprender un conjugado Tipo I que comprende un grupo derivado de un disacárido, un grupo derivado de un trisacárido y un grupo derivado de un pentasacárido, en una relación desde 5 a 0.1 : 5 a 0.1 : 5 a 0.1, preferiblemente en una relación de 1:1:1 o una mezcla de conjugados Tipo I cada conjugado que comprende los grupos xenoantigénicos idénticos, siendo los grupos xenoantigénicos derivados de un disacárido, un trisacárido o un pentasacárido, los conjugados están presentes en la composición en una relación desde 5 a 0.1 : 5 a 0.1 : 5 a 0.1, preferiblemente en una relación de 1:1:1.

En conformidad con lo anterior la presente invención además provee:

(a): un conjugado Tipo I para utilizar como un medicamento, preferiblemente como un agente de eliminación de xenoanticuerpos a partir del fluido corporal humano o como un ligando para presentar el xeno-antígeno en la inducción de tolerancia o anergia;

(b): un método de eliminación de anticuerpos xenoantigénicos de un recipiente de injerto heterólogo, método que comprende el contacto de manera intracorporal de dicho fluido corporal con un conjugado Tipo I como debajo de (a);

(c): un método para inducir la tolerancia o anergia hacia los epitopes xenoantigénicos o para apuntar específicamente a las células B con los receptores xenoantigénicos en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, método que comprende la administración, por ejemplo por inyección, infusión o perfusión, en un recipiente de injerto heterólogo previo a y/o después del transplante del injerto heterólogo de una cantidad efectiva de un conjugado Tipo I como debajo de (a);

(d): una composición que comprende un conjugado Tipo I como debajo de (a) o una mezcla de tales conjugados Tipo I como se revela más arriba para utilizar preferiblemente en un método de eliminación de xenoanticuerpos a partir del fluido corporal humano o para inducir la tolerancia o anergia hacia los epitopes xenoantigénicos o para apuntar específicamente a las células B con receptores xenoantigénicos.

En los conjugados Tipo II el grupo xenoantigénico se conjuga al esqueleto de poliamida vía Y de un elemento estructural de fórmula Iaa y la entidad macromolecular o macroscópica se conjuga al esqueleto de poliamida vía Y' de un elemento estructural de fórmula II. Los conjugados Tipo II pueden comprender uno o más grupos xenoantigénicos idénticos o diferentes. Los conjugados Tipo II puede comprender una o más entidades macromoleculares, macro- o microscópicas idénticas o diferentes. Una sola entidad puede ser unida a una o simultáneamente a 2 o más elementos estructurales a partir del mismo esqueleto de poliamida. Alternativamente una sola entidad puede ser simultáneamente unida a uno o más elementos estructurales de esqueletos de poliamida diferentes.

Los conjugados tipo II pueden además comprender uno del grupo activo biológicamente más idéntico o diferente, por ejemplo derivado de radicales de alcaloides, carbohidratos, vitaminas, péptidos, proteínas, proteínas conjugadas, lípidos, terpenos, oligonucleótidos, antígenos y anticuerpos; o cualquier otro ligando, que preferiblemente se reconoce en una forma multivalente por su receptor o una superficie celular. Preferiblemente el grupo activo biológicamente se deriva de un antígeno, preferiblemente de un xenoantígeno, más preferido de un oligosacárido que termina con un \alpha-ligado D-galactopiranosa o ácidoN-glicol neuramínico en el terminal reductor, por ejemplo como se describe más arriba para los conjugados Tipo I.

Ejemplos para entidades macromoleculares y macroscópicas son las proteínas globulares tal como albúmina en suero o KLH; los polímeros tal como poli-amidas, poli-imidas, poli-etileno glicoles, poli-estirenos, poli-acrilatos, poli-acrilamidas, co- y polímeros en bloque de estos, polisacáridos naturales y modificados; cuentas de vidrio, silica gel, tierra diatomácea y formados de estructuras de mono- o bi-capas, o múltiples bicapas de lípidos aglomerados o ligado en cruz. Si la entidad macromolecular, o macroscópica es un polisacárido, este puede consistir de más de 20 monómeros de azúcar con un peso molecular desde algunos miles hasta 100 millones. La persona de habilidad es familiar con polisacáridos naturales y modificados que difieren en la naturaleza de sus unidades del monosacárido que recurren, en la longitud de sus cadenas, y en el grado de ramificación. Los polisacáridos naturales modificados pueden comprender los derivados obtenibles reaccionando con los polisacáridos naturales con reactivos u oxidantes mono-, bi- o polifuncionales, que se pueden basar sustancialmente en las modificaciones de los grupos hidroxi de los polisacáridos por éter o éster formando las reacciones u oxidaciones selectivas. Particularmente útiles son los polisacáridos ligados en cruz, preferiblemente ligados tri-dimensionalmente. Ejemplos para polisacáridos naturales y modificados son almidones, celulosas, dextranes y agarosas naturales y modificados. Particularmente útiles como polisacáridos ligados en cruz, preferiblemente ligados tri-dimensionalmente son por ejemplo Sephacryl® y Sepharose® y sus derivados, por ejemplo NHS-activated CHSepharose 4B o NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (disponibles comercialmente).

En los conjugados Tipo II las siguientes significancias son preferidas tanto individualmente como en cualquier combinación o subcombinación.

(a): Y' es un grupo de fórmula III en donde R^{5} es un enlace directo, X^{5} es -NH-, R^{6} es -[(CH_{2})_{2}O]_{2}(CH_{2})_{2}-, X^{4} es -NHC(O)-, y R^{7} es alquiloeno C_{1}-C_{8}, preferiblemente Y' es un grupo de fórmula IIIb -NH[(CH_{2})_{2}O]_{2}(CH_{2})_{2}NHC(O)(CH_{2})_{3}- (IIIb) en donde en consideración a la fórmula II -(CH_{2})_{3}- se une a S;

(b): la entidad macromolecular o macroscópica, a partir de este momento será refedida como a R^{4}, es preferiblemente el derivado de un polisacárido natural o modificado, más preferiblemente de celulosa, agarosa o sepharose, particularmente de NHS-activated CH- Sepharose 4B o NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, más preferiblemente de NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow.

Particularmente preferidos son los conjugados Tipo II en donde R^{4}-Y'- es un grupo de fórmula Vg

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Un subgrupo preferido son los conjugados Tipo II que comprende al menos un elemento estructural de fórmula II*

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en donde

A, R^{1}, X^{1}, R^{2}, X^{2} y Y son como se definieron anteriormente y R_{4} es una entidad macromolecular, o macroscópica, más preferido un elemento estructural de fórmula IIa1,

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más preferido un elemento estructural de fórmula IIa,

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en la cual -Y'-R^{04} es un grupo de fórmula Vg.

De acuerdo con la invención el esqueleto de poliamida de conjugados Tipo II adicionalmente puede comprender al menos un elemento estructural de fórmula VIb con todos los significados y preferencias como arriba.

Particularmente preferidos son los conjugados Tipo II que comprenden al menos un elemento estructural de fórmula I**, al menos un elemento estructural de fórmula II* y al menos un elemento estructural de fórmula VI en donde A', R^{1}', X^{1}', R^{2}', X^{2}', Y', R^{3} y R^{4} tienen los significados y preferencias según se menciona anteriormente.

Más preferidos son los conjugados Tipo II que comprenden al menos un elemento estructural de fórmula Iaa en donde -YR^{03} es un grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve o Vf, al menos un elemento estructural de fórmula IIa y al menos un elemento estructural de fórmula Vlb.

En los conjugados Tipo II novedosos el contenido de los elementos estructurales de fórmulas I**, II* y VII puede por ejemplo estar entre 0.1 y 99.9% mol, los valores adicionados al 100% en el caso de conjugados Tipo II que únicamente consisten de elementos estructurales de fórmulas I**, II* y VI. En el caso de los elementos estructurales de fórmula I** el contenido puede por ejemplo estar entre 1 y 50%, preferiblemente desde 10 a 30%. En el caso de los elementos estructurales de fórmula II* el contenido puede por ejemplo estar entre 0.1 y 20%, preferiblemente desde 0.1 a 5%. En el caso de los elementos estructurales de fórmula VI el contenido puede estar entre 0 y 98.9%, preferiblemente desde 50 a 98.9%. Ejemplos para relaciones útiles se revelan en la siguiente tabla:

elemento I** [%]	25	13	14	23	20	21.5	16	12.5	16
elemento II* [%]	2	2.6	2.6	3	3	2	2.5	2.5	2.5

Los conjugados Tipo II preferidos son aquellos en donde la suma media de los elementos estructurales [n] está en el rango de 200 a 300 con una polidispersidad de 1.1 a 1.2, la relación de los elementos estructurales de fórmula la [x] en donde R^{03}-Y es un grupo seleccionado de un grupo que consiste de grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve y Vf es 5 a 30% y la relación de los elementos estructurales de fórmula llb (intermediario para el elemento estructural de fórmula IIa, ver abajo) [y]

17

en donde Z-Y'' es H_{2}N [(CH_{2})_{2}O] (CH_{2})_{2}NHC(O) (CH_{2})_{3}- es de 1 a 5%; o aquellos en donde [n] esta en el rango desde 900 a 1200 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2, [x] es 5 a 50% y [y] es de 1 a 5%;

con una relación de los elementos estructurales de fórmula VIb [z] fluctuando desde 45 a 94%.

Ejemplos de conjugados Tipo II preferidos son aquellos en donde

(a): n es 250, x es 25% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Vc y y es 2%; + 73% [z];

(b): n es 250, x es 14% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Vc y y es 2.6%; + 83.4% [z];

(c): n es 1050, x es 13% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Vc y yis 2.6%; + 84.4% [z];

(d): n es 1050, x es 16% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Vb y y es 2.5%; + 81.5% [z];

(e): n es 1050, x es 12.5% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Vf y y es 2.5%; + 85% [z]; o

(f): n es 1050, x es 16% cuando R^{3}-Y- es un grupo de fórmula Ve y y es 2.5%; más 81.5% [z];

particularmente los ejemplos (c) a (f).

Los conjugados Tipo II novedosos se obtienen mediante un proceso que comprende la reacción de una poliamida que contiene al menos dos elementos estructurales de fórmula VII como arriba con uno o más compuestos o entidades seleccionados del grupo de un tiol de fórmula VIII

(VIII),R^{3}-Y-SH

en la cual R^{3} y Y son como se definieron anteriormente,

un tiol de fórmula VIIIa

(VIIIa)Z-Y''-SH

en donde Y'' es un puente del grupo de fórmula III en donde R^{5} es un enlace directo y los otros significados son como se definieron anteriormente,

y Z es hidrógeno o un grupo protector para X^{4}, preferiblemente un grupo protector amino,

y una entidad macromolecular, o macroscópica apropiadamente derivatizada.

Los conjugados de poliamida que comprenden un elemento estructural resultante de la reacción de un elemento estructural de fórmula VII con un tiol de fórmula VIIIa pueden, después de la eliminación del grupo protector Z, convenientemente además hacerse reaccionar con un tiol de fórmula VIII o una entidad macromolecular, o macroscópica apropiadamente derivatizada.

El término "entidad macromolecular, o macroscópica apropiadamente derivatizada" es para ser entendido como indicando una entidad macromolecular, o macroscópica que lleva al menos un grupo funcional apropiado para reaccionar con un elemento estructural de fórmula IIb. Ejemplos para grupos funcionales útiles para el acoplamiento de grandes entidades son conocidos por artesanos de habilidad y se describen por ejemplo en Gabius y Gabius (Eds.) Lectins y Cancer 53ff, Springer Verlag, Berlin Heidelberg (1991). Ejemplos son amina/activada carboxilato (N-hidroxi-succinimidil éster, pentafluorofenil éster), amina/epóxido, amina/isocianato, amina/isotiocianato, amina Michael-aceptor (maleimida), tiol/tiofil y amina/aldehído.

La entidad macromolecular, o macroscópica derivatizada puede ser preparada por reacción con una entidad macromolecular, o macroscópica con conocidos ligantes bifuncionales.

Los tioles de las fórmulas VIII y VIIIa se pueden obtener como se revela arriba para los tioles de fórmula VIIIa'.

Los conjugados Tipo II adicionalmente que comprenden un elemento estructural de fórmula VIb se obtienen mediante un proceso que comprende la reacción con una poliamida que contiene al menos tres elementos estructurales de fórmula VII, con uno o más compuestos o entidades seleccionadas de los tioles de las fórmulas VIII y VIIIa, una entidad macromolecular, o macroscópica apropiadamente derivatizada y un tiol de fórmula IX como arriba. En particular el proceso puede comprender la reacción de una poliamida que contiene al menos tres elementos estructurales de fórmula VII, con uno o más compuestos o entidades seleccionados de los tioles de las fórmulas VIII, VIIIa y IX como arriba, la eliminación del grupo protector Z y además la reacción del compuesto resultante con una entidad macromolecular o macroscópica apropiadamente derivatizada.

Las condiciones de reacción pueden ser en conformidad con las condiciones de reacción como se describe para los conjugados Tipo I arriba.

Detalles no-limitantes para la preparación de los conjugados Tipo II se revelan en los Ejemplos A a D.

Los conjugados Tipo II novedosos tienen interesantes propiedades. En particular ellos tienen afinidad por los anticuerpos xenoreactivos policlonales humanos y son útiles como adsorbentes en la cromatografía de afinidad de fluido corporal. Preferiblemente el fluido corporal es sangre, particularmente plasma sanguíneo.

Preferiblemente los conjugados Tipo II se utilizan para la eliminación extracorporal de los anticuerpos de un fluido corporal, que comprende la extracción del anticuerpo-contenido en el fluido corporal de un recipiente de injerto heterólogo previo a y/o después de un transplante del injerto heterólogo, la extracción preforma los anticuerpos a partir del fluido vía cromatografía de afinidad que contiene los conjugados Tipo II como adsorbente, y volviendo a introducir el anticuerpo-agotado del fluido corporal en el recipiente.

La cromatografía de afinidad preferiblemente puede ser llevada a cabo como cromatografía de columna en donde la columna se empaca con el conjugado Tipo II de una manera conocida por aquellos de habilidad en el oficio y se describe por ejemplo en US 5, 149,425, los contenidos de estos en relación con el llenado, almacenamiento y uso de tales columnas se incorpora por referencia.

Los conjugados Tipo II puede ser utilizados como un solo conjugado o como una mezcla de diferentes conjugados Tipo II como tal o en la forma de una composición adaptada para la cromatografía de afinidad.

Tal mezcla puede comprender conjugados Tipo II que difieren en relación con el esqueleto de poliamida, la entidad macromolecular, macro- o microscópica y/o con el grupo antigénico.

Preferidas son las composiciones en donde el conjugado Tipo II comprende los grupos xenoantigénicos idénticos o diferentes o composiciones que comprenden una mezcla de conjugados Tipo II cada conjugado que comprende grupos xenoantigénicos idénticos o diferentes, siendo los grupos xenoantigénicos derivados de un disacárido, preferiblemente de un grupo de fórmula Vb, de un trisacárido, preferiblemente un grupo de fórmula Vc o Vd, o de un pentasacárido, preferiblemente de un grupo de fórmula Ve o Vf.

El método de eliminación de los anticuerpos del fluido corporal del paciente puede ser realizada de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo como se revela en US 5, 695,759. Preferidas temperaturas de contacto pueden estar en el rango de 5ºC a 40ºC, preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El fluido corporal se puede directamente volver a introducir sin interrupción o puede ser recolectado y luego se vuelve a introducir. El método se puede repetir como se requiera previo al transplante y/o después del transplante con tal de que la eliminación de los anticuerpos sea de ventaja terapéutica.

En conformidad con lo precedente la presente invención adicionalmente proporciona:

(a): un conjugado Tipo II para utilizar preferiblemente como adsorbente en la cromatografía de afinidad de un fluido corporal;

(b): un método de eliminación anticuerpos del fluido corporal humano, método que comprende el contacto de manera extracorporal de dicho fluido corporal con un conjugado Tipo II como debajo de (a) y volviendo a introducir el fluido corporal dentro del cuerpo del paciente;

(c): una composición que comprende un conjugado Tipo II como debajo de (a) o una mezcla de tales conjugados Tipo II como más arriba se revela para utilizar preferiblemente en un método de eliminación de xenoanticuerpos del fluido corporal humano; y

(d): un cartucho de cromatografía de afinidad que contiene como adsorbente un conjugado Tipo II o una mezcla del mismo o una composición como debajo de (c).

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitación.

Las siguientes abreviaciones se utilizan en los ejemplos: Ac: acetil; Bn: bencil; Bz: benzoil; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0] undec-7-eno; DMF: N,N-dimetil formamida; DMTST: dimetil-metiltio-sulfonim trifluorometilsulfonato; eq: equivalente(s); GlcNAc: N-acetilglucosamina; n: grado de polimerización; Sepharose 4 fast flow: NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia Biotech); TESOTf: trietilsilil trifluorometano-sulfonato; UDP-Gal: uridina-O (6)-difosforil-\alpha-D-galactosa; RT: temperatura ambiente.

Los pesos moleculares medios (M) y las polidispersidades de the polylysine hydrobromides que son comercialmente obtenibles de SIGMA se determinaron por medio de medidas de viscosidad y SEC-LALLS (cromatografía de permeación sobre gel/difusión de láser luminoso de ángulo pequeño) de los derivados succinil de los compuestos.

A Preparación de los compuestos iniciales

Ejemplo A1

Preparación de etil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1\rightarrow3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-1-tio-\beta-D-galactopiranosida)3

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18

El etil 4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-1-tio-\beta-D-galactopiranosida 1 se prepara en analogía con el correspondiente derivado metiltio [Garegg y Oscarson, Carbohyd. Res. 136:207-213 (1985)] y se disuelve (2.12 g, 4.47 mmol) en dietil éter seco (40 ml) y diclorometano seco (25 ml). Se adiciona 1 ml de una solución de TESOTf (225 \mul) en dietil éter seco (10 ml) a -25ºC bajo argón. Una solución de 2, 3, 4,6-tetra-O-bencil-\beta-D-galactopirasonil tricloroacetimidato 2 [7.50 g, 11.18 mmol; se prepara de acuerdo con Wegmann y Schmidt, J. Carb. Chem. 6:357-375 (1987)] en éter seco (22 ml) y luego se adiciona diclorometano seco (11 ml) a -25ºC durante 7 min. Después de la agitación durante 10 min a -25ºC, se adiciona NaHCO_{3} (10%) (50 ml) y se continúa la agitación vigorosa por 10 min. Se adiciona agua (100 ml) y la fase orgánica se separa. La fase acuosa se extrae dos veces con diclorometano (80 ml cada una), las fases orgánicas se lavaron con agua (100 ml) y salmuera saturada (100 ml), se secaron con MgSO_{4}, y los solventes se evaporan a presión reducida. La cromatografía del producto crudo (10.25 g) sobre silica gel (700 g) con hexano/acetato de metilo (5: 1) como eluente da el etil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1\rightarrow3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-1-tio-\beta-D-galactopiranosida)3.

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Ejemplo A2

Preparación de (3-benciloxicarbonilamino)-propil 6-O-bencil-2-deoxi-2-tetracloroftalimido- \beta-D-glucopiranosida 14

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19

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(a): 12.55 g (20.4 mmol) de 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-deoxi-2-tetracloroftalimido-D-glucopiranosa 9 se prepara de acuerdo con Castro-Palomino y Schmidt [Tetrahedron Lett. 36:5343-5346 (1995)] se tratan con 4.1 M HBr en ácido acético (35 ml). Después de la agitación por 18 h a RT, la mezcla se adiciona cuidadosamente a CHCl_{3} (50 ml) y NaHCO_{3} acuoso (10%) (400 ml) bajo enfriamiento helado y agitación. La neutralización (pH 7) con NaHCO_{3} 10% se sigue por la extracción con CHCl_{3} (3-veces 150 ml). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera saturada (200 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), y el solvente se evapora bajo presión reducida, proporcionando el 1-bromo-3,4,6-tri-O-acetil-2-deoxi-2-tetracloroftalimido-D-glucopiranosa 10 crudo, que se utiliza para las subsiguientes reacciones sin purificación.

(b): se adicionan 3-Benciloxicarbonilamino-1-propanol (8.61 g, 41.3 mmol) y cianuro mercúrico (10.45 g, 41.3 mmol) a una solución de 10 crudo (13.15 g) en 165 ml de tolueno seco. La suspensión se agita por 18 h, se filtra a través de un tapón de algodón, y el solvente se evapora bajo presión reducida. La cromatografía del residuo sobre silica gel (1.3 kg) con hexano/acetato de etilo (2: 1) como eluente da el (3-benciloxicarbonilamino)-propil 3,4,6-tri-O-acetil-2-deoxi- 2-tetracloroftalimido-\beta-D-glucopiranosida 11.

(c): 2.4 ml de una solución de sodio (820 mg) en metanol seco (40 ml) se adicionan a una solución de acetato 11 (8.18 g, 10.7 mmol) en metanol seco (220 ml). La mezcla se agita a RT por 15 min y subsecuentemente se trata con Amberlite 15 H + (2.8 g) por 15 min. La filtración y evaporación del solvente a presión reducida da el (3-benciloxicarbonilamino)-propil 2-deoxi-2-tetracloroftalimido-\beta-D-glucopiranosida 12.

(d): ácido p-Toluenosulfónico monohidrato (96 mg) se adiciona a una solución de 12 crudo (6.46 g) en acetonitrilo (60 ml) y \alpha, \alpha'-dimetoxi-tolueno (2 ml). Después de la agitación por 15 min a RT, la mezcla se diluye con acetato de etilo (350 ml) y se extrae con NaHCO_{3} acuoso 10% (180 ml) seguido por salmuera saturada (180 ml). La fase orgánica se seca con Na_{2}SO_{4} y los solventes se evaporan a presión reducida. La cromatografía del residuo (6.63 g) sobre silica gel (800 g), eluyendo con hexano/acetato de etilo (2: 1), proporciona el (3-benciloxicarbonilamino)-propil 4,6-di-O-bencilideno-2-deoxi-2-tetracloroftalimido-\beta-D-glucopiranosida 13.

(e): Tamiz molecular de 4\ring{A} (10 g) y NaCNBH_{3} (2.91 g, 46.35 mmol) se adicionan a una solución de acetal 13 (3.74 g, 5.15 mmol) en THF seco (150 ml) a 0ºC bajo argón. Bajo la agitación se adiciona HCl en etér hasta que la espuma cede. Dentro de 1.5 h se adicionan y agitan dos porciones adicionales de HCl en éter saturado (cada una de 5 ml) a 0ºC se continua por 18 h. Luego se adicionan tres porciones adicionales de 5 ml de etheral HCl durante 90 min antes se vierte la mezcla en agua helada (250 ml) después de 45 min. El frasco se enjuaga con diclorometano y la mezcla se agita por 10 min. La filtración (Celite) se sigue por la extracción CH_{2}Cl_{2}. La fase acuosa se extrae una segunda vez con CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y las fases orgánicas se lavaron con salmuera saturada (300 ml), se secaron con Na_{2}SO_{4}, y los solventes se eliminan bajo presión reducida. La cromatografía del residuo (5.03 g) sobre silica gel (60 g) y la elución con hexano/acetato de etilo (1: 1) da el (3-benciloxicarbonilamino)-propil 6-O-bencil-2-deoxi-2-tetracloroftalimido-\beta-D-glucopiranosida 14. ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}): 1.5-1.8 (m, CH_{2}); 3.0-3.25 (m, NCH_{2}, OH); 3.40 (b, OH); 3.5-3.6 y 3.77-3.87 (2m, OCH2); 3.55-3.65 (m, H-C(4),-C(5)); 4.05-4.17 (m, H-C(2)); 4.2-4.3 (m, H-C(3)); 4.50 y 4.57 (2d, J = 12, OCH_{2}C_{6}H_{5}); 4.9-5.05 (m, C(O)OCH_{2}C_{6}H_{5}); 5.1 - 5.2 (m, NH); 5.15 (d, J = 8, H-C(1)); 7.2-7.4 (m, 2 C_{6}H_{5}). La asignación pico se basa en 2-dimensional ^{1}H/^{1}H-correlación (COSY) y ^{1}H/^{13}C-correlación espectroscopia (HSQC).

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Ejemplo A3

Preparación de (3-acetamidoamino)-propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida) A5

20

Una solución de 8 (13 mg, 0.0216 mmol), se prepara de acuerdo con el ejemplo A9e, N-acetoxi-succinimida (3.4 mg, 0.0324 mmol), y diisopropil-etil-amina (7.3 \mul, 0.0432 mmol) en DMF (1 ml) se agita por 15 h a RT. La evaporación de los solventes a presión reducida y cromatografía (5 g de silica gel, cloroformo/metanol/agua = 30:30; 2) proporciona A5; ^{1}H-NMR (400 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 1.6-1.75 (m, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH); 2.90 y 2.95 (2s, 2 NH-COCH_{3}); 3.02-3.12 y 3.12-3.22 (2m, O(CH_{2})_{2}CH_{2}NH); 4.43 y 4.47 (2d, J = 8, H-C(1), H-C(1')); 5.08 (d, J = 4, H-C(1'')).

Ejemplo A4

Preparación de 3,4,6-tri-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido-\beta-D-glucopirasonil tricloroacetimidato (37)

21

(a): A una solución de 10 de acuerdo con el ejemplo A2a (12.3 g, 18.73 mmol) en acetona (175 ml) se le adiciona agua (55 ml). Después de la agitación durante 18 h a RT el solvente se evapora y la solución residual acuosa se extrae con tolueno (3 x 100 ml). La cromatografía del residuo de las fases orgánicas (silica gel 500 g, CH_{2}Cl_{2} & 2% CH_{3}OH) da el 3, 4,6- tri-O-acetil-2-deoxi-2-ftalimido-D-glucopiranosa (36) (en su mayoría \beta-anómero).

(b): A una solución de 36 (4.0 g, 6.98 mmol) y tricloroacetonitrilo (4.2 ml, 14.88 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (25 ml) se le adicionan 18 g de K_{2}CO_{3} en polvo seco finamente. Después de la agitación por 60 min a RT la mezcla se filtra a través de Celite®. La cromatografía (silica gel, 500 g, hexano/acetato de etilo = 2: 1) da 37 (\beta-anómero).

Ejemplo A5

Preparación de (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-glucopiranosida) 35

22

(a): A una suspensión de lactosa seca 28 (100 g, 0.28 mol) en piridina (500 ml) se le adiciona benzoil cloruro (520 ml, 5.0 mol) gota a gota a 0ºC y bajo agitación mecánica. Después de la adición de 4-(N,N-dimetilamino)-piridina la mezcla se agita a RT por 3 días y a 100ºC por 2 días adicionales. La mezcla de reacción luego se vierte en agua helada y se extrae con acetato de etilo. La fase orgánica se lava con solución de NaHCO_{3} saturada y salmuera. Secándola con Na_{2}SO_{4}, la evaporación de solventes, y co-evaporación de piridina con tolueno proporciona el O-(2,3,4,6-tetra-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(1,2,3,6-tetra-O-benzoil-D-glucopiranosa) crudo (29) como una mezcla anomérica.

(b): 29 (150 g, 0.127 mol) se disuelve en diclorometano (500 ml) y se adiciona HBr 4.1 M en ácido acético (100 ml) a -10ºC. La mezcla se calienta lentamente a RT y la conversión se monitorea por TLC (éter de petróleo/acetato de etilo = 3: 1). Después del consumo la mezcla cuidadosamente se neutraliza con NaOH 4 N y luego se vierte en agua helada. La extracción con acetato de etilo, lavando los extractos con solución de NaHCO_{3} saturada, salmuera, y agua, la evaporación de solventes, y el secado del residuo a alto vacío da el O-(2,3,4,6-tetra-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(1-deoxi-1-bromo-2,3,6-tri-O-benzoil-\alpha-D-glucopiranosa) (30).

(c): 30 (18.9 g, 16.7 mmol) y N-benciloxicarbonil propanolamina (7.0 g, 33.5 mmol) se disuelven en tolueno (abs., 150 ml) bajo Ar. Con agitación Hg (CN)_{2} (8.45 g, 33.45 mmol) y Hg Br_{2} (1.21 g, 3.35 mmol) se adicionan. La mezcla se agita a RT por 18 h, luego se filtra sobre Celite® y el residuo se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/n-hexano/acetato de etilo 5:5:2, v/v) para producir el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,3,4,6-tetra-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-glucopiranosida) (31).

(d): 31 (16.3 g, 12.9 mmol) se disuelve bajo Ar a RT en metanol (abs., 90 ml). Se prepara una solución fresca de NaOMe en metanol (1 N, 3.9 ml) se adiciona y la solución se agita por 16 h. Luego la solución de NaOMe adicional (3.9 ml) se adiciona y la agitación se continúa por otras 7 h. La mezcla se neutraliza con ácido acético y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía instantánea (eluente CH_{2}Cl_{2}/MeOH 2:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(\beta-D-gatactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 32.

(e): A una solución de 32 (6.5 g, 12.18 mmol) en acetona (500 ml) se le adiciona ácido p-toluenosulfónico (770 mg, 4.06 mmol) a temperatura de reflujo. Después de 20 min la mezcla de reacción se apaga con solución de NaHCO_{3} (10%) y el solvente se evapora. El residuo se extrae muchas veces con diclorometano, se lava con agua, se seca y evapora. El producto crudo se purifica por cromatografía instantánea (eluente acetato de etilo/metanol 9:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(3,4-di-O -isopropilideno-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 33.

(f): A una solución de 33 (2.2 g, 3.84 mmol) en piridina (abs., 60 ml) se le adiciona benzoilcloruro (6.68 ml, 57.6 mmol) gota a gota con agitación a RT bajo argón. La solución se agita por 16 h. La mezcla se evapora y se vuelve a disolver en diclorometano. La fase orgánica se lava muchas veces con HCl 1 N, agua y se neutraliza con solución de NaHCO_{3} (10%). Después, secando el solvente se evapora, y el residuo se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/acetona 15:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,6-di-O-benzoil-3,4-di-O-isopropilideno-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-lucopiranosida) (34).

(g): Una suspensión de 34 (3.4 g, 3.11 mmol) en ácido acético/agua (60 ml, 4:1, v/v) se calienta bajo argón a 100ºC por 40 min. La mezcla se enfría a RT y se evapora. El residuo se co-evapora muchas veces con tolueno, y se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/acetona 5:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-glucopiranosida) (35).

Ejemplo A6

Preparación de (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-lactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) (A9)

23

(i)

(a): Una solución de 37 (seco, 3.5 g, 4.88 mmol) y 35 (seco, 2.7 g, 2.56 mmol) en diclorometano (abs., 30 ml) se enfría a -20ºC y se adiciona TESOTf (58 \mul, 0.1 eq.). Después de 3 h adicionales se le agrega el TESOTf (0.2 eq.). Después de otra hora la mezcla de reacción se neutraliza con trietilamina, se evapora y co-evapora dos veces con tolueno. El residuo se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/acetona 7:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2-deoxi-2-tetracloroftalimido-3,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-glucopiranosida) 38.

(b): Una solución de 38 (2.64 g, 1.64 mmol) en etanol (abs., 80 ml) se trata a 60ºC con etilendiamina (220 \mul, 3.28 mmol) bajo argón. Después de 2 h adicionales se agrega etilendiamina (110 \mul) y después de otra hora la mezcla se evapora y co-evapora muchas veces con tolueno. El residuo se trata con piridina/anhídrido acético (120 ml, 2:1, v/v) y se agita a RT bajo argón por 60 h. La mezcla se evapora y co-evapora muchas veces con tolueno y el residuo se purifica por cromatografía instantánea (tolueno/acetona 3:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2-deoxi-2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoil-\beta-D-glucopiranosida) 39.

(c): Una solución de 39 en metanol (abs., 100 ml) se trata con una solución de NaOMe preparada recientemente (1 N, 1 ml) y se agita a RT bajo argón por 16 h. La mezcla se neutraliza con TFA y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía instantánea (diclorometano/metanol 2:1, v/v) para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 40.

(d): A una solución clara de 40 (230 mg, 0.312 mmol), UDP-Gal (273 mg, 0.447 mmol), BSA (17 mg) y MnCl_{2}\cdot6 H_{2}O (73.5 mg, 0.313 mmol) en 20 ml de solución reguladora de sodio cacodilato (0.1 M, pH 7.3) se le adicionan \beta-(1 \rightarrow 4)-galactosil-transferasa (2.5 U, 500 \mul de Sigma No G-5507, 25 U/5 ml) y fosfatasa alcalina (25 \mul, Boehringer No 108146, 7500 U/498 \mul) y la mezcla se incuba a 37ºC durante la noche. La mezcla luego se pasa sobre una columna RP-18 (2.5 cm \diameter, 10 cm de longitud), se lava con agua y se eluye con metanol para dar el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 41.

(e): A una solución de MnCl_{2}\cdot6 H_{2}O (317.2 mg, 1.6 mmol) en H_{2}O (19 ml) y 0.5 M solución reguladora de sodio cacodilato (6. ml, pH 6.5) 225 mg (0.250 mmol) de 41, se le adicionan UDP-Gal (219 mg, 0.36 mmol) y BSA (20 mg). Esta mezcla se incuba a 37ºC con 2.5 ml de recombinante \alpha-(1 \rightarrow 3)-galactosil-transferasa [3U/ml, se prepara de acuerdo con Joziasse et al., Europ. J. Biochem. 191:75 (1990)] y 25 \mul de fosfatasa alcalina de intestino de becerro (Boehringer No 108146, 7500 U/498 \mul) por 48 h. La mezcla se pasa por una columna corta C-18 de fase reversa (2.5 cm \diameter, 10 cm de longitud), se lava con agua y se eluye con metanol. La cromatografía del residuo sobre silica gel (CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/H_{2}O = 10: 2; 0.2) da A9.

(ii)

(a): O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acet-amido-\beta-D-gluco-pirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosa) (23) (Chem. Abstr. Reg. No. 177331-58-7, 500 mg, 0.54 mmol) se disuelve en piridina (10 ml) y se le adiciona anhídrido acético (5 ml) lentamente. La solución se agita a RT durante la noche. La solución clara se evapora y se co-destila muchas veces con tolueno. El residuo se disuelve y purifica por el sistema instantáneo 40 en silica gel (eluente tolueno/acetona 3:2 v/v) para dar después de la concentración el O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-triO-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-3,6-di-O-acetil-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(1,2,3,6-tetra-O-acetil-\beta-D-glucopiranosa) (24) como un jarabe incoloro.

(b): 24 (770 mg, 0.499 mmol) se disuelve en DMF (abs, 50 ml) bajo argón. Tamices moleculares (4 A, 1 g) se adicionan y la mezcla se agita a RT por 30 min. Luego se adiciona acetato de hidrazinio seco (140 mg, 1.50 mmol) a la mezcla y se agita por 3 h a 50ºC. La mezcla de reacción se filtra a través de un almohadilla pequeña de Celite® y se le adiciona agua helada. El producto se extrae con acetato de etilo, se lava, se seca (MgSO_{4}) y la solución se evapora a sequedad. El residuo se purifica por cromatografía sobre silica gel para dar el O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-3,6-di-O-acetil-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranosa) (25).

(c): 25 (seco, 570 mg, 0.38 mmol) se disuelve en diclorometano (abs., 3 ml) bajo argón. Se le adiciona tricloroacetonitrilo (600 \mul), seguido por adición gota a gota de DBU hasta que la mezcla de reacción vira a amarillo (3-4 gotas). La mezcla se agita a RT hasta que la TLC (tolueno/acetona, 1:1, v/v) muestra conversión completa del material inicial a un producto de traslado mayor (Rf 0.48). La solución se evapora cuidadosamente a sequedad y directamente se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/acetona, 1:1, v/v) para producir el O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-3,6-di-O-acetil-\beta-Dglucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopirasonil) tricloroacetimidate (26) como un jarabe incoloro.

(d): 26 (40 mg, 24.3 \mumol) y N-carbobenciloxi-1-propanolamina (15.5 mg, 73.0 \mumol) se disuelven bajo argón en diclorometano (abs., 1 ml) y n-hexano (abs., 3 ml), aproximadamente 1 g de MS (4A) molido luego se adiciona, y la mezcla se agita a RT por 30 min antes se le adiciona TESOTf (5 \mul). Después de 30 min la mezcla se neutraliza con trietilamina y se evapora a sequedad. El residuo se purifica por cromatografía instantánea (eluente tolueno/acetona 3:2, v/v) y se aísla el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-3,6-di-O-acetil-\beta-Dglucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(2,4,6-tri-O-acetil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2,3,6-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranosida) 27.

(e): 27 (59 mg, 34.5 \mumol) se suspende en metanol (abs., 1 ml). Se prepara una solución fresca de metilato de sodio en metanol (1N, 100 \mul) se adiciona y la mezcla se agita durante la noche a RT bajo argón. Finalmente se le adiciona agua (0.5 ml) y la agitación se continúa. Después de 1 h la solución se neutraliza con TFA (10 \mul) y se evapora a sequedad. La purificación del residuo por cromatografía instantánea da A9. [\alpha]D + 44.4 (c 1.075, H_{2}O). MS (ESI+) 1083 (M+Na+). ^{1}H-NMR (500 MHz, CDCl_{3}), señales seleccionadas: 4.31 (d, J = 8, H-C (1) \beta-glucosa y \beta-galactosa); 4.44 (d, J = 8, H-C (1) \beta-galactosa); 4.59 (d, J = 8, H-C (1) N-Acetil-\beta-glucosamina); 5.30 (d, J = 4, H-C (1) \alpha-galactosa).

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Ejemplo A7

Preparación de [3-(4-mercapto-butirolil)amino]-propil 2-desoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida A6

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24

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A una solución de 3-amino-propil 2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida 18a (500 mg, 1.80 mmol) y \gamma-tiobutirolactona (1.84 g, 18 mmol) en 15 ml de metanol seco y libre de oxígeno, se le adiciona trietilamina (1.82 g, 18 mmol). La solución se hierve por 16 h bajo reflujo (argón). El solvente se evapora bajo presión reducida y el residuo se somete a cromatografía sobre silica gel. La elución con acetato de etilo/metanol (3: 1) proporciona A6. ^{1}H-NMR (400 MHz, CD_{3}OD): 1.72 (m, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH); 1.88 (quint., J = 7, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 1.99 (s, COCH_{3}); 2.33 (t, J = 7, NH-COCH_{2}CH_{2})_{2}SH); 2.51 (t, J = 7, NH-CO- (CH_{2})_{2}CH_{2}SH); 3.15-3.95 (m, 10 H); 4.36 (d, J = 8.5, H-C (1)).

Ejemplo A8

Preparación de [6-(4-mercapto-butirolil)amino]hexil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-galactopiranosida) (A4)

25

(a): A una solución de 3 de acuerdo con el ejemplo A1 (1.0 g, 1.004 mmol) y (6-benciloxicarbonilamino)-1-hexanol (0.504 g, 2.008 mmol) en 4 ml de diclorometano seco se adiciona tamiz molecular en polvo (2.0 g, 4 \ring{A}) bajo argón y la suspensión se agita por 20 min a RT. Porciones de 1 ml de una solución de DMTST (0.778 g, 3.012 mmol) en diclorometano (9 ml) que contienen tamiz molecular (2.5 g, 4 \ring{A}) se adicionan en intervalos de 10 min, mientras se continúa la agitación a RT y bajo argón. Después de la adición de 7 porciones, la mezcla se vierte en acetato de etilo, NaHCO_{3} acuoso al 10%, y el hielo comprimido. La mezcla se agita por 10 min y se filtra a través de Celite™. La fase acuosa se separa y se extrae dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas se lavaron con NaCl acuoso al 10% y salmuera saturada, se secan con Na_{2}SO_{4}, y los volátiles se evaporan a presión reducida. La cromatografía (150 g de silica gel) del residuo (1.6 g) eluyendo con tolueno/acetato de etilo (10: 1) proporciona el (6-benciloxicarbonilamino)-hexil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopiranosida) 15.

(b): A una solución de 15 (925 mg, 0.781 mmol) en metanol (30 ml) y agua (3 ml) se le adiciona LiOH\cdotH_{2}O (328 mg, 7.81 mmol). La mezcla se calienta a 60ºC bajo argón por 6 h. Los solventes se evaporan a presión reducida y el residuo se somete a partición entre CHCl_{3} y agua. La capa de CHCl_{3} se separa y se lava con agua, las fases acuosas se extraen con CHCl_{3}. Las fases orgánicas se secan con Na_{2}SO_{4} y se evaporan. La cromatografía (100 g de silica gel) con tolueno/acetato de etilo (1:1) como eluente da el (6-benciloxicarbonilamino)-hexil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopiranosida) 16.

(c): A una solución de 16 (479 mg, 0.512 mmol) en dioxano (16 ml) y agua (9 ml) Pd (OH)_{2} (20% de carbón, 350 mg) se adiciona bajo argón. La suspensión se agita por 36 h bajo H_{2}. La mezcla se filtra a través de Celite™ y el filtrado se evapora bajo presión reducida. El residuo se vuelve a disolver en dioxano (16 ml) y agua (9 ml). Después de la adición de Pd (OH)_{2} (20% de carbón, 350 mg) la suspensión se agita por 18 h bajo H_{2}. La filtración (Celite™) y la evaporación de solventes se sigue por filtración a través de un Acrodisc™ en agua. La liofilización del filtrado da el 6-amino-hexil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopiranosida) 17.

(d): Una solución del compuesto 17 (100 mg, 0.227 mmol), \gamma-tiobutirolactona (196 \mul, 2.27 mmol), y trietilamina (316 \mul, 2.27 mmol) en DMF seco, libre de oxígeno (7 ml) se calienta durante 24 h a 90ºC bajo argón. La evaporación de los volátiles bajo presión reducida a 40ºC y la cromatografía (10.5 g silica gel) del residuo (160 mg) con cloroformo/metanol/agua (30: 30: 5) como eluente proporciona A4. ^{1}H-NMR (400 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 1.15-1.35 (m, O (CH_{2})_{2} (CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}NH); 1.35-1.45 (m, O(CH_{2})_{4} CH_{2}CH_{2}NH); 1.45-1.6 (m, OCH_{2}CH_{2} (CH_{2})_{4}NH); 1.77 (quint., J = 7.5, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.24 (t, J = 7.5, NH-CO-CH_{2} (CH_{2})_{2}SH); 2.43 (t, J = 7.5, NH-CO-(CH_{2})_{2}CH_{2}SH); 3.07 (t, J = 7, O(CH_{2})_{5}CH_{2}NH); 4.34 (d, J = 8, H-C(1)); 5.04 (d, J = 4, H-C(1')).

Ejemplo A9

Preparación de [3-(4-mercaptobutirolil) amino] propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1\rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida) (A2)

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26

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(a): tamiz molecular activado recientemente en polvo 4\ring{A} (2.0 g) se adicionan a una solución de 3 (2.3 g, 2.31 mmol) y 14 (1.12 g, 1.54 mmol) en diclorometano seco (10 ml). Después se agita esta suspensión por 30 min bajo argón, una solución de DMTST (0.99 g, 3.85 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (7.5 ml) que contienen tamiz molecular en polvo 4\ring{A} (1.5 g) se adiciona en 5 porciones con 20 min intervalos. La adición de NaHCO_{3} acuoso (10%) (20 ml) se sigue agitando por 10 min y se le adiciona agua (50 ml) y acetato de etilo (150 ml). Después se filtra sobre Celite™ y se lava con acetato de etilo la fase acuosa se separa y se extrae dos veces con acetato de etilo. La fase orgánica se lava con salmuera saturada, se seca con Na_{2}SO_{4}, y los solventes se evaporan a presión reducida. La cromatografía del producto crudo (3.43 g) sobre silica gel (550 g) y la elución con hexano/acetato de metilo (3:1) da el (3-benciloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1\rightarrow3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(6-O-bencil-2-deoxi-2-tetracloroftalimido-\beta-D-glucopiranosida) 4.

(b): Una mezcla de 4 (1.412 g, 0.850 mmol), 1,2-diaminoetano (86 \mul), y etanol (40 ml) se calienta bajo argón a 60ºC. Después de 140 min adicionales se agrega 1,2-diaminoetano (36 \mul) y el calentamiento se continúa por 1 h. El solvente luego se evapora bajo presión reducida y el residuo se somete a cromatografía sobre silica gel (170 g). La elución con CH_{2}Cl_{2}/2-propanol (15:1) proporciona el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(6-O-bencil-2-deoxi-3-amino-\beta-Dglucopiranosida) 5.

(c): se adiciona anhídrido acético (15 ml) a una solución de amina 5 (975 mg, 0.699 mmol) en piridina (15 ml). Después de la agitación por 18 h a RT, el solvente y el reactivo se evaporan a 40ºC bajo presión reducida. La cromatografía del residuo (1.26 g) sobre silica gel (125 g) con diclorometano/2-propanol (15 : 1) como eluente da el (benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(4-O-acetil-2,6-di-O-benzoil-\beta-D-galactapirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(3-O-acetil-6-O-bencil-2-deoxi-2-acetamino-\beta-D-glucopiranosida) 6.

(d): monohidrato de hidróxido de litio (255 mg, 6.08 mmol) se adiciona a una solución de 6 (898 mg, 0.608 mmol) en metanol (25 ml) y agua (2.5 ml). Después de la agitación por 3 h 15 min a 60ºC, los solventes de la suspensión densa se evaporan bajo presión reducida. El residuo se disuelve en acetato de etilo (150 ml) y la solución se lava con agua (3-veces 70 ml) y salmuera saturada (50 ml). Los lavados acuosos se extraen con acetato de etilo una vez. Las fases orgánicas se secan con Na_{2}SO_{4}, y el solvente se evapora. La cromatografía del residuo (732 mg) sobre silica gel (120 g) con diclorometano/2-propanol (10 : 1) como eluente, seguido por acetato de etilo/acetona/2-propanol (5:1:1) proporciona el (3-benciloxicarbonilamino)-propil O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-Dgalactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(6-O-bencil-2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida) 7.

(e): Se adiciona el catalizador Perlmann (1.46 g 20% Pd (OH)_{2} de carbón) a una solución de 7 (610 mg, 0.514 mmol) en dioxano (50 ml) y agua (28 ml). La suspensión se agita vigorosamente bajo H_{2} por 22 h. Después de la filtración (Celite) el filtrado se evapora y el residuo se vuelve a disolver en dioxano (50 ml) y agua (28 ml). El catalizador recién preparado (1.46 g 20% Pd (OH)_{2} de carbón) se adiciona y la agitación bajo H_{2} se continúa por 3 días. La filtración y la evaporación de solventes a presión reducida da 290 mg (93%) de (3-amino)-propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopiranosida) crudo 8.

(f): 100 mg (0.166 mmol) del compuesto 8 se disuelven en 5 ml de DMF seco, libre de oxígeno. Después de la adición de \gamma-tiobutirolactona (0.144 ml, 1.66 mmol) y trietilamina (0.231 ml, 1.66 mmol) la mezcla se calienta a 90ºC por 18 h bajo argón. El solvente y los volátiles se eliminan por evaporación bajo vacío a 45ºC. La cromatografía (15 g de silica gel) del residuo (140 mg) con cloroformo/metanol/agua (30: 30: 10) proporciona A2. ^{1}H-NMR (400 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 1.68 (quint., J = 6.0, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH); 1.78 (quint., J = 7.5, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH), 1.95 (s, COCH_{3}); 2.25 (t, J = 7.5, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.44 (t, J = 7.5, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 3.03-3.13 y 3.13-3.23 (2m, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH); 4.43 y 4.46 (2d, J = 8, H-C(1), H-C(1')); 5.03 (d, J = 4, H-C(1'')). MS/EI: 703 (M-H)-.

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Ejemplo A10

Preparación de [3-(4-mercapto-butirolil)amino]propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) (A3)

27

Una solución de 3-aminopropil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 18 (74 mg, 0.1319 mmol), se prepara sintéticamente de la lactosa y galactosa de acuerdo con métodos estándar, \gamma-tiobutirolactona (114 \mul, 1.319 mmol), y trietilamina (184 \mul, 1.319 mmol) en metanol seco, libre de oxígeno (10 ml) se calienta bajo reflujo por 18 h (argón). Después de la separación de algún material insoluble (9 mg) por filtración y evaporación del filtrado a presión reducida, el residuo (119 mg) se somete a cromatografía en silica gel (15 g). La elución con cloroformo/metanol/agua (30:30:10) da A3. ^{1}H-NMR (400 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 1.65-1.85 (m, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.25 (t, J = 7.5, NH-CO-CH_{2} (CH_{2})_{2}SH); 2.45 (t, J = 7.5, NH-CO-(CH_{2})_{2}CH_{2}SH); 3.1-3.25 (m, H-C(2), O(CH_{2})_{2}CH_{2}NH); 4.38 y 4.42 (2d, J = 8, H-C(1), H-C(1')); 5.04 (d, J = 4, H-C(1'')).

Ejemplo A11

Preparación de [N-(4-mercaptobutirolil)]-glicinoil N-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(1-deoxi-1-amino-\beta-D-glucopiranosida) (A8)

28

Una solución/suspensión desgasificada de glicinoil N-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(1-deoxi-1-amino-\beta-D-glucopiranosida) (disponibles comercialmente)(22, 205 mg, 0.222 mmol), 1-tiobutirolactona (192 \mul, 2.22 mmol), trietilamina (310 \mul, 2.22 mmol), y ditio-D/L-treitol (51.4 mg, 0.333 mmol) en DMF seco (10 ml) se calientan por 3.5 h a 90ºC bajo argón. Los volátiles se evaporan bajo presión reducida (alto vacío) y el residuo se somete a cromatografía en silica gel (25 g). La elución con cloroformo/metanol/agua (30: 30: 10) y la liofilización proporciona A8. ^{1}H-NMR (400 MHz, D2O), señales seleccionadas: 1.8 (quint., J = 7, CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 1.93 (s, NH-COCH_{3}); 2.34 (t, J = 7, COCH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.47 (t, J = 7, CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 3.32-3.4 (m, H-C(2), glucosa); 3.87 (m, CO-CH_{2}-NH); 4.33 y 4.44 (2d, J = 8, 2 H-C(1), \beta-galactosa); 4.60 (d, J = 8, H-C(1) N-acetilglucosamina); 4.91 (d, J = 9, H-C(1), glucosa); 5.04 (d, J = 4, H-C(1) \alpha-galactosa)

Ejemplo A12

Preparación de [3-(4-mercapto-butirolil) amino]-propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) (A10)

29

(a): A9 (25 mg, 23.6 \mumol) se disuelve en agua (5 ml) y se adiciona hidróxido de paladio (5 mg). La mezcla se agita durante la noche bajo hidrógeno a RT. El catalizador se retira por filtrado de la mezcla a través de una pequeña almohadilla de Celite®. Después de la evaporación y la liofilización del agua se obtiene 3-amino-propil O-(\alpha-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta-D-galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucopirasonil)-(1 \rightarrow 3)-O-(\beta- D- galactopirasonil)-(1 \rightarrow 4)-O-(\beta-D-glucopiranosida) 42 como un polvo incoloro.

(b): A una solución de 42 (450 mg, 0.4855 mmol) y ditiotreitol (112 mg, 0.728 mmol) en DMF seco (30 ml) 420 \mul de \gamma-tiobutirolactona y se adicionan 680 \mul de trietilamina. Después de desgasificar, la solución se calienta por 18 h a 90ºC bajo argón. La evaporación del solvente a 50ºC bajo presión reducida y cromatografía en silica gel (50 g, cloroformo/metanol/agua = 30: 30: 10) proporciona A10. ^{1}H-NMR (400 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 1.65-1.85 (m, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCOCH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.25 (t, J = 7, COCH_{2} (CH_{2})_{2}SH); 2.43 (t, J = 7, CO(CH_{2})_{2}CH_{2}SH); 3.10-3.27 (m, O(CH_{2})_{2}CH_{2}NH, H-C(2) \beta-glucosa); 4.33 y 4.44 (2d, J = 8, 2 H-C(1) \beta-galactosa); 4.36 (d, J = 8, H-C (1) \beta-glucosa); 4.6 (d, J = 8, H-C(1) 2-deoxi-2-acetamido-\beta-D-glucosa); 5.03 (d, J = 4, H-C(1) \alpha-galactosa).

Ejemplo A13

Preparación de N-(8-[N-difenil-(4-metoxifenil)-metil]-amino-3,6-dioxa-1-octil}-4-mercapto-butiramida A7

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30

(a): A una emulsión agitada de trietilen glicol (39 g, 0.26 mol) en éter (200 ml) y trietilamina (50 ml) fría a 0ºC se le adiciona metanosulfonil cloruro (10.1 ml, 0.13 mol) durante 3 h. La mezcla se deja alcanzar la RT y se continúa la agitación por 20 min. Los solventes se evaporan a presión reducida y el residuo se vuelve a disolver en metanol/agua (95: 5, 300 ml). Después de la adición de NaN_{3} (18.2 g, 0.28 mol) la solución se hierve por 18 h bajo reflujo. El solvente luego se evapora bajo presión reducida y el residuo se somete a partición entre éter y salmuera saturada. La cromatografía del residuo de la fase orgánica se seca (Na_{2}SO_{4}) en silica gel (260 g), eluyendo con hexano/acetato de etilo (2: 1) da 1,8-diazido-3,6-dioxa-octano 19.

(b): A una solución del diazido 19 (14.67 g, 0.073 mol) en THF (100 ml) 1.5 g de 5% Pt en carbón se adiciona. La mezcla se agita por 12 h bajo hidrógeno. La filtración a través de Celite™ y la evaporación de solventes a presión reducida da el 1,8-diamino-3,6-dioxa-octano 20.

(c): A una solución de 20 (1.0 g, 6.76 mmol) en piridina (5 ml) se le adiciona una solución de difenil-(4-metoxifenil)-metil cloruro (2.09 g, 6.76 mmol) en piridina (10 ml) a 5ºC dentro de 5 min. Después de la agitación por 3 h a 0ºC el solvente se evapora bajo presión reducida a 20ºC. El residuo se somete a partición entre acetato de etilo y salmuera saturada. La fase orgánica se separa, se seca (Na_{2}SO_{4}) y el solvente se evapora. La cromatografía (170 g de silica gel) del residuo (3.1 g) eluyendo con cloroformo/metanol/agua (65: 25: 4) produce el 8-[N-difenil-(4-metoxifenil)-metil]-amino-3,6-dioxa-octilamina 21.

(d): Una solución de 21 (395 mg, 0.94 mmol), \gamma-butirolacton (0.81 ml, 9.4 mmol), y trietilamina (1.31 ml, 9.4 mmol) en metanol seco, libre de oxígeno (17 ml) se hierve por 18 h bajo reflujo. Los solventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo (635 mg) se somete a cromatografía en silica gel (100 g). La elución con acetato de etilo da A7. ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}): 1.33 (t, J = 7, SH); 1.90 (quint., J = 7, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}SH); 2.1 (amplitud, NH); 2.20 (t, J = 7, NH-CO-CH_{2} (CH_{2})_{2}SH); 2.39 (t, J = 6, CH_{2}NH); 2.53 (q, J = 7, CH_{2}SH); 3.43 (m, CH_{2}NH-CO); 3.5-3.67 (m, 4 OCH_{2}); 3.80 (s, OCH_{3}); 6.02 (amplitud, NH); 6.78-6.88 (2H), 7.15-7.25 (2H), 7.25-7.33 (4H), 7.35-7.45 (2H), 7.45-7.55 (4H) (arom. CH). MS (EI): 523 (M + H)+.

B Preparación de derivados de poliamida activados

Ejemplo B1

Preparación de N (6)-cloroacetil-poli-L-lisinas B1a, B1b y B1c

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31

\newpage

(a): 500 mg (2.39 mmol eq) de poli-L-lisina bromhídrico (M: 30,000-70,000) se suspenden en 8 ml de DMF bajo argón. La suspensión se enfría a 0ºC y se adicionan 2.5 ml de 2,6-lutidina. Una solución de 1 g (5.85 mmol) de anhídrido cloroacético en 4 ml de DMF se adiciona gota a gota en 15 min. La mezcla subsecuentemente se calienta lentamente a RT y se agita por 5 h. La solución ligeramente turbia, débilmente amarilla, se adiciona gota a gota a 100 ml de dietil éter/etanol (2:1) con la formación de un precipitado incoloro. Continuando con la filtración (a través de un filtro de vidrio sinterizado inicialmente sin aplicar vacío) el filtrado se realiza con etanol, agua, con etanol otra vez y finalmente con dietiléter. El producto crudo se disuelve en tan poco DMF como sea posible y se precipita una vez más en dietil éter/etanol. Después del secado en vacío a RT B1a [M: 30,000-70,000 (n \cong 250)] se obtiene. ^{1}H-NMR (DMSO, 500 MHz) \delta= 8.20 (2H, s, 2 x NH); 4.05 (2H, s, -CO-CH_{2}-Cl); 3.80 (1H, s, CH); 3.05 (2H, s, -CH_{2}-NH-CO-); 2.00-1.20 (6H, m, -CH-(CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-).

(b): De una manera análoga N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B1b [M: 4,000-15,000 (n \cong 50)] se obtiene de 50 mg (0.24 mmol eq) de poli-L-lisina bromhídrico (M: 4,000-15,000) y N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B1c [M: 150,000-300,000 (n \cong 1050)] se obtiene de 50 mg (0.24 mmol) de poli-L-lisina bromhídrico (M:150,000-300,000). Los espectros ^{1}H-NMR son idénticos a aquellos del compuesto B1a.

Ejemplo B2

Síntesis de N(6)-cloroacetil-poli-D-lisinas B2a, B2b y B2c

(a): En analogía al Ejemplo B1(a) N(6)-cloroacetil-poli-D-lisina B2a [M: 30'000-70'000 (n \cong 250)] se obtiene de 100 mg (0.48 mmol eq) de poli-D-lisina bromhídrico (M: 30,000-70,000), y N(6)-cloroacetil-poli-D-lisina B2b [M: 4'000-15'000 (n \cong 50)] de 250 mg (1.196 mmol eq) de poli-D-lisina bromhídrico (M: 4'000-15'000). Los espectrosH-NMR son idénticos a aquellos de compuestos B1a y B1b, respectivamente.

(b): Una solución de poli-D-lisina bromhídrico (478 mg, 2.29 mmol eq; M: 150'000-300'000) en agua (50 ml) se pasa a través de una columna (diámetro 2 cm, longitud 11 cm) llena con resina básica de intercambio iónico (DowexR 1 x8, malla 20-50, forma-OH). La elución con agua hasta que alcance el pH 7 se sigue por neutralización a pH 3 con ácido p-toluenosulfónico acuoso al 10%. Después de la liofilización del eluato, el residuo se disuelve en DMF (10 ml) y 2,6-lutidina también como una solución de anhídrido cloroacético (800 mg) en DMF (2 ml) se adicionan a 0ºC. Después de la agitación a 0ºC por 18 h bajo argón, la mezcla se diluye con etanol (100 ml) y el producto se precipita por la adición de dietil éter (250 ml). El precipitado, se colecta por filtración por gravedad, se vuelve a disolver en DMF (20 ml), y la solución luego se adiciona en 10 min a etanol (80 ml). La suspensión resultante se agita por 16 h a RT antes se adiciona dietiléter (300 ml) en 20 min. La filtración y el secado del precipitado a presión reducida (alto vacío) proporciona el B2c [M: 150'000-300'000 (n \cong 1000)]. El espectro 1H-NMR es idéntico a aquel compuesto B1c.

Ejemplo B3

Síntesis de N(6)-cloroacetil-poli-D/L-lisinas B3a, B3b y B3c

(a): 250 mg (1.19 mmol eq) de poli-D/L-lisina bromhídrico (M: 30'000-70'000) se suspenden en 4 ml de DMF bajo argón. La suspensión se enfría a 0ºC y se adicionan 1.25 ml de 2,6-lutidina. Una solución de 500 mg (2.93 mmol) de anhídrido cloroacético en 2 ml de DMF se adiciona gota a gota en 15 min. La mezcla subsecuentemente se calienta lentamente a RT y se agita por 16 h. La preparación y purificación toma lugar en analogía con el Ejemplo B1(a) para obtener B3a [M: 30'000-70'000 (n \cong 250)]. ^{1}H-NMR (DMSO, 500 MHz) \delta= 8.20 (1H, s, N(6)H); 8.05 y 7.90 (en cada caso 1/2H, 2s, N(2)H); 4.25 (1 H, s (br), CH); 4.05 (2H, s, -CO-CH_{2}-Cl); 3.05 (2H, s, -CH_{2}-NH-CO-); 1.70-1.20 (6H, m, -CH-(CH_{2})_{3}-CH_{2}-NH-).

(b): De una manera análoga N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B3b [M: 4'000-15'000 (n \cong 50)] se obtiene de 50 mg (0.24 mmol eq) de poli-D/L-lisina bromhídrico (M: 4'000-15'000), y N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B3c [M: 150'000-300'000 (n \cong 1050)] de 500 mg (2.392 mmol eq) de poli-L-lisina bromhídrico (M: 150'000-300'000). Los espectros ^{1}H-NMR son idénticos a aquellos del compuesto B3a.

Ejemplo C1

Preparación de conjugados Tipo I

(i) A partir del poli-N (6)-cloroacetil-L-lisina:

(a): B1a (10 mg, 0.0489 mmol eq) y tiol A2 (10.3 mg, 0.0147 mmol) se disuelven, en sucesión, en 2.0 ml de DMF seco y libre de oxígeno a RT y bajo argón. Se adiciona DBU (7.3 \mul, 0.0489 mmol) a la solución clara. Después de la agitación a RT por 1 h se adicionan tioglicerol (12.7 \mul, 0.147 mmol) y trietilamina (33.4 \mul, 0.24 mmol) y la agitación se continua por 18 h. La solución incolora se adiciona gota a gota a 15 ml de dietil éter/etanol (1: 1). Los precipitados fabricados se separan por filtración a través de un embudo de embudo filtrante por gravedad, se lava con éter/etanol (1: 1), se disuelve en agua, y la solución resultante se somete a ultrafiltración utilizando un equipo Amicon equipado con una membrana YM-3 (MW 3000 límite). El lavado se hace con cinco porciones de 10 ml de agua ultrapura. La liofilización de los contenidos de la cámara filtro ocupados en agua proporciona C1a [x = 0.25 (n \cong 250)] con 25% de derivatización del sacarido (x = 0.25) de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración de señales seleccionadas). ^{1}H-NMR(500 MHz, D_{2}O), señales seleccionadas: 2.26-2.36 (m, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}S, A2); 2.53-2.58 (m, NH-CO-CH_{2}CH_{2}CH_{2}S, A2); 2.58-2.68 y 2.7-2.8 (2m, SCH_{2}-CHOH-CH_{2}OH); 4.49 y 4.51 (2d, J = 8, H-C(1), H-C(1'), A2); 5.12 (d, J = 4, H-C(1''), A2).

B1a se trata con cantidades que varían de A2, A3, A4 o A8 y tioglicerol como se describe arriba dando los conjugados Tipo I de la derivatización de sacáridos que varían de acuerdo con el ^{1}H-NMR (integración).

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Conjugados Tipo I	Cantidad de B1a	Cantidad de A2, A3,	% de derivatización
(n \cong 250)		A4 o A8	del sacárido
C1b	10 mg, 48.9 \mumol eq	A2: 3.44 mg, 4.89 \mumol	8% (x = 0.08)
C1c	10 mg, 48.9 \mumol eq	A2: 6.89 mg, 9.78 \mumol	16% (x = 0.16)
C1d	10 mg, 48.9 \mumol eq	A2: 17.2 mg, 24.5 \mumol	41% (x = 0.41)
C1en	10 mg, 48.9 \mumol eq	A2: 24.1 mg, 34.2 \mumol	61% (x = 0.61)
C4	20 mg, 97.8 \mumol eq	A3: 19.5 mg, 29.3 \mumol)	23% (x = 0.23)
C5	30 mg, 146.7 \mumol eq	A4: 23.9 mg, 44 \mumol)	25% (x = 0.25)
C1k	10 mg, 48.9 \mumol eq	A8: 12.6 mg, 12 \mumol)	22% (x = 0.22)

(b): En analogía a (a) a partir de B1b (20 mg, 97.8 \mumol eq), A2 (20.7 mg, 29.3 \mumol) y tioglicerol proporciona C1f (n \cong 50) derivatización del sacarido: 28% (x = 0.28).

(c): B1c se trata con diversas cantidades de A2, A4 o A8 y tioglicerol según se describe arriba dando los conjugados Tipo I de diversas derivatizaciones del sacarido de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración).

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Conjugados Tipo I	Cantidad de B1c	Cantidad de A2,	% de derivatización
(n \cong 1050)		A4 o A8	del sacárido
C1g	10 mg, 48.9 \mumol eq	A2: 10.3 mg, 14.7 \mumol	28% (x = 0.28)
C1h	20 mg, 97.8 \mumol eq	A4: 14.3 mg, 26.4 \mumol	21% (x = 0.21)
C1i	20 mg, 97.8 \mumol eq	A8: 25.1 mg, 24 \mumol	25% (x = 0.25)
C1j	70 mg, 342 \mumol eq	A2: 24.1 mg, 34.2 \mumol	9% (x = 0.09)
		A8: 35.2 mg, 34.2 \mumol	9% (x = 0.09)
		A4: 18.6 mg, 34.2 \mumol	9% (x = 0.09)

(ii)

(a): A partir de poli-N(6)-cloroacetil-D-lisina: B2a (10 mg, 48.9 \mumol eq) se trata con A2 (10.3 mg, 14.7 \mumol) y tioglicerol como se describe en el ejemplo C1 (i) a. La filtración de los contenidos de la cámara de ultrafiltración a través de un Acrodisc^{TM} y la liofilización del filtrado da C2 [x = 0.35 (n \cong 250)] con 35% de derivatización del sacarido (x = 0.35) de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración).

(b): En analogía a (a) a partir de B2c (100 mg, 489 \mumol eq), A2 (86 mg, 122 \mumol) y tioglicerol proporciona C2b (n \cong 1000), derivatización del sacarido: 24% (x = 0.24).

(iii) A partir de poli-N(6)-cloroacetil-D, L-lisina: B3a (10 mg, 0.0489 mmol eq) se trata con A2 (10.3 mg, 0.0147 mmol) y tioglicerol como se describe en ejemplo C1 (i) a dando el C3 [x = 0.22 (n \cong 250)] con 22% de derivatización del sacarido (x = 0.22) de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración).

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Ejemplo C2

Preparación de los precursores de conjugados Tipo II

(i) Los precursores de conjugados Tipo II en donde -Y-R^{03} es un grupo de fórmula Vc (derivado de A2, tri)

(a): Poli-N (6)-cloroacetil-L-lisina (B1a, 200 mg, 978 \mumol eq), tiol A2 (172 mg, 244 \mumol) y tiol A7 (15.3 mg, 29.3 \mumol) se disuelven en DMF seco, libre de oxígeno (20 ml). Se adiciona DBU (146 \mul, 0.978 mmol) a la solución clara. Después de la agitación por 40 min a RT y bajo argón, se adicionan tioglicerol (254 \mul, 2.934 mmol) y trietilamina (682 \mul, 4.89 mmol) y la agitación se continúa durante 18 h. La solución incolora se adiciona a 100 ml de etanol y se adiciona dietiléter (200 ml) gota a gota bajo agitación. El precipitado formado se separa por filtración a través de un embudo filtrante por gravedad, se lava con etanol/éter (1: 2, 3 x 30 ml) y se disuelve en agua. La solución se somete a ultrafiltración utilizando un equipo Amicon habilitado con una membrana YM-3 (MW = 3000 límite). La liofilización de los contenidos de la cámara de filtración ocupados en agua proporciona C6aI [x = 0.25, y = 0.03 (n \cong 250)].

(b): A una solución de C6aI (366 mg) en agua (25 ml) se le adiciona ácido tricloroacético (1.2 g) a 0ºC. Después de la agitación por 2 h a 0ºC la solución se neutraliza a pH 11 con hidróxido de sodio 2 N y se somete a ultrafiltración utilizando un equipo Amicon habilitado con una membrana YM-10 (MW = 10000 límite). El lavado se hace con tres porciones de agua ultrapura. Después de la adición de NaOH 2 N (10 gotas) a la cámara de filtración, se continúa lavando con agua (seis porciones). La liofilización de los contenidos de la cámara de filtración ocupados en agua proporciona el C6bI [x = 0.25, y = 0.02 (n \cong 250)] con 25% de derivatización del sacarido (x = 0.25) de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración de señales seleccionadas), y 2% de derivatización de aminas (y = 0.02) basado en el análisis-NMR de C6aI y la ausencia de las señales de monometoxi-tritil en el ^{1}H-NMR de C6bI: ^{1}H-NMR (500 MHz, D_{2}O, 60ºC), señales seleccionadas: 2.65-2.75 (m, NH-CO-CH_{2}CH_{2})_{2}S, R_{1}, R_{2}); 2.95-3.01 (m, NHCO-(CH_{2})_{2}CH_{2}S, R_{1}, R_{2}); 3.01-3.08 y 3.13-3.19 (2m, HOCH_{2}-CHOH-CH_{2}S, R_{3}); 4.87-4.95 (m, H-C(1), H-C(1'), R_{1}); 5.52 (m, H-C(1''), R_{1}).

: Poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina de diferente grado de polimerización cada uno se trata con tioglicerol y diversas cantidades de A7 y A2 según se describe arriba dando C6bII, C6bIII y C6bIV de variadas derivatizaciones de aminas y sacáridos de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración).

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Precursores de	Cantidad de	Cantidad de	Cantidad de	% de	% de funciones
conjugados	poli-(6)cloro-	A2	A7	derivatización	amina
Tipo II	acetil-L-lisina			del sacárido
C6bII B1c:	100 mg,	51.6 mg,	7.66 mg,	13%	2.6%
(n \cong 1050)	489 \mumol eq	73.4 \mumol	14.7 \mumol	(x = 0.13)	(y = 0.026)
C6bIII B1a:	100 mg,	51.6 mg,	7.66 mg,	14%	2.6%
(n \cong 250)	489 \mumol eq	73.4 \mumol	14.7 \mumol	(x = 0.14)	(y = 0.026)
C6bIV B1b:	150 mg,	129.1 mg,	19.1 mg,	23%	3%
(n \cong 50)	733.5 \mumol eq)	183.4 \mumol	36.67 \mumol	(x = 0.23)	(y = 0.03)

(ii) Los precursores de conjugados Tipo II en donde -Y-R^{03} es un grupo de fórmula Vb (derivado de A4, di), Va (derivado de A6, mono), Vf (derivado de A8, penta) o Ve (derivado de A10, penta)

: Poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina se trata con tioglicerol y variadas cantidades de A7 y A4, A6, A8 o A10 según se describe arriba (ejemplo C2i) dando C7a, C7b, C8bI, C9bI y C10bI de variadas derivatizaciones de aminas y sacáridos de acuerdo con ^{1}H-NMR (integración).

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Precursores de	Cantidad de	Cantidad de	Cantidad de	% de	% de
conjugados	poli-N(6)-loro-	tiol A6, A4,	A7	derivatización	funciones
Tipo II	acetil-L-lisina	A8 o A10		del sacárido	amina
C7a	B1: 70 mg,	A6: 26 mg,	5.36 mg,	20%	3%
(n \cong 160)	342 \mumol eq	68.5 \mumol	10.3 \mumol	(x = 0.20)	(y = 0.03)
C7b	B1a: 111 mg,	A6: 50 mg,	8.6 mg,	21.5%	2%
(n \cong 250)	54.3 \mumol eq	109 \mumol	16.4 \mumol	(x = 0.215)	(y = 0.02)

(Continuación)

Precursores de	Cantidad de	Cantidad de	Cantidad de	% de	% de
conjugados	poli-N(6)-loro-	tiol A6, A4,	A7	derivatización	funciones
Tipo II	acetil-L-lisina	A8 o A10		del sacárido	amina
C8b	B1c: 130 mg,	A4: 51.9 mg,	10.0 mg,	16%	2.5%
(n \cong 1050)	635.7 \mumol eq	95.6 \mumol	19.1 \mumol	(x = 0.16)	(y = 0.025)
C9b	B1c: 99.7 mg,	A8: 75.1 mg,	7.6 mg,	12.5%	2.5%
(n \cong 1050)	488 \mumol eq	73.1 \mumol	14.6 \mumol	(x = 0.125)	(y = 0.025)
C10b	B1c: 500 mg,	A10:376 mg,	38.2 mg,	16%	2.5%
(n \cong 1050)	2.44 mmol eq	366 \mumol	73.2 \mumol	(x = 0.16)	(y = 0.025)

D Preparación de los conjugados Tipo II

Ejemplo D1

Los conjugados Tipo II que comprende CH-Sepharose 4B

(a): C6bI: 4.0 g NHS-activated CH-Sepharose 4B (Pharmacia Biotech) se lavaron con HCl 1 mM (800 ml en un embudo filtrante (15 min) y se adiciona a una solución de C6bI (20 mg) en NaHCO_{3}-solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 8, 6 ml). Después de la agitación por 2 h a RT la solución reguladora se separa por filtración por gravedad y la resina se lava con NaHCO_{3}-solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 8, 3 veces 50 ml) antes del tratamiento con 1 M etanolamina (pH 8) por 1 h a RT. La filtración y el lavado con agua (3 veces 20 ml), TRIS-solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 8, 30 ml), acetato solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 4, 30 ml) - alternando 3 veces -, y 20% de etanol (3 veces 50 ml) da D1a con 5 \mumol de epitope de carbohidrato por ml de resina almacenada en 20% etanol.

(b): C7a: 1.0 g NHS-activated CH Sepharose 4B se trata como arriba (ejemplo D1a) con una solución de C7a (25 mg) en NaHCO_{3}0.1 M (0.5 M NaCl, pH 8, 6 ml) proporcionando D1b con 4 \mumol de epitope de carbohidrato por ml de resina almacenada en 20% de etanol.

Ejemplo D2

Los conjugados Tipo II que comprende Sepharose 4 Fast Flow

11 ml de Sepharose 4 fast flow suspendidos en 2-propanol se lavaron con HCl 1 mM frío (0ºC) (6 veces con 20 ml) y se transfirieron con NaHCO_{3}-solución reguladora (0.1 M, 0.05 M en NaCl, pH 8, 1.5 ml) frío (0ºC) a una solución del precursor C6bI (150 mg) en 6 ml de NaHCO_{3}-solución reguladora (0.1 M, 0.05 M en NaCl, pH 8, 6 ml) a 0ºC. Después de la agitación por 3 h a RT la mezcla se filtra y la resina se lava con agua (50 ml) antes de ser suspendida en etanolamina 1 M (pH 8, 20 ml) y agitada a RT por 15 h. La resina se separa por filtración y se lava alternativamente con TRIS-solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 8, 30 ml) y acetato-solución reguladora (0.1 M, 0.5 M en NaCl, pH 4, 30 ml) tres veces proporcionando D2a con 5 \mumol del epitope de carbohidrato por ml de resina almacenado en 20% de etanol.

De acuerdo con el procedimiento de arriba se preparan los conjugados Tipo II D2b, D3, D5, D6, D7 y D8:

Conjugado Tipo II	Cantidad de sepharose	Precursor en 1 ml 0.1	Epitopes de azúcar por
		M NaHCO_{3} (0.5 M	ml resina
		NaCl, pH 8)
D2b	11 ml	C6bII (146 mg)	3.9 \mumol
D3	11 ml	C6bIII (141.5 mg)	3.9 \mumol
D5	2 ml	C7b (24.8 mg)	7 \mumol
D6	11 ml	C8b (140 mg)	4.7 \mumol
D7	11 ml	C9b (165 mg)	2.9 \mumol
D8	50 ml	C10b (800 mg)	3 \mumol

E Actividad biológica de los compuestos

Ejemplo E1

Afinidades de enlace de los conjugados Tipo I

Las placas Nunc Polysorp (catálogo # 475094) se recubren durante la noche a 4ºC con 0.1 ml/pozo de una solución de 5 \mug/ml de C1g (\rightarrowC1g-ELISA) o C1h (\rightarrowC1h-ELISA) o C1i (\rightarrowC1i-ELISA) en PBS. Las placas se bloquean con 0.250 ml/pozos de una solución al 10% de SEA BLOCK (Pierce, catálogo # 37527) por 24 h a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con 0.250 ml de PBS que contiene 0.02% de Tween 20.

Un combinado de suero humano (Sigma H-1513) se diluye 1:20 en solución reguladora PBS que contiene 0.1% de Tween 20 y 10% del Bloqueador BSA (Pierce catálogo # 37525). Una alícuota de 60 \mul de la dilución de suero humano se coloca en los pozos en forma de U de bajo-enlace y 60 \mul de una dilución serial del conjugado Tipo I se adiciona en los pozos sucesivos en las series apropiadas de concentraciones.

Después de 1 h de incubación a RT 0.100 ml de la mezcla de suero se transfieren en los pozos revestidos de polímero lavados. Las placas se incuban por 1 h a RT y se lavan 3 veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. Las placas luego se llenan con 0.100 ml de una dilución 1:2500 de un conjugado IgG-peroxidasa anti humano (Jackson Immunoresearch 109-036-098) o, alternativamente, con un conjugado IgM-peroxidasa anti humano (Jackson Immunoresearch 109-036-129) en PBS que contiene 10n% del Bloqueador BSA y 0.1n% de Tween 20. Las placas se incuban por 1 h a RT y luego se lavan 5 veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. Las placas se cultivan con 0.100 ml de sustrato TMB (Sigma catálogo # T-3405) y se detiene después de 10 min de desarrollo del sustrato con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M. La absorbancia se lee a 450-650 nm utilizando a lector de placa de microtitulación. Para el análisis los valores de absorbancia se registran contra las concentraciones del conjugado. Trisacárido B lineal (Dextra catálogo # GN334) se utiliza como un estándar para la medición de la IC_{50} relativa.

TABLA 1 Afinidades del enlace de los conjugados Tipo I medidas con placas recubiertas de C1g Las afinidades se tabulan como afinidades del enlace relativas (RIC_{50}= IC_{50} Lineal B/IC_{50} compuesto)

Compuesto	RIC_{50} IgG	RIC_{50} IgM	Compuesto	RIC_{50} IgG	RIC_{50} IgM
C1b	.0070	.0134	C2	.0007	.0026
C1c	.0017	.0066	C3	.0004	.0013
C1a	.0018	.0040	C4	.004	.013
C1d	.003	.133	C1g	.0004	.0001
C1e	.007	>.3	C1f	.002	.07
C5	.18	.009

Ejemplo E2

Eliminación del Xenoanticuerpo de los monos Cynomolgus

Un grupo de 4 monos Cynomolgous (peso medio 3 kg) se inyectan con un 1 mg/kg de dosis del conjugado Tipo I a 0, 72 y 168 h. Los animales se desangran en varios intervalos y el suero se analiza para anticuerpos anti-\alphaGal por ELISA contra C1g (Ejemplo E1). Una sola dosis de conjugado Tipo I provoca una disminución aguda en el título del anticuerpo, seguido por una recuperación del título del anticuerpo a un valor debajo del título inicial. Por una segunda y particularmente una tercera dosis la recuperación del título del anticuerpo en efecto se detiene por un largo periodo de tiempo.

TABLA 3 Títulos del anticuerpo en monos Cynomolgus que reciben inyecciones de C1g Los resultados se tabulan como títulos relativos a un suero humano estándar

	Animal 1	Animal 2	Animal 3	Animal 4
Tiempo (h)	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM	IgG	IgM
0	1.6	0	0.85	0.95	1.5	0.17	0.24	3
1	0	0	0	0.11	0	0	0	0.07
72	0.31	0	0.35	0.08	0.16	0	0.06	0.32
73	0	0	0	0	0	0	0	0.01
168	0.21	0	0.4	0.34	0.29	0.05	0.03	0.95
169	0	0	0	0	0	0	0	0.13
264	0.18	0	0.1	0.41	0.06	0.12	0.06	0.84
672	0.73	0	0.45	0.51	0.44	0.38	0.23	1.55

Ejemplo E3

Medición del título de los anticuerpos

Las placas Polysorp Nunc (catálogo # 475094) se recubren durante la noche a 4ºC con 0.1 ml/pozo de una solución 5 \mug/ml de C1g o C1h o C1i en PBS. Las placas se bloquean con 0.250 ml/pozo de una solución al 10% de SEA BLOCK (Pierce, catálogo # 37527) por 24 h a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con 0.250 ml de PBS que contienen 0.02% de Tween 20. Una alícuota de 0.100 ml de la muestra de suero se adiciona a los pozos en diluciones sucesivas. Típicamente las diluciones son como sigue 1:5; 1:15; 1:45; 1:135; 1:405; 1:1215; 1:3645; 1:10935 etc. El diluente es solución reguladora PBS que contiene 0.1% de Tween 20 y 10% de SEABLOCK. Las placas se incuban por 1 h a RT y se lavan tres veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. Las placas luego se llenan con 0.100 ml de una dilución 1:2500 de un conjugado de IgG-peroxidasa anti humano (Jackson Immunoresearch 109-036-098) o, alternativamente, con un conjugado de IgM-peroxidasa anti humano (Jackson Immunoresearch 109-036-129) en PBS que contiene 10% de Bloqueador BSA y 0.1% de Tween 20. Las placas se incuban por 1 h a RT y luego se lavan 5 veces con PBS que contiene 0.02% de Tween 20. Las placas se cultivan con 0.100 ml de sustrato TMB (Sigma catálogo # T-3405) y se detiene después de 10 min de desarrollo del sustrato con 50 \mul de 2 M H_{2}SO_{4}. La absorbancia se lee a 450-650 nm utilizando un lector de placa de microtitulación. Para el análisis los valores absorbancia se registran contra el log del factor de dilución y el título se encuentra por extrapolación de la porción lineal de la curva al eje de X. Se utiliza un suero estándar título que se normaliza a 1.

Ejemplo E4

Cromatografía de Inmunoafinidad del Suero Humano

5 ml del conjugado Tipo II inmovilizado se empaca en un columna (1x3.5 cm). El combinado de suero humano (Sigma H-1513, se filtra a través de un filtro de 0.4 \mum) se pasa a través de la columna por bombeo a una rata de flujo de 4 ml/min. Después de la columna, las fracciones de cada 10 ml se colectan. Las fracciones se analizan para la presencia de anticuerpos xenoreactivos anti Gal\alpha1, 3Gal utilizando un ensayo ELISA según se describe en el Ejemplo E3 arriba. Utilizando el material del Ejemplo D2 al menos 200 ml del combinado de suero de sangre humana por ml gel se limpia en un solo paso.

Ejemplo E5

Comparación de la afinidad del enlace y especificidad del anticuerpo de D2b, D6 y D7

Un volumen de 200 ml de suero se pasa a través de una primera columna llena con D6 y probada en los ensayos de ELISA (de acuerdo con el Ejemplo E3). El suero subsecuentemente se pasa a través de una segunda columna llena con D2b, probada, y luego se pasa a través de una tercera columna llena con D7 y probada por ELISA nuevamente. Las muestras después de cada columna se analizan. Cada una de las columnas probadas es más eficiente en la extracción de los anticuerpos contra el tipo de oligosacárido implicado. De esa manera D6 es eficiente en la extracción de anticuerpos unidos a un disacárido, D2b retira los anticuerpos unidos a un trisacárido y D7 retira los anticuerpos unidos a un pentasacárido. El suero pasado a través de dos columnas se agota de anticuerpos contra los dos epitopes transportados por estas columnas, pero retiene los anticuerpos contra el tercer epitope. El suero pasado de las tres columnas se agota de anticuerpos contra los tres sacáridos.

Ejemplo E6

Afinidad del enlace y especificidad del anticuerpo de la columna de lecho mixto

2 ml de D6, 2 ml de D2b y 1 ml de D7 se mezclan. El material se empaca en una columna de 5 ml y 200 ml de suero humano se pasa a través de esta. Las fracciones son de 10 ml cada una. Toda la segunda fracción recolectada se analiza. Las fracciones se analizan por ELISA para los tres antígenos \alpha-galactosilados y también para citotoxicidad hacia las células PK1. La columna de lecho mixto eficientemente retira la actividad del anti-\alphaGal del suero según se mide por los tres ensayos de ELISA como se describe en el Ejemplo E3.

Ejemplo E7

Enlace del Anticuerpo a las células del cerdo

La muestras de suero pasadas después de cada columna (Ejemplo E5) se analizan para el enlace a las células de cerdo PK15 (ATCC #CCL-33). Las células se tripsinizan y 1x10^{6} células se suspenden en 0.3 ml de PBS/0.1% BSA. Las células se incuban con 0.040 ml de muestra de suero (pre-tratadas por 10 min a 56ºC) por 30 min en hielo. Las células se llevan a 3 ml de PBS, se centrifugan y resuspenden en 0.3 ml PBS 0.1% de BSA. Una alícuota de 0.004 ml de un anticuerpo secundario (anti hlgG/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-098 o anti hlgM/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-129) se adiciona e incuba por 30 min en hielo. Después de lavadas una vez en PBS las células se analizan por FACS. La media de fluorescencia del combinado de suero humano es 480, de suero después de la columna D6 (Ejemplo E5) es 117, de suero después de las columnas D6 y D2b (Ejemplo E5) es 80, de suero después de las columnas D6, D2b y D7 (Ejemplo E5) es 54 y de suero después de la columna de lecho mixto (Ejemplo E6) es 52 (todos obtenidos con el anticuerpo anti hlgG). Resultados similares se obtuvieron con las medidas del anti hlgM.

Ejemplo E8

Inmunoaféresis de anticuerpos anti-\alphaGal en babuinos

Un volumen de 7 ml D6, 7 ml D2b y 5 ml D7 se combina con 45 ml de Sepharose CL2B (Pharmacia) para hacer una columna de. La columna se utiliza con un sistema de inmunoaféresis Citem 10 (Excorim) para retirar los anticuerpos anti-\alphaGal de 2 babuinos (6 kg peso). Después se pasan de 600 ml y 500 ml respectivamente a través de la columna (ca. 2 volúmenes de sangre) los títulos del anticuerpo anti-\alphaGal caen el 10% de los niveles iniciales (según se cuantifica por un ELISA contra C1g, Ejemplo E3).

Claims

1. Un conjugado de poliamida que comprende un grupo xenoantigénico unido a un a esqueleto de poliamida, en donde el esqueleto de poliamida comprende al menos un elemento estructural de fórmula laa,

32

en donde R^{03a}-Y- es un grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve o Vf

33

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34

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35

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36

37

2. Un conjugado de poliamida de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el esqueleto de poliamida se une a una entidad macromolecular o macroscópica y además a) comprende al menos un elemento estructural de fórmula II,

38

en la cual

A' es un grupo de puente trivalente;

R^{1}' es un enlace directo o alquileno C_{1}-C_{6};

X^{1}' es -C(O)O-, -C(O)NR-, -NR-, -S- o -O-;

R^{2}' es un enlace directo o un grupo de puente bivalente;

Y' es un enlace directo o un grupo de puente bivalente;

con la condición de que X^{1}' no sea -NR-, -S- o -O- cuando R^{1}' es un enlace directo.

y b) se une a una entidad macromolecular o macroscópica vía y' del elemento estructural de fórmula II.

3. Un conjugado de poliamida de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el esqueleto de poliamida comprende al menos un elemento estructural de fórmula IIa,

39

en la cual -Y'-R04 es un grupo de fórmula Vg

40

4. Un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el esqueleto de poliamida adicionalmente comprende al menos un elemento estructural de fórmula VIb

41

5. Un conjugado de poliamida de acuerdo con la reivindicación 4 en donde la suma media de los elementos estructurales [n] está (a) en el rango de 200 a 300 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2 y la relación de los elementos estructurales de fórmula laa [x] es 5 a 30%; o en el rango desde 900 a 1200 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2 y [x] es 5 a 50%; con una relación de los elementos estructurales de fórmula VIb [z] fluctuando entre 45 a 94%; R^{03a}-Y- siendo idéntico o diferente y seleccionado de los grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve y Vf; o

(b) en el rango desde 200 a 300 con una polidispersidad desde 1.1 a 1.2, la relación de los elementos estructurales de fórmula laa [x] en donde R^{03}-Y- es un grupo seleccionado de un grupo que consiste de grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve y Vf es 5 a 30% y la relación de los elementos estructurales de fórmula IIb [y]

42

en donde A', R^{1}', X^{1}', R^{2}' y X^{2}' son como se definieron en la reivindicación 2 y Z-Y'' es H_{2}N[(CH_{2})_{2}O](CH_{2})_{2}NHC(O)(CH_{2})_{3}-, esta entre 1 a 5%; o en el rango de 900 a 1200 con una polidispersidad entre 1.1 a 1.2, [x] esta entre 5 a 50% y [y] esta entre 1 a 5%; con una relación de los elementos estructurales de fórmula VIb [z] fluctuando entre 45 a 94%.

6. Una composición que comprende un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 5 o una mezcla de tales conjugados de poliamida para utilizar en un método de eliminación de los xenoanticuerpos del fluido corporal humano o Para la inducción de la tolerancia o la anergia hacia los epitopes xenoantigénicos o para apuntar específicamente a las células B con receptores xenoantigénicos.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el conjugado de poliamida comprende al menos un elemento estructural en donde el grupo xenoantigénico se deriva de un disacárido, al menos un elemento estructural en donde el grupo xenoantigénico se deriva de un trisacárido y al menos un elemento estructural en donde el grupo xenoantigénico se deriva de un pentasacárido, en una relación de 1:1:1; o una mezcla de conjugados de poliamida cada conjugado que comprende grupos xenoantigénicos idénticos, los grupos xenoantigénicos se derivan de un disacárido, un trisacárido o un pentasacárido, los conjugados están presentes en la composición en una relación de 1:1:1.

8. Una composición que comprende un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o una mezcla de tales conjugados de poliamida para utilizar en un método de eliminación de xenoanticuerpos de un fluido corporal humano.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 en donde el conjugado de poliamida comprende al menos un elemento estructural en donde el grupo activo biológicamente se deriva de un disacárido, al menos un elemento estructural en donde el grupo activo biológicamente se deriva de un trisacárido y al menos un elemento estructural en donde el grupo activo biológicamente se deriva de un pentasacárido, en una relación de 1:1:1; o una mezcla de conjugados de poliamida cada conjugado que comprende grupos activos biológicamente idénticos, los grupos activos biológicamente se derivan de un disacárido, un trisacárido o un pentasacárido, los conjugados están presentes en la composición en una relación de 1:1:1.

10. Un cartucho de cromatografía de afinidad que comprende como adsorbente de un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o una mezcla de estos o una composición de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

11. El uso de un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 5, o una composición de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento para eliminar de manera intracorporal los anticuerpos xenoantigénicos de un recipiente de injerto heterólogo.

12. El uso de un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 5, o una composición de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento para la inducción de manera intracorporal de la tolerancia o anergia hacia epitopes xenoantigénicos o para apuntar específicamente las células B con receptores xenoantigénicos.

13. El uso de un conjugado de poliamida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9 para la preparación de un agente para eliminar de manera extracorporal los anticuerpos de un fluido corporal humano.