CN1252807A - 新糖蛋白 - Google Patents

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Abstract

聚酰胺共轭物,包含键合到聚酰胺主链上的(a)异种抗原基;或(b)生物活性基和大分子、大的或小的实体,它们的制备方法和这些共轭物在治疗组合物中的用途。

Description

新糖蛋白
本发明涉及新颖的聚酰胺共轭物、它们的制备方法和这些共轭物在治疗性组合物中的用途。
在人与人之间进行的移植术所需的供体器官越来越缺乏，使人们对异种移植(从非人类的动物到人类的移植)产生了浓厚的兴趣。目前，研究的焦点在于将易为利用的动物作为器官来源，例如猪。不过，猪到人的异种移植不得不克服一系列障碍，其中最直接和明显的是超急性排斥(HAR)。HAR是由预先生成的“天然”多克隆抗体引起的，后者主要针对含有末端Galα1，3Gal结构的碳水化合物细胞表面抗原决定部位(抗αGal)。此外，也可能存在针对猪内皮上含有的N-羟乙酰基神经氨糖酸结构的其他抗体。
为了使移植物长期存活，需要一些策略来对付异种反应性抗体。一种方法是通过注射高亲和力的配体来除去抗体，该配体可以充当抗体沉积在移植组织上的抑制剂。另一种方法是免疫除去法，它是血浆除去法的进一步发展，是在临床上制定的类似于透析的操作程序。免疫除去法涉及血液的体外处理，首先分离血细胞，然后使血浆通过免疫亲和柱，将血细胞与排除了抗体的血浆再次混合，将该血液重新输入到患者体内。
因此，人们需要能够体内键合的配体和能够体外键合的柱材料，它们都能以较高亲和力与多克隆异种反应性抗体键合。
本发明涉及聚酰胺共轭物，其包含键合到聚酰胺主链上的
(a)异种抗原基；或
(b)生物活性基和大分子、大的或小的实体；
其中该聚酰胺主链包含至少一个式I的结构单元
Figure A9880428300071
在(b)的情况下，还包含至少一个式II的结构单元
Figure A9880428300081
其中
A和A’各自独立为三价桥连基；
R1和R1’各自独立为直接的键或C1-C6亚烷基；
X1和X1’各自独立为-C(O)O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-或-O-；
R2和R2’各自独立为直接的键或二价桥连基；
X2和X2’各自独立为直接的键或-O-或-NR-；其中的R为氢、OH、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C2-C7杂环烷基、C2-C11杂环烯基、C6或C10芳基、C5-C9杂芳基、C7-C16芳烷基、具有C2-C6亚烯基和C6或C10芳基-的C8-C16芳烯基、或二C6或C10芳基-C1-C6烷基；
Y和Y’各自独立为直接的键或二价桥连基；
其条件是当R1或R1’是直接的键时，X1或X1’不是-NR-、-S-或-O-。
当本发明的聚酰胺主链包含一个以上式I或II的结构单元时，这些单元可以是相同或不同的。它可以是均聚的或共聚的，也可以是另外具有例如其他氨基羧酸等共聚单体的共聚物。共聚主链可以是嵌段聚合物，也可以是统计聚合物。若三价桥连基为手性，聚酰胺主链可以统一具有L构型或D构型，或者含有两种构型的结构单元，作为均一的嵌段或包括外消旋物(1∶1混合物)的统计学混合物。
聚酰胺主链的结构单元的平均总数[n]可以在10至10000的范围内，优选为50至1500，更优选为250至1200，最优选为900至1200。多分散性可以在1.001至2.0的范围内，优选为1.1至1.5，更优选为1.15至1.2。
任何烷基和亚烷基原子团或部分都可以是直链或支链的。优选地，烷基为C1-C18烷基，更优选为C1-C4烷基，例如可以是甲基、乙基、正或异丙基、正、异或叔丁基。优选地，链烯基可以含有2至7个C原子。芳基或杂芳基可以是5元或6元环、或两个稠合环的双环原子团，杂芳基中存在的一个或几个杂原子选自0、N和S原子。例子包括苯基、萘基、呋喃基、吡咯基等等。芳烷基优选具有7至12个C原子，可以是苯基C1-C6烷基，例如苄基或苯乙基。芳烯基的一个例子是肉桂基。A或A’可以是具有至少三价的单原子，例如C、N或Si；特别是
Figure A9880428300091
其中Raa为H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C7环烷基、苯基或苄基。
R2或R2’作为二价桥连基，可以含有1至35个、优选为1至20个、特别是1至16个C原子，例如C1-C35亚烷基、C2-C8亚烯基、C2-C8亚炔基、C3-C12亚环烷基、C6-C10亚芳基或C7-C35亚芳烷基，其中的亚烷基、亚烯基和亚炔基原子团或部分可以被一个或几个选自-O-、-S-、-C(O)-、-SO2-和-HN-的基团中断。
桥连基R2或R2’例如可以符合式III
-R5-X5-R6-X4-R7-(III)
其中
X5和X4各自独立为直接的键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-SO2O-、-OSO2-、-OSO2O-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)NH-、-NHSO2-、-SO2NH-、-NHSO2O-、-OSO2NH-或-NHSO2NH-；
R5和R7各自独立为直接的键、C1-C20亚烷基、C5或C6亚环烷基、C6-C10亚芳基或C7-C12亚芳烷基；
R6为直接的键或C1-C20亚烷基，该亚烷基可选地被一个或几个O原子中断，优选为2个；
其条件是当R6是直接的键时，X4也是直接的键。
优选地，R2或R2’可以是亚氧烷基或聚亚氧烷基，更优选地在亚烷基中具有2至4个C原子、特别是2或3个C原子，并且具有2至20个、优选为2至10个亚烷基单元，尤其是亚丙氧基和聚亚丙氧基，例如具有2至20个、优选为2至10个亚丙氧基单元的聚亚丙氧基。
以下把包含异种抗原基但不合大分子、大的或小的实体的聚酰胺共轭物称为“I型共轭物”，把包含生物活性基和大分子、大的或小的实体的聚酰胺共轭物称为“II型共轭物”。
在I型共轭物中，异种抗原基通过式I结构单元的Y结合到聚酰胺主链上。I型共轭物可以包含一个或几个相同或不同的异种抗原基。
异种抗原基可以是用已知方法可鉴别的任意基团，例如US5695759所公开的方法(关于该方法的内容结合在此作为参考)，包括用异种移植物灌注血液，藉此从人血液中离析异种抗体，例如从异种移植物中除去键合的抗体，利用这些抗体例如通过适当的免疫测定法筛选出候选的抗原决定部位。
异种抗原基可以优选地从低聚糖衍生而来，该低聚糖在其还原末端终止于α-连接的D-吡喃半乳糖或N-羟乙酰基神经氨糖酸。
典型情况(关于I型和II型共轭物)下，低聚糖可以由1至20个、优选为1至15个、特别是1至10个糖单体组成，选自天然来源和修饰的糖单体。借助于下列有机化学或生物化学的标准著作，技术人员可熟悉天然来源和修饰的糖单体，和包含这些糖单体的低聚糖，例如最初由化学会编辑、现由伦敦皇家化学会编辑的《专业期刊报道》(Specialist Periodical Reports)，伦敦皇家化学会编、Ferrier等著《碳水化合物化学》(Carbohydrate Chemistry)29(1997)。
糖单体的例子包括D-与L-吡喃醛糖和D-与L-呋喃醛糖，例如甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖；D-与L-吡喃酮糖和D-与L-呋喃酮糖，例如二羟基丙酮、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖；以及D-与L-吡喃二酮糖，例如戊二酮糖(pentodiulose)和己二酮糖(hexodiulose)。
糖单体一词也包括是所举例子变体的糖单体，例如被保护的、部分被保护的或未被保护的D-与L-构型的脱氧糖，优选为2-、3-、4-、5-和6-脱氧醛糖，如岩藻糖、鼠李糖和洋地黄毒糖；1，2-二脱氧醛糖，如葡萄烯糖(glucal)、半乳醛和岩藻醛(fucal)；1-、3-、4-、5-和6-脱氧酮糖；D-与L-构型的2-、3-、4-、5-和6-脱氧氨基糖，如葡萄糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺和岩藻糖胺；和脱氧酰氨基糖，如N-酰基葡萄糖胺、N-酰基甘露糖胺、N-酰基半乳糖胺和N-酰基岩藻糖胺，优选为它们的C1-C4烷基酯。另外，这些变体被理解为指的是醛糖糖酸、醛糖二酸和糖醛酸，如葡糖酸或葡糖醛酸，以及抗坏血酸和携带氨基酸的糖单体。修饰的糖单体也被理解为指的是具有一个长于6个C原子的碳链的糖单体，如庚糖、辛糖、壬糖、庚酮糖、辛酮糖和壬酮糖，以及根据上面列举的条件而被取代的其代表产物，如酮基脱氧辛酸、酮基脱氧壬酸、N-酰基神经氨糖酸和N-酰基胞壁酸(muraminic acid)。
如果二、三、四或五个上述相同或不同的单体装配在一起，那么所得的糖表示为二糖、三糖、四糖或戊糖。键优选为α-O-配糖键或β-O-配糖键，例如(1→2)-、(1→3)-、(1→4)-、(1→5)-、(1→6)-、(2→3)-和(2→6)-配糖键。二糖的例子为海藻糖、槐糖、曲二糖、昆布二糖、麦芽糖、纤维二糖、异麦芽糖、龙胆二糖、蔗糖和乳糖，及它们的衍生物。三糖的例子为棉子糖和松三糖。而且，低聚糖可以通过S-、N-和C-配糖键连接，例如-S-、-NR12-、-NR12C(O)-或-CR13R14-，其中R12、R13和R14彼此独立为H、C1-C12烷基、C5或C6环烷基、C5或C6环烷基甲基或乙基、苯基、苄基或苯乙基。
在I型共轭物中，单独或以任意组合或其亚组合使用的下列含义是优选的：
(a)A为C1-C6烷三基(alkanetriyl)，更优选为甲烷三基(methanetriyl)；
(b)R1为C1-C6亚烷基，更优选为-(CH2)4-；
(c)X1为-NR-，其中的R具有上述含义，更优选地X1为-NH-；
(d)R2为直接的键；
(e)X2为直接的键；
(f)Y为式III基团，其中的R5为C1-C8亚烷基，X5为-NH-，R6为直接的键，X4为-C(O)-，R7为C1-C8亚烷基，
优选地Y为式IIIa基团
-(CH2)mNHC(O)(CH2)3-            (IIIa)
其中的m是一个1至8的数字，优选为1至6；
其中关于式I，-(CH2)3-键合到S上；
(g)异种抗原基、以下称之为R3a，是式IVa1、IVb1、IVc1、IVd1或IVe1基团
Figure A9880428300121
其中各Rz独立为ORz1、SRz1或NHXzRz1，其中的Xz为-C(O)-、-C(S)-、-S(O)2-、-C(O)Y-或-C(S)Y-，其中的Y为-NH-、-O-、-S-、-S-C1-C6亚烷基、-NH-C1-C6亚烷基、-O-C1-C6亚烷基、-C1-C6亚烷基-O-、-C1-C6亚烷基-S-、-C1-C6亚烷基-NH-、-C1-C6亚烷基-O-C(O)O-、-C1-C6亚烷基-S-C(O)O-或-C1-C6亚烷基-NH-C(O)O-，Rz1为氢、C1-C20烷基、C2-C20链烯基、C3-C15环烷基、C3-C15环烯基、C6-C10芳基、C7-C20芳烷基或C2-C9杂芳基，其中的烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、芳烷基和杂芳基是未取代的或被一个或几个取代基取代，取代基选自OH、卤素、卤代C1-C20烷基、硝基、C1-C18烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烯氧基、氨基、一-C1-C18烷基氨基、二-C1-C18烷基氨基、苄氨基、SO3H、SH、硫代C1-C18烷基和NHC(O)-C1-C18烷基；
Zz为-O-或-NHC(O)-；
优选为式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基团
Figure A9880428300131
特别优选的I型共轭物中，R3a-Y-为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团
Figure A9880428300132
一小类优选的I型共轭物包含至少一个式I*结构单元
Figure A9880428300142
其中A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定义的，R3a为异种抗原基，更优选为式Ia1a的结构单元，最优选为式Iaa的结构单元，
其中Y为式IIIa基团，R03a为式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基团。
特别优选的I型共轭物包含至少一个式Iaa的结构单元，其中-Y-R03a为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团。
按照本发明，I型共轭物的聚酰胺主链可以另外包含至少一个式VI的结构单元，
Figure A9880428300151
其中
A”、R1”、X1”、R2”和X2”独立地分别具有如上A、R1、X1、R2和X2所定义的含义和优选含义，
R8为极性基团，优选为多羟基-C2-C12烷基或多羟基-C3-C12环烷基，更优选为具有1至6个、优选为2至5个羟基的多羟基-C2-C6烷基或多羟基-C3-C6环烷基，最优选为-CH2CHOHCH2OH。
一小类优选的式VI结构单元为式VIa其中R8是如上定义的。特别优选的式VI结构单元为式VIb1更优选为式VIb
Figure A9880428300154
特别优选的I型共轭物包含至少一个式I*的结构单元和至少一个式VI的结构单元，其中A、A”、R1、R1”、X1、X1”、R2、R2”、X2、X2”、Y、R3a和R8具有上述含义和优选含义。
最优选的I型共轭物包含至少一个式Iaa的结构单元，其中-Y-R03a为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团，和至少一个式VIb的结构单元。
在新颖的I型共轭物中，式I*和式VI结构单元的含量例如可以是0.1至99.9mol％，在I型共轭物仅由式I*和式VI结构单元组成的情况下，二者的值加起来等于100％。对于式I*的结构单元来说，含量例如可以是1至50％，优选为10至30％。对于式VI的结构单元来说，含量可以是0至99％，优选为70至90％。
优选的I型共轭物是其中结构单元的平均总数[n]在200至300的范围内，多分散性为1.1至1.2，式Iaa结构单元的比例[x]为5至30％，或者[n]在900至1200的范围内，多分散性为1.1至1.2，[x]为5至50％；式VIb结构单元的比例[z]为45至94％；R03a-Y-是相同或不同的，并且选自式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基团。
优选的I型共轭物例子是其中
(a)n为250，若R3a-Y-为式Vb基团，则[x]为25％；+75％[z]；
(b)n为250，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为8％；+92％[z]；
(c)n为250，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为16％；+84％[z]；
(d)n为250，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为41％；+59％[z]；
(e)n为250，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为61％；+39％[z]；
(f)n为250，若R3a-Y-为式Vd基团，则[x]为23％；+77％[z]；
(g)n为250，若R3a-Y-为式Vf基团，则[x]为22％；+78％[z]；
(h)n为1000，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为24％；+76％[z]；
(i)n为1050，若R3a-Y-为式Vb基团，则[x]为21％；+79％[z]；
(j)n为1050，若R3a-Y-为式Vc基团，则[x]为28％；+72％[z]；
(k)n为1050，若R3a-Y-为式Vf基团，则[x]为25％；+75％[z]；
(1)n为1050，若R3a-Y-在式I*结构单元三分之一中为式Vb基团，在另三分之一中为式Vc基团，在另三分之一中为式Vf基团，则[x]为27％；+73％[z]；
特别例如(i)至(1)。
可以得到新颖的I型共轭物的方法包括：使包含至少一个式VII结构单元的聚酰胺
Figure A9880428300171
其中A、R1、X1、R2和X2是如上定义的，X3为卤素，该聚酰胺例如可以由WO 97/19105所公开的方法得到，
与式VIIIa’的硫醇反应，
R3a-Y-SH             (VIIIa’)
其中R3a和Y是如上定义的。
该硫醇是已知的，或者可以按照已知方法制备，例如使氨基官能化的异种抗原、如低聚糖与硫代内酯反应。
若异种抗原为一种糖类，它可以按照常规化学过程制备，即利用酶或者随后用一种混合方法。酶在制备低聚糖衍生物中的用途例如公开在WO 97/28173和WO 97/28174中。
可以得到另外包含至少一个式VI结构单元的I型共轭物的方法包括：使包含至少两个式VII结构单元的聚酰胺与一个或几个化合物反应，该化合物选自式VIIIa’的硫醇和式IX的硫醇
R8-SH                       (IX)
其中R8是如上定义的。
优选地，反应可以在一种强的、非亲核性碱的存在下进行，优选为具有至少一个叔N原子的有机碱；特别是二环或多环胺。例子为奎宁环和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1，5-5)(DBU)。碱的用量可以至少为等摩尔量，优选为轻微过量。
反应也可以利用碱金属硫醇盐R3aSM来进行，其中M为一种碱金属，例如Li或Na。
可以使用一种极性非质子传递溶剂，优选为氮二烷基化的羧酰亚胺、内酰胺、亚砜或砜，例如二甲基甲酰胺。加入或不加入水都可进行反应，例如所加入水的量使聚合物保持在溶液中。实施例A至C1公开了制备I型共轭物的非限制性详细描述。
新颖的I型共轭物具有有趣的性质，特别是它们具有对体液、例如血液中存在的人多克隆异种反应性抗体的亲和力，可用作配体或排除剂。优选地，I型共轭物用于异种抗体的体内排除，方法是在异种移植物的移植之前和/或之后，将I型共轭物给药，例如注射、输入或灌注到异种移植物接受者体内。剂量可以是每次注射0.0001至10、优选为0.01至5、更优选为0.2至2mg每kg体重。根据需要，可以在移植前和/或移植后重复给药，只要抗体的去除具有治疗上的益处。
新颖的I型共轭物也可以用作药物，用于诱导对异种抗原的抗原决定部位产生耐受性或无变应性，或者用来特定地对准具有异种抗原受体的B细胞。当在异种移植物的移植之前例如通过注射给药到异种移植物接受者体内时，I型共轭物的剂量可以是每次注射0.0001至10、优选为0.001至5、更优选为0.02至2mg每kg体重。根据需要，可以重复注射，以达到耐受性。
I型共轭物的给药方式可以是以单一的共轭物，或者不同I型共轭物的混合物本身的方式或以适合于静脉内给药的组合物的方式，例如为此加之以一种或几种药学上可接受的载体或稀释剂。这样的混合物可以包含具有不同聚酰胺主链和/或异种抗原基的I型共轭物。
优选的组合物中，I型共轭物包含相同或不同的异种抗原基，或者优选的组合物包含I型共轭物的混合物，每种共轭物包含相同或不同的异种抗原基，该异种抗原基来源于一种二糖、优选为式IVb基团，一种三糖、优选为式IVc或IVd基团，或一种戊糖、优选为式IVe或IVf基团。优选地，组合物可以包含这样一种I型共轭物，它包含一个来源于二糖的基团、一个来源于三糖的基团和一个来源于戊糖的基团，其比例为5至0.1∶5至0.1∶5至0.1，优选的比例为1∶1∶1，或者组合物可以包含I型共轭物的混合物，每种共轭物包含相同的异种抗原基，该异种抗原基来源于一种二糖、一种三糖或一种戊糖，组合物中存在的共轭物比例为5至0.1∶5至0.1∶5至0.1，优选的比例为1∶1∶1。
按照上述，本发明进一步提供了：
(a)用作药物的I型共轭物，优选地用作用于从人体液中除去异种抗体的药剂，或者用作在诱导耐受性或无变应性中提供异种抗原的配体；
(b)从异种移植物接受者中除去异种抗原的抗体的方法，该方法包括在体内使所述体液与(a)下的I型共轭物接触；
(c)用于在需要接受治疗的受治疗者中，诱导对异种抗原的抗原决定部位产生耐受性或无变应性、或者用来特定地对准具有异种抗原受体的B细胞的方法，该方法包括在异种移植物的移植之前和/或之后，将有效量(a)下的I型共轭物例如通过注射、输入或灌注给药到异种移植物接受者体内；
(d)包含一种(a)下的I型共轭物或如上文所公开的I型共轭物混合物的组合物，优选用在一种方法中，该方法用于从人体液中除去异种抗体或诱导对异种抗原的抗原决定部位产生耐受性或无变应性、或特定地对准具有异种抗原受体的B细胞。
在II型共轭物中，生物活性基通过式I结构单元的Y共轭连接到聚酰胺主链上，大分子、大的或小的实体通过式II结构单元的Y’共轭连接到聚酰胺主链上。II型共轭物可以包含一种或几种相同或不同的生物活性基。II型共轭物可以包含一种或几种相同或不同的大分子、大的或小的实体。单独一个实体可以连接到来自同一条聚酰胺主链的一个、或同时2个或多个结构单元上。另一种选择是，单独一个实体可以同时连接到来自不同聚酰胺主链的一个或几个结构单元上。
生物活性基的例子是来源于下列物质的原子团：生物碱、碳水化合物、维生素、肽、蛋白质、共轭蛋白、脂质、萜类、低聚核苷酸、抗原和抗体；或任意其他配体，优选以多价方式被其受体或细胞表面识别。优选地，生物活性基来源于抗原，优选为异种抗原，更优选为一种低聚糖，该低聚糖在其还原末端终止于α-连接的D-吡喃半乳糖或N-羟乙酰基神经氨糖酸，例如上文有关I型共轭物的描述。
大分子、大的或小的实体的例子有球状蛋白质，如血清白蛋白或KLH；聚合物，如聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙二醇、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、它们的共聚物及嵌段聚合物、天然及修饰多糖；玻璃珠，硅胶，硅藻土，和由聚集或交联的脂质单层或双层、或多个双层形成的结构。如果大分子、大的或小的实体是一种多糖，它可以由20个以上的糖单体组成，分子量由几千至高达一亿。天然和修饰多糖是为技术人员所熟悉的，它们具有不同的循环单糖单元、链长和支化度的性质。修饰的天然多糖可以包括可通过天然多糖与单、双或多官能的试剂或氧化剂的反应而得到的衍生物，该反应可以通过成醚、成酯或选择性氧化作用，基本上是以多糖羟基的修饰为基础的。特别有用的是交联的多糖，优选为三维连接的多糖。天然和修饰多糖的例子有天然和修饰的淀粉、纤维素、葡聚糖和琼脂糖。作为交联、优选为三维连接的多糖，特别有用的是Sephacryl和琼脂糖Sepharose及其衍生物，例如NHS活化的CH-Sepharose4B或NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow(商业上可得到的)。
在II型共轭物中，单独或以任意组合或其亚组合使用的A、A’、R1、R1’、X1、X1’、R2、R2’、X2和X2’各自独立地具有如上I型共轭物给出的优选含义之一，包括：
(g)Y’为式III基团，其中R5为直接的键，X5为-NH-，R6为-[(CH2)2O]2(CH2)2-，X4为-NHC(O)-，R7为C1-C8亚烷基，
优选地，Y’为IIIb基团
-NH[(CH2)2O]2(CH2)2NHC(O)(CH2)3- (IIIb)
其中关于式II，-(CH2)3-是连接到S上的；
(h)生物活性基、以下称之为R3，是上式IVa1、IVb1、IVc1、IVd1或IVe1基团，优选为上式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基团；
(i)大分子、大的或小的实体以下称之为R4，优选来源于天然或修饰多糖，更优选来源于纤维素、琼脂糖或琼脂糖凝胶，特别是来源于NHS活化的CH-Sepharose 4B或NHS活化的Sepharose 4 FastFlow，最优选来源于NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow。
特别优选的II型共轭物中，R3-Y-为上式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团。
一小类优选的II型共轭物包含至少一个式I**的结构单元
Figure A9880428300211
其中A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定义的，R3为生物活性基，更优选为式Ia1的结构单元
Figure A9880428300212
最优选为式Ia的结构单元
Figure A9880428300213
其中的Y为式IIIa基团，R03为式IVa、IVb、IVc、IVd、IVe或IVf基团。
特别优选的II型共轭物包含至少一个式Ia的结构单元，其中-Y-R03为Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团。
特别优选的II型共轭物中，R4-Y’-为式Vg基团一小类优选的II型共轭物包含至少一个式II*的结构单元
其中
A、R1、X1、R2、X2和Y是如上定义的，R4为大分子、大的或小的实体，
更优选为式IIa1的结构单元
Figure A9880428300223
最优选为式IIa的结构单元
Figure A9880428300224
其中的-Y’-R04为式Vg基团。
按照本发明，II型共轭物的聚酰胺主链可以另外包含至少一个式VI的结构单元，其全部含义和优选含义同上。
特别优选的II型共轭物包含至少一个式I**的结构单元、至少一个式II*的结构单元和至少一个式VI的结构单元，其中A、A’、A”、R1、R1’、R1”、X1、X1’、X1”、R2、R2’、R2”、X2、X2’、X2”、Y、Y’、R3、R4和R8具有如上所述的含义和优选含义。
最优选的II型共轭物包含至少一个式Ia的结构单元、其中-Y-R03为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团，还包含至少一个式IIa的结构单元和至少一个式VIb的结构单元。
在新颖的II型共轭物中，式I**、II*和VI结构单元的含量例如为0.1至99.9mol％，在II型共轭物仅由式I**、II*和VI结构单元组成的情况下，各值相加之和等于100％。对式I**的结构单元来说，其含量例如可以是1至50％，优选为10至30％。对式II*的结构单元来说，其含量例如可以是0.1至20％，优选为0.1至5％。对式VI的结构单元来说，含量可以是0至98.9％，优选为50至98.9％。下表公开了有用的比例的例子：
  单元I**(％)   25   13   14   23   20   21.5   16  12.5   16
  单元II*(％)   2   2.6   2.6   3   3     2   2.5   2.5   2.5
优选的II型共轭物是其中结构单元的平均总数[n]在200至300的范围内，多分散性为1.1至1.2，式Ia结构单元的比例[x]为5至30％，式中的R03-Y-基团选自由Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基团组成的组，式IIb结构单元(式IIa结构单元的中间体，见下)的比例[y]为1至5％
Figure A9880428300231
其中Z-Y”为H2N[(CH2)2O](CH2)2NHC(O)(CH2)3-；
或者是其中[n]在900至1200的范围内，多分散性为1.1至1.2，[x]为5至50％，[y]为1至5％；
式VIb结构单元的比例[z]为45至94％。
优选的II型共轭物例子是其中
(a)n为250，若R3-Y-为式Vc基团，[y]为2％，则[x]为25％；+73％[z]；
(b)n为250，若R3-Y-为式Vc基团，[y]为2.6％，则[x]为14％；+83.4％[z]；
(c)n为250，若R3-Y-为式Va基团，[y]为2％，则[x]为21.5％；+76.5％[z]；
(d)n为1050，若R3-Y-为式Vc基团，[y]为2.6％，则[x]为13％；+84.4％[z]；
(e)n为1050，若R3-Y-为式Vb基团，[y]为2.5％，则[x]为16％；+81.5％[z]；
(f)n为1050，若R3-Y-为式Vf基团，[y]为2.5％，则[x]为12.5％；+85％[z]；或
(g)n为1050，若R3-Y-为式Ve基团，[y]为2.5％，则[x]为16％；+81.5％[z]；
特别例如(d)至(g)。
可以得到新颖的II型共轭物的方法包括使包含至少两个上式VII结构单元的聚酰胺与一个或几个选自下组的化合物或实体反应：
式VIII的硫醇
R3-Y-SH                 (VIII)
其中的R3和Y是如上定义的，
式VIIIa的硫醇
Z-Y”-SH                   (VIIIa)
其中Y”为式III的桥连基，其中R5为直接的键，其他含义是如上定义的，Z为氢或X4的保护基团，优选为氨基保护基团，
和适当衍生的大分子、大的或小的实体。
包含由式VII结构单元与式VIIIa硫醇反应生成的结构单元的聚酰胺共轭物可以在除去保护基团Z后，方便地与式VIII硫醇或适当衍生的大分子、大的或小的实体进行进一步反应。
对“适当衍生的大分子、大的或小的实体”一词的理解是指携带至少一个适于与式IIb结构单元反应的官能团的大分子、大的或小的实体。用于大实体偶联的官能团例子是为技术人员所已知的，例如描述在Gabius and Gabius(Eds.)《凝集素与癌症》53ff，Springer Verlag，Berlin Heidelberg(1991)中。例如胺/活化的羧酸酯(N-羟基-琥珀酰亚胺酯、五氟苯基酯)、胺/环氧化物、胺/异氰酸酯、胺/异硫氰酸酯、胺/Michael受体(马来酰亚胺)、硫醇/适硫物(thiophil)和胺/醛。
衍生的大分子、大的或小的实体可以通过大分子、大的或小的实体与已知的双官能连接体的反应来制备。
按照上文公开的得到式VIIIa’硫醇的方法，可以得到式VIII和VIIIa的硫醇。
可以得到另外包含式VI结构单元的II型共轭物的方法包括使包含至少三个式VII结构单元的聚酰胺与一个或几个化合物或实体反应，选自上述式VIII与VIIIa硫醇、适当衍生的大分子、大的或小的实体和式IX硫醇。特别是该方法可以包括使包含至少三个式VII结构单元的聚酰胺与一个或几个选自上式VIII、VIIIa和IX硫醇的化合物或实体反应，消去保护基团Z，并进一步使所得化合物与适当衍生的大分子、大的或小的实体反应。
反应条件可以按照上述I型共轭物的反应条件。
实施例A至D公开了制备II型共轭物的非限制性详细描述。
新颖的II型共轭物具有有趣的性质。特别是它们具有对人多克隆异种反应性抗体的亲和力，可用作人体液亲和色谱法的吸附剂。优选地，体液为血液，特别是血浆。
优选地，II型共轭物用于体外从体液中除去抗体，包括在异种移植物的移植之前和/或之后从异种移植物接受者体内抽出含抗体的体液，通过含有II型共轭物作为吸附剂的亲和色谱法从体液中除去预先形成的抗体，然后将排除了抗体的体液重新输入到接受者体内。
亲和色谱法可以优选地以柱色谱法的方式进行，其中按照本领域技术人员已知的方法用II型共轭物装填柱子，例如US 5149425所述，其有关柱子的装填、贮存和使用方面的内容结合在此作为参考。
II型共轭物可以仅以单独一种共轭物的方式使用，或者以不同II型共轭物本身的混合物的方式使用，或以适用于亲和色谱法的组合物的方式使用。该混合物可以包含具有不同聚酰胺主链、大分子、大的或小的实体和/或抗原基的II型共轭物。
优选的组合物中，II型共轭物包含相同或不同的异种抗原基，或者优选的组合物包含II型共轭物的混合物，每种共轭物包含相同或不同的异种抗原基，该异种抗原基来源于一种二糖、优选为式IVb基团，来源于一种三糖、优选为式IVc或IVd基团，或来源于一种戊糖、优选为式IVe或IVf基团。
用于从患者体液中除去抗体的方法可以按照已知方法进行，例如公开在US 5695759中。优选的接触温度可以在5℃至40℃范围内，优选为25℃至40℃。可以直接将体液连续地重新输入，或者可以先收集，再重新输入。根据需要，可以在移植前和/或移植后重复该方法，只要抗体的除去具有治疗上的益处。
按照上述，本发明进一步提供了：
(a)II型共轭物，优选地在体液的亲和色谱法中用作吸附剂；
(b)从人体液中除去抗体的方法，该方法包括使所述体液与(a)下的II型共轭物进行体外接触，再将体液重新输入到患者体内；
(c)包含(a)下的II型共轭物或如上文所公开的II型共轭物的混合物的组合物，优选地用在从人体液中除去异种抗体的方法中；和
(d)亲和色谱法药筒，包含II型共轭物或其混合物或(c)下的组合物作为吸附剂。
下列实施例没有限制地阐述本发明。
实施例中使用下列缩写：Ac：乙酰基；Bn苄基；Bz：苯甲酰基；DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DMTST：二甲基甲硫基锍三氟甲磺酸酯；eq：当量；GlcNAc：N-乙酰基葡萄糖胺；n：聚合度；Sepharose 4 fast flow：NHS活化的Sepharose 4 Fast F1ow(Pharmacia Biotech)；TESOTf：三乙基甲硅烷基三氟甲磺酸酯；UDP-Gal：尿苷-O(6)-二磷酰基-α-D-半乳糖；RT：室温。
通过对这些化合物的琥珀酰衍生物进行粘度测量和SEC-LALLS(体积排阻色谱法/低角度激光散射法)，测定商业上可从SIGMA得到的聚赖氨酸氢溴化物的平均分子量(M)和多分散性。
A原料化合物的制备
实施例A1：乙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)3的制备
Figure A9880428300271
用类似于制备对应的甲硫基衍生物的方法(Garegg和Oscarson《碳水化合物研究》136：207-213(1985))制备乙基4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷1，并溶(2.12g，4.47mmol)于无水二乙醚(40ml)和无水二氯甲烷(25ml)。在-25℃、氩气下，加入1ml TESOTf(225μl)的无水二乙醚(10ml)溶液。然后在-25℃下，历时7分钟，加入2，3，4，6-四-O-苄基-β-D-吡喃半乳糖基三氯乙酰亚氨化物(acetimidate)2(7.50g，11.18mmol；按照Wegmann和Schmidt《碳水化合物化学杂志》6：357-375(1987)制备)在无水乙醚(22ml)和无水二氯甲烷(11ml)中的溶液。在-25℃下搅拌10分钟后，加入NaHCO3(10％)(50ml)，继续剧烈搅拌10分钟。加入水(100ml)，分离有机相。含水相用二氯甲烷萃取两次(每次80ml)，有机相用水(100ml)和饱和盐水(100ml)洗涤，用MgSO4干燥，在减压下蒸发溶剂。粗产物(10.25g)经硅胶(700g)色谱法纯化，用己烷/乙酸甲酯(5∶1)作为洗脱剂，得到乙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)3。
实施例A2：(3-苄氧基羰基氨基)丙基6-O-苄基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷14的制备
Figure A9880428300272
(a)用4.1M HBr的乙酸(35ml)溶液处理12.55g(20.4mmol)按照Castro-Palomino和Schmidt方法(《四面体快报》36：5343-5346(1995))制备的1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-D-吡喃葡萄糖9。在RT下搅拌18小时后，在冰冷却和搅拌下小心地将该混合物加入到CHCl3(50ml)和NaHCO3水溶液(10％)(400ml)中。用10％NaHCO3中和(pH7)，随后用CHCl3萃取(3次150ml)。有机相用饱和盐水(200ml)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发溶剂，得到粗的1-溴-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-D-吡喃葡萄糖10，不经纯化用于后面的反应中。
(b)向粗产物10(13.15g)的165ml无水甲苯溶液中加入3-苄氧基羰基氨基-1-丙醇(8.61g，41.3mmol)和氰化汞(10.45g，41.3mmol)。混悬液搅拌18小时，用棉絮塞过滤，在减压下蒸发溶剂。残余物经硅胶(1.3kg)色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱剂，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷11。
(c)向乙酸酯11(8.18g，10.7mmol)的无水甲醇(220ml)溶液中加入2.4ml钠(820mg)在无水甲醇(40ml)中的溶液。混合物在RT下搅拌15分钟，随后用Amberlite 15H*阴离子交换树脂(2.8g)处理15分钟。过滤并在减压下蒸发溶剂，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷12。
(d)向粗产物12(6.46g)在乙腈(60ml)和α，α’-二甲氧基甲苯(2ml)中的溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(96mg)。在RT下搅拌15分钟后，混合物用乙酸乙酯(350ml)稀释，用10％NaHCO3水溶液(180ml)萃取，随后用饱和盐水(180ml)萃取。有机相用Na2SO4干燥，在减压下蒸发溶剂。残余物(6.63g)经硅胶(800g)色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)洗脱，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基4，6-二-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷13。
(e)在0℃、氩气下，向缩醛13(3.74g，5.15mmol)的无水THF(150ml)溶液中加入分子筛4(10g)和NaCNBH3(2.91g，46.35mmol)。在搅拌下加入醚合HCl，直到起泡停止。在1.5小时内，再加入两份饱和的醚合HCl(每次5ml)，继续在0℃下搅拌18小时。然后历时90分钟加入另外三份醚合HCl各5ml，45分钟后将混合物倾入冰水(250ml)中。烧瓶用二氯甲烷冲洗，混合物搅拌10分钟。过滤(硅藻土Celite)后用CH2Cl2萃取。含水相用CH2Cl2(100ml)萃取第二遍，有机相用饱和盐水(300ml)洗涤，用Na2SO4干燥，在减压下除去溶剂。残余物(5.03g)经硅胶(60g)色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脱，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基6-O-苄基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷14。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.5-1.8(m，CH2)；3.0-3.25(m，NCH2，OH)；3.40(b，OH)；3.5-3.6和3.77-3.87(2m，OCH2)；3.55-3.65(m，H-C(4)，-C(5))；4.05-4.17(m，H-C(2))；4.2-4.3(m，H-C(3))；4.50和4.57(2d，J＝12，OCH2C6H5)；4.9-5.05(m，C(O)OCH2C6H5)；5.1-5.2(m，NH)；5.15(d，J＝8，H-C(1))；7.2-7.4(m，2C6H5)。峰的分配是根据2维1H/1H-相关光谱(COSY)和1H/13C-相关光谱(HSQC)得出的。
实施例A3：(3-乙酰氨基氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A5的制备
将按照实施例A9e制备的8(13mg，0.0216mmol)、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺(3.4mg，0.0324mmol)和二异丙基乙胺(7.3μl，0.0432mmol)的DMF(1ml)溶液在RT下搅拌15小时。在减压下蒸发溶剂，并经色谱法纯化(5g硅胶，氯仿/甲醇/水＝30∶30∶2)，得到A5；1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.6-1.75(m，OCH2CH2CH2NH)；2.90和2.95(2s，2NH-COCH3)；3.02-3.12和3.12-3.22(2m，O(CH2)2CH2NH)；4.43和4.47(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.08(d，J＝4，H-C(1”))。
实施例A4：3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚氨化物37的制备
Figure A9880428300301
(a)向按照实施例A2a制备的10(12.3g，18.73mmol)的丙酮(175ml)溶液中加入水(55ml)。在RT下搅拌18小时后蒸发溶剂，残余的水溶液用甲苯萃取(3×100ml)。有机相的残余物经色谱法纯化(硅胶500g，CH2Cl2 & 2％ CH3OH)，得到3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-苯二甲酰亚氨基-D-吡喃葡萄糖36(主要为β-端基异构体)。
(b)向36(4.0g，6.98mmol)和三氯乙腈(4.2ml，14.88mmol)的CH2Cl2(25ml)溶液中加入18g微细粉碎的无水K2CO3。在RT下搅拌60分钟后，混合物通过Celite过滤。色谱法(硅胶500g，己烷/乙酸乙酯＝2∶1)得到37(β-端基异构体)。
实施例A5：(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)35的制备
Figure A9880428300302
(a)在0℃和机械搅拌下，向干燥乳糖28(100g，0.28mol)的吡啶(500ml)混悬液中滴加苯甲酰氯(520ml，5.0mol)。加入4-(N，N-二甲氨基)吡啶后，混合物在RT下搅拌3天，在100℃下再搅拌2天。然后将反应混合物倾入冰水中，用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤。用Na2SO4干燥，蒸发溶剂，使吡啶与甲苯进行共蒸发，得到粗的O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖)29，为端基异构体混合物。
(b)将29(150g，0.127mol)溶于二氯甲烷(500ml)，在-10℃下加入4.1M HBr的乙酸(100ml)溶液。使混合物温度缓慢升至RT，用TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)监测转化过程。反应完全后，混合物用4N NaOH小心地中和，然后倾入冰水中。用乙酸乙酯萃取，萃取液用饱和NaHCO3溶液、盐水和水洗涤，蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥，得到O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脱氧-1-溴-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖)30。
(c)在氩气下，将30(18.9g，16.7mmol)和N-苄氧基羰基丙醇胺(7.0g，33.5mmol)溶于甲苯(绝对，150ml)。在搅拌下加入Hg(CN)2(8.45g，33.45mmol)和HgBr2(1.21g，3.35mmol)。混合物在RT下搅拌18小时，然后经Celite过滤，残余物用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/正己烯/乙酸乙酯5∶5∶2，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)31。
(d)在氩气、RT下，将31(16.3g，12.9mmol)溶于甲醇(绝对，90ml)。加入新制备的NaOMe甲醇溶液(1N，3.9ml)，溶液搅拌16小时。然后再加入NaOMe溶液(3.9ml)，继续另搅拌7小时。混合物用乙酸中和，并蒸发。残余物用快速色谱法纯化(洗脱剂：CH2Cl2/MeOH2∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)32。
(e)在回流温度下，向32(6.5g，12.18mmol)的丙酮(500ml)溶液中加入对甲苯磺酸(770mg，4.06mmol)。20分钟后反应混合物用NaHCO3溶液(10％)骤冷，蒸发溶剂。残余物用二氯甲烷萃取数次，用水洗涤，干燥并蒸发。粗产物用快速色谱法纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯/甲醇9∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(3，4-二-O-亚异丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)33。
(f)在RT、氩气下，一边搅拌一边向33(2.2g，3.84mmol)的吡啶(绝对，60ml)溶液中滴加苯甲酰氯(6.68ml，57.6mmol)。溶液搅拌16小时。蒸发混合物，并再次溶于二氯甲烷。有机相用1N HCl和水洗涤数次，用NaHCO3溶液(10％)中和。干燥后蒸发溶剂，残余物用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮15∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-3，4-二-O-亚异丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)34。
(g)在氩气下，将34(3.4g，3.11mmol)的乙酸/水(60ml，4∶1，v/v)混悬液在100℃下加热40分钟。混合物冷却至RT，并蒸发。使残余物与甲苯共蒸发数次，用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮5∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)35。
实施例A6：(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A9的制备
Figure A9880428300321
(i)(a)将37(无水，3.5g，4.88mmol)和35(无水，2.7g，2.56mmol)的二氯甲烷(绝对，30ml)溶液冷却至-20℃，加入TESOTf(58μl，0.1eq.)。3小时后另外加入TESOTf(0.2eq.)。另一小时后，反应混合物用三乙胺中和，蒸发，并与甲苯共蒸发两次。残余物用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮7∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)38。
(b)在氩气下，将38(2.64g，1.64mmol)的乙醇(绝对，80ml)溶液在60℃下用乙二胺(220μl，3.28mmol)处理。2小时后，另外加入乙二胺(110μl)，另一小时后，混合物蒸发，并与甲苯共蒸发数次。残余物用吡啶/乙酸酐(120ml，2∶1，v/v)处理，在RT、氢气下搅拌60小时。混合物蒸发，并与甲苯共蒸发数次，残余物用快速色谱法纯化(甲苯/丙酮3∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)39。
(c)将39的甲醇(绝对，100ml)溶液用新制备的NaOMe(1N，1ml)溶液处理，在RT、氢气下搅拌16小时。混合物用TFA中和，并蒸发。残余物用快速色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇2∶1，v/v)，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)40。
(d)向40(230mg，0.312mmol)、UDP-Gal(273mg，0.447mmol)、BSA(17mg)和MnCl2·6H2O(73.5mg，0.313mmol)在20ml二甲基胂酸钠缓冲液(0.1M，pH7.3)中的澄清溶液中加入β-(1→4)-半乳糖基转移酶(2.5U，500μl，Sigma No G-5507，25U/5ml)和碱性磷酸酯酶(25μl，Boehringer No 108146，7500U/498μl)，混合物在37℃下温育过夜。然后使混合物通过RP-18柱(2.5cmФ，10cm长)，用水洗涤，用甲醇洗脱，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)41。
(e)向MnCl2·6H2O(317.2mg，1.6mmol)在H2O(19ml)和0.5M二甲基胂酸钠缓冲液(6.8ml，pH6.5)中的溶液中加入225mg(0.250mmol)41、UDP-Gal(219mg，0.36mmol)和BSA(20mg)。将该混合物与2.5ml重组α-(1→3)-半乳糖基转移酶(3U/ml，按照Joziasse等《欧洲生物化学杂志》191：75(1990)制备)和25μl小牛肠碱性磷酸酯酶(Boehringer No 108146，7500U/498μl)在37℃下温育48小时。使混合物通过短C-18反相柱(2.5cmФ，10cm长)，用水洗涤，用甲醇洗脱。残余物经硅胶色谱法纯化(CH2Cl2/CH3OH/H2O＝10∶2∶0.2)，得到A9。
(ii)(a)将O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖)23(《化学文摘》Reg.No.177331-58-7，500mg，0.54mmol)溶于吡啶(10ml)，缓慢加入乙酸酐(5ml)。溶液在RT下搅拌过夜。蒸发该澄清溶液，与甲苯共蒸馏数次。将残余物溶解，用硅胶快速40系统纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮3∶2 v/v)，浓缩后得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1，2，3，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)24，为无色糖浆。
(b)在氩气下，将24(770mg，0.499mmol)溶于DMF(绝对，50ml)。加入分子筛(4，1g)，混合物在RT下搅拌30分钟。然后向混合物中加入无水乙酸(140mg，1.50mmol)，在50℃下搅拌3小时。反应混合物通过一小片Celite垫过滤，加入冰水。产物用乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥(MgSO4)，溶液蒸发至干。残余物用硅胶色谱法纯化，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)25。
(c)在氢气下，将25(干燥，570mg，0.38mmol)溶于二氯甲烷(绝对，3ml)。加入三氯乙腈(600μl)，然后滴加DBU，直到反应混合物呈黄色(3-4滴)。混合物在RT下搅拌，直到TLC(甲苯/丙酮1∶1，v/v)显示原料完全转化为移行更高的产物(Rf0.48)。溶液小心地蒸发至干，直接用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮1∶1，v/v)，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亚氨化物26，为无色糖浆。
(d)在氩气下，将26(40mg，24.3μmol)和N-苄酯基-1-丙醇胺(15.5mg，73.0μmol)溶于二氯甲烷(绝对，1ml)和正己烷(绝对，3ml)，然后加入约1g研磨的分子筛(4)，混合物在RT下搅拌30分钟，然后加入TESOTf(5μl)。30分钟后，混合物用三乙胺中和，蒸发至干。残余物用快速色谱法纯化(洗脱剂∶甲苯/丙酮3∶2，v/v)，分离得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-3，6-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(2，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)27。
(e)将27(59mg，34.5μmol)悬浮在甲醇(绝对，1ml)中。加入新制备的甲醇钠的甲醇溶液(1N，100μl)，混合物在RT、氢气下搅拌过夜。最后，加入水(0.5ml)，继续搅拌。1小时后，溶液用TFA(10μl)中和，蒸发至干。残余物用快速色谱法纯化，得到A9。[α]D+44.4(c1.075，H2O).MS(ESI+)1083(M+Na+).1H-NMR(500MHz，CDCl3)，选择的信号：4.31(d，J＝8，H-C(1)β-葡萄糖和β-半乳糖)；4.44(d，J＝8，H-C(1)β-半乳糖)；4.59(d， J＝8，H-C(1)N-乙酰基-β-葡萄糖胺)；5.30(d， J＝4，H-C(1)α-半乳糖)。
实施例A7：[3-(4-巯基丁酰)氨基]丙基2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷A6的制备
Figure A9880428300361
向3-氨基丙基2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷18a(500mg，1.80mmol)和γ-硫代丁内酯(1.84g，18mmol)的15ml无水和无氧的甲醇溶液中加入三乙胺(1.82g，18mmol)。将溶液在回流下沸腾16小时(氩)。在减压下蒸发溶剂，残余物经硅胶色谱法纯化。用乙酸乙酯/甲醇(3∶1)洗脱，得到A6。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：1.72(m，OCH2CH2CH2NH)；1.88(五重峰，J＝7，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；1.99(s，COCH3)；2.33(t，J＝7，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.51(t，J＝7，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.15-3.95(m，10H)；4.36(d，J＝8.5，H-C(1))。
实施例A8：[6-(4-巯基丁酰)氨基]己基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-吡喃半乳糖苷)A4的制备
Figure A9880428300362
(a)在氩气下，向按照实施例A1制备的3(1.0g，1.004mmol)和(6-苄氧基羰基氨基)-1-己醇(0.504g，2.008mmol)的4ml无水二氯甲烷溶液中加入粉碎的分子筛(2.0g，4)，混悬液在RT下搅拌20分钟。以10分钟间隔加入1ml一份的含有分子筛(2.5g，4)的DMTST(0.778g，3.012mmol)的二氯甲烷(9ml)溶液，同时继续在RT和氩气下搅拌。加入7份后，将混合物倾入乙酸乙酯、10％NaHCO3水溶液和压碎的冰。混合物搅拌10分钟，通过CeliteTM过滤。分离含水相，用乙酸乙酯萃取两次。有机相用10％NaCl水溶液和饱和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，在减压下蒸发挥发物。残余物(1.6g)经色谱法(150g硅胶)纯化，用甲苯/乙酸乙酯(10∶1)洗脱，得到(6-苄氧基羰基氨基)己基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖苷)15。
(b)向15(925mg，0.781mmol)的甲醇(30ml)与水(3ml)溶液中加入LiOH·H2O(328mg，7.81mmol)。混合物在氢气下加热至60℃达6小时。在减压下蒸发溶剂，使残余物在CHCl3与水之间分布。分离CHCl3层并用水洗涤，含水相用CHCl3萃取。有机相用Na2SO4干燥，并蒸发。用甲苯/乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱剂的色谱法(100g硅胶)得到(6-苄氧基羰基氨基)己基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖苷)16。
(c)在氩气下，向16(479mg，0.512mmol)的二噁烷(16ml)与水(9ml)溶液中加入Pd(OH)2(炭上20％，350mg)。混悬液在H2下搅拌36小时。混合物通过CeliteTM过滤，在减压下蒸发滤液。将残余物再溶于二噁烷(16ml)与水(9ml)。加入Pd(OH)2(炭上20％，350mg)后，混悬液在H2下搅拌18小时。过滤(CeliteTM)并蒸发溶剂后，通过AcrodiscTM水溶液进行过滤。滤液冷冻干燥，得到6-氨基己基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖苷)17。
(d)在氩气下，将化合物17(100mg，0.227mmol)、γ-硫代丁内酯(196μl，2.27mmol)和三乙胺(316μl，2.27mmol)的无水、无氧DMF(7ml)溶液加热至90℃达24小时。在40℃、减压下蒸发挥发物，残余物(160mg)经色谱法(10.5g硅胶)纯化，用氯仿/甲醇/水(30∶30∶5)作为洗脱剂，得到A4。1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.15-1.35(m，O(CH2)2(CH2)2(CH2)2NH)；1.35-1.45(m，O(CH2)4CH2CH2NH)；1.45-1.6(m，OCH2CH2(CH2)4NH)；1.77(五重峰，J＝7.5，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.24(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.43(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.07(t，J＝7，O(CH2)5CH2NH)；4.34(d，J＝8，H-C(1))；5.04(d，J＝4，H-C(1’)).
实施例A9：[3-(4-巯基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A2的制备
Figure A9880428300381
(a)向3(2.3g，2.31mmol)和14(1.12g，1.54mmol)的无水二氯甲烷(10ml)溶液中加入新活化的粉碎分子筛4(2.0g)。混悬液在氩气下搅拌30分钟后，以20分钟间隔分五次加入含有粉碎的分子筛4(1.5g)的DMTST(0.99g，3.85mmol)的CH2Cl2(7.5ml)溶液。加入NaHCO3水溶液(10％)(20ml)后，搅拌10分钟，加入水(50ml)和乙酸乙酯(150ml)。经CeliteTM过滤并用乙酸乙酯洗涤后，分离含水相，用乙酸乙酯萃取两次。有机相用饱和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，在减压下蒸发溶剂。粗产物(3.43g)进行硅胶(550g)色谱法，用己烷/乙酸甲酯(3∶1)洗脱，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-苄基-2-脱氧-2-四氯苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)4。
(b)将4(1.412g，0.850mmol)、1，2-二氨基乙烷(86μl)和乙醇(40ml)的混合物在氩气下加热至60℃。140分钟后，另外加入1，2-二氨基乙烷(36μl)，继续加热1小时。然后在减压下蒸发溶剂，残余物经硅胶(170g)色谱法纯化。用CH2Cl2/2-丙醇(15∶1)洗脱，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-苄基-2-脱氧-3-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)5。
(c)向胺5(975mg，0.699mmol)的吡啶(15ml)溶液中加入乙酸酐(15ml)。在RT下搅拌18小时后，在40℃、减压下蒸发溶剂和试剂。残余物(1.26g)经硅胶(125g)色谱法纯化，用二氯甲烷/2-丙醇(15∶1)作为洗脱剂，得到(芐氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(4-O-乙酰基-2，6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(3-O-乙酰基-6-O-苄基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)6。
(d)向6(898mg，0.608mmol)的甲醇(25ml)与水(2.5ml)溶液中加入氢氧化锂一水合物(255mg，6.08mmol)。在60℃下搅拌3小时15分钟后，在减压下从浓混悬液中蒸发溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(150ml)，溶液用水(3次70ml)和饱和盐水(50ml)洗涤。含水洗液用乙酸乙酯萃取一次。有机相用Na2SO4干燥，蒸发溶剂。残余物(732mg)经硅胶(120g)色谱法纯化，用二氯甲烷/2-丙醇(10∶1)作为洗脱剂，然后用乙酸乙酯/丙酮/2-丙醇(5∶1∶1)作为洗脱剂，得到(3-苄氧基羰基氨基)丙基O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(6-O-苄基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)7。
(e)向7(610mg，0.514mmol)的二噁烷(50ml)与水(28ml)溶液中加入Perlmann催化剂(1.46g，炭上20％Pd(OH)2)。混悬液在H2下剧烈搅拌22小时。过滤(Celite)后蒸发滤液，将残余物重新溶于二噁烷(50ml)和水(28ml)。加入新催化剂(1.46g，炭上20％Pd(OH)2)，继续在H2下搅拌3天。过滤并在减压下蒸发溶剂后，得到290mg(93％)粗的(3-氨基)丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)8。
(f)将100mg(0.166mmol)化合物8溶于5ml无水、无氧DMF。加入γ-硫代丁内酯(0.144ml，1.66mmol)和三乙胺(0.231ml，1.66mmol)后，混合物在氩气下加热至90℃达18小时。在45℃真空下蒸发除去溶剂和挥发物。残余物(140mg)经色谱法(15g硅胶)纯化，用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脱，得到A2。1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.68(五重峰，J＝6.0，OCH2CH2CH2NH)；1.78(五重峰，J＝7.5，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；1.95(s，COCH3)；2.25(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.44(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.03-3.13和3.13-3.23(2m，OCH2CH2CH2NH)；4.43和4.46(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.03(d，J＝4，H-C(1”)).MS/EI：703(M-H)-.
实施例A10：[3-(4-巯基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A3的制备
将按照标准方法从乳糖和半乳糖合成制备的3-氨基丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)18(74mg，0.1319mmol)、γ-硫代丁内酯(114μl，1.319mmol)和三乙胺(184μl，1.319mmol)的无水、无氧甲醇(10ml)溶液在回流下加热18小时(氢气)。过滤分离一些不溶性物质(9mg)和在减压下蒸发滤液后，残余物(119mg)经硅胶(15g)色谱法纯化。用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脱，得到A3。1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.65-1.85(m，OCH2CH2CH2NH，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.25(t，J＝7.5，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.45(t，J＝7.5，NH-CO-(CH2)2CH2SH)；3.1-3.25(m，H-C(2)，O(CH2)2CH2NH)；4.38和4.42(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’))；5.04(d，J＝4，H-C(1”)).
实施例A11：[N-(4-巯基丁酰)]甘氨酰基N-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脱氧-1-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)A8的制备
Figure A9880428300411
将甘氨酰基N-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(1-脱氧-1-氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷)(商业上可得到的)(22，205mg，0.222mmol)、1-硫代丁内酯(192μl，2.22mmol)、三乙胺(310μl，2.22mmol)和二硫-D/L-苏糖醇(51.4mg，0.333mmol)的无水DMF(10ml)脱气溶液/混悬液在氢气下加热至90℃达3.5小时。在减压(高真空)下蒸发挥发物，残余物经硅胶(25g)色谱法纯化。用氯仿/甲醇/水(30∶30∶10)洗脱，冷冻干燥，得到A8。1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.8(五重峰，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；1.93(s，NH-COCH3)；2.34(t，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；2.47(t，J＝7，CO-CH2CH2CH2SH)；3.32-3.4(m，H-C(2)，葡萄糖)；3.87(m，CO-CH2-NH)；4.33和4.44(2d， J＝8，2H-C(1)，β-半乳糖)；4.60(d，J＝8，H-C(1)，N-乙酰基葡萄糖胺)；4.91(d，J＝9，H-C(1)，葡萄糖)；5.04(d，J＝4，H-C(1)，α-半乳糖)。
实施例A12：[3-(4-巯基丁酰)氨基]丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)A10的制备
Figure A9880428300421
(a)将A9(25mg，23.6mmol)溶于水(5ml)，加入氢氧化钯(5mg)。混合物在氢气、RT下搅拌过夜。使混合物通过一小片Celite垫过滤，以除去催化剂。蒸发并从水中冷冻干燥后，得到3-氨基丙基O-(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→3)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)42，为无色粉末。
(b)向42(450mg，0.4855mmol)和二硫苏糖醇(112mg，0.728mmol)的无水DMF(30ml)溶液中加入420μl γ-硫代丁内酯和680μl三乙胺。脱气后，溶液在氩气下加热至90℃达18小时。在50℃、减压下蒸发溶剂，经硅胶色谱法纯化(50g，氯仿/甲醇/水＝30∶30∶10)，得到A10。1H-NMR(400MHz，D2O)，选择的信号：1.65-1.85(m，OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2CH2SH)；2.25(t，J＝7，COCH2(CH2)2SH)；2.43(t，J＝7，CO(CH2)2CH2SH)；3.10-3.27(m，O(CH2)2CH2NH，H-C(2)，β-葡萄糖)；4.33和4.44(2d，J＝8，2H-C(1)，β-半乳糖)；4.36(d，J＝8，H-C(1)，β-葡萄糖)；4.6(d，J＝8，H-C(1)，2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-葡萄糖)；5.03(d，J＝4，H-C(1)，α-半乳糖).
实施例A1 3：N-{8-[N-二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基]氨基-3，6-二氧杂-1-辛基}-4-巯基丁酰胺A7的制备
Figure A9880428300422
(a)在3小时内，向冷却至0℃的、搅拌着的三甘醇(39g，0.26mol)的乙醚(200ml)与三乙胺(50ml)乳液中加入甲磺酰氯(10.1ml，0.13mol)。使混合物温度达到RT，继续搅拌20分钟。在减压下蒸发溶剂，将残余物重新溶于甲醇/水(95∶5，300ml)。加入NaN3(18.2g，0.28mol)后，溶液在回流下沸腾18小时。然后在减压下蒸发溶剂，使残余物在乙醚和饱和盐水之间分布。干燥(Na2SO4)了的有机相残余物经硅胶(260g)色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯(2∶1)洗脱，得到1，8-二叠氮基-3，6-二氧杂辛烷19。
(b)向二叠氮化物19(14.67g，0.073mol)的THF(100ml)溶液中加入1.5g 5％炭上Pt。混合物在氢气下搅拌12小时。通过CeliteTM过滤并在减压下蒸发溶剂，得到1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷20。
(c)在5分钟内，在5℃下，向20(1.0g，6.76mmol)的吡啶(5ml)溶液中加入二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基氯(2.09g，6.76mmol)的吡啶(10ml)溶液。在0℃下搅拌3小时后，在20℃、减压下蒸发溶剂。使残余物在乙酸乙酯和饱和盐水之间分布。分离有机相，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂。残余物(3.1g)经色谱法(170g硅胶)纯化，用氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)洗脱，得到8-[N-二苯基-(4-甲氧基苯基)甲基]氨基-3，6-二氧杂-辛胺21。
(d)将21(395mg，0.94mmol)、γ-丁内酯(0.81ml，9.4mmol)和三乙胺(1.31ml，9.4mmol)的无水、无氧甲醇(17ml)溶液在回流下沸腾18小时。在减压下除去溶剂，残余物(635mg)经硅胶(100g)色谱法纯化。用乙酸乙酯洗脱，得到A7。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.33(t，J＝7，SH)；1.90(五重峰，J＝7，NH-CO-CH2CH2CH2SH)；2.1(宽峰，NH)；2.20(t，J＝7，NH-CO-CH2(CH2)2SH)；2.39(t，J＝6，CH2NH)；2.53(q，J＝7，CH2SH)；3.43(m，CH2NH-CO)；3.5-3.67(m，4OCH2)；3.80(s，OCH3)；6.02(宽峰，NH)；6.78-6.88(2H)，7.15-7.25(2H)，7.25-7.33(4H)，7.35-7.45(2H)，7.45-7.55(4H)(芳族CH).MS(EI)：523(M+H)+。B活化的聚酰胺衍生物的制备实施例B1：N(6)-氯乙酰基聚-L-赖氨酸B1a、B1b和B1c的制备
Figure A9880428300441
(a)在氩气下，将500mg(2.39mmol eq)聚-L-赖氨酸氢溴化物(M：30000-70000)悬浮在8ml DMF中。混悬液冷却至0℃，加入2.5ml2，6-二甲基吡啶。在15分钟内滴加1g(5.85mmol)氯乙酸酐的4mlDMF溶液。随后将混合物缓慢加热至RT，搅拌5小时。将该微黄色、有点浑浊的溶液滴加至100ml二乙醚/乙醇(2∶1)中，生成无色沉淀。过滤(通过最初不施加真空的多孔玻璃滤器)后，用乙醇、水洗涤，再用乙醇洗涤，最后用二乙醚洗涤。将粗产物溶于尽可能少的DMF，再一次在二乙醚/乙醇中生成沉淀。在真空、RT下干燥后，得到B1a(M：30000-70000(n≈250))。1H-NMR(DMSO，500MHz)δ＝8.20(2H，s，2×NH)；4.05(2H，s，-CO-CH2-Cl)；3.80(1H，s，CH)；3.05(2H，s，-CH2-NH-CO-)；2.00-1.20(6H，m，-CH-(CH2)3-CH2-NH-).
(b)以类似方法从50mg(0.24mmol eq)聚-L-赖氨酸氢溴化物(M：4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基聚-L-赖氨酸B1b(M：4000-15000(n≈50))，从50mg(0.24mmol)聚-L-赖氨酸氢溴化物(M：150000-300000)得到N(6)-氯乙酰基聚-L-赖氨酸B1c(M：150000-300000(n≈1050))。1H-NMR光谱同于化合物B1a。
实施例B2：N(6)-氯乙酰基聚-D-赖氨酸B2a、B2b和B2c的合成
(a)类似于B1(a)，从100mg(0.48mmol eq)聚-D-赖氨酸氢溴化物(M：30000-70000)得到N(6)-氯乙酰基聚-D-赖氨酸B2a(M：30000-70000(n≈250))，从250mg(1.196mmol eq)聚-D-赖氨酸氢溴化物(M：4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基聚-D-赖氨酸B2b(M：4000-15000(n≈50))。1H-NMR光谱分别同于化合物B1a和B1b。
(b)使聚-D-赖氨酸氢溴化物(478mg，2.29mmol eq；M：150000-300000)的水(50ml)溶液通过装填了碱性离子交换树脂(DowexR1×8，20-50目，OH型)的柱子(直径2cm，长11cm)。用水洗脱，直到pH达到7，然后用10％对甲苯磺酸水溶液中和至pH3。洗脱液冷冻干燥后，将残余物溶于DMF(10ml)，在0℃下加入2，6-二甲基吡啶以及氯乙酸酐(800mg)的DMF(2ml)溶液。在0℃、氩气下搅拌18小时后，混合物用乙醇(100ml)稀释，加入二乙醚(250ml)使产物沉淀出来。用重力式过滤法收集沉淀物，重新溶于DMF(20ml)，然后在10分钟内将该溶液加入到乙醇(80ml)中。所得混悬液在RT下搅拌16小时，然后在20分钟内加入二乙醚(300ml)。过滤并在减压(高真空)下干燥沉淀物，得到B2c(M：150000-300000(n≈1000))。1H-NMR光谱同于化合物B1c。
实施例B3：N(6)-氯乙酰基-聚-D/L-赖氨酸B3a、B3b和B3c的合成
(a)在氩气下，将250mg(1.19mmol eq)聚-D/L-赖氨酸氢溴化物(M：30000-70000)悬浮在4ml DMF中。混悬液冷却至0℃，加入1.25ml 2，6-二甲基吡啶。在15分钟内滴加500mg(2.93mmol)氯乙酸酐的2ml DMF溶液。随后将混合物缓慢加热至RT，搅拌16小时。后面的操作和纯化类似于实施例B1(a)，得到B3a(M：30000-70000(n≈250))。1H-NMR(DMSO，500MHz)δ＝8.20(1H，s，N(6)H)；8.05和7.90(每种情况下均为1/2H，2s，N(2)H)；4.25(1H，s(br)，CH)；4.05(2H，s，-CO-CH2-Cl)；3.05(2H，s，-CH2-NH-CO-)；1.70-1.20(6H，m，-CH-(CH2)3-CH2-NH-)。
(b)以类似方法从50mg(0.24mmol eq)聚-D/L-赖氨酸氢溴化物(M：4000-15000)得到N(6)-氯乙酰基-聚-L-赖氨酸B3b(M：4000-15000(n≈50))，从500mg(2.392mmol)聚-L-赖氨酸氢溴化物(M：150000-300000)得到N(6)-氯乙酰基-聚-L-赖氨酸B3c(M：150000-300000(n≈1050))。1H-NMR光谱同于化合物B3a。
实施例C1：I型共轭物的制备
(i)从聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸开始：
(a)在RT和氢气下，将B1a(10mg，0.0489mmol eq)和硫醇A2(10.3mg，0.0147mmol)连续溶于2.0ml无水、无氧DMF。向该澄清溶液中加入DBU(7.3μl，0.0489mmol)。在RT下搅拌1小时后，加入硫甘油(12.7μl，0.147mmol)和三乙胺(33.4μl，0.24mmol)，继续搅拌18小时。将该无色溶液滴加到15ml二乙醚/乙醇(1∶1)中。借助重力，通过多孔玻璃漏斗过滤分离所生成的沉淀，用乙醚/乙醇(1∶1)洗涤，溶于水，所得溶液进行超滤，超滤使用装有YM-3膜(截止MW3000)的Amicon仪器。用10ml超纯水洗涤五次。将溶于水中的滤腔内容物冷冻干燥，得到C1a(x＝0.25(n≈250))，根据1H-NMR(选择信号的积分)，糖衍生度(derivatisation)为25％(x＝0.25)。1H-NMR(500MHz，D2O)，选择的信号：2.26-2.36(m，NH-CO-CH2CH2CH2S，A2)；2.53-2.58(m，NH-CO-CH2CH2CH2S，A2)；2.58-2.68和2.7-2.8(2m，SCH2-CHOH-CH2OH)；4.49和4.51(2d，J＝8，H-C(1)，H-C(1’)，A2)；5.12(d，J＝4，H-C(1”)，A2)。
如上所述，用不同量的A2、A3、A4或A8和硫甘油处理B1a，根据1H-NMR(积分)得到不同糖衍生度的I型共轭物。
I型共轭物(n≈250)     B1a的量     A2、  A3、  A4或A8的量   糖衍生度％
    C1b  10mg，48.9μmol eq  A2：3.44mg，4.89μmol  8％(x＝0.08)
    C1c  10mg，48.9μmol eq  A2：6.89mg，9.78μmol  16％(x＝0.16)
    C1d  10mg，48.9μmol eq  A2：17.2mg，24.5μmol  41％(x＝0.41)
    C1e  10mg，48.9μmol eq  A2：24.1mg，34.2μmol  61％(x＝0.61)
    C4  20mg，97.8μmol eq  A3：19.5mg，29.3μmol  23％(x＝0.23)
    C5  30mg，146.7μmol eq  A4：23.9mg，44μmol  25％(x＝0.25)
    C1k  10mg，48.9μmol eq  A8：12.6mg，12μmol  22％(x＝0.22)
(b)类似于(a)，从B1b(20mg，97.8μmol eq)、A2(20.7mg，29.3μmol)和硫甘油开始，得到C1f(n≈50)，糖衍生度：28％(x＝0.28)。
(c)如上所述，用不同量的A2、A4或A8和硫甘油处理B1c，根据1H-NMR(积分)得到不同糖衍生度的I型共轭物。
I型共轭物(n≈1050)     B1c的量     A2、A4或A8的量   糖衍生度％
    C1g  10mg，48.9μmol eq  A2：10.3mg，14.7μmol  28％(x＝0.28)
    C1h  20mg，97.8mol eq  A4：14.3mg，26.4μmol  21％(x＝0.21)
    C1i  20mg，97.8μmol eq  A8：25.1mg，24μmol  25％(x＝0.25)
    C1j  70mg，342μmol eq  A2：24.1mg，34.2μmolA8：35.2mg，34.2μmolA4：18.6mg，34.2μmol  9％(x＝0.09)9％(x＝0.09)9％(x＝0.09)
(ii)(a)从聚-N(6)-氯乙酰基-D-赖氨酸开始：如实施例C1(i)a所述，用A2(10.3mg，14.7μmol)和硫甘油处理B2a(10mg，48.9μmol eq)。将超滤腔内容物通过AcrodiscTM过滤，滤液冷冻干燥，得到C2(x＝0.35(n≈250))，根据1H-NMR(积分)，糖衍生度为35％(x＝0.35)。
(b)类似于(a)，从B2c(100mg，489μmol eq)、A2(86mg，122μmol)和硫甘油开始，得到C2b(n≈1000)，糖衍生度：24％(x＝0.24)。
(iii)从聚-N(6)-氯乙酰基-D，L-赖氨酸开始：如实施例C1(i)a所述，用A2(10.3mg，0.0147mmol)和硫甘油处理B3a(10mg，0.0489mmol eq)，得到C3(x＝0.22(n≈250))，根据1H-NMR(积分)，糖衍生度为22％(x＝0.22)。
实施例C2：II型共轭物前体的制备
(i)其中-Y-R03为式Vc基团(来源于A2，三)的II型共轭物前体
(a)将聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸(B1a，200mg，978μmoleq)、硫醇A2(172mg，244μmol)和硫醇A7(15.3mg，29.3μmol)溶于无水、无氧DMF(20ml)。向该澄清溶液中加入DBU(146μl，0.978mmol)。在RT和氩气下搅拌40分钟后，加入硫甘油(254μl，2.934mmol)和三乙胺(682μl，4.89mmol)，继续搅拌18小时。将该无色溶液加入到100ml乙醇中，在搅拌下滴加二乙醚(200ml)。借助重力，通过多孔玻璃漏斗过滤分离所生成的沉淀，用乙醇/乙醚洗涤(1：2，3×30ml)，并溶于水。使用装有YM-3膜(截止MW＝3000)的Amicon仪器对溶液进行超滤。将溶于水的滤腔内容物冷冻干燥，得到C6a1(x＝0.25，y＝0.03(n≈250))。
(b)在0℃下，向C6a1(366mg)的水(25ml)溶液中加入三氯乙酸(1.2g)。在0℃下搅拌2小时后，溶液用2N氢氧化钠中和至pH11，使用装有YM-10膜(截止MW＝10000)的Amicon仪器进行超滤。用三份超纯水进行洗涤。向滤腔中加入2N NaOH(10滴)后，继续用水(六份)洗涤。将溶于水的滤腔内容物冷冻干燥，得到C6bI(x＝0.25，y＝0.02(n≈250))，根据1H-NMR(选择信号的积分)，糖衍生度为25％(x＝0.25)，根据C6a1的NMR分析结果和C6bI的1H-NMR中一甲氧基三苯甲基信号的缺无，胺衍生度为2％(y＝0.02)。1H-NMR(500MHz，D2O，60℃)，选择的信号：2.65-2.75(m，NH-CO-CH2(CH2)2S，R1，R2)；2.95-3.01(m，NH-CO-(CH2)2CH2S，R1，R2)；3.01-3.08和3.13-3.19(2m，SCH2-CHOH-CH2S，R3)；4.87-4.95(m，H-C(1)，H-C(1’)，R1)；5.52(m，H-C(1”)，R1).
如上所述，不同聚合度的聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸各自用硫甘油和不同量的A7和A2处理，根据1H-NMR(积分)，得到不同糖衍生度和胺衍生度的C6bII、C6BIII和C6bIV。
II型共轭物前体 聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸的量   A2的量   A7的量 糖衍生度％ 胺官能度％
  C6bII(n≈1050)     B1c：100mg，489μmol eq   51.6mg，73.4μmol   7.66mg，14.7μmol     13％(x＝0.13)     2.6％(y＝0.026)
  C6bIII(n≈250)     B1a：100mg，489μmol eq   51.6mg，73.4μmol   7.66mg，14.7μmol     14％(x＝0.14)     2.6％(y＝0.026)
  C6bIV(n≈50)     B1b：150mg，733.5μmol eq  129.1mg，183.4μmol   19.1mg，36.67μmol     23％(x＝0.23)     3％(y＝0.03)
(ii)其中-Y-R03为式Vb(来源于A4，二)基团、式Va(来源于A6，一)基团、式Vf(来源于A8，五)或式Ve(来源于A10，五)基团的II型共轭物前体
如上所述(实施例C2i)，聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸用硫甘油和不同量的A4、A6、A8或A10处理，根据1H-NMR(积分)，得到不同糖衍生度和胺衍生度的C7a、C7b、C8b1、C9b1和C10b1。
II型其轭物前体  聚-N(6)-氯乙酰基-L-赖氨酸的量 硫醇A6、A4、A8或A10的量   A7的量   糖衍生度％ 胺官能度％
    C7a(n≈160)   B1：70mg，342μmol eq   A6：26mg，68.5μmol  5.36mg，10.3μmol     20％(x＝0.20)     3％(y＝0.03)
    C7b(n≈250)   B1a：111mg，54.3μmol eq   A6：50mg，109μmol   8.6mg，16.4μmol     21.5％(x＝0.215)     2％(y＝0.02)
    C8b(n≈1050)   B1c：130mg，635.7μmol eq  A4：51.9mg，95.6μmol  10.0mg，19.1μmol     16％(x＝0.16)     2.5％(y＝0.025)
    C9b(n≈1050) B1c：99.7mg，488μmol eq  A8：75.1mg，73.1μmol   7.6mg，14.6μmol     12.5％(x＝0.125)     2.5％(y＝0.025)
    C10b(n≈1050)   B1c：500mg，2.44mmol eq  A10：376mg，366μmol  38.2mg，73.2μmol     16％(x＝0.16)     2.5％(y＝0.025)
DII型共轭物的制备实施例D1：包含CH-Sepharose 4B的II型共轭物(a)C6bI：在多孔玻璃漏斗上，用1mM HCl(800ml)洗涤4.0gNHS活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)(15分钟)，加入到C6bI(20mg)的NaHCO3缓冲溶液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，6ml)中。在RT下振摇2小时后，用重力过滤法分离缓冲液，树脂用NaHCO3缓冲溶液洗涤(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，3次50ml)，然后在RT下用1M乙醇胺(pH8)处理1小时。过滤并用水(3次20ml)、TRIS缓冲液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，30ml)、乙酸盐缓冲液(0.1M，NaCl中0.5M，pH4，30ml)-交替3次-和20％乙醇(3次50ml)洗涤，得到D1a，每ml贮存在20％乙醇中的树脂具有5μmol碳水化合物抗原决定部位。
(b)C7a：如上(实施例D1a)用C7a(25mg)的0.1M NaHCO3(0.5MNaCl，pH8，6ml)溶液处理1.0g NHS活化的CH Sepharose 4B，得到D1b，每ml贮存在20％乙醇中的树脂具有4μmol碳水化合物抗原决定部位。
实施例D2：包含Sepharose 4 Fast Flow的II型共轭物
将悬浮在2-丙醇中的11ml Sepharose 4 fast flow用冷的(0℃)1mM HCl洗涤(6次20ml)，在0℃下，用冷的(0℃)NaHCO3缓冲液(0.1M，NaCl中0.05M，pH8，1.5ml)转移至前体C6bI(150mg)的6ml NaHCO3缓冲溶液(0.1M，NaCl中0.05M，pH8，6ml)中。在RT下振摇3小时后，混合物过滤，树脂用水(50ml)洗涤，然后悬浮在1M乙醇胺(pH8，20ml)中，在RT下振摇15小时。过滤分离树脂，交替用TRIS缓冲液(0.1M，NaCl中0.5M，pH8，30ml)和乙酸盐缓冲液(0.1M，NaCl中0.5M，pH4，30ml)洗涤三次，得到D2a，每ml贮存在20％乙醇中的树脂具有5μmol碳水化合物抗原决定部位。
按照上述过程，制备II型共轭物D2b、D3、D5、D6、D7和D8：
 II型共轭物 sepharose的量     1ml 0.1M NaHCO3(0.5M NaCl，pH8)中的前体 每ml树脂的糖抗原决定部位
    D2b     11ml     C6bII(146mg)     3.9μmol
    D3     11ml     C6bIII(141.5mg)     3.9μmol
    D5     2ml     C7b(24.8mg)     7μmol
    D6     11ml     C8b(140mg)     4.7μmol
    D7     11ml     C9b(165mg)     2.9μmol
    D8     50ml     C10b(800mg)     3μmol
E化合物的生物活性
实施例E1：I型共轭物的键合亲和性
在4℃下，将Nunc Polysorp盘(目录#475094)用0.1ml/孔的5μg/ml C1g(→C1g-ELISA)或C1h(→C1h-ELISA)或C1i(→Cli-ELISA)的PBS溶液包被过夜。在4℃下，盘用0.250ml/孔的10％SEA BLOCK溶液(Pierce，目录#37527)封闭24小时。盘用含有0.02％吐温20的0.250ml PBS洗涤3次。
采集的人血清(Sigma H-1513)以1∶20稀释在含有0.1％吐温20和10％封阻剂BSA(Pierce目录#37525)的PBS缓冲液中。将60μl等分试样的人血清稀释液置于低结合(low-bind)的U形孔中，向孔中连续加入适当浓度系列的I型共轭物的60μl系列稀释液。
在RT下培养1小时后，将0.100ml血清混合物转移至洗涤了的聚合物包被的孔上。盘在RT下培养1小时，用含有0.02％吐温20的PBS洗涤3次。然后向盘中装入0.100ml抗人IgG-过氧化酶共轭物(Jackson Immunoresearch 109-036-098)或者是抗人IgM-过氧化酶共轭物(Jackson Immunoresearch 109-036-129)的、含有10％封阻剂BSA和0.1％吐温20的PBS溶液，稀释比为1∶2500。盘在RT下培养1小时，然后用含有0.02％吐温20的PBS洗涤5次。盘用0.100ml TMB底物(Sigma目录#T-3405)显色，底物显色10分钟后用50μl 2M H2SO4终止显色。用微量滴定盘读数仪在450-650nm下读取吸光度。在进行分析时，将吸光度值对共轭物浓度作图。直链B三糖(Dextra目录#GN334)用作测量相对IC50的标准。
表1：用C1g包被的盘测量的I型共轭物键合亲和性
以相对结合亲和性对亲和性制表(RIC50＝IC50直链B/IC50化合物)。
  化合物   RIC50 IgG   RIC50 IgM   化合物   RIC50 IgG   RIC50 IgM
    C1b     .0070     .0134     C2     .0007     .0026
    C1c     .0017     .0066     C3     .0004     .0013
    C1a     .0018     .0040     C4     .004     .013
    C1d     .003     .133     C1g     .0004     .0001
    C1e     .007     ＞.3     C1f     .002     .07
    C5     .18     .009
实施例E2：从cynomolgus猴中除去异种抗体
一组4只cynomolgus猴(平均重3kg)注射1mg/kg剂量的I型共轭物，时间为第0、72和168小时。动物在不同时间间隔取血，血清用ELISA法化验对C1g的抗αGal抗体(实施例E1)。单剂量I型共轭物刺激了抗体效价的急剧降低，随后抗体效价恢复为一个低于原始效价的值。通过第二次、特别是第三次给药，抗体效价的恢复被有效阻止了较长时间阶段。
表3：接受C1g注射的cynomolgus猴的抗体效价
以相对于标准人血清的效价对结果制表。
  时间(小时)         动物1         动物2         动物3         动物4
    IgG     IgM     IgG     IgM     IgG     IgM     IgG     IgM
    0     1.6     0     0.85     0.95     1.5     0.17     0.24     3
    1     0     0     0     0.11     0     0     0     0.07
    72     0.31     0     0.35     0.08     0.16     0     0.06     0.32
    73     0     0     0     0     0     0     0     0.01
    168     0.21     0     0.4     0.34     0.29     0.05     0.03     0.95
    169     0     0     0     0     0     0     0     0.13
    264     0.18     0     0.1     0.41     0.06     0.12     0.06     0.84
    672     0.73     0     0.45     0.51     0.44     0.38     0.23     1.55
实施例E3：抗体效价的测量
在4℃下，将Nunc Polysorp盘(目录#475094)用0.1ml/孔的5μg/ml C1g或C1h或Cli的PBS溶液包被过夜。在4℃下，盘用0.250ml/孔的10％SEA BLOCK溶液(Pierce，目录#37527)封闭24小时。盘用含有0.02％吐温20的0.250ml PBS洗涤3次。以连续稀释比向孔中加入0.100ml等分试样的血清样本。稀释比一般如下：1∶5；1∶15；1∶45；1∶135；1∶405；1∶1215；1∶3645；1∶10935等。稀释液为含有0.1％吐温20和10％SEABLOCK的PBS缓冲液。盘在RT下培养1小时，用含有0.02％吐温20的PBS洗涤3次。然后向盘中装入0.100ml抗人IgG-过氧化酶共轭物(JacksonImmunoresearch 109-036-098)或者是抗人IgM-过氧化酶共轭物(Jackson Immunoresearch 109-036-129)的、含有10％封阻剂BSA和0.1％吐温20的PBS溶液，稀释比为1∶2500。盘在RT下培养1小时，然后用含有0.02％吐温20的PBS洗涤5次。盘用0.100ml TMB底物(Sigma目录#T-3405)显色，底物显色10分钟后用50μl 2M H2S04终止显色。用微量滴定盘读数仪在450-650nm下读取吸光度。在进行分析时，将吸光度值对稀释因子的对数作图，将曲线的直线部分外推至X轴，得到效价值。使用标准血清，并使其效价值为1。
实施例E4：人血清的免疫亲和色谱
将5ml固定化II型共轭物装柱(1×3.5cm)。泵入所采集的人血清(Sigma H-1513，通过0.4μm过滤器过滤)并使其穿过柱子，流速为4ml/分钟。在柱后每10ml收集一份。如上实施例E3所述，用ELISA化验法化验各部分的抗Galα，3Gal异种反应性抗体的存在。利用来自实施例D2的材料，在每次穿过柱子时，每ml凝胶清除至少200ml所采集的人血清。
实施例E5：D2b、D6与D7的结合亲和性和抗体特异性比较
使体积为200ml的血清通过第一支装有D6的柱子，并进行ELISA化验(按照实施例E3)。使血清连续通过第二支装有D2b的柱子并化验，然后通过第三支装有D7的柱子，并再次用ELISA法化验。化验每支柱子后的样本。每支供试柱子对除去抗其所携带类型低聚糖的抗体来说都是最有效的。因此，D6有效除去二糖结合抗体，D2b除去三糖结合抗体，D7除去戊糖结合抗体。通过两支柱子的血清排除了抗这些柱子携带的两种抗原决定部位的抗体，但是保留了抗第三种抗原决定部位的抗体。通过所有柱子的血清排除了抗所有三种糖的抗体。
实施例E6：混合床柱的结合亲和性和抗体特异性
将2ml D6、2ml D2b和1ml D7混合。将该材料装入5ml柱子，使200ml人血清通过该柱子。每10ml为一份。每次收集的第二份进行化验。用ELISA法对所有三种α半乳糖基化抗原以及对PK1细胞的细胞毒性进行化验。如实施例E3所述，三种ELISA测量结果表明，混合床柱有效地从血清中除去抗αGal活性。
实施例E7：结合至猪细胞上的抗体
化验通过每支柱子的血清样本(实施例E5)对猪PK15细胞(ATCC#CCL-33)的结合作用。使细胞受胰蛋白酶作用，将1×106个细胞悬浮在0.3ml PBS/0.1％BSA中。将细胞在冰中用0.040ml血清样本(在56℃下预处理10分钟)培养30分钟。将细胞置于3ml PBS中，离心后重新悬浮在0.3ml PBS/0.1％BSA中。加入0.004ml等分试样的二次抗体(抗hlgG/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-098或抗hlgM/FITC Jackson ImmunoResearch #109-096-129)，在冰中培养30分钟。在PBS中洗涤一次后，细胞用FACS法分析。所采集的人血清的平均荧光为480，D6柱后血清(实施例E5)为117，D6和D2b柱后血清(实施例E5)为80，D6、D2b和D7柱后血清(实施例E5)为54，混合床柱后血清(实施例E6)为52(均由抗hlgG抗体得到)。用抗hlgM测量，得到类似结果。
实施例E8：狒狒中抗αGal抗体的免疫除去
将7ml D6、7ml D2b和5ml D7与45ml Sepharose CL2B(Pharmacia)混合，制得免疫除去柱。使用该柱以及Citem 10免疫除去系统(Excorim)从2只狒狒(6kg重)中除去抗αGal抗体。柱子分别通过600ml和500ml(约2血容量)后，抗αGal抗体效价降至原始水平的10％(如实施例E3所述用ELISA法对C1g测量)。

Claims (10)

1.聚酰胺共轭物，包含键合到聚酰胺主链上的(a)异种抗原基；或(b)生物活性基和大分子、大的或小的实体；
其中该聚酰胺主链包含至少一个式I的结构单元
Figure A9880428300021
在(b)的情况下，还包含至少一个式II的结构单元
其中
A和A’各自独立为三价桥连基；
R1和R1’各自独立为直接的键或C1-C6亚烷基；
X1和X1’各自独立为-C(O)O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-或-O-；
R2和R2’各自独立为直接的键或二价桥连基；
X2和X2’各自独立为直接的键或-O-或-NR-；其中的R为氢、OH、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C2-C7杂环烷基、C2-C11杂环烯基、C6或C10芳基、C5-C9杂芳基、C7-C16芳烷基、具有C2-C6亚烯基和C6或C10芳基-的C8-C16芳烯基、或二C6或C10芳基-C1-C6烷基；
Y和Y’各自独立为直接的键或二价桥连基；
其条件是当R1或R1’是直接的键时，X1或X1’不是-NR-、-S-或-O-。
2.根据权利要求1的聚酰胺共轭物，其中
(a)该聚酰胺主链包含至少一个式Iaa的结构单元其中R03a-Y-为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团
Figure A9880428300032
或者
(b)该聚酰胺主链包含至少一个式Ia的结构单元
Figure A9880428300033
其中-Y-R03为式Va、Vb、Vc、Vd、Ve或Vf基团；和至少一个式IIa的结构单元
Figure A9880428300041
其中-Y’-R04为式Vg基团
Figure A9880428300042
3.根据权利要求1的聚酰胺共轭物，其中该聚酰胺主链另外包含至少一个式VIb的结构单元
4.根据权利要求2的聚酰胺共轭物，其中结构单元的平均总数[n](a)在200至300的范围内，多分散性为1.1至1.2，式Iaa结构单元的比例[x]为5至30％；或者[n]在900至1200的范围内，多分散性为1.1至1.2，[x]为5至50％；式VIb结构单元的比例[z]为45至94％；R03a-Y-是相同或不同的，并且选自式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基团；或者
(b)在200至300的范围内，多分散性为1.1至1.2，式Ia结构单元的比例[x]为5至30％，其中R03-Y-选自由式Va、Vb、Vc、Vd、Ve和Vf基团组成的组，式IIb结构单元的比例[y]为1至5％，
Figure A9880428300044
其中A’、R1’、X1’、R2’和X2’是如权利要求1所定义的，Z-Y”为H2N[(CH2)2O](CH2)2NHC(O)(CH2)3-；或者[n]在900至1200的范围内，多分散性为1.1至1.2，[x]为5至50％，[y]为1至5％；式VIb结构单元的比例[z]为45至94％。
5.包含根据权利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共轭物或这些聚酰胺共轭物混合物的组合物，用在一种方法中，该方法用于从人体液中除去异种抗体或用于诱导对异种抗原的抗原决定部位产生耐受性或无变应性、或特定地对准具有异种抗原受体的B细胞。
6.根据权利要求5的组合物，其中该聚酰胺共轭物包含至少一个异种抗原基来源于二糖的结构单元、至少一个异种抗原基来源于三糖的结构单元和至少一个异种抗原基来源于戊糖的结构单元，其比例为1∶1∶1；或聚酰胺共轭物的混合物，每种共轭物包含相同的异种抗原基，该异种抗原基来源于一种二糖、一种三糖或一种戊糖，这些共轭物在该组合物中含有的比例为1∶1∶1。
7.包含根据权利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共轭物或这些聚酰胺共轭物混合物的组合物，用在一种方法中，该方法用于从人体液中除去异种抗体。
8.根据权利要求7的组合物，其中该聚酰胺共轭物包含至少一个生物活性基来源于二糖的结构单元、至少一个生物活性基来源于三糖的结构单元和至少一个生物活性基来源于戊糖的结构单元，其比例为1∶1∶1；或聚酰胺共轭物的混合物，每种共轭物包含相同的生物活性基，该生物活性基来源于一种二糖、一种三糖或一种戊糖，这些共轭物在该组合物中含有的比例为1∶1∶1。
9.亲和色谱法药筒，包含根据权利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共轭物或其混合物、或根据权利要求7的组合物，作为吸附剂。
10.用于从异种移植物接受者中除去异种抗原的抗体的方法，该方法包括在体内使所述体液与根据权利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共轭物进行接触；或用于在需要接受治疗的受治疗者中，诱导对异种抗原的抗原决定部位产生耐受性或无变应性、或者用来特定地对准具有异种抗原受体的B细胞的方法，该方法包括在异种移植物的移植之前和/或之后，将有效量的根据权利要求1(a)或2(a)的聚酰胺共轭物例如通过注射、输入或灌注给药到异种移植物接受者体内；或用于从人体液中除去抗体的方法，该方法包括在体外使所述体液与根据权利要求1(b)或2(b)的聚酰胺共轭物进行接触，然后重新将体液输入到患者体内。
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