PT970114E - Neoglicoproteínas - Google Patents

Description

ΡΕ0970114 1 DESCRIÇÃO "NEOGLICOPROTEÍNAS" O presente invento refere-se a novos conjugados de poliamida, a processos para a sua preparação e à utilização destes conjugados em composições terapêuticas. 0 aumento da falta de dadores de órgãos para transplantação de humano para humano conduziu a um grande interesse nas possibilidades de xenotransplantantação (transplantação de não humano para humano). A investigação actual está focalizada em animais facilmente acessíveis, tais como o porco, como fonte de órgãos. Contudo, a xenotransplantação de porcos em humanos tem que ultrapassar uma série de obstáculos, sendo o mais imediato e principal destes a rejeição hiperaguda (HAR). A HAR é provocada por anticorpos policlonais "naturais" pré-formados que estão sobretudo dirigidos contra epitopos dos hidratos de carbono da superfície das células contendo estruturas terminais Galai,3Gal (anti-aGal). Adicionalmente, podem também existir outros anticorpos dirigidos contra as estruturas de ácido N-glicolilneuramínico também presentes no endotélio do porco.

Para se conseguir uma sobrevivência a longo prazo do enxerto, são necessárias estratégias relacionadas com os 2 ΡΕ0970114 anticorpos xeno-reactivos. Uma aproximação é a remoção de anticorpos por injecção de ligandos de alta afinidade que podem actuar como inibidores da deposição de anticorpos no tecido transplantado. Outra aproximação é a imunoaférese, um posterior desenvolvimento da plasmaférese, um procedimento clinicamente estabelecido semelhante à diálise. A imunoaférese envolve o tratamento extracorporal do sangue, separando primeiro as células do sangue, e então passagem do plasma através de colunas de imunoafinidade, remistu-rando as células do sangue com o plasma esgotado de anticorpos e reintroduzindo o sangue no doente.

Os conjugados portadores de péptidos são correntemente utilizados como imunogénios ou antigénios de teste. Por exemplo, o documento W092/22318A1 descreve péptidos contendo apenas um único resíduo de lisina possuindo uma cadeia lateral bromoacetilada, que pode ser utilizada para ligar o péptido a qualquer composto contendo tiol, por exemplo, grupos antigénicos, tais como péptidos, açúcares ou polímeros do tipo macromolecular.

Deste modo, existe uma necessidade de ligandos capazes de se ligarem intracorporalmente e de um material de coluna se ligar extracorporalmente a anticorpos xeno-reactivos policlonais com afinidade melhorada. 0 presente invento refere-se a um conjugado de poliamida compreendendo 3 ΡΕ0970114 um grupo xenoantigénico; a ligação a um esqueleto de poliamida em que a estrutura de poliamida compreende, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula Iaa O-

O \ em que -Y-R03a é um grupo de fórmula Vb, Vc, Vd,

Ve ou Vf.

ou 4 ΡΕ0970114

0 conjugado de poliamida pode compreender, adicionalmente, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula II, e a ligação de uma entidade macromolecular ou macroscópica ao esqueleto de poliamina através de y' do elemento estrutural de fórmula II,

O *7* A*' É!

O (IS)

HN em que A' é um grupo ponte trivalente; R1' é uma ligação directa ou alquileno Ci-C6; X1' é -C(0)0-, -C (0) NR-, -NR-, -S- ou -0-; R2' é uma ligação directa ou grupo ponte bivalente; X2' é uma ligação directa ou -0- ou -NR-; em que R é hidrogénio, OH, alquilo C1-C12, alcenilo C2-C12, cicloalquilo C3-C8, cicloalcenilo C3-C8, heterocicloalquilo 5 ΡΕ0970114 C2-C7, heterocicloalcenilo C2“Cn, arilo C6 ou Cio, heteroarilo C5-C9, aralquilo C7“Cl6, aralcenilo Cs-Ci6, com alcenileno C2-C6 e arilo Cô ou Cio, ou diaril C6 ou 0 M O 1 alquilo Ci-C6; e Y' é uma ligação directa ou um grupo ponte bivalente; com a condição de que X1” não é -NR-, -S- ou -0-quando R1' é uma ligação directa.

Quando o esqueleto de poliamida do invento compreende mais do que um elemento estrutural de fórmula Iaa e opcionalmente II, estes elementos podem ser idênticos ou diferentes. Pode ser homopolimérico ou copolimérico, ou copolimérico contendo adicionalmente unidades de comonómero de e.g. outros ácidos aminocarboxílicos. Os esqueletos copoliméricos podem ser polímeros em bloco ou estatísticos. Quando o grupo ponte trivalente é quiral, os esqueletos de poliamida podem ter homogeneamente a configuração L ou D ou conterem elementos estruturais de ambas as configurações, tais como misturas de blocos ou estatísticas, homogéneas, incluindo racematos (1:1 misturas). A soma média dos elementos estruturais do esqueleto de poliamida [n] pode estar na gama de 10 a 10 000, preferencialmente de 50 a 1500, mais preferencialmente de 250 a 1200, muito preferencialmente de 900 a 1200. A polidispersidade pode variar de 1,001 a 2,0, preferencialmente de 1,1 a 1,5, mais preferencialmente de 1,15 a 1,2. 6 ΡΕ0970114

Qualquer radical ou porção alquilo e alquileno pode ser linear ou ramificada. Preferencialmente o alquilo é alquilo Ci-Cis, mais preferencialmente alquilo C1-C4, e pode ser e.g. metilo, etilo, n- ou i-propilo ou n-, i- ou t-butilo. Preferencialmente, o alcenilo pode conter 2 a 7 átomos de carbono. Arilo ou heteroarilo pode ser um anel de 5 ou 6 membros ou um radical biciclico de dois anéis fundidos, um ou mais heteroátomos escolhidos do grupo átomos 0-, N- e S- estando presentes no heteroarilo. Exemplos incluem fenilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, etc. 0 aralquilo tem, preferencialmente, 7 a 12 átomos de carbono e pode ser f anil-alquilo Ci-C6, e.g. benzilo ou fenetilo. Um exemplo de aralcenilo ou cinamilo. A' pode ser um átomo único com, pelo menos, três valências, e.g. C, N ou Si; em particular em que Raa é H, alquilo C1-C6, alcenilo C2-C6, cicloalquilo C3-C7, fenilo ou benzilo. R2' como grupo ponte bivalente pode conter de 1 a 35, preferencialmente, de 1 a 20, particularmente de 1 a 16 átomos de carbono, e.g. alquileno C1-C35, alcenileno C2-C8, alcinileno C2-Cs, cicloalquileno C3-C12, arileno C6-C10 ou aralquileno C7-C35, em que os radicais ou porções alquileno, alcenileno e alcinileno podem ser interrompidos por um ou mais grupos seleccionados de -O-, -S-, -C(O)-, -S02- e -HN- 7 ΡΕ0970114

0 grupo ponte R2' pode, por exemplo, ser conforme a fórmula III -R5-X5-R6-X4-R7- (III) em que cada um de X5 e X4 é uma ligação directa, -0-, -S-, -C (0) -, -C(0)0-, -0C (0) -, -0C(0)0-, -S020-, -oso2-, -0S020-, -NH-, -NHC(O)-, -C(0)NH-, -NHC(0)0-, -0C(0)NH-, -NHC (0) NH-, -NHS02-, -S02NH-, -NHS020-, -0S02NH- ou -NHS02NH-; cada um de R5 e R7, independentemente, é uma ligação directa, alquileno Ci~C2o, cicloalquileno C5 ou Ce, arileno C6-C10 ou aralquileno C7~Ci2; e R6 é uma ligação directa ou alquileno Ci-C2o que é, opcionalmente, interrompido por um ou mais, preferencialmente, 2 átomos de oxigénio; com a condição de que quando R6 é uma ligação directa X4 é também uma ligação directa.

Preferencialmente, R2' pode ser oxialquileno ou polioxialquileno, mais preferencialmente, possuindo de 2 a 4 átomos de carbono, particularmente 2 ou 3 átomos de ΡΕ0970114 carbono, no alquileno e, de 2 a 20, preferencialmente, de 2 a 10, unidades de alquileno, especialmente oxipropileno e polioxipropileno, e.g. polioxipropileno possuindo de 2 a 20, preferencialmente, de 2 a 10, unidades de oxipropileno.

Um conjugado de poliamina compreendendo um grupo xenoantigénico e sem uma entidade macromolecular, macro ou microscópico será, daqui para a frente, referida como "conjugado do Tipo I" e um conjugado de poliamina compreendendo um grupo xenoantigénico e uma entidade macromolecular ou macroscópica será, daqui para a frente, referida como "conjugado do Tipo II".

Em conjugados do Tipo I o grupo xenoantigénico é conjugado com o esqueleto de poliamida através de Y de um elemento estrutural de fórmula Iaa. Os conjugados do Tipo I podem compreender um ou mais, idênticos ou diferentes grupos xenoantigénicos.

Um grupo xenoantigénico pode ser qualquer grupo identificável através de métodos conhecidos, e.g. tal como descrito no documento US 5.695.759, compreendendo o isolamento de xenoanticorpos do sangue humano por perfusão do sangue sobre o material xenoenxertado, e.g. removendo anticorpos ligados do xenoenxerto e utilizando esses anticorpos para analisar epitopos candidatos, e.g. através de um imunoensaio adequado. O grupo xenoantigénico pode, preferencialmente 9 ΡΕ0970114 ser derivado de um oligossacárido terminando com grupo xenoantigénico de D-galactopiranose ligado em α ou ácido N-glicoilneuraminico na sua extremidade de redução.

Tipicamente (e no que respeita aos conjugados do Tipo I e II) o oligossacárido pode consistir de 1 a 20, preferencialmente, de 1 a 15, particularmente, 1 a 10 monómeros de açúcar seleccionados de monómeros de açúcar modificados e que ocorrem naturalmente. Um perito na matéria está familiarizado com os monómeros de açúcar modificados e que ocorrem naturalmente e os oligossacáridos que compreendem estes monómeros de açúcar, a partir de trabalhos correntes de química orgânica ou bioquímica, por exemplo, o Specialist Periodical Reports editado no início pela The Chemical Society e agora pela The Royal Society of Chemistry London, e.g. Ferrier et al. Carbohydrate Chemistry 29 The Royal Society of Chemistry London (1997).

Exemplos de tais monómeros de açúcar incluem D e L-aldopiranoses e D e L-aldofuranoses, por exemplo, gliceraldeído, eritrose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, glucose, manose, gulose, idose, galactose e talose, D e L-cetopiranoses e D e L-cetofuranoses, por exemplo, di-hidroxiacetona, eritrulose, ribulose, xilulose, psicose, frutose, sorbose e tagatose, e também D e L-dicetopiranoses, por exemplo, pentodiulose e hexodiulose. O termo monómeros de açúcar inclui também aqueles 10 ΡΕ0970114 monómeros de açúcar que são modificações dos exemplos listados, por exemplo, desoxiaçúcares parcialmente protegidos ou não protegidos de configurações D e L, preferencialmente, 2-, 3-, 4-, 5- e 6-desoxialdoses, tais como a fucose, ramnose e digitoxose, 1,2-didesoxialdoses, tais como glucal, galactal e fucal, e 1-, 3-, 4-, 5- e 6-desoxicetoses, 2-, 3-, 4-, 5- e 6-desoxiaminoaçúcares de configurações D e L, tal como a glucosamina, manosamina, galactoseamina e ficosamina e desoxiacilaminoaçúcares, tais como a N-acilglucosamina, N-acilmanosamina, N-acilgalac-toseamina e N-acilfucosamina, preferencialmente, os seus ésteres alquilicos Ci-C4. Adicionalmente, estas modificações pretendem significar ácidos aldónicos, aldáricos e urónicos, tais como o ácido glucónico ou ácido glucurónico, e também ácido ascórbico e monómeros de açúcar contendo aminoácidos. Monómeros de açúcar modificados pretendem também significar aqueles que possuem uma cadeia carbonada que tem mais de 6 átomos de carbono, tais como as heptoses, octoses, nonoses, heptuloses, octuloses e nonuloses e também os seus representantes, que são substituídos de acordo com os critérios acima listados, tais como o ácido cetodesoxioctânico, ácido cetodesoxinonânico, N-acilneu-ramínico e ácidos N-acilmuraminico.

Se dois, três, quatro ou cinco dos monómeros idênticos ou diferentes atrás mencionados foram ligados, os sacáridos resultantes são referidos como di, tri, tetra ou pentassacáridos. A ligação é, preferencialmente, a-O-glicosídica ou β-Ο-glicosídica, e.g. ligações (1-^2)-, 11 ΡΕ0970114 (1*3)-, (1^4)-, (1^5)-, (1^6)-, (2^3)- e (2*6)- glicosídicas. Exemplos de dissacáridos são, e.g. trealose, soforose, kojibiose, laminaribiose, maltose, celobiose, isomaltose, gentibiose, sacarose e lactose, e os seus derivados. Exemplos de trissacáridos são a rafinose e a melezitose. Para além disso, os oligossacáridos podem ser ligados através de ligações S-, N- e C-glicosidicas, e.g. -S-, -NR12, -NR12C(0)- ou -CR13R14-, em que R12, R13 e R14, independentemente uns dos outros, são H, alquilo C1-C2, cicloalquilo C5 ou Ce, cicloalquilmetilo ou -etilo C5 ou Ce, fenilo, benzilo ou fenetilo.

De acordo com o invento o esqueleto de poliamida pode compreender, adicionalmente, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VIb

Mais preferidos são os conjugados do Tipo I, compreendendo, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula Iaa, em que -Y-R03a é um grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf e, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VIb.

Nos novos conjugados do Tipo I, o teor dos elementos estruturais de fórmulas Iaa e VIb pode, por 12 ΡΕ0970114 exemplo, ser de 0,1 a 99,9 mol % indo os valores até 100% no caso de conjugados do Tipo I consistindo apenas de elementos estruturais de fórmula Iaa e VIb. No caso dos elementos estruturais de fórmula Iaa o teor pode ser, por exemplo, de 1 a 50%, preferencialmente, de 10 a 30%. No caso dos elementos estruturais de fórmula VIb o teor pode ser de 0 a 99%, preferencialmente, de 70 a 90%.

Os conjugados do Tipo I preferidos são aqueles em que a soma média dos elementos estruturais [n] está na gama de 200 a 300 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2 e a razão dos elementos estruturais de fórmula Iaa [x] é de 5 a 30% ou aqueles em que [n] está na gama de 900 a 1200 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2 e [x] é de 5 a 50%; com uma razão de elementos estruturais de fórmula VIb [z] variando de 45 a 94%; sendo r03s-y- idênticos ou diferentes e seleccionados de grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve e Vf.

Exemplos de conjugados do Tipo I preferidos são aqueles em que: (a) n é 250, [x] é 25% quando R03a-Y- é um grupo de f ó rmu1a Vb; +75% [z]; (b) n é 250, [x] é 8% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +92% [z] ; (c) n é 250, [x] é 16% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +84% [z]; (d) n é 250, [x] é 41% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +59% [z]; 13 ΡΕ0970114 (e) n é 250, [x] é 61% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vb; +39% [z]; (f) n é 250, [x] é 2% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vd; +77% [z]; (g) n é 250, [x] é 22% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vf; +78% [z]; (h) n é 1000, [x] é 24% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +76% [z]; (i) n é 1050, [x] é 21% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +79% [z]; (j) n é 1050, [x] é 28% quando R03a-Y- é um grupo de fórmula Vc; +72% [z]; (k) n é 100, [x] é 25% quando r03s-y- é um grupo de fórmula Vf; +75% [z]; (l) n é 1050, [x] é 27% quando r03s-y- num terço do elemento estrutural de fórmula Iaa é um grupo de fórmula Vb, noutro terço é um grupo de fórmula Vc e ainda noutro terço é um grupo de fórmula Vf; +73% [z]; particularmente os exemplos (i) a (I).

Os novos conjugados do Tipo I são obtidos através de um processo compreendendo a reacção de uma poliamida compreendendo, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VII

em que X3 é halogéneo, obtido e.g. tal como 14 ΡΕ0970114 descrito no documento WO 97/19105, com um tiol de fórmula VIIIa' R3a_Y_SR (VIIIa ' ) em que R3a é tal como definido acima.

Os tióis são quer conhecidos quer podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos, e.g. por reacção de xenoantigénio funcionalizado com amino, e.g. o oligossacárido, com uma tiolactona.

Quando o xenoantigénio é um sacárido, este pode ser preparado de acordo com procedimentos químicos convencionais, utilizando enzimas ou seguindo uma aproximação mista. A utilização de enzimas para a preparação de derivados de oligossacárido é descrita, e.g. no documento WO 97/28173 e WO 97/28174.

Os conjugados do Tipo I compreendendo, adicionalmente, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VIb são obtidos através de um processo compreendendo a reacção de uma poliamida compreendendo, pelo menos, dois elementos estruturais de fórmula VII, com um ou mais compostos selec-cionados do grupo de um tiol de fórmula VlIIa' e um tiol de fórmula IX

Preferencialmente a reacção pode ser realizada na 15 ΡΕ0970114 presença de uma base forte, não nucleofílica, preferencialmente uma base orgânica possuindo, pelo menos, um átomo de azoto terciário; particularmente aminas biciclicas ou policiclicas. Exemplos são a quiniclidina e o 1,8-diazabi-ciclo[5.4.0]undec-7-eno(1,5-5) (DBU). A base pode ser empregue em quantidades, pelo menos, equimolares, preferencialmente com ligeiro excesso. também utilizando que M é um metal A reacção pode realizar-se tiolatos de metais alcalinos R3aSM em alcalino, por exemplo, Li ou Na.

Pode ser utilizado um solvente polar, aprótico, preferencialmente, carboxiimida dialquilada com azoto, lactama, sulfóxido ou sulfona, por exemplo, dimetilforma-mida. A reacção pode ser efectuada quer sem quer com a adição de água, por exemplo, até com quantidades que o polímero permaneça em solução. Os detalhes não limitativos para a preparação de conjugados do Tipo I são descritos nos Exemplos A até Cl.

Os novos conjugados do Tipo I possuem interessantes propriedades. Em particular, estes possuem afinidade em relação aos anticorpos xeno-reactivos policlonais humanos presentes nos fluidos corporais, e.g. sangue e são úteis como ligandos ou agentes de depleção. Preferencialmente, os conjugados do Tipo I são úteis para a depleção intracorporal de xenoanticorpos, compreendendo administração, e.g. através de injecção, infusão ou 16 ΡΕ0970114 perfusão, num receptor de xenoenxerto, antes de e/ou após a transplantação do xenoenxerto, do conjugado do Tipo I. A dosagem pode ser de 0,0001 a 10, preferencialmente, de 0,01 a 5, mais preferencialmente, de 0,2 a 2 mg por kg de peso corporal por injecção. A administração pode ser repetida, tal como requerido, antes da transplantação e/ou após a transplantação, desde que a remoção dos anticorpos é de beneficio terapêutico.

Os novos conjugados do Tipo I podem ser também utilizados como produtos farmacêuticos para induzir tolerância ou anergia em relação aos epítopos xenoantigénicos ou para visar especificamente células B com receptores de xenoantigénio. Quando administrado, e.g. por injecção, num receptor de xenoenxerto antes da transplantação do xenoenxerto, a dosagem de um conjugado do Tipo I pode ser de 0, 0001 a 10, preferencialmente, de 0,001 a 5, mais preferencialmente, de 0,02 a 2 mg por kg de peso corporal por injecção. A administração pode ser repetida, tal como requerido para se alcançar a tolerância.

Os conjugados do Tipo I podem ser administrados como um único conjugado ou como uma mistura de diferentes conjugados do Tipo I ou sob a forma de uma composição adaptada para administração intravenosa, e.g. em conjunto com um ou mais portadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis destes. Uma tal mistura pode compreender conjugados do Tipo I diferindo no que respeita ao esqueleto de poliamida e/ou ao grupo xenoantigénico. 17 ΡΕ0970114 São preferidas as composições em que o conjugado do Tipo I grupos xenoantigénicos idênticos ou diferentes ou composições compreendendo uma mistura de conjugados do Tipo I, compreendendo cada conjugado grupos xenoantigénicos idênticos ou diferentes, sendo os grupos xenoantigénicos derivados de dissacárido, preferencialmente, um grupo de fórmula Ve ou Vf. Preferencialmente, a composição pode compreender um conjugado do Tipo I compreendendo um grupo derivado de dissacárido, um grupo derivado de trissacárido e um grupo derivado de pentassacárido, com uma razão de 5 a 0,1 : 5 a 0,1; 5 a 0,1, preferencialmente, uma razão de 1:1:1 ou uma mistura de conjugados do Tipo I, compreendendo cada conjugado grupos xenoantigénicos idênticos, sendo os grupos xenoantigénicos derivados de um dissacárido, um trissacárido ou um pentassacárido, estando os conjugados presentes na composição com uma razão de 5 a 0,1 : 5 a 0,1; 5 a 0,1, preferencialmente, uma razão de 1:1:1.

De acordo com o precedente o presente invento proporciona ainda: (a) um conjugado do Tipo I para utilização como produto farmacêutico, preferencialmente, como um agente para remover xenoanticorpos de fluidos corporais humanos ou como um ligando para apresentar xenoantigénio na indução de tolerância ou anergia; (b) método para remover anticorpos xenoantigénicos de um receptor de xenoenxertos, método esse que compre- 18 ΡΕ0970114 ende o contacto intracorporal do referido fluido corporal com um conjugado do Tipo I, tal como em a); (c) método para induzir a tolerância ou anergia em relação aos epítopos xenoantigénicos ou para visar especificamente células B com receptores xenoantigénicos num sujeito que necessite de tal tratamento, método esse que compreende a administração, e.g. através de injecção, infusão ou perfusão, a um recipiente de xenoenxerto antes de e/ou após transplantação do xenoenxerto, de uma quantidade eficaz de um conjugado do Tipo I, tal como em (a); (d) composição compreendendo um conjugado do Tipo I, tal como em (a) ou uma mistura de tais conjugados do tipo I, tal como aqui descrito antes para utilizar, preferencialmente, num método para remover xenoanticorpos de um fluido corporal humano ou para induzir tolerância ou anergia em relação a epítopos xenoantigénicos ou para visar especificamente células B com receptores xenoantigénicos.

Nos conjugados do Tipo II o grupo xenoantigénico é conjugado com o esqueleto de poliamida através de Y de um elemento estrutural de fórmula Iaa e a entidade macromo-lecular ou macroscópica é conjugada com o esqueleto de poliamida através de Y' de um elemento estrutural de fórmula II. Os conjugados do Tipo II podem compreender um ou mais grupos xenoantigénicos idênticos ou diferentes. Os conjugados do Tipo II podem compreender uma ou mais entidades idênticas ou diferentes, macromoleculares, macro-, ou microspópicas. Uma única entidade pode ser ligada a uma ou, simultaneamente, a 2 ou mais elementos estruturais 19 ΡΕ0970114 do mesmo esqueleto de poliamida. Alternativamente, uma única entidade pode ser, simultaneamente, ligada a um ou mais elementos estruturais de diferentes esqueletos de poliamida.

Os conjugados do Tipo II podem compreender ainda um ou mais grupos biologicamente activos, idênticos ou diferentes, e.g. radicais derivados de alcaloides, hidratos de carbono, vitaminas, péptidos, proteínas, proteínas conjugadas, lípidos, terpenos, oligonucleótidos, antigénios e anticorpos; ou qualquer outro ligando, que é preferencialmente reconhecido numa forma multivalente pelo seu receptor ou superfície celular. Preferencialmente, o grupo biologicamente activo é derivado de um antigénio, preferencialmente, de um xenoantigénio, mais preferencialmente, de um oligissacárido que termine com uma D-galactopiranose ligada em α ou ácido N-glicoilneuramínico na extremidade de redução, e.g. tal como aqui acima descrito para os conjugados do Tipo I.

Exemplos de entidades macromoleculares e macroscópicas são as proteínas globulares, tais como a albumina do soro ou KLH; polímeros, tais como as poliamidas, poli-imidas, polietilenoglicóis, poliestirenos, poliacrilatos, poliacrilamidas, copolímeros e polímeros em bloco destes, polissacáridos naturais e modificados; esferóides de vidro, sílica gel, terra de diatomáceas e estruturas formadas a partir de agregados ou lípidos reticulados em mono ou bicamadas, ou camadas múltiplas. Se a entidade macromo- 20 ΡΕ0970114 lecular ou macroscópica é um polissacárido este pode consistir de mais de 20 monómeros de açúcar com um peso molecular desde alguns milhares até tão alto como 100 milhões. Um especialista na matéria está familiarizado com os polissacáridos naturais e modificados que diferem na natureza das suas unidades de monossacárido recorrentes, no comprimento das suas cadeias, e no grau de ramificação. Os polissacáridos naturais modificados podem compreender derivados obtidos por reacção de polissacáridos naturais com reagentes ou oxidantes mono-, bi- ou polifuncionais, que podem ser substancialmente modificados em modificações dos grupos hidróxido dos polissacáridos através de reacções que formam éteres ou ésteres ou oxidações selectivas. Particularmente úteis são os polissacáridos reticulados, preferencialmente, ligados tridimensionalmente. Exemplos de de polissacrádiso naturais e modificados são os amidos, celuloses, dextranos e agaroses naturais ou modificados. Particularmente úteis como polissacáridos reticulados, preferencialmente, ligados tridimensionalmente são, e.g. Sephacryl® e Sepharose® e os seus derivados, e.g. CH- Sepharose 4N NHS-activada ou Sepharose 4 Fast Flow NHS- activada (comercialmente disponíveis).

Nos conjugados do Tipo II são preferidos os significados seguintes quer individualmente quer em qualquer combinação ou sub-combinação, (a) Y' é um grupo de fórmula III em que R5 é uma ligação directa, X5 é -NH-, R6 é - [ (0¾) 2O] 2 (CH2) 2-, X4 é -NHC(O)-, e R7 é alquileno C1-C6, 21 ΡΕ0970114 preferencialmente, Y' é um grupo de fórmula Illb -NH- [ (CH2) 20] 2 (CH2) 2NHC (0) (CH2) 3- (Illb) em que com respeito à fórmula II -(CH2)3- está ligado a S; (b) a entidade macromolecular ou macroscópica, daqui para a frente referida como R4 é, preferencialmente, derivada de um polissacárido natural ou modificado, mais preferencialmente, de celulose, agarose ou sefarose, particularmente de CH-Sepharose 4B NHS-activada ou Sepharose 4 Fast Flow NHS-activada, muito preferencialmente, de Sepharose 4 Fast Flow NHS-activada.

Particularmente preferidos são os conjugados do Tipo II, em que R4-Y'- é um grupo de fórmula Vg

Um subgrupo preferido são conjugados do Tipo II compreendendo, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula II* 22 ΡΕ0970114 em que A, R1, X1, R2, X2 e Y são tal como definidos acima e R4 é uma entidade macromolecular, macroscópica, mais preferencialmente, um elemento estrutural de fórmula Ilal,

muito preferencialmente um elemento estrutural de fórmula lia

(Me) em que -Y'-R04 é um grupo de fórmula Vg.

De acordo com o invento o esqueleto de poliamida dos conjugados do Tipo II pode compreender, adicionalmente, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VIb com todos os significados e preferências como acima.

Particularmente preferidos são os conjugados do Tipo II compreendendo, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula I**, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula II* e, pelo menos, um elemento estrutural de 23 ΡΕ0970114 fórmula VI, em que A', R1 , X1 , R2 , X2 , Y', R3 e R4 possuem os significados e preferências como acima.

Os mais preferidos são os conjugados do Tipo II compreendendo, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula Iaa, em que -Y-R03 é um grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula lia e, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula VIb.

Nos novos conjugados do Tipo II o teor de elementos estruturais de fórmulas I**, II* e VII pode ser, por exemplo, de 0,1 a 99,9 mol%, indo os valores até 100% no caso dos conjugados do Tipo II consistindo apenas de elementos estruturais de fórmulas I**, II* e VI. No caso dos elementos estruturais de fórmula I** o teor pode, por exemplo, ser de 1 a 50%, preferencialmente, de 10 a 30%. No caso dos elementos estruturais de fórmula II*, o teor pode ser, por exemplo, de 0,1 a 20%, preferencialmente, de 0,1 a 5%. O caso dos elementos estruturais de fórmula VI, o teor pode ser de 0 a 98,9%, preferencialmente, de 50 a 98,9%. Exemplos de razões úteis são descritos na tabela seguinte:

Elemento I * * (%) 25 13 14 23 20 21,5 16 12,5 16 Elemento II* (%) 2 2, 6 2, 6 3 3 2 2,5 2,5 2,5

Os conjugados do Tipo II preferidos são aqueles em que a soma média de elementos estruturais [n] está na gama de 200 a 300 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2, a razão de elementos estruturais de fórmula Ia [x] em que 24 ΡΕ0970114 03 / R -Y- e um grupo seleccionado de um grupo constituído por grupos de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve e Vf é de 5 a 30% e a razão de elementos estruturais de fórmula Ilb (intermediário do elemento estrutural de fórmula lia, ver abaixo) [y]

em que Z-Y'' é H2N[(CH2)20] (CH2)2NHC(0) (CH2)3- é de 1 a 5%; ou aqueles em que [n] está na gama de 900 a 1200 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2, [x] é de 5 a 50% e [y] é de 1 a 5%; com uma razão de elementos estruturais de fórmula VIb [z] variando de 45 a 94%.

Exemplos de conjugados do Tipo II preferidos são aqueles em que (a) n é 250, x é 25% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Vc e y é 2%; +73% [z]; (b) n é 250, x é 14% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Vc e y é 2,6%; +83,4% [z]; (c) n é 1050, x é 13% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Vc e y é 2,6%; +84,4% [z]; 25 ΡΕ0970114 (d) n é 1050, x é 16% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Vb e y é 2,5%; +81,5% [z]; (e) n é 1050, x é 12,5% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Vf e y é 2,5%; +85% [z]; (f) n é 1050, x é 16% quando R3-Y- é um grupo de fórmula Ve e y é 2,5%; mais 81,5% [z];

Particularmente os exemplos (c) a (f).

Os novos conjugados do Tipo II são obtidos através de um processo compreendendo a reacção de uma poli-amida compreendendo, pelo menos, dois elementos estruturais de fórmula VII, tal como acima, com um ou mais compostos ou entidades seleccionados do grupo de um tiol de fórmula VIII R3-Y-SH (VIII) em que R3 e Y são tal como definidos acima, um tiol de fórmula VIIIa Z-Y''-SH (VlIIa) em que Y'' é um grupo ponte de fórmula III em que R5 é uma ligação directa e os outros significados são tal como definidos acima, e Z é hidrogénio ou um grupo protec-tor de X4, preferencialmente, um grupo protector amino, e uma entidade macromolecular ou macroscópica apropriadamente derivatizada. 26 ΡΕ0970114

Os conjugados de poliamida compreendendo um elemento estrutural que resulta da reacção de um elemento estrutural de fórmula VII com um tiol de fórmula VlIIa pode, após eliminação do grupo Z protector, ser convenientemente ainda feito reagir com um tiol de fórmula VIII ou uma uma entidade macromolecular ou macroscópica apropriadamente derivatizada. 0 termo "entidade macromolecular ou macroscópica apropriadamente derivatizada" deve ser entendida como referindo-se a uma entidade macromolecular ou macroscópica tendo, pelo menos, um grupo funcional adequado para reagir com um elemento estrutural de fórmula Ilb. Exemplos de grupos funcionais úteis para a ligação de grandes entidades são conhecidos pelos especialistas na matéria e descritos e.g. por exemplo, em Gabius and Gabius (Eds.) Lectins and Câncer 53ff, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg (1991). Exemplos são amina/carboxilato activado (éster N-hidroxi-succinimidílico, éster pentafluorofenílico), amina/epóxido, amina/isocianato, amina/isotiocianato, receptor de Michael amina (maleimida), tiol/tiofil e amina/aldeido. A entidade macromolecular ou macroscópica derivatizada pode ser preparada por reacção de uma entidade macromolecular ou macroscópica com agentes de ligação bifuncionais conhecidos.

Os tióis de fórmulas VIII e VlIIa podem ser 27 ΡΕ0970114 obtidos tal como descrito acima para os tióis de fórmula VlIIa' .

Os conjugados do Tipo I compreendendo adicionalmente um elemento estrutural de fórmula VIb são obtidos através de um processo que compreende a reacção de poli-amida compreendendo, pelo menos, três elementos estruturais de fórmula VII, com um ou mais compostos ou entidades seleccionados dos tióis de fórmula VIII ou VlIIa, uma entidade macromolecular ou macroscópica apropriadamente derivatizada e um tiol de fórmula IX acima. Em particular, o processo pode compreender a reacção de uma poliamina compreendendo, pelo menos, três elementos estruturais de fórmula VII, com um ou mais compostos ou entidades seleccionados de tióis de fórmulas VIII, VlIIa e IX acima, eliminado o grupo protector Z e ainda fazendo reagir o composto resultante com uma entidade macromolecular ou macroscópica apropriadamente derivatizada.

As condições reaccionais podem estar de acordo com as condições reaccionais que foram descritas para os conjugados do Tipo I acima.

Os detalhes não limitativos para a preparação de conjugados do Tipo II, são descritos nos Exemplos A a D.

Os novos conjugados do Tipo II possum propriedades interessantes. Em particular estes possuem afinidade pelos anticorpos xeno-reactivos policlonais humanos e são 28 ΡΕ0970114 úteis como adsorventes em cromatografia de afinidade de fluidos corporais. Preferencialmente, o fluido corporal é o sangue, particularmente o plasma sanguíneo.

Preferencialmente, os conjugados do Tipo II são utilizados para remoção extracorporal de anticorpos de um fluido corporal, compreendendo a recolha de fluido corporal contendo anticorpo de um receptor de xenoenxerto antes de e/ou após transplantação do xenoenxerto, removendo anticorpos pré-formados do fluido através de cromatografia de afinidade compreendendo os conjugados do Tipo II como adsrovente, e reintrodução do fluido corporal sem anticorpo no receptor. A cromatografia de afinidade pode, preferencialmente, ser realizada como cromatografia em coluna em que a coluna é cheia com o conjugado Tipo II de maneira conhecida pelos peritos na matéria e descrita, e.g. no documento US 5.149.425, cujos conteúdos no que respeita ao enchimento, armazenamento e utilização de tais colunas são incorporados como referência.

Os conjugados do Tipo II podem ser utilizados como conjugados únicos ou em misturas de diferentes conjugados do Tipo II ou sob a forma de uma composição adaptada da cromatografia de afinidade. Uma tal mistura pode compreender conjugados do Tipo II que diferem no que respeita ao esqueleto de 29 ΡΕ0970114 poliamida, entidade macroloecular ou macro- ou microscópica e/ou ao grupo antigénico. São preferidas as composições em que os conjugados do Tipo II compreendem grupos xenoantigénicos idênticos ou diferentes ou composições compreendendo uma mistura de conjugados do Tipo II compreendendo cada conjugado grupos xenoantigénicos, idênticos ou diferentes, sendo os grupos xenoantigénicos derivados de um dissa-cárido, preferencialmente, um grupo de fórmula Vb, de um trissacárido, preferencialmente, um grupo de fórmula Vc ou Vd, ou de um pentassacárido, preferencialmente, um grupo de fórmula Ve ou Vf. 0 método para remover os anticorpos dos fluidos corporais do doente pode ser realizado de acordo com métodos conhecidos, e.g. tal como descrito no documento US 5.695.759. As temperaturas de contacto preferidas podem estar na gama de 5°C a 40°C, preferencialmente, de 25 °C a 40°C. 0 fluido corporal pode ser directamente reintroduzido continuamente ou este pode ser recolhido e então reintroduzido. 0 método pode ser repetido como requerido antes da transplantação e/ou após transplantação, desde que a remoão dos anticorpos seja de beneficio terapêutico.

De acordo com o precedente o presente invento compreende ainda: (a) um conjugado do Tipo II para utilização 30 ΡΕ0970114 preferencialmente, como adsorvente na cromatografia de afinidade do fluido corporal; (b) método para remover anticorpos de um fluido corporal humano, método esse que compreende o contacto extracorporal do referido fluido corporal com um conjugado do Tipo II, tal como em (a) e reintrodução do fluido corporal no corpo do paciente; (c) uma composição compreendendo um conjugado do Tipo II, tal como em (a) ou uma mistura de tais conjugados do Tipo II, tal como aqui descrito atrás para utilização, preferencialmente, num método para remover xenoanticorpos de um fluido corporal humano; e (d) um cartucho de cromatografia de afinidade compreendendo como adsorvente um conjugado do Tipo II ou uma mistura destes ou uma composição tal como em (c).

Os exemplos seguintes ilustram o invento sem limitação. São utilizadas as abreviações seguintes nos exemplos: Ac: acetilo; Bn: benzilo; Bz: benzoílo; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DMF: N,N-dimetilformamida; DMTST: trifluorometilsulfonato de dimetil-metiltio-sul-fónio; eq: equivalente (s); GlcNAc: N-acetilglucosamina; n: graus de polimerização; Sepharose 4 fast flow: Sepharose 4 fast flow NHS-activada (Pharmacia Biotec); TESOTf: tri-fluorometanossulfonato de trietilsililo; UDP-Gal: uridino-0 ( 6)-difosforil-a-D-galactose; RT: temperatura ambiente. 31 ΡΕ0970114

Os pesos moleculares médios (M) e as poli-dispersidades dos bromidratos de polilisina que são comercialmente disponibilizados pela SIGMA são determinados por meio de medições de viscosidade e SEC-LALLS (cromato-grafia de exclusão por dimensões/varrimento de luz laser de baixo ângulo) dos derivados de succinilo dos compostos. A Preparação de compostos de partida

Exemplo Al: Preparação de 0-(2,3,4,6-tetra-0-benzil-a-D-galactopiranosil)-(l->3) -0-(4-0-acetil-2,6-di-0-benzoil-l-tio-p-D-galactopiranósido) de etilo 3

0 4-0-acetil-2,6-di-0-benzoil-l-tio^-D-galacto-piranósido de etilo 1 é preparado em analogia com o derivado metiltio [Garegg e Oscarson, Carbohyd. Res. 136: 207-213 (1985)] e dissolvido (2,12 g, 4,47 mmol) em éter dietí-lico seco (40 ml) e em diclorometano seco (25 ml). 1 ml de uma solução de TESOTf (225 μΐ) em éter dietílico seco (10 ml) é adicionado, a -25°C, sob atmosfera de árgon. Uma solução de tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-0-benzil-p-D-galactopiranosilo 2 [750 g, 11,18 mmol; preparado de acordo com Wegmann e Schmidt, J. Carb. Chem., 6: 357-375 (1987)] em éter seco (22 ml) e diclorometano seco (11 ml) é 32 ΡΕ0970114 então adicionado, a -25°C, durante 7 min. Após agitação durante 10 min, a -25°C, é adicionado NaHCCh (10%) (50 ml) e a agitação vigorosa é continuada durante 10 min. É adicionada água (100 ml) e a fase orgânica é separada. A fase aguosa é extractada duas vezes com diclorometano (80 ml cada), as fases orgânicas são lavadas com água (100 ml) e solução saturada de água salgada (100 ml) , seca-se com MgS04 e os solventes são evaporados sob pressão reduzida. Cromatografia do produto em bruto (10,25 g) em sílica gel (700 g) com hexano/acetato de metilo (5:1) como eluente originou 0-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)-(1-^3)-O-(4-0-acetil-2,6-di-0-benzoil-l-tio-p-D-galacto-piranósido) de etilo 3.

Exemplo A2: Preparação de (3-benziloxicarbonil-amino)-propil-6-0-benzil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-β-D-glucopiranósido 14 CH, O.. ►' ” o V„ 'Mii n iiiii / α -.1 Π 41 (a) 12,55 g (20,4 mmol) de 1,3,4,6-tetra-O-ace- til-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-D-glucopiranose 9 preparada de acordo com Castro-Palomino e Schmidt [Tetrahedron Lett. 36: 5343-5346 (1995)] é tratada com HBr 4,1 M em 33 ΡΕ0970114 ácido acético (35 ml). Após agitação, durante 18 h, à RT, a mistura é cuidadosamente adicionada a CHCI3 (50 ml) e NaHCCg aquoso (10%) (400 ml) sob arrefecimento com gelo e agitação. Neutralização (pH 7) com NaHCC>3 a 10% é seguida por extracção com CHCI3 (3 vezes 150 ml) . As fases orgânicas foram lavadas com solução saturada de água salgada (200 ml) , secou-se (Na2S04) e o solvente é evaporado sob pressão reduzida, originando l-bromo-3,4,6-tri-0-acetil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-D-glucopiranose 10 em bruto, que é utilizada nas reacções subsequentes sem purificação. (b) 3-benziloxicarbonilamino-l-propanol (8,61 g, 41,3 mmol) e cianeto mercúrico (10,45 g, 41,3 mmol) são adicionados a uma solução de 10 em bruto (13,15 g) em 165 ml de tolueno seco. A suspensão é agitada durante 18 h, filtrada através de um tampão de algodão, e o solvente é evaporado sob pressão reduzida. A cromatografia do resíduo em sílica gel (1,3 kh) com hexano/acetato de etilo (2:1) como eluente origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-3, 4, 6-tetra-0-acetil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-p-D-glucopiranósido 11. (c) 2,4 ml de uma solução de sódio (820 mg) em metanol seco (40 ml) é adicionada a uma solução de acetato 11 (8,18 g, 10,7 mmol) em metanol seco (220 ml). A mistura é agitada à RT, durante 15 min e subsequentemente tratada com Amberlite 15 H+ (2,8 g) , durante 15 minutos. Filtração e evaporação do solvente e pressão reduzida origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-2-desoxi-2-tetracloroftali-mido^-D-glucopiranósido 12. 34 ΡΕ0970114 (d) Mono-hidrato do ácido p-toluenossulfónico (96 mg) é adicionado a uma solução 12 em bruto (6,46 g) em acetonitrilo (60 ml) e a, a' -dimetoxitolueno (2 ml). Após agitação, durante 15 min, à RT, a mistura é diluída com acetato de etilo (350 ml) e extractada com NaHCCh aquoso a 10% (180 ml) seguido de solução salina saturada (180 ml). A fase orgânica é seca com Na2S04 e os solventes são evaporados a pressão reduzida. A cromatografia do resíduo (6,63 g) em sílica gel (800 g), eluindo com hexano/acetato de etilo (2:1), origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-4,6-di-0-benzil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-p-D-glucopiranósido 13. (e) Peneiros moleculares de 4 Â (10 g) e NaCNBH3 (2,91 g, 46, 35 mmol) são adicionados a uma solução de acetal 13 (3,74 g, 5,15 mmol) em THF seco (150 ml), a 0°C, sob atmosfera de azoto. Sob agitação HC1 etéreo é adicionado até se formar espuma. No espaço de 1,5 horas mais duas porções de HC1 etéreo saturado (5 ml cada) são adicionados e a agitação, a 0°C, é continuada durante 18 h. Três porções adicionais de 5 ml de HC1 étereo são então adicionados ao longo de 90 minutos deitando a mistura em água gelada (250 ml) após 45 min. O balão é aspergido com diclorometano e a mistura é agitada durante 10 min. Filtração (Celite) é seguida por extracção com CH2CI2. A fase aquosa é extractada uma segunda vez com CH2CI2 (100 ml) e as fases orgânicas são lavadas com solução salina 35 ΡΕ0970114 saturada (300 ml) , secas com Na2SC>4, e os solventes são removidos sob pressão reduzida. Cromatografia do residuo (5,03 g) em silica gel (60 g) e eluição com hexano/acetato de etilo (1:1) origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-6-0-benzil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-p-D-glucopiranósido 14. 1R RMN (400 MHZ, CDC13) : 1,5-1,8 (m, CH2) ; 3,0-3,25 (m, NCH2, OH); 3,40 (b, OH); 3,5-3, 6 3 3,77-3, 87 (2m, OCH2) ; 3,55-3, 65 (m, H-C (4)-C (5) ) ; 4,05-4,17 (m, H-C(2)); 4,2-4,3 (M, H-C (3)); 4,50 e 4,57 (2d, J = 12, OCH2C6H5) ; 4,9-5,05 (m, C (O) OCH2C6H5) ; 5,1-5,2 (m, NH) ; 5,15 (d, J= 8, H-C(l)); 7,2-7,4 (m, 2 CeH5) . A identificação dos picos é baseada numa correlação 1H/1H bidimensional (COSY) e numa correlação 1H/13C de espectroscopia (HSQC).

Exemplo A3: Preparação de (3-acetamidoamino)-propil-O- (α-D-galactopiranosil) - (l->3) -O- (β-D-galactopi-ranosil) - (1-^4) -O- (2-desoxi-2-acetamido-|5-D-glucopiranó-sido A5

ΟΝ. ..tfHAc X*» (AS) 30: 2)

Uma solução de 8 (13 mg, 0,0216 mmol) , preparada de acordo com o exemplo A9e, N-acetoxissuccinamida (3,4 mg, 0,0324 mmol), e diisopropiletilamina (7,3 μΐ, 0,0432 mmol) em DMF (1 ml) é agitada, durante 15 h, à RT. Evaporação de solventes sob pressão reduzida e cromatografia (5 g de silica gel, clorofórmio/metanol/água = 30 36 ΡΕ0970114 originou A5; RMN (400 MHZ, D20) , sinais seleccionados: 1.6- 1,75 (m, OCH2CH2CH2NH) ; 2,90 e 2,95 (2s, 2 NH-COCH3) ;

3,02-3,12 e 3,12-3,22 (2m, O (CH2) CH2NH) ; 4,43 e 4,47 (2d, J = 8, H-C(l), H-C(l')); 5,08 (d, J = 4, H-C(l*)).

Exemplo A4: Preparação de tricloroacetimidato de 3.4.6- tri-0-acetil-2-desoxi-2-ftalimido-a-D-glucopiranosi-lo (37) !||Í||!1! (37) NTGP j[

NH (a) A uma solução de 10 de acordo com o exemplo A2a (12,3 g, 18,73 mmol) em acetona (175 ml) é adicionada água (55 ml). Após agitação, durante 18 h, à RT, o solvente é evaporado e a solução aquosa residual é extractada com tolueno (3 x 100 ml) . A cromatografia do resíduo das fases orgânicas (sílica gel 500 g, CH2C12 & 2% CH3OH) origina 3,4, 6-tri-0-acetil-2-desoxi—2-ftalimido-D-glucopiranose (36) (pr incipalmente o anómero β) . (b) A uma solução de 36 (4,0 g, 6,98 mmol) e tricloroacetonitrilo (4,2 ml, 14,88 mmol) em CH2C12 (25 ml) é adicionado 18 g de K2CO3 seco em pó finamente dividido. Após agitação, durante 60 min, à RT, a mistura é filtrada através de Celite®. Cromatografia (sílica gel, 500 g, hexano/acetato de etilo = 2:1) origina 37 (anómero β). 37 ΡΕ0970114

Exemplo A5: Preparação de (3-benziloxicarbonil-amino)-propil-O-(2,6-di-0-benzoil-p-D-galactopiranosil)-(1-^4)-0-(2,3,6-tri-0-benzoil-p-D-glucopiranósido) 35 ,o

Si

MO 08* 0 06í

(a) A uma suspensão de lactose seca 28 (100 g, 0,28 mol) em piridina (500 ml) é adicionado, gota a gota, cloreto de benzoílo (520 ml, 5,0 mol), a 0°C e sob agitação mecânica. Após adição de 4-(N,N-dimetilamino)piridina a mistura é agitada, à RT, durante 3 dias e a 100°C, durante 2 dias adicionais. A mistura reaccional é então deitada em água gelada e extractada com acetato de etilo. A fase orgânica é lavada com uma solução saturada de NaHCCb e solução salina. Secagem com Na2So4, evaporação de solventes, e co-evaporação de piridina com tolueno origina 0-(2,3,4, 6-tetra-0-benzoil-p-D-galactopiranosil)- (l->4) -O- (1,2,3, 6-tetra-O-benzoil-D-glucopiranose) em bruto (29) como mistura anomérica. (b) 29 (150 g, 0,127 mol) é dissolvido em diclo-rometano (500 ml) e é adicionado HBr 4,1 M em ácido acético (100 ml) a -10°C. A mistura é lentamente aquecida até à RT e a conversão é monitorizada por TLC (éter de petróleo/ace-tato de etilo = 3:1) . Após se ter completado a mistura é cuidadosamente neutralizada com NaOH 4N e então deitada em água gelada. Extracção com acetato de etilo, lavagem dos 38 ΡΕ0970114 extractos com uma solução saturada de NaHCCd, solução salina, e água, evaporação dos solventes, e secagem do resíduo com alto vácuo origina 0-(2,3,4,6-tetra-0-benzoil-β-D-galactopiranosil)- (1-^4) -0-(l-desoxi-l-bromo-2,3,6-tri-O-benzoil-a-D-glucopiranose)(30). (c) 30 (18,9 g, 16,7 mmol) e N-benziloxicarbo- nilpropanolamina (7,0 g, 33,5 mmol) são dissolvidos em tolueno (abs., 150 ml) sob atmosfera de Ar. São adicionados com agitação Hg(CN)2 (8,45 g, 33,45 mmol) e HgBr2 (1,21 g, 3,35 mmol). A mistura é agitada à RT durante 18 h, e então filtrada com Celite® e o resíduo é purificado por croma-tografia "flash" (eluente tolueno/n-hexeno/acetato de etilo 5:5:2, v/v) para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-0-benzoil-p-D-galactopiranosil)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-0-benzoil-p-D-glucopiranósido) (31). (d) 31 (16,3 g, 12,9 mmol) é dissolvido, sob atmosfera de Ar, à RT, em metanol (abs. 90 ml). Uma solução acabada de preparar de NaOMe em metanol (IN, 3,9 ml) é adicionada e a solução é agitada durante 16 h. Então foi adicionada uma solução de NaOMe adicional (3,9 ml) e a agitação continua durante mais 7h. A mistura é neutralizada com ácido acético e evaporada. O resíduo é purificado através de cromatografia "flash" (eluente CH2Cl2/MeOH 2:1, v/v) para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(β-D-galactopiranosil)- (1->4) -O-(p-D-glucopiranósido) (32) . (e) A uma solução de 32 (6,5 g, 12,18 mmol) em 39 ΡΕ0970114 acetona (500 ml) é adicionado ácido p-toluenossulfónico (770 mg, 4,06 mmol) à temperatura de refluxo. Após 20 min, a reacção é terminada com uma solução de NaHC03 (10%) e o solvente é evaporado. O resíduo é extractado várias vezes com diclorometano, lavado com água, seco e evaporado. O produto em bruto é purificado por cromatografia "flash" (eluente acetato de etilo/metanol 9:1, v/v), para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(β-D-galactopiranosil) -(1-^4)-0- (β-D-glucopiranósido) 32. (f) A uma solução de 33 (2,2 g, 3,84 mmol) em

piridina (abs. 60 ml) é adicionado, gota a gota, cloreto de benzoílo (6,68 ml, 57,6 mmol) com agitação, à RT, sob atmosfera de árgon. A solução é agitada durante 16 h. A mistura é evaporada e redissolvida em diclorometano. A fase orgânica é lavada várias vezes com HC1 IN, água e neutralizada com uma solução de NaHCCq (10%). Após secagem o solvente é evaporado, e o resíduo é purificado por cromatografia "flash" (eluente tolueno/acetona 15:1, v/v) para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,6-di-O-benzoil-3,4-di-0-isopropilideno^-D-galactopiranosil)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-O-benzoil-β-D-glucopiranósido) (34). (g) Uma suspensão de 34 (3,4 g, 3,11 mmol) em ácido acético/água (60 ml, 4:1, v/v) é aquecida sob atmosfera de árgon, a 100°C, durante 40 min. A mistura é arrefecida à RT e evaporada. O resíduo é co-evaporado várias vezes com tolueno, e purificado por cromatografia "flash" (eluente tolueno/acetona 5:1, v/v) para originar (3- 40 ΡΕ0970114 benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,6-di-O-benzoil-β-D-galactopiranosil)- (1-^4) - O-(2,3, 6-tri-0-benzoil-p-D-gluco-piranósido) (35).

Exemplo A6: Preparação de (3-benziloxicarbonil-amino) -propil-O- (α-D-galactopiranosil) - (l->3) -O- (β-D-galactopiranosil)- (l->4)-O-(2-desoxi-2-acetamido-p-D-glucopiranosil)- (1-^3) -O-(β-D-glucopiranosil)-(1-^4) -Ο-(β-D-glucopiranósido) (A9)

'QSft (A9) (a) Uma solução de 37 (seca, 3,5 g, 4,88 mmol) e 35 (seco, 2,7 g, 2,56 mmol) em diclorometano (abs. 30 ml) é arrefecida a -20°C e adiciona-se TESOTf (58 μΐ, 0,1 eq.)· Após 3 h, TESOTf adicional (0,2 eq.) é adicionado. Após outra h, a mistura reaccional é neutralizada com trietil-amina, evaporada e co-evaporada duas vezes com tolueno. O resíduo é purificado por cromatografia "flash" (eluente tolueno/acetona 7:1, v/v) para originar (3-benziloxicarbo-nilamino)-propil-O-(2-desoxi-2-tetracloroftalimido-3,4,6-tri-O-acetil-β-D-glucopiranosil)- (1-^3) -O-(2, 6-di-0-p-D-glucopiranosil)- (1~^4) -O-(2,3, 6-tri-0-benzoil-p-D-gluco-piranósido) 38. (b) Uma solução de 38 (2, 64 g, 1,64 mmol) em etanol (abs. 80 ml) é tratada, a 60°C, com etilenodiamina 41 ΡΕ0970114 (220 μΐ, 3,28 mmol) sob atmosfera de árgon. Após 2 h é adicionada etilenodiamina adicional (110 μΐ) e após outra h a mistura é evaporada e co-evaporada várias vezes com tolueno. O resíduo é tratado com piridina/anidrido acético (120 ml, 2:1, v/v) e agita-se, à RT, sob atmosfera de árgon, durante 60 h. A mistura é evaporada e co-evaporada várias vezes com tolueno e o resíduo é purificado por cro-matografia "flash" (tolueno/acetona 3:1, v/v) para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2-desoxi-2-acetamido-3, 4, 6-tri-0-acetil-p-D-glucopiranosil)- (l->3) -O-(4-O-ace-til-2, 6-di-0-benzoil-p-D-glucopiranosil)- (l->4) -O-(2,3, 6-tri-O-benzoil-p-D-glucopiranósido) 39. (c) Uma solução de 39 em metanol (abs. 100 ml) é tratada com uma solução de NaOMe acabada de preparar (1 N, 1 ml) e agitou-se, à RT, sob atmosfera de árgon, durante 16 h. A mistura é neutralizada com TFA e evaporada. O resíduo é purificado por cromatografia "flash" (diclorometano/me-tanol 2:1, v/v) para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2-desoxi-2-acetamido-p-D-glucopiranosil)- (1-^3) -O-(β-D-glucopiranosil)- (1-^4) -O-(β-D-glucopiranósido) 40. (d) A uma solução límpida de 40 (230 mg, 0,312

mmol) são adicionados UDP-Gal (273 mg, 0,447 mmol), BSA (17 mg) e MnCl2.6H20 (73,5 mg, 0,313 mmol) em 20 ml de tampão de cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,3) β-(l->4) -galactosil-transferase (2,5 U, 500 μΐ de Sigma No G-5507, 25 U/5 ml) e fosfatase alcalina (25 μΐ, Boehringer No 108146, 7500 U/498 μΐ) e a mistura é incubada, a 37°C, durante a noite. A 42 ΡΕ0970114 mistura é então feita passar numa coluna RP-18 (2,5 cm 0, 10 cm de comprimento), lavada com água e eluida com metanol para originar (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(β — D— glucopiranosil) - (1-^4) -O- (2-desoxi-2-acedtamido^-D-gluco-piranosil) - (1-^3) -O- (β-D-galactopiranosil) - (1-^4) -O- (β — D— glucopiranósido) 41. (e) A uma solução de MnCl2.6H20 (317,2 mg, 1,6 mmol) em H20 (19 ml) e tampão de cacodilato de sódio 0,5 M (6,8 ml, pH 6,5) 225 mg (0,250 mmol) de 41, são adicionados UDP-Gal (219 mg, 0,36 mmol) e BSA (20 mg). Esta mistura é incubada, a 37°C, com 2,5 ml de a- (l->3) galactosil-transferase recombinante [3U/ml, preparada de acordo com Joziasse et al., Europ. J. Biochem. 191:75 (1990)] e 25 μΐ de fosfatase alcalina de intestino bovino (Boehringer No 108146, 7500 U/498 μΐ) durante 48 h. A mistura é passada numa coluna curta de fase reversa C-18 (2,5 cm 0, 10 cm de comprimento), lavada com água e eluida com metanol. Cromatografia do resíduo sobre sílica gel (CH2C12/CH30H/H20 = 10:2:0,2) origina A9. (ii) (a) O-(α-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(β-D-galactopiranosil) - (1-^4) -O- (2-desoxi-2-acetamido^-D-galactopi-ranosil) - (l->3) -O- (β-D-galactopiranosil) - (l->4) -O- (β — D— galactopiranose) (23) (Chem. Abstr. Reg. No. 177331-58-7, 500 mg, 0,54 mmol) é dissolvido em piridina (10 ml) e anidrido acético (5 ml) é lentamente adicionado. A solução 43 ΡΕ0970114 é agitada, à RT, durante a noite. A solução límpida é evaporada e co-destilada várias vezes com tolueno. 0 resíduo é dissolvido e purificado por cromatografia "flash" de 40 em sílica gel (eluente tolueno/acetona 3:2 v/v) para originar, após concentração O- (2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosil)- (l->3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-p-D-galac-topiranosil)- (l->4) -O-(2-desoxi-2-acetamido-3,6-di-O-ace-til-3-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-3-D-galactopiranosil) - (1-^4) -O- (1,2,3, 6-tetra-0-acetil^-D-galactopiranose)(24) sob a forma de um xarope sem cor.

(b) 24 (770 mg, 0,499 mmol) é dissolvido em DMF (abs, 50 ml) sob atmosfera de árgon. Peneiros moleculares (4 A, 1 g) são adicionados e a mistura é agitada, a RT, durante 30 minutos. Então acetato de hidrazínio (140 mg, 1,50 mmol) é adicionado à mistura e agita-se, durante 3 h, a 50°C. A mistura reaccional é filtrada através de um pequeno tampão de Celite® e adiciona-se água gelada. O produto é extraído com acetato de etilo, lavado, seco (MgS04) e a solução é evaporada até à secura. O resíduo é purificado por cromatografia em sílica gel para originar O-(2,3,4, 6-tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosil)- (l->3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-3-D-galactopiranosil)- (l->4) -O-(2-desoxi-2-acetamido-3,6-di-0-acetil-3-D-galactopiranosil)-(1”^3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)- (1-^4) -O- (2,3,6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranose) (25) . (c) 25 (seco, 570 mg, 0,38 mmol) é dissolvido em diclorometano (abs. 3 ml) sob atmosfera de árgon. É 44 ΡΕ0970114 adicionado tricloroacetonitrilo (600 μΐ) seguido de adição, gota a gota, de DBU até a mistura reaccional se tornar amarela (3-4-gotas) . A mistura é agitada à RT até TLC (tolueno/acetona, 1:1, v/v) mostrar conversão completa do material de partida num produto com maior movimentação (Rf 0,48). A solução é cuidadosamente evaporada até à secura e directamente purificada por cromatografia "flash" (eluente tolueno/acetona, 1:1, v/v) para originar tricloroacetimi-dato de O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosil)-(1-^3) -O- (2,4, 6-tri-0-acetil^-D-galactopiranosil) - (l->4) -O-(2-desoxi-2-acetamido-3,6-di-0-acetil^-D-galactopira-nosil)- (1-^3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)-(l->4)-O- (2,3, 6-tri-0-acetil^-D-galactopiranosilo) (26) sob a forma de um xarope sem cor. (d) 26 (40 mg, 24,3 pmol) e N-carbobenziloxi-1- propanolamina (15,5 mg, 73,0 pmol) são dissolvidos sob atmosfera de árgon em diclorometano (abs. 1 ml) e n-hexano (abs. 3 ml), é então adicionado cerca de 1 g de MS triturado (4 A) , e a mistura é agitada, à RT, durante 30 min antes de se adicionar TESOTf (5 μΐ) . Após 30 min a mistura é neutralizada com trietilamina e evaporada até à secura. O resíduo é purificado por cromatografia "flash" (eluente tolueno/acetona 3:2, v/v) e é isolado (3-ben-ziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-galactopiranosil)- (1 3) -O-(2,4, 6-tri-0-acetil-p-D-galac- topiranosil)- (l->4) -O-(2-desoxi-2-acetamido-3,6-di-O-ace-til-p-D-galactopiranosil)- (l->3) - O-(2,4, 6-tri-0-acetil-p-D-galactopiranosil)- (l->4) -O-(2,3, 6-tri-0-acetil-p-D-galacto-piranósido) 27. 45 ΡΕ0970114 (e) 27 (59 mg, 34,5 μηιοί) é suspenso em metanol (abs., 1 ml) . Uma solução de metilato de sódio em metanol acabada de preparar (IN, 100 μΐ) é adicionada e a mistura é agitada, durante a noite, à Rt, sob atmosfera de árgon. Finalmente é adicionada água (0,5 ml) e a agitação continuou. Após lha solução é neutralizada com TFA (10 μΐ) e evaporou-se até à secura. Purificação do resíduo por cromatografia "flash" origina A9. [a] d +44,4 (c 1,075, H20) . MS (ESI + ) 1083 (M+Na+) . XH RMN (500 MHz, CDC13) , sinais seleccionados: 4,31 (d, J = 8, H-C(l) β-glucose e β-galactose); 4,44 (d, J = 8, H-C(l) β-galactose); 4,59 (d, J = 8, H-C(l) N-Acetil^-glucosamina) ; 5,30 (d, J = 4, H-C(l) α-galactose).

Exemplo A7: Preparação de [3-(4-mercaptobuti-roil)amino]-propil-2-desoxi-2-acetamido-p-D-glucopiranósi-do A6

^QH ^ 0 im A uma solução de 3-aminopropil-2-desoxi-2-aceta-mido-β-D-glucopiranósido 18a (500 mg, 1,80 mmol) e γ-tiobu-tirolactona (1,84 g, 18 mmol) em 15 ml de metanol seco e sem oxigénio, é adicionada trietilamina (1,82 g, 18 mmol). A solução é levada à ebulição durante 16 h, sob refluxo (árgon). O solvente é evaporado sob pressão reduzida e o resíduo é cromatografado em sílica gel. Eluição com acetato de etilo/metanol (3:1) origina A6. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): 46 ΡΕ0970114 1,72 (m, OCH2CH2CH2NH) ; 1,88 (quint., J = 7, NH-CO- CH2CH2CH2SH) ; 1,99 (s, COCH3) ; 2,33 (t, J = 7, NH-CO-CH2CH2) 2SH) ; 2,51 (t, J = 7, NH-CO- (CH2) 2CH2SH) ; 3,15-3,95 (m, 10H) ; 4,36 (d, J = 8,5, H-C(l)).

Exemplo A8: Preparação de [6-(4-mercaptobuti-roil) amino]-hexil-O-(a-D-galactopiranosil)-(l->3) -Ο- (β-galactopiranósido)(A4)

2:2:2 «ó HO (a) A uma solução de 3 de acordo com o exemplo AI (1,0 g, 1,004 mmol) e (6-benziloxicarbonilamino)-2-hexanol (0,504 g, 2,008 mmol) em 4 ml de diclorometano seco são adiiconados peneiros moleculares (2,0 g, 4 A) em pó, sob atmosfera de azoto e a suspensão é agitada, durante 10 min, à RT. Porções de 1 ml de uma solução de DMTST (0,778 g, 3,012 mmol) em diclorometano (9 ml) contendo peneiros moleculares (2,5 g, 4 A) são adicionadas com intervalos de 10 min, ao mesmo tempo que agitação à RT e sob atmosfera de azoto é continuada. Após a adição de 7 porções, a mistura é deitada em acetato de etilo, NaHCCb aquoso a 10% e gelo triturado. A mistura é agitada, durante 10 min e filtrada através de Celite®. A fase aquosa é separada e extractada duas vezes com acetato de etilo. As fases orgânicas são lavadas com NaCl aquoso a 10% e solução salina saturada, seca-se com Na2S04, e os voláteis são evaporados sob 47 ΡΕ0970114 pressão reduzida. Cromatografia (150 g de sílica gel) do resíduo (1,6 g) eluindo com tolueno/acetato de etilo (10:1) origina (6-benziloxicarbonilamino)-hexil-O-(2,3,4, 6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(4-0-acetil-2,6-di-O-benzoil^-D-galactopiranósido) 15. (b) A uma solução de 15 (925 mg, 0,781 mmol) em metanol (30 ml) e água (3 ml) é adicionado Li0H-H20 (328 mg, 7,81 mmol). A mistura é aquecida, a 60°C, sob atmosfera de árgon, durante 6h. Os solventes são evaporados sob pressão reduzida e o resíduo é repartido entre CHCI3 e água. A camada de CHC13 é separada e lavada com água, sendo as fases aquosas extractadas com CHCI3. As fases orgânicas são secas com Na2S04 e evaporadas. Cromatografia (100 g de sílica gel) com tolueno/acetato de etilo (1:1) como eluente origina (6-benziloxicarbonilamino)-hexil-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(β-D-galactopi-ranósido) 16. (c) A uma solução de 16 (479 mg, 0,512 mmol) em dioxano (16 ml) e água (9 ml) é adicionado Pd(OH)2 (20% sobre carbono, 350 mg), sob atmosfera de árgon. A suspensão é agitada, durante 36 h, sob atmosfera de H2. A mistura é filtrada através de Celite® e o filtrado é evaporado sob pressão reduzida. O resíduo é redissolvido em dioxano (16 ml) e água (9 ml). Após a adição de Pd(OH)2 (20% sobre carbono, 350 mg) , a suspensão é agitada, durante 18 h, sob atmosfera de H2. Filtração (Celite®) e evaporação dos solventes é seguida de filtração através de Acrodisc™ em 48 ΡΕ0970114 água. Liofilização do filtrado origina 6-amino-hexil-0-(a-D-galactopiranosil)- (l->3) -0-(β-D-galactopiranósido) 17. (d) Uma solução do composto 17 (100 mg, 0,227 mmol), γ-tiobutirolactona (196 μΐ, 2,27 mmol), e trietil-amina (316 μΐ, 2,27 mmol) em DMF seco, sem oxigénio (7 ml) é aquecida, durante 24 h, até 90°C, sob atmosfera de árgon. A evaporação de voláteis sob pressão reduzida, a 40°C e cromatografia (10,5 g de sílica gel) do resíduo (160 mg) com clorofórmio/metanol/água (30:30:5) como eluente origina A4. 1H RMN (400 MHz, D20), sinais seleccionados: 1,15-1,35 (m, 0(CH2)2 (CH2)2 (CH2)2NH) ; 1,35-1,45 (m, O (CH2) 4CH2CH2NH) ; 1,45-1,6 (m, OCH2CH2 (CH24NH) ; 1,77 (quint. J = 7,5 NH-CO- CH2CH2CH2SH) ; 2,24 (t, J = 7,5, NH-CO-CH2 (CH2) 2SH) ; 2,43 (t, J = 7,5, NH-CO- (CH2)2CH2SH) ; 3,07 (t, J = 7, O (CH2) 5CH2NH) ; 4,34 (d, J = 8, H-C(l)); 5,04 (d, J = 4, H-C(l'))·

Exemplo A9: preparação de [3-(4-mercaptobu- tiroil) amino]-hexil-O-(a-D-galactopiranosil)-(1-^3) - Ο-(β-galactopiranosil)- (l->4) -O-(2-desoxi-2-acetamido^-D-glucopiranósido)(A2)

OH oh r«o

A^h .O HH

HCÍW OH

HO OH ΝΗΑδ y o (a) Peneiros moleculares 4Â em pó acabados de activar (2,0 g) são adicionados a uma solução de 3 (2,3 g, 49 ΡΕ0970114 2,31 mmol) e 14 (1,12 g, 1,54 mmol) em diclorometano seco (10 ml). Após agitação desta suspensão, durante 30 min, sob atmosfera de azoto, é adicionada uma solução de DMTST (0,99 g, 3,85 mmol) em CH2C12 (7,5 ml) contendo peneiros moleculares 4A em pó (1,5 g) , em 5 porções com intervalos de 20 min. A adição de NaHCC>3 aquoso (10%) (20 ml) é seguida de agitação, durante 10 min, e de adição de água (50 ml) e de acetato de etilo (150 ml). Após filtração sobre Celite™ e lavagem com acetato de etilo a fase aquosa é separada e extractada duas vezes com acetato de etilo. A fase orgânica é lavada com solução salina saturada, seca com Na2S04, e os solventes são evaporados sob pressão reduzida. Cromato-grafia do produto em bruto (3,43 g) em sílica gel (550 g) e eluição com hexano/acetato de metilo (3:1) origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(4-0-acetil-2,6-di-O-benzoil-β-D-galactopiranosil)- (l->4) -O-(6-0-benzil-2-desoxi-2-tetracloroftalimido-p-D-galactopiranósido) 4. (b) Uma mistura de 4 (1,412 g, 0,850 mmol), 1,2- diaminoetano (86 μΐ) e etanol (40 ml) é aquecida sob atmosfera de árgon, até 60°C. Após 140 min é adicionado 1,2-diaminoetano adicional (36 μΐ) e continua-se o aquecimento, durante 1 h. O solvente é então evaporado sob pressão reduzida e o resíduo é cromatografado em sílica gel (170 g) . Eluição com CH2Cl2/2-propanol (15:1) origina (3-ben-ziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)- (1~>3) -O-(4-0-acetil-2, e-di-O-benzoil-β- 50 ΡΕ0970114 D-galactopiranosil)- (1-^4) -Ο-(6-0-benzil-2-desoxi-3-amino-β-D-galactopiranósido) 5. (c) Anidrido acético (15 ml) é adicionado a uma solução de amina 5 (975 mg, 0,699 mmol) em piridina (15 ml) . Após agitação, durante 18 h, à RT, o solvente e o reagente são evaporados, a 40°C, sob pressão reduzida. Cromatografia do resíduo (1,26 g) em sílica gel (125 g) com diclorometano/2-propanol (15:1) como eluente origina (benziloxicarbonilamino)-propil-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-a-D-galactopiranosil)- (l->3) -O-(4-0-acetil-2, 6-di-O-benzoil-β-D-galactopiranosil)- (l->4) -O-(3-0-acetil-6-0-benzil-2-desoxi-2-acetamido-β-D-galactopiranósido) 6. (d) Mono-hidrato de hidróxido de lítio (255 mg, 6,08 mmol) é adicionado a uma solução de 6 (898 mg, 0,608 mmol) em metanol (25 ml) e água (2,5 ml). Após agitação, durante 3 h 15 min, a 60°C, os solventes são evaporados sob pressão reduzida a partir da suspensão espessa. O resíduo é dissolvido em acetato de etilo (150 ml) e a solução é lavada com água (3 vezes 70 ml) e solução salina saturada (50 ml) . As águas de lavagem aquosas são extractadas uma vez com acetato de etilo. As fases orgânicas são secas com Na2SC>4 , e o solvente é evaporado. Cromatograf ia do resíduo (732 mg) em silica gel 8120 g) com diclorometano/2-propanol (19:1) como eluente, seguido de acetato de etilo/acetona/2-propanol (5:1:1) origina (3-benziloxicarbonilamino)-propil-0- (2,3, 4, 6-tetra-O-benzil-oí-D-galactopiranosil) - (1“^3) -O- 51 ΡΕ0970114 (β-D-galactopiranosil)- (1->4) - Ο-(6-0-benzil-2-desoxi-2-acetamido-p-D-galactopiranósido) 7. (e) Catalisador de Perimann (1,46 g de 20% de

Pd (OH) 2 sobre carvão) é adicionado a uma solução de 7 (610 mg, 0,514 mmol) em dioxano (50 ml) e água (28 ml) . A suspensão é vigorosamente agitada, sob atmosfera de H2, durante 22 h. Após filtração (celite) o filtrado é evaporado e o resíduo é redissolvido em dioxano (50 ml) e água (28 ml). Catalisador fresco (1,46 g de 10% Pd(OH)2 sobre carvão) é adicionado e agitação sob atmosfera de H2 é continuada durante 3 dias. Filtração e evaporação de solventes sob pressão reduzida origina 290 mg (93%) de (3-amino)-propil-O-(α-D-galactopiranosil)- (1-^3) -O-(β-D-galactopiranosil) - (1-^4) -O- (2-desoxi-2-acetamido^-D-galactopiranósido) 8 em bruto. (f) 100 mg (0,166 mmol) de composto 8 é dissol vido em 5 ml de DMF seco, sem oxigénio. Após adição de γ-tiobutirolactona (0,144 ml, 1,66 mmol) e trietilamina (0,231 ml, 1,66 mmol), a mistura é aquecida, a 90°C, durante 18 h, sob atmosfera de árgon. O solvente e os voláteis são removidos por evaporação, sob vácuo, a 45°C. Cromatografia (15 g de sílica gel) do resíduo (140 mg) com clorofórmio/metanol/água (30:20:10) origina A2. 1H RMN (400 MHz, D20) , sinais seleccionados: 1,68 (quint., J = 6,0, OCH2CH2CH2NH) ; 1,78 (quint., J = 7,5, NH-CO-CH2CH2CH2SH) , 1,95 (s, COCH3) ; 2,25 (t, J = 7,5, NH-CO-CH2CH2CH2SH) , 2,44 (t, J = 7,5, NH-CO-CH2CH2CH2SH) ; 3,03-3,13 e 3,13-3,23 (2m, 52 ΡΕ0970114 0-CH2CH2CH2NH) ; 4,43 e 4,46 (2d, J = 8, H-C(l')); 5,03 (d, J = H-C(!'')). MS/EI: 703 (M-H)".

Exemplo AIO: Preparação de [3-(4-mercaptobuti- roil)amino]-propil-O-(a-D-galactopiranosil)-(l->3) -Ο-(β-galactopiranosil)- (1-^4) -O-(β-D-glucopiranósido) (A3)

Uma solução de 3-aminopropil-O-(a-D-galactopira-nosil) - (1-^3) -O- (β-galactopiranosil) - (l->4) -O- (β-D-gluco-piranósido) 18 (74 mg, 0,1319 mmol), preparado sinteticamente a partir de lactose e galactose, de acordo com métodos correntes, γ-tiobutirolactona (114 μΐ, 1,319 mmol) e trietilamina (184 μΐ, 1,319 mmol) em metanol seco, sem oxigénio (10 ml) é aquecida, sob refluxo, durante 18 h (árgon). Após separação de algum material insolúvel (9 mg) por filtração e evaporação do filtrado sob pressão reduzida, o resíduo (119 mg) é cromatografado em sílica gel (15 g). Eluição com clorofórmio/metanol/água (30:30:10) origina A3. 1H RMN (400 MHz, D20) , sinais seleccionados: 1,65-1,85 (m, OCH2CH2CH2NH, NH-CO-CH2CH2CH2SH) ; 2,25 (t, J = NH-CO- CH2 (CH2) 2SH) ; 2,45 (t, J = 7,5, NH-CO-(CH2) 2CH2SH) ; 3,1-3,25 (m, H-C (2) , O (CH2) 2CH2NH) ; 4,38 e 4,42 (2d, J = 8, H-C(l*)); 5, 04 (d, J = 4, H-C (1 ' ' ) ) . 53 ΡΕ0970114

Exemplo All: Preparação de [N-(4-mercaptobuti-roil)]-glicinoil-N-(α-D-galactopiranosil)-(l->3) -0-(β-galactopiranosil) - (1-^4) -0- (2-desoxi-2-acetamido^-D-galactopiranosil)-(l->3) -0-(β-galactopiranosil)- (l->4)-0-(l-desoxi-l-amino-p-D-galactopiranósido) (A8)

Uma solução/suspensão desgaseifiçada de glici-noil-N-(α-D-galactopiranosil)- (l->3) -0-(β-galactopiranosil) - (1-^4) -0-(2-desoxi-2-acetamido-p-D-galactopiranosil)-(1"^3)-0-(β-galactopiranosil)- (1~^4) -0-(l-desoxi-l-amino-β-D-galactopiranósido) (comercialmente disponível) (22, 205 mg, 0,222 mmol), 1-tiobutirolactona (192 μΐ, 2,22 mmol), trietilamina (310 μΐ, 2,22 mmol), e ditio-D/L-treitol (51,4 mg, 0,333 mmol) em DMF seco (10 ml) é aquecida, durante 3,5 h, a 90°C, sob atmosfera de árgon. Os voláteis são evaporados sob pressão reduzida (alto vácuo) e o resíduo é cromatografado em sílica gel (25 g) . Eluição com cloro-fórmio/metanol/água (30:30:10) e liofilização origina A8. 1H RMN (400 MHz, D20), sinais seleccionados: 1,8 (quint., J = 7, CO-CH2CH2CH2SH) ; 1,93 (s, NH-COCH3) ; 2,34 (t, J = 7, CO-CH2CH2CH2SH) ; 2,47 (t, J = 7, CO-CH2CH2CH2SH) ; 3,32-3,4 (m, H-C(2), glucose); 3,87 (m, CO-CH2-NH) ; 4,33 e 4,44 (2d, J = 8, 2 H-C(1), β-galactose) ; 4,60 (d, J = 8, H-C(l) N- acetilglcosamina) ; 4,91 (d, J = 9, H-C(l), glucose); 5,04 (d, J = 4, H-C(l) a-galactose) 54 ΡΕ0970114

Exemplo A12: Preparação de [3-(4-mercaptobuti-roil)amino] -propil-O- (α-D-galactopiranosil) - (1-^3) -0- (β-galactopiranosil)-(l->4) - O-(2-desoxi-2-acetamido-p-D-galactopiranosil)-(l->3) -O-(β-galactopiranosil)- (l->4) -0-(l-desoxi-l-amino-p-D-galactopiranósido) (AIO)

(a) A9 (25 mg, 23,6 μιηοΐ) é dissolvido em água (5 ml) e é adicionado hidróxido de paládio (5 mg). A mistura é agitada, durante a noite, sob atmosfera de hidrogénio, à RT. 0 catalisador é removido por filtração através de um pequeno tampão de Celite®. Após evaporação e liofilização de água obtém-se 3-aminopropil-0-(a-D-galactopiranosil)-(1-^3) -0- (β-galactopiranosil) - (1-^4) -0- (2-desoxi-2-acetami-do-p-D-galactopiranosil)- (l->3) -0-(β-galactopiranosil)- (1-^4)-0- (β-D-galactopiranósido) 42, sob a forma de um pó sem cor. (b) A uma solução de 42 (450 mg, 0,4855 mmol) e ditiotreitol (112 mg, 0,728 mmol) em DMF seco (30 ml) são adicionados 420 μΐ de γ-tiobutirolactona e 680 μΐ de trietilamina. Após desgaseificação a solução é aguecida, durante 18 h, a 90°C, sob atmosfera de árgon. Evaporação do solvente, a 50°C, sob pressão reduzida e cromatografia em sílica gel (50 g, clorofórmio/metanol/água = 30:30:10) ori- 55 ΡΕ0970114

gina AIO. 1H RMN (400 MHz, D2O) , sinais seleccionados: 1, 65-1,85 (m, OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2SH) ; 2,25 (t, J COCH2 (CH2) 2SH) ; 2,43 (t, J = 7,5, CO (CH2) 2CH2SH) ; 3,10-3,27 (m, O (CH2) 2CH2NH, H-C (2) β-glucose) ; 4,33 e 4,44 (2d, J = 8, H-C(l) β-galactose); 4,36 (d, J = 8, H-C(l) β-glucose); 4,6 (d, J = 8, H-C(l) 2-desoxi-2-acetamido-β-D-glucose); 5,03 (d, J = 4, H-C(l) α-galactose).

Exemplo A13: preparação de N-(8-[N-difenil-(4-metoxifenil)-metil]-amino-3,6-dioxa-l-octil)-4-mercapto-butlramlda A7.

H.,CO .......... H........S.............................................................;....................................1 .

SM (A7i (a) A uma emulsão agitada de trietilenoglicol (39 g, 0,26 mol) em éter (200 ml) e trietilamina (50 ml), arrefecida a 0°C, é adicionado cloreto de metanossulfonilo (10,1 ml, 0,13 mol) durante 3 h. A mistura é deixada a atingir a RT e a gitação é continuada durante 20 min. Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida e o resíduo é redissolvido em metanol/água (955, 300 ml). Após adição de NaN3 (18,2 g, 0,28 mol) a solução é levada à ebulição, durante 18 h, sob refluxo. O solvente é então evaporado, sob pressão reduzida e o resíduo é repartido entre éter e solução salina saturada. Cromatografia do resíduo da fase orgânica seca (Na2S04) em sílica gel (260 g, eluindo com 56 ΡΕ0970114 hexano/acetato de etilo (2:1) origina 1,8-diazo-3,6-dioxa-octano 19. (b) A uma solução de diazida 19 (14,67 g, 0,073 mol) em THF (100 ml) é adicionado 1,5 g de 5% Pt sobre carvão. A mistura é agitada, durante 12 h, sob atmosfera de hidrogénio. Filtração em Celite™ e evaporação dos solventes sob pressão reduzida origina 1,8-diamino-3,6-dioxa-octano 20. (c) A uma solução de 20 (1,0 g, 6,76 mmol) em piridina (5 ml) é adicionada uma solução de cloreto de difenil- (4-metoxifenil)-metilo (2, 09 g, 6,76 mmol) em piridina (10 ml), a 5°C, no espaço de 5 min. Após agitação durante 3 h, a 0°C, o solvente é evaporado sob pressão reduzida a 20°C. O resíduo é repartido entre acetato de etilo e solução salina saturada. A fase orgânica é separada, seca (Na2S04) e o solvente é evaporado. Cromatografia (170 g de sílica gel) do resíduo (3,1 g) eluindo com clorofórmio/metanol/água (65:25:4) origina 8-[N-difenil-(4-metoxifenil)-metil]-amino-3,6-dioxa-l-octilamina 21. (d) Uma solução de 21 (395 mg, 0,94 mmol) , γ- butirolactona (0,81 ml, 9,4 mmol) e trietilamina (1,31 ml, 9,4 mmol) em metanol seco, sem oxigénio (17 ml) é levada à ebulição, durante 18 h, sob refluxo. Os solventes são removidos, sob pressão reduzida e o resíduo (635 mg) é cromatografado em sílica gel (100 g) . Eluição com acetato de etilo origina A7. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) ; 1,33 (t, J = 57 ΡΕ0970114 7, SH); 1,90 (quint., J = 7, NH-CO-CH2CH2CH2SH); 2,1 (largo, NH) ; 2,20 (t, J = 7, NH-CO-CH2 (CH2) 2SH) ; 2,39 (t, J = 6, CH2NH) ; 2,53 (q, J= 7, CH2SH) ; 3,43 (m, CH2NH-CO) ; 3,5-3,67 (m, 4 OCH2) ; 3,80 (s, OCH3) ; 6,02 (largo, NH) ; 6,78-6,88 (2H) , 7,15-7,25 (2H) , 7,25-7,33 (4H) ; 7,35-7,45 (2H) ; 7,45-7,55 (4H) (arom. CH). MS(EI): 523 (M+H)+. B Preparação de derivados de poliamida activados

Exemplo Bl: Preparação de N(6)-cloroacetil-poli-L-lisinas Bla, Blb e Blc

(a) 500 mg (2,39 mmol eq) de bromidrato de poli- L-lisina (M: 30 000 - 70 000) são suspensos em 8 ml de DMF, sob atmosfera de árgon. A suspensão é arrefecida, a 0°C e adiciona-se 2,5 ml de 2, 6-lutifina. Uma solução de 1 g (5,85 mmol) de anidrido cloroacético em 4 ml de DMF é adicionado, gota a gota, no espaço de 15 min. A mistura é, subsequentemente, lentamente aquecida à RT e agita-se durante 5 h. A solução amarelo pálido, ligeiramente turva é adicionada, gota a gota, a 100 ml de éter dietílico/etanol (2:1) com a formação de um precipitado sem cor. A seguir à filtração (através de um filtro de vidro sinterizado, 58 ΡΕ0970114 inicialmente sem a aplicação de vácuo) faz-se lavagem com etanol, água, com etanol novamente e finalmente com éter dietilico. 0 produto em bruto é dissolvido em tão pouco DMF quanto possível e precipitado novamente em éter dietíli-co/etanol. Após secagem em vácuo à RT obtém-se Bla [M: 30 000 - 70 000 (n = 250)]. XH RMN (DMSO, 500 MHz) δ = 8,20 (2H, s, 2 x NH) ; 4,05 (2H, s, -CO-CH2-CI); 3,80 (1H, s, CH) ; 3,05 (2H, s, -CH2-NH-CO-) ; 2,00-1,20 (6H, m, -CH- (CH2)3-CH2-NH-) . (b) De maneira análoga é obtida N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina Blb [M: 4000 - 15 000 (n= 50)] a partir de 50 mg (0,24 mmol eq) de bromidrato de poli-L-lisina (M: 4000 - 15 000) e obtém-se N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina

Blc [M: 150 000 - 300 000 (n = 1050) ] a partir de 50 mg (0,24 mmol eq) de bromidrato de poli-L-lisina (M: 150 000 -300 000) . Os espectros de 1H-RMN são idênticos aos do composto Bla.

Exemplo B2: Sintese de N(6)-cloroacetil-poli-L-lisinas B2a, B2b e B2c (a) Analogamente ao Exemplo BI(a) obtém-se N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B2a [M: 30 000 - 70 000 (n = 250)] a partir de 100 mg (0,48 mmol eq) de bromidrato de poli-L-lisina (M: 30 000 - 70 000) e N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B2b [M: 4000 - 15 000 (n = 50)] a partir de 250 mg (1,196 mmol eq) de bromidrato de poli-L-lisina (M: 4000 - 59 ΡΕ0970114 15 000) . Os espectros de 1H-RMN são idênticos aos dos compostos Bla e Blb, respectivamente. (b) Uma solução de bromidrato de poli-L-lisina (47 8 mg, 2,2 9 mmol eq; M: 150 000 - 300 000) em água (50 ml) é feita passar através de uma coluna (2 cm de diâmetro; comprimento de 11 cm) com enchimento de resina de permuta iónica básica (DowexR 1x8, 20-50 de malha, forma OH).

Eluição com água até o pH atingir 7 é seguida de neutralização com ácido p-toluenossulfónico aquoso a 10%, até pH 3. Após liofilização do eluato o resíduo é dissolvido em DMF (10 ml) e são adicionados 2,6-lutidina assim como uma solução de anidrido cloroacético (800 mg) em DMF (2 ml) , a 0°C. Após agitação, a 0°C, durante 18 h, sob atmosfera de árgon, a mistura é diluída com etanol (100 ml) e o produto é precipitado por adição de éter dietílico (250 ml) . O precipitado, recolhido por filtração por gravidade, é redissolvido em DMF (20 ml), e a solução é então adicionada no espaço de 10 min a etanol (80 ml). A suspensão resultante é agitada, durante 16 h, à RT, antes de ser adicionado éter dietílico (300 ml) no espaço de 20 min. A filtração e a secagem do precipitado sob pressão reduzida (alto vácuo) origina B2c [M: 150 000 - 300 000 (n= 1000)]. O espectro de 1H-RMN é idêntico ao do composto Blc.

Exemplo B3: Síntese de N(6)-cloroacetil-poli-D/L-lisinas B3a, B3b e B3c (a) 250 mg (1,19 mmol eq) de bromidrato de poli- 60 ΡΕ0970114 D/L-lisina (Μ: 30 000 - 70 000) é suspenso em 4 ml de DMF, sob atmosfera de árgon. A suspensão é arrefecida até 0°C e adiciona-se 1,25 ml de 2,6-lutidina. Uma solução de 500 mg (2,93 mmol) de anidrido cloroacético em 2 ml de DMF é adicionada, gota a gota, no espaço de 15 min. A mistura é, subsequentemente, aquecida lentamente à RT e agita-se durante 16 h. A continuação do processo e a purificação ocorreram analogamente ao Exemplo BI(a) para se obter B3a [M: 30 000 - 70 000 (n = 250)]. 1H-RMN (DMSO , 500 MHz) δ = 8,20 (1H, s, N(6)H) ; 8,05 e 7,90 (em cada caso 1/2H, 2s, N(2)H); 4, 25 (1H, s, (br), CH) ; 4,05 (2H, s, -CO-CH2-CI) 3,05 (2H, s, -ch2-nh- CO) ; 1,70-1,20 (6H, m, -CH- (CH2) 3-CH2- NH-) . (b) De maneira análoga N(6)-cloroacetil-poli-L-lisina B3b [M: 4000 - 15 000 (n = 50)] é obtida a partir de 50 mg (0,24 mmol eq) de bromidrato de poli-D/l-lisina (M: 4000 - 15 000) e N (6)-cloroacetil-poli-L-lisina B3c [M: 150 000 - 300 000 (n= 1050)] é obtida a partir de 500 mg (2,392 mmol eq) de bromidrato de poli-L-lisina (M: 150 000 - 300 000) . Os espectros de 1H-RMN são idênticos aos do composto B3a.

Exemplo Cl: Preparação de conjugados do Tipo I (i) A partir de poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina: (a) Bla (10 mg, 0, 0489 mmol eq) e tiol A2 (10,3 61 ΡΕ0970114 mg, 0,0147 mmol) são dissolvidos, sucessivamente, em 2,0 ml de DMF seco, sem oxigénio, à RT e sob atmosfera de árgon. É adicionado DBU (7,3 μΐ, 0,0480 mmol) à solução límpida. Após agitação, à RT, durante 1 h, são adicionados tio-glicerol (12,7 μΐ, 0,147 mmol) e trietilamina (33,4 μΐ, 0,24 mmol) e a agitação é continuada, durante 18 h. A solução sem cor é adicionada, gota a gota, a 15 ml de éter dietílico/etanol (1:1). O precipitado formado é separado por filtração por gavidade através de um funil de frita, lavado com éter/etanol (1:1), dissolvido em água e a solução resultante foi sujeita a ultrafiltração utilizando um equipamento Amicon equipado com uma membrana YM-3 (limite de PM 3000) . A lavagem foi feita com cinco porções de 10 ml de água ultrapura. A liofilização dos contúdos da câmara do filtro tomados em água originaram Cia [x = 0,25 (n=250)] com 25% de derivatização de sacáridos (x=0,25) de acordo com 1H-RMN (integração dos sinais detectados). 1H- RMN (500 MHz, D20), sinais seleccionados: 2,26-2,36 (m, NH-CO-CH2CH2CH2S, A2) ; 2,53-2,58 (m, NH-CO-CH2CH2CH2S, A2) ; 2, 58-2, 68 e 2,7-2,8 (2m, SCH2-CHOH-CH2OH) ; 4,49 e 4,51 (2d, J = 8, H-C(l), H-C (1 ' ) , A2) ; 5,12 (d, J = 4, H-C(l"), A2) .

Bla é tratado com várias quantidades de A2, A3, A4 ou A8 e tioglicerol tal como descrito acima dando origem a conjugados do Tipo I com várias derivatizações de sacáridos de acordo com 1H-RMN (integração). 62 ΡΕ0970114

Conjugados do Quantidade de Bla Quantidade de A2, A3, % de deriva- Tipo I (n = A4 ou A8 tização de 250) sacárido Clb 10 mg, 48, 9 pmol eq A2: 3,44 mg, 4,89 pmol 8% (x = 0,08) Clc 10 mg, 48, 9 pmol eq A2: 6,89 mg, 9,78 pmol 16% (x = 0,16) Cld 10 mg, 48, 9 pmol eq A2 : 17,2 mg, 24,5 pmol 41% (x = 0,41) Cie 10 mg, 48, 9 pmol eq A2: 24,1 mg, 34,2 pmol 61% (x = 0,61) C4 20 mg, 97, 8 pmol eq A2: 19,5 mg, 29,3 pmol 23% (x = 0,23) C5 30 mg, 146 ,7 pmol eq A2 23, 9 mg, 44 gmol 25%(x = 0,25) Clk 10 mg, 48, 9 pmol eq A2 12, 6 mg, 12 gmol 22%(x = 0,22) (b) Analogamente a (a) com início em Blb (20 mg, 97,8 pmol eq), A2 (20,7 mg, 29,3 pmol eq) e tioglicerol Cif (n = 50) derivatização de sacárido: 28% (x=0,28). (c) Blc é tratado com várias quantidades de A2, A4 ou A8 e tioglicerol, tal como descrito acima originando conjugados do Tipo I com várias derivatizações de sacárido de acordo com 1H-RMN (integração).

Conjugados do Quantidade de Blc Quantidade de A2, A4 % de deriva- Tipo I (n = ou A8 tização de 1050) sacárido Clg 10 mg, 48,9 pmol eq A2 : 10,3 mg, 14,7 pmo1 28% (x = 0,28) Clh 20 mg, 97,8 pmol eq A4: 14,3 mg, 26,4 pmol 21%(x = 0,21) Cli 20 mg, 97,8 pmol eq A8: 2 5,1 mg, 2 4 pmol 25% (x = 0,25) Clj 70 mg, 342 pmol eq A2: 24,1 mg, 34,2 pmo1 9% (x = 0,09) A8: 35,2 mg, 34,2 pmol 9% (x = 0,09) A4: 18,6 mg, 34,2 pmol 9% (x = 0,09) (ii) (a) Partindo de poli-N(6)-cloroacetil-D-lisina: 63 ΡΕ0970114 B2a (10 mg, 48,9 pmol eq) é tratado com A2 (10,3 mg, 14,7 μιηοΐ) e tioglicerol, tal como descrito no exemplo Cl(i)a. A filtração dos conteúdos da câmara de ultrafiltração através de um Acrodisc™ e liofilização do filtrado origina C2 [x = 0,35 (n=250)] com 35% de derivatização de sacárido (x=0,35) de acordo com 1 2H-RMN (integração). (b) Analogamente a (a) a partir de B2c (100 mg, 489 pmol eq) , A2 (86 mg, 122 μιηοΐ) e tioglicerol origina C2b (n = 1000), derivatização de sacárido: 24% (x=0,24). (iii) Partindo de poli-N(6)-cloroacetil-D,L-li-sina: B3a (10 mg, 122 pmol eq) é tratado com A2 (10,3 mg, 0,0147 mmol) e tioglicerol, tal como descrito no exemplo Cl(±)a originando C3 [x = 0,22 (n = 250)] com 22% de derivatização de sacárido (x=0,22) de acordo com 1H-RMN (integração).

Exemplo C2: Preparação de precursores de conjugados do Tipo II 1

Precursores de conjugados do Tipo II em que -Y-R3 é um grupo de fórmula Vc (derivado de A2, tri) 2 (a) Poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina (Bla, 200 mg, 978 pmol eq) , tiol A2 (172 mg, 244 pmol) e tiol A7 (15,3 mg, 29,3 pmol) são dissolvidos em DMF seco, sem oxigénio 3 (20 ml) . DBU (146 μΐ, 0, 978 mmol) é adicionado à solução límpida. Após agitação, durante 40 min, à RT e sob atmosfera de árgon, são adicionados tioglicerol (254 μΐ, 64 ΡΕ0970114 2,934 mmol) e trietilamina (682 μΐ, 4,89 mmol) e a agitação é continuada, durante 18 h. A solução sem cor é adicionada a 100 ml de etanol e éter dietilico (200 ml) é adicionado, gota a gota, sob agitação. O precipitado formado é separado por filtração por gravidade através de um funil de frita, lavado com etanol/éter (1:2, 3 x 30 ml) e dissolvido em água. A solução é sujeita a ultrafiltração utilizando um equipamento Amicon equipado com uma membrana YM-3 (limite de PM = 3000). Liofilização dos conteúdos da câmara do filtro tomados em água origina C6al [x = 0,25, y = 0,03 (n s 250)]. (b) A uma solução de C6al (366 mg) em água (25 ml) é adicionado ácido tricloroacético (1,2 g), a 0°C. Após agitação, durante 2 h, a 0°C, a solução é neutralizada com hidróxido de sódio 2N a pH 11 e é sujeita a ultrafiltração utilizando um equipamento Amicon equipado com uma membrana YM-3 (limite de PM = 10 000) . A lavagem é efectuada com três porções de água ultrapura. Após adição de NaOH 2N (10 gotas) à câmara do filtro, a lavagem com água é continuada (seis porções) . A liofilização dos conteúdos da câmara do filtro tomados em água origina C6bl [x = 0,25, y = 0,02 (n = 250)] com 25% de derivatização do sacárido (x=0,25) de acordo com 1H-RMN (integração de sinais seleccionados), e 2% de derivatização de amina (y = 0,02) com base em análise por RMN de C6al e a ausência de sinais de monometoxitritilo no 1H-RMN do C6bl: 1H-RMN (500 MHz, D20, 60°C), sinais seleccionados: 2, 65-2,75 (m, NH-CO-CH2CH2) 2S, Ri, R2) ; 2,95-3,01 (m, NH-CO-(CH2) CH2S, Ri, R2) ; 3,01 e 3,13-3,19 (2m, 65 ΡΕ0970114 OHCH2-CHOH-CH2S, Ra); 4,87-4, 95 (m, H-C(l), H-C(l'), Ri) ; 5, 52 (m, H-C (1' ' ) , Ri) .

Poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina com diferentes graus de polimerização cada um tratado com tioglicerol e quantidades variadas de A7 e A2, tal como descrito acima, originam C6bII, C6bIII e C6bIV com variada derivatização de sacárido e amina de acordo com 1H-RMN (integração).

Percursores de conjugados do Tipo II Quantidade de poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina Quantidade de A2 Quantidade de A7 % de derivatização de sacárido % de funções amina C6bII Blc: 100 mg, 51,6 mg, 7,66 mg, 13% 2, 6% (n =1050) 48 9 μπιοί eq 73,4 μπιοί 14,7 μπιοί (x=0,13) (y= 0,02 6) C6bIII Bla: 100 mg, 51,6 mg, 7,66 mg, 14% 2, 6% (n=250) 48 9 μπιοί eq 73,4 μπιοί 14,7 μπιοί (x=0,14) (y=0,026) C6bIV Blb: 150 mg, 129,1 mg, 19,1 mg, 23% 3% (y=0,03) (n =50) 733,5 μπιοί eq 183,4 μπιοί 3 6, 67 μπιοί (x=0,23) (ii) Precursores de conjugados do Tipo II em que -Y-R03 é um grupo de fórmula Vb (derivado de A4, di) , Va (derivado de A6, mono) , Vf (derivado de A8, penta) ou Ve (derivado de AIO penta) A poli-N(6)-cloroacetil-L-lisina é tratada com tioglicerol e variadas quantidades de A7 e A4, A6, A8 ou AIO, tal como descrito acima (exemplo C2i) originando C7a, C7b, C8bl, C9bl e ClObl com variada derivatização de sacárido e amina de acordo com 1H-RMN (integração). 66 ΡΕ0970114

Percursores de conjugados do Tipo II Quantidade de poli-N(6) -cloroacetil-L-lisina Quantidade de tiol A6, A4, A8 ou AIO Quantidade de A7 % de deriva-tização de sacárido % de funções amina C7a Bl: 70 mg, A6: 2 6 mg, 5,36 mg, 20% 3% (x=0,03) (n =160) 342 μπιοί eq 68,5 μπιοί 10,3 μπιοί (x=0,20) C7b Bla: 111 mg, A6: 5 0 mg, 8,6 mg, 21,5% 2% (x=0,02) (n =250) 54,3 μπιοί eq 10 9 μπιοί 16,4 μπιοί (x=0,215) C8b Blc: 130 mg, A4 : 51,9 mg, 10,0 mg, 16% 2,5% (nsl050) 635,7 μπιοί eq 95,6 μπιοί 19,1 μπιοί (x=0,16) (x=0,025) C9b Blc: 99,7 mg, A8: 75,1 mg, 7, 6 mg, 12,5% 2,5% (n =1050) 488 μπιοί eq 73,1 μπιοί 14,6 μπιοί (x=0,125) (x=0,0,25) ClOb Blc: 500 mg, AIO: 376 mg, 38,2 mg, 16% 2,5% (n =1050) 2,44 mmol eq 366 μπιοί 73,2 μπιοί (x=0,16) (x=0,0,25)

D Preparação de conjugados do Tipo II

Exemplo Dl: Conjugados do Tipo II compreendendo CH-Sepharose 4B (a) C6bl: 4,0 g de CH-Sepharose 4B NHS-activada (Pharmacia Biotech) é lavada com HCl 1 mM (800 ml sobre um funil frita (15 min) é adicionada a uma solução de C6bl (20 mg) em tampão de NaHC03 (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 6 ml) .

Após agitar durante 2 h, à RT, o tampão é separado por filtração por gravidade e a resina é lavada com tampão de NaHCCd (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 3 vezes 50 ml) antes do tratamento com etanolamina 1M (pH 8), durante 1 h, à RT. Filtração e lavagem com água (3 vezes 20 ml) , tampão TRIS (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 30 ml), tampão acetato (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 4, 30 ml) - alternando 3 vezes - e 20% etanol (3 vezes 50 ml) origina Dl com 5 pmol de epítopo de 67 ΡΕ0970114 hidrato de carbono por ml de resina armazenada em etanol a 20%. (b) C7a: 1,0 g de CH-Sepharose 4B NHS-activada é tratada como acima (exemplo Dia) com uma solução de C7a) (25 mg) em NaHCC>30,l M (NaCl 0,5 M, pH 8, 6 ml) originando Dlb com 4 pmol de epitopo de hidrato de carbono por ml de resina armazenado em etanol a 20%.

Exemplo D2: Conjugados do Tipo II compreendendo Sepharose 4 Fast Flow 11 ml de Sepharose 4 fast flow suspensa em 2-propanol a lavado com HC1 1 mM (6 vezes 20 ml) frio (0°C) e transferida com tampão de NaHCCh (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 6 ml) frio (0°C) para uma solução do precursor C6bl (150 mg) em 6 ml de tampão de NaHCCh (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 6 ml) a 0°C. Após agitar, durante 3 h, à RT, a mistura é filtrada e a resina é lavada com água (50 ml) antes de ser suspensa em etanolamima 1M (pH 8, 20 ml) e agita-se, à RT, durante 15 h. A resina é separada por filtração e lavada alternativamente com tampão TRIS (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 8, 30 ml) e tampão acetato (em NaCl 0,1M, 0,5 M, pH 4, 30 ml) , três vezes, para originar D2a com 5 pmol de epitopo de hidrato de carbono por ml de resina armazenada em etanol a 20%.

De acordo com o procedimento acima os conjugados do Tipo II D2b, D3, D5, D6, D7 e D8 são preparados: 68 ΡΕ0970114

Conjugado do Tipo II Quantidade de sefarose Precursor em 1 ml 0,1M NaHC03 (0,5M NaCl, pH 8) Epitopos de açúcar por ml de resina D2b 11 ml C6bII (146 mg) 3, 9 μπιοί D3 11 ml C6bIII (141,5 mg) 3, 9 μπιοί D5 2 ml C7b (24,8 mg) 7 μπιοί D6 11 ml C8b (140 mg) 4,7 μπιοί D7 11 ml C9b (165 mg) 2, 9 μπιοί D8 50 ml ClOb (800 mg) 3 μπιοί E Actividade biológica dos compostos

Exemplo EI: Afinidades de ligação dos conjugados

do Tipo I

Placas Nunc Polysorp (# catálogo 475094) são revestidas durante a noite, a 4°C, com 0,1 ml/poço de uma solução de 5 pg/mol de Clg (->Clg-ELISA) ou Clh (->Clh-ELISA) ou Cli ("^Clg-ELISA) em PBS. As placas são bloqueadas com 0,250 ml/poço de uma solução a 10% de SEA BLOCK (Pierce, # catálogo 37527), durante 24 h, a 4°C. As placas foram lavadas, 3 vezes, com 0,250 ml de PBS contendo 0,02% Tween 20.

Soro humano coagulado (Sigma H-1513) é diluído 1:20 em tampão PBS contendo 0,02% Tween 20 e 10% de Blocker BSA (Pierce, # catálogo 37525) . Uma alíquota de 60 μΐ da diluição do soro humano é colocada em poços em forma de U pouco pronunciada e 60 μΐ de uma diluição em série do conjugado do Tipo I é adicionado em poços sucessivos nas 69 ΡΕ0970114 séries apropriadas de concentrações.

Após 1 h de incubação, à RT, 0,100 ml da mistura de soro é transferida para os poços lavados revestidos com polímero. As placas são incubadas, durante 1 h, à RT e lavadas três vezes com PBS contendo 0,02% Tween 20. As placas são então cheias com 0,100 ml de uma diluição de 1:2500 de um conjugado IgG-peroxidase anti-humano (Jackson Immuno-research 109-036-098) ou, alternativamente, com um conjugado IgG-peroxidase anti-humano (Jackson Immunoresearch 109-036-129) em PBS contendo 10% Blocker BSA e 0,1% Tween 20. As placas são incubadas, durante 1 h, à RT e então lavadas 5 vezes com PBS contendo 0,02% Tween 20. As placas são desenvolvidas com 0,100 ml de substrato TMB (# catálogo Sigma T-3405) e pára-se após 10 min de desenvolvimento no substrato com 50 μΐ de H2S04 2M. A absorvância é lida a 450-650 nm utilizando um leitor de placa de microtitulação. Para análise, os valores da absorvância são registados em função das concentrações dos conjugados. O trissacárido Linear B (# catálogo Dextra GN334) é utilizado como padrão para medição do IC5o relativo.

Tabela 1: Afinidades de ligação dos conjugados do Tipo I medidos com placas revestidas com Clg. As afinidades são apresentadas como afinidades de ligação (RIC50 = IC50 do Linear B/IC50 do composto)

Composto Ric50 IgG RIC50 igM Composto RIC50 IgM RICso IgM 70 ΡΕ0970114

Clb 0,0070 0,0134 C2 0,007 0,0026 Clc 0,0017 0,0066 C3 0,0004 0,0013 Cia 0,0018 0,0040 C4 0, 004 0,013 Cld 0, 003 0,133 Clg 0,0004 0,0001 Cie 0, 007 >0,3 Cif 0, 002 0,07 C5 co \—1 o 0,009

Exemplo 2 E2: Remoção de xenoanticorpo de macacos cynomolgus

Um grupo de 4 macacos cynomolgus (peso médio de 3 kg) é injectado com 1 mg/kg de dose do conjugado do Tipo I a 0, 72 e 168 h. Os animais são sangrados em vários intervalos e o soro é analisado relativamente a anticorpos anti-aGal através de ELISA em relação a Clg (Exemplo El). Uma dose única de conjugado do tipo I provoca uma acentuada diminuição no titulo de anticorpo, seguido por uma recuperação do titulo de anticorpo até um valor abaixo do titulo inicial. Através de uma segunda e de uma terceira dose a recuperação do titulo do anticorpo é eficazmente parada durante um longo período de tempo.

Tabela 3: Títulos dos anticorpos em macacos cynomolgus que receberem injecção de Clg. Os resultados são apresentados como títulos em relação a um soro humano padrão.

Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Tempo IgG IgM IgG IgM IgG IgM IgG IgM 71 ΡΕ0970114 0 1, 6 0 0,85 0, 95 1,5 0,17 0,24 3 1 0 0 0 0,11 0 0 0 0,07 72 0,31 0 0,35 0,08 0,16 0 0,06 0,32 73 0 0 0 0 0 0 0 0,01 168 0,21 0 0,4 0,34 0,29 0,05 0,03 0,95 169 0 0 0 0 0 0 0 0,13 264 0,18 0 0,1 0,41 0,06 0,12 0,06 0,84 672 0,73 0 0,45 0,51 0,44 0,38 0,23 1,55

Exemplo E3: Medição de títulos de anticorpos

Placas Nunc Polysorp (# catálogo 475094) são revestidas durante a noite, a 4°C, com 0,1 ml/poço de uma solução de 5 pg/mol de Clg ou Clh ou Cli em PBS. As placas são bloqueadas com 0,250 ml/poço de uma solução a 10% de SEA BLOCK (Pierce, # catálogo 37527), durante 24 h, a 4°C. As placas foram lavadas 3 vezes com 0,250 ml de PBS contendo 0,02% Tween 20. Uma alíquota de 0,100 ml da amostra de soro é adicionada aos poços em diluições sucessivas. Tipicamente as diluições são como se segue 1:5; 1:15; 1:45; 1:135; 1:405; 1:1215; 1:3645; 1:10935 etc. O diluente é tampão de PBS contendo 0,1% Tween 20 e 10% SEA-BLOCK. As placas são incubadas, durante 1 h, à RT e lavadas três vezes com PBs contendo 0,02% Tween 20. As placas são então cheias com 0,100 ml de uma diluição de 1:2500 de um conjugado de IgG-peroxidase anti-humano (Jackson Immunoresearch 109-036-098) ou, alternativamente, com um conjugado IgG-peroxidase anti-humano (Jackson Immunoresearch 109-036-129) em PBS contendo 10% Blocker BSA e 0,1% Tween 20. As placas 72 ΡΕ0970114 são incubadas, durante 1 h, à RT e então lavadas 5 vezes com PBS contendo 0,02% Tween 20. As placas são desenvol vidas com 0,100 ml de substrato TMB (# catálogo Sigma T-3405) e pára-se após 10 min de desenvolvimento no substrato com 50 μΐ de H2SO4 2M. A absorvância é lida a 450-650 nm utilizando um leitor de placa de microtitulação. Para análise os valores da absorvância são registados em função do log do factor de diluição e o titulo é encontrado extrapolando a porção linear da curva até ao eixo X. É utilizado um soro padrão cujo titulo é normalizado a 1.

Exemplo E4: Cromatografia de Imunoafinidade de Soro Humano 5 ml de conjugado do Tipo II imobilizado é colocado numa coluna (1x3,5 cm). Soro humano coagulado (Sigma H-1513, filtrado através de um filtro de 0,4 μιη) é feito passar através da coluna bombeando com um caudal de 4 ml/min. Fracções de 10 ml cada são recolhidas à saída da coluna. As fracções são avaliadas em relação à presença de anticorpos xeno-reactivos anti Galai,3Gal utilizando o teste ELISA, tal como descrito no Exemplo E3 acima. Utilizando o material do Exemplo D2 pelo menos 200 ml do soro do sangue humano coagulado por ml de gel é limpo num único passo.

Exemplo E5: Comparação da afinidade de ligação e especificidade de anticorpo de D2b, D6 e D7 73 ΡΕ0970114

Um volume de 200 ml de soro é feito passar através de uma primeira coluna cheia com D6 e testado com o teste ELISA (de acordo com o Exemplo E3) . 0 soro é, subsequentemente, feito passar através de uma segunda coluna cheia com D2b, testado, e então feito passar através de uma terceira coluna cheia com D7 e testado novamente com ELISA. São analisadas as amostras que saem de cada coluna. Cada uma das colunas testadas é muito eficiente na remoção de anticorpos contra o tipo de oligossacárido que contém. Deste modo, D6 é eficiente na remoção de anticorpos de ligação a dissacáridos, D2b remove os anticorpos de ligação a trissacáridos e D7 remove os anticorpos de ligação a polissacáridos. 0 soro que é feito passar através da coluna fica sem anticorpos contra os dois epítopos contidos nestas duas colunas, mas retém anticorpos contra o terceiro epitopo. O soro que passa todas as três colunas fica sem anticorpos contra todos os três sacáridos.

Exemplo E6: Afinidade de ligação e especificidade de anticorpo de coluna de leito misto 2 ml de D6, 2 ml de D2b e 1 ml de D7 são misturados. 0 material vai encher uma coluna de 5 ml e 200 ml de soro humano é feito passar através desta. Fracções de 10 ml de cada vez. Cada segunda fracção recolhida é avaliada. As fracções são avaliadas por ELISA em relação a todos os três antigénios α-galactosilados e também em relação à toxicidade relativa às células PK1. A coluna de leito misto remove eficientemente a actividade anti-pGal do 74 ΡΕ0970114 soro, tal como medido pelos três testes ELISA descritos no Exemplo E3.

Exemplo E7: Ligação de anticorpos a células de porco

Amostras de soro após passagem em cada coluna (Exemplo E5) são avaliadas no que se refere à ligação a células PK15 de porco (ATCC #CCL-33) . As células são tripsinizadas e lxlO6 células são suspensas em 0,3 ml de PBS/0,1% BSA. As células são incubadas com 0, 040 ml de amostra de soro (pré-tratado durante 10 min, a 56°C) durante 30 min em gelo. As células são tomadas em 3 ml de PBS, centrifugada e ressuspensa em 0,3 ml de BSA 10%. Uma aliquota de 0,004 ml de um anticorpo secundário (anti hlgG/FITC Jackson Immunoresearch #109-096-098 ou anti hlgM/FITC Jackson Immunoresearch #109-096-129) é adicionado e incuba-se, durante 30 min, em gelo. Após lavar uma vez com PBS as células são analisadas por FACS. A fluorescência média do soro humano coagulado é de 480, do soro após a coluna D6 (Exemplo E5) é de 117, do soro após as colunas D6 e D2b (Exemplo E5) é de 80, do soro após as colunas D6, D2b e D7 (Exemplo E5) é de 54 e do soro após a coluna de leito misto (Exemplo E6) é de 52 (todos obtidos com o anticorpo anti-hlgG). Resultados semelhantes são obtidos com as medições de anti-hlgM.

Exemplo E8: Imunoaferese de anticorpos anti-aGal em babuínos 75 ΡΕ0970114

Um volume de 7 ml de D6, 7 ml de D2b e 5 ml de D7 é combinado com 45 ml de Sefarose CL2B (Pharmacia)para fazer uma coluna de imunoaférese. A coluna é utilizada com um sistema de imunoaférese Citem 10 (Excorim) para remover anticorpos anti-a-Gal de 2 babuínos (6 kg de peso) . Após passagem de 600 ml e 500 ml, respectivamente, através da coluna (ca, 2 volumes de sangue) o título de anticorpo anti-a-Gal caiu para 10% dos níveis iniciais (medido através de ELISA em relação a Clg, Exemplo E3).

Lisboa, 10 de Outubro de 2006

Claims (13)

1. ΡΕ0970114 1 REIVINDICAÇÕES um em um 1. Conjugado de poliamida compreendendo grupo xenoantigénico ligado a um esqueleto de poliamida, que o esqueleto de poliamida compreende, pelo menos, elemento estrutural de fórmula Iaa \ em que r03s-y- é um grupo de fórmula Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf

   ΡΕ0970114 2 ou OH OH

   CW).
2. 2. Conjugado de poliamida de acordo com a reivindicação 1, em que o esqueleto de poliamida está ligado a uma entidade macromolecular ou macroscópica e ainda a) compreende, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula II,

   <il> \ em que A' é um grupo ponte trivalente; R1' é uma ligação directa ou alquileno Ci-C6; X1' é -C(0)0-, -C (0) NR-, -NR-, -S- ou -0-; R2' é uma ligação directa ou grupo ponte bivalente; X2' é uma ligação directa ou -0- ou -NR-; em que R é hidrogénio, OH, alquilo C1-C12, alcenilo C2_Ci2, cicloalquilo C3-C8, cicloalcenilo C3-C8, heterocicloalquilo C2-C7, 3 ΡΕ0970114 heterocicloalcenilo C2-C11, arilo C6 ou Cio, heteroarilo C5-Cg, aralquilo C7-C16, aralcenilo Cs_Ci6, com alcenileno C2-C6 e arilo C6 ou Cio, ou diaril C6 ou Ci0-alquilo Ci-Ce; e Y' é uma ligação directa ou um grupo ponte bivalente; com a condição de que X1” não é -NR-, -S- ou -O- quando R1 é uma ligação directa. e b) está ligado a uma entidade macromolecular ou macroscópica através de y' do elemento estrutural de fórmula II.
3. 3. Conjugado de poliamida de acordo com a reivindicação 2, em que o esqueleto de poliamida compreende, pelo menos, um elemento estrutural de fórmula Vila

   MCHjfc Q .Ff m) em que -Y'-R1 é um grupo de fórmula Vg /'SepfiaroseY
4. \4 FF b Q o A.„ H: |CVg):. 1 Conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o esqueleto de poliamida compreende adicionalmente, pelo menos, um 4 ΡΕ0970114 elemento estrutural de fórmula VIb

   íayrN p o mpH ÉVIb) \
5. 5. Conjugado de poliamida de acordo com a reivindicação 4, em que a soma média de elementos estruturais [n] está (a) na gama de 200 a 300 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2 e a razão de elementos estruturais de fórmula Iaa [x] é de 5 a 30%; ou está na gama de 900 a 1200 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2 e [x] é de 5 a 50%; com uma razão de elementos estruturais de fórmula VIb [z] variando de 45 a 94%; R03a-y- sendo idênticos ou diferentes e sendo seleccionados dos grupos de fórmulas Vb, Vc, Vd, Ve e Vf; ou (b) na gama de 200 a 300 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2, a razão de elementos estruturais de fórmula Iaa [x] em que R03a-Y- e um grupo seleccionado dos grupos de fórmulas Vb, Vc, Vd, Ve e Vf é de 5 a 30% e a razão de elementos estruturais de fórmula Ilb [y]

   \ em que A', R1', X1', R2' e X2 são definidos tal como na é de reivindicação 2 e Z-Y'' é H2N [ (CH2) 2O] (CH2) 2NHC (CH2) 3-, 5 ΡΕ0970114 1 a 5%; ou na gama de 900 a 1200 com uma polidispersidade de 1,1 a 1,2, [x] é 5 a 50% e [y] é de 1 a 5%; com uma razão de elementos estruturais de fórmula VIb [z] variando de 45 a 94%.
6. 6. Composição compreendendo um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 5 ou uma mistura de tais conjugados de poliamida para utilização num método para remover xenoanticorpos de fluidos corporais humanos ou para induzir tolerância ou anergia a epitopos xenoantigénicos ou visar especificamente células B com receptores de xenoantigénios.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6 em que o conjugado de poliamida compreende, pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo xenoantigénico é derivado de dissacárido, pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo xenoantigénico é derivado de trissacárido e pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo xenoantigénico é derivado de um pentassacárido, com uma razão de 1:1:1 ou uma mistura de conjugados de poliamida, compreendendo cada conjugado grupos xenoantigénicos idênticos, sendo os grupos xenoantigénicos derivados de um dissacárido, um trissacárido ou um pentassacárido, estando os conjugados presentes na composição com uma razão de 1.1:1.
8. 8. Composição compreendendo um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, ou uma mistura de tais conjugados de poliamida para 6 ΡΕ0970114 utilização num método para remoção de xenoanticorpos de fluidos corporais humanos.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8 em que o conjugado de poliamida compreende, pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo biologicamente activo é derivado de um dissacárido, pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo biologicamente activo é derivado de um trissacárido e pelo menos, um elemento estrutural em que o grupo biologicamente activo é derivado de um pentas-sacárido, com uma razão de 1:1:1 ou uma mistura de conjugados de poliamida, compreendendo cada conjugado de poliamida grupos biologicamente activos idênticos, sendo os grupos biologicamente activos derivados de um dissacárido, um trissacárido ou um pentassacárido, estando os conjugados presentes na composição na razão de 1:1:1.
10. 10. Cartucho de cromatografia de afinidade compreendendo como adsorvente um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5 ou uma mistura destes ou uma composição de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9.
11. 11. Utilização de um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 5, ou uma composição de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, para a preparação de um medicamento para remover intracorporalmente anticorpos xenoantigénicos de um recep-tor de xenoenxerto. 7 ΡΕ0970114
12. 12. Utilização de um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 5, ou uma composição de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, para a preparação de um medicamento para induzir tolerância ou anergia intracorporalmente em epítopos xenoantigénicos ou para visar especificamente células B com receptores xenoantigénicos
13. 13. Utilização de um conjugado de poliamida de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, ou uma composição de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, para a preparação de um agente para remoção extracor-poral de anticorpos de um fluido corporal humano. Lisboa, 10 de Outubro de 2006