DE69635730T2 - Synthese des durch den monoklonalen antikörper mbr1 definierten brusttumorassoziierten antigens und seine verwendung - Google Patents

Synthese des durch den monoklonalen antikörper mbr1 definierten brusttumorassoziierten antigens und seine verwendung Download PDF

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Description

  • Diese Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der am 15. März 1994 angemeldeten U.S. Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 08/213,053.
  • Diese Erfindung entstand mit Unterstützung der Regierung unter den Zuwendungen GM-15240-02, GM-16291-01 und A1-16943 von den nationalen Gesundheitsinstituten. Die U.S.-Regierung hat folglich bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Anmeldung werden Zitierungen von verschiedenen Veröffentlichungen in Klammern in dem Text bereitgestellt.
  • Die Funktion von Kohlenhydraten als Strukturmaterialien und als Energiespeichereinheiten in biologischen Systemen ist gut bekannt. Im Gegensatz dazu wurde die Rolle von Kohlenhydraten als signalgebende Moleküle in dem Kontext von biologischen Vorgängen erst vor kurzem erkannt. (M.L. Phillips, E. Nudelman, F.C.A. Gaeta, M. Perez, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Science, 1990, 250, 1130; M.J. Polley, M.L. Phillips, E. Wagner, E. Nudelman, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 6224; T. Taki, Y. Hirabayashi, H. Ishikawa, S. Kon, Y. Tanaka, M. Matsumoto, J. Biol. Chem., 1986, 261, 3075; Y. Hirabayashi, A. Hyogo, T. Nakao, K. Tsuchiya, Y. Suzuki, M. Matsumoto, K. Kon, S. Ando, ibid., 1990, 265, 8144; O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R. U. Lemieux, Carbohydr. Res., 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemieux, ibid., 1988, 174, 211) Die Aufklärung des Ausmaßes der Beteiligung von Kohlenhydraten beim Vermitteln von zellulärer Interaktion ist ein wichtiges Untersuchungsgebiet in der gegenwärtigen biomedizinischen Forschung. Die Kohlenhydratmoleküle, die detaillierte strukturelle Informationen enthalten, neigen dazu, anstatt als freie Einheiten als Glycokonjugate (d. h. Glycoproteine und Glycolipide) zu existieren. In Anbetracht der oftmals mit dem Isolieren der Konjugate in homogener Form verbundenen Komplexitäten und den Schwierigkeiten beim Gewinnen von intakten Kohlenhydraten aus diesen natürlich vorkommenden Konjugaten ist die Anwendungsmöglichkeit von synthetischen Ansätzen bzw. Annäherungen offensichtlich. (Für kürzlich erschienene Übersichten zur Glycolysierung siehe: Paulsen, H., Angew. Chemie Int. Ausgabe Engl., 1982, 21, 155; Schmidt, R.R., Angew. Chemie Int. Ausgabe. Engl., 1986, 25, 212; Schmidt, R.R., Comprehensive Organic Synthesis, Band 6, Kapitel 1(2), Pergamon Press, Oxford, 1991; Schmidt, R.R., Carbohydrates, Synthetic Methods und Applications in Medicinal Chemistry, Teil I, Kapitel 4, VCH Publishers, Weinheim, New York, 1992. Für die Verwendung von Glycalen als Glycosyl-Donoren bei der Glycosid-Synthese siehe Lemieux, R.U., Can. J. Chem., 1964, 42, 1417; Lemieux, R.U., Faser-Reid, B., Can. J. Chem., 1965, 43, 1460; Lemieux, R.U., Morgan, A.R., Can. J. Chem., 1965, 43, 2190; Thiem, J., Karl, H., Schwentner, J., Synthesis, 1978, 696; Thiem. J. Ossowski, P., Carbohydr. Chem., 1984, 3, 287; Thiem, J., Prahst, A., Wendt, T. Liebigs Ann. Chem., 1986, 1044; Thiem, J. in Trends in Synthetic Carbohydrate Chemistry, Horton, D., Hawkins, L.D., McGarvvey, G.L., Herausgeber, ACS Symposium Serien #386, Amerikanische Chemische Gesellschaft, Washington, D.C., 1989, Kapitel 8.)
  • Die Kohlenhydrat-Domänen der sowohl in Glycoproteinen als auch Glycolipiden enthaltenen Blutgruppen-Substanzen sind verteilt auf Erythrozyten, Epithelzellen und verschiedene Sekrete. Früher konzentrierte sich der Augenmerk auf diese Systeme auf ihre zentrale Rolle bei der Bestimmung von Blutgruppen-Spezifitäten. (R.R. Race und R. Sanger, Blood Groups in Man, 6te Ausgabe, Blackwell, Oxford, 1975). Es ist jedoch bekannt, dass derartige Determinanten stark im Zusammenhang stehen mit Zelladhäsion und Bindungsphänomenen. (Siehe beispielsweise M.L. Phillips, E. Nudelman, F.C.A. Gaeta, M. Perez, A.K. Singhal, S. Hakomori, J.C. Paulson, Science, 1990, 250, 1130.) Darüber hinaus werden mit den Blutgruppen-Substanzen in konjugierter Form verwandte Ensembles als Marker für das Auftreten von verschiedenen Tumoren angetroffen. (K.O. Lloyd, Am. J. Clinical Path., 1987, 87, 129; K.O. Lloyd, Cancer Biol., 1991, 2, 421) Auf Kohlenhydrat basierende Tumor-Antigen-Faktoren könnten Anwendung finden auf der Ebene der Diagnose, als Quellen bei der Arzneimittelzufuhr bzw. -verteilung, oder idealer Weise bei der Immuntherapie. (Toyokuni, T., Dean, B., Cai, S., Boivin, D., Hakomori, S., und Singhal, A.K., J. Am. Chem Soc., 1994, 116, 395; Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K., Jackson, V., Hamada, H., Paardoll, D., Mulligan, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 3539; Tao, M-H., Levy, R., Nature, 1993, 362, 755; Boon, T., Int. J. Cancer, 1993, 54, 177; Livingston, P.O., Curr. Opin. Immunol., 1992, 4, 624; Hakomori, S., Annu. Rev. Immunol., 1984, 2, 103; K. Shigeta, et al., J. Biol. Chem, 1987, 262, 1358)
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Strategien und Protokolle zur Oligosaccharid-Synthese zur Verfügung. Es ist die Aufgabe, derartige Konstruktionen zu vereinfachen, so dass relativ komplexe Domänen mit großer Stereospezifität assembliert werden können. Größere Fortschritte bei der Synthese von Glycokonjugaten erfordert das Erreichen eines hohen Maßes an Konvergenz und Befreiung von den Schwierigkeiten, die mit der Manipulation von blockierenden Gruppen verbunden sind. Eine weitere Anforderung ist die Zufuhr der Kohlenhydrat-Determinante unter geeigneter Berücksichtigung der Konjugation mit Trägerproteinen oder Lipiden (Bernstein, M.A., und Hall, L.D., Carbohydr. Res., 1980, 78, Cl; Lemieux, R.U., Chem. Soc. Rev., 1978, 7, 423; R.U. Lemieux, et al., J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 4076) Dies ist eine kritische Bedingung, wenn die synthetisch erhaltenen Kohlenhydrate in Träger inkorporiert werden sollen, die für eine biologische Anwendung geeignet sind.
  • Antigene, die selektiv oder idealer Weise spezifisch für Krebszellen sind, könnten sich bei der Unterstützung aktiver Immunität als hilfreich erweisen. (Hakomori, S., Cancer Res., 1985, 45, 2405-2414; Feizi, T., Cancer Surveys, 1985, 4, 245-269) Neue Kohlenhydratmuster sind oft bei transformierten Zellen entweder als Zelloberflächen-Glycoproteine oder als membran-verankerte Glycolipide vorhanden. Gut ausgewählte synthetische Glycokonjugate, die die Antikörperproduktion stimulieren, könnten grundsätzlich eine aktive Immunität verleihen gegen Krebserkrankungen, bei denen äquivalente Strukturtypen auf ihren Zelloberflächen vorhanden sind. (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K.O., in Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New Yorker Akademie der Wissenschaften S. 50-58) Chancen für eine erfolgreiche Therapie erhöhen sich mit zunehmender Beschränkung des Antigens auf die Zielzelle. Von Hakomori und Mitarbeitern ist ein Glycosphingolipid aus der Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 isoliert worden und durch den monoklonalen Antikörper MBr1 immunologisch charakterisiert worden. (Bremer, E. G., et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 14773-14777; Menard, S., et al., Cancer Res., 1983, 43, 1295-1300) Die neue Glycosphingolipid-Struktur 1b (8a) wurde für dieses Brusttumor-assoziiertes Antigen auf der Grundlage von Methylierung und enzymatischen Abbauprotokollen vorgeschlagen. Ein mit der vorgeschlagenen Struktur vereinbares aber nicht definitives 1H NMR-Spektrum wurde aus Spurenmengen an isoliertem Antigen erhalten. Während einzelne Abschnitte der vorgeschlagenen Struktur nicht unbekannt waren, wurde die Gesamtstruktur zuerst auf Basis von Studien über die Brustkrebslinie beschrieben. Es muss festgehalten werden, dass MBr1 auch an normales menschliches Brustdrüsengewebe und an Eierstock-Krebszelllinien bindet. Daher ist 1b als eine Gesamteinheit wahrscheinlich nicht auf die transformierten Brustzellen beschränkt. Alternativ dazu sind kleinere Unterabschnitte von 1b geeignet zur Antikörpererkennung und -bindung. (Es wurde die Synthese des DEF-Fragments von 1b berichtet, und es wurde gezeigt, das es an MBr1 bindet: Lay, L.; Nicotra, F.; Panza, L.; Russo, G. Helv. Chim. Acta, 1994, 77, 509-514.)
  • Die durch hier beschriebene Verfahren hergestellte Verbindungen sind Antigene, die verwendbar sind bei adjuvanten Therapien, als ein Impfstoff, der in der Lage ist, MBr1-Antikörper zu induzieren, die immunreaktiv sind mit menschlichen Brusttumorzellen. Derartige adjuvante Therapien haben das Potential, die Quote des Wiederauftretens von Brustkrebs zu reduzieren, und die Überlebensquoten nach Operationen zu erhöhen. Klinische Studien an 122 Patienten, die chirurgisch gegen AJCC Stufe III Melanom behandelt worden waren, die mit Impfstoffen behandelt wurden, die aus dem Melanom-Differenzierungs-Antigen GM2 hergestellt worden waren (ein weiteres Tumor-Antigen, das ähnlich wie MBr1 ein Zelloberflächen-Kohlenhydrat ist), zeigte bei Patienten, die vor der Immunisierung den Antikörper nicht aufwiesen, eine stark signifikante Zunahme des krankheitsfreien Zeitraums (P.O. Livingston, et al., J. Clin Oncol., 12, 1036 (1994)).
  • Die vorliegende Erfindung stellt sowohl ein Verfahren zum Synthetisieren von 1b in Mengen als auch künstliche Protein-Konjugate des Oligosaccharids zur Verfügung, die stärker immunogen sein könnten als das kleinere Glycolipid. Das Antigen enthält eine neue Anordnung an Merkmalen einschließlich der α-Bindung zwischen der B- und der C-Einheit, sowie den β-verknüpften Ring D gal-NAc-Rest. (Für die Synthese einer verwandten Struktur (SSEA-3), der der Fucose-Rest fehlt, siehe: Nunomura, S.; Ogawa, T., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 5681-5684.) Die vorliegende Erfindung stellt (i) eine komplette Synthese von 1b zur Verfügung, (ii) einen rigorosen Nachweis dafür, dass das Hakomori-Antigen tatsächlich 1b entspricht, und (iii) die Synthese einer biokonjugierba ren Version von 1b. Die Kürze der Synthese reflektiert die Effizienz von Glycal-Assemblierungsverfahren, die gesteigert wird durch ein leistungsstarkes Verfahren zur Sulfonamid-Glycosylierung (siehe z. B. die Transformation von 14b-15b, 10).
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt Glycal-Assemblierung, die zu Neoglycoproteinen führt.
  • 2 dient zum Vergleich und zeigt die Synthese von 4a. Reagenzien: a) TBDPSCL, Imidazol/DMF 84%; b) Carbonyldiimidazol, Kat. Imidazol, THF (65%) c) 5a, di-tert-Butylpyridin, AgClO4, SnCl2, Ether (51 %): PhSO2NH2, 1(sym-coll)2ClO4 (94%).
  • 3 dient zum Vergleich und zeigt die Synthese von 8a. Reagenzien: a) 9a, AgBF4, 4A Molekülsiebe, THF (75%); b) i. TBAF, THF; ii. Na/NH3; iii Ac2O, Pyr. c) i. 3,3-Dimethioxiran; Allylalkohol, ZnCl2 (72%); ii. NaOMe, MeOH (quant.).
  • 4 zeigt eine Strategie für die Festphase von Oligosacchariden unter Verwenden des Glycal-Assemblierungsverfahrens.
  • 5 zeigt die Anwendung des Festkörper-Trägerverfahrens für die Assemblierung von 1,2-Verzweigungsmustern von komplexen Kohlenhydraten.
  • 6 zeigt die Synthese eines Tetrasaccharids mit H-Typ 2 Blutgruppen-Spezifität. Reagenzien: (a) 1. 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2; 2. 8, ZnCl2, THF; (b) 10, Sn(OTf)2, di-tert-Butylpyridin, THF; (c) TBAF, AcOH, THF; (d) TIPSCl, Imidazol, DMF; (e) I(coll)2ClO4, PhSO2NH2, CH2Cl2; (f) 15, AgBF4, 4A Molekülsiebe, THF; (g) 1. TBAF, AcOH, THF; 2. Na/NH3; 3. Ac2O, Pyridin.
  • 7a und 7b dienen zum Vergleich und zeigen die Synthese von einem Leb-Hexasaccharid in biokonjugierbarer Form. Reagenzien: (a) 1. 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2; 2. 19, ZnCl2, THF; (b) 10, Sn(OTf)2 di-tert-Butylpyridin, THF; (c) TBAF, AcOH, THF; (d) TIPSCl, Imidazol, DMF; (e) I(coll)2ClO4, PhSO2NH2, CH2Cl2; (f) 24, AgBF4, 4A Molekülsiebe, THF; (g) 1. TBAF, AcOH, THF; 2. Na/NH3; 3. Ac2O, Pyridin; (h) 1. 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2; 2. Allylalkohol, ZnCl2; 3. NaOMe, MeOH.
  • 8a und 8b zeigen die Struktur des MBr1-Antigens und einen Reaktionsweg zu einer Trisaccharid-Zwischenverbindung. Reagenzien: a. n-Bu2SnO, PMBCl, TBABr, PhH, 70%; b. NaH, BnBr, DMF, 95%; c. (i) 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2; (ii) TBAF, THF; (iii) NaH, BnBr, DMF, 40% (drei Schritte); d. NaH, BnBr, DMF, 80%; e. (i) TBAF, THF; (ii) NaOMe, MeOH, 93% (zwei Schritte); f. (n-Bu3Sn)2O, BnBr, TBABr, PhH, 90%; g. SnCl2, AgClO4, 2,6-di-Butylpyridin, 4 Å Molekülsiebe, Et2O, 40% ά (4,5:1 ά:B); h. DDQ, CH2Cl2, H2O 84%.
  • 9 zeigt einen Reaktionsweg zu einer Trisaccharid-Zwischenverbindung.
    • Reagenzien: a. (i) 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2; (ii) 10b, ZnCl2, THF, 87%; b. SnCl2, AgClO4, Et2O, 47%; c. I(coll)2ClO4, PhSO2NH2, 4 Å Molekülsiebe, 47%.
  • 10(a) zeigt einen Reaktionsweg zu dem Hexasaccharid-MBr1-Antigen.
    • Reagenzien: a. EtSH, LiHMDS, DMF, 75%. B. 8b (0,5 Äquiv.), MeOTf, 4 Å Molekülsiebe, 70-85% B, (10:1 B:ά); c. (i) 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2 (ii) 17b (5 Äquiv.), Zn(OTf)2, 20%; d. Ac2O, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 95%; e. Lindlar-Kat., H2-Palmitinanhydrid, EtOAc, 90%; f. (i) TBAF, THF; (ii) NaOMe, MeOH, 94%; g. (i) Na, NH3, THF; (ii) Ac2O, Et3N, DMAP, CH2Cl2, 80% h. NaOMe, MeOH, quant.
  • 10(b) zeigt einen Reaktionsweg zu dem Allylglycosid.
    • Reagenzien: a. TBAF, THF, 94%; b. (i) Na, NH3, THF; (ii) Ac2O, Et3N, DMAP, THF, DMF, 85%; c. (i) 3,3-Dimethyldioxiran, CH2Cl2, (ii) Allylalkohol, 65% (+29% ά-Mannoisomer); d. NaOMe, MeOH, quant.
  • 11a und 11b zeigen einen Reaktionsweg zu Zwischenverbindungen zum Herstellen des Hexasaccharid-Antigens MBr1.
  • 12 zeigt einen Reaktionsweg zu dem Hexasaccharid-Antigen MBr1 über einen 4 + 2 Syntheseweg.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00070001
    zur Verfügung, wobei R H und Bn Benzyl ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Trisaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00070002
    zur Verfügung, wobei Bn Benzyl ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Synthetisieren eines Mercaptotrisaccharids mit der Struktur:
    Figure 00080001
    zur Verfügung, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00080002
    zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00080003
    zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Allylhexasaccharids mit der Struktur:
    Figure 00090001
    zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharids mit der Struktur:
    Figure 00090002
    zur Verfügung, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00090003
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Die vorliegende Verbindung stellt auch eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00100001
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00100002
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Um das Verständnis für die Erfindung zu unterstützen, wird Bezug genommen auf relevantes verwandtes Referenzmaterial. Zuerst wird Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00110001
    wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) einer Aminosäure mit einer ω-Aminogruppe oder einer ω-(C=O)-Gruppe, (ii) einem Aminosäurerest eines Peptids, wobei der Rest eine ω-Aminogruppe oder eine ω-(C=O)-Gruppe besitzt, und (iii) einem Aminosäurerest eines Protein, wobei der Rest eine ω-Aminogruppe oder eine ω-(C=O)-Gruppe besitzt; wobei R1 H, OH, NH2 oder NHR4 ist, wobei R4 SO2Ph, eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe ist, oder eine Arylgruppe; wobei M die Struktur aufweist:
    Figure 00110002
    wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 18 ist, und wenn n größer ist als 1, jedes M unabhängig voneinander gleich oder verschieden ist; wobei p entweder 0 oder 1 ist; wobei R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander gleich oder verschieden und H oder OH sind, mit der Maßgabe, dass die geminalen R2 und R3 nicht beide OH sind, und dass die geminalen R5 und R6 nicht beide OH sind; wobei jede Wellenlinie zwischen einem Kohlenstoffatom und einem Sauerstoffatom eine R- oder S-Konfiguration bei dem Kohlenstoffatom bedeutet; wobei X und Y unabhängig voneinander gleich oder verschieden und H2 oder O sind; und wobei k eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 ist, mit der Maßgabe, dass wenn A eine Aminosäure mit einer ω-Aminogruppe oder einer ω-(C=O)-Gruppe ist, k gleich 1 ist.
  • Beispielsweise wird Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei A Lysin oder ein Lysinrest ist, es wird Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei A Glutaminsäure oder eine Glutaminsäurerest ist, und es wird Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei A Asparaginsäure oder ein Asparaginsäurerest ist.
  • Es wird auch Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei A ein Aminosäurerest eines globularen Proteins ist. In einer Ausführungsform wird Bezug genommen auf die Verbindung, wobei das globulare Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rinderserumalbumin und menschlichem Serumalbumin.
  • Beispielsweise wird Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei k 1 ist, und es Bezug genommen auf die oben offenbarte Verbindung, wobei n und p beide gleich 0 sind.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00120001
    wobei R1 H, OH, NH2 oder NHR4 ist, wobei R4 SO2Ph, eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe, oder eine Arylgruppe ist; wobei M die Struktur:
    Figure 00130001
    aufweist; wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 18 ist, und wenn n größer ist als 1, jedes M unabhängig voneinander gleich oder verschieden ist; wobei R2, R3, R5 und R6 unabhängig voneinander gleich oder verschieden und H oder OH sind, mit der Maßgabe, dass die geminalen R2 und R3 nicht beide OH sind, und dass die geminalen R5 und R6 nicht beide OH sind; wobei jede Wellenlinie zwischen einem Kohlenstoffatom und einem Sauerstoffatom eine R- oder S-Konfiguration bei dem Kohlenstoffatom bedeutet; und wobei R7 eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00130002
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist; wobei R H oder eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe ist; wobei R1 H, OH, NH2 oder NHR4 ist, wobei R4 SO2Ph, eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe, oder eine Arylgruppe ist; und wobei R2 eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist. Beispielsweise die Verbindung, wobei n gleich 1 ist.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00140001
    wobei R H, eine lineare oder verzweigte Kettenacylgruppe ist; wobei R1 H, OH, NH2 oder NHR4 ist, wobei R4 SO2Ph, eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe, oder eine Arylgruppe ist; und wobei R2 eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00140002
    wobei R H oder eine lineare oder verzweigte Kettenacylgruppe ist; wobei R1 H, OH, NH2 oder NHR4 ist, wobei R4 SO2Ph, eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl- oder eine Acylgruppe, oder eine Arylgruppe ist; und wobei R2 eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist; und wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist. Beispielsweise die Verbindung, wobei n 1 ist.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00150001
    wobei R H oder eine lineare oder verzweigte Kettenacylgruppe ist.
  • Bezug genommen wird auch auf ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00160001
    wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist, welches die Schritte umfasst von (a) Synthetisieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00160002
    wobei R eine Trialkylsilyl-, Aryldialkylsilyl-, Alkyldiarylsilyl- oder Triarylsilyl-Gruppe ist; (b) Reagieren der Verbindung von Schritt (a) mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00160003
    unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00170001
    zu bilden, wobei R eine Trialkylsilyl-, Aryldialkylsilyl-, Alkyldiarylsilyl- oder Triarylsilyl-Gruppe ist; (c) Reagieren der in Schritt (b) gebildeten Verbindung mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00170002
    unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00170003
    zu bilden, wobei R eine Trialkylsilyl-, Aryldialkylsilyl-, Alkyldiarylsilyl- oder Triarylsilyl-Gruppe ist; (d) Entschützen und wieder Schützen der in Schritt (c) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00180001
    zu bilden, wobei R TIPS ist; (e) Iodsulfonamidieren der in Schritt (d) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00180002
    zu bilden; (f) Reagieren der in Schritt (e) gebildeten Verbindung mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00190001
    unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00190002
    zu bilden; wobei R H ist; (g) Entschützen und Peracetylieren der in Schritt (f) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00190003
    zu bilden; (h) Epoxidieren der in Schritt (g) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen, um ein Epoxid davon zu bilden, und reagieren des Epoxids unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00200001
    zu bilden; wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist; und wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist; und (i) Behandeln der in Schritt (h) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00200002
    zu bilden, wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Allylgruppe ist. In dem obigen Verfahren können die geeigneten Bedingungen, die für die verschiedenen Reaktionen und Behandlungen notwendig sind, in dem nachfolgenden Abschnitt Experimentelle Details gefunden werden. Jedoch können die angegebenen spezifischen Reagenzien und Lösungsmittel wie auch die spezifischen Bedingungen, die für Reaktion oder Behandlung notwendig sind, gegen andere geeignete Reaktanten, Lösungsmittel und Bedingungen substituiert werden, die Fachleuten gut bekannt sind.
  • Die Allylverbindung kann konjugiert sein an ein Peptid oder Protein via Amin oder Carboxylsäure-Seitenkette. Bei der Benutzung der Erfindung wird ein Biokonjugat entsprechend dem Protokoll von Bernstein und Hall (Carbohydr. Res. 1980, 78, C1) hergestellt. Die Allylgruppe wird ozonolysiert, um entweder einen Aldehyd oder eine Carbonsäure zu bilden, der/die mit einem terminalen Amin kondensiert wird, um ein Imin bzw. Amid zu bilden. Das Imin wird mit Natriumborhydrid zu dem Amin reduziert. Alternativ dazu wird der Aldehyd unter Verwenden von im Stand der Technik bekannten Verfahren reduzierend aminiert, um ein Amin zu bilden, das mit einer terminalen Seitenketten-Carbonsäure umgesetzt wird, um ein Amidkonjugat zu bilden.
  • Es wird auch Bezug genommen auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge der oben offenbarten Verbindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
  • Pharmazeutisch akzeptable Träger sind Fachleuten gut bekannt und schließen ein 0,01-0,1 M Phosphatpuffer, und vorzugsweise 0,05 M Phosphatpuffer, oder 0,8 % Salzlösung. Darüber hinaus können derartige pharmazeutisch akzeptable Träger wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele von nicht-wässrigen Lösungen sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie beispielsweise Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise Ethyloleat. Wässrige Träger schließen ein Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel schließen ein Natriumchloridlösung, Ringers Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, lactierte Ringers oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel schließen ein fluide und nahrhafte Nachfüll- bzw. Regeneratorlösungen (orig.: "replenishers"), elektrolytische Nachfüll- bzw. Regeneratorlösungen (orig.: "replenishers"), wie beispielsweise jene auf Basis von Ringers Dextrose. Konservierungsmittel und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein, wie beispielsweise keimtötende Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und inerte Gase.
  • Es wird auch Bezug genommen auf ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts, das von einer Krankheit befallen ist, die durch Helicobacter pylori verursacht wird, das das Verab reichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer hier oben offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, um so das mit der Krankheit befallene Subjekt zu behandeln.
  • Beispielsweise ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts, das befallen ist von Magen- oder Duodenal-Geschwür, und ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts, das befallen ist von Magen-Adenokarzinom.
  • Zusätzlich wird Bezug genommen auf ein Verfahren zum Inhibieren der Adhäsion von Helicobacter pylori an Magenepithel in einem Subjekt, das Verabreichen einer Menge der hier oben offenbarten Verbindung umfasst, die wirksam ist, die Adhäsion von Helicobacter pylori an Magenepithel in dem Subjekt zu verhindern.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00220001
    zur Verfügung, wobei R H und Bn Benzyl ist, das umfasst: (a)(i) Reagieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00220002
    mit einem epoxidierenden Mittel unter geeigneten Bedingungen, um ein Epoxid zu bilden; (ii) Spalten des in Schritt (a)(i) gebildeten Epoxids unter geeigneten Bedingungen mit R4NF, wobei jedes R unabhängig voneinander gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist, um einen Fluoralkohol zu bilden; und (iii) Alkylieren des in Schritte (a)(ii) gebildeten Fluoralkohols unter geeigneten Bedingungen mit einer nicht-nukleophilen Base und einem organischen Halogenid mit der Formel C6H5CH2X, wobei X Br, Cl, I oder F ist, um eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00230001
    zu bilden.
    (b) Behandeln der Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00230002
    wobei TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einem epoxidierenden Mittel unter geeigneten Bedingungen, um ein Epoxid zu bilden; und (c) Kuppeln des in Schritt (b) gebildeten Epoxids mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00230003
    wobei Bn Benzyl ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00230004
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist
    (d)(i) Alkylieren der in Schritt (c) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen mit einer nicht-nukleophilen Base und einem organischen Halogenid mit der Formel C6H5CH2X, wobei X Br, Cl, I oder F ist; und (ii) Desilylieren der in Schritt (d)(i) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen mit R4NF, wobei jedes R unabhängig voneinander gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist; (iii) Behandeln der in Schritt (d)(ii) gebildeten Verbindung mit einem Metallalkoxid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Disaccharid zu bilden; und (iv) Alkylieren des in Schritt (d)(iii) gebildeten Disaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein selektiv entschütztes Disaccharid mit der Struktur:
    Figure 00240001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl ist;
    (e)(i) Kuppeln des in Schritt (d)(iv) gebildeten selektiv entschützten Disaccharids mit der in Schritt (a)(iii) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, ein geschütztes Trisaccharid zu bilden; und (ii) Entschützen des in Schritt (e)(i) gebildeten geschützten Trisaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharid mit der Struktur:
    Figure 00240002
    zu bilden, wobei R H und Bn Benzyl ist. In Schritt (a) kann Reaktion (i) unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln durchgeführt werden, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid. Ein bevorzugtes Mittel ist 3,3-Dimethyldioxiran. Es können nicht-nukleophile inerte Lösungsmittel verwendet werden, wie beispielsweise Dichlormethan. Die Reaktion (a)(ii) kann unter Verwendung von organischen Ammoniumfluorid-Salzen durchgeführt werden, die Tetrabutylammoniumfluorid einschließen, in einer Reihe von Lösungsmitteln, die etherische Lösungsmittel einschließt, bevorzugt in Tetrahydrofuran. Schritt (iii) kann unter Verwendung einer nicht-nukleophilen Base, wie beispielsweise Natriumhydrid in einem nicht-nukleophilen Lösungsmittel, wie beispielsweise DMF, durchgeführt werden. Schritt (b) kann unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln durchgeführt werden, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan. Kupplungsschritt (c) kann unter Verwendung eines Metall-Katalysators, wie beispielsweise Zinkchlorid, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF, durchgeführt werden. Schritt (d)(i) wird unter Verwendung einer nicht-nukleophilen Base, wie beispielsweise Natriumhydrid, in einem nicht-nukleophilen Lösungsmittel, wie beispielsweise DMF, durchgeführt. In Schritt (d) (ii) wird die Desilylierung unter Verwendung eines organischen Ammoniumfluorid-Salzes, einschließlich Tetrabutylammoniumfluorid, in einer Reihe von Lösungsmitteln, einschließlich etherischer Lösungsmittel, bevorzugt in Tetrahydrofuran, bewirkt. Der Carbonatester wird unter Verwendung eines Metallalkoxids, wie beispielsweise Natriummethoxid, in einem alkoholischen Medium, wie beispielsweise Methanol abgespalten. Schritt (d)(iv) wird selektiv unter Verwendung eines Metalloxids, wie beispielsweise (n-Bu3Sn)2O, in Anwesenheit eines organischen Ammoniumbromids, wie beispielsweise tetra-n-Butylammoniumbromid, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Benzol, durchgeführt. Schritt (e) ist eine Kopplung, die in Anwesenheit eines Metallhalogenid-Salzes, wie beispielsweise SnCl2, in Anwesenheit von Silberperchlorat und 2,6-di-t-Butylpyridin, in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ether, das Molekülsiebe enthält, durchgeführt wird. Oxidative Entfernung von PMB wird mit einem oxidierenden Mittel, wie beispielsweise DDQ, in einem inerten Lösungsmittelsystem, das bevorzugt heterogen sein kann, beispielsweise Verwendung von Wasser/Dichlormethan, durchgeführt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Trisaccharidceramids mit der Struktur
    Figure 00260001
    zur Verfügung, wobei Bn Benzyl ist,
    welches umfasst: (a) Synthetisieren eines Trisaccharids mit der Struktur
    Figure 00260002
    wobei R PMB (p-Methoxybenzyl) und Bn Benzyl ist; (b)(i) Reagieren des in Schritt (a) gebildeten Trisaccharids mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharidepoxid zu bilden; und
    (ii) Reagieren des in Schritt (b)(i) gebildeten Trisaccharidepoxids mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00260003
    wobei Bn Benzyl ist
    unter Bedingungen, die geeignet sind, ein geschütztes Trisaccharidceramid mit der Struktur:
    Figure 00270001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und PMB p-Methoxybenzyl ist;
    (c)(i) Acylieren des in Schritt (b)(ii) gebildeten Ceramids unter geeigneten Bedingungen; und (ii) selektives Entschützen der in Schritt (c)(i) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, das Trisaccharidceramid zu bilden.
  • In Schritt (a) kann das Trisaccharid wie hier beschrieben synthetisiert werden. Schritt (b)(i) wird unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan, durchgeführt. Kupplungsschritt (b)(ii) kann unter Verwendung eines Tributyl-Zinnethers der Ceramid-Vorstufe und eines Metall-Katalysators, wie beispielsweise Zinkchlorid, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF, ausgeführt werden. In Schritt (c)(i) wird Acylierung unter Verwendung eines linearen oder verzweigtkettigen Alkylanhydrids, vorzugsweise Essigsäureanhydrid oder -halogenid, in Gegenwart von Triethylamin und DMAP in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Dichlormethan, durchgeführt. Die PMB-Schutzgruppe wird oxidativ entfernt, vorzugsweise wie oben beschrieben ist. Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Synthetisieren eines Mercaptotrisaccharids mit der Struktur:
    Figure 00270002
    zur Verfügung, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, welches umfasst:
    • (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
      Figure 00280001
      wobei TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
      Figure 00280002
      wobei TIPS Triisopropylsilyl ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Disaccharid mit der Struktur:
      Figure 00280003
      zu bilden, wobei TIPS Triisopropylsilyl ist
    • (b) Kuppeln des in Schritt (a) gebildeten Disaccharids mit einer Verbindung mit der Struktur:
      Figure 00280004
      wobei Bn Benzyl ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharid mit der Struktur:
      Figure 00290001
      zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist;
    • (c) Iodsulfonamidieren des in Schritt (b) gebildeten Trisaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Iodsulfonamid mit der Struktur:
      Figure 00290002
      zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist;
    • und (d) Reagieren des in Schritt (c) gebildeten Iodsulfonamids mit einem Thiolat unter Bedingungen, die geeignet sind, das Mercaptotrisaccharid zu bilden.
  • Schritt (a) wird ausgeführt durch Reagieren der ersten Verbindung von Schritt (a), die wie hier beschrieben oder auf andere Weise erhalten werden kann, mit einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan, gefolgt von Kuppeln mit dem Diol-Monosaccharid von Schritt (a), was unter Verwendung eines Metall-Katalysators, wie beispielsweise Zinkchlorid, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF, ausgeführt werden kann. Kuppeln mit dem Fluorzucker wird in Schritt (b) ausgeführt in Anwesenheit eines Metallhalogenid-Salzes, wie beispielsweise SnCl2, in Anwesenheit von Silberperchlorat und 2,6-di-t-Butylpyridin, in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ether, das Molekülsiebe enthält. Schritt (c) wird durchgeführt unter Verwen dung von I(coll)2-Perchlorat und PhSO2NH2 in Anwesenheit von Molekülsieben. Schritt (d) wird ausgeführt unter Verwendung von Alkylthiol und einer Base, wie beispielsweise LiHMDS, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise DMF.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00300001
    zur Verfügung, welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00300002
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00300003
    wobei Bn Benzyl ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00310001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist
    (b)(i) Reagieren der in Schritt (a) gebildeten Verbindung mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidepoxid zu bilden; und (ii) Reagieren des Hexasaccharidepoxids mit einem Stannylether mit der Struktur:
    Figure 00310002
    wobei Bn Benzyl ist
    unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Hexasaccharidalkohol zu bilden;
    (c) Acylieren des in Schritt (b)(ii) gebildeten Hexasaccharidalkohols unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidacetat mit der Struktur:
    Figure 00310003
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist;
    (d) reduzierendes Acylieren des in Schritt (c) gebildeten Hexasaccharidacetats in der Anwesenheit von Palmitinanhydrid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramid zu bilden; (e) Desilylieren und teilweises Entschützen des Hexasaccharidceramids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharid ceramid zu bilden; (f)(i) Reduzieren des partiell entschützten Hexasaccharidceramids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharidceramidacetat zu bilden; und (ii) Acylieren des entschützten Hexasaccharidceramidacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramidperacetat zu bilden; und (g) Verseifen des Hexasaccharidceramidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Hexasaccharidceramid zu bilden.
  • Schritt (a) wird unter Verwendung von Triflat-Estern, wie beispielsweise Methyltriflat, in Anwesenheit von Molekülsieben in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt. Schritt (b)(i) wird ausgeführt unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan. Schritt (b)(ii) wird durchgeführt unter Verwendung eines Stannylether der Ceramid-Vorstufe, vorzugsweise der tri-n-Butylstannylether, in Anwesenheit eines Metallsalzes, wie beispielsweise Zn-Triflat, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF. Schritt (c) wird ausgeführt unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Anwesenheit einer Base, wie beispielsweise Triethylamin und DMAP. Schritt (d) wird ausgeführt unter Verwendung eines Edelmetall-Katalysators, wie beispielsweise Lindlar-Katalysator, und Wasserstoffgas in Anwesenheit von Palmitinanhydrid in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat. Desilylierungsschritt (e) wird bewirkt unter Verwendung von organischen Ammoniumfluorid-Salzen, wie beispielsweise tetra-n-Butlyammoniumfluorid in THF. Der Carbonatester wird unter Verwendung eines Metallalkoxids, wie beispielsweise NaOMe, in einem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, abgespalten. In Schritt (f)(i) wird Reduktion durchgeführt unter Verwendung eines Metalls, wie beispielsweise Lithium oder Natrium, in flüssigem Ammoniak und einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF. Schritt (f)(ii) wird ausgeführt unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Anwesenheit einer Base, wie beispielsweise Et3N und DMAP in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dichlormethan. Das Peracetat wird unter Verwendung eines Metallalkoxids, wie beispielsweise Natrium-Methoxid in einem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, verseift.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00330001
    zur Verfügung, welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00330002
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00330003
    wobei Bn Benzyl ist,
    unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharid mit der Struktur:
    Figure 00340001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist; und (b)(i) Reduzieren des in Schritt (a) gebildeten Hexasaccharids in Anwesenheit von Palmitinanhydrid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Palmitoylamid zu bilden; (ii) Desilylieren des Palmitoylamids mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder eine Arylgruppe ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (iii) Entschützen des in Schritt (b)(ii) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (iv) Acylieren des in Schritt (b)(iii) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramidperacetat zu bilden; und (v) Verseifen des Hexasaccharidceramidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Hexasaccharidceramid zu bilden.
  • Schritt (a) wird durchgeführt unter Verwendung von Triflat-Estern, wie beispielsweise Methyltriflat, in Anwesenheit von Molekülsieben in einem inerten Lösungsmittel. Schritt (b) wird ausgeführt unter Verwendung eines Edelmetall-Katalysators, wie beispielsweise Lindlar-Katalysator, und Wasserstoffgas in Anwesenheit von Palmitinanhydrid in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat. Schritt (b)(ii) wird durchgeführt unter Verwendung von organischen Ammoniumfluorid-Salzen, wie beispielsweise tetra-n-Butylammoniumfluorid, in THF. In Schritt (b)(iii) wird Reduktion durchgeführt unter Verwendung eines Metalls, wie beispielsweise Lithium und Natrium, in flüssigem Ammoniak und einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF. Schritt (b)(iv) wird ausgeführt unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Anwesenheit einer Base, wie beispielsweise Et3N und DMAP, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dichlormethan. In Schritt (v) wird das Peracetatcarbonat unter Verwendung eines Metall alkoxids, wie beispielsweise Natriummethoxid, in einem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, verseift.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Allylhexasaccharids mit der Struktur:
    Figure 00350001
    zur Verfügung, welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00350002
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00350003
    wobei Bn Benzyl ist,
    wobei R H ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharid mit der Struktur:
    Figure 00360001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist
    (b)(i) Desilylieren der in Schritt (a) gebildeten Verbindung mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder eine Arylgruppe ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (ii) Entschützen des in Schritt (b)(i) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharid zu bilden; und (iii) Peracylieren der in Schritt (b)(ii) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidperacetat mit der Struktur:
    Figure 00360002
    zu bilden
    (c)(i) Reagieren des in Schritt (b)(iii) gebildeten Hexasaccharidperacetats mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidepoxidperacetat zu bilden; (ii) Behandeln des in Schritt (c)(i) gebildeten Hexasaccharidepoxidperacetats mit Allylalkohol unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Allylhexasaccharidperacetat zu bilden; und (iii) Verseifen des Allylhexasaccharidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Allylhexasaccharid zu bilden.
  • Schritt (a) wird durchgeführt unter Verwendung von Triflat-Estern, wie beispielsweise Methyltriflat, in Anwesenheit von Molekülsieben in einem inerten Lösungsmittel. Schritt (b)(i) wird ausgeführt unter Verwendung von organischen Ammoniumfluorid-Salzen, wie beispielsweise tetra-n-Butylammoniumfluorid, in THF. Schritt (b)(ii) wird durchgeführt unter Verwendung eines Metallalkoxids, wie beispielsweise Natriummethoxid, in einem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, gefolgt von Reduktion, die durchgeführt wird unter Verwendung eines Metalls, wie beispielsweise Lithium oder vorzugsweise Natrium, in flüssigem Ammoniak und einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise THF. Schritt (b)(iii) wird ausgeführt unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Anwesenheit einer Base, wie beispielsweise Et3N und DMAP in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dichlormethan. Schritt (c)(i) wird ausgeführt unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan. Schritt (c)(ii) wird ausgeführt unter Verwendung von Allylalkohol in einem inerten Lösungsmittel. In Schritt (c)(iii) wird das Peracetatcarbonat unter Verwendung eines Metallalkoxids, wie beispielsweise Natriummethoxid, in einem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, verseift.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharids mit der Struktur:
    Figure 00370001
    zur Verfügung, welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur
    Figure 00380001
    mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00380002
    unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00380003
    zu bilden.
    (b)(i) Acylieren der in Schritt (a) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen; und (ii) Reagieren der in Schritt (b)(i) gebildeten Verbindung mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Epoxid mit der Struktur:
    Figure 00380004
    zu bilden.
    (c)(i) Behandeln des Epoxids mit R4NF, wobei jedes R unabhängig voneinander gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist, unter geeigneten Bedingungen; und (ii) Alkylieren der in Schritt (c)(i) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00390001
    zu bilden, wobei R H oder Acyl ist; (d) Kuppeln der in Schritt (c)(ii) gebildeten Verbindung mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00390002
    unter Bedingungen, die geeignet sind, das Hexasaccharid zu bilden.
  • Schritt (a) wird durchgeführt unter Verwendung eines Metall-Katalysators, wie beispielsweise Silbertetrafluorborat in einem inerten Lösungsmittel. Schritt (b)(i) wird ausgeführt unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Anwesenheit einer Base, wie beispielsweise Et3N und DMAP, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dichlormethan. Schritt (b)(ii) wird ausgeführt unter Verwendung einer Vielfalt an epoxidierenden Mitteln, einschließlich Peressigsäure, m-Chlorbenzoesäure, Trifluoressigsäure und Wasserstoffperoxid, wobei 3,3-Dimethyldioxiran bevorzugt wird, in nicht-nukleophilen inerten Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dichlormethan. Schritt (c)(i) wird mit organischen Ammoniumfluroidsalzen bewirkt, wie beispielsweise tetra-n-Butylammoniumfluroid, in THF. Schritt (c)(ii) wird durchgeführt unter Verwendung einer nicht-nukleophilen Base, wie beispielsweise Natriumhydrid, in einem inerten Lösungsmittel. Schritt (d) wird durch geführt unter Verwendung eines Metallsalz-Katalysators, wie beispielsweise Zinndichlorid, in Anwesenheit von Silberperchlorat in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise di-t-Butylpyridin. Weitere Transformationen stellen entschützte Produkte oder Konjugate mit Proteinen oder anderen Trägern zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00400001
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Das gezeigte Allylglycosid wird unter Verwendung der hier gelehrten Glycal-Kupplungsverfahren hergestellt und kann an Proteinträger unter Verwendung von hier beschriebenen allgemeinen Reaktionen oder durch Standardverfahren nach dem Stand der Technik gebunden werden. Beispielsweise kann das Allylglycosid hergestellt werden durch Kuppeln der hier offenbarten Verbindung 9b mit einem geeignet geschützten 8b, gefolgt von Kuppeln mit 12b, dann Kuppeln mit Allylalkohol und einer geeigneten Entschützungssequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00410001
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Das gezeigte Allylglycosid wird unter Verwendung der hier gelehrten Glycal-Kupplungsverfahren, Allylierung und einer Entschützungssequenz (vgl. 12) hergestellt, und kann an Proteinträger unter Verwendung von hier beschriebenen allgemeinen Reaktionen oder durch Standardverfahren nach dem Stand der Technik gebunden werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00410002
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  • Die gezeigten Allylglycoside werden unter Verwendung der hier gelehrten Glycal-Kupplungsverfahren hergestellt und können an Proteinträger unter Verwendung von hier beschriebenen allgemeinen Reaktionen oder durch Standardverfahren nach dem Stand der Technik gebunden werden.
  • Es liegt innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, die Kombination von Schutzgruppen für die verschiedenen Zucker-Hydroxylgruppen gemäß dem normalen Fachwissen zu variieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00420001
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger, die wirksam ist, Antikörper zu induzieren, bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der das Subjekt in klinischer Remission ist, oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung der obigen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00430001
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger, bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der das Subjekt in klinischer Remission ist, oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung der obigen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine Verwendung einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00430002
    zur Verfügung, wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger, bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung zur Verfügung, bei der das Subjekt in klinischer Remission ist, oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung der obigen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt zur Verfügung.
  • Experimentelle Details
  • Allgemeine Arbeitsweisen
  • Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Luft- und Feuchtigkeits-empfindlichen Reaktionen in einer Flammen-getrockneten Apparatur unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Luft-empfindliche Flüssigkeiten und Lösungen wurden durch eine Spritze oder Kanüle übertragen. Wo immer möglich, wurden Reaktionen mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) kontrolliert bzw. überwacht. Grobe Lösungsmittel-Entfernung wurde im Vakuum unter Wasserstrahlvakuum mit einem Buchi-Rotationsverdampfer durchgeführt, und Lösungsmittelspuren wurden mit einer Hochvakuumpumpe bei 0,1 – 0,5 mm Hg entfernt. Schmelzpunkte (mp) wurden nicht korrigiert und in Weichglas-Kapillarröhrchen unter Verwendung einer digitalen Schmelzpunktapparatur der Elektrothermalserie IA9100 durchgeführt.
  • Infrarot-Spektren (IR) wurden unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Instruments der Serie 1600 von Perkin-Elmer aufgezeichnet. Sofern nicht anders angegeben, wurden Proben als unverdünnte Filme auf NaCl-Platten hergestellt. Absorptionsbanden werden als Wellenzahlen (cm–1) angegeben.
  • Es werden nur relevante zuordenbare Banden angegeben.
  • Protonen-Kernspinnresonanz- (1H NMR) -Spektren wurden unter Verwendung eines Bruker AMX-400 Spektrometers bei 400 MHz bestimmt. Chemische Verschiebungen werden als Teilchen pro Million (ppm) tieffeld von Tetramethylsilan (TMS; δ=0 ppm) angegeben, unter Verwendung von restlichem CHCl3 als feste Referenz (orig.: "lock reference") (δ=7,25 ppm). Multiplizitäten werden auf die übliche Weise abgekürzt: s=Singulett; d=Dublett; t=Triplett; q=Quartett; m=Multiplett; br=breit.
  • Kohlenstoff-Kernspinnresonanz- (13C NMR) -Spektren wurden unter Verwendung eines Bruker AMX-400 Spektrometers bei 100 MHz mit zusammengesetzter Puls-Entkopplung durchgeführt. Beispiele wurden wie bei 1H-NMR-Spektren hergestellt, und chemische Verschiebungen werden in Bezug auf TMS (0 ppm) angegeben; restliches CHCl3 wurde als eine interne Referenz (δ=77,0 ppm) verwendet.
  • Alle hoch auflösenden Massenspektrometrie-(HRMS)-Analysen wurden durch Elektronenstoß-Ionisierung (EI) mit einem JEOL JMS-DX 303HF-Massenspektrometer mit Perfluorkerosin (PFK) als einem internen Standard bestimmt. Niedrig auflösende Massenspektren (MS) wurden entweder durch Elektronenstoß-Ionisierung (EI) oder chemischer Ionisierung (CI) unter Verwendung des angegebenen Trägergases (Ammoniak oder Methan) mit einem Delsi-Nermag R-10-10 Massenspektrometer bestimmt. Für Gaschromatographie/Massenspektren (GCMS) wurde eine geschmolzene DB-5 Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm Dicke) mit Helium als dem Trägergas verwendet. Typische Bedingungen verwendeten ein Temperaturprogramm von 60-250°C bei 40°C/min.
  • Dünnschicht-Chromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Glasplatten (Silicagel 60, 0,25 mm Dicke) durchgeführt. Sichtbarmachung erfolgte durch Beleuchtung mit einer 254 nm UV-Lampe oder durch Eintauchen in Anisaldehyd-Färbemittel (9,2 mL p-Anisaldehyd in 3,5 mL Essigsäure, 12,5 mL konzentrierter Schwefelsäure und 338 mL 95%igem Ethanol (EtOH)) und Erwärmung zur Farbbildung.
  • Silicagel-Blitzchromatographie wurde entsprechend dem Standardprotokoll ausgeführt.
  • Soweit nicht anders angegeben, besaßen alle Lösungsmittel und Reagenzien handelsübliche Qualität und wurden wie erhalten verwendet, außer wie nachfolgend angegeben, bei denen Lösungsmittel unter Argon unter Verwendung der in Klammern angegebenen Trocknungsverfahren destilliert wurden: CH2Cl2 (CaH2); Benzol (CaH2); THF (Na/Ketyl); Et2O (Na/Ketyl); Diisopropylamin (CaH2).
  • Abkürzungen
    • OTf
      Triflat
      TLC
      Dünnschicht-Chromatographie
      EtOAc
      Ethylacetat
      TIPS
      Triisopropylsilyl
      PMB
      p-Methoxybenzyl
      Bn
      Benzyl
      Ac
      Acetat
      hex
      Hexan
      THF
      Tetrahydrofuran
      coll
      Collidin
      LiHMDS
      Lithiumhexamethyldisilazid
      DMF
      N,N-Dimethylformamid
      DMAP
      2-Dimethylaminopyridin
      DDQ
      2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon
      TBAF
      tetra-n-Butylammoniumfluroid
      M.S.
      Molekülsiebe
      r.t.
      Raumtemperatur
      r.b.
      Rundkolben
  • VERGLEICHSBEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung von Polymer-gebundenem Glucal 18:
  • Polymer-gebundenes Galactal 7 (500 mg; S.J. Danishefsky, et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 8331) wurde in ein 100 mL Polymergefäß gegeben und im Vakuum getrocknet. Nach Abkühlen auf 0°C unter N2 wurde trockenes CH2Cl2 (20 mL) und frisch hergestellte Murray-Lösung (30 mL; R.W. Murray und R. Jeyaraman, J. Org. Chem. 1985, 2847) zugegeben. Nach Rühren bei 0°C für ~90 Minuten wurden lösliche Anteile unter Verwendung von N2-Druck filtriert. Der Oxidationsvorgang wurde wiederholt. Das resultierende Epoxid 7 wurde in einer Vakuumleitung für ~3 Stunden zum Trocknen aufbewahrt. Ein Lösung von Glucal 19 (1,0 g in 8 mL trockenem THF) wurde zugegeben und die Mischung wurde auf –23°C (Trockeneis-CCl4) gekühlt. Eine Lösung aus ZnCl2 in THF (0,8 mL 1,0 M) wurde zugegeben. Man ließ die Mischung langsam auf r.t. erwärmen (während ~2 Stunden) und rührte sie dann bei r.t. über Nacht. Das Polymer-gebundene Glucal 18 wurde mit 3 × 20 mL THF gewaschen und in einer Vakuumleitung getrocknet.
  • Herstellung von Polymer-gebundenem Tetrasaccharid 20:
  • Polymer-gebundenes Glucal 18 und Sn(OTf)2 (0,80 g, 1,92 mmol) wurden kombiniert und im Vakuum getrocknet. Nach Abkühlen auf 0°C unter N2 wurde eine Lösung aus Fucosyl-Donor 10 (1,8 g, 4,1 mmol) in 20 mL trockenem THF mit di-t-Butylpyridin (1,7 mL, 7,57 mmol) zugegeben. Man ließ die Mischung langsam auf r.t. erwärmen und rührte sie dann bei r.t. über Nacht. Das Polymer wurde mit 2 × 20 mL trockenem THF, 2 × 20 mL trockenem Dioxan, 20 mL DMSO und 2 × 20 mL THF gewaschen. Das resultierende Polymer-gebundene Tetrasaccharid 20 wurde in einer Vakuumleitung zum Trocknen bewahrt.
  • Herstellung von Tetrasaccharid Glycal 21:
  • Das Polymer-gebundene Tetrasaccharid 20 (50 mg) wurde 2 mL THF gerührt und mit 0.2 mL je einer 1.0 M Lösung von TBAF und AcOH in THF behandelt. Die Mischung wurde bei 40°C über Nacht gerührt. Das Polymer wurde mit 3 × 5 mL THF gewaschen. Die kombinierten Waschlösungen wurden konzentriert und einer Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (2:1 EtOAc:hex) unterzogen, was Tetrasaccharidglycal 21 als einen farblosen Gummi ergab. Ausbeute: 9,0 mg.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von Diol 18':
  • Galactal 7' (0,100 g, 0,304 mmol) in 5 mL trockenem CH2Cl2 bei 0°C unter einer N2-Atmosphäre wurde mit 10 mL Murray Lösung (frisch hergestellt) behandelt und bei 0°C für 40 min gerührt. TLC (1:1 EtOAc:hex) zeigte keine Spur von T. Lösungsmittel wurden unter Verwendung eines trockenen N2-Stroms verdampft. Das zurückbleibende Epoxid von 7' wurde in einer Vakuumleitung für ~2h belassen. Zu dem Epoxid wurde unter einer N2-Atmosphäre eine Lösung von Glucalderivat 3' (0,150 g, 0,496 mmol) in 3 mL trockenem THF geben. Nach Abkühlung auf –78°C, wurde 1.0 M ZnCl2 in Et2O (0,50 mL, 0,50 mmol) zugegeben. Man ließ die Mischung langsam auf r.t. erwärmen (während ~2 Stunden) und wurde dann bei r.t. über Nacht gerührt. TLC (1:1 EtOAc:hex) zeigte, dass die Reaktion vollständig war. Es wurde gesättigtes wässriges NaHCO3 (20 mL) zugegeben und dann wurde die Mischung mit EtOAc (3 × 20 mL) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet. Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:3 EtOAc:hex) ergab Diol 18' als einen farblosen Feststoff. Ausbeute: 173 mg (89%). [α]D 23 –9.8° (c 1,0, CH2Cl2).
  • Herstellung of Tetrasaccharid 22:
  • Diol 18' (86 mg, 0,133 mmol) und Fucosyl-Donor 10 (0,290 g, 0,665 mmol) wurden azeotrop unter Verwendung von Benzol getrocknet. Die Mischung wurde in 3 mL trockenem THF zusammen mit 0,65 mL di-t-Butylpyridin gelöst und dann durch eine Kanüle in ein Gefäß gegeben, das Sn(OTf)2 (0,30 g, 0,72 mmol) und 4 Å MS (500 mg) bei 0°C unter N2-Atmosphäre enthielt. Die Mischung wurde bei 0°C ~7 Stunden gerührt. TLC (1:3 EtOAc:hex) zeigte keine Spur von Diol 18'. Die Mischung wurde aufgeteilt zwischen gesättigtem wässrigem NaHCO3 (100 mL) und EtOAc (2 × 100 mL). Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet. Die organische Phase wurde durch Siliciumdioxid unter Verwendung von EtOAc gefiltert, um Rohmaterial zu erhalten, das dann mittels Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:9 EtOAc:hex) gereinigt wurde, was Tetrasaccharid 22 erbrachte. Ausbeute: 170 mg (86%).
  • Herstellung von Iodsulfonamid 23:
  • Verfahren 1.
  • Tetrasaccharidglycal 22 (120 mg, 81,1 mmol) und PhSO2NH2 (20 mg, 0,13 mmol) wurden unter Verwendung von Benzol azeotrop getrocknet. Es wurden (Handschuh-Schutzsack) 4 Å MS (0,2 g) zugegeben. Nach Abkühlung auf 0°C unter N2 wurde trockenes CH2Cl2 (1,0 mL) zugegeben. Die Mischung wurde mit einer Lösung aus I(coll)2ClO4 (hergestellt aus 100 mg Ag(coll)2ClO4, 5 mL Collidin und 60 mg I2 in 1 mL trockenem CH2Cl2) durch eine Kanüle durch eine Stopfen von Flammen-getrocknetem Celite und 4 Å MS behandelt. Die Mischung wurde bei 0°C für 40 min gerührt. TLC (1:4 EtOAc:hex) ergab Iodsulfonamid 23 als die Hauptkomponente. Die Mischung wurde dann durch Celite gefiltert, das mit Et2O gewaschen wurde. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Na2S2O3, gesättigtem wässrigem CuSO4, Salzlauge extrahiert und dann über MgSO4 getrocknet. Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:4 EtOAc:hex) ergab Iodsulfonamid 23 als einen farblosen Feststoff.
    Ausbeute: 115 mg (80%).
  • Verfahren 2.
  • Tetrasaccharidglycal 22 (200 mg, 0,135 mmol), PhSO2NH2 (42 mg, 0,27 mmol) und 200 mg pulverisierte 4 Å MS in 2,0 mL trockenem CH2Cl2 bei 0°C unter einer N2-Atmosphäre wurden mit I(coll)2ClO4 (hergestellt aus 120 mg Ag(coll)2ClO4 und 67 mg I2 in 1 mL trockenem CH2Cl2) behandelt. Die Mischung wurde bei 0°C (geschützt gegen Licht durch Verwendung von Folie) für 30 min gerührt. TLC (1:2 EtOAc:hex) ergab hauptsächlich Iodsulfonamid mit etwas Glycal.
  • Nach ~1 weiteren Stunde bei 0°C, ergab TLC keine merkliche Verbesserung. Die Mischung wurde durch Celite gefiltert, das mit Et2O gewaschen wurde. Nach Extrahieren mit gesättigtem wässrigem Na2S2O3, gesättigtem wässrigem CuSO4, Salzlauge, wurden die organischen Verbindungen über MgSO4 getrocknet. Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:3 EtOAc:hex) ergab 23 als einen farblosen Feststoff.
    Ausbeute: 165 mg (69%). [α]D 23 = –85,7° (c 1,0, CH2Cl2).
  • Herstellung von Hexasaccharid 25:
  • Iodsulfonamid 23 (60 mg, 34 mmol) in einem 35 mL r.b. wurde mit 200 mg pulverisierte 4 Å MS (Handschuh-Schutzsack) behandelt. Zu diesem Gefäß wurde N2 eine Lösung von geschütztem Lactal 24 in THF (1,5 mL) gegeben. Nach Abkühlung der Mischung auf –78°C wurde eine Lösung von AgBF4 (40 mg, 0,206 mmol) in 0,25 mL trockenem THF zugegeben. Die Mischung wurde gerührt und langsam über Nacht auf r.t. erwärmt. Die Mischung wurde auf 45°C erwärmt und ~36 Stunden gerührt. TLC ergab nur ein Spur Iodsulfonamid. Es wurde gesättigtes wässriges NH4Cl (5 mL) zugegeben und die Mischung wurde mit 3 × 10 mL EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet. Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:3 EtOAc:hex) ergab 25 als ein farbloses Öls. Ausbeute: 42 mg (55%).
    [α]D 23 = –33,8° (c 2,0, CH2Cl2)
  • Herstellung von Hexasaccharid 25a:
  • Hexasaccharid 25 (55 mg, 24,4 mmol) in ~1,5 mL THF wurde bei 0°C mit TBAF (0,25 mL, 1,0 M Lösung in THF, 0,25 mmol) behandelt und bei r.t. über Nacht gerührt. TLC (1:9 MeOH:CH2Cl2) ergab eine 3:1 Mischung von 25a zu einer weniger polaren Substanz. Es wurde noch einmal 1,0 M TBAF (0,10 mL) zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei r.t. gerührt. TLC ergab, dass die Reaktion vollständig war. Lösungsmittel wurden unter Verwendung eines N2-Stroms entfernt. Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:19 MeOH:CH2Cl2) ergab eine ~1:2 Mischung entsprechend der zwei Verbindungen, die sich nur durch die Anwesenheit oder Abwesenheit einer 3,4-zyklischen Carbonatgruppe unterscheiden. Rohausbeute: 35 mg Gesamtgewicht für zwei Produkte. Die Rohmischung wurde als solche für die nächste Reaktion verwendet.
  • Herstellung von peracetyliertem Hexasaccharid 26:
  • Hexasaccharid 25a (36 mg) in 0,25 mL trockenem THF wurde durch eine Kanüle zu ~8 mL hellblauer Na/NH3-Lösung bei –78°C (Trockeneisbad) unter N2-Atmosphäre zugegeben. Nach Entfernung des Trockeneisbads wurde die Mischung in refluxierendem NH3 (Trockeneiskühler) für 15 min gerührt. Nach Zugabe von 2 mL trockenem MeOH (langsam!) wurde die resultierende Mischung gerührt, während NH3 mit einem N2-Strom ab- bzw. ausgeblasen wurde. Die MeOH-Lösung wurde mit Dowex 50 × 8 [H+] bis zu einem pH ~8-9 behandelt und dann gefiltert. Das Harz wurde mit MeOH gewaschen. Der Rückstand wurde konzentriert und in einer Vakuumleitung zum Trocknen aufbewahrt. Unter einer N2-Atmosphäre wurde der Rückstand mit 1 mL trockenem Pyridin und 0,5 mL Ac2O behandelt und bei r.t. über Nacht gerührt. TLC (EtOAc) ergab, dass Hexasaccharid 26 die Hauptkomponente ist. Nach Konzentrierung wurde der Rückstand durch Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:4 hex:EtOAc) gereinigt.
  • Herstellung of Hexasaccharid 17:
  • Hexasaccharid 26 (10,0 mg, 6,3 mmol) unter N2 bei 0°C wurde mit 0,5 mL trockenem CH2Cl2 behandelt. Es wurde eine Dioxiran-Lösung (0,20 mL) zugegeben und die Mischung wurde bei 0°C ~40 Min gerührt. TLC (EtOAc) ergab keine Spur von 26. Lösungsmittel wurden mit einem N2-Strom verdampft. Das Epoxid wurde in einer Vakuumleitung für ~2 Stunden getrocknet. Das Epoxid wurde unter einer N2-Atmosphäre mit 0,5 mL Allylalkohol (der zur Trocknung durch basisches Aluminiumoxid geleitet wurde) und 0,5 mL trockenem THF behandelt. Nach Abkühlung auf –78°C wurde 1,0 M ZnCl2 (10 mL) in trockenem Et2O zugegeben. Nach langsamem Erwärmen auf r.t. wurde die Mischung über Nacht gerührt. Gesättigtes wässriges NaHCO3 (5 mL) wurde zugegeben und die Mischung wurde mit 3 × 5 mL EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und zu einem Öl konzentriert, das in einer Vakuumleitung für ~2 Stunden getrocknet wurde. Der Rückstand wurde mit Pyridin:Ac2O (2:1, 1,5 mL) behandelt, während er über Nacht gerührt wurde. Lösungsmittel wurden entfernt und der Rückstand wurde durch Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxid (1:4 hex:EtOAc) gereinigt, was Hexasaccharid 17 als einen farblosen Feststoff ergab. Ausbeute: 5,5 mg.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Eine hoch konvergente Synthese der Lewis Y Blutgruppendeterminante in konjugierbarer Form
  • Konstruktion der LeY-Determinante beginnt mit Lactal (1a) (W.N. Haworth, E.L. Hirst, M.M.T. Plant, R.J.W. Reynolds, J. Chem. Soc. 1930, 2644), wie in 2 gezeigt ist. Abdecken der beiden primären Hydroxylgruppen als ihre TBDPS-Ether unter Standardbedingungen wurde gefolgt von einfachem Einsatz der 3' und 4' Hydroxylfunktionen als ein zyklisches Carbonat 2a. Die stereospezifische Einführung von zwei α-verknüpften Fucose-Resten ergab Tetrasaccharidglycal 3a mit 51 % Ausbeute in einem einzigen Schritt. Der verwendete Donor war der bekannte Fluorzucker 5a (S.J. Danishefsky, J. Gervay, J.M. Peterson, F.E. McDonald, K. Koseki, T. Oriyama, D.A. Griffith, C-H. Wong, D.P. Dumas, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8329), folgend einer Modifikation der originalen Bedingungen nach Mukaiyama. (T. Mukaiyama, Y. Murai, S. Shoda, Chem. Lett. 1981, 431) Glycal 3a entspricht dem LeY-Hapten, ohne die N-Acetylfunktion in dem Glucoserest. Das Problem war nun, diese Gruppe sowie ein Galactose-Spacer-Modul einzuführen.
  • Bereits entwickelte Methodik (D.A. Griffith, S.J. Danishefsky, "On the Sulfonamidoglycosylation of Glycals. A Route to Oligosaccharides With 2-Aminohexose Subunts+", J. Am. Chem. Soc. 1990 112, 5811) erwies sich als geeignet, um diese Ziele zu erreichen. Glycal 3a wurde mit Iodoniumdicollidinperchlorat und Benzolsulfonamid behandelt, um Iodsulfonamid 4a zu ergeben. Azaglycosylierung unter Verwendung des 3-Stannylethers von Galactal (9a) (S.J. Danishefsky, K. Koseki, D.A. Griffith, J. Gervay, J. M. Peterson, F.E. McDonald, T. Oriyama, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8331) in Anwesenheit von Silbertetrafluorborat ergab Pentasaccharidglycal 6a mit 75% Ausbeute, wie in 3 gezeigt ist. Mit Vorliegen von 6a kann man die Azaglycosylierungssequenz wiederholen oder das Glycal als sein Epoxid aktivieren und mit weiteren Glycosylierungen fortfahren. Um die Fähigkeit zum Herstellen einer konjugierbaren Form des LeY-Haptens zu demonstrieren, war die Bildung des Allylglycosids wichtig. Es wurde die Durchführbarkeit der Umwandlung der Sulfonamidgruppe in das gewünschte Acetamid demonstriert. Glycal 6a wurde wie gezeigt in zwei Schritten entschützt. Peracetylierung ergab Acet amidoglycal 7a. Aktivierung des Glycals als sein Epoxid mit Dimethyldioxiran (R.L. Halcomb, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6661), gefolgt von Öffnung des Epoxids mit Allylalkohol in Anwesenheit von Zinkchlorid ergab das gewünschte peracetylierte β-Allylpentasaccharid, das durch die Wirkung von Methoxid deacetyliert wurde, um das gewünschte LeY-Hapten als sein β-Allylglycosid 8a bereitzustellen. (8a [α]D –72,7° (c. 1 MeOH); IR (Dünnfilm) 3350, 2940, 2900, 2830, 1650, 1550, 1365, 1300, 1155, 1070, 1030; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5,95 (m, 1H), 5,32 (d, J=17,25 Hz, 1H), 5,14-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J=3,83 Hz, 1H), 5,02 (d, J=3,50 Hz, 1H). 4,68 (d, J=8,15 Hz, 2H), 4,51 (d, J=5,70 Hz, 1H) 3,40-4,38 (m, 27H). 1,96 (s, 3H), 1,23 (m, 6H); HRMS (FAB) berechnet für C35H56NO24Na 900,3325, gefunden 900,3310. Der durch Ozonolyse von 8a erhaltene Aldehyd kann an ein Trägerprotein mit einem Verfahren von Bernstein und Hall konjugiert werden.
  • Diese Synthese ist der direkteste bekannte Weg zu der LeY-Determinante (O. Hindsgaul, T. Norberg, J. Le Pendu, R. U. Lemieux, Carbohydr Res. 1982, 109, 109; U. Spohr, R.U. Lemieux ibid, 1988, 174, 211; für frühere Synthesen, vergleiche: J.C. Jacquinet, P. Sinay, J. Org. Chem. 1977, 42, 720; S. Nilsson, H. Lohn, T. Norberg, Glycoconjugate J. 1989, 6, 21; R.R. Schmidt, A. Topfer, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 3353; W. Kinzy, A. Low, Carbohydrate. Res. 1993, 245, 193) Das Verfahren ist bei jedem Schritt stereospezifisch und es veranschaulicht die Vielseitigkeit von Glycalen sowohl als Donoren als auch als Akzeptoren und nutzt 1,2-Glycalepoxide und ihre mutmaßlichen N-Sulfonylaziridin-Gegenstücke. Das Verfahren macht auch eine extensive analoge Herstellung und Variation von Konjugationsstrategien möglich.
  • Die Synthese von 3a und 6a werden nachfolgend gezeigt:
    3a: Zu 2,00g (2,47 mmol) Lactalcarbonat 2a wurden 4,44g (9,86 mmol) Fucosylfluorid 5a zugegeben. Die Mischung wurde 5 Mal mit Benzol azeotropiert und für zwei Stunden unter Hochvakuum gegeben. Unter einer Argon-Atmosphäre wurden 2,77 ml (12,33 mmol) di-tert-Butylpyridin and 16 mL trockener Ether zugegeben. 2,0 g frisch aktivierte 4A Molekülsiebe wurden zugegeben und die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. In einem Argon-Handschuh-Schutzsack wurden 2,34g (12,33 mmol) Zinnchlorid (SnCl2) und 2,56 g (12,33 mmol) Silberperchlorat (AgClO4) zugegeben. Der Behälter war versehen mit einem Rückflusskühler und die Reaktion wurde für 72 Stunden unter Rückfluss gebracht. Die Reaktion wurde mit 5 mL gesättigtem Bicarbonat unterbrochen und durch ein Celitekissen gefiltert. Sie wurde mit 50 mL Ethylacetat verdünnt und 2 Mal mit gesättigtem Bicarbonat, 2 Mal mit gesättigtem Kupfersulfat und 2 Mal mit gesättigter Salzlauge gewaschen. Die organischen Anteile wurden über MgSO4 getrocknet und konzentriert. Blitzchromatographie in 20% Ethylacetat/Hexanen ergab 2,10 g (51 %) eines weißen Schaums 3a: [α]D –78,9 (c.555, CHCl3); IR (Dünnfilm) 3040, 3000, 2905, 2860, 2830, 1820, 1800, 1710, 1635, 1585, 1570, 1480, 1460, 1440, 1415, 1370, 1350, 1300, 1260, 1205, 1145, 1100, 950, 735, 695, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,09 (d, J=8,12 Hz, 2H), 8,00 (d, J=8,26 Hz, 2H) 7,66 (m, 4H), 7,59 (d, J=6,74 Hz, 4H), 7,56 (t, J=7,27 Hz, 1H), 7,30-7,50 (m, 22H) 7,16-7,26 (m, 10H) 7,09 (m, 2H), 6,99 (t, J=7,59 Hz, 2H) 6,89 (t, J=7,97 Hz, 1H), 6,43 (d, J=6,08Hz, 1H), 5,46 (bs, 1H), 5,38 (bs, 1H), 5,35 (d, J=3,42 Hz, 1H), 4,89 (d, J=11,35 Hz, 1H) 4,75-4,80 (m, 4H), 4,72 (d, J=5,88 Hz, 2H), 4,69 (d, J=4,27 Hz, 2H), 4,36-4,55 (m, 5H), 4,28 (q, J=6,51 Hz, 1H), 4,17 (bd, J=5,46 Hz, 1H), 3,90-4,00 (m, 6H), 3,85 (d, J=2,99 Hz, 1H), 3,82 (d, J=2,89 Hz, 1H), 3,56-3,78 (m, 4H), 1,07 (m, 24H); HRMS (FAB): berechnet für C99H106O20Si2Na 1694,6740 gefunden 1694,6787,
    6a: 230 mg (0,12 mmol) Iodsulfonamid 4a wurde 5 Mal mit trockenem Benzol azeotropiert und für zwei Stunden unter Hochvakuum gegeben. Es wurden 2,4 ml THF-Lösung von 15 äq. Zinnether 9a (erzeugt durch azeotrope Entfernung von Wasser über Nacht mit einer Dean-Stark-Falle, die mit frisch aktivierten 4A Molekülsieben versehen war, aus 561 mg (1,80 mmol) 6a-TIPS-Galactal und 673 μl (1,32 mmol) bis(tributylin)-Oxid in 80 ml Benzol). Zu dieser Lösung wurden unter Rühren unter einer Argon-Atmosphäre 200 mg frisch aktivierte pulverisierte 4A Molekülsiebe zugegeben. Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf –78°C abgekühlt und über eine Kanüle eine Lösung von 187 mg (0,96 mmol) Silbertetrafluorborat in 2,4 ml THF zugegeben. Sie wurde während 15 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt und die Reaktion, die hellgelb geworden war, mit 2 mL gesättigtem Bicarbonat unterbrochen. Die Reaktionsmischung wurde durch ein Celitekissen in einen Scheidetrichter filtriert. Das Celitekissen wurde gründlich mit Ethylacetat gewaschen. Die organischen Anteile wurden zwei Mal mit gesättigtem Bicarbonat und zwei Mal mit gesättigter Salzlauge gewaschen. Die organischen Anteile wurden über MgSO4 getrocknet. Konzentrierung und Chromatographie in 25% Ethylacetat/Hexanen ergaben 193 mg (75%) 6a als einen weißen Schaum: [α]D –126,4° (c, 505, CHCl3), IR (Dünnfilm) 3500, 3040, 3000, 2905, 2840, 1820, 1800, 1705, 1635, 1590, 1440, 1410, 1255, 1195, 1100, 1080, 1035, 815, 730, 695; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,09 (scheinbar t, 4H), 7,08-7,65 (m, 46H), 6,90 (t, J=7,65 Hz, 3H), 6,76 (d, J=6,91 Hz, 2H), 6,12 (d, J=6,59 Hz, 1H), 5,50 (bs 1H), 5,45 (bs 1H), 5,28 (scheinbar t, 2H), 3,03-4,91 (m, 36H), 1,09 (m, 45H); LRMS (FAB): berechnet für C120H141NO26SSi3Na 2153, gefunden 2153.
  • Strategie für die Assemblierung von komplexen verzweigten Oligosaccharid-Domänen auf einem festen Träger: Eine Anwendung für eine präzise Synthese der Lewisb-Domäne in biokonjugierbarer Form.
  • Das Assemblieren der Leb- (Typ 1) -Domäne ist ein relativ schwierigeres Unterfangen als das Ley- (Typ 2) -Ziel, wobei Lactal als ein zweckmäßiges Ausgangsmaterial verwendet wurde. Im Fall der Typ 1-Determinante ist Lactal kein verwendbares Ausgangsmaterial. Die Synthese des Leb-Systems bot die Möglichkeit, das Polymer-basierte Oligosaccharid-Aufbauverfahren anzuwenden. (S.J. Danishefsky, K.F. McCLure, J.T. Randolph, R.B. Ruggeri, Science 1993, 260, 1307) Die Strategie ist in 4 zusammengefasst, wobei Polymer-gebundenes Glycal 1 aktiviert wird zur Glycosylabgabe durch direkte Bildung eines 1,2-Anhydroderivats 2. Reaktion von 2 mit Akzeptor-Glycal 3 ergibt 4. Wiederholung wird erreicht mittels direkter Epoxidation und Reaktion mit Akzeptor 3. Die selbstkontrollierende Natur des Verfahrens und die einfache "einmalige" Reinigung am Ende der Synthese sind nützliche Merkmale.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine wichtige zusätzliche Dimension des Polymergebundenen Verfahrens. Die Logik erschließt sich durch Betrachtung von 5. Jedes Glycosylierungsereignis erzeugt ein einzelnes C2-Hydroxyl. Grundsätzlich (und tatsächlich, vergleiche unten) kann dieses Hydroxyl als ein Glycosyl-Akzeptor nach Reaktion mit einem auf Lösung basierenden Donor funktionieren. Die Glycalverknüpfung von 5, die noch auf dem Träger beherbergt ist, kann weiter verlängert werden. Auf diesem Weg wird eine Verzweigung bei C2 erreicht, während das Erfordernis an Schutzgruppen-Manipulierungen minimiert wird. (Für eine Anwendung dieser Strategie bei der Synthese eines komplexen Saponins, vergleiche: J.T. Randolph, S.J. Danishefsky, J. Am Chem Soc. 1993, 115, 8473)
  • Grundsätzlich kann diese Verzweigung an jeder Stelle in einer wachsenden Kette implementiert werden. Für eine solche Verlängerung wäre es notwendig, alle vorher auf der "Polymer-Seite" (nicht-reduzierendes Ende) der wachsenden Domäne gebildeten Hydroxylgruppen abzudecken. Somit kann das Polymer-gebundene Oligosaccharid wie es gerade dienlich ist entweder als Donor oder als Akzeptor dienen.
  • Anfängliche Anstrengungen bei der praktischen Ausführung identifizierten Tetrasaccharidglycal 6, das H-Typ 2 Blutgruppen-Spezifität trägt, als ein Ziel. Polymer-geträgertes Galactal 7 (das als Polymerträger Polystryrol verwendet, das mit 1% Divinylbenzol quervernetzt und unter Verwendung von veröffentlichen Verfahren funktionalisiert worden war: T-H. Chan, W.-Q. Huang, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1985, 909; M.J. Farrall. J.M.J. Frechet, J. Org. Chem 1976, 41, 3877) reagierte mit einer 3,3-Dimethyldioxiran-Lösung (R.W. Murray, R. Jeyaraman, J. Org. Chem. 1985, 50, 2847), um den korrespondierenden 1,2-Anhydrozuckerglycosyl-Donor bereitzustellen, der mit einer Lösung von Glucalderivat 8 in Anwesenheit von ZnCl2 behandelt wurde, um 9 bereitzustellen (R.L. Halcomb, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6661) Dieses Polymer-gebundene Disaccharid wirkte als ein Glycosyl-Akzeptor nach Behandlung mit einer Lösung von Fucosylfluorid 10 (K.C. Nicoloau, C.W. Hummel, Y. Iwabuchi, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 3126) in Anwesenheit von Sn(OTf)2, wodurch sich 11 ergibt. Rückgewinnung des Trisaccharidglycals von dem Träger wurde unter Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) erreicht, um 12 in 50%iger Gesamtausbeute von 7 zu erhalten.
  • Das von dem Polymer zurückgewonnene Trisaccharid konnte dann weiter verarbeitet werden. Zu diesem Zweck wurde Verbindung 12 in den Silylether 13 durch Reaktion mit TIPSCl umgewandelt. Der letztere wurde in das Iodsulfonamidderivat 14 durch die Wirkung von I(coll)2ClO4 in Anwesenheit von PhSO2NH2 umgewandelt. Reaktion von 14 mit Galactal-Stannyletherderivat 15 in Anwesenheit von AgBF4 ergab 16 mit 77% Ausbeute. (D.A. Griffith, S.J. Danishefsky, J. Am. Chem Soc. 1990, 112, 5811) Tetrasaccharidglycal 16 wurde entschützt und peracetyliert, um 6 zu ergeben. (S.J. Danishefsky, K. Koseki, D.A. Griffith, J. Gervay, J.M. Peterson, F.E. MsDonald, T. Oriyama, J. Am. Chem Soc. 1992, 114, 8331)
  • Somit wurde die Synthese der vollständigen H-Typ-Determinante durch sequentielle auf Polymer- und Lösung-basierenden Manöver erreicht. Das nächste Ziel war das komplexere Leb-Hexasaccharid 17, Der eingeschlagene Weg ist in 6 gezeigt. Polymergebundenes Galactal 7 wurde in 18 umgewandelt durch Epoxidierung mit 3,3-Dimethyldioxiran gefolgt von einer Reaktion mit Glucalderivat 19. Dieses Disacchariddiol wurde dann bisfucosyliert unter Verwendung von Fucosyl-Donor 10 in Anwesenheit von Sn(OTf)2, um 20 zu erhalten. Gewinnung von dem Träger mit TBAF ergab 21, das in einer Gesamtausbeute von 40% aus 7 erhalten wurde. Verbindung 21 reagierte mit TIPSCl, um 22 zu ergeben.
  • Iodsulfonamid 23, das erhalten wurde aus 22 unter Verwendung von I(coll)2ClO4 und PhSO2NH2, reagierte mit Lactalderivat 24 in Anwesenheit von AgBF4, um Hexasaccharidglycal 25 mit 55% Ausbeute bereitzustellen. Entschützen von 25 wurde in zwei Schritten erreicht (TBAF, um die Silylether zu entfernen, gefolgt von Na/NH3-Reduktion, um die aromatischen Schutzgruppen zu entfernen), und das Rohprodukt wurde peracetyliert, um 26 mit einer Gesamtausbeute von 51% zu ergeben. Verbindung 26 wurde über das 1,2-Anhydrozuckerderivat zum Allylglycosid 17 umgewandelt, das durch Ozonolyse zu dem Aldehyd (R = CH2CHO) aktiviert werden kann, für nachfolgendes Kuppeln an ein Protein durch das Verfahren von Bernstein und Hall.
  • Zusammengefasst erweitert die vorliegende Erfindung das Glycal-Assemblierungsverfahren mit festem Träger auf die Synthese einer komplexen Kohlenhydrat-Domäne, um die Verzweigungsmuster einzuschließen, die wichtig sind für biologische Erkennung. Insbesondere wurde die Determinante für das Binden von H. pylori an humanes Magenepithel stereospezifisch mit Leichtigkeit hergestellt, auf einem Weg, der signifikante Befreiung von einigen der Schwierigkeiten bei der Handhabung von Schutzgruppen bietet.
  • Experimentelles Verfahren:
    • 6: 1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 6,39 (d, 1H, J=6,2 Hz, Hz Galactal), 5,65 (d, 1H, J=8,9 Hz, NHAc), 5,35 (d, 1H, J=3,8 Hz), 5,33 (m, 1H), 5,29 (d, 1H, J=2,6 Hz), 5,27 (d, 1H, J=3,1 Hz), 5,17-5,09 (m, 2H), 4,97-4,90 (m, 2H), 4,81 (dd, 1H, J=3 Hz, J=6,1 Hz, H2 Galactal), 4,75 (d, 1H, J=8,0 Hz), 4,52 (m, 1H), 4,48 (dd, 1H, J=12,0 Hz), 4,44-4,06 (m, 8H), 3,88-3,77 (m, 4H), 3,61 (m, 1H), 2,18-1,97 (m, 33H, COCH3), 1,18 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3 Fucose); 13C NMR (CDCl3): δ 170,80, 170,77, 170,72, 170,67, 170,62, 170,34, 170,21, 170,09, 170,01, 169,99, 169,65, 144,92 (C1 Galactal), 100,22, 98,83, 98,58, 95,55, 74,48, 73,38, 73,13, 73,06, 71,48, 71,01, 70,68, 67,97, 67,42, 67,18, 67,05, 65,94, 64,83, 62,35, 62,22, 60,88, 60,37, 54,21, 23,23, 22,15, 20,85, 20,82, 20,79, 20,76, 20,65, 20,61, 20,57, 15,51, (C6 Fucose); IR (Dünnfilm): 3368,7 (NH), 2965,6, 2934,6, 1746,5 (C=O), 1537,5, 1435,9, 1371,3, 1228,5, 1065,0, 1046,0; [α]D 23= –51,1° (c 1,8, CH2Cl2); HRMS (FAB): berechnet für C46H63NNaO28: m/z = 1100,3434, gefunden 1100,3436.
    • 21: Polymer-gebundenes Galactal 7 (Beladung =0,85 mmol Glycal/g), das in ein Gefäß mit rundem Boden, das einen mit einer Fritte versehenen Auslass aufwies, platziert worden war, wurde in CH2Cl2 unter N2 suspendiert, auf 0°C gekühlt, und dann mit einer Lösung von 3,3-Dimethyldioxiran behandelt. Die Mischung wurde für 40 Minuten bei 0°C gerührt (Teflon-beschichteter magnetischer Rührstab), nach dieser Zeit wurden lösliche Anteile durch Filtration durch den mit einer Fritte versehenen Auslass (N2-Druck) entfernt. Der Polymer-gebundene 1,2-Anhydrozucker wurde für mehrere Stunden evakuiert (ca. 0,1 Torr), um das Material für den nächsten Schritt zu trocknen. Dieses Material wurde erneut unter N2 platziert, bevor es mit 19 behandelt wurde. (~10 Moläquivalente als eine 0,5 M Lösung in THF). Die Suspension wurde auf –40°C gekühlt und mit ZnCl2 (~2 Moläquivalente als eine 1,0 M Lösung in THF) behandelt. Man ließ die Reaktionsmischung langsam auf r.t. erwärmen (über ca. 2 Stunden), und dann wurde sie weitere 3-4 Stunden gerührt. Lösliche Anteile wurden durch Filtration entfernt, und Polymer 18 wurde mehrere Male mit THF gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Zur Verbindung 18 wurde in einem Handschuh-Schutzsack festes Sn(OTf)2 zugegeben (~ Moläquivalente), und die Mischung wurde unter N2 platziert und auf 0°C gekühlt, bevor sie mit 10 (~5 Moläquivalente als eine 0,2 M Lösung in THF) und di-tert-Butylpyridin (~8 Moläquivalente) behandelt wurde. Man lies die Suspension auf r.t. erwärmen und rührte sie 8-10 Stunden. Die Mischung wurde mit wasserfreiem THF (2 Mal), mit 1,4-Dioxan (2 Mal), wieder mit THF gewaschen, und dann im Vakuum getrocknet. Verbindung 20 (100 mg) wurde in THF suspendiert, mit einer 1:3 Mischung aus AcOH und TBAF (~0,2 M in TBAF, ~10 Moläquivalente) behandelt, und die Mischung wurde für 18 Stunden bei 40°C gerührt. Das Polymer wurde mit THF (3 Mal) gewaschen und die kombinierten Waschlösungen wurden konzentriert und durch Säulen-Chromatographie mit Siliciumdioxidgel (1:1 EtOAc:Hexane) gereinigt. Verbindung 21 (18 mg) wurde als ein farbloser Feststoff erhalten (40% Gesamtausbeute von 7): 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,40-7,25 (m, 3OH, Ar H), 6,18 (d, 1H, J=6,0 Hz, H1 Glucal), 5,26 (d, 1H, J=3,5 Hz, H1 Fucose), 5,09 (d, 1H, J=3,7 Hz, H1 Fucose), 4,96 (t, 2H, J=10,8 Hz, PhCH2), (4,90-4,56 (m, 13H), 4,43 (m, 1H), 4,15-4,06 (m, 4H), 3,97 (dt, 1H, J=8,3 Hz, J=2,4 Hz), 3,87-3,65 (m, 10H), 3,64 (d, 1H), 3,57 (d, 1H), 2,69 (br, 1H, OH), 2,52 (br, 1H, OH), 1,11 (d, 3H, J=7,0 Hz, CH3 Fucose), 1,09 (d, 3H, J=7,0 Hz, CH3 Fucose); 13C NMR (CDCl3); δ 153,37 (C=O), 145,75 (C1 Glucal), 138,60, 138,52, 138,19, 137,61, 128,55, 128,52, 128,44, 128,24, 128,16, 128,07, 127,62, 127,56, 127,45, 98,71, 98,38, 97,65, 97,34, 79,26, 78,87, 78,67, 78,01, 77,79, 77,65, 76,37, 76,10, 74,92, 74,40, 74,16, 73,95, 72,86, 72,64, 72,53, 67,43, 67,29, 61,31, 60,90, 16,65 (C6 Fucose), 16,53 (C6 Fucose); IR (Dünnfilm): 3467,0 (OH), 3029,6, 2923,6, 1807,2 (C=O), 1647,3, 1496,0, 1453,5, 1358,1, 1240,2, 1095,6, 1049,2, 738,5, 697,2; [α]D 23 = –82,5° (c 0,4, CH2Cl2); HRMS (FAB); berechnet für C67H74NaO18: m/z = 1189,4772, gefunden 1189,4757,
    • 25: Zu einer Mischung aus 23 (60 mg, 34 μmol) und pulverisierten 4A Molekülsieben (200 mg) unter N2 wurde durch eine Kanüle eine Lösung von 24 (0,21 mmol) in wasserfreiem THF (1,5 mL) zugegeben. Die gerührte Suspension wurde auf –78°C gekühlt, bevor sie mit einer Lösung von AgBF4 (0,21 mmol) in 0,25 mL wasserfreiem THF behandelt wurde. Die Mischung wurde gerührt und man lies sie langsam über Nacht auf r.t. erwärmen. Die Suspension, die eine hellgelbe Farbe entwickelt hatte, wurde unter Rühren auf 45°C für weitere 36 Stunden erwärmt, bis die TLC (2:5 EtOAc:Hexane) keine Spur von 23 ergab. Die Mischung wurde mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5 mL) behandelt und dann mit EtOAc (3 × 10 mL) extrahiert, und die organischen Anteile wurden über MgSO4 getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie (1:3 EtOAc:Hexane) gereinigt, um 25 als ein farbloses Öl zu ergeben (42 mg, 55%): 1H NMR (400 MHz, Aceton-d6): δ 8,17 (d, 2H, J=7,3 Hz, PhSO2), 7,50-7,20 (m, 33H, ArH), 6,52 (d, 1H, J=10,5 Hz, NH), 6,30 (dd, 1H, J=6,0 Hz, H1 Glucal), 5,35-5,32 (m, 2H), 5,25 (d, 1H, J=7,9 Hz), 5,15 (m, 2H), 4,99-4,92 (m, 3H), 4,86-4,52 (m, 14H), 4,45 (dd, 1H, J=7,91 Hz, J=2,4 Hz), 4,32-4,23 (m, 3H), 4,22 (dd, 1H), 4,17 (d, 1H, J=10,1 Hz), 4,08-3,84 (m, 18H), 3,79-3,73 (m, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,55 (t, 1H, J=6 Hz), 3,50 (dd, 1H, J=9,7 Hz), 1,33 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3 Fucose), 1,31 (d, 3H, J=6,4 Hz, CH3 Fucose), 1,20-0,98 (m, 84H, 3 × Si(i-Pr)3); 13C NMR (Aceton-d6): 145,66 (C=O), 132,72, 131,48, 131,45, 131,28, 131,16, 130,77, 130,48, 121,31, 120,11, 119,86, 119,78, 119,25, 95,63, 94,70, 91,37, 89,64, 89,31, 86,52, 73,38, 72,24, 71,00, 70,71, 70,37, 69,80, 69,59, 69,06, 68,23, 67,92, 67,38, 67,10, 66,49, 65,67, 65,33, 64,60, 64,34, 64,03, 63,45, 63,30, 59,46, 58,83, 58,37, 54,45, 53,32, 49,86, 19,67 (C6 Fucose), 18,42 (C6 Fucose), 9,55, 9,48, 9,45, 9,31, 9,23, 3,82, 3,70, 3,64; IR (Dünnfilm): 3491,9 (OH), 3030,1, 2941,2, 2865,5, 1835,8, 1819,5, 1649,8, 1496,2, 1462,3, 1349,9, 1245,5, 1155,2, 1095,1, 1049,4, 882,2, 734,8, 692,0; [α]D 23 = –33,8° (c 2,0, CH2Cl2); HRMS (FAB): berechnet für 12C120 13CH179NNaO29SSi4: m/z = 2278,1292, gefunden 2278,1296.
    • 17: 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 6,00 (m, 1H, J=5,6 Hz, CH2CH=CH2), 5,37 (dd, 1H, J=1,6 Hz, J=7,3 Hz, CH2CH=CH2), 5,20 (dd, 1H, J=1,6 Hz, J=9,5 Hz, CH2CH=CH2), 5,18 (d, 1H, J=3,9 Hz, H1 Fucose), 5,10 (d, 1H, J=3,8 Hz, H1 Fucose), 4,64 (d, 1H, J=6,9 Hz), 4,45 (d, 1H, J=7,4 Hz), 4,43-4,23 (m, 2H), 4,27 (dd, 1H, J=9,3 Hz, J= 10,6 Hz), 4,23-4,11 (m, 2H), 4,02-3,29 (m, 31H), 2,06 (s, 3H, NAc), 1,31 (d, 3H, J=6,6 Hz, CH3 Fucose), 1,29 (d, 3H, J=6,6 Hz, CH3 Fucose); 13C NMR (CD3OD): δ 173,20 (C=O), 135,73 (CH2CH=CH2), 105,13, 103,30, 102,49, 101,62, 99,63, 96,86, 80,79, 80,67, 78,44, 76,67, 76,49, 75,89, 74,80, 74,59, 73,94, 73,61, 73,40, 71,55, 71,38, 71,16, 70,42, 70,26, 70,14, 67,77, 67,30, 67,21, 62,79, 62,34, 61,99, 55,54, 22,97 (NAc), 16,65 (2 C's, C6 Fucose); IR (Dünnfilm): 3376,6 (OH), 2924,2, 1652,5 (C=O), 1383,1, 1032,4; [α]D 23 = –12,8° (c 0,25, MeOH); HRMS (FAB): berechnet für C41H69NNaO29: m/z = 1062,3853, gefunden 1062,3837
  • BEISPIELE DER ERFINDUNG
  • Glycal-Assemblierungsverfahren angewandt auf die Synthese von humanem Brusttumor-assoziiertem Antigen
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine konvergente Synthese des Hexasaccharids zur Verfügung, wobei die zwei Trisaccharid-Domänen effizient in Formen assembliert wurden, die leicht für Kupplung zugänglich sind. Die Synthese des ABC-Trisaccharids wird in 8 dargestellt. Die α-Bindung bzw. α-Verknüpfung dieses Trisaccharids kann gebildet werden durch Einsatz eines Fluorzucker-Donors 4b, unter Verwendung von etablierten Bedingungen. (Gordon, D. M.; Danishefsky, S. J., Carbohydr. Res., 1990, 206, 361-366.) Herstellung des geeigneten Disaccharid-Akzeptors beginnt mit 5b (Danishefsky, S. J.; Behar, V.; Randolph, J. T.; Lloyd, K. O., J. Am. Chem. Soc., 1995, 0000), das selbst durch eine Glycal-Kupplung erhalten wird.
  • Benzylierung gefolgt von Desilylierung, Carbonat-Entfernung und selektive Dibenzylierung ergab das Disaccharid 6b. Den so erhaltene Akzeptor lies man mit dem Fluorzucker 4b reagieren unter Verwendung von modifizierten Mukaiyama-Bedingungen (Mukaiyama, T.; Murai, Y.; Shoda, S., Chem. Lett., 1981, 431-433), um das Trisaccharidglycal 7b bereitzustellen. Entschützen des PMB-Ethers stellte das ABC-Trisaccharid 8b bereit, das für eine Kupplung mit einem geeigneten DEF-Trisaccharid-Donor ausbalanciert wurde (orig.: "poised").
  • Die Synthese des DEF-Trisaccharids ist in 9 beschrieben. Epoxidierung des Galactals 9b und Standardkupplung (Halcomb, R.L.; Danishefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 6661-6666,) mit Akzeptor 10b ergab regioselektiv das Disaccharid 11b. Fucosylierung, die die Fluor-Fucose 12b verwendete (Dejter-Juszynski, M.; Flowers, H.M., Carbohydr. Res., 1973, 28, 61), stellte ein 5:1 Verhältnis an Monoglycosylierungs-Regioisomeren zur Verfügung, wobei das hauptsächliche Isomer das gewünschte Trisaccharid 13b ist. Dieses Material wurde unter Standardbedingungen behandelt, um das trans-diaxiale Iodsulfonamid 14b zu ergeben.
  • Direkte Kupplungsreaktionen (Griffith, D.A.; Danishefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5811-5819; Danishefsky, S.J.; Koseki, K.; Griffith, D.A.; Gervay, J.; Peterson, J.M.; McDonald, F.E.; Oriyama, T., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 8331-8333), die Iodsulfonamide, wie beispielsweise 14b, mit ABC-Trisaccharid-Akzeptoren verwendeten schlugen fehl und führten zu einer unterschiedlichen Donorfunktionalität in dem Trisaccharid. In der Praxis wurde das Iodsulfonamid 14b mit einem Überschuss an Lithiumethanthiolat behandelt, um das Ethylthioglycosid 15b (10) zu erhalten. Ein von den gegenwärtigen Erfindern bereitgestelltes Beispiel führt zu der Vorhersage von Sulfonamid-Beteiligung, um das gewünschte β-verknüpfte Produkt aus 15b bereitzustellen. (Griffith, D.A., Doktorarbeit, Yale University, 1992) Wenn der Donor 15b mit MeOTf in Anwesenheit von Akzeptor 8b behandelt wurde, wurde eine 10:1 Mischung an Hexasaccharid-Isomeren erhalten. Das Hauptprodukt 16b wurde mit 70-85% Ausbeute erhalten.
  • Ceramidbefestigung und Bearbeitung begann mit Epoxidierung von 16b, gefolgt von Reaktion mit dem Stannylether 17b, gefördert durch Zn(OTf)2. (Liu, K.K.-C.; Danishefsky, S.J., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 4933-4934) Obwohl die Ausbeute bei dieser Ceramidkupplung niedrig ist, wurde das korrespondierende Produkt mit einer Ausbeute von 66% erhalten, wenn diese Reaktion mit Trisaccharid 7b durchgeführt wurde. Dieses Material kann dann verwendet werden, um 18b zu erhalten. Nach Acetylierung wurde die Ceramid-Seitenkette durch Reduktion der Azid-Funktionalität unter Verwendung von Lindlar-Katalysator unter einer H2-Atmosphäre in Anwesenheit von Palmitinanhydrid bearbeitet, um 18b bereitzustellen. Desilylierung und Verseifung folgte auflösende Metall-Entschützung und MeOH-Abschreckung. Peracetylierung der rohen Mischung, gefolgt von Verseifung stellten das Glycosphingolipid 1b bereit. Von dem natürlichen Material sind nur die chemischen Verschiebungen und Kopplungskonstanten der anomeren Protonen berichtet worden. Das Spektrum des synthetischen 1b befindet sich in vollständiger Übereinstimmung mit diesen Daten. Weiter wurde das Produkt durch exakte Masse und 1H und 13C NMR charakterisiert. Es wurde auch gezeigt, dass das synthetische Material an den monoklonalen Antikörper MBr1 bindet.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung das korrespondierende Allylglycosid (10b) zur Verfügung. Entschützen von 16b, wie oben, und Acetylierung ergab das Perace tat des Hexasaccharidglycals. Epoxidierung, Reaktion mit Allylalkohol und Verseifung stellten das Allylglycosid 19b zur Verfügung.
  • Wie im Falle der Le Determinante, schafft Ozonolyse der Allylgruppe von 19b die Voraussetzung für reduktive Kupplung an Lysinreste von Proteinen.
  • Synthese of 3b:
  • 3-O-(4-Metbozybenzyl)-D-galactal
  • Eine Suspension von D-Galactal (2b) (3,70 g, 25,3 mmol) und Dibutylzinnoxid (6,30 g, 1,0 Äquiv.) in trockenem Benzol (150 mL) wurde für 2 Stunden unter Rückfluss mit azeotroper Entfernung von Wasser erwärmt. Die Reaktion wurde abgekühlt und mit PMBCI (3,80 mL, 1,1 Äquiv.) und Tetrabutylammoniumbromid (9,10 g, 1,1 Äquiv.) behandelt und für 4 Stunden refluxiert. Die Reaktion wurde durch eine Siliciumdioxidsäule gefiltert und mit EtOAc/Hexanen (4:1) eluiert. Produkt enthaltende Fraktionen wurden konzentriert und der Rückstand in Hexanen zerkleinert, um 4,50 g (67%) Produkt als einen weißen kristallinen Feststoff zu ergeben.
    mp (Hexan) 117-118°C; (a)23 = –23,0° (CHCl3, c = 1,1); IR (KBr) 3313 (br), 1645, 1513, 1228, 1082, 821 cm–1 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,28 (2H, d, J=8,4 Hz), 6,89 (2H, d, J=8,4 Hz), 6,44 (1H, dd, J=6,4 Hz), 4,70 (1H, dt, J=6,3, 1,9 Hz), 4,59-4,52 (2H, ABq, J=11,4 Hz), 4,20-4,18 (1H, m), 4,04-3,97 (1H, m), 3,90-3,82 (2H, m), 3,81 (3H, s), 2,73 (1H, d, J=3,1 Hz, C4-OH), 2,54 (1H, dd, J=8,2, 4,2 Hz, C6-OH); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 159,46, 145,02, 142,05, 129,46, 113,95, 99,36, 76,12, 70,17, 70,14, 63,65, 62,74, 55,26; LRMS (NH3) 284 (M+ NH4)+, 266 (M)+, 249.
  • 4,6-di-O-Benzol-3-O-(4-metbozybenzyl)-D-galactal (3b).
  • Eine Lösung von 3-O-(4-methoxybenzyl)-D-galactal (2,28 g, 8,56 mmol) und Benzylbromid (3,75 mL, 3,68 Moläquivalente; frisch passiert durch basisches Aluminiumoxid) in DMF (30 mL) unter N2 bei 0°C wurde mit NaH (1,37 g, 4,0 Moläquivalente) in zwei Portionen behandelt. Die Reaktion wurde 0,5 Stunden bei 0°C und 1 Stunde bei r.t. gerührt. Die Reaktion wurde sorgfältig in 50 g zerstoßenes Eis gegossen, mit Wasser auf 100 mL verdünnt, dann mit EtOAc-Hexanen (1:1, 100 mL × 3 ) extrahiert. Organische Extrakte wurden mit Wasser gewaschen (100 mL × 2), getrocknet (Na2SO4) und konzentriert. Blitzchromatographie mit 15% EtOAc-Hexanen ergab 3,58 g (94%) der Titelverbindung als eine klare Lösung.
    [α]23 D = –48,2° (CHCl3, c = 0,85); IR (rein) 3030, 2867, 1645, 1613, 1513, 1247, 1092, 821, 736 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,34-7,23 (12H, m), 4,62 (1H, d, J=12,0 Hz), 4,59-4,51 (2H, ABq, J=11,7 Hz), 4,50-4,39 (2H, ABq, J=11,9 Hz) 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 159,04, 143,99, 138,30, 137,90, 130,43, 128,26, 128,20, 128,03, 127,77, 127,57, 127,56, 113,67, 100,00, 75,58, 73,28, 73,17, 71,13, 70,42, 70,28, 68,35, 55,15; LRMS (NH3) 464 (M+ NH4 +, 100), 326 (18), 309 (48), 253 (17).
  • Synthese von 4b:
  • Eine Lösung von Galactal 3b (3,20g, 7,17 mmol) in trockenem CH2Cl2 unter N2 bei 0°C wurde mit Dimethyldioxiran (0,09M, 80 mL) behandelt und gerührt, bis alles Glycal verbraucht war (0,5-1 Stunde; TLC 30% EtOAc in Hexanen). Flüchtige Bestandteile wurden bei 0°C mit einem Strom an trockenem N2 entfernt. Der Rückstand wurde in 30 mL trockenem THF unter N2 bei 0°C gelöst und mit TBAF (36 mL, aufbewahrt über Molekülsieben) behandelt, dann bei Umgebungstemperatur für 20 Stunden gerührt. Die dunkelbraune Lösung wurde durch ein Siliciumdioxidkissen filtriert (~4 cm Dicke) und mit EtOAc (200 mL) gewaschen. Das Filtrat wurde mit Wasser gewaschen (200 mL × 3) und getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Der Rückstand wurde in 30% EtOAc-Hexanen (50 mL) erneut gelöst und durch eine kurze Sliciumdioxidsäule filtriert (10 cm d × 4 cm h) und mit dem gleichen Lösungsmittelsystem (1L) gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert, um 2,59g Fluorhydrin mit > 90% Reinheit zu ergeben. Der Rückstand wurde in trockenem DMF (30 mL) unter N2 bei 0°C gelöst und mit Benzylbromid (958 uL, 1,5 Äquiv., frisch durch basisches Aluminiumoxid filtriert) behandelt, am Ende mit NaH (322 mg, 60% Dispersion, 1,5 Äquiv.) und für 30 Minuten bei 0°C und 30 Min. bei r.t. gerührt. Die Reaktion wurde durch Giesen in 100g Eis abgeschreckt und mit 1:1 EtOAc-Hexanen (150 mL × 2) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen (150 mL × 2), getrocknet (MgSO4) und im Vakuum konzentriert. Blitzchromatographie mit 10% EtOAc-Hexanen ergab 2,00g (49%) der Titelverbindung als eine gelbliche Flüssigkeit.
    [α]23 D = +15,3° (CHCl3, c = 0,85); IR (CHCl3 Film) 2916, 1612, 1513, 1248, 1103, 1056, 734 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,35-7,24 (17H, m), 6,84 (2H, d, J=8,4 Hz), 5,15 (1H, dd, J=53,2, 7,0 Hz), 4,92 (1Hz, d, J=11,6 Hz), 4,48-4,74 (2H, ABq, J=11,8 Hz), 3,96-3,89 (1H, m), 3,86 (1H, br s), (3H, s), 3,65-3,56 (3H, m), 3,51 (1H, dd, J=9,8, 2,8Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 159,22, 138,33, 138,11, 137,62, 130,16, 129,19, 128,40, 128,29, 128,21, 128,04 (2C), 127,90, 127,81, 127,69, 127,59, 113,77, 110,20 (d, J= 214 Hz), 80,60 (d, J=11,3Hz), 79,00 (d, J=20,5Hz), 74,92, 74,52, 73,59 (d, J=5,0Hz), 73,54, 72,99, 72,70, 68,34, 55,20; LRMS (NH3) 454 (M + NH4 +, 100).
  • Synthese von 6b:
  • Eine Lösung von TIPS-Carbonat-Galactal 5b (Danishefsky, S.J.; Behar, V.; R. Andolph, J.T.; Lloyd, K., J. Am. Chem. Soc., 1995, 0000) (4,28g, 5,62 mmol) in THF (25 mL)-MeOH (5 mL) wurde mit TBAF-Lösung (1,0 M, 6,75 mL, 1,2 Äquiv.) behandelt. Nach 6 Stunden wurde zusätzlich TBAF (4 mL) zugegeben und weitere 3 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert und direkt mit 4:1 EtOAc-Hexanen chromatographiert, um 2,20 g des Triols zu erhalten. Verbleibende Mischungen an zyklischem Carbonat und gemischtem Carbonat wurden in MeOH mit MeONa (1,0 mL, 25 Gew.%) hydrolysiert und chromatographisch gereinigt. Gesamtausbeute betrug 3,02 g (93%). Dieses Material wurde direkt für den Dibenzylierungsschritt verwendet.
    1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,35-7,24 (15H, m), 6,43 (1H, d, J=6,3 Hz), 4,87 (1H, dd, J=6,3, 3,4Hz), 4,84 (1H, d, J=11,4Hz), 4,63 (2H, scheinbar s), 4,61 (1H, d, J=11,4Hz), 4,53-4,47 (3H, m), 4,19-4,16 (3H, m), 3,87-3,84 (2H, m), 3,78-3,66 (3H, m), 3,46 (2H, scheinbar d, J=4,6 Hz), 3,29 (1H, t, J=5,5 Hz), 3,08 (1H, br), 2,73 (2H, br); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 144,70, 138,41, 138,22, 137,83, 128,45, 128,33 (2C), 128,12, 127,84, 127,73, 127,64, 127,57, 102,28, 99,74, 78,99, 76,03, 74,64, 74,07, 73,24 (2C), 73,17, 72,64, 70,20, 69,10, 67,79, 62,15.
  • Eine Mischung aus Triolglycal von oben (2,95 g, 5,1 mmol), Dibutylzinnoxid (1,33 g, 1,05 Äquiv.) und Bistributylzinnoxid (1,69 mL, 0,65 Äquiv.) in trockenem Benzol (50 mL) unter N2 wurde für 5 Stunden refluxiert mit azeotroper Entfernung von Wasser.
  • Die Reaktion wurde unterhalb des Siedepunkts abgekühlt und mit Benzylbromid (2,43 mL, 4,0 Moläquivalente) und Tetrabutylammoniumbromid (3,29 g, 2,0 Äquiv.) behandelt. 10 mL Benzol wurde abdestilliert und die Reaktion für 16 Stunden refluxiert. Die Reaktion wurde direkt auf eine Siliciumdioxidsäule geladen und mit 15-20% EtOAc-Hexanen eluiert, um 3,48 g (90%) von Produkt 6b als ein klares Öl zu ergeben.
    [α]23 D = –3,3° (CHCl3, c = 0,87); IR (CHCl3 Film) 2867, 1652, 1454, 1364, 1097, 736 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,35-7,21 (25H, m), 6,45 (1H, d, J=6,2 Hz), 4,88 (1H, dd, J=6,2, 3,9Hz), 4,83 (1H, d, J=10,9 Hz), 4,69 (2H, scheinbar s), 4,68 (1H, d, J=10,9Hz), 4,59 (2H, scheinbar s), 4,55 (1H, d, J=7,8 Hz), 4,49 (2H, scheinbar s), 4,47 (2H, scheinbar s), 4,29 (1H, dd, J=9,6, 5, 8 Hz), 4,18 (1H, t, J=4,4 Hz), 4,13 (1H, m), 3,99 (1H, br s), 3,85 (1H, dd, J=10,6, 6,4 Hz), 3,75-3,60 (4H, m), 3,47-3,41 (2H, m); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 144,43, 138,64, 138,42, 137,99, 137,84, 137,80, 128,40, 128,34, 128,26, 128,23, 128,18, 128,15, 127,82, 127,75, 127,69, 127,67, 127,65, 127,55, 127,51, 127,46, 127,31, 102,56, 99,56, 80,57, 78,69, 75,72, 75,10, 73,57, 73,32, 72,94, 72,28, 71,94, 70,12, 68,90, 67,85, 66,62; LRMS (NH3) 776 (M + NH4 +' 100).
  • Synthese of 7b:
  • Lactal 6b (1,32 g, 1,74 mmol, 1,0 Äquiv.) und Fluorzucker 4b (1,49 g, 2,60 mmol, 1,5 Äquiv.) wurden in Ether kombiniert und konzentriert. Die Mischung wurde durch Verdampfung in trockenem Benzol (25 mL × 2), in Vakuum für 2 Stunden getrocknet, dann mit di-t-Butylpyridin (389 uL, 1,0 Äquiv.) im Handschuh-Schutzsack behandelt und in trockenem Ether (18 mL) unter Stickstoff-Atmosphäre gelöst. In einem separaten 50 mL Gefäß wurden 4A M.S. (4,0g) platziert, dann Flammen-getrocknet unter Vakuum, auf Raumtemperatur gekühlt. Wasserfreies Silberperchlorat (360 mg, 1,0 Äquiv.) und SnCl2 (329 mg, 1,0 Äquiv.) wurden in den Handschuh-Schutzsack zugegeben und mit Stickstoff gespült. Die Salzmischung wurde in ein Wasserbad platziert und es wurde Zuckerlösung über eine doppelt bestückte Nadel eingeführt und die Mischung wurde für 2 Minuten beschallt. Die Reaktion wurde mit Aluminiumfolie umhüllt und für 45 Stunden bei r.t. gerührt. Das Filtrat (200 mL) wurde mit verdünnter NaHCO3 (100 mL × 2) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Blitzchromatographie mit 15-20 % EtOAc/Hexanen ergab eine Ausbeute an Trisacchariden (1,107g, 49%) und unsauberes Lactal. Der Trisaccharid-Teil wurde noch einmal mit 2% Ether-Methylenchlorid chromatographiert, um 879 mg (39%) des gewünschten α-Produkts und 195 mg (8,6%) an β-Produkt zu ergeben. Die unsaubere Lactalfraktion wurde noch einmal mit 3-4% Ether-Methylenchlorid chromatographiert, um 479 mg (36%) sauberes Lactal zu ergeben. 77% Kupplungsausbeute (61 % α-Produkt) beruhte auf zurückgewonnenem Ausgangsmaterial.
    [α]23 D = +41,8° (CHCl3, c = 1,8); IR (CHCl3 Film) 2867, 1648, 1513, 1496, 1453, 1364, 1248, 1097, 735 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,33-7,12 (42H, m) 6,83 (2H, d, J=8,4 Hz), 6,45 (1H, d, J=6,0 Hz), 5,03 (1H, d, J=2,3 Hz), 4,91-4,76 (6H, m), 4,68-4,40 (12H, m), 4,23-3,97 (11H, m), 3,86-3,82 (1H, dd, J=2,3 Hz), 3,76 (3H, s), 3,69-3,64 (2H, m), 3,53 (1H, t, J=8,7 Hz), 3,47-3,43 (1H, m), 3,40-3,36 (1H, m), 3,34-3,31 (1H, dd, J=9,9, 2,8 Hz), 3,22 (1H, dd, J=8,3, 4,8 Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 158,93, 144,59, 138,98, 138,84, 138,78, 138,64, 138,58, 138,06, 138,02 (2C), 130,82, 129,04, 128,33, 128,24, 128,21, 128,15, 128,08, 128,05, 127,83, 127,81, 127,72, 127,64, 127,58, 127,55, 127,50, 127,44, 127,41, 127,36, 127,33, 127,31, 113,65, 103,02, 100,39, 100,01, 80,93, 78,93, 78,70, 76,53, 76,11, 75,14, 74,84, 74,79, 74,35, 73,91, 73,59, 73,36, 73,15, 73,10, 72,98, 72,15, 72,10, 71,99, 70,55, 69,25, 67,92 (2C), 67,69, 55,19.
  • Synthese of 8b:
  • Eine Lösung von PMB-Trisaccharid (37 mg, 0,028 mmol) in CH2Cl2 (1 mL) at 0°°C. Die Reaktion wurde direkt auf eine Siliciumdioxidsäule geladen und mit 20% EtOAc-Hexanen eluiert, um 28 mg (84%) des gewünschten Produkts zu ergeben.
    [ά]23 D = +45,6° (CHCl3, c = 1,78); IR (CHCl3 Film) 2866, 1648, 1496, 1453, 1248, 1097, 735 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,15 (40H, M), 6,43 (1H, d, J=6,2 Hz), 5,09 (1H, d, J=3,3 Hz), 4,85 (1H, dd, J=6,2, 3,6 Hz), 4,83-4,65 (5H, m), 4,61-4,41 (9H, m), 4,29-4,08 (8H, m), 4,02 (1H, d, J=2,6 Hz), 3,97 (1H, d, J=2,2 Hz), 3,93 (1H, t, J=8,4 Hz), 3,86-3,78 (2H, m), 3,67-3,61 (2H, m), 3,53 (1H, dd, J=8,5, 4,8 Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 144,38, 138,78, 138,62, 138,47, (2C), 138,20, 138,00, 137,88, (2C, 128,31, 128,29, 128,23, 128,19, 128,16, 128,05, 127,88, 127,83, 127,62, 127,57, 127,49, 127,45, 127,43, 127,41, 127,37, 127,32, 127,23, 102,68, 99,89, 99,34, 80,82, 78,72, 77,49, 77,10, 75,88, 75,13, 75,03, 74,23, 73,62, 73,05, 73,01, (3C), 72,62, 72,19 (2C), 70,46, 69,66, 68,92, 67,85, 67,74, 67,54.
  • Synthese von 11b:
  • Glycal 9b (4,32 g, 3,14 mmol) wurde in CH2Cl2 (20 mL) gelöst und auf 0°C gekühlt. Es wurde dann mit Dimethyldioxiran (219 ml, 3,14 mmol) bei 0°C behandelt. Die Epoxidation endete innerhalb von 1 Stunde und dann wurde die Reaktionsmischung bis zur Trockenheit unter Verwendung eines trockenen N2-Stroms konzentriert. Der Rückstand wurde weiter einmal mit Benzol (20 ml) azeotropiert und für 30 Minuten bei 0°C in einer Vakuumleitung gehalten, bevor er in THF (60 ml) gelöst und auf –78°C gekühlt wurde. In die obige Lösung wurde über eine Kanüle azeotrop getrocknetes Galactal 10b (3,32 g, 10,95 mmol, 20 ml THF) zugegeben, gefolgt von ZnCl2 (26,3 ml, 1,0 M in Ether). Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Behandlung mit gesättigtem wässrigem Behandlung Na2CO3 (40 ml) wurde die Reaktionsmischung konzentriert und mit Ether (500 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie (1:4 EtOAc-Hexane) gereinigt, um 6,20 g 11b als einen weißen Schaum zu ergeben (87,4%).
    IR (CHCl3 Film) xyz cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,45 (1H, dd, J=6,4, 1,6 Hz), 4,85 (1H, dd, J=6,4, 2,0 Hz), 4,72-4,68 (2H, m), 4,65 (1H, d, J=7,2 Hz), 4,55 (1H, m), 4,21 (1H, m), 4,08 (1H, dd, J=9,6, 5,6 Hz), 3,96-3,82 (6H, m), 3,33 (1H, d, J=3,2Hz, OH), 3,27 (1H, d, J=2,8 Hz, OH), 1,16-1,04 (42H, m); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 154,45, 145,75, 99,14, 98,27, 77,83, 76,59, 74,27, 72,04, 71,62, 70,86, 64,52, 62,57, 61,60, 17,84, 11,78, 11,77; LRMS (NH3) 664 (M + NH4 +, 100), 647 (M + 1+, 5), 422 (21), 380 (25).
  • Synthese von 13b:
  • Disaccharid 11b (2,64 g, 4,08 mmol) wurde drei Mal azeotrop getrocknet (3 × 10 ml) zusammen mit Fluor-Fucose 12b (1,64 g, 3,77 mmol) und Molekülsieben (4 A, 4,0 g) in THF (20 ml) mit 2,6-di-tert-Butylpyridin. Die Lösung wurde durch eine Kanüle einem Behälter zugegeben, der AgClO4 (1,56 g, 7,54 mmol), SnCl2 (1,43 g, 7,54 mmol) und Molekülsiebe (4 Å, 4,0 g) in THF (15 ml) at –40°C enthielt. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Min. bei –40°C gerührt und dann 34 Stunden bei 5°C bis zum Verschwinden von Fluor-Fucose. Nach Behandlung mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 (40 ml) at 5°C wurde die Mischung mit EtOAc (700 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt, um 1,93 g des gewünschten Trisaccharidglycals 13b (48%, auf Basis der verwendeten Fluor-Fucose) und 500 mg des wiedergewonnenen Disaccharids mit nur einer Spur des anderen Monofucosylprodukts zu ergeben.
  • Synthese von 15b:
  • Eine azeotrop getrocknete Mischung des Trisaccharidglycals 13b (1,11 g, 1,05 mmol) und Benzolsulfonamid (0,82 g, 5,24 mmol) wurde in dem THF (20 ml) gelöst zusammen mit Molekülsieben (4 A, 2,6 g). Die Mischung wurde auf –40°C gekühlt und dann wurde durch eine Kanüle eine Lösung von I(sym-coll)2COl4 zugegeben, hergestellt in situ durch Rühren von I2 (0,54 g, 2,09 mmol) mit Ag(sym-coll)2COl4 (0,986 g, 2,29 mmol) in THF (20 ml) bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten, bis zum Verschwinden der braunen Farbe von I2. Die Mischung wurde auf 0°C innerhalb von 1 Stunde erwärmt und für eine weitere Stunde gerührt. Nach Abschrecken mit gesättigtem wässrigem Na2S2O3 wurde die Mischung filtriert und mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem CuSO4 (100 ml), gesättigtem NaCl (100 ml × 2) gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Nach Konzentration wurde das Rohprodukt durch Silicagel-Chromatographie (1:4 EtOAc-Hexane) gereinigt, um 981 mg eines farblosen Öls als eine 2:1 (orig.: "21") Mischung des gewünschten ά-trans-diaxialen Iodsulfonamids und seines cis-Isomers zu ergeben. Die Iodsulfonamid-Mischung wurde dann unter Rühren einem Gefäß zugegeben, das Ethanthiol (226,3 mg, 3,64 mmol) und Lithiumhexamethydisilylazid (1,46 ml, 1,46 mmol) in DMF (10 ml) bei –40°C enthielt. Die Reaktionsmischung wurde bei ~40°C über Nacht gerührt und dann mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 abgeschreckt und mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Nach Konzentration wurde das Rohprodukt durch Silicagel-Chromatographie (3:97 EtOAc-CH2Cl2) gerei nigt, um eine Ausbeute von 438 mg 15b (33%) und 333 mg des intakten cis-Iodsulfonamids zu ergeben.
  • Synthese von 16b:
  • Eine Mischung von Akzeptor Trisaccharid 8b (92 mg, 0,077 mmol, 1,0 Äquiv.), Thioglycosid 15b (198 mg, 2,0 Äquiv.) und frisch aktivierte 4Å MS (560 mg) unter N2 bei r.t. wurde in CH2Cl2-Et2O (1:2, 3,9 mL) suspendiert und für 10 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde auf 0°C gekühlt, dann mit Methyltriflat (52,4 uL, 6,0 Äquiv.) behandelt. Die Reaktion wurde für 4,5 Stunden bei 0°C und für 1,5 Stunden gerührt, während sie auf 15°C erwärmt war. Die Reaktion wurde mit TEA (1,0 mL) abgeschreckt, durch eine Siliciumdioxidkissen gefiltert und mit Et2O gewaschen. Das Filtrat (70 mL) wurde mit gesättigtem NaHCO3 (50 mL × 2) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch HPLC (17% EtOAc in Hexanen, 15 mL/min, 260 nm UV Bestimmung) gereinigt, um 158 mg (85%) des gewünschten Produkts und 27,7 mg von ά-verknüpftem Nebenprodukt (ca. 55% Reinheit) zu ergeben.
    Retentionszeit =22 Min.; [ά]23 D = –13,3° (CHCl3, c = 1,4); IR (CHCl3 Film) 2940, 2865, 1792, 1652, 1454, 1161, 1101, 734 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,8 (2H, m), 7,38-7,06 (58H, m), 6,43 (1H, d, J=6,1Hz), 5,15 (1H, br s), 5,07 (1H, d, J=3,6 Hz), 5,03 (1H, d, J=3,6 Hz), 4,99 (1H, d, J=11,6 Hz), 4,89-4,61 (12H, m), 4,54-4,46 (4H, m), 4,42 (2H, scheinbar s), 4,38 (1H, d, J=11,9 Hz), 4,34-4,26 (3H, m), 4,21-4,18 (4H, m), 4,13-4,03 (7H, m), 3,98-3,76 (14H, m), 3,70-3,61 (4H, m), 3,46-3,27 (7H, m), 2,84 (1H, OH), 1,16 (3H, d, J=6,4 Hz), 1,13-1,02 (42H, m); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 155,35, 144,55, 140,78, 138,99, 138,75, 138,68, xxx, 138,54, 138,43, 138,13, 138,03, 137,94, 137,82, 132,31, 128,81, 128,52, xxx, 128,38, 128,36, 128,27, 128,24, 128,20, 128,16, 128,02, 127,93, 127,72, 127,66, 127,58, 127,48, 127,43, 127,37, 127,20, 103,41, 102,75, 99,79, 99,55, 98,29, 97,76, 80,49, 80,39, 79,09, 78,91, 78,25, 77,68, xxx, 76,51, 75,88, 75,09, 74,99, 74,91, 74,73, 74,15, 74,02, 73,92, 73,52, 73,19, 73,10, 72,94, 72,67, 72,25, 72,07, 71,76, 71,56, 71,33, 70,33, 69,45, 69,32, 68,48, 68,08, 67,86, 67,75, 61,97, 61,60, 56,14, 17,99, 17,96, 17,95, 17,92, 16,75, 11,86; HRMS (FAB) berechnet für C138H169NO30SSi2Na (M + Na) 2432,0920, gefunden 2432,0970.
  • Synthese von 19b:
  • Eine Lösung von Hexasaccharidglycal 16b (85 mg, 0,035 mmol) in THF (6 mL) unter N2 bei r.t. wurde mit TBAF (1,0 M, 353 uL, 10 Äquiv.) behandelt. Nach 38 Stunden bei r.t. wurde die Reaktion auf ca. 1 mL konzentriert, dann in EtOAc (60 mL) gelöst, mit Wasser (30 mL × 2) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und konzentriert. Blitzchromatographie mit 4% MeOH in CH2Cl2 ergab 70,0 mg (98%) des Desilyl-decarbonierten Produkts.
    [ά]23 D = 1,8° (CHCl3 Film) 2868, 1652, 1455, 1157, 1094, 735 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,80 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,47 (2H, d, J=7,2 Hz), 7,37-6,95 (56H, m), 6,45 (1H, d, J=6,3 Hz), 5,86 (1H, br s), 5,35 (1H, d, J=11,6Hz), 5,30 (1H, D, J= 2,8 Hz), 4,95 (1H, d, J=11,3 Hz), 4,89 (1H, d, J= 3,5 Hz), 4,86-4,67 (9H, m), 4,54-4,39 (9H, m), 4,34 (1H, dd, J=10,4, 2,8 Hz), 4,26-4,06 (9H, m), 3,98-3,45 (23H, m), 3,41 (1H, d, J=10,0 Hz), 3,29-3,20 (5H, m), 0,73 (3H, d, J=6,3 Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 144,87, 142,49, 139,49, 139,11, 138,87, 138,63, 138,54, 138,37, 138,00, 137,98, 137,97, 137,18, 131,64, 128,74, 128,52, 128,43, 128,33, 128,28, 128,25, 128,21, 128,02, 127,99, 127,97, 127,80, 127,74, 127,67, 127,63, 127,61, 127,54, 127,53, 127,50, 127,44, 127,33, 127,31, 127,02, 126,86, 103,39, 102,78, 100,75, 100,09, 99,80, 99,75, 81,42, 80,64, 78,98, 78,86, 77,82, 77,40, 77,26, 76,26, 75,16, 75,09, 75,07, 74,95, 74,69, 74,30, 73,58, 73,17, 73,11, 72,71, 72,67, 72,65, 72,55, 72,36, 72,18, 69,65, 69,53, 68,54, 68,18, 68,08, 67,85, 67,79, 67,21, 54,95, 16,60.
  • Zu flüssigem Ammoniak (ca. 8mL) unter N2 bei –78°C wurde metallisches Natrium (95 mg) zugegeben und für 2 Minuten gerührt. Zu der blauen Lösung wurde eine Lösung von obigem Hexasaccharidglycal (70 mg, 33,8 umol) in trockenem THF (2mL) gegeben. Nach 45 Min. bei –78°C (orig.: "78°C") wurde die Reaktion mit absolutem Methanol (4 mL) abgeschreckt. Das meiste Ammoniak wurde mit einem Stickstoffstrom entfernt (Endvolumen betrug ca. 4 mL) und die Reaktion mit Methanol auf ca. 10 mL verdünnt. Zu der Lösung wurde Dowex 50-X8 (890 mg, gewaschen und getrocknet) zugegeben und für 5 Minuten gerührt. Die Lösung wurde filtriert und mit Methanol gewaschen, zuletzt mit ammoniakalischem Methanol (5 mL), und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand und DMAP (2,4 mg) wurden unter N2 platziert und in DMF (1,0 mL), THF (1,0 mL) und TEA (1,0 mL) suspendiert, dann mit Ac2O (0,3 mL) behandelt. Nach 20 Stunden (TLC-Analyse mit EtOAc) wurde die Reaktion in Wasser (40 mL) gegossen und mit EtOAc (40 mL × 2) extrahiert, mit verdünntem NaHCO3 (30 mL) und mit Wasser (30 mL) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und konzentriert. Blitzchromatographie mit 80% EtOAc in CH2Cl2 ergab 52,0 mg (93%) des Produkts als weißen Schaum.
    mp 132-134°C; [ά]23 D = +4,7° (CHCl3, c= 1,4); IR (CHCl3 Film) 1742, 1652, 1371, 1227, 1069 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,68 (1H, d, J=6,8 Hz), 6,42 (1H, d, J=6,0 Hz), 5,58 (1H, d, J=3,2 Hz), 5,47 (1H, d, J=3,4 Hz), 5,40-5,37 (2H, m), 5,29 (1h, dd, J=10,9, 3,1 Hz), 5,25-5,15 (5H, m) 5,06 (1H, dd, J=11,2, 3,3 Hz), 5,02 (1H, d, J=3,6 Hz), 4,99-4,92 (2H, m), 4,84-4,81 (2H, m), 4,67 (1H, d, J=7,8 Hz), 4,56-4,51 (2H, m), 4,45-4,38 (3H, m), 4,29 (1H, dd, J=10,6, 3,4 Hz), 4,22-3,95 (13H, m), 3,90-3,77 (3H, m), 2,19-1,92 (51H, m), 1,15 (3H, d, J=6,4 Hz); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172,40, 171,45, 170,84, 170,54, 170,52, 170,48, 170,45, 170,40, 170,39, 170,34, 170,23, 169,99, 169,82, 169,74, 169,36, 169,00, 145,43, 102,01, 101,17, 98,83, (2C), 98,45, 94,24, 75,65, 74,95, 73,98, 73,64, 73,49, 72,32, 71,84, 71,53, 71,44, 70,81, 70,74, 70,66, 70,12, 69,77, 68,97, 68,71, 68,67, 68,02, 67,97, 67,88, 67,60, 67,35, 64,43, 61,88, 61,81, 61,42, 61,29, 61,04, 56,18, 23,06, 21,02, 20,81, 20,76, 20,68, 20,64, 20,62, 20,58, 20,57, 20,55, 20,49, 20,43, 15,88.
  • Obiges Peracetyl-Hexasaccharidglycal (52 mg) wurde in zwei Portionen aufgeteilt (22 mg und 30 mg). Eine Lösung von Hexasaccharidglycal (22,0 mg, 13,4 umol) in trockenem CH2Cl2 (2 mL) unter N2 bei 0°C wurde dann mit Allylalkohol (5 mL) behandelt. Die Mischung wurde für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiger Allylalkohol wurde im Vakuum entfernt. Die andere Charge (30 mg) wurde ähnlich behandelt. Die Rohprodukte wurden kombiniert und mit 85% EtOAc-CH2Cl2 chromatographiert, um 35,8 mg (66%) weniger polares Produkt und 15,7 mg (29%) polareres Produkt zu ergeben. 33,2 mg (19 umol) des weniger polaren Produkts wurde unter N2 in absolutem MeOH (14 mL) gelöst und mit MeONa-Lösung in Methanol (165 uL, 25Gew.%) behandelt. Nach 6 Stunden wurde die Reaktion mit Dowex 50-X8 (200 mg, gewaschen und getrocknet) neutralisiert, filtriert und konzentriert, um eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung 19b zu ergeben.
    mp 204-206° (Zersetzung); [ά]23 D " +5,5° (MeOH, c = 0,67); IR (MeOH Film) 3356 (br), 2923, 1658, 1374, 1071 cm–1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5,99-5,93 (1H, m), 5,24 (1H, d, J=3,8 Hz), 5,18-5,14 (1H, m), 4,93 (1H, d, J=3,9 Hz), 4,56-4,54 (2H, m), 4,42-4,06 (10H, m), 3,99 (1H, s), 3,91-3,47 (26H, m), 3,41-3,37 (1H, m), 3,27 (1H, t, J=8,8 Hz), 2,01 (3H, s), 1,24 (3H, d, J=6,5 Hz); 13C-NMR (100MHz, CD3OD, Referenz = δ 49,05) δ 174,55, 135,73, 117,57, 105,48, 105,42, 103,94, 103,26, 102,79, 101,08, 81,21, 80,67, 80,05, 79,20, 78,09, 76,79, 76,56, 76,48, 76,44, 76,41, 75,54, 74,86, 74,68, 73,57, 72,63, 72,50, 71,57, 71,16, 70,64, 70,41, 69,68, 68,16, 62,67, 62,64, 62,57, 61,96, 61,63, 53,11, 23,58, 16,78.
  • Zum Zweck der präparativen Synthese von Struktur 1b wurde eine Ceramid-Vorstufe an dem ABC-Trisaccharid befestigt (11). Epoxidation von 7b, gefolgt von Reaktion mit der Ceramid-Vorstufe 17b (als ihr Tributylstannylether) gefördert durch Zn(OTF)2 stellte 20b zur Verfügung. Acetylierung und PMB-Entfernung gingen reibungslos bzw. sanft vonstatten, um 21b zu liefern, welches zum Kuppeln mit einem geeigneten DEF-Trisaccharid-Donor ausbalanciert wurde (orig.: "poised").
  • Wenn Trisaccharid 15b mit MeOTf in Anwesenheit von Akzeptor 21b behandelt wurde, wurde eine 4:1 Mischung von Hexasaccharid-Isomeren erhalten. Das Hauptprodukt 22b wurde mit 50% Ausbeute erhalten.
  • Die Ceramid-Seitenkette wurde durch Reduktion der Azid-Funktionalität unter Verwendung von Lindlar-Katalysator unter einer H2-Atmosphäre in Anwesenheit von Palmitinanhydrid bearbeitet, um direkt 18b bereitzustellen. Desilylierung wurde gefolgt von auflösendem Metall-Entschützen der Sulfonamid- und Benzylgruppen und MeOH-Abschreckung, um die Carbonat- und Acetatgruppen zu entfernen. Peracetylierung der rohen Mischung ergab eine 78% Ausbeute an peracetyliertem Hexasaccharid. Verseifung dieses Materials unter Verwendung von NaOMe stellte das natürliche Produkt 1b mit 96% Ausbeute bereit. Die Kopplungskonstanten und chemischen Verschiebungen der anomeren Protonen von 1b entsprachen berichteten Daten. Zusätzlich wurde das Produkt durch exakte Masse, und 1H und 13C NMR charakterisiert.
  • Synthese von 20b:
  • Die benzylierte Ceramid-Vorstufe (475 mg, 1,14 mmol) wurde in 4 mL PhH gelöst. Bis(tribuylzinn)ether (0,29 mL, 0,34 g, 0,57 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgefäß (ausgestattet mit einer Dean-Stark-Falle) wurde bis zum Rückfluss erwärmt. Nach 3 Stunden ließ man die Reaktion abkühlen und konzentrierte sie unter einem N2-Strom. In einem getrennten Gefäß wurde das Glycal 7b in 1 mL wasserfreiem CH2Cl2 gelöst und die resultierende Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und es wurde eine Lösung von 3,3-Dimethyldioxiran (2,8 mL, 0,25 mmol, 0,09 M in Aceton) zugegeben. Nach 45 Minuten wurde die Lösung unter einem N2-Strom konzentriert, dann unter Vakuum. Der Zinnether wurde in 1 mL wasserfreiem THF gelöst und über eine Kanüle zu einer Mischung aus Zn(OTf)2 (170 mg, 0,468 mmol) in 1 mL THF at –78°C zugegeben (gewaschen 1 × 0,5 mL THF). Man ließ die Reaktion über 12 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen und schreckte diese dann mit destilliertem Wasser ab. Die wässrige Phase wurde 3 × mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Säulen-Blitzchromatographie (3:1 Hexan/EtOAc, 3 × 16 cm Silicagel) ergab 265 mg (66%) der gewünschten Verbindung 20b.
    1H NMR (CDCl3) δ 7,43-7,15 (m, 45H), 7,03 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,79 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,76 (dt, J=6,7, 15,4 Hz, 1H), 5,43 (dd, J=8,5, 15,4 Hz, 1H), 5,07 (d, J=3,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J=12,0 Hz, 1H), 4,90 (d, J=12,9 Hz, 2H), 4,83-4,77 (m, 3H), 4,69 (d, J=12,0 Hz, 1H), 4,61 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,54-4,45 (m, 3H), 4,42-4,25 (m, 7H), 4,18-4,05 (m, 6H), 4,01-3,91 (m, 4H), 3,83 (dd, J=4,4, 10,6 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,71-3,65 (m, 4H), 3,57-3,32 (m, 7H), 3,20 (m, 1H), 2,29 (bs, 1H), 2,11 (bq, J=6,7 Hz, 2H), 1,42-1,29 (m, 22H), 0,91 (t, J=6,6 Hz, 3H); 13C-NMR (CDCl3) δ 158,8, 139,1, 139,0, 138,7, 138,6, 138,34, 138,29, 138,2, 138,1, 130,8, 128,7, 128,55, 128,50, 128,4, 128,33, 128,28, 128,26, 128,12, 128,06, 127,84, 127,76, 127,7, 127,64, 127,60, 127,5, 127,45, 127,36, 125,8, 113,5, 102,7, 100,6, 81,9, 81,5, 79,4, 77,4, 77,0, 76,7, 76,6, 76,4, 75,5, 74,9, 74,7, 74,4, 73,9, 73,3, 73,2, 73,11, 73,06, 72,3, 72,1, 70,0, 69,4, 68,7, 68,1, 67,9, 67,7, 64,2, 55,2, 32,4, 31,9, 29,70, 29,65, 29,5, 29,4, 29,2, 29,0, 22,7, 14,2; IR (Dünnfilm) 3447, 3062, 3029, 2923, 2853, 2099, 1612, 1586, 1514, 1496, 1454, 1364 cm–1; [ά]23 D +25,0 (c 0,70).
  • Synthese von 21b:
  • Das obige Trisaccharid (256 mg, 0,147 mmol) wurde in 2 mL wasserfreiem CH2Cl2 gelöst. Nacheinander wurden Triethylamin (0,105 mL, 76 mg, 0,753 mmol), DMAP (2 mg, 0,02 mmol) und Essigsäureanhydrid (0,042 mL, 45 mg, 0,445 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde für 1 Stunde gerührt, dann mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 abgeschreckt. Die Extrakte wurden mit wasserfreiem MgSO4 getrocknet, filtriert und konzentriert. Reinigung durch Säulen-Blitzchromatographie (4:1 Hexan/EtOAc, 2 × 16 cm Silicagel) ergaben 235 mg (90%) der gewünschten Verbindung.
    1H-NMR (CDCl3) δ 7,42-7,17 (m, 45H), 7,03 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,81 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,75 (dt, J=6,7, 15,4 Hz, 1H), 5,43 (dd, J=8,6, 15,4 Hz, 1H), 5,07 (d, J=3,4, 1H), 4,99-4,90 (m, 4H), 4,85 (d, J=11,3 Hz, 2H), 4,77 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,76 (d, J=12,4 Hz, 1H), 4,70 (d, J=12,0 Hz, 1H), 4,62 (d, J=11,7Hz, 1H), 4,57-4,52 (m, 3H), 4,49-4,34 (m, 7H), 4,30 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,25 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,14-4,06 (m, 7H), 4,01-3,95 (m, 2H), 3,91 (dd, J=5,6, 8,6 Hz, 1H), 3,85 (dd, J=4,3, 11,1, Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,74 (d, J=9,8 Hz, 1H), 3,69 (dd, 7,7, 9,9 Hz, 1H), 3,63-3,51 (m, 5H), 3,43-3,34 (m, 3H), 3,22 (dd, J=4,6, 8,2 Hz, 1H), 2,12 (dd, J=6,8, 13,6, 2H), 1,87 (s, 3H), 1,43-1,30 (m, 22H), 0,93, (t, J=6,6 Hz, 3H); 13C-NMR (CDCl3) δ 169,3, 158,8, 139,1, 139,0, 138,69, 138,65, 138,6, 138,31, 138,26, 138,2, 138,1, 138,0, 130,8, 128,8, 128,6, 128,41, 128,35, 128,30, 128,28, 128,14, 128,0, 127,9, 127,8, 127,64, 127,60, 127,58, 127,51, 127,47, 127,38, 126,0, 113,5, 102,7, 100,8, 100,6, 81,5, 79,9, 79,5, 79,4, 79,3, 77,4, 77,1, 76,8, 75,5, 75,3, 74,9, 74,5, 74,2, 73,9, 73,2, 73,1, 73,0, 72,4, 72,2, 72,1, 70,2, 69,4, 68,1, 68,0, 67,9, 67,5, 63,8, 55,2, 32,4, 32,0, 29,72, 29,67, 29,5, 29,4, 29,2, 29,1, 22,7, 20,9, 14,2; IR (Dünnfilm) 3028, 2923, 2852, 2098, 1751, 1611, 1513, 1496, 1453, 1365, 1232 cm–1; [ά]23 D +20,3 (c 0,45).
  • Das obige Trisaccharid (230 mg, 0,129 mmol) wurde in 4 mL CH2Cl2 gelöst, es wurde destilliertes Wasser (1 mL) zugegeben und die Mischung wurde auf 0°C gekühlt. DDQ (35 mg, 0,15 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 abgeschreckt. Die wässrige Phase wurde 3 × mit CH2Cl2 extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Säulen-Blitzchromatographie (4:1 Hexan/EtOAc, 2 × 16 cm Siliciumdioxid) ergab 182 mg (85%) der gewünschten Verbindung 21b.
    1H NMR (CDCl3) δ 7,38-7,13 (m, 45H), 5,73 (dt, J=6,7, 15,4 Hz, 1H), 5,41 (dd, J=8,6, 15,4 Hz, 1H), 5,09 (d, J=3,2 Hz, 1H), 4,98 (d, J=12,5 Hz, 1H), 4,95 (dd, J=8,0, 9,2 Hz, 1H), 4,87 (d, J=11,2 Hz, 1H), 4,80 (d, J=11,3 Hz, 1H), 4,77 (d, J=10,9 Hz, 1H), 4,70 (d, J=11,4 Hz, 1H), 4,65-4,50 (m, 6H), 4,45-4,42 (m, 3H), 4,38-4,34 (m, 3H), 4,28 (bs, 2H), 4,15 (d, J=11,7 Hz, 1H), 4,11 (d, J=11,8 Hz, 1H), 4,08-4,01 (m, 3H, 3,98-3,94 (m, 3H), 3,88 (dd, J=5,5, 8,5 Hz, 1H), 3,82 (dd, J=4,3, 7,0 Hz, 1H), 3,77 (dd, J=3,1, 10,1Hz, 1H), 3,70 (d, J=9,8 Hz, 1H), 3,64-3,51 (m, 5H), 3,46 (dd, J=5,4, 9,4, 1H), 3,39 (m, 1H), 3,34-3,30 (m, 2H), 3,21 (dd, J=4,7, 8,4 Hz, 1H), 2,09 (m, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,84 (d, J=5,1Hz, 1H), 1,41-1,27 (m, 22H), 0,90 (t, J=6,5 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3) δ 169,3, 165,9, 139,3, 138,7, 138,6, 138,5, 138,3, 138,2, 138,1, 138,0, 128,5, 128,4, 128,32, 128,27, 128,25, 128,17, 128,00, 127,94, 127,91, 127,8, 127,75, 127,70, 127,67, 127,61, 127,55, 127,49, 127,45, 127,21, 125,9, 107,8, 102,6, 100,8, 99,4, 81,4, 80,6, 79,3, 77,5, 77,3, 77,0, 76,9, 76,7, 75,5, 75,3, 75,2, 74,3, 73,2, 73,1, 73,0, 72,9, 72,3, 72,1, 70,1, 70,0, 69,1, 68,1, 68,0, 67,8, 67,4, 63,8, 32,4, 31,9, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 29,2, 29,1, 22,7, 20,9, 14,1; IR (Dünnfilm) 3570, 3087, 3062, 3029, 2924, 2853, 2099, 1950, 1873, 1752, 1496, 1453, 1366, 1231 cm–1; [ά]23 D +17,6 (c 1,40).
  • Synthese von 22b:
  • Thioglycosid 15b (188 mg, 0,151 mmol) und der Akzeptor 21b (125 mg, 0,0751 mmol) wurden azeotrop mit Benzol zwei Mal getrocknet. Die Mischung wurde dann in 2,6 mL wasserfreiem Et2O und 1,3 mL CH2Cl2 gelöst und es wurden zu dieser Lösung 500 mg 4 Å Molekülsiebe zugegeben. Diese Mischung wurde für 1 Stunde gerührt und dann auf 0°C gekühlt und es wurde MeOTf (0,051 mL, 74 mg, 0,45 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 0°C für 9 Stunden gerührt. Triethylamin (1 mL) wurde dann zugegeben und die Reaktion wurde durch eine Siliciumdioxidkissen gefiltert und mit Et2O gewaschen. Das Filtrat wurde dann mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Reinigung mit präparativer HPLC (85:15 Hexan/EtOAc) ergab 108 mg (50%) der gewünschten Verbindung 22b. Das b/a-Verhältnis der Reaktion betrug 4:1.
    1H NMR (CDCl3) δ 7,75 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,46-7,05 (m, 63H), 5,75 (dt, J=6,8, 15,2 Hz, 1HO), 5,43 (dd, J=8,6, 15,5 Hz, 1H), 5,13 (m, 2H), 5,09 (d, 3,6 Hz, 1H), 5,05 (d, J=11,6 Hz, 1H), 5,00 (d, J=11,5 Hz, 1H), 4,94-4,86 (m, 5H), 4,83-4,65 (m, 14H), 4,59 (d, 11,7 Hz, 2H), 4,53-4,43 (m, 6H), 4,39-4,31 (m, 4H), 4,23 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,18 (d, J=11,9 Hz, 1H), 4,15-4,08 (m, 2H), 4,05-3,57 (m, 31H), 3,54 (d, J=9,1 Hz, 1H), 3,49-3,45 (m, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,31-3,23 (m, 3H), 2,92-2,89 (m, 2H), 2,75 (bt, 6,0H, H), 2,12 (bq, J= 6,9 Hz, 2H), 1,85 (s, 3H), 1,20-1,09 (m, 42H), 0,92 (t, J=6,6 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3) δ 169,1, 165,9, 155,5, 140,9, 139,2, 139,0, 138,8, 138,64, 138,59, 138,47, 138,43, 138,3, 138,2, 138,10, 138,07, 138,0, 132,1, 129,1, 128,69, 128,65, 128,56, 128,43, 128,40, 128,36, 128,35, 128,26, 128,17, 128,12, 128,08, 127,97, 127,77, 127,66, 127,64, 127,60, 127,54, 127,49, 127,45, 127,41, 127,3, 126,0, 103,0, 102,7, 100,8, 99,7, 99,2, 98,0, 81,2, 80,6, 79,5, 79,2, 79,0, 78,3, 77,7, 76,8, 76,5, 75,5, 75,3, 75,1, 75,03, 74,97, 74,91, 74,87, 74,0, 73,2, 73,10, 73,07, 72,98, 72,93, 72,6, 72,3, 72,1, 72,0, 71,32, 71,25, 70,2, 69,4, 69,32, 69,25, 68,1, 67,9, 67,5, 68,3, 62,1, 62,0, 56,1, 32,4, 31,9, 29,71, 29,68, 29,66, 29,48, 29,38, 29,2, 29,1, 22,7, 20,7, 18,13, 18,11, 18,01, 17,98, 16,9, 14,2, 11,9; IR (Dünnfilm) 3344, 3030, 2924, 2864, 2101, 1789, 1754, 1496, 1453, 1366, 1232 cm–1.
  • Synthese von 18b:
  • Das Hexasaccharid 22b (66 mg, 0,023 mmol) wurde in 1 mL EtOAc gelöst. Es wurde Lindlar-Katalysator (66 mg) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Palmitinanhydrid (23 mg, 0,046 mmol). Das System wurde unter Vakuum gesäubert (orig.: "purged") und dann unter 1 Atmosphäre H2 gegeben. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion durch ein Siliciumdioxidkissen gefiltert, mit EtOAc gewaschen und konzentriert. Reinigung durch präparative HPLC (4:1 Hexan/EtOAc) ergab 64 mg (90%) des gewünschten Produkts 18b.
    1H NMR (CDCl3) δ 7,72 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,42-7,02 (m, 63H), 5,65 (d, J=9,1 Hz, 1H), 5,62 (dt, J=6,6, 15,3 Hz, 1H), 5,31 (dd, J=8,6, 15,3 Hz, 1H), 5,10 (m, 2H), 5,05 (d, J=3,6 Hz, 1H), 5,02 (d, J=11,5 Hz, 1H), 4,96 (d, J=11,4 Hz, 1H), 4,90-4,62 (m, 13H), 4,57-4,38 (m, 8H), 4,32-4,26 (m, 3H), 4,21-4,07 (m, 9H), 4,01-3,41 (m, 31H), 3,30 (m, 1H), 3,23 (m, 3H), 2,20 (m, 4H), 1,82 (s, 3H), 1,52 (bm, 2H), 1,32-1,19 (m, 53H), 1,15-1,08 (m, 42H), 0,88 (t, J=6,8 Hz, 6H); IR (Dünnfilm) 3531, 3346, 3063, 3030, 2924, 2854, 1790, 1748, 1674, 1496, 1454, 1365, 1236 cm–1; [ά]23 D – 17,9 (c 0,65).
  • Synthese von 1b:
  • Das obige Hexasaccharid (20 mg, 0,0065 mmol) wurde in 0,5 mL THF gelöst. Eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1,0 M in THF, 0,050 mL, 0,050 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion für 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde durch ein Siliciumdioxidkissen gefiltert, mit EtOAc gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde in 1 mL wasserfreiem MeOH gelöst und es wurde NaOMe (10 mg, 0,19 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde für 3 Stunden gerührt, mit 40 mg Dowex-50 Harz neutralisiert, filtriert und konzentriert. Reinigung durch Säulen-Blitzchromatographie (1,5 × 4 cm 10-40 u Silicagel, 95:5 CH2Cl2/MeOH) ergab 16,5 mg (94%) der gewünschten Verbindung.
    1H NMR (CDCl3) δ 7,78 (d, J=7,6 Hz, 2H), 7,46 (d, J=7,4 Hz, 2H), 7,41-6,97 (m, 61H), 6,02 (d, J=9,1 Hz, 1H), 5,76 (bs, 1H), 5,67 (dt, J=6,6, 15,3 Hz, 1H), 5,37-5,30 (m, 2H), 5,19 (d, J=2,6 Hz, 1H), 4,96 (d, J=11,3 Hz, 1H), 4,93 (d, J=3,4 Hz, 1H), 4,90-4,83 (m, 3H), 4,78-4,66 (m, 7H), 4,56 (d, J=11,1 Hz, 1H), 4,53 (d, J=10,2 Hz, 1H), 4,47-4,32 (m, 5H), 4,28-4,06 (m, 14H), 4,01-3,13 (m, 36H), 2,73 (bt, 1H), 2,61 (bs, 1H), 2,54 (bs, 1H), 2,05 (m, 4H), 1,50 (m, 2H), 1,38-1,23 (m, 46H), 0,88 (t, J=6,6 Hz, 6H), 0,78 (d, 6,3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3) δ 173,4, 142,4, 139,5, 139,0, 138,7, 138,5, 138,33, 138,26, 138,14, 138,09, 137,9, 137,2, 137,1, 131,6, 129,0, 128,8, 128,54, 128,47, 128,37, 128,32, 128,27, 128,22, 128,17, 128,14, 128,05, 127,99, 127,79, 127,73, 127,68, 127,63, 127,59, 127,49, 127,46, 127,37, 127,32, 126,98, 126,58, 104,1, 102,83, 102,76, 100,3, 100,2, 82,1, 81,5, 81,2, 79,6, 79,2, 79,0, 78,0, 77,3, 77,0, 76,7, 75,6, 75,3, 75,1, 75,0, 74,8, 74,6, 73,5, 73,4, 73,2, 73,0, 72,7, 72,6, 71,9, 70,1, 69,6, 68,5, 68,2, 68,0, 67,5, 62,4, 61,9, 54,8, 52,3, 36,9, 32,3, 31,9, 29,71, 29,67, 29,54, 29,50, 29,43, 29,37, 29,28, 29,20, 25,7, 22,7, 16,7, 14,1; IR (Dünnfilm) 3424, 3062, 3023, 2923, 2852, 1641, 1530, 1496, 1453, 1362, 1325 cm–1; [ά]23 D –3,2 (c 0,83).
  • Ein Gefäß wurde mit einem Trockeneiskühler ausgestattet und wurde mit 4 mL NH3 beladen. Natrium (18 mg, 0,78 mmol) wurde zugegeben und zu der resultierenden blauen Lösung wurden 29 mg des obigen Hexasaccharids (0,010 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei –78°C für 45 Minuten gerührt. Abschreckung durch die Zugabe von MeOH (3 mL). Es wurde Stickstoff über die Lösung geblasen, um das NH3 zu verdampfen. Die Reaktion wurde mit 170 mg Dowex-50 Harz neutralisiert, filtriert und konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in 1 mL 4:1 THF/DMF gelöst. Triethylamin (0,5 mL) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von DMAP (3 mg) und Essigsäureanhydrid (0,200 mL). Nach 2 Stunden wurde die Reaktion im Vakuum konzentriert. Reinigung durch Blitzsäule (1,5 × 5 cm 10-40 m Siliciumdioxid, 9:1 EtOAc/Hexan) ergab 18 mg (78%) des Peracetats. Ein Probe von diesem Hexasaccharid (15 mg, 0,0065 mmol) wurde in 0,5 mL wasserfreiem MeOH gelöst und es wurde eine NaOMe Lösung (30% in MeOH, 0,010 mL, 0,05 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde für 3 Stunden gerührt, mit 9 mg Dowex-50 Harz neutralisiert, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulen-Blitzchromatographie (1,5 × 4 cm C-18 Umkehrphasen-Siliciumdioxid, MeOH) gereinigt, um 9,6 mg des natürlichen Produkts 1 zu ergeben. Spektraldaten stimmen mit jenen von Hakomori, et al. berichteten überein.
  • Biologische Ergebnisse
  • Das MBR1-Hexasaccharid wurde in zwei Formen hergestellt, der natürlichen "B"-Form und der nicht natürlichen "A"-Form, wie nachfolgend gezeigt wird.
  • Die natürliche Struktur ("β") ist:
    Fuca1→GalB1→GalNAcB1→Galά1→4GlB1→4GcB1→1Cer
  • Die nicht natürliche Struktur "α" ist:
    Fucά1→2GalB1→3GalNAcά1→3Galά1→4GalB1→1Cer
  • Beide wurden mit Ceramid verknüpft, um das Testen auf immunologische Reaktivität mit monoklonalem Antikörper (mAb) MBr1 zu erleichtern.
  • Bei Dünnschicht-Chromatographie (TLC) wandern die 2 Präparate als ähnliche einzelne Banden. Immun-TLC (siehe Ritter, G., et al., Cancer Res. 50, 1403-10 (1990)) zeigt, dass beide Formen mit dem monoklonalen Antikörper MBr1 spezifisch reagieren, dass aber die β-Form 10 Mal stärker bindet (vergleichbare Färbung wird mit 1/10 der Menge an Antigen beobachtet). Das hohe Maß an Reaktivität der β-Struktur mit mAb MBr1 wurde durch Verwendung von Durchflusscytometrie-Inhibierungs-Assays bestätigt. Reaktivität von MAb MBr1 mit Brustkrebs-Zelllinien, wie beispielsweise MCF-7 wurde zu 98% durch 8 μg/ml des β-verknüpften Präparats inhibiert, wurde jedoch nur zu 6% durch 8 μg des α-verknüpften Präparats inhibiert. GD3-Gangliosid (negative Kontrolle) zeigte überhaupt keine Inhibierung.

Claims (22)

  1. Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00810001
    wobei R H und Bn Benzyl ist, welches umfasst: (a)(i) Reagieren einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00810002
    mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind ein Epoxid zu bilden; (ii) Spalten des in Schritt (a)(i) gebildeten Epoxids mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder eine Arylgruppe ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Fluoralkohol zu bilden; und (iii) Alkylieren des in Schritt (a)(ii) gebildeten Fluoralkohols mit einer nicht-nukleophilen Base und einem organischen Halogenid mit der Formel C6H5CH2X, wobei X Br, Cl, I oder F ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00820001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und PMB p-Methoxybenzyl ist; (b) Behandeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00820002
    wobei TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Epoxid zu bilden; und (c) Kuppeln des in Schritt (b) gebildeten Epoxids mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00820003
    wobei Bn Benzyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00820004
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist (d)(i) Alkylieren der in Schritt (c) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen mit einer nicht-nukleophilen Base und einem organischen Halogenid mit der Formel C6H5CH2X, wobei X Br, Cl, I oder F ist; und (ii) Desilylieren der in Schritt (d)(i) gebildeten Verbindung unter geeigneten Bedingungen mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist; (iii) Behandeln der in Schritt (d)(ii) gebildeten Verbindung mit einem Metallalkoxid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Disaccharid zu bilden; und (iv) Alkylieren des in Schritt (d)(iii) gebildeten Disaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein selektiv entschütztes Disaccharid mit der Struktur:
    Figure 00830001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl ist; (e)(i) Kuppeln des in Schritt (d)(iv) gebildeten selektiv entschützten Disaccharids mit der in Schritt (a)(iii) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, ein geschütztes Trisaccharid zu bilden; und (ii) Entschützen des in Schritt (e)(i) gebildeten geschützten Trisaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharid mit der Struktur:
    Figure 00840001
    zu bilden, wobei R H und Bn Benzyl ist.
  2. Verfahren zum Synthetisieren eines Trisaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00840002
    wobei Bn Benzyl ist, welches umfasst: (a) Synthetisieren eines Trisaccharids mit der Struktur
    Figure 00840003
    wobei R PMB (p-Methoxybenzyl) und Bn Benzyl ist; (b)(i) Reagieren des in Schritt (a) gebildeten Trisaccharids mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharidepoxid zu bilden; und (ii) Reagieren des in Schritt (b)(i) gebildeten Trisaccharidepoxids mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00850001
    wobei Bn Benzyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, ein geschütztes Trisaccharidceramid mit der Struktur:
    Figure 00850002
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und PMB p-Methoxybenzyl ist; (c)(i) Acylieren des in Schritt (b)(ii) gebildeten Ceramids unter geeigneten Bedingungen; und (ii) selektives Entschützen der in Schritt (c)(i) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, das Trisaccharidceramid zu bilden.
  3. Verfahren zum Synthetisieren eines Mercaptotrisaccharids mit der Struktur:
    Figure 00860001
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00860002
    wobei TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00860003
    wobei TIPS Triisopropylsilyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Disaccharid mit der Struktur:
    Figure 00860004
    zu bilden, wobei TIPS Triisopropylsilyl ist (b) Kuppeln des in Schritt (a) gebildeten Disaccharids mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00870001
    wobei Bn Benzyl ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Trisaccharid mit der Struktur:
    Figure 00870002
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist (c) Iodsulfonamidieren des in Schritt (b) gebildeten Trisaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Iodsulfonamid mit der Struktur:
    Figure 00870003
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist; und (d) Reagieren des in Schritt (c) gebildeten Iodsulfonamids mit einem Thiolat unter Bedingungen, die geeignet sind, das Mercaptotrisaccharid zu bilden.
  4. Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00880001
    welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00880002
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00880003
    wobei Bn Benzyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00890001
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist (b)(i) Reagieren der in Schritt (a) gebildeten Verbindung mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidepoxid zu bilden; und (ii) Reagieren des Hexasaccharidepoxids mit einem Stannylether mit der Struktur:
    Figure 00890002
    wobei Bn Benzyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, einen Hexasaccharidalkohol zu bilden; (c) Acylieren des in Schritt (b)(ii) gebildeten Hexasaccharidalkohols unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidacetat mit der Struktur:
    Figure 00890003
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist; (d) reduzierendes Acylieren des in Schritt (c) gebildeten Hexasaccharidacetats in Anwesenheit von Palmitinanhydrid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramid zu bilden; (e) Desilylieren des Hexasaccharidceramids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharidceramid zu bilden; (f)(i) Reduzieren des partiell entschützten Hexasaccharidceramids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharidceramidacetat zu bilden; und (ii) Acylieren des entschützten Hexasaccharidceramidacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramidperacetat zu bilden; und (g) Verseifen des Hexasaccharidceramidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Hexasaccharidceramid zu bilden.
  5. Verfahren zum Synthetisieren eines Hexasaccharidceramids mit der Struktur:
    Figure 00900001
    welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00910001
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00910002
    wobei Bn Benzyl ist unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharid mit der Struktur:
    Figure 00910003
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist; und (b)(i) Reduzieren des in Schritt (a) gebildeten Hexasaccharids in Anwesenheit von Palmitinanhydrid unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Palmitoylamid zu bilden; (ii) Desilylieren des Palmitoylamids mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (iii) Entschützen des in Schritt (b)(ii) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (iv) Acylieren des in Schritt (b)(iii) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidceramidperacetat zu bilden; und (v) Verseifen des Hexasaccharidceramidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Hexasaccharidceramid zu bilden.
  6. Verfahren zum Synthetisieren eines Allylhexasaccharids mit der Struktur:
    Figure 00920001
    welches umfasst: (a) Kuppeln einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00920002
    wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist, mit einer Verbindung mit der Struktur
    Figure 00930001
    wobei Bn Benzyl ist, wobei R H ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharid mit der Struktur:
    Figure 00930002
    zu bilden, wobei Bn Benzyl und TIPS Triisopropylsilyl ist (b)(i) Desilylieren der in Schritt (a) gebildeten Verbindung mit R4NF, wobei jedes R unabhängig gleich oder verschieden ist und eine lineare oder verzweigte Kettenalkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, ein partiell entschütztes Hexasaccharid zu bilden; (ii) Entschützen des in Schritt (b)(i) gebildeten Hexasaccharids unter Bedingungen, die geeignet sind, ein entschütztes Hexasaccharid zu bilden; und (iii) Peracylieren der in Schritt (b)(ii) gebildeten Verbindung unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidperacetat mit der Struktur:
    Figure 00940001
    zu bilden (c)(i) Reagieren des in Schritt (b)(iii) gebildeten Hexasaccharidperacetats mit einem epoxidierenden Mittel unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Hexasaccharidepoxidperacetat zu bilden; (ii) Behandeln des in Schritt (c)(i) gebildeten Hexasaccharidepoxidperacetats mit Allylalkohol unter Bedingungen, die geeignet sind, ein Allylhexasaccharidperacetat zu bilden; und (iii) Verseifen des Allylhexasaccharidperacetats unter Bedingungen, die geeignet sind, das Allylhexasaccharid zu bilden.
  7. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00940002
    wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  8. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00950001
    wobei n ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  9. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00950002
    wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger.
  10. Verwendung einer Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00950003
    wobei n eine ganze Zahl zwischen etwa 0 und etwa 9 ist, konjugiert an einen Proteinträger, die wirksam ist, Antikörper zu induzieren, bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind.
  12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Subjekt in klinischer Remission ist, oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  13. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 7 bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind.
  15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Subjekt in klinischer Remission ist, oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  16. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 8 bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Antikörpern in einem humanen Subjekt, die immunreaktiv mit humanen Brusttumorzellen sind.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die induzierten Antikörper MBr1-Antikörper sind.
  18. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Subjekt in klinischer Remission ist oder, wenn das Subjekt chirurgisch behandelt wurde, eine beschränkte nicht-resezierte Erkrankung hat.
  19. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 7 bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt.
  20. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 8 bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt.
  21. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 9 bei der Herstellung eines Medikaments zum Vermeiden des erneuten Auftretens von Brustkrebs in einem humanen Subjekt.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 7, 8, oder 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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