ES2256857T3 - Sintesis del antigeno asociado al tumor de mama definido por el anticuerpo monoclonal mbr1 y sus usos. - Google Patents

Sintesis del antigeno asociado al tumor de mama definido por el anticuerpo monoclonal mbr1 y sus usos.

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ES2256857T3 ES96913895T ES96913895T ES2256857T3 ES 2256857 T3 ES2256857 T3 ES 2256857T3 ES 96913895 T ES96913895 T ES 96913895T ES 96913895 T ES96913895 T ES 96913895T ES 2256857 T3 ES2256857 T3 ES 2256857T3
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Shuang Hua Hu
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN PROCESO PARA SINTETIZAR UN COMPUESTO QUE POSEE LA ESTRUCTURA (I), EN LA QUE R ES H, ASI COMO OLIGOSACARIDOS RELACIONADOS UTILES COMO VACUNAS PARA INDUCIR ANTICUERPOS CONTRA CELULAS DE CANCER DE MAMA HUMANAS EN UNA TERAPIA ADYUVANTE PARA LA MISMA.

Description

Síntesis del antígeno asociado al tumor de mama definido por el anticuerpo monoclonal MBR1 y sus usos.
Esta solicitud es una continuación en parte del documento U.S. Nº de Serie 08/213.053, presentado el 15 de Marzo de 1994.
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo las subvenciones GM-15240-02, GM-16291-01 y AI-16943 de the National Institutes of Health. De acuerdo con esto, el gobierno de los EE.UU. tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
A lo largo de esta memoria descriptiva, las citas de diversas publicaciones se proporcionan entre paréntesis en el texto.
La función de los carbohidratos como materiales estructurales y como unidades de almacenamiento de energía en sistemas biológicos es bien conocida. En contraste, el papel de los carbohidratos como moléculas de señalización en el contexto de los procesos biológicos solo se ha apreciado recientemente (M.L. Phillips, E. Nudelman, F.C.A. Gaeta, M. Pérez, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Science, 1990, 250, 1130; M.J. Polley, M.L. Phillips, E. Wagner, E. Nudelman, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 6224: T. Taki, Y. Hirabayashi, H. Ishikawa, S. Kon, Y. Tanaka, M. Matsumoto, J. Biol Chem., 1986, 261, 3075; Y. Hirabayashi, A. Hyogo, T. Nakao, K. Tsuchiya, Y. Suzuki, M. Matsumoto, K. Kon, S. Ando, ibid., 1990, 265, 8144; O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R. U. Lemieux, Carbohydr. Res., 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemieux, ibid., 1988, 174, 211). La elucidación del alcance de la implicación de los carbohidratos para mediar en la interacción celular es un área de indagación importante en la investigación biomédica contemporánea. Las moléculas de carbohidrato, que llevan una información estructural detallada, tienden a existir como glicoconjugados (cfr. glicoproteínas y glicolípidos) en vez de como entidades libres. Dadas las complejidades a menudo asociadas con el aislamiento de los conjugados en forma homogénea y las dificultades para recuperar carbohidratos intactos de estos conjugados presentes en la naturaleza, la aplicabilidad de los enfoques sintéticos es evidente. (Para revisiones recientes de la glicosilación véanse: Paulsen, H., Agnew. Chemie Int. Ed. Engl., 1982, 21, 155; Schmidt, R.R., Angew. Chemie Int. Ed. Engl., 1986, 25, 212; Schmidt, R.R., Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 6, Capítulo 1(2), Pergamon Press, Oxford, 1991; Schmidt, R.R., Carbohydrates, Synthetic Methods and Applications in Medicinal Chemistry, Parte I, Capítulo 4, VCH Publishers, Weinheim, Nueva York, 1992. Para el uso de glicales como donantes de glicosilo en la síntesis de glicósidos, véanse Lemieux, R.U., Can. J. Chem., 1964, 42, 1417; Lemieux, R.U., Faser-Reid, B., Can. J. Chem., 1965, 43, 1460; Lemieux, R.U., Morgan, A.R., Can. J. Chem., 1965, 43, 2190; Thiem, J., Karl, H., Schwentner, J., Synthesis, 1978, 696; Thiem. J. Ossowski, P., Carbohydr. Chem., 1984, 3, 287; Thiem, J., Prahst, A., Wendt, T. Liebígs Ann. Chem., 1986, 1044; Thiem, J. en Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry, Horton, D., Hawkins, L.D., McGarvvey, G.L., eds., ACS Symposium Series Nº 386, American Chemical Society, Washington, D.C., 1989, Capítulo 8).
Los dominios de carbohidrato de las sustancias de grupo sanguíneo contenidas tanto en las glicoproteínas como en los glicolípidos están distribuidos en los eritrocitos, las células epiteliales y diversas secreciones. El foco inicial en estos sistemas se centró en su papel principal para determinar las especificidades para el grupo sanguíneo (R.R. Race y R. Sanger, Blood Groups in Man, 6ª ed., Blackwell, Oxford, 1975). Sin embargo, se sabe que tales determinantes están ampliamente implicados en los fenómenos de adhesión y unión celular (Por ejemplo, véanse, M.L. Phillips, E. Nudelman, F.C.A. Gaeta, M. Pérez, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Science, 1990, 250, 1130). Por otra parte, conjuntos relacionados con las sustancias de grupo sanguíneo en forma conjugada se encuentran como marcadores para el inicio de diversos tumores (K.O. Lloyd, Am. J. Clinical Path., 1987, 87, 129; K.O. Lloyd, Cancer Biol., 1991, 2, 421). Factores antigénicos tumorales basados en carbohidratos podrían encontrar aplicaciones a nivel diagnóstico, como fuentes en el aporte de fármacos o idealmente en la inmunoterapia (Toyokuni, T., Dean, B., Cai, S., Boivin, D., Hakomori, S. y Singhal, AX., J. Am. Chem Soc., 1994, 116, 395; Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K., Jackson, V., Hamada, H., Paardoll, D., Mulligan, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 3539; Tao, M-H., Levy, R., Nature, 1993, 362, 755; Boon, T., Int. J. Cancer, 1993, 54, 177; Livingston, P.O., Curr. Opin. Immunol, 1992, 4, 624; Hakomori, S., Annu. Rev. Immunol., 1984, 2, 103; K. Shigeta y otros, J. Biol Chem., 1987, 262, 1358).
La presente invención proporciona nuevas estrategias y protocolos para la síntesis de oligosacáridos. El objetivo es simplificar tales construcciones de modo que dominios relativamente complejos puedan ensamblarse con alta estereoespecificidad. Avances principales en la síntesis de glicoconjugados requieren la obtención de un alto grado de convergencia y el alivio de las cargas asociadas con la manipulación de grupos de bloqueo. Otro requisito es el de aportar el determinante de carbohidrato con el suministro apropiado para la conjugación a proteínas o lípidos portadores (Bernstein, M.A. y Hall, L.D., Carbohydr. Res., 1980, 78, CI; Lemieux, R.U., Chem. Soc. Rev., 1978, 7, 423; R.U. Lemieux y otros, J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 4076). Esta es una condición crítica si los carbohidratos derivados sintéticamente han de incorporarse a portadores adecuados para una aplicación biológica.
Los antígenos que son selectivos o idealmente específicos para células cancerosas podrían resultar útiles para fomentar la inmunidad activa (Hakomori, S., Cancer Res., 1985, 45, 2405-2414; Feizi, T., Cancer Surveys, 1985, 4, 245-269). A menudo nuevos patrones de carbohidratos son presentados por células transformadas como glicoproteínas de la superficie celular o como glicolípidos anclados a la membrana. En principio, los glicoconjugados sintéticos bien elegidos que estimulan la producción de anticuerpos podrían conferir inmunidad activa contra cánceres que presentan tipos estructurales equivalentes sobre sus superficies celulares (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., en Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences pp. 50-58). Las posibilidades de una terapia satisfactoria mejoran con la restricción creciente del antígeno a la célula diana. Un glicoesfingolípido fue aislado por Hakomori y colaboradores de la línea de células de cáncer de mama MCF-7 y se inmunocaracterizó mediante el anticuerpo monoclonal MBr1 (Bremer, E. G. y otros, J. Biol. Chem., 1984, 259, 14773-14777; Menard, S. y otros, Cancer Res., 1983, 43, 1295-1300). La nueva estructura de glicoesfingolípido 1b (Figura 8) se propuso para este antígeno asociado con tumor de mama sobre la base de los protocolos de metilación y degradación enzimática. Un espectro de ^{1}H NMR de acuerdo con pero no definitivo para la estructura propuesta se obtuvo a partir de cantidades traza de antígeno aislado. Aunque los sectores individuales de la estructura propuesta no se conocían, toda la estructura se describió en primer lugar basándose en estudios sobre la línea de cáncer de mama. Debe apuntarse que MBr1 también se une a tejido de glándulas mamarias humanas normales y a líneas de células de cáncer ovárico. Por lo tanto, es probable que 1b como una entidad total no se restrinja a las células de mama transformadas. Alternativamente, subsecciones menores de 1b son adecuadas para el reconocimiento de y la unión a anticuerpos. (La síntesis del fragmento DEF de 1b se ha presentado y se ha observado que se une a MBr1: Lay, L.; Nicotra, F.; Panza, L.; Russo, G. Helv. Chim. Acta, 1994, 77, 509-514).
Los compuestos preparados mediante procedimientos descritos aquí son antígenos útiles en terapias adyuvantes como vacunas capaces de inducir anticuerpos MBr1 inmunorreactivos con células de tumor de mama humano. Tales terapias adyuvantes tienen potencial para reducir el grado de presencia del cáncer de mama e incrementar los grados de supervivencia después de la cirugía. Experimentos clínicos sobre 122 pacientes tratados quirúrgicamente para melanoma AJCC fase III que fueron tratados con vacunas preparadas a partir de antígenos de diferenciación de melanoma GM2 (otro antígeno tumoral que como MBr1 es un carbohidrato de la superficie celular) demostraron en pacientes que carecían del anticuerpo antes de la inmunización un incremento altamente significativo en el intervalo libre de enfermedad (P.O. Livingston y otros, J. Clin Oncol., 12, 1036 (1994)).
La presente invención proporciona un método para sintetizar 1b en cantidad, así como conjugados proteínicos artificiales del oligosacárido que podrían ser más inmunogénicos que el glicolípido menor. El antígeno contiene una nueva serie de rasgos incluyendo el enlace \alpha entre las entidades B y C, así como el residuo de gal-NAc del anillo D enlazado por \beta. (Para la síntesis de una estructura relacionada (SSEA-3) que carece del residuo de fucosa, véase: Nunomura, S.; Ogawa, T., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 5681-5684). La presente invención proporciona (i) una síntesis total de 1b, (ii) una prueba rigurosa de que el antígeno de Hakomori, de hecho, no corresponde a 1b y (iii) la síntesis de una versión bioconjugable de 1b. La concisión de la síntesis refleja la eficacia de métodos de ensamblaje de glicales aumentada por un método poderoso para la sulfonamidoglicosilación (véase, por ejemplo, la transformación de 14b-15b, Figura 10).
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un ensamblaje de glicales que conduce a neoglicoproteínas.
La Figura 2 es para referencia y muestra la síntesis de 4a. Reaccionantes 22: a) TBDPSCL, imidazol/DMF 84%; b) carbonildiimidazol, cat. imidazol, THF (65%); c) 5a, di-terc-butilpiridina, AgClO_{4}, SnCl_{2}, éter (51%), PhSO_{2}NH_{2}, 1(sym-col)_{2}-ClO_{4} (94%).
La Figura 3 es para referencia y muestra la síntesis de 8a. Reaccionantes: a) 9a, AgBF_{4}, tamices moleculares de 4 \ring{A}, THF (75%); b) i. TBAF, THF; ii. Na/NH_{3}; iii. Ac_{2}O, pir. c) i. 3,3-dimetoxirano; alcohol alílico, ZnCl_{2} (72%); ii. NaOME, MeOH (cuant.).
La Figura 4 muestra una estrategia para la fase sólida de oligosacáridos usando el método de ensamblaje de glicales.
La Figura 5 muestra la aplicación del método del soporte sólido para el ensamblaje de patrones de ramificación 1,2 de carbohidratos complejos.
La Figura 6 muestra la síntesis de un tetrasacárido que tiene especificidad para el grupo sanguíneo H-tipo 2. Reaccionantes: (a) 1. 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}; 2. 8, ZnCl_{2}, THF; (b) 10, Sn(OTf)_{2}, di-terc-butilpiridina, THF; (c) TBAF, AcOH, THF; (d) TIPSC1, imidazol, DMF; (e) I(col)_{2}ClO_{4}, PhSO_{2}NH_{2}, CH_{2}Cl_{2}; (f) 15, AgBF_{4}, tamices moleculares de 4 \ring{A}, THF; (g) 1. TBAF, AcOH, THF; 2. Na/NH_{3}; 3. Ac_{2}O, piridina.
Las Figuras 7a y 7b son para referencia y muestran las síntesis de un hexasacárido Le^{b} en forma bioconjugable. Reaccionantes: (a) 1. 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}; 2. 19, ZnCl_{2}, THF; (b) 10, Sn(OTf)_{2} di-terc-butilpiridina, THF; (c) TBAF, AcOH, THF; (d) TIPSCl, imidazol, DMF; (e) I(col)_{2}ClO_{4}, PhSO_{2}NH_{2}, CH_{2}Cl_{2}; (f) 24, AgBF_{4}, tamices moleculares de 4 \ring{A}, THF; (g) 1. TBAF, AcOH, THF; 2. Na/NH_{3}; 3. Ac_{2}O, piridina; (h) 1. 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}; 2. alcohol alílico, ZnCl_{2}; 3. NaOMe, MeOH.
Las Figuras 8a y 8b muestran la estructura del antígeno MBr1 y una ruta de reacción hasta un producto intermedio de trisacárido. Reaccionantes: n-Bu_{2}SnO, PMBCI, TBABr, PhH, 70%; b. NaH, BnBr, DMF, 95%; c. (i) 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}; (ii) TBAF, THF, (iii) NaH, BnBr, DMF, 40% (tres etapas); d. NaH, BrBr, DMF, 80%; e. (i) TBAF, THF; (ii) NaOMe, MeOH, 93% (dos etapas); f. (n-Bu_{3}Sn)_{2}O, BnBr, TBABr, PhH; 90%; f. SnCl_{2}, AgClO_{4}; 2,6-di-butilpiridina, tamices moleculares de 4 \ring{A}, Et_{2}O, 40% a (4,5:1\alpha:B); h. DDQ, CH_{2}Cl_{2}, H_{2}O, 84%.
La Figura 9 muestra una ruta de reacción hasta un producto intermedio de trisacárido.
Reaccionantes: a. (i) 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}; (ii) 10b, ZnCl_{2}, THF, 87%; b. SnCl_{2}, AgClO_{4}, Et_{2}O, 47%; c.
I(col)_{2}ClO_{4}, PhSO_{2}NH_{2}; tamices moleculares de 4 \ring{A}, 47%.
La Figura 10(a) muestra una ruta de reacción hasta el antígeno MBr1 hexasacárido.
Reaccionantes: a. Et_{2}H, LiHMDS, DMF, 75%. B. 8b (0,5 equivalente), MeOTf, tamices moleculares de 4 \ring{A}, 70-85% B, (10:1 B \alpha); c. (i) 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2} (ii) 17b (5 equivalentes), Zn(OTf)_{2}, 20%, d. Ac_{2}O, Et_{3}N , DMAP, CH_{2}Cl_{2} 95%; e. cat. de Lindlar, H_{2}, anhídrido palmítico, EtOAc, 90%; f. (i) TBAF, THF, (ii) NaOMe, MeOH, 94%; g. (i) Na, NH_{3}, THF; (ii) Ac_{2}O, Et_{3}N , DMAP, CH_{2}Cl_{2}, 80% h. NaOMe, MeOH, cuant.
La Figura 10(b) muestra una ruta de reacción hasta el alilglicósido.
Reaccionantes: a. TBAF, THF, 94%; b. (i) Na, NH_{3}, THF; (ii) Ac_{2}O, Et_{3}N , DMAP, THF, DMF, 85%; c. (i) 3,3-dimetildioxirano, CH_{2}Cl_{2}, (ii) alcohol alílico, 65% (+ 29% de \alpha-manoisómero); d. NaOMe, MeOH, cuant.
Las Figuras 11a y 11b muestran una ruta de reacción hasta productos intermedios para preparar el antígeno MBr1 hexasacárido.
La Figura 12 muestra una ruta de reacción hasta el antígeno MBr1 hexasacárido mediante un enfoque sintético 4+2.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para sintetizar un compuesto que tiene la estructura:
1
en la que R es H y Bn es bencilo.
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una trisacaridoceramida que tiene la estructura:
2
en la que Bn es bencilo.
\newpage
La presente invención proporciona además un procedimiento para sintetizar un mercaptotrisacárido que tiene una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
3
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo.
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
4
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
5
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar un alquilhexasacárido que tiene la estructura:
6 
\newpage
La presente invención proporciona un procedimiento para sintetizar un hexasacárido que tiene la estructura:
7
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo.
La presente invención proporciona además un compuesto que tiene la estructura:
8
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura:
9
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
Descripción detallada de la invención
Para ayudar en la comprensión de la invención se hace referencia a material de referencia relacionado pertinente. En primer lugar, se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
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11
en la que A se selecciona del grupo que consiste en (i) un aminoácido que tiene un grupo \omega-amino o un grupo \omega-(C=O)-, (ii) un residuo de aminoácido de un péptido, residuo que tiene un grupo \omega-amino o un grupo \omega-(C=O)-, y (iii) un residuo de aminoácido de una proteína, residuo que tiene un grupo \omega-amino o un grupo \omega-(C=O)-; en donde R_{1} es H, OH, NH_{2} o NHR_{4}, donde R_{4} es SO_{2}Ph, un grupo alquilo o acilo de cadena lineal o ramificada o un grupo arilo; en donde M tiene la estructura:
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12
en la que n es un número entero de 0 a 18 y, cuando n es mayor que 1, cada M es independientemente igual o diferente; en la que p es 0 ó 1; en la que R_{2}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son independientemente iguales o diferentes y son H u OH, con la condición de que los R_{2} y R_{3} geminales no sean ambos OH y los R_{5} y R_{6} geminales no sean ambos OH; en la que cada línea ondulada entre un átomo de carbono y un átomo de oxígeno indica una configuración R o S en el átomo de carbono; en la que X e Y son independientemente iguales o diferentes y son H_{2} u O; y en la que k es un número entero mayor que o igual a 1, con la condición de que cuando A sea un aminoácido que tiene un grupo \omega-amino o un grupo \omega-(C=O)-, k sea igual a 1.
Por ejemplo, se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que A es lisina o un residuo de lisina, se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que A es ácido glutámico o un residuo de ácido glutámico y se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que A es ácido aspártico o un residuo de ácido aspártico.
También se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que A es un residuo de aminoácido de una proteína globular. En una realización, se hace referencia al compuesto en el que la proteína globular se selecciona del grupo que consiste en albúmina de suero bovino y albúmina de suero humano.
Por ejemplo, se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que k es 1 y se hace referencia al compuesto descrito anteriormente aquí en el que n y p son ambos iguales a 0.
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También se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
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en la que R_{1} es H, OH, NH_{2} o NHR_{4}, donde R_{4} es SO_{2}Ph, un grupo alquilo o acilo lineal o ramificado o un grupo arilo; en la que M tiene la estructura:
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en la que n es un número entero de 0 a 18 y, cuando n es mayor que 1, cada M es independientemente igual o diferente; en la que R_{2}, R_{3}, R_{5} y R_{6} son independientemente iguales o diferentes y son H u OH, con la condición de que los R_{2} y R_{3} geminales no sean ambos OH y los R_{5} y R_{6} geminales no sean ambos OH; en la que cada línea ondulada entre un átomo de carbono y un átomo de oxígeno indica una configuración R o S en el átomo de carbono; y en la que R_{7} es un grupo alilo sustituido o no sustituido.
También se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero de 1 a 18; en la que R es H o un grupo acilo de cadena lineal o ramificada; en la que R_{1} es H, OH, NH_{2} o NHR_{4}, donde R_{4} es SO_{2}Ph, un grupo alquilo o acilo de cadena lineal o ramificada o un grupo arilo; y en la que R_{2} es un grupo alilo sustituido o no sustituido. Por ejemplo, el compuesto en el que n es 1.
También se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
16
en la que R es H o un grupo acilo de cadena lineal o ramificad; en la que R_{1} es H, OH, NH_{2} o NHR_{4}, donde R_{4} es SO_{2}Ph, un grupo alquilo o acilo de cadena lineal o ramificada o un grupo arilo; y en la que R_{2} es un grupo alilo sustituido o no sustituido.
También se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
17
en la que R es H o un grupo acilo de cadena lineal o ramificad; en la que R_{1} es H, OH, NH_{2} o NHR_{4}, donde R_{4} es SO_{2}Ph, un grupo alquilo o acilo de cadena lineal o ramificada o un grupo arilo; en la que R_{2} es un grupo alilo sustituido o no sustituido; y en la que n es un número entero de 1 a 18. Por ejemplo el compuesto en el que n es 1.
También se hace referencia a un compuesto que tiene la estructura:
18
en la que R es H o un grupo acilo de cadena lineal o ramificada.
También se hace referencia a un procedimiento para sintetizar un compuesto que tiene la estructura:
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19
en la que R es un grupo alilo sustituido o no sustituido, que comprende las etapas de (a) sintetizar un compuesto que tiene la estructura:
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20
en la que R es un grupo trialquilsililo, arildialquilsililo, alquildiarilsililo o triarilsililo; (b) hacer reaccionar el compuesto de la etapa (a) con un compuesto que tiene la estructura:
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21
bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
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22
en la que R es un grupo trialquilsililo, arildialquilsililo, alquildiarilsililo o triarilsililo; (c) hacer reaccionar el compuesto formado en la etapa (b) con un compuesto que tiene la estructura:
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bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
24
en la que R es un grupo trialquilsililo, arildialquilsililo, alquildiarilsililo o triarilsililo; (d) desproteger y reproteger el compuesto formado en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
25
en la que R es TIPS; (e) yodosulfonamidar el compuesto formado en la etapa (d) bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
26 
\newpage
(f) hacer reaccionar el compuesto formado en la etapa (e) con un compuesto que tiene la estructura:
27
bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
28
en la que R es H; (g) desproteger y peracetilar el compuesto formado en la etapa (f) bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
29
(h) epoxidar el compuesto formado en la etapa (g) bajo condiciones adecuadas para formar uno de sus epóxidos y hacer reaccionar el epóxido bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
30
en la que R es un grupo alilo sustituido o no sustituido; y (i) tratar el compuesto formado en la etapa (h) bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
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31 
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en la que R es un grupo alilo sustituido o no sustituido. En el procedimiento anterior las condiciones adecuadas necesarias para las reacciones y los tratamientos diversos pueden encontrarse en la sección de los Detalles Experimentales que sigue posteriormente. Sin embargo, los reaccionantes y disolventes específicos proporcionados así como las condiciones específicas necesarias para la reacción o el tratamiento pueden sustituirse por otros reaccionantes, disolventes y condiciones adecuados bien conocidos por los expertos en la técnica.
El compuesto alílico puede estar conjugado a un péptido o una proteína a través de una cadena lateral de amina o ácido carboxílico. Al poner en práctica la invención, se prepara un bioconjugado de acuerdo con el protocolo de Bernstein y Hall (Carbohydr. Res. 1980, 78, Ca). El grupo alilo se ozonoliza para formar un aldehído o un ácido carboxílico, que se condensa hasta una amina terminal para formar, respectivamente, una imina o una amida. La imina se reduce con borohidruro sódico hasta la amina. Alternativamente, el aldehído se amina reductivamente usando procedimientos conocidos en la técnica para formar una amina que se hace reaccionar con un ácido carboxílico terminal de cadena lateral para formar un conjugado de amida.
También se hace referencia a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto descrito anteriormente aquí y un portador farmacéuticamente aceptable.
Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen tampón de fosfato 0,01-0,1 M, y preferiblemente tampón de fosfato 0,05 M, o solución salina al 0,8%. Adicionalmente, tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, medio de Ringer con lactato o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes.
También se hace referencia a un método para tratar a un sujeto que sufre un trastorno provocado por Hellicobacter pylori que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente aquí para tratar al sujeto que sufre el trastorno.
Por ejemplo, un método para tratar a un sujeto que sufre úlcera gástrica o duodenal y un método para tratar a un sujeto que sufre adenocarcinoma gástrico.
Además, se hace referencia a un método para inhibir la adhesión de Hellicobacter pylori al epitelio gástrico en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad del compuesto descrito anteriormente aquí eficaz para inhibir la adhesión de Hellicobacter pylori al epitelio gástrico en un sujeto.
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La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar un compuesto que tiene la estructura:
32
en la que R es H y Bn es bencilo, que comprende: (a) (i) hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura:
33
con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido; (ii) separar el epóxido formado en la etapa (a) (i) bajo condiciones adecuadas con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, para formar un fluoroalcohol; y (iii) alquilar el fluoroalcohol formado en la etapa (a) (ii) bajo condiciones adecuadas con una base no nucleófilo y un haluro orgánico que tiene la fórmula C_{6}H_{5}CH_{2}X en la que X es Br, Cl, I o F, para formar un compuesto que tiene la estructura:
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34
(b) tratar el compuesto que tiene la estructura:
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35
en la que TIPS es triisopropilsililo, con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido; y (c) acoplar el epóxido formado en la etapa (b) con un compuesto que tiene la estructura:
36 
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en la que Bn es bencilo, bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
37
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(d) (i) alquilar el compuesto formado en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas con una base no nucleófila y un haluro orgánico que tiene la fórmula C_{6}H_{5}CH_{2}X en la que X es Br, Cl, I o F; y (ii) desililar el compuesto formado en la etapa (d) (i) bajo condiciones adecuadas con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo; (iii) tratar el compuesto formado en la etapa (d) (ii) bajo condiciones adecuadas con un alcóxido metálico para formar un disacárido desprotegido; y (iv) alquilar el disacárido formado en la etapa (d) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un disacárido desprotegido selectivamente que tiene la estructura:
38
en la que Bn es bencilo;
(e) (i) acoplar el disacárido desprotegido selectivamente formado en la etapa (d) (iv) con el compuesto formado en la etapa (a) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido protegido; y (iii) desproteger el trisacárido protegido formado en la etapa (e) (i) bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido que tiene la estructura:
39
en la que R es H y Bn es bencilo. En la etapa (a) la reacción (i) puede llevarse a cabo usando una variedad de agentes epoxidantes incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno. Un agente preferido es el 3,3-dimetildioxirano. Pueden usarse disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano. La reacción (a) (ii) puede realizarse usando sales de fluoruro amónico orgánicas, incluyendo fluoruro de tetrabutilamonio, en una gama de disolventes, incluyendo disolventes etéreos, preferiblemente tetrahidrofurano. La etapa (ii) puede realizarse usando una base no nucleófila tal como hidruro sódico en un disolvente no nucleófilo tal como DMF. La etapa (b) puede llevarse a cabo usando una variedad de agentes epoxidantes, incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano. La etapa de acoplamiento (c) puede llevarse a cabo usando un catalizador metálico, tal como cloruro de zinc, en un disolvente inerte, tal como THF. La etapa (d) (i) se lleva a cabo usando una base no nucleófila tal como hidruro sódico en un disolvente no nucleófilo tal como DMF. En la etapa (d) (ii) la desililización se efectúa usando una sal de fluoruro amónica orgánica, incluyendo fluoruro de tetrabutilamonio, en una gama de disolventes, incluyendo disolventes etéreos, preferiblemente en tetrahidrofurano. El éster de carbonato se separa usando un alcóxido metálico, tal como metóxido sódico, en un medio alcohólico tal como metanol. La etapa (d) (iv) se realiza selectivamente usando un óxido metálico, tal como (n-Bu_{3}-Sn)_{2}O, en presencia de un bromuro amónico orgánico, tal como bromuro de tetra-n-butilamonio, en un disolvente inerte tal como benceno. La etapa (e) es un acoplamiento realizado en presencia de una sal de haluro metálico, tal como SnCl_{2}, en presencia de perclorato de plata y 2,6-di-t-butilpiridina, en un disolvente, tal como éter, que contiene tamices moleculares. La retirada oxidativa de PMB se realiza con un agente oxidante tal como DDQ en un sistema de disolventes inertes, que preferiblemente puede ser heterogéneo, por ejemplo usando agua/diclorometano.
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una trisacaridoceramida que tiene la estructura:
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40
en la que Bn es bencilo,
que comprende: (a) sintetizar un trisacárido que tiene la estructura:
41
en la que R es PMB (p-metoxibencilo) y Bn es bencilo; (b) (i) hacer reaccionar el trisacárido formado en la etapa (a) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido de trisacárido; y
(ii) hacer reaccionar el epóxido de trisacárido formado en la etapa (b) (i) con un compuesto que tiene la estructura:
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42
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar una triscaridoceramida protegida que tiene la estructura:
43
en la que Bn es bencilo y PMB es p-metoxibencilo; (c) (i) acilar la ceramida formada en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas; y (ii) desproteger selectivamente el compuesto formado en la etapa (c) (i) bajo condiciones adecuadas para formar la trisacaridoceramida.
En la etapa (a) el trisacárido puede sintetizarse como se describe aquí. La etapa (b) (i) se realiza usando una variedad de agentes epoxidantes, incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano. La etapa de acoplamiento (b) (ii) puede llevarse a cabo usando un éter de tributilestaño del precursor de ceramida y un catalizador metálico, tal como cloruro de zinc, en un disolvente inerte, tal como THF. En la etapa (c) (i) la acilación se realiza usando un anhídrido, preferiblemente anhídrido acético, o haluro de alquilo de cadena lineal o ramificada en presencia de trietilamina y DMAP en un disolvente orgánico inerte tal como diclorometano. El grupo protector PMB se retira oxidativamente, preferiblemente como se describe anteriormente. La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar un mercaptotrisacárido que tiene la estructura:
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44
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, que comprende: (a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
45
en la que TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
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46
en la que TIPS es triisopropilsililo, bajo condiciones adecuadas para formar un disacárido que tiene la estructura:
47
en la que TIPS es triisopropilsililo;
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(b) acoplar el disacárido formado en la etapa (a) con un compuesto que tiene la estructura:
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48
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido que tiene la estructura:
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49
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo; (c) yodosulfonamidar el trisacárido formado en la etapa (b) bajo condiciones adecuadas para formar una yodosulfonamida que tiene la estructura:
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50
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
y (d) hacer reaccionar la yodosulfonamida formada en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas con un tiolato para formar el mercaptotrisacárido.
La etapa (a) se realiza haciendo reaccionar el primer compuesto de la etapa (a), que puede obtenerse como se describe aquí o de otro modo, con una variedad de agentes epoxidantes, incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano, seguido por acoplamiento con el diolmonosacárido de la etapa (a) que puede llevarse a cabo usando un catalizador metálico, tal como cloruro de zinc, en un disolvente inerte, tal como THF. El acoplamiento con el azúcar fluorado se lleva a cabo en la etapa (b) en presencia de una sal de haluro metálico, tal como SnCl_{2}, en presencia de perclorato de plata y 2,6-di-t-butilpiridina, en un disolvente, tal como éter, que contiene tamices moleculares. La etapa (c) se realiza usando perclorato de I(col)_{2} y PhSO_{2}NH_{2} en presencia de tamices moleculares. La etapa (d) se lleva a cabo usando alquiltiol y una base como LiHMDS en un disolvente inerte como
DMF.
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La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
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51
que comprende: (a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
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52
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
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53
en la que Bn es bencilo, bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
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54
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(b) (i) hacer reaccionar el compuesto formado en la etapa (a) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido de hexasacárido; y (ii) hacer reaccionar el epóxido de hexasacárido con un éter estannílico que tiene la estructura:
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en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacaridoalcohol; (c) acilar el hexasacaridoalcohol formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un acetato de hexasacárido que tiene la estructura:
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56 
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en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(d) acilar reductivamente el acetato de hexasacárido formado en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas en presencia de anhídrido palmítico para formar una hexasacaridoceramida; (e) desililar y desproteger parcialmente la hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar una hexasacaridoceramida parcialmente desprotegida; (f) (i) reducir la hexasacaridoceramida parcialmente desprotegida bajo condiciones adecuadas para formar un acetato de hexasacaridoceramida desprotegido; y (ii) acilar el acetato de hexasacaridoceramida desprotegido bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacaridoceramida; y (g) saponificar el peracetato de hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar la hexasacaridoceramida.
La etapa (a) se realiza usando ésteres de triflato, tales como triflato de metilo, en presencia de tamices moleculares en un disolvente inerte. La etapa (b) (i) se lleva a cabo usando una variedad de agentes epoxidantes incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano. La etapa (b) (ii) se realiza usando un éter estannílico del precursor de ceramida, preferiblemente el (tri-n-butil)-estannil-éter, en presencia de una sal metálica, tal como triflato de Zn, en un disolvente inerte, tal como THF. La etapa (c) se lleva a cabo usando anhídrido acético en presencia de una base tal como trietilamina y DMAP. La etapa (d) se lleva a cabo usando un catalizador de metal noble tal como catalizador de Lindlar e hidrógeno gaseoso en presencia de anhídrido palmítico en un disolvente inerte, tal como acetato de etilo. La etapa de desililación (e) se efectúa usando sales de fluoruro amónico orgánicas, tales como fluoruro de tetra-n-butilamonio en THF. El éster de carbonato se separa usando un alcóxido metálico tal como NaOMe en un alcohol tal como metanol. En la etapa (f) (i) la reducción se realiza usando un metal tal como litio o sodio en amoníaco líquido y un disolvente inerte tal como THF. La etapa (f) (ii) se lleva a cabo usando anhídrido acético en presencia de una base tal como Et_{3}N y DMAP en un disolvente inerte tal como diclorometano. El peracetato se saponifica usando un alcóxido metálico tal como metóxido sódico en un alcohol tal como
metanol.
\newpage
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
57
que comprende: (a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
58
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
59
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido que tiene la estructura:
60
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo; y (b) (i) reducir el hexasacárido formado en la etapa (a) bajo condiciones adecuadas en presencia de anhídrido palmítico para formar una palmitoilamida; (ii) desililar la palmitoilamida con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido parcialmente desprotegido; (iii) desproteger el hexasacárido formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido desprotegido; (iv) acilar el hexasacárido formado en la etapa (b) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacaridoceramida; y (v) saponificar el peracetato de hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar la hexasacaridoceramida.
La etapa (a) se realiza usando ésteres de triflato, tales como triflato de metilo, en presencia de tamices moleculares en un disolvente inerte. La etapa (b) (i) se lleva a cabo usando un catalizador de metal noble tal como catalizador de Lindlar e hidrógeno gaseoso en presencia de anhídrido palmítico en un disolvente inerte, tal como acetato de etilo. La etapa (b) (ii) se realiza usando sales de fluoruro amónico orgánicas, tales como fluoruro de tetra-n-butilamonio en THF. En la etapa (b) (iii) la reducción se realiza usando un metal tal como litio o sodio en amoníaco líquido y un disolvente inerte tal como THF. La etapa (b) (iv) se lleva a cabo usando anhídrido acético en presencia de una base tal como Et_{3}N y DMAP en un disolvente inerte tal como diclorometano. En la etapa (v) el peracetatocarbonato se saponifica usando un alcóxido metálico tal como metóxido sódico en un alcohol tal como metanol.
La presente invención también proporciona un procedimiento para sintetizar una alilhexasacárido que tiene la estructura:
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61
que comprende: (a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
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62
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
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63
en la que Bn es bencilo
\newpage
en la que R es H, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido que tiene la estructura:
64
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(b) (i) desililar el compuesto formado en la etapa (a) con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido parcialmente desprotegido; (ii) desproteger el hexasacárido formado en la etapa (b) (i) bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido desprotegido; y (iii) peracilar el compuesto formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacárido que tiene la estructura:
65
(c) (i) hacer reaccionar el peracetato de hexasacárido formado en la etapa (b) (ii) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de epóxido de hexasacárido; (ii) tratar el peracetato de epóxido de hexasacárido formado en la etapa (c) (i) con alcohol alílico bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de alilhexasacárido; y (iii) saponificar el peracetato de alilhexasacárido bajo condiciones adecuadas para formar el alilhexasacárido.
La etapa (a) se realiza usando ésteres de triflato, tales como triflato de metilo, en presencia de tamices moleculares en un disolvente inerte. La etapa (b) (i) se lleva a cabo usando sales de fluoruro amónico orgánicas, tales como fluoruro de tetra-n-butilamonio, en THF. La etapa (b) (ii) se realiza usando un alcóxido metálico tal como metóxido sódico en un alcohol tal como metanol, seguido por reducción realizada usando un metal tal como litio o preferiblemente sodio en amoníaco líquido y un disolvente inerte tal como THF. La etapa (b) (ii) se lleva a cabo usando anhídrido acético en presencia de una base tal como Et_{3}N y DMAP en un disolvente inerte tal como diclorometano. La etapa (c) (i) se lleva a cabo usando una variedad de agentes epoxidantes, incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en disolventes inertes no nucleófilos, tales como diclorometano. La etapa (c) (ii) se lleva a cabo usando alcohol alílico en un disolvente inerte. En la etapa (c) (iii) el peracetatocarbonato se saponifica usando un alcóxido metálico tal como metóxido sódico en un alcohol tal como metanol.
La presente invención proporciona un procedimiento para sintetizar un hexasacárido que tiene la estructura:
66
que comprende: (a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
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con un compuesto que tiene la estructura:
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68
bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
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(b) (i) acilar el compuesto formado en la etapa (a) bajo condiciones adecuadas; y (ii) hacer reaccionar el compuesto formado en la etapa (b) (i) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido que tiene la estructura:
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70
(c) (i) tratar el epóxido con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, bajo condiciones adecuadas; y (ii) alquilar el compuesto formado en la etapa (c) (i) bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
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71
en la que R es H o acilo; (d) acoplar el compuesto formado en la etapa (c) (ii) con un compuesto que tiene la estructura:
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72
bajo condiciones adecuadas para formar el hexasacárido;
La etapa (a) se realiza usando un catalizador metálico tal como tetrafluoroborato de plata y un disolvente inerte. La etapa (b) (i) se lleva a cabo usando anhídrido acético en presencia de una base tal como Et_{3}N y DMAP en un disolvente inerte tal como diclorometano. La etapa (b) (ii) se lleva a cabo usando una variedad de agentes epoxidantes, incluyendo ácido peracético, ácido m-clorobenzoico, ácido trifluoroacético y peróxido de hidrógeno, prefiriéndose el 3,3-dimetildioxirano, en un disolvente inerte no nucleófilo, tal como diclorometano. La etapa (c) (i) se efectúa con sales de fluoruro amónico orgánicas, tales como fluoruro de tetra-n-butilamonio, en THF. La etapa (c) (ii) se realiza usando una base no nucleófila tal como hidruro sódico en un disolvente inerte. La etapa (d) se realiza usando un catalizador de sal metálica tal como dicloruro de estaño en presencia de perclorato de plata en un disolvente inerte tal como di-t-butilpiridina. Transformaciones adicionales proporcionan productos desprotegidos o conjugados con proteínas u otros portadores.
La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura:
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73
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
El alilglicósido mostrado se prepara usando los métodos de acoplamiento de glicales enseñados aquí, y puede unirse a portadores proteínicos usando reacciones generales descritas aquí o mediante métodos estándar de la técnica. Por ejemplo, el alilglicósido puede prepararse acoplando el compuesto 9b descrito aquí con un 8b adecuadamente protegido, seguido por acoplamiento con 12b, a continuación acoplamiento con alcohol alílico y una secuencia de desprotección apropiada.
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La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
El alilglicósido mostrado se prepara usando los métodos de acoplamiento de glicales, alilación y una secuencia de desprotección como la enseñada aquí (véase la Fig. 12), y puede unirse a portadores proteínicos usando reacciones generales descritas aquí o mediante métodos estándar en la técnica.
La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
Los alilglicósidos mostrados se preparan usando los métodos de acoplamiento de glicales enseñados aquí, y pueden unirse a portadores proteínicos usando reacciones generales descritas aquí o mediante métodos estándar de la técnica.
Está dentro del alcance de la presente invención variar la combinación de grupos protectores para los diversos grupos hidroxilo de los azúcares de acuerdo con la experiencia normal de la técnica.
La presente invención también proporciona un uso de un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico, eficaz para inducir los anticuerpos, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano. En una realización, la presente invención proporciona un uso en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1. En otra realización, la presente invención proporciona un uso en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto ha sido tratado mediante cirugía, tiene una enfermedad no sometida a resección limitada.
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La presente invención proporciona un uso del compuesto anterior en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
La presente invención también proporciona un uso de un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano. En una realización, la presente invención proporciona un uso en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1. En otra modalidad, la presente invención proporciona un uso en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto ha sido tratado mediante cirugía, tiene enfermedad no sometida a resección limitada.
La presente invención también proporciona un uso de un compuesto anterior en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
La presente invención proporciona adicionalmente un uso de un compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano. En una realización, la presente invención proporciona un uso en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1. En otra modalidad, la presente invención proporciona un uso en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto ha sido tratado mediante cirugía, tiene enfermedad no sometida a resección limitada.
La presente invención también proporciona un uso de un compuesto anterior en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
Detalles experimentales Procedimientos generales
Todas las reacciones sensibles al aire y la humedad se realizaron en un aparato secado a la llama bajo una atmósfera de argón a no ser que se apunte otra cosa. Los líquidos y las soluciones sensibles al aire se transfirieron a través de una jeringa o una cánula. Siempre que fuera posible, las reacciones se verificaron mediante cromatografía en capa fina (TLC). La retirada de disolvente en bruto se realizó a vacío bajo vacío de aspirador en un evaporador giratorio Buchi y el disolvente traza se retiró en una bomba de alto vacío a 0,1-0,5 mm de Hg. Los puntos de fusión (pf) estaban sin corregir y se realizaron en tubos capilares de vidrio blando usando un aparato para medir el punto de fusión digital Electrothermal serie IA9100.
Los espectros infrarrojos (IR) se registraron usando un instrumento de transformación de Fourier de la serie Perkin-Elmer 1600. Las muestras se prepararon como películas limpias sobre placas de NaCl a no ser que se apunte otra cosa. Las bandas de absorción se presentan en números de onda (cm^{-1}).
Solo se presentan las bandas asignables pertinentes.
Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (^{1}H NMR) se determinaron usando un espectrómetro Bruker AMX-400 a 400 MHz. Los desplazamientos químicos se presentan en partes por millón (ppm) por debajo del tetrametilsilano (TMS; \delta=0 ppm) usando CHCl_{3} residual como una referencia de cierre (\delta=7,25 ppm). Las multiplicidades se abrevian del modo habitual: s=singlete; d=doblete; t=triplete; q=cuadruplete; m=multiplete; br=ancho.
Los espectros de resonancia magnética nuclear de carbono (^{13}C NMR) se realizaron en un espectrómetro Bruker AMX-400 a 100 MHz con desacoplamiento pulsatorio compuesto. Las muestras se prepararon como con los espectros de ^{1}H NMR y los desplazamientos químicos se presentan con relación al TMS (0 ppm); se usó CHCl_{3} residual como una referencia interna (\delta=77,0 ppm).
Todos los análisis espectrales de masas de alta resolución (HRMS) se determinaron mediante ionización de impacto electrónico (EI) en un espectrómetro de masas JEOL JMS-DX 303HF con perfluoroqueroseno (PFK) como un patrón interno. Los espectros de masas de baja resolución (MS) se determinaron mediante ionización de impacto electrónico (EI) o ionización química (CI) usando el gas portador indicado (amoníaco o metano) en un espectrómetro de masas Delsi-Nermag R-10-10. Para los espectros de cromatografía de gases/masas (GCMS), se usó una columna capilar fundida DB5 (30 m, 0,25 mm de grosor) con helio como el gas portador. Las condiciones típicas usaban un programa de temperatura de 60-250ºC a 40ºC/min.
La cromatografía en capa fina (TLC) se realizó usando placas de vidrio prerrevestidas (gel de sílice 60, grosor 0,25 mm). La visualización se realizó mediante iluminación con una lámpara UV de 254 nm o mediante inmersión en colorante de anisaldehído (9,2 ml de p-anisaldehído en 2,5 ml de ácido acético, 12,5 ml de ácido sulfúrico concentrado y 338 ml de etanol (EtOH) al 95%) y calentando para la coloración.
La cromatografía en gel de sílice de desarrollo rápido se llevó a cabo usando el protocolo estándar.
A no ser que se apunte otra cosa, todos los disolventes y reaccionantes eran de calidad comercial y se usaban según se recibían, excepto cuando se indica posteriormente aquí, donde los disolventes se destilaban bajo argón usando los métodos de secado listados entre paréntesis: CH_{2}Cl_{2} (CaH_{2}); benceno (CaH_{2}); THF (Na/cetilo); Et_{2}O (Na/cetilo); diisopropilamina (CaH_{2}).
Abreviaturas
OTf
triflato
TLC
cromatografía en capa fina
EtOAc
acetato de etilo
TIPS
triisopropilsililo
PMB
p-metoxibencilo
Bn
bencilo
Ac
acetato
hex
hexano
THF
tetrahidrofurano
col
colidina
LiHMDS
hexametildisilazida de litio
DMF
N,N-dimetilformamida
DMAP
2,-dimetilaminopiridina
DDQ
2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
TBAF
fluoruro de tetra-n-butilamonio
T.M.
tamices moleculares
t.a.
temperatura ambiente
f.r.
matraz de fondo redondo
Ejemplos de referencia Ejemplo 1 Preparación del Glucal 18 Unido a Polímero
El galactal 7 unido a polímero (500 mg; S.J. Danishefsky y otros, J. Am. Chem. Soc. 1992, 8331) se puso en un matraz para polímero de 100 ml y se secó a vacío. Al enfriar hasta 0ºC bajo N_{2}, se añadieron CH_{2}Cl_{2} seco (20 ml) y solución de Murray recientemente preparada (30 ml, R.W. Murray y R. Jeyaraman, J. Org. Chem. 1985, 2847). Después de agitar a 0ºC durante -90 minutos, los materiales solubles se filtraron usando presión de N_{2}. El procedimiento de oxidación se repitió. El epóxido de 7 resultante se mantuvo en un conducto de vacío durante -3 h para secar. Se añadió una solución del glucal 19 (1,0 g en 8 ml de THF seco) y la mezcla se enfrió hasta -22ºC (hielo seco-CCl_{4}). Se añadió una solución de ZnCl_{2} en THF (0,8 ml, 1,0 M). La mezcla se dejó calentar lentamente hasta t.a. (durante -2 h) y a continuación se agitó a t.a. durante la noche. El glucal 18 unido a polímero se enjuagó con 3 x 20 ml de THF y se secó en un conducto de vacío.
Preparación del Tetrasacárido 20 Unido a Polímero
El glucal 18 unido a polímero y Sn(OTf)_{2} (0,80 g, 1,92 mmol) se combinaron y se secaron a vacío. Al enfriar hasta 0ºC bajo N_{2}, se añadió una solución del donante de fucosilo 10 (1,8 g, 4,1 mmol) en 20 ml de THF seco con di-t-butilpiridina (1,7 ml, 7,57 mmol). La mezcla se dejó calentar lentamente hasta t.a. y se agitó durante la noche. El polímero se lavó con 2 x 20 ml de THF seco, 2 x 20 ml de dioxano seco, 20 ml de DMSO y 2 x 20 ml de THF. El tetrasacárido 20 unido a polímero resultante se mantuvo en un conducto de vacío para secar.
Preparación del Tetrasacaridoglical 21
El tetrasacárido 20 unido a polímero (50 mg) se agitó en 2 ml de THF y se trató con 0,2 ml de cada una de soluciones 1,0 M de TBAF y AcOH en THF. La mezcla se agitó a 0ºC durante la noche. El polímero se lavó con 3 x 5 ml de THF. Los enjuagues combinados se concentraron y se cromatografiaron en columna sobre sílice (EtOAc:hex 2:1), proporcionando el tetrasacaridoglical 21 como una goma incolora. Rendimiento: 9,0 mg.
Ejemplo 2 Preparación del Diol 18'
El galactal 7' (0,100 g, 0,304 mmol) en 5 ml de CH_{2}Cl_{2} seco a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2} se trató con 10 ml de solución de Murray (recientemente preparada) y se agitó a 0ºC durante 40 minutos. La TLC (EtOAc:hex 1:1) no mostraba trazas de 7'. Los disolventes se evaporaron usando una corriente de N_{2}. El epóxido de 7' residual se mantuvo en un conducto de vacío -2 h. Se añadió al epóxido bajo una atmósfera de N_{2} una solución del derivado de glucal 3' (0,150 g, 0,496 mmol) en 3 ml de THF seco. Al enfriar hasta -78ºC, se añadió ZnCl_{2} 1,0 M en Et_{2}O (0,50 ml, 0,50 mmol). La mezcla se dejó calentar lentamente hasta t.a. (durante -2 h) y se agitó durante la noche. La TLC (EtOAc:hex 1:1) mostraba que la reacción era completa. Se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado (20 ml) y la mezcla se extrajo a continuación con EtOAc (3 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}. La cromatografía en columna sobre sílice (EtOAc:hex 1:3) producía el diol 18' como un sólido incoloro. Rendimiento: 173 mg (89%). [\alpha]_{D}^{23} -9,8º (c 1,0, CH_{2}Cl_{2}).
Preparación del Tetrasacárido 22
El diol 18' (86 mg, 0,133 mmol) y el donante de fucosilo 10 (0,290 g, 0,665 mmol) se secaron azeotrópicamente usando benceno. La mezcla se disolvió en 3 ml de THF seco junto con 0,65 ml de di-t-butilpiridina y a continuación se añadió a través de una cánula a un matraz que contenía Sn(OTf)_{2} (0,30 g, 0,72 mmol) y TM de 4 \ring{A} (500 mg) a 0ºC bajo atmósfera de N_{2}. La mezcla se agitó a 0ºC-7 h. La TLC (EtOAc:hex 1:3) no mostraba trazas del diol 18'. La mezcla se sometió a reparto entre NaHCO_{3} acuoso saturado (100 ml) y EtOAc (2 x 100 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}. La capa orgánica se filtró a través de sílice usando EtOAc para obtener material en bruto, que se purificó a continuación mediante cromatografía sobre sílice (EtOAc:hex 1:9) proporcionando el tetrasacárido 22. Rendimiento: 170 mg (86%).
\newpage
Preparación de la Yodosulfonamida 23
Procedimiento 1
El tetrasacaridoglical 22 (120 mg, 81,1 mmol) y PhSO_{2}NH_{2} (20 mg, 0,13 mmol) se secaron azeotrópicamente usando benceno. Se añadieron (bolsa de manipulación con guantes) TM de 4 \ring{A} (0,2 g). Después de enfriar hasta 0ºC bajo N_{2}, se añadió CH_{2}Cl_{2} seco (1,0 ml). La mezcla se trató con una solución de I(col)_{2}ClO_{4} (preparada a partir de 100 mg de Ag(col)_{2}ClO_{4}, 5 ml de colidina y 60 mg de I_{2} en 1 ml de CH_{2}Cl_{2} seco) mediante una cánula a través de un bloque de celita secada a la llama y TM de 4 \ring{A}. La mezcla se agitó a 0ºC durante 40 min. La TLC (EtOAc:hex 1:4) mostraba la yodosulfonamida 23 como el componente principal. La mezcla se filtró a través de celita que se enjuagó con Et_{2}O. La capa orgánica se extrajo con Na_{2}SO_{2}O_{3} saturado, CuSO_{4} acuoso saturado, salmuera y a continuación se secó sobre MgSO_{4}. La cromatografía en columna sobre sílice (EtOAc:hex 1:4) daba la yodosulfonamida 23 como un sólido incoloro.
Rendimiento: 115 mg (80%).
Procedimiento 2
El tetrasacaridoglical 22 (200 mg, 0,35 mmol), PhSO_{2}NH_{2} (42 mg, 0,27 mmol) y 200 mg de TM de 4 \ring{A} en polvo en 2,0 ml de CH_{2}Cl_{2} seco a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2} se trataron con I(col)_{2}ClO_{4} (preparado a partir de 120 mg de Ag(col)_{2}ClO_{4} y 67 mg de I_{2} en 1 ml de CH_{2}Cl_{2} seco). La mezcla se agitó a 0ºC (protegida de la luz usando papel metalizado) durante 30 min. La TLC (EtOAc:hex 1:2) mostraba principalmente yodosulfonamida con algo de glical.
Después de \sim 1 h más a 0ºC, la TLC no mostraba una mejora apreciable. La mezcla se filtró a través de celita, que se lavó con Et_{2}O. Después de extraer con Na_{2}SO_{2}O_{3} acuoso saturado, CuSO_{4} acuoso saturado y salmuera, los materiales orgánicos se secaron sobre MgSO_{4}. La cromatografía en columna sobre sílice (EtOAc:hex 1:3) daba 23 como un sólido incoloro.
Rendimiento: 165 mg (69%). [\alpha]_{D}^{23} = -85,7º (c 1,0, CH_{2}Cl_{2}).
Preparación del Hexasacárido 25
La yodosulfonamida 23 (60 mg, 34 mmol) en un f.r. de 35 ml se trató con 200 mg de TM de 4 \ring{A} en polvo (bolsa de manipulación con guantes). A este matraz bajo N_{2} se añadió una solución del lactal protegido 24 en THF (1,5 ml). Al enfriar la mezcla hasta -78ºC, una solución de AgBF_{4} (40 mg, 0,206 mmol) se añadió en 0,25 ml de THF seco. La mezcla se agitó y se calentó lentamente hasta t.a. durante la noche. La mezcla se calentó hasta 45ºC y se agitó -36 h. La TLC mostraba solo una traza de yodosulfonamida. Se añadió NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml) y la mezcla se extrajo con 3 x 10 ml de EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}. La cromatografía en columna sobre sílice (EtOAc:hex 1:3) proporcionaba 25 como un aceite incoloro. Rendimiento: 42 mg (55%). [\alpha]_{D}^{23} = -33,8º (c 2,0, CH_{2}Cl_{2}).
Preparación del Hexasacárido 25a
El hexasacárido 25 (55 mg, 24,4 mmol) en -1,5 ml de THF se trató a 0ºC con TBAF (0,25 ml, solución 1,0 M en THF, 0,25 mmol) y se agitó a t.a. durante la noche. La TLC (HeOH:CH_{2}Cl_{2} 1:9) mostraba una mezcla 3:1 de 25a frente a una sustancia menos polar. Se añadió TBAF 1,0 M (0,10 ml) adicional y la mezcla se agitó durante la noche a t.a. La TLC mostraba que la reacción era completa. Los disolventes se retiraron usando una corriente de N_{2}. La cromatografía en columna sobre sílice (MeOH:CH_{2}Cl_{2} 1:19) proporcionaba una mezcla -1:2 correspondiente a dos compuestos que diferían solo en la presencia o ausencia de un grupo carbonato 3,4-cíclico. Rendimiento en bruto: 35 mg de peso total para los dos productos. La mezcla en bruto se usó como tal para la siguiente reacción.
Preparación del Hexasacárido peracetilado 26
El hexasacárido 25a (36 mg) en 0,25 ml de THF seco se añadió a través de una cánula a \sim8 ml de solución de Na/NH_{3} azul claro a -78ºC (baño de hielo seco) bajo atmósfera de N_{2}. Después de retirar el baño de hielo seco, la mezcla se agitó en NH_{3} a reflujo (condensador de hielo seco) durante 15 min. Después de añadir 2 ml de MeOH seco (¡lentamente!), la mezcla resultante se agitó mientras se barría el NH_{3} con una corriente de N_{2}. La solución de MeOH se trató con Dowex 50 x 8 [H^{+}] hasta pH -8-9 y a continuación se filtró. La resina se lavó con MeOH. El residuo se concentró y se mantuvo en un conducto de vacío para secar. Bajo una atmósfera de N_{2}, el residuo se trató con 1 ml de piridina seca y 0,5 ml de Ac_{2}O y se agitó a t.a. durante la noche. La TLC (EtOAc) mostraba que el hexasacárido 26 era el componente principal. Al concentrar, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (hex:EtOAc 1:4).
Preparación del hexasacárido 17
El hexasacárido 26 (10,0 mg, 6,3 mmol) bajo N_{2} a 0ºC se trató con 0,5 ml de CH_{2}Cl_{2} seco. Se añadió solución de dioxirano (0,20 ml) y la mezcla se agitó a 0ºC -40 min. La TLC (EtOAc) no mostraba trazas de 26. Los disolventes se evaporaron con una corriente de N_{2}. El epóxido se secó en un conducto de vacío durante -2 h. El epóxido se trató bajo una atmósfera de N_{2} con 0,5 ml de alcohol alílico (pasado a través de alúmina básica para secar) y 0,5 ml de THF seco. Al enfriar hasta -78ºC, se añadió ZnCl_{2} 1,0 M (10 ml) en Et_{2}O seco. Después de calentar lentamente hasta t.a., la mezcla se agitó durante la noche. Se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado (5 ml) y la mezcla se extrajo con 3 x 5 ml de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron hasta un aceite, que se secó en un conducto de vacío durante -2 h. El residuo se trató con piridina:Ac_{2}O (2:1, 1,5 ml) mientras se agitaba durante la noche. Los disolventes se retiraron y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (hex:EtOAc 1:4), produciendo el hexasacárido 17 como un sólido incoloro. Rendimiento 5,5 mg.
Resultados y análisis Una Síntesis Altamente Convergente del Determinante del Grupo Sanguíneo Y de Levis en Forma Conjugable
La construcción del determinante Le^{y} comienza con el lactal (1a) (W.N. Harworth, E.L., Hirst, M.M.T., Plant, R.J.W., Reynolds, J. Chem. Soc. 1930, 2644) según se muestra en la Figura 2. La protección de ambos grupos hidroxilo primarios como sus éteres de TBDPS bajo condiciones estándar fue seguida por asociación simple de las funciones hidroxilo 3' y 4' como un carbonato cíclico 2a. La introducción estereoespecífica de dos residuos de fucosa conectados en \alpha daba el tetrasacaridoglical 3a con un rendimiento de 51% en una sola etapa. El donante usado era el azúcar fluorado conocido 5a (S.J. Danishefsky, J. Gervay, J. M. Peterson, F. E. McDonald, K. Koseki, T. Oriyama, D.A. Griffith, C-H. Wong, D.P. Dumas, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8329) siguiendo una modificación de las condiciones de Mukaiyama originales. (T. Mukaiyama, Y. Murai, S. Shoda, Chem. Lett. 1981, 431). El glical 3a corresponde al hapteno Le^{y}, que carece de la función N-acetilo en el residuo de glucosa. El problema era introducir a continuación este grupo así como un módulo espaciador de galactosa.
La metodología desarrollada previamente (D.A. Griffith, S.J. Danishefsky, "On the Sulfonamidoglycosylation of Glycals. A Route to Oligosaccharides With 2-Aminohexose Subunits+", J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5811) resultaba apropiada para alcanzar estos objetivos. El glical 3a se trató con dicolidinperclorato de yodonio y bencenosulfonamida para proporcionar la yodosulfonamida 4a. La azaglicosilación usando el éter 3-estannílico del galactal (9a) (S.J. Danishefsky, K. Koseki, D.A. Griffith, J. Gervay, J. M. Peterson, F.E. McDonald, T. Oriyama, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8331) en presencia de tetrafluoroborato de plata daba el pentasacaridoglical 6a con 75% de rendimiento según se muestra en la Figura 3. Teniendo 6a, se puede repetir la secuencia de azaglicosilación o activar el glical como su epóxido y continuar con glicosilaciones adicionales. Para demostrar la capacidad para idear una forma conjugable del hapteno Le^{y}, era importante la formación del alilglicósido. Se demostró lo factible de convertir el grupo sulfonamido en la acetamida buscada. El glical 6a se desprotegió en dos etapas según se muestra. La peracetilación proporcionaba el acetamidoglical 7a. La activación del glical como su epóxido con dimetildioxirano (R.L. Halcomb, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6661) seguido por apertura del epóxido con alcohol alílico en presencia de cloruro de zinc daba el \beta-alilpentasacárido peracetilado deseado que se desacetilaba mediante adición de metóxido para proporcionar el hapteno Le^{y} buscado como su \beta-alilglicósido 8a. (8a [\alpha]_{D} -72,7º (c. 1 MeOH): IR (película fina) 3350, 2940, 2900, 2830, 1650, 1550, 1365, 1300, 1155, 1070, 1030; ^{1}H NMR (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 5,95 (m, 1 H), 5,32 (d, J = 17,25 Hz, 1 H), 5,14-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J = 3,83 Hz, 1 H), 5,02 (d, J = 3,50 Hz, 1 H), 4,68 (d, J = 8,15 Hz, 2H), 4,51 (d, J = 5,70 Hz, 1H) 3,40-4,38 (m, 27H), 1,96 (s, 3H), 1,23 (m, 6H); HRMS (FAB) calculado para C_{35}H_{56}NO_{24}Na 900,3325 encontrado 900,3310). El aldehído, derivado mediante ozonolisis de 8a, podía conjugarse a una proteína portadora mediante el método de Bernstein y Hall.
Esta síntesis es la ruta más directa conocida para el determinante Le^{y} (O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R. U. Lemieux, Carbohydr Res. 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemieux ibid, 1988, 174, 211; para síntesis previas, véanse: J.C. Jacquinet, P. Sinay, J. Org. Chem. 1977, 42, 720; S. Nilsson, H. Lohn, T. Norberg, Glycoconjugate J. 1989, 6, 21; R.R. Schmidt, A. Topfer, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3353; W. Kinzy, A. Low, Curbohydrate. Res. 1993, 245, 193). El método es estereoespecífico en cada etapa e ilustra la versatilidad de los glicales como donantes y como aceptores y se beneficia de 1,2-glicalepóxidos y sus supuestos homólogos de N-sulfonilaziridina. El método también hace posible la preparación intensiva de análogos y la variación de estrategias de conjugación.
Las síntesis de 3a y 6a se muestran posteriormente
3a: Se añadieron a 2,00 g (2,47 mmol) de carbonato de lactal 2a 4,44 g (9,86 mmol) de fluoruro de fucosilo 5a. La mezcla se azeotropizó 5 veces con benceno y se puso bajo alto vacío durante dos horas. Bajo una atmósfera de argón se añadieron 2,77 ml (12,33 mmol) de di-terc-butilpiridina y 16 ml de éter seco. Se añadieron 2,0 g de TM de 4 \ring{A} recientemente activados y la mezcla se agitó 1 hora a temperatura ambiente. En una bolsa de manipulación con guantes con argón, se añadieron 2,34 g (12,33 mmol) de cloruro estannoso (SnCl_{2}) y 2,56 g (12,33 mmol) de percolato de plata (AgClO_{4}). El matraz se equipó con un condensador de reflujo y la reacción se llevó hasta reflujo durante 72 horas. La reacción se extinguió con 5 ml de bicarbonato saturado y se filtró a través de un bloque de celita. Se diluyó con 50 ml de acetato de etilo y se lavó 2 veces con bicarbonato saturado, 2 veces con sulfato de cobre saturado y 2 veces con salmuera saturada. Los materiales orgánicos se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron. La cromatografía de desarrollo rápido en acetato de etilo al 20%/hexanos proporcionaba 2,10 g (51%) de una espuma blanca 3a: [\alpha]_{D} -78,9 (c. 555, CHCl_{3}); IR (película fina) 3040, 3000, 2905, 2860, 2830, 1820, 1800, 1710, 1635, 1585, 1570, 1480, 1460, 1440, 1415, 1370, 1350, 1300, 1260, 1205, 1145, 1100, 950, 735, 695, ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,09 (d, J = 8,12 Hz, 2H), 8,00 (d, J = 8,26 Hz, 2H) 7,66 (m, 4H), 7,59 (d, J = 6,74 Hz,4H), 7,56 (t, J = 7,27 Hz, 1H), 7,30-7,50 (m,22H) 7,16-7,26 (m,10H) 7,09 (m,2H), 6,99 (t, J = 7,59 Hz, 2H) 6,89 (t, J = 7,97 Hz, 1 H), 6,43 (d, J = 6,08 Hz, 1 H), 5,46 (bs, 1 H), 5,38 (bs, 1H), 5,35 (d, J = 3,42 Hz, 1 H), 4,89 (d, J = 11,35 Hz, 1 H), 4,75-4,80 (m, 4H), 4,72 (d, J = 5,88 Hz, 2H), 4,69 (d, J = 4,27 Hz, 2H), 4,36-4,55 (m, 5H), 4,28 (q, J = 6,51 Hz, 1 H), 4,17 (bd, J = 5,46 Hz, 1 H), 3,90-4,00 (m,6H), 3,85 (d, J = 2,99 Hz, 1 H), 3,82 (d, J = 2,89 Hz, 1H), 3,56-3,78 (m, 4H), 1,07 (m, 24H); HRMS (FAB): calculado para C_{99}H_{106}O_{20}Si_{2}Na 1694,6740 encontrado 1694,6787.
6a: Se azeotropizaron 5 veces con benceno seco 230 mg (0,12 mmol) de yodosulfonamida 4a y se pusieron bajo alto vacío durante 2 horas. Se añadieron 2,4 ml de solución en THF de 15 equivalentes de éter de estaño 9a (generado mediante retirada azeotrópica de agua durante la noche con un separador de Dean-Stark equipado con TM de 4 \ring{A} recientemente activados a partir de 561 mg (1,80 mmol) de 6a-TIPS-galactal y 673 \mul (1,32 mmol) de óxido de bis(tributilestaño) en 80 ml de benceno). Se añadieron a esta solución bajo agitación bajo una atmósfera de argón 200 mg de tamices moleculares en polvo de 4 \ring{A} recientemente activados. Se agitó 1 hora a temperatura ambiente. Se enfrió la solución hasta -78ºC y se añadió, a través de una cánula, una solución de 187 mg (0,96 mmol) de tetrafluoroborato de plata en 2,4 ml de THF. Se calentó hasta temperatura ambiente durante 15 horas y se extinguió la reacción, que se había vuelto de color amarillo claro, con 2 ml de bicarbonato saturado. La mezcla de reacción se filtró a través de un bloque de celita hacia un embudo separador. El bloque de celita se lavó a fondo con acetato de etilo. Los materiales orgánicos se lavaron dos veces con bicarbonato saturado y dos veces con salmuera saturada. Los materiales orgánicos se secaron sobre MgSO_{4}. La concentración y la cromatografía en acetato de etilo al 25%/hexanos daba 193 mg (75%) como una espuma blanca 6a: [\alpha]_{D} -126,4º (c, 505, CHCl_{3}), IR (película fina) 3500, 3040, 3000, 2905, 2840, 1820, 1800, 1705,1635, 1590, 1440, 1410, 1255, 1195, 1100, 1080, 1035, 815, 730, 695; ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,09 (t ap, 4H), 7,08-7,65 (m, 46H), 6,90 (t, J = 7,65 Hz, 3H), 6,76 (d, J = 6,91 Hz, 2H), 6,12 (d, J = 6,59 Hz, 1 H), 5,50 (bs 1 H), 5,45 (bs 1 H), 5,28 (t ap, 2H), 3,03-4,91 (m, 36H), 1,09 (m, 45H); LRMS (FAB): calculado para C_{120}H_{141}NO_{26}SSi_{3}Na 2153 encontrado 2153.
Una Estrategia para el Ensamblaje de Dominios de Oligosacáridos Ramificados Complejos sobre un Soporte Sólido: Una Aplicación para una Síntesis Concisa del Dominio Lewis^{b} en Forma Bioconjugable
El ensamblaje del dominio Le^{b} (tipo 1) es relativamente más difícil de llevar a cabo que el objetivo Le^{y} (tipo 2), en el que se usaba lactal como un material de partida conveniente. En el caso del determinante de tipo 1, el lactato es un material de partida útil. La síntesis del sistema Le^{b} ofrecía una oportunidad para aplicar el método de construcción de oligosacáridos basado en polímeros (S. J. Danishefsky, K. F. McCLure, J. T. Randolph, R. B. Ruggeri, Science 1993, 260, 1307). La estrategia se resume en la Figura 4, en la que el glical 1 unido a polímero se activa para la donación del glicosilo a través de la formación directa de un 1,2-anhidroderivado 2. La reacción de 2 con el glical aceptor 3 da lugar a 4. La reiteración se alcanza por medio de epoxidación directa y reacción con el aceptor 3. La naturaleza autovigilante del método y la purificación de la muestra "de una vez" al final de la síntesis son características útiles.
La presente invención describe una dimensión adicional importante del método unido a polímero. La lógica se capta mediante la inspección de la Figura 5. Cada suceso de glicosilación genera un hidroxilo C_{2} único. En principio (y de hecho, véase posteriormente) este hidroxilo puede funcionar como un aceptor de glicosilo durante la reacción con un donante basado en solución. El enlace de glical de 5, todavía alojado en el soporte, puede alargarse adicionalmente. De este modo, se efectúa la ramificación en C_{2} mientras que se minimiza el requerimiento de proteger las manipulaciones de los grupos. (Para una aplicación de esta estrategia en la síntesis de una saponina compleja, véase: J. T. Randolph, S. J. Danishefsky, J. Am Chem Soc. 1993, 115, 8473).
En principio, esta ramificación puede establecerse en cualquier sitio en una cadena en crecimiento. Para tal extensión, sería necesario proteger todos los grupos hidroxilo previamente generados en el "lado del polímero" (extremo no reductor) del dominio en crecimiento. Así, el oligosacárido unido a polímero puede servir como donante o aceptor, siempre que sea apropiado.
Esfuerzos iniciales en la reducción a la práctica identificaron el tetrasacaridoglical 6, que tiene especificidad para el grupo sanguíneo H-tipo 2, como un objetivo. El galactal 7 soportado en polímero (usando como soporte de polímero poliestireno reticulado con divinilbenceno al 1% funcionalizado usando procedimientos publicados: T-H. Chan, W. Q. Huang, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1985, 909; M. J. Farrall. J.M.J. Frechet, J. Org. Chem 1976, 41, 3877) reaccionaba con una solución de 3,3-dimetildioxirano (R.W. Murray, R. Jeyaraman, J. org. Chem. 1985, 50, 2847), para proporcionar el correspondiente donante de glicosilo de 1,2-anhidroazúcar, que se trató con una solución de derivado de glucal a en presencia de ZnCl_{2} para proporcionar 9 (R.L. Halcomb, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem Soc. 1989, 111, 6661). Este disacárido unido a polímero actuaba como un aceptor de glicosilo durante el tratamiento con una solución de fluoruro de fucosilo 10 (K.C. Nicoloau, C.W. Hummel, Y. Iwabuchi, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3126) en presencia de Sn(OTf)_{2}, dando de ese modo 11. La recuperación del trisacaridoglical del soporte se efectuó usando fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) para proporcionar 12 con un rendimiento global de 50% a partir de 7.
El trisacárido, recuperado del polímero, podía elaborarse adicionalmente a continuación. A este fin, el compuesto 12 se convirtió en el éter silílico 13 mediante reacción con TIPSC1. El último se convirtió en el derivado de yodosulfonamida 14 mediante la adición de I(col)_{2}ClO_{4} en presencia de PhSO_{2}NH_{2}. La reacción de 14 con el derivado de galactal-estannil-éter 15 en presencia de AgBF_{4} daba 16,77% de rendimiento (D.A. Griffith, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem Soc. 1990, 112, 5811). El tetrasacaridoglical 16 se desprotegió y se peracetiló para proporcionar 6 (S.J. Danishefsky, K. Koseki, D.A. Griffith, J. Gervay, J.M. Peterson, F.E. McDonald, T. Oriyama, J. Am. Chem Soc. 1992, 114, 8331).
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Así, la síntesis del determinante tipo H completo se alcanzó mediante maniobras secuenciales basadas en polímeros y soluciones. El siguiente objetivo era el hexasacárido Le^{b} 17 más complejo. La campaña avanzaba según se muestra en la Figura 6. El galactal 7 unido a polímero se convirtió en 18 al epoxidar con 3,3-dimetildioxirano seguido por reacción del derivado de glucal 19. Este disacaridodiol se bisfucosiló a continuación usando el donante de fucosilo 10 en presencia de Sn(OTf)_{2} para proporcionar 20. La recuperación del soporte con TBAF proporcionaba 21, que se obtuvo con un 40% de rendimiento global a partir de 7. El compuesto 21 reaccionaba con TIPSCl para dar 22.
La yodosulfonamida 23, obtenida a partir de 22 usado I(col)_{2}ClO_{4} y PhSO_{2}NH_{2}, reaccionaba con el derivado de lactal 24 en presencia de AgBF_{4} para proporcionar el hexasacaridoglical 25 con 55% de rendimiento. La desprotección de 25 se efectuó en dos fases (TBAF para retirar los éteres silílicos, seguido por reducción con Na/NH_{3} para retirar los grupos protectores aromáticos) y el producto en bruto se peracetiló para dar 26 con un rendimiento global de 51%. El compuesto 26 se convirtió, a través del derivado de 1,2-anhidroazúcar, en el alilglicósido 17, que puede activarse mediante ozonolisis hasta el aldehído (R = CH_{2}CHO) para el acoplamiento subsiguiente a una proteína mediante el método de Bernstein y Hall.
En suma, la presente invención se extiende al método del ensamblaje de glicales soportados en sólidos para la síntesis de dominios de carbohidrato complejos para incluir los patrones de ramificación críticos para el biorreconocimiento. Específicamente, el determinante para la unión de H. pylori al epitelio gástrico humano se ha formado estereoespecíficamente, con simplicidad, de un modo que proporciona un alivio significativo de algunas de las complejidades de proteger las manipulaciones de los grupos.
Procedimiento Experimental
6: ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}); \delta 6,39 (d, 1H, J = 6,2 HZ, H_{1}, galactal), 5,65 (d, 1H, J = 8,9 Hz, NHAc), 5,35 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 5,33 (m, 1 H), 5,29 (d, 1H, J = 2,6 Hz), 5,27 (d, 1H, J = 3,1 Hz), 5,17-5,09 (m, 2H), 4,97-4,90(m,2H), 4,81 (dd, 1H, J = 3 Hz, J = 6,1 Hz, H_{2} galactal), 4,75 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,52 (m, 1 H), 4,48 (dd, 1H, J = 12,0 Hz), 4,44-4,06 (m, 8H), 3,88-3,77 (m, 4H), 3,61 (m, 1 H), 2,18-1,97 (m, 33H, COCH_{3}), 1,18 (d, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{3} fucosa); ^{13}C NMR (CDCl_{3}): \delta 170,80, 170,77, 170,72, 170,67, 170,62, 170,34, 170,21, 170,09, 170,01, 169,99, 169,65, 144,92 (C_{1} galactal), 100,22, 98,83, 98,58, 95,55, 74,48, 73,38, 73,13, 73,06, 71,48, 71,01, 70,68, 67,97, 67,42, 67,18, 67,05, 65,94, 64,83, 62,35, 62,22, 60,88, 60,37, 54,21, 23,23, 22,15, 20,85, 20,82, 20,79, 20,76, 20,65, 20,61, 20,57, 15,51, (C_{6} fucosa); IR (película fina): 3368,7 (NH), 2965,6, 2934,6, 1746,5 (C=O), 1537,5, 1435,9, 1371,3, 1228,5, 1065,0, 1046,0; [\alpha]_{D}^{23} = -51,1º (c 1.8, CH_{2}Cl_{2}) HRMS (FAB); calculado para C_{46}H_{63}NNaO_{28}: m/z = 1100,3434, encontrado 1100,3436,.
21: El galactal 7 unido a polímero (carga = 0,85 mmol de glical/g), que se había puesto en un matraz de fondo redondo equipado con una salida fritada, se suspendió en CH_{2}Cl_{2} bajo N_{2}, se enfrió hasta 0ºC y a continuación se trató con una solución de 3,3-dimetildioxirano. La mezcla se agitó (barra de agitación magnética revestida con teflón) durante 40 min a 0ºC, tiempo después del cual los materiales solubles se retiraron mediante filtración a través de la salida fritada (presión de N_{2}). El 1,2-anhidroazúcar unido a polímero se evacuó (alrededor de 0,1 torr) durante varias horas para secar el material para la siguiente etapa. Este material se puso una vez más bajo N_{2} antes de tratarse con 19 (-10 equivalentes molares como una solución 0,5 M en THF). La suspensión se enfrió hasta -40ºC y se trató con ZnCl_{2} (-2 equivalentes molares como una solución 1,0 M en THF). La mezcla de reacción se dejó calentar lentamente hasta ta (durante alrededor de 2 h) y a continuación se agitó 3-4 h adicionales. Los materiales solubles se retiraron mediante filtración y el polímero 18 se lavó varias veces con THF y a continuación se secó a vacío. Se añadió al compuesto 18, en una bolsa de manipulación con guantes, Sn(OTf)_{2} sólido (equivalentes molares) y la mezcla se puso bajo N_{2} y se enfrió hasta 0ºC antes de tratarse con 10 (\sim5 equivalentes molares) como una solución 0,2 M en THF y di-terc-butilpiridina (\sim8 equivalentes molares). La suspensión se dejó calentar hasta ta y se agitó 8-10 h. La mezcla se enjuagó con THF anhidro (2 veces), 1,4-dioxano (2 veces), de nuevo con THF y a continuación se secó a vacío. El compuesto 20 (100 mg) se suspendió en THF, se trató con una mezcla 1:3 de AcOH y TBAF (-0,2 M en TBAF, -10 equivalentes molares) y la mezcla se agitó durante 18 h a 40ºC. El polímero se enjuagó con THF (3 veces) y los enjuagues combinados se concentraron y se purificaron mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc:hexanos 1:1). El compuesto 21 (18 mg) se obtuvo como un sólido incoloro (40% de rendimiento global a partir de 7): ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,40-7,25 (m, 30H, Ar H), 6,18 (d, 1H, J = 6,0 Hz, H, glucal), 5,26 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H_{1} fucosa), 5,09 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H_{1} fucosa), 4,96 (t, 2H, J = 10,8 Hz, PhCH_{2}), 4,90-4,56 (m, 13 H), 4,43 (m, 1 H), 4,15-4,06 (m, 4 H), 3,97 (dt, 1H, J = 8,3 Hz, J = 2,4 Hz), 3,87-3,65 (m, 10H), 3,64 (d, 1 H), 3,57 (d, 1 H), 2,69 (ancho, 1H, OH), 2,52 (ancho, 1H, OH), 1,11 (d, 3H, J = 7,0 Hz, CH_{3} fucosa), 1,09 (d, 3H, J = 7,0 Hz, CH_{3} fucosa); ^{13}C NMR (CDCl_{3}); \delta 153,37 (C=O), 145,75 (C_{1} glucal), 138,60, 138,52, 138,19, 137,61, 128,55, 128,52, 128,44, 128,24, 128,16, 128,07, 127,62, 127,56, 127,45, 98:71, 98,38, 97,65, 97,34, 79,26, 78,87, 78,67, 78,01, 77,79, 77,65, 76,37, 76,10, 74,92, 74,40, 74,16, 73,95, 72,86, 72,64, 72,53, 67,43, 67,29, 61,31, 60,90, 16,65 (C_{6} fucosa), 16,53 (C_{6} fucosa); IR (película fina): 3467,0 (OH), 3029,6, 2923,6, 1807,2 (C=O), 1647,3, 1496,0, 1453,5, 1358,1, 1240,2, 1095,6, 1049,2, 738,5, 697,2; [\alpha]_{D}^{23} = -82,5º (c 0,4, CH_{2}Cl_{2}); HRMS (FAB); calculado para C_{67}H_{74}NaO_{18}: m/z = 1189,4772, encontrado 1189,4757.
25: A una mezcla de 23 (60 mg, 34 mmol) y tamices moleculares de 4 \ring{A} en polvo (200 mg) bajo N_{2} se añadió, a través de una cánula, una solución de 24 (0,21 mmol) en THF anhidro (1,5 ml). La suspensión agitada se enfrió hasta -78ºC antes de tratarse con una solución de AgBF_{4} (0,21 mmol) en 0,25 ml de THF anhidro. La mezcla se agitó y se dejó calentar lentamente hasta ta durante la noche. La solución, que había desarrollado un color amarillo claro, se calentó, con agitación, a 45ºC durante 36 h adicionales, hasta que la TLC (EtOAc:hexanos 2,5) no mostraba trazas de 23. La mezcla se trató con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml) y a continuación se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml) y los materiales orgánicos se secaron sobre MgSO_{4}. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc:hexanos 1:3) para dar 25 como un aceite incoloro (42 mg, 55%): ^{1}H NMR (400 MHz, acetona-d_{6}): \delta 8,17(d, 2H, J = 7,3 Hz, PhSO_{2}), 7,50-7,20 (m, 33H, ArH), 6,52 (d, 1H, J = 10,5 Hz, NH), 6,30 (dd, 1H, J = 6,0 Hz, H, glucal), 5,35-5,32 (m, 2H), 5,25 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 5,15 (m, 2 H), 4,99-4,92 (m, 3H), 4,86-4,52 (m, 14 H), 4,45 (dd, 1H, J = 7,91 Hz, J = 2,4 Hz), 4,32-4,23 (m, 3H), 4,22 (dd, 1 H), 4,17 (d, 1H, J = 10,1 Hz), 4,08-3,84 (m, 18 H), 3,79-3,73 (m, 2H), 3,66 (m, 1 H), 3,55 (t, 1H, J = 6 Hz), 3,50 (dd, 1H, J = 9,7 Hz), 1,33 (d, 3H, J = 6,5 Hz, CH_{3} fucosa), 1,31 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH_{3} fucosa), 1,20-0,98 (m, 84H, 3 x Si(i-Pr)_{3}); ^{13}C NMR (acetona-d_{6}): 145,66 (C=O), 132,72, 131,48, 131,45, 131,28, 131,16, 130,77, 130,48, 121,31, 120,11, 119,86, 119,78, 119,25, 95,63, 94,70, 91,37, 89,64, 89,31, 86,52, 73,38, 72,24, 71,00, 70,71, 70,37, 69,80, 69,59, 69,06, 68,23, 67,92, 67,38, 67,10, 66,49, 65,67, 65,33, 64,60, 64,34, 64,03, 63,45, 63,30, 59,46, 58,83, 58,37, 54,45, 53,32, 49,86, 19,67 (C_{6} fucosa), 18,42 (C_{6} fucosa), 9,55, 9,48, 9,45, 9,31, 9,23, 3,82, 3,70, 3,64; IR (película fina): 3491,9 (OH), 3030,1, 2941,2, 2865,5, 1835,8, 1819,5, 1649,8, 1496,2, 1462,3, 1349,9, 1245,5, 1155,2, 1095,1, 1049,4, 882,2, 734,8, 692,0; [\alpha]_{D}^{23} = -33,8º (c 2,0, CH_{2}Cl_{2}); HRMS (FAB): calculado para ^{12}C_{120} ^{13}CH_{179}NNaO_{29}SSi_{4}: m/z = 2278,1292, encontrado 2278,1296.
17: ^{1}H NMR (400 MHz, CD_{3}OD): \delta 6,00 (m, 1H, J = 5,6 Hz, CH_{2}CH=CH_{2}), 5,37 (dd, 1H, J = 1,6 Hz, J = 7,3 Hz, CH_{2}CH=CH_{2}), 5,20 (dd, 1H, J = 1,6 Hz, J = 9,5 Hz, CH_{2}CH=CH_{2}), 5,18 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H_{1} fucosa), 5,10 (d, 1H, J = 3,8 Hz, H_{1} fucosa), 4,64 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 4,45 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 4,43-4,23 (m, 2H), 4,27 (dd, 1H, J = 9,3 Hz, J = 10,6 Hz), 4,23-4,11 (m, 2H), 4,02-3,29 (m, 31 H), 2,06 (s, 3H, NAc), 1,31 (d, 3H, J = 6,6 Hz, CH_{3} fucosa), 1,29 (d, 3H, J = 6,6 Hz, CH_{3} fucosa); ^{13}C NMR (CD_{3}OD): \delta 173,20 (C=O), 135,73 (CH_{2}CH=CH_{2}), 105,13, 103,30, 102,49, 101,62, 99,63, 96,86, 80,79, 80,67, 78,44, 76,67, 76,49, 75,89, 74,80, 74,59, 73,94, 73,61, 73,40, 71,55, 71,38, 71,16, 70,42, 70,26, 70,14, 67,77, 67,30, 67,21, 62,79, 62,34, 61,99, 55,54, 22,97 (NAc), 16,65 (2 C's, C_{6} fucosa); IR (película fina): 3376,6 (OH), 2924,2, 1652,5 (C=O), 1383,1, 1032,4; [\alpha]_{D}^{23} = -12,8º(c 0,25, MeOH); HRMS (FAB): calculado para C_{41}H_{69}NNaO_{29}: m/z = 1062,3853, encontrado 1062,3837.
Ejemplos de la invención Método de Ensamblaje de Glicales Aplicado a la Síntesis de Antígeno Asociado con el Tumor de Mama Humano
La presente invención proporciona una síntesis convergente del hexasacárido en el que los dos dominios de trisacárido se han ensamblado eficazmente en formas fácilmente disponibles para el acoplamiento. La síntesis del trisacárido ABC se muestra en la Figura 8. El enlace \alpha de este trisacárido podría formarse empleando un donante de azúcar fluorado 4b, usando condiciones establecidas (Gordon, D. M.; Danishefsky, S. J., Carbohydr. Res., 1990, 206, 361-366). La preparación del aceptor de disacárido apropiado comenzaba con 5b (Danishefsky, S. J.; Behar, V.; Randolph, J. T.; Lloyd, K. O., J. Am. Chem. Soc., 1995, 0000), el mismo obtenido a partir de un acoplamiento de glicales.
La bencilación seguida por desililación, retirada de carbonato y dibencilación selectiva proporcionaba el disacárido 6b. El aceptor así obtenido se hizo reaccionar con el azúcar fluorado 4b usando condiciones de Mukaiyama modificadas (Mukaiyama, T.; Murai, Y.; Shoda, S., Chem. Lett., 1981, 431-433) para proporcionar el trisacaridoglical 7b. La desprotección del PMB proporcionaba el trisacárido ABC 8b, que estaba listo para el acoplamiento con un donante de trisacárido DEF adecuado.
La síntesis del trisacárido DEF se describe en la Figura 9. La epoxidación del galactal 9b y el acoplamiento estándar (Halcomb, R.L.; Danishefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 6661-6666) con aceptor 10b proporcionaban, regioselectivamente, el disacárido 11b. La fucosilación empleando la fluorofucosa 12b (Dejter-Juszynski, M.; Flowers, H.M., Carbohydr. Res., 1973, 28, 61) proporcionaba una relación 5:1 de regioisómeros de monoglicosilación, siendo el isómero principal el trisacárido deseado 13b. Este material se trató bajo condiciones estándar para proporcionar la yodosulfonamida diaxial trans 14b.
Las reacciones de acoplamiento directo (Griffith, D.A.; Danshefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5811-5819; Danishefsky, S.J.; Koseki, K.; Griffith, D.A.; Gervay, J.; Peterson, J.M.; McDonald, F.E.; Oriyama, T., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 8331-8333) que empleaban yodosulfonamidas tales como 14b con aceptores de trisacárido ABC fallaban, conduciendo a una funcionalidad de donante diferente en el trisacárido. En la práctica, la yodosulfonamida 14b se trató con etanotiolato de litio en exceso para proporcionar el etiltioglicósido 15b (Figura 10). El precedente establecido por los presentes inventores conducía a la predicción de que la participación de la sulfonamida proporcionaba el producto conectado en \beta deseado a partir de 15b (Griffith, D.A., Ph.D. Thesis, Yale University, 1992). Cuando el donante 15b se trataba con MeOTf en presencia del aceptor 8b, se obtenía una mezcla 10:1 de isómeros de hexasacárido. El producto principal 16b se obtuvo con un rendimiento de 70-85%.
La ligación y la elaboración de la ceramida comenzó con la epoxidación de 16b, seguido por reacción con el éter estannílico 17b promovida por Zn(OTf)_{2} (Liu, K.K.-C.; Danishefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 4933-4934). Aunque el rendimiento de este acoplamiento de ceramida es bajo, cuando esta reacción se realizaba sobre el trisacárido 7b, el producto correspondiente se obtenía con 66% de rendimiento. Este material puede usarse a continuación para obtener 18b. Después de la acetilación, la cadena lateral de la ceramida se elaboró mediante la reducción de la funcionalidad azida usando catalizador de Lindlar bajo una atmósfera de H_{2} en presencia de anhídrido palmítico para proporcionar 18b. La desililación y la saponificación fueron seguidas por desprotección del metal con disolución y extinción con MeOH. La peracetilación de la mezcla en bruto, seguida por saponificación, proporcionaba el glicoesfingolípido 1b. Los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento de los protones anómeros solo se han presentado para el material natural. El espectro de 1b sintético está en completo acuerdo con estos datos. Por otra parte, el producto se caracterizaba por la masa exacta y ^{1}H y ^{13}C NMR. También se mostró que el material sintético se unía al anticuerpo monoclonal MBr1.
Además, la presente invención proporciona el alquilglicósido correspondiente (Figura 10b). La desprotección de 16b, como anteriormente, y la acetilación proporcionaban el peracetato del hexasacaridoglical. La epoxidación, la reacción con alcohol alílico y la saponificación proporcionaban el alilglicósido 19b.
Como en el caso del determinante Le, la ozonolisis del grupo alilo de 19b fijará la fase para el acoplamiento reductivo de residuos de lisina de proteínas.
Síntesis de 3b
3-O-(4-Metoxibencil)-D-galactal
Una suspensión de D-galactal (2b) (3,70 g, 25,3 mmol) y óxido de dibutilestaño (6,30 g, 1,0 equivalentes) en benceno seco (150 ml) se calentó hasta reflujo durante 2 h con retirada azeotrópica de agua. La reacción se enfrió y se trató con PMBC1 (3,80 ml, 1,1 equivalentes) y bromuro de tetrabutilamonio (9,10 g, 1,1 equivalentes) y se sometió a reflujo durante 4 h. La reacción se filtró a través de una columna de sílice y se eluyó con EtOAc/hexanos (4:1). Las fracciones que contenían producto se concentraron y el residuo se trituró en hexanos para dar 4,50 g (67%) de producto como un sólido cristalino blanco.
pf (hexanos) 117-118ºC; (a)^{23} = -23,0º (CHCl_{3}, c = 1,1); IR (KBr) 3313 (ancho), 1645, 1513, 1228, 1082, 821 cm^{-1} ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,28 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,89 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,44 (1H, dd, J = 6,4 Hz), 4,70 (1H, dt, J = 6,3, 1,9 Hz), 4,59-4,52 (2H, ABq, J = 11,4 Hz), 4,20-4,18 (1H, m), 4,04-3,97 (1H, m), 3,90-3,82 (2H, m), 3,81 (3H, s), 2,73 (1H, d, J = 3,1 Hz, C4-OH), 2,54 (1H, dd, J = 8,2, 4,2 Hz, C6-OH); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 159,46, 145,02, 142,05, 129,46, 113,95, 99,36, 76,12, 70,17, 70,14, 63,65, 62,74, 55,26; LRMS(NH_{3}) 284 (M+NH_{4})^{+},
266 (M)^{+}, 249.
4,6-di-O-bencil-3-O-(4-metoxibencil)-D-galactal (3b)
Una solución de 3-O-(4-metoxibencil)-D-galactal (2,28 g, 8,56 mmol) y bromuro de bencilo (3,75 ml, 3,68 equivalentes molares; recientemente pasados a través de alúmina básica) en DMF (30 ml) bajo N_{2} a 0ºC se trató con NaH (1,37 g, 4,0 equivalentes molares) en dos porciones. La reacción se agitó 0,5 h a 0ºC y 1 h a ta. La reacción se vertió cuidadosamente en 50 g de hierro triturado, se diluyó hasta 100 ml con agua y a continuación se extrajo con EtOAc-hexanos (1:1, 100 ml x 3). Los extractos orgánicos se lavaron con agua (100 ml x 2), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron. La cromatografía de desarrollo rápido con EtOAc al 15%-hexanos daba 3,58 g (94%) del compuesto del epígrafe como un líquido transparente.
[\alpha]_{D}^{23} = -48,2º (CHCl_{3}, c=0,85); IR (puro) 3030, 2867, 1645, 1613, 1513 1247, 1092, 821, 736 cm^{-1}; ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,34-7,23 (12H, m), 4,62 (1H, d, J =12,0 Hz), 4,59-4,51 (2H, ABq, J =11,7 Hz), 4,50-4,39 (2H, ABq, J = 11,9 Hz) ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 159,04, 143,99, 138,30, 137,90, 130,43, 128,26, 128,20, 128,03, 127,77, 127,57, 127,56, 113,67, 100,00, 75,58, 73,28, 73,17, 71,13, 70,42, 70,28, 68,35, 55,15; LRMS (NH_{3}) 464 (M+ NH^{4+}, 100), 326 (18), 309 (48), 253 (17).
Síntesis de 4b
Una solución del galactal 3b (3,20 g, 7,17 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco bajo N_{2} a 0ºC se trató con dimetildioxirano (0,09 M, 80 ml) y se agitó hasta que todo el glical se consumía (0,5-1H, TLC EtOAc al 30% en hexanos). Las materias volátiles se retiraron a 0ºC con una corriente de N_{2} seco. El residuo se disolvió en 30 ml de THF seco bajo N_{2} a 0ºC y se trató con TBAF (36 ml, almacenado sobre TM) y a continuación se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La solución de color marrón oscuro se filtró a través de un bloque de sílice (\sim4 cm de altura) y se lavó con EtOAc (200 ml). El filtrado se lavó con agua (200 ml x 3) y se secó (MgSO_{4}) y se concentró. El residuo se redisolvió en EtOAc al 30%-hexanos (50 ml) y se filtró a través de una columna corta de sílice (10 cm d x 4 cm h) y se lavó con el mismo sistema de disolventes (1 l). El filtrado se concentró para dar 2,59 g de fluorhidrina con >90% de pureza. El residuo se disolvió en DMF seca (30 ml) bajo N_{2} a 0ºC y se trató con bromuro de bencilo (958 \mul, 1,5 equivalentes, recientemente filtrados a través de alúmina básica), finalmente con NaH (322 mg, dispersión al 60%, 1,5 equivalentes) y se agitó durante 30 min a 0ºC y 30 min a ta. La reacción se extinguió vertiendo en 100 g de hierro y se extrajo con EtOAc-hexanos 1:1 (150 ml x 2). Los extractos orgánicos se lavaron con agua (150 ml x 2), se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a vacío. La cromatografía de desarrollo rápido con EtOAc al 10%-hexanos daba 2,00 g (49%) del compuesto del epígrafe como un líquido amarillento.
[\alpha]_{D}^{23} = +15,3º (CHCl_{3}, c = 0,85); IR (película de CHCl_{3}) 2916, 1612, 1513, 1248, 1103, 1056, 734 cm^{-1} ; ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,35-7,24 (17H, m), 6,84 (2H, d, J = 8,4 Hz), 5,15 (1H, dd, J = 53,2, 7,0 Hz), 4,92 (1 Hz, d, J = 11,6 Hz), 4,48-4,74 (2H, ABq, J = 11,8 Hz), 3,96-3,89 (1H, m), 3,86 (1H, bs), (3H, s), 3,65-3,56 (3H, m), 3,51 (1H, dd, J =9,8, 2,8 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 159,22, 138,33, 138,11, 137,62, 130,16, 129,19, 128,40, 128,29, 128,21, 128,04 (2C), 127,90, 127,81,127,69,127,59, 113,77, 110,20 (d, J = 214 Hz), 80,60 (d, J =11,3 Hz), 79,00 (d, J = 20,5 Hz), 74,92, 74,52, 73,59 (d, J = 5,0 Hz), 73,54, 72,99, 72,70, 68,34, 55,20; LRMS (NH_{3}) 454 (M + NH_{4}^{+}, 100).
Síntesis de 6b
Una solución de TIPS-carbonatogalactal 5b (Danishefsky, S.J.; Behar, V.; Randolph, J.T.; Lloyd, K., J. Am. Chem. Soc., 1995, 0000) (4,28 g, 5,62 mmol) en THF (25 ml)-MeOH (5 ml) se trató con solución de TBAF (1,0 M, 6,75 ml, 1,2 equivalentes). Después de 6 h, se añadió TBAF adicional (4 ml) y se agitó 3 h adicionales. La reacción se concentró y se cromatografió directamente con EtOAc-hexanos 4:1 para obtener 2,220 g de triol. Las mezclas restantes de carbonato cíclico y carbonato mixto se hidrolizaron en MeOH con MeONa (1,0 ml, 25% en peso) y se purificaron cromatográficamente. El rendimiento total era 3,02 g (93%). Este material se usó directamente para la etapa de dibencilación.
^{1}H-HMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,35-7,24 (15H, m), 6,43 (1H, d, J = 6,3 Hz), 4,87 (1H, dd, J = 6,3, 3,4 Hz), 4,84 (1H, d, J = 11,4 Hz), 4,63 (2H, s aparente), 4,61 (1H, d, J = 11,4 Hz), 4,5-4,47 (3H, m), 4,19-4,16 (3H, m), 3,87-3,84 (2H,m), 3,78-3,66 (3H, m), 3,46 (2H, d aparente, J = 4,6 Hz), 3,29 (1H, t, J = 5,5 Hz), 3,08 (1H, ancho), 2,73 (2H, ancho); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 144,70, 138,41, 138,22, 137,83, 128,45, 128,33 (2C), 128,12, 127,84, 127,73, 127,64, 127,57, 102,28, 99,74, 78,99, 76,03, 74,64, 74,07, 73,24 (2C), 73,17, 72,64, 70,20, 69,10, 67,79, 62,15.
Una mezcla del tiolglical anterior (2,95 g, 5,1 mmol), óxido de dibutilestaño (1,33 g, 1,05 equivalentes) y óxido de bistributilestaño (1,69 ml, 0,65 equivalentes) en benceno seco (50 ml) bajo N_{2} se sometió a reflujo durante 5 h con retirada azeotrópica de agua. La reacción se enfrió por debajo de ebullición y se trató con bromuro de bencilo (2,43 ml, 4,0 equivalentes molares) y bromuro de tetrabutilamonio (3,29 g, 2,0 equivalentes). Se separaron por destilación 10 ml de benceno y la reacción se sometió a reflujo durante 16 h. La reacción se cargó directamente sobre una columna de sílice y se eluyó con EtOAc al 15-20%-hexanos para dar 3,48 g (90%) de producto 6b como un aceite transparente.
[\alpha]^{23}_{D} = -3,3º (CHCl_{3}, c = 0,87); IR (película de CHCl_{3}) 2867, 1652 1454, 1364, 1097, 736 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,35-7,21 (25H, m), 6,45 (1H, d, J = 6,2 Hz), 4,88 (1H, dd, J =6,2, 3,9 Hz), 4,83 (1H, d, J = 10,9 Hz), 4,69 (2H, s aparente), 4,68 (1H, d, J = 10,9 Hz), 4,59 (2H, s aparente), 4,55 (1H, d, J = 7,8 Hz), 4,49 (2H, s aparente), 4,47 (2H, s aparente), 4,29 (1H, dd, J = 9,6, 5,8 Hz), 4,18 (1H, t, J = 4,4 Hz), 4,13 (1H, m), 3,99 (1H, bs), 3,85 (1H, dd, J = 10,6, 6,4 Hz), 3,75-3,60 (4H, m), 3,47-3,41 (2H, m); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 144,43, 138,64, 138,42, 137,99, 137,84, 137,80, 128,40, 128,34, 128,26, 128,23, 128,18, 128,15, 127,82, 127,75, 127,69, 127,67, 127,65, 127,55, 127,51, 127,46, 127,31102,56, 99,56, 80,57, 78,69, 75,72, 75,10, 73,57, 73,32, 72,94, 72,28, 71,94, 70,12, 68,90, 67,85, 66,62; LRMS (NH_{3}) 776 (M + NH_{4}^{+}, 100).
Síntesis de 7b
El lactal 6b (1,32 g, 1,74 mmol, 1,0 equivalentes) y el azúcar fluorado 4b (1,49 g, 2,60 mmol, 1,5 equivalentes) se combinaron en éter y se concentraron. La mezcla se secó mediante evaporación en benceno seco (25 ml x 2) a vacío durante 2 h y a continuación se trató con di-t-butilpiridina (389 \mul, 1,0 equivalentes) en una bolsa de manipulación con guantes y se disolvió en éter seco (18 ml) bajo atmósfera de nitrógeno. En un matraz de 50 ml separado se pusieron TM de 4 \ring{A} (4,0 g) y a continuación se secaron a la llama bajo vacío, se enfriaron hasta temperatura ambiente. Se añadieron perclorato de plata anhidro (160 mg, 1,0 equivalentes) y SnCl_{2} (329 mg, 1,0 equivalentes) en una bolsa de manipulación con guantes y se barrió con nitrógeno. La mezcla de sales se puso en un baño de agua y la solución de azúcar se introdujo a través de agujas de doble punta y la mezcla se sometió a sonicación durante 2 min. La reacción se envolvió con papel de aluminio y se agitó durante 45 h a ta. El filtrado (200 ml) se lavó con NaHCO_{3} diluido (100 ml x 2), se secó (MgSO_{4}) y se concentró. La cromatografía de desarrollo rápido con EtOAc al 15-20%/hexanos daba trisacáridos (1,107 g, 49%) y lactal impuro. La porción de trisacáridos se recromatografió con éter al 2%-cloruro de metileno para dar 879 mg (39%) del producto \alpha deseado y 195 mg (8,6%) de producto \beta. La fracción de lactal impuro se recromatografió con éter al 3-4%-cloruro de metileno para dar 479 mg (36%) de lactal puro. 77% de rendimiento de acoplamiento (61% de producto \alpha) basado en el material de partida recuperado.
[\alpha]^{23}_{D} = +41,8º (CHCl_{3}, c = 1,8); IR (película de CHCl_{3}) 2867, 1648, 1513, 1496, 1453, 1364, 1248, 1097, 735 cm^{-1}; ^{1}H-MR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,33-7,12 (42H, m) 6,83 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,45 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,03 (1H, d, J = 2,3 Hz), 4,91-4,76 (6H, m), 4,68-4,40 (12H, m), 4,23-3,97 (11H, m), 3,86-3,82 (1H, dd, J = 2,3 Hz), 3,76 (3H, s), 3,69-3,64 (2H, m), 3,53 (1H, t, J = 8,7 Hz), 3,47-3,43 (1H, m), 3,40-3,36 (1H, m), 3,34-3,31 (1H, dd, J = 9,9, 2,8 Hz), 3,22 (1H, dd, J = 8,3, 4,8 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 158,93, 144,59, 138,98, 138,84, 138,78, 138,64, 138,58, 138,06, 138,02 (2C), 130,82, 129,04, 128,33, 128,24, 128,21, 128,15, 128,08, 128,05, 127,83, 127,81, 127,72, 127,64, 127,58, 127,55, 127,50, 127,44, 127,41, 127,36, 127,33, 127,31, 113,65, 103,02, 100,39, 100,01, 80,93, 78,93, 78,70, 76,53, 76,11, 75,14, 74,84, 74,79, 74,35, 73,91, 73,59, 73,36, 73,15, 73,10, 72,98, 72,15, 72,10, 71,99, 70,55, 69,25, 67,92 (2C), 67,69, 55,19.
Síntesis de 8b
Una solución de PMB-trisacárido (37 mg, 0,028 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) a 0ºC. La reacción se cargó directamente en una columna y se eluyó con EtOAc al 20%-hexanos para dar 28 mg (84%) del producto deseado.
[\alpha]^{23}_{D} = +45,6º (CHCl_{3}, c = 1,78); IR (película de CHCl_{3}) 2866, 1648, 1496, 1453, 1248, 1097, 735 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,36-7,15 (40H, M), 6,43 (1H, d, J = 6,2 Hz), 5,09 (1H, d, J = 3,3 Hz), 4,85 (1H, dd, J = 6,2, 3,6 Hz), 4,83-4,65 (5H, m), 4,61-4,41 (9H, m), 4,29-4,08 (8H, m), 4,02 (1H, d, J = 2,6 Hz), 3,97 (1H, d, J = 2,2 Hz), 3,93 (1H, t, J = 8,4 Hz), 3,86-3,78 (2H, m), 3,67-3,61 (2H, m), 3,53 (1H, dd, J = 8,5, 4,8 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 144,38, 138,78, 138,62, 138,47, (2C), 138,20, 138,00, 137,88, (2C, 128,31, 128,29, 128,23, 128,19, 128,16, 128,05, 127,88, 127,83, 127,62, 127,57, 127,49, 127,45, 127,43, 127,41, 127,37, 127,32, 127,23, 102,68, 99,89, 99,34, 80,82, 78,72, 77,49, 77,10, 75,88, 75,13, 75,03, 74,23, 73,62, 73,05, 73,01, (3C), 72,62, 72,19 (2C), 70,46, 69,66, 68,92, 67,85, 67,74, 67,54.
Síntesis de 11b
El glical 9b (4,32 g, 3,14 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y se enfrió hasta 0ºC. Se trató a continuación con dimetildioxirano (219 ml, -3,14 mmol) a 0ºC. La epoxidación acababa en menos de 1 h y a continuación la mezcla de reacción se concentró hasta sequedad usando corriente de N_{2} seco. El residuo se azeotropizó adicionalmente una vez con benceno (20 ml) y se puso en un conducto de vacío durante 30 min a 0ºC antes de disolverse en THF (60 ml) y enfriarse hasta -78ºC. Se añadió a la solución anterior, a través de una cánula, el galactal 10b secado azeotrópicamente (3,32 g, 10,95 mmol, 20 ml de THF) y seguido por ZnCl_{2} (26,3 ml, 1,0 M en éter). La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Después del tratamiento con Na_{2}CO_{3} acuoso saturado (40 ml), la mezcla de reacción se concentró y se extrajo con éter (500 ml). La fase orgánica se lavó con NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}) y se concentró. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc-hexanos 1:4) para dar 6,20 g de 11b como una espuma blanca (87,4%).
IR (película de CHI_{3}) xyz cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,45 (1H, dd, J = 6,4, 1,6 Hz), 4,85 (1H, dd, J = 6,4, 2,0 Hz), 4,72-4,68 (2H, m), 4,65 (1H, d, J = 7,2 Hz), 4,55 (1H, m), 4,21 (1H, m), 4,08 (1H, dd, J = 9,6, 5,6 Hz), 3,96-3,82(6H, m), 3,33 (1H, d, J = 3,2 Hz, OH), 3,27 (1H, d, J = 2,8 Hz, OH), 1,16-1,04 (42H, m); ^{13}C-NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 154,45, 145,75, 99,14, 98,27, 77,83, 76,59, 74,27, 72,04, 71,62, 70,86, 64,52, 62,57, 61,60, 17,84, 11,78, 11,77; LRMS (NH_{3}) 664 (M + NH_{4}^{+} 100), 647 (M +1^{+}, 5), 422 (21), 380 (25).
Síntesis de 13b
El disacárido 11b (2,64 g, 4,08 mmol) se secó azeotrópicamente tres veces (3 x 10 ml) junto con la fluorofucosa 12b (1,64 g, 3,77 mmol) y tamices moleculares (4 \ring{A}, 4,0 g) en THF (20 ml) con 2,6-di-terc-butilpiridina. La solución se añadió a través de una cánula a un matraz que contenía AgClO_{4} (1,56 g, 7,54 mmol), SnCl_{2} (1,43 g, 7,54 mmol) y tamices moleculares (4 \ring{A}, 4,0 g) en THF (15 ml) a -40ºC. La mezcla de reacción se agitó 30 min a -40ºC y a continuación 34 h a 5ºC hasta la desaparición de la fluorofucosa. Después del tratamiento con NaHCO_{3} acuoso saturado (40 ml) a 5ºC, la mezcla se extrajo con EtOAc (700 ml). La fase orgánica se lavó con NaCl saturado, se secó (MgSO_{4}) y se concentró. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para dar 1,93 g del trisacaridoglical 13b deseado (48%, basado en la fluorofucosa usada) y 500 mg del disacárido recuperado con solo una traza del otro producto de monofucosilo.
Síntesis de 15b
Una mezcla secada azeotrópicamente del trisacaridoglical 13b (1,11 g, 1,05 mmol) y bencenosulfonamida (0,82 g, 5,24 mmol) se disolvió en el THF (20 ml) junto con tamices moleculares (4 \ring{A}, 2,6 g). La mezcla se enfrió hasta -40ºC y a continuación se añadió, a través de una cánula, a una solución de I(sym-col)_{2}-COI_{4} preparada in situ agitando I_{2} (0,54 g, 2,09 mmol) con Ag(sym-col)_{2}-COI_{4} (0,986 g, 2,28 mmol) en THF (20 ml) a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min hasta la desaparición del color marrón del I_{2}. La mezcla se calentó hasta 0ºC en menos de 1 h y se agitó durante otra 1 h. Después de extinguir con Na_{2}S_{2}O_{3} acuoso saturado, la mezcla se filtró y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica combinada se lavó con CuSO_{4} acuoso saturado (100 ml), NaCl saturado (100 ml x 2) y se secó (Na_{2}SO_{4}). Después de la concentración, el producto en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc-hexanos 1:4) para dar 981 mg de un aceite incoloro como una mezcla 2:1 de la yodosulfonamida diaxial \alpha-trans deseada y su isómero cis. La mezcla de yodosulfonamidas se añadió a continuación con agitación a un matraz que contenía etanotiol (226,3 mg, 3,04 mmol) y hexametildisililazida de litio (1,48 ml, 1,46 mmol) en DMF (10 ml) a -40ºC. La mezcla de reacción se agitó a -40ºC durante la noche y a continuación se extinguió con NaHCO_{3} acuoso saturado y se extrajo con éter (3 x 100 ml). La fase orgánica combinada se lavó con NaCl acuoso saturado y se secó (Na_{2}SO_{4}). Después de la concentración, el producto en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc-CHCl_{2} 3:97) para dar 438 mg de 15b (33%) y 333 mg de la yodosulfonamida cis intacta.
Síntesis de 16b
Una mezcla del trisacárido aceptor 8b (92 mg, 0,077 mmol, 1,0 equivalentes), el tioglicósido 15b (198 mg, 2,0 equivalentes) y TM de 4 \ring{A} recientemente activados (560 mg) bajo N_{2} a ta se suspendió en CH_{2}Cl_{2}-Et_{2}O (1:2, 3,9 ml) y se agitó durante 10 min. La reacción se enfrió hasta 0ºC y a continuación se trató con triflato de metilo (52,4 \mul, 6,0 equivalentes). La reacción se agitó durante 4,5 h a 0ºC y 1,5 h mientras se calentaba hasta 15ºC. La reacción se extinguió con TEA (1,0 ml), se filtró a través de un bloque de sílice y se enjuagó con Et_{2}O. El filtrado (70 ml) se lavó con NaHCO_{3} saturado (50 ml x 2), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El producto en bruto se purificó mediante HPLC (EtOAc al 17% en hexanos, 15 ml/min, detección UV a 260 nm) para dar 158 mg (85%) del producto deseado y 27,7 mg de subproducto conectado en \alpha (alrededor de 55% de pureza).
Tiempo de retención=22 min; [\alpha]^{23}_{D} = -13,3º (CHCl_{3}, c = 1,4); IR (película de CHCl_{3}) 2940, 2865, 1792, 1652, 1454, 1161, 1101, 734 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz CDCl_{3}) \delta 7,8 (2H, m), 7,38-7,06 (58H, m), 6,43 (1H d, J = 6,1 Hz), 5,15 (1H bs), 5,07 (1H d, J = 3,6 Hz), 5,03 (1H d, J = 3,6 Hz), 4,99 (1H d, J = 11,6 Hz), 4,89-4,61 (12H, m), 4,54-4,46 (4H, m), 4,42 (2H, s aparente), 4,38 (1H d, J = 11,9 Hz), 4,34-4,26 (3H, m), 4,21-4,18 (4H, m), 4,13-4,03 (7H, m), 3,98-3,76 (14H, m), 3,70-3,61 (4H, m), 3,46-3,27 (7H, m), 2,84 (1H OH), 1,16 (3H, d, J = 6,4 Hz), 1,13-1,02 (42H, m); ^{13}C-NMR (100 MHz CDCl_{3}) \delta 155,35, 144,55, 140,78, 138,99, 138,75, 138,68, xxx, 138,54, 138,43, 138,13, 138,03, 137,94, 137,82, 132,31, 128,81, 128,52, xxx, 128,38, 128,36, 128,27, 128,24, 128,20, 128,16, 128,02, 127,93, 127,72, 127,66, 127,58, 127,48, 127,43, 127,37, 127,20, 103,41, 102,75, 99,79, 99,55, 98,29, 97,76, 80,49, 80,39, 79,09, 78,91, 78,25, 77,68, xxx, 76,51, 75,88, 75,09, 74,99, 74,91, 74,73, 74,15, 74,02, 73,92, 73,52, 73,19, 73,10, 72,94, 72,67, 72,25, 72,07, 71,76, 71,56, 71,33, 70,33, 69,45, 69,32, 68,48, 68,08, 67,86, 67,75, 61,97, 61,60, 56,14, 17,99, 17,96, 17,95, 17,92, 16,75, 11,86; HRMS (FAB) calculado para C_{138}H_{169}NO_{30}SSi_{2}Na (M + Na) 2432,0920, encontrado 2432,0970.
Síntesis de 19b
Una solución del hexasacaridoglical 16b (85 mg, 0,035 mmol) en THF (6 ml) bajo N_{2} a ta se trató con TBAF (1,0 M, 353 \mul, 10 equivalentes). Después de 38 h a ta, la reacción se concentró hasta alrededor de 1 ml, a continuación se disolvió en EtOAc (60 ml), se lavó con agua (30 ml x 2), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. La cromatografía de desarrollo rápido con MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2} daba 70,0 mg (98%) del producto desilildescarbonado.
[\alpha]^{23}_{D} = 1,8º (película de CHCl_{3}) 2868, 1652, 1455, 1157, 1094, 735 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz CDCl_{3}) \delta 7,80 (2H, d, J = 7,4 Hz), 7,47 (2H d, J = 7,2 Hz), 7,37-6,95 (56H, m), 6,45 (1H d, J = 6,3 Hz), 5,86 (1H bs), 5,35 (1H d, J = 11,6 Hz), 5,30 (1H D, J = 2,8 Hz), 4,95 (1H d, J = 11,3 Hz), 4,89 (1H d, J = 3,5 Hz), 4,86-4,67 (9H, m), 4,54-4,39 (9H, m), 4,34 (1H dd, J = 10,4, 2,8 Hz), 4,26-4,06 (9H, m), 3,98-3,45 (23H, m), 3,41 (1H d, J = 10,0 Hz), 3,29-3,20 (5H, m), 0,73 (3H, d, J = 6,3 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz CDCl_{3}) \delta 144,87, 142,49, 139,49, 139,11, 138,87, 138,63, 138,54, 138,37, 138,00, 137,98, 137,97, 137,18, 131,64, 128,74, 128,52, 128,43, 128,33, 128,28, 128,25, 128,21, 128,02, 127,99, 127,97, 127,80, 127074, 127,67, 127,63, 127,61, 127,54, 127,53, 127,50, 127,44, 127,33, 127,31, 127,02, 126,86, 103,39, 102,78, 100,75, 100,09, 99,80, 99,75, 81,42, 80,64, 78,98, 78,86, 77,82, 77,40, 77,26, 76,26, 75,16, 75,09, 75,07, 74,95, 74,69, 74,30, 73,58, 73,17, 73,11, 72,71, 72,67, 72,65, 72,55, 72,36, 72,18, 69,65, 69,53, 68,54, 68,18, 68,08, 67,85, 67,79, 67,21, 54,95, 16,60.
Se añadió sodio metálico (95 mg) a amoniaco líquido (alrededor de 8 ml) bajo N_{2} a -78ºC y se agitó durante 2 min. Se añadió a la solución azul una solución del hexasacaridoglical anterior (70 g, 33,8 \mumol) en THF seco (2 ml). Después de 45 min a 78ºC, la reacción se extinguió con metanol absoluto (4 ml). La mayoría del amoníaco se retiró con una corriente de nitrógeno (el volumen final era alrededor de 1 ml) y la reacción se diluyó con metanol hasta alrededor de 10 ml. Se añadió a la solución Dowex 50-X8 (890 mg, lavada y secada) y se agitó durante 5 min. La solución se filtró y se enjuagó con metanol, finalmente con metanol amoniacal (5 ml) y el filtrado se concentró a vacío. El residuo y DMAP (2,4 mg) se pusieron bajo N_{2} y se suspendieron en DMF (1,0 ml), THF (1,0 ml) y TEA (1,0 ml), a continuación se trataron con Ac_{2}O (0,3 ml). Después de 20 h (análisis por TLC con EtOAc), la reacción se vertió en agua (40 ml) y se extrajo con EtOAc (40 ml x 2), se lavó con NaHCO_{3} diluido (30 ml), con agua (30 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. La cromatografía de desarrollo rápido con EtOAc al 80% en CH_{2}Cl_{2} daba 52,0 mg (93%) del producto como una espuma blanca.
mp 132-134ºC; [\alpha]^{23}_{D} = +4,7º (CHCl_{3}, c = 1,4); IR (película de CHCl_{3}) 1742, 1652, 1371, 1227, 1069 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz CDCl_{3}) \delta 6,68 (1H d, J = 6,8 Hz), 6,42 (1H d, J = 6,0 Hz), 5,58 (1H d, J = 3,2 Hz), 5,47 (1H d, J = 3,4 Hz), 5,40-5,37 (2H, m), 5,29 (1H dd, J = 10,9, 3,1 Hz), 5,25-5,15 (5H, m) 5,06 (1H dd, J = 11,2, 3,3 Hz), 5,02 (1H d, J = 3,6 Hz), 4,99-4,92 (2H, m), 4,84-4,81 (2H, m), 4,67 (1H d, J = 7,8 Hz), 4,56-4,51 (2H m), 4,45-4,38 4,29 (1H dd, J = 10,6, 3,4 Hz), 4,22-3,95 (13H, m), 3,90-3,77 (3H, m), 2,19-1,92 (51H, m), 1,15 (3H, d, J = 6,4 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz CDCl_{3}) \delta 8 172,40, 171,45, 170,84, 170,54, 170,52, 170,48, 170,45, 170,40, 170,39, 170,34, 170,23, 169,99, 169,82, 169,74, 169,36, 169,00, 145,43, 102,01, 101,17, 98,83, (2C), 98,45, 94,24, 75,65, 74,95, 73,98, 73,64, 73,49, 72,32, 71,84, 71,53, 71,44, 70,81, 70,74, 70,66, 70,12, 69,77, 68,97, 68,71, 68,67, 68,02, 67,97, 67,88, 67,60, 67,35, 64,43, 61,88, 61,81, 61,42, 61,29, 61,04, 56,18, 23,06, 21,02, 20,81, 20,76, 20,68, 20,64, 20,62, 20,58, 20,57, 20,55, 20,49, 20,43, 15,88.
El peracetilhexasacaridoglical anterior (52 mg) se dividió en dos porciones (22 mg y 300 mg). Una solución de hexasacaridoglical (22,0 mg, 13,4 \mumol) en CH_{2}Cl_{2} seco (2 ml) bajo N_{2} a 0ºC se trató a continuación con alcohol alílico. La mezcla se agitó durante 15 h a temperatura ambiente. El alcohol alílico en exceso se retiró a vacío. La otra partida (30 mg) se trató de forma similar. Los productos en bruto se combinaron y se cromatografiaron con EtOAc al 85% -CH_{2}Cl_{2} para dar 35,8 mg (66%) de producto menos polar y 15,7 mg (29%) de producto más polar. Se disolvieron en MeOH absoluto (14 ml) 33,2 mg (19 \mumol) del material menos polar bajo N_{2} y se trataron con solución de MeONa en metanol (165 \mul, 25% en peso). Después de 6 h, la reacción se neutralizó con Dowex 50-X8 (200 mg, lavada y secada), se filtró y se concentró para dar un rendimiento cuantitativo del compuesto del epígrafe 19b.
mp 204-206º (desc.); [\alpha]^{23}_{D} = +5,5º (MeOH, c = 0,67); IR (película de MeOH) 3356 (br), 2923, 1658, 1374, 1071 cm^{-1}; ^{1}H-NMR (400 MHz CD_{3}OD) \delta 5,99-5,93 (1H m), 5,24 (1H d, J = 3,8 Hz), 5,18-5,14 (1H m), 4,93 (1H d, J = 3,9 Hz), 4,56-4,54 (2H, m), 4,42-4,06 (10H, m), 3,99 (1H s), 3,91-3,47 (26H, m), 3,41-3,37 (1H m), 3,27 (1H t, J = 8,8 Hz), 2,01 (3H, s), 1,24 (3H, d, J = 6,5 Hz); ^{13}C-NMR (100 MHz CD_{3}OD, ref = \delta 49,05) \delta 174,55, 135,73, 117,57, 105,48, 105,42, 103,94, 103,26, 102,79, 101,08, 81,21, 80,67, 80,05, 79,20, 78,09, 76,79, 76,56, 76,48, 76,44, 76,41, 75,54, 74,86, 74,68, 73,57, 72,63, 72,50, 71,57, 71,16, 70,64, 70,41, 69,68, 68,16, 62,67, 62,64, 62,57, 61,96, 61,63, 53,11, 23,58, 16,78.
Para los propósitos de la síntesis preparativa de la estructura 1b, un precursor de ceramida se ligó al trisacárido ABC (Figura 11). La epoxidación de 7b, seguida por la reacción con el precursor de ceramida 17b (como su éter tributilestannílico) promovida por Zn(OTF)_{2} proporcionaba 20b. La acetilación y la retirada de PMB avanzaban uniformemente para proporcionar 21b que estaba listo para el acoplamiento con un donante de trisacárido DEF adecuado.
Cuando el trisacárido 15b se trataba con MeOTf en presencia del aceptor 21b, se obtenía una mezcla 4:1 de isómeros de hexasacárido. El producto principal 22b se obtuvo con un rendimiento de 50%.
La cadena lateral de la ceramida se elaboró mediante reducción de la funcionalidad azida usando catalizador de Lindlar bajo una atmósfera de H_{2} en presencia de anhídrido palmítico para proporcionar 18b directamente. La desililación fue seguida por desprotección de metal con disolución de la sulfonamida y los grupos bencilo y extinción con MeOH para retirar los grupos carbonato y acetato. La peracetilación de la mezcla en bruto proporcionaba 78% de rendimiento de hexasacárido peracetilado. La saponificación de este material usando NaOMe proporcionaba el producto natural 1b con un rendimiento de 96%. Las constantes de acoplamiento y los desplazamientos químicos de los protones anómeros de 1b se ajustaban a los datos presentados. Además, el producto se caracterizaba por masa exacta y ^{1}H y ^{13}C NMR.
Síntesis de 20b
El precursor de ceramida bencilado (475 mg, 1,14 mmol) se disolvió en 4 ml de PhH. Se añadió bis(tributilestaño)-éter (0,29 ml, 0,34 g, 0,57 mmol) y el recipiente de reacción (equipado con un separador de Dean-Stark) se calentó hasta reflujo. Después de 3 h la reacción se dejó enfriar y se concentró bajo un flujo de N_{2}. En un matraz separado, el glical 7b se disolvió en 1 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro y la solución resultante se enfrió hasta 0ºC y se añadió una solución de 3,3-dimetildioxirano (2,8 ml, 0,25 mmol, 0,09 M en acetona). Después de 45 min la solución se concentró bajo un flujo de N_{2} y a continuación bajo vacío. El éter de estaño se disolvió en 1 ml de THF anhidro y se añadió a través de una cánula a una mezcla de Zn(OTf)_{2} (170 mg, 0,468 mmol) en 1 ml de THF a -78ºC (lavado 1 x 0,5 ml de THF). La reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante 12 h y a continuación se extinguió con agua destilada. La fase acuosa se extrajo tres veces con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La cromatografía en columna de desarrollo rápido (hexano/EtOAc 3:1, 3 x 16 cm de gel de sílice) proporcionaba 265 mg (66%) del compuesto buscado 20b.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,43-7,15 (m, 45H), 7,03 (d, J = 8,6 Hz 2H), 6,79 (d, J = 8,6 Hz 2H), 5,76 (dt, J = 6,7, 15,4 Hz 1 H), 5,43 (dd, J = 8,5, 15,4 Hz 1 H), 5,07 (d, J = 3,5 Hz 1 H), 5,05 (d, J = 12,0 Hz 1 H), 4,90 (d, J = 12,9 Hz 2H), 4,83-4,77 (m, 3H), 4,69 (d, J = 12,0 Hz 1 H), 4,61 (d, J = 11,9 Hz 1 H), 4,54-4,45 (m, 3H), 4,42-4,25 (m, 7H), 4,18-4,05 (m, 6H), 4,01-3,91 (m, 4H), 3,83 (dd, J = 4,4, 10,6 Hz 1 H), 3,79 (s, 3H), 3,71-3,65 (m, 4H), 3,57-3,32 (m,7H), 3,20 (m, 1 H), 2,29 (bs, 1 H), 2,11 (bq, J = 6,7 Hz 2H), 1,42-1,29 (m, 22H), 0,91 (t, J = 6,6 Hz 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 158,8, 139,1, 139,0, 138,7, 138,6, 138,34, 138,29, 138,2, 138,1, 130,8, 128,7, 128,55, 128,50, 128,4, 128,33, 128,28, 128,26, 128,12, 128,06, 127,84, 127,76, 127,7, 127,64, 127,60, 127,5, 127,45, 127,36, 125,8, 113,5, 102,7, 100,6, 81,9, 81,5, 79,4, 77,4, 77,0, 76,7, 76,6, 7 6,4, 75,5, 74,9, 74,7, 74,4, 73,9, 73,3, 73,2, 73,1 1, 73,06, 72,3, 72,1, 70,0, 69,4, 68,7, 68,1, 67,9, 67,7, 64,2, 55,2, 32,4, 31,9, 29,70, 29,65, 29,5, 29,4, 29,2, 29,0, 22,7, 14,2; IR (película fina) 3447, 3062, 3029, 2923, 2853, 2099, 1612, 1586, 1514, 1496, 1454, 1364 cm^{-1}; [\alpha]^{23}_{D} +25,0 (c 0,70).
Síntesis de 21b
El trisacárido anterior (256 mg, 0,147 mmol) se disolvió en 2 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro. Se añadieron secuencialmente trietilamina (0,105 ml, 76 mg, 0,753 mmol), DMAP (2 mg, 0,02 mmol) y anhídrido acético (0,042 ml, 45 mg, 0,445 mmol). La reacción se agitó durante 1 h y a continuación se extinguió con NaHCO_{3} acuoso saturado. Los extractos se secaron con MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron. La purificación mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (hexano/EtOAc 4:1, 2 x 16 cm de gel de sílice) proporcionaba 235 mg (90%) del compuesto del epígrafe.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,42-7,17 (m, 45H), 7,03 (d, J = 8,6 Hz 2H), 6,81 (d, J = 8,6 Hz 2H), 5,75 (dt, J = 6,7, 15,4 Hz 1 H), 5,43 (dd, J = 8,6, 15,4 Hz 1 H), 5,07 (d, J = 3,4, 1 H), 4,99-4,90 (m, 4H), 4,85 (d, J = 11,3 Hz 2H), 4,77 (d, J = 11,9 Hz 1 H), 4,76 (d, J = 12,4 Hz 1 H), 4,70 (d, J = 12,0 Hz 1 H), 4,62 (d, J = 11,7 Hz 1 H), 4,57-4,52 (m, 3H), 4,49-4,34 (m, 7H), 4,30 (d, J = 11,8 Hz 1 H), 4,25 (d, J = 11,8 Hz 1 H), 4,14-4,06 (m, 7H), 4,01-3,95 (m, 2H), 3,91 (dd, J = 5,6, 8,6 Hz 1 H), 3,85 (dd, J = 4,3, 11,1, Hz 1 H), 3,80 (s, 3H), 3,74 (d, J = 9,8 Hz 1 H), 3,69 (dd, 7,7, 9,9 Hz 1 H), 3,63-3,51 (m, 5H), 3,43-3,34 (m, 3H), 3,22 (dd, J = 4,6, 8,2 Hz 1 H), 2,12 (dd, J = 6,8, 13,6, 2H), 1,87 (s, 3H), 1,43-1,30 (m, 22H), 0,93, (t, J = 6,6 Hz 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 169,3, 158,8, 139,1, 139,0, 138,69, 138,65, 138,6, 138,31, 138,26, 138,2, 138,1, 138,0, 130,8, 128,8, 128,6, 128,41, 128,35, 128,30, 128,28, 128,14, 128,0, 127,9, 127,8, 127,64, 127,60, 127,58, 127,51, 127,47, 127,38, 126,0, 113,5, 102,7, 100,8, 1006, 81,5, 79,9, 79,5, 79,4, 79,3, 77,4, 77,1, 76,8, 75,5, 75,3, 74,9, 74,5, 74,2, 73,9, 73,2, 73,1, 73,0, 72,4, 72,2, 72,1, 70,2, 69,4, 68,1, 68,0, 67,9, 67,5, 63,8, 55,2, 32,4, 32,0, 29,72, 29,67, 29,5, 29,4, 29,2, 29,1, 22,7, 20,9, 14,2; IR (película fina) 3028, 2923, 2852, 2098, 1751, 1611, 1513, 1496, 1453, 1365, 1232 cm^{-1}; [\alpha]^{23}_{D} +20,3 (c 0,45).
\newpage
El trisacárido anterior (230 mg, 0,129 mmol) se disolvió en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se añadió agua destilada (1 ml) y la mezcla se enfrió hasta 0ºC. Se añadió DDQ (35 mg, 0,15 mmol) y la reacción se agitó durante 1 h. La reacción se extinguió con NaHCO_{3} acuoso saturado. La fase acuosa se extrajo tres veces con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas se lavaron y se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. La cromatografía en columna de desarrollo rápido (hexano/EtOAc 4:1, 2 x 16 cm de sílice) proporcionaba 182 mg (85%) del compuesto buscado 21b.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,38-7,13 (m, 45H), 5,73 (dt, J = 6,7, 15,4 Hz 1H), 5,41 (dd, J = 8,6, 15,4 Hz 1H), 5,09 (d, J = 3,2 Hz 1 H), 4,98 (d, J = 12,5 Hz 1 H), 4,95 (dd, J = 8,0, 9,2 Hz 1 H), 4,87 (d, J = 11,2 Hz 1 H), 4,80 (d, J = 11,3 Hz 1 H), 4,77 (d, J = 10,9 Hz 1 H), 4,70 (d, J = 11,4 Hz 1 H), 4,65-4,50 (m, 6H), 4,45-4,42 (m, 3H), 4,38-4,34 (m, 3H), 4,28 (bs, 2H), 4,15 (d, J = 11,7 Hz 1 H), 4,11 (d, J =11,8 Hz 1 H), 4,08-4,01 (m, 3H), 3,98-3,94 (m, 3H), 3,88 (dd, J = 5,5, 8,5 Hz 1 H), 3,82 (dd, J = 4,3, 7,0 Hz 1 H), 3,77 (dd, J = 3,1, 10,1 Hz 1 H), 3,70 (d, J = 9,8 Hz 1 H), 3,64-3,51 (m, 5H), 3,46 (dd, J = 5,4, 9,4, 1 H), 3,39 (m, 1 H), 3,34-3,30 (m, 2H), 3,21 (dd, J = 4,7, 8,4 Hz 1 H), 2,09 (m, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,84 (d, J = 5,1 Hz 1 H), 1,41-1,27 (m, 22H), 0,90 (t, J = 6,5 Hz 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 169,3, 165,9, 139,3, 138,7, 138,6, 138,5, 138,3, 138,2, 138,1, 138,0, 128,5, 128,4, 128,32, 128,27, 128,25, 128,17, 128,00, 127,94, 127,91, 127,8, 127,75, 127,70, 127,67, 127,61, 127,55, 127,49, 127,45, 127,21, 125,9, 107,8, 102,6, 100,8, 99,4, 81,4, 80,6, 79,3, 77,5, 77,3, 77,0, 76,9, 76,7, 75,5, 75,3, 75,2, 74,3, 73,2, 73,1, 73,0, 72,9, 72,3, 72,1, 70,1, 70,0, 69,1, 68,1, 68,0, 67,8, 67,4, 63,8, 32,4, 31,9, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 29,2, 29,1, 22,7, 20,9, 14,1; IR (película fina) 3570, 3087, 3062, 3029, 2924, 2853 2099, 1950, 1873, 1752, 1496, 1453, 1366, 1231 cm^{-1}; [\alpha]^{23}_{D} +17,6 (c 1,40).
Síntesis de 22b
El tioglicósido 15b (188 mg, 0,151 mmol) y el aceptor 21b (125 mg, 0,0751 mmol) se secaron azeotrópicamente con benceno dos veces. La mezcla se disolvió a continuación en 2,6 ml de Et_{2}O anhidro y 1,3 ml de CH_{2}Cl_{2} y a esta solución se añadieron 500 mg de tamices moleculares de 4 \ring{A}. Esta mezcla se agitó durante 1 h y a continuación se enfrió hasta 0ºC y se añadió MeOTf (0,051 ml, 74 mg, 0,45 mmol). La reacción se agitó a 0ºC durante 9 h. Se añadió a continuación trietilamina (1 ml) y la reacción se filtró a través de un bloque de sílice y se lavó con Et_{2}O. El filtrado se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. La purificación mediante HPLC preparativa (hexano/EtOAc 85:15) proporcionaba 108 mg (50%) del compuesto buscado 22b. La relación b/a de la reacción era 4:1.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,75 (d, J = 7,2 Hz 2H), 7,46-7,05 (m, 63H), 5,75 (dt, J = 6,8, 15,2 Hz 1H), 5,43 (dd, J = 8,6, 15,5 Hz 1 H), 5,13 (m, 2H), 5,09 (d, 3,6 Hz 1 H), 5,05 (d, J = 11,6 Hz 1 H), 5,00 (d, J = 11,5 Hz 1 H), 4,94-4,86 (m, 5H), 4,83-4,65 (m, 14H), 4,59 (d, 11,7 Hz 2H), 4,53-4,43 (m, 6H), 4,39-4,31 (m, 4H), 4,23 (d, J = 11,9 Hz 1 H), 4,18 (d, J = 11,9 Hz 1 H), 4,15-4,08 (m, 2H), 4,05-3,57 (m, 31 H), 3,54 (d, J = 9,1 Hz 1 H), 3,49-3,45 (m, 2H), 3,38 (m, 1 H), 3,31-3,23 (m, 3H), 2,92-2,89 (m, 2H), 2,75 (bt, 6,0 H, H), 2,12 (bq, J = 6,9 Hz 2H), 1,85 (s, 3H), 1,20-1,09 (m, 42H), 0,92 (t, J = 6,6 Hz 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 169,1, 165,9, 155,5, 140,9, 139,2, 139,0, 138,8, 138,64, 138,59, 138,47, 138,43, 138,3, 138,2, 138,10, 138,07, 138,0, 132,1, 129,1, 128,69, 128,65, 128,56, 128,43, 128,40, 128,36, 128,35, 128,26, 128,17, 128,12, 128,08, 127,97, 127,77, 127,66, 127,64, 127,60, 127,54, 127,49, 127,45, 127,41, 127,3, 126,0, 103,0, 102,7, 100,8, 99,7, 99,2, 98,0, 81,2, 80,6, 79,5, 79,2, 79,0, 78,3, 77,7, 76,8, 76,5, 75,5, 75,3, 75,1, 75,03, 74,97, 74,91, 74,87, 74,0, 73,2, 73,10, 73,07, 72,98, 72,93, 72,6, 72,3, 72,1, 72,0, 71,32, 71,25, 70,2, 69,4, 69,32, 69,25, 68,1, 67,9, 67,5, 68,3, 62,1, 62,0, 56,1, 32,4, 31,9, 29,71, 29,68, 29,66, 29,48, 29,38, 29,2, 29,1, 22,7, 20,7, 18,13, 18,11, 18,01, 17,98, 16,9, 14,2, 11,9; IR (película fina) 3344, 3030, 2924, 2864, 2101, 1789, 1754, 1496, 1453, 1366, 1232 cm^{-1}.
Síntesis de 18b
El hexasacárido 22b (66 mg, 0,023 mmol) se disolvió en 1 ml de EtOAc. Se añadió catalizador de Lindlar (66 mg) seguido por la adición de anhídrido palmítico (23 mg, 0,046 mmol). El sistema se purgó bajo vacío y a continuación se puso bajo una atmósfera de H_{2}. Después de 24 h la reacción se filtró a través de un bloque de gel de sílice, se lavó con EtOAc y se concentró. La purificación mediante HPLC preparativa (hexano/EtOAc 4:1) proporcionaba 64 mg (90%) del producto deseado 18b.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,72 (d, J = 7,2 Hz 2H), 7,42-7,02 (m, 63H), 5,65 (d, J = 9,1 Hz 1 H), 5,62 (dt, J = 6,6, 15,3 Hz 1 H), 5,31 (dd, J = 8,6, 15,3 Hz 1 H), 5,10 (m, 2H), 5,05 (d, J = 3,6 Hz 1 H), 5,02 (d, J =11,5 Hz 1 H), 4,96 (d, J = 11,4 Hz 1 H), 4,90-4,62 (m, 13H), 4,57-4,38 (m, 8H), 4,32-4,26 (m, 3H), 4,21-4,07 (m, 9H), 4,01-3,41 (m, 31 H), 3,30 (m, 1 H), 3,23 (m, 3H), 2,20 (m, 4H), 1,82 (s, 3H), 1,52 (bm, 2H), 1,32-1,19 (m, 53H), 1,15-1,08 (m, 42H), 0,88 (t, J = 6,8 Hz 6H); IR (película fina) 3531, 3346, 3063, 3030, 2924, 2854, 1790, 1748, 1674, 1496, 1454, 1365, 1236 cm^{-1}; [\alpha]^{23}_{D} -17,9 (c 0,65).
Síntesis de 1b
El hexasacárido anterior (20 mg, 0,0065 mmol) se disolvió en 0,5 ml de THF. Se añadió una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (1,0 M en THF, 0,050 ml, 0,050 mmol) y la reacción se agitó durante 2 h. La solución se filtró a través de un bloque de sílice, se lavó con EtOAc y se concentró. El residuo se disolvió en 1 ml de MeOH anhidro y se añadió NaOMe (10 mg, 0,019 mmol). La reacción se agitó durante 3h, se neutralizó con 40 mg de resina Dowex-50, se filtró y se concentró. La purificación mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (1,5 x 4 cm de gel de sílice 10-40 u, CH_{2}Cl_{2}/MeOH 95:5) proporcionaba 16,5 mg (94%) del compuesto deseado.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,78 (d, J = 7,6 Hz 2H), 7,46 (d, J = 7,4 Hz 2H), 7,41-6,97 (m, 61 H), 6,02 (d, J = 9,1 Hz 1 H), 5,76 (bs, 1 H), 5,67 (dt, J = 6,6, 15,3 Hz 1 H), 5,37-5,30 (m, 2H), 5,19 (d, J = 2,6 Hz 1 H), 4,96 (d, J = 11,3 Hz 1 H), 4,93 (d, J = 3,4 Hz 1 H), 4,90-4,83 (m, 3H), 4,78-4,66 (m, 7H), 4,56 (d, J =11,1 Hz 1 H), 4,53 (d, J =10, 2 Hz 1H), 4,47-4,32 (m, 5H), 4,28-4,06 (m, 14H), 4,01-3,13 (m, 36H), 2,73 (bt, 1 H), 2,61 (bs, 1 H), 2,54 (bs, 1 H), (2,05 (m, 4H), 1,50 (m, 2H), 1,38-1,23 (m, 46H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz 6H), 0,78 (d, 6,3 Hz 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 173,4, 142,4, 139,5, 139,0, 138,7, 138,5, 138,33, 138,26, 138,14, 138,09, 137,9, 137,2, 137,1, 131,6, 129,0, 128,8, 128,54, 128,47, 128,37, 128,32, 128,27, 128,22, 128,17, 128,14, 128,05, 127,99, 127,79, 127,73, 127,68, 127,63, 127,59, 127,49, 127,46, 127,37, 127,32, 126,98, 126,58, 104,1, 102,83, 102,76, 100,3, 100,2, 82,1, 81,5, 81,2, 79,6, 79,2, 79,0, 78,0, 77,3, 77,0, 76,7, 75,6, 75,3, 75,1, 75,0, 74,8, 74,6, 73,5, 73,4, 73,2, 73,0, 72,7, 72,6, 71,9, 70,1, 69,6, 68,5, 68,2, 68,0, 67,5, 62,4, 61,9, 54,8, 52,3, 36,9, 32,3, 31,9, 29,71, 29,67, 29,54, 29,50, 29,43, 29,37, 29,28, 29,20, 25,7, 22,7, 16,7, 14,1; IR (película fina) 3424, 3062, 3023, 2923, 2852, 1641, 1530, 1496, 1453, 1362, 1325 cm^{-1}; [\alpha]^{23}_{D} -3,2 (c 0,83).
Un matraz se equipó con un condensador de hielo seco y se cargó con 4 ml de NH_{3}. Se añadió sodio (18 mg, 0,78 moles) y a la solución azul resultante se añadieron 29 mg del hexasacárido anterior (0,010 mmol). La reacción se agitó a -78ºC durante 45 min. Se extinguió mediante la adición de MeOH (3 ml). Se inyectó nitrógeno sobre la solución para evaporar el NH_{3}. La reacción se neutralizó con 170 mg de resina Dowex-50, se filtró y se concentró. El residuo resultante se disolvió en 1 ml de THF/DMF 4:1. Se añadió trietilamina (0,5 ml) seguido por la adición de DMAP (3 mg) y anhídrido acético (0,200 ml). Después de 2 h la reacción se concentró a vacío. La purificación mediante columna de desarrollo rápido (1,5 x 5 cm de sílice 10-40 m, EtOAc/hexano 9:1) proporcionaba 18 mg (78%) del peracetato. Una muestra de este hexasacárido (15 mg, 0,0065 mmol) se disolvió en 0,5 ml de MeOH anhidro y se añadió una solución de NaOMe (30% en MeOH, 0,010 ml, 0,05 mmol). La solución se agitó durante 3h, se neutralizó con 9 mg de resina Dowex-50, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (1,5 x 4 cm de sílice en fase inversa C-18, MeOH) para proporcionar 9,6 mg del producto natural 1. Los datos espectrales están de acuerdo con los presentados por Hakomori y otros.
Resultados Biológicos
El hexasacárido MBR1 se ha preparado de dos formas, la forma "B" natural y la forma "A" no natural, según se muestra posteriormente.
La estructura natural ("\beta") es:
Fuca\rightarrowGalB1\rightarrow3GalNAcB1\rightarrow3Gal\alpha1\rightarrow4GlB1\rightarrow4GcB1\rightarrowCer
La estructura no natural "\alpha" es:
Fuc\alpha1\rightarrow2GalB1\rightarrow3GalNAc\alpha1\rightarrow3Gal\alpha1\rightarrow4GalB1\rightarrow1Cer
Ambas se han conectado a ceramida para facilitar la prueba para la reactividad inmunológica con anticuerpo monoclonal (mAb) MBR1.
Mediante cromatografía en capa fina (TLC) las dos preparaciones migran como bandas simples similares. La TLC inmunitaria (véase Ritter, G. y otros, Cancer Res. 50, 1403-10 (1990)) demuestra que ambas forman reaccionan con el anticuerpo monoclonal MBr1 específicamente pero que la forma \beta reacciona 10 veces más fuertemente (se observa una tinción comparable con 1/10 la cantidad de antígeno). El alto nivel de reactividad de la estructura \beta con mAb MBr1 se confirmó usando ensayos de inhibición por citometría de flujo. La reactividad del mAb MBr1 con líneas celulares de cáncer de mama tales como MCF-7 se inhibía 98% mediante 8 \mug/ml de la preparación con conexión \beta pero solo se inhibía 6% mediante 8 mg de la preparación con conexión \alpha. El gangliósido GD3 (control negativo) no mostraba inhibición en absoluto.

Claims (22)

1. Un procedimiento para sintetizar un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es H y Bn es bencilo, que comprende:
(a)
(i)
hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
80 
\vskip1.000000\baselineskip
con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido;
(ii)
separar el epóxido formado en la etapa (a) (i) bajo condiciones adecuadas con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, para formar un fluoroalcohol; y
(iii)
alquilar el fluoroalcohol formado en la etapa (a) (ii) bajo condiciones adecuadas con una base no nucleófilo y un haluro orgánico que tiene la fórmula C_{6}H_{5}CH_{2}X en la que X es Br, Cl, I o F, para formar un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
81 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Bn es bencilo y PMB es p-metoxibencilo;
\newpage
(b) tratar el compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
82
en la que TIPS es triisopropilsililo,
con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido; y
(c) acoplar el epóxido formado en la etapa (b) con un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
83
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
84
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(d)
(i)
alquilar el compuesto formado en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas con una base no nucleófila y un haluro orgánico que tiene la fórmula C_{6}H_{5}CH_{2}X en la que X es Br, Cl, I o F; y
(ii)
desililar el compuesto formado en la etapa (d) (i) bajo condiciones adecuadas con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo;
(iii)
tratar el compuesto formado en la etapa (d) (ii) bajo condiciones adecuadas con un alcóxido metálico para formar un disacárido desprotegido; y
(iv)
alquilar el disacárido formado en la etapa (d) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un disacárido desprotegido selectivamente que tiene la estructura:
85
en la que Bn es bencilo;
(e)
(i)
acoplar el disacárido desprotegido selectivamente formado en la etapa (d) (iv) con el compuesto formado en la etapa (a) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido protegido; y
(ii)
desproteger el trisacárido protegido formado en la etapa (e) (i) bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
86 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es H y Bn es bencilo.
2. Un procedimiento para sintetizar una trisacaridoceramida que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
87
en la que Bn es bencilo, que comprende:
(a) sintetizar un trisacárido que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
88
en la que R es PMB (p-metoxibencilo) y Bn es bencilo;
(b)
(i)
hacer reaccionar el trisacárido formado en la etapa (a) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido de trisacárido; y
\newpage
(ii)
hacer reaccionar el epóxido de trisacárido formado en la etapa (b) (i) con un compuesto que tiene la estructura:
89
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar una trisacaridoceramida protegida que tiene la estructura:
90
en la que Bn es bencilo y PMB es p-metoxibencilo;
(c)
(i)
acilar la ceramida formada en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas; y
(ii)
desproteger selectivamente el compuesto formado en la etapa (c) (i) bajo condiciones adecuadas para formar la trisacaridoceramida.
3. Un procedimiento para sintetizar un mercaptotrisacárido que tiene la estructura:
91
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo,
que comprende:
(a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
92
en la que TIPS es triisopropilsililo,
con un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que TIPS es triisopropilsililo,
bajo condiciones adecuadas para formar un disacárido que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
94
en la que TIPS es triisopropilsililo;
(b) acoplar el disacárido formado en la etapa (a) con un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
95 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un trisacárido que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
96 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
\newpage
(c) yodosulfonamidar el trisacárido formado en la etapa (b) bajo condiciones adecuadas para formar una yodosulfonamida que tiene la estructura:
97
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo; y
(d) hacer reaccionar la yodosulfonamida formada en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas con un tiolato para formar el mercaptotrisacárido.
4. Un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
98
que comprende:
(a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
99
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
100
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto que tiene la estructura:
101
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(b)
(i)
hacer reaccionar el compuesto formado en la etapa (a) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un epóxido de hexasacárido; y
(ii)
hacer reaccionar el epóxido de hexasacárido con un éter estannílico que tiene la estructura:
102
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacaridoalcohol;
(c) acilar el hexasacaridoalcohol formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un acetato de hexasacárido que tiene la estructura:
103
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(d) acilar reductivamente el acetato de hexasacárido formado en la etapa (c) bajo condiciones adecuadas en presencia de anhídrido palmítico para formar una hexasacaridoceramida;
(e) desililar la hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar una hexasacaridoceramida parcialmente desprotegida;
(f)
(i)
reducir la hexasacaridoceramida parcialmente desprotegida bajo condiciones adecuadas para formar un acetato de hexasacaridoceramida desprotegido; y
(ii)
acilar el acetato de hexasacaridoceramida desprotegido bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacaridoceramida; y
(g) saponificar el peracetato de hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar la hexasacaridoceramida.
5. Un procedimiento para sintetizar una hexasacaridoceramida que tiene la estructura:
104
que comprende:
(a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
105
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
106
en la que Bn es bencilo,
bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido que tiene la estructura:
107
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo; y
(b)
(i)
reducir el hexasacárido formado en la etapa (a) bajo condiciones adecuadas en presencia de anhídrido palmítico para formar una palmitoilamida;
(ii)
desililar la palmitoilamida con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido parcialmente desprotegido;
(iii)
desproteger el hexasacárido formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido desprotegido;
(iv)
acilar el hexasacárido formado en la etapa (b) (iii) bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacaridoceramida; y
(v)
saponificar el peracetato de hexasacaridoceramida bajo condiciones adecuadas para formar la hexasacaridoceramida.
6. Un procedimiento para sintetizar una alilhexasacárido que tiene la estructura:
108
que comprende:
(a) acoplar un compuesto que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
109 
\newpage
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo, con un compuesto que tiene la estructura:
110
en la que Bn es bencilo,
en la que R es H, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido que tiene la estructura:
111
en la que Bn es bencilo y TIPS es triisopropilsililo;
(b)
(i)
desililar el compuesto formado en la etapa (a) con R_{4}NF, en donde cada R es independientemente igual o diferente y es un grupo alquilo o aralquilo de cadena lineal o ramificada o arilo, bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido parcialmente desprotegido;
(ii)
desproteger el hexasacárido formado en la etapa (b) (i) bajo condiciones adecuadas para formar un hexasacárido desprotegido; y
(iii)
peracilar el compuesto formado en la etapa (b) (ii) bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de hexasacárido que tiene la estructura:
112
(c)
(i)
hacer reaccionar el peracetato de hexasacárido formado en la etapa (b) (ii) con un agente epoxidante bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de epóxido de hexasacárido;
(ii)
tratar el peracetato de epóxido de hexasacárido formado en la etapa (c) (i) con alcohol alílico bajo condiciones adecuadas para formar un peracetato de alilhexasacárido; y
(iii)
saponificar el peracetato de alilhexasacárido bajo condiciones adecuadas para formar el alilhexasacárido.
7. Un compuesto que tiene la estructura:
113
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
8. Un compuesto que tiene la estructura:
114
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
9. Un compuesto que tiene la estructura:
115
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico.
10. Uso de un compuesto que tiene la estructura:
116
en la que n es un número entero entre aproximadamente 0 y aproximadamente 9, conjugado a un portador proteínico, eficaz para inducir anticuerpos, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto se ha tratado mediante cirugía, tiene enfermedad no sometida a resección limitada.
13. Uso del compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto se ha tratado mediante cirugía, tiene enfermedad no sometida a resección limitada.
16. Uso del compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en la fabricación de un medicamento para inducir anticuerpos en un sujeto humano que son inmunorreactivos con células de tumor de mama humano.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que los anticuerpos inducidos son anticuerpos MBr1.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el sujeto está en remisión clínica o, cuando el sujeto se ha tratado mediante cirugía, tiene enfermedad no sometida a resección limitada.
19. Uso del compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
20. Uso del compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
21. Uso del compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en la fabricación de un medicamento para prevenir la recaída del cáncer de mama en un sujeto humano.
22. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, 8 o 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.
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