CN1037925A - 单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的肿瘤相关抗原，该抗原是一 种分子量在110,000-140,000道尔顿范围内的细胞 表面糖蛋白，存在于包括鳞状上皮细胞癌和腺癌在内 的各种癌中。本发明还包括能与该抗原反应的抗体、 产生本发明抗体的杂交瘤细胞系、以及在癌症的诊断 和治疗中使用该抗体的方法。

Description

本发明涉及一种新的肿瘤相关抗原，该抗原是存在于包括鳞状上皮细胞癌和腺癌在内的各种癌中的一种细胞表面抗原。本发明还包括能与该抗原反应的抗体、能产生本发明抗体的杂交瘤细胞系、以及应用这些抗体诊断和治疗癌症的方法。
恶性肿瘤的早期诊断和肿瘤类型的鉴定对肿瘤的临床治疗至关重要。本发明包括能与人癌细胞上表达的抗原反应的单克隆抗体。虽然有关能与癌反应的单克隆抗体的制备方法已有叙述（美国专利4，708，930;欧洲专利公告157，613;Mazauric    et    al.，Cancer    Research，42∶150，1982;Brenner    et    al.，Cancer    Research，42∶3187，1982;Mulshine    et    al.，The    Journal    of    Immunology，13161∶497，1983;Masuko    et    al.，Japanese    Journal    for    Cancer    Research，76（5）∶386，1985），但尚未有有关能与本发明抗原反应的单克隆抗体的叙述。肺、头和颈的鳞状上皮细胞癌，以及结肠和肺的腺癌，都表达该抗原，因而都能与本发明抗体反应。人癌上L/1C2抗原的广泛分布，说明本发明具有重要的诊断和治疗应用。
本发明涉及基本纯净形式的一种与肿瘤相关的糖蛋白抗原，所述抗原的分子量在还原条件下用SDS-PAGE测得为在110，000-140，000道尔顿的范围内;该抗原存在于由头、颈和肺的上皮细胞产生的人鳞状上皮癌细胞表面;该抗原能与由杂交瘤细胞系L/1C2产生的抗体发生免疫沉淀反应。
意外的是，L/1C2抗原与本发明抗体结合后发生内在化（interalized）。L/1C2抗原的内在化是本发明治疗方案的一个重要方面，因为这种内在化作用造成已与本发明抗体连接的溶癌剂的细胞内释放，这种释放要在抗体与L/1C2抗原结合形成抗原抗体复合物并随后被内吞后才会发生。
本发明还涉及产生能与上述与肿瘤相关的糖蛋白抗原反应的抗体的杂交瘤细胞系。
本发明还涉及能与上述与肿瘤相关的糖蛋白抗原反应的抗体。
本发明还涉及检测样品中L/1C2抗原存在的方法，该方法包括，向该样品中加入能与上述肿瘤相关抗原反应的抗体，并测定该抗体与样品的反应活性。
本发明的抗体尤其适用于在体内向表达L/1C2抗原的肿瘤释放胞毒剂。胞毒剂与本发明抗体相连后效力大大增强。
图1：L/1C2抗原和L/1C2单克隆抗体的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。各样品在十二烷基硫酸钠存在下通过聚丙烯酰胺基质进行电泳。将迁移距离与已知分子量的蛋白比较以确定抗体各亚基和抗原的分子量。在还原条件下进行SDS-PAGE以使二硫键连接的各亚基解离。图A：在还原条件下进行电泳并经考马斯蓝染色的7-15%梯度凝胶，显示经A蛋白的单条重链和单条轻链纯化的L/1C2抗体。图B：免疫沉淀的3H-葡糖胺标记的L/1C2抗原与分子量标准物一起在还原条件下在7-15%凝胶上分析后的放射自显影照片。所示的数字代表标准物的分子量乘10-3。骨髓瘤IgG3阴性对照未免疫沉淀出可鉴定的抗原。
图2：L/1C2与选定的肿瘤细胞系的反应活性的细胞分选仪分析。如图所示，将USCLS-1、M21和T222靶细胞与L/1C2或骨髓瘤IgG3对照免疫球蛋白（m-IgG3）一起悬浮而保温。检测试剂为荧光素标记的羊F（ab′）2抗小鼠IgG和IgM。标出了平均通道荧光。
图3：通过紫外显微术揭示L/1C2抗体与T222细胞上的L/1C2抗原结合后的内在化动力学。这一分析的细节见实例10。图A显示0时膜染色特有的亮环样荧光。图B为105分钟时的分析，显示细胞周边染色的荧光束。图C为135分钟时的分析，显示唯一的细胞内染色，表明L/1C2抗体已内在化。
图4：显示实例12所述的裸鼠异种移值模型中T222异种移植物的生长曲线。图A显示L/1C2-DAVLBHYD抑制T222肿瘤生长的效力。图B为一个对照组，其中DAVLBHYD与一种不与肿癌细胞结合的免疫球蛋白结合。图C为游离药物对照，引入该对照是为了能够将DAVLBHYD的活性与能与L/1C2抗原反应的图A免疫结合物和不能与L/1C2抗原反应的图B免疫结合物作比较。
通过生物合成用3H-葡糖胺标记人癌细胞系，则可利用免疫沉淀法从这些细胞系的提取物中分离出称为L/1C2的抗原。经过在还原性SDS-PAGE梯度凝胶上测定，L/1C2抗原是一种分子量在110，000至140，000道尔顿范围内的糖蛋白。
本发明的杂交瘤细胞系可用如下方法制备：用一种人癌来源的细胞系作免疫原性物质来激活免疫学上相关的脾细胞，然后通过脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，使脾细胞保持存活。然后选择并筛选由这一融合产生的那些能与存在于多种人癌细胞系（包括下面表1所列的细胞系）上的L/1C2抗原反应的杂交细胞（称为杂交瘤）或杂交瘤细胞系。
表1
L/1C2抗原在人癌细胞系上的代表性分布
细胞系    来源/简评    膜荧光
鳞状上皮细胞癌
FADU    咽    +
ME180    子宫颈（表皮样）    +
T222    肺    +
USCLS-1    肺    +
5637    膀胱    +
移行细胞癌
T24    膀胱    +
RT4    膀胱（乳头瘤）    +
J82    膀胱    +/-
TCCSUP    膀胱    +
腺癌
WiDr    结肠    +
HT29    结肠    +
SK-CO-1    结肠（腹水）    +
UCLA/P3    肺    +
DU145    前列腺    +
PC3    前列腺    +/-
黑瘤
M21    皮肤    -
M14    皮肤    -
非转化细胞系
FLOW    2000    胎肺成纤维细胞    -
Detroit    551    皮肤成纤维细胞    -
表1中，明显的膜荧光用（+）表示;弱荧光用（+/-）表示;阴性反应活性用（-）表示。所有测定都是相对于骨髓瘤蛋白阴性对照进行的。靶细胞系包括下列得自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD    20852    ATCC）的细胞系：FaDu（ATCC＃HTB43）、5637（ATCC    ＃HTB9）、ME180（ATCC    ＃HTB33）、SK-CO-1（ATCC    ＃HTB39）、PC3（ATCC    ＃CRL1435）、DU145（ATCC    ＃HTB81）、T24（ATCC    ＃HTB4）、RT4（ATCC    ＃HTB2）、HT29（ATCC    ＃HTB38）、J82（ATCC    ＃HTB1）、TCCSUP（ATCC    ＃HTB5）和WiDr（ATCC    ＃CCL218）。其它细胞系包括：T222（Masui，et    al.，Cancer：44（3）：1002-7    1984）、M14（Chee    et    al.，Cancer    Research    36（4）：1503-1509，1976）、UCLA/P3（Varki    et    al.，Cancer    Research    44：681-687，1984）、和M21（Morton    et    al.，Surgery    64（1）：233-240，1968）。Flow    2000得自Flow    Laboratory，Inc.，7655    Old    Springhouse    Road，Mclean，VA，22101。
表1充分显示了L/1C2抗原在得自上皮肿瘤的细胞系上的广泛分布。用一台Epics-Coulter Mark IV
Figure 891025251_IMG2
细胞分析仪（Coulter    Electronics，Hialeh，FL），按厂家方法评价本发明抗体与细胞系的反应活性。流式血细胞计数分析的结果示于附图2。对新鲜人肿瘤的病理样品和正常组织进行评价以说明本发明的诊断方法。用免疫过氧化物酶（一种抗体-酶结合物）法测定L/1C2抗原的正常组织分布的方法描述于实例6。
表2说明了L/1C2抗原在不同器官的癌上的广泛分布。
表2
用说明性抗体L/1C2对人肿瘤
组织进行免疫过氧化物酶染色
肿瘤    反应个数/测试个数
肺鳞状上皮细胞癌    15/15
头和颈鳞状上皮细胞癌    12/12
结肠腺癌    17/17
肺腺癌    7/7
乳腺癌    9/14
卵巢癌    6/8
前列腺癌    4/5
淋巴瘤    0/1
黑瘤    0/2
对人的正常组织所作的评价表明，L/1C2抗原表达在包括肾和肝在内的若干器官的血管、导管和小管上。它也表达在肠和支气管的上皮表面上。在同时含有肿瘤和正常组织的结肠样品中，肿瘤组织比正常结肠组织染色更深。
杂交瘤技术最早由Kohler和Milstein叙述（Nature，256：495-497，1975），可利用此技术来制备某些杂交瘤细胞系，使其分泌产物单克隆抗体能与L/1C2抗原反应。制备本发明的这些杂交瘤细胞系的一种一般方法叙述于实例1，该方法涉及杂交瘤细胞系L/1C2的构建，该细胞系可从ATCC得到，登记号为ATCC    ＃B9682。本领域专业人员将会知道，本⒚鳎ò固搴驮咏涣鱿赴礚/1C2）提供了多种不同的制备本发明杂交瘤和抗体的途径。
就本发明而言，L/1C2抗体仅仅是说明性的，所有能与L/1C2抗原反应的抗体，不管其来源物种或免疫球蛋白类型或亚型分类（包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）如何，都包括在本发明的范围内。本发明也包括L/1C2抗体的抗原结合片段。与L/1C2抗原结合的能力是本发明抗体的一个一般特点。
如上所讨论的，本发明抗体可用下列步骤构建和分离，即免疫、制备杂交瘤、然后鉴定能与肿瘤细胞系反应并且其正常组织分布与L/1C2抗体相似的抗体。但是，本发明还提供了一种鉴定本发明抗体的方法，该方法无需测定抗体与大量肿瘤和正常组织的反应活性。本发明的抗体可以利用L/1C2细胞系产生的L/1C2抗体，通过免疫沉淀和竞争性结合实验来鉴定。
如实例2所述，用L/1C2单克隆抗体进行免疫沉淀时得到类似的迁移图谱，可利用这些图谱来鉴定抗原。可利用下列方法来证实鉴定结果：用过量的一种抗体从细胞提取液中清除该抗原，并观察另一个抗体是否不能从所处理的提取液中免疫沉淀出抗原。此外，在抗体与同一抗原决定基或密切相关的抗原决定基结合的情况下，各抗体将彼此竞争与L/1C2抗原的结合。竞争性结合实验叙述于实例4。
用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理抗体制备物，产生一些抗体片段，包括保持了抗原结合活性的Fab和F（ab′）2片段。因此，可以利用这些酶处理本发明抗体，从而产生本发明的L/1C2结合片段。本发明抗体的抗原结合片段的制备及它们在治疗上的用途说明于实例17。L/1C2抗体的抗原结合片段特别适用于本发明的治疗方案。
本领域专业人员将会知道，本发明抗体的抗原结合区和抗体片段是本发明的关键特征。本发明的L/1C2杂交瘤细胞是编码本发明这样一种抗原结合区的DNA的优选来源。可以通过重组DNA技术将此DNA与编码任何所需的氨基酸残基顺序的DNA相连，从而生成一新的“杂交”或“嵌合”DNA顺序，该DNA顺序编码一种杂交或嵌合蛋白。可以以这种方式得到本发明的嵌合抗体，在这些抗体中，最终一部分抗体来源于一个物种，另一部分来源于另一个物种。但本发明也包括任何含有L/1C2抗原结合区的嵌合分子。
包括L/1C2抗体在内的本发明抗体，可用于免疫测定从而诊断人组织样品中是否有癌存在。可以利用本发明的L/1C2抗体，评价患者的活检样品和尸检样品中是否有癌存在。可以用某些检测基团标记本发明抗体以鉴定表达L/1C2抗原的癌，这些基团包括荧光标记、酶标记和放射性标记。用于本发明的检测基团包括作为荧光标记的荧光素、作为酶标记的过氧化物酶和作为放射性标记的碘-125。
另一些能够用于本发明的荧光标记包括（但不限于）若丹明、藻红蛋白和其它一些发射荧光能的化合物。另一些能够用于本发明的酶标记包括（但不限于）葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酯酶。另一些能够用于本发明的放射性标记包括（但不限于）碘-131和铟-111。本领域专业人员应清楚地知道，上述这些标记仅仅是说明可用于本发明的不同标记。能与L/1C2抗原反应的抗体还可以通过与生物素结合而衍生化（实例7），在加入与荧光标记、酶标记或放射性标记结合的抗生物素蛋白类化合物后即可用于多种免疫化学和免疫组织学应用中，上述抗生物蛋白类化合物由于结合了标记物而能被检测。用本发明抗体检测和诊断癌的方法说明于实例6。
L/1C2抗体的特性包括本发明的抗体的一般特性，即能与L/1C2抗原结合。由杂交瘤细胞系L/1C2（ATCC    HB9682）产生的L/1C2反应性抗体的特殊特性包括下列物理特性：如实例8所测定，为鼠IgG3同型;作为L/1C2细胞系（即ATCCB9682）所分泌的唯一免疫球蛋白而产生（见图1的SDS-PAGE分析）;在PBS中溶解度为10mg/ml。
L/1C2抗体在治疗上的实用性已经用该抗体的胞毒性药物结合物予以确认，并已进一步确认，即使未修饰的抗体也具有体外活性。L/1C2抗体抑制肿瘤细胞体外生长的能力概括于表3。肿瘤细胞生长的体外测定法详述于实例9。
表3
肿瘤细胞体外生长抑制作用1
浓度    CPM    +/-    S.E.    %变化    P
L/1C2
100μg/ml    57，144    +/-    7，242    -92    .001
10    424，406    +/-    98，658    -41    .05
1    595，578    +/-    109，209    -19    ns
0    736，567    +/-    19，026
L4/KS
100μg/ml    698，823    +/-    81，625    -8    ns
10    656，286    +/-    43，969    -13    ns
1    709，928    +/-    12，1271    -6    ns
0    758，271    +/-    18，931
硫酸博莱霉素
10μg/ml    89，906    +/-    13，685    -86    .01
0    648，327    +/-    109，017
1给出的是3H-亮氨酸掺入T222鳞状上皮细胞癌靶细胞中的每分钟计数（CPM）。本测定中的大量样品要求使用不止一个组织培养皿。因此，每种试剂都与其自身的一组阴性对照小孔作比较而计算出抑制百分率。P值是利用Student t检验确定的。在该测定中引入博莱霉素作阳性对照。
表3给出了L/1C2抗体和L4/KS抗体抑制肿瘤细胞体外生长的能力的比较。具体地说，表3说明了浓度低至10μg/ml的未修饰L/1C2抗体显著抑制L/1C2抗原阳性肿瘤细胞系T222生长的能力。与KS1/4抗原（Varki    et    al.，Cancer    Res.，44∶681，1984）结合的L4/KS抗体（Starling    et    al.，J.Cell    Biochem.，Supplement11B∶192，1987）也表达在T222肿瘤细胞系上。与L/1C2抗体相反，L4/KS抗体没有抑制T222细胞生长的效果。
为了理解未修饰的L/1C2抗体抑制肿瘤细胞生长的新能力，进行实验来确定补体结合和抗原内在化所起的作用。利用血清进行实例9所述的测定，该血清已于56℃下加热30分钟以造成补体活性的热失活。该实验的结果表明，补体的结合并不是造成对未修饰抗体所观察到的细胞毒性水平的原因。此数据与表3数据的一致之处在于，L4/KS是一种IgG2a同型体，这是一种已知在补体结合中起重要作用的抗体亚型。
为评价L/1C2抗体与抗原阳性肿瘤细胞系结合的结果，建立了实例10和11所述的测定法。实例10阐述的是，利用荧光素标记的能与L/1C2抗原反应的抗体，评价L/1C2抗体在与细胞表面的L/1C2抗原结合后内在化的动力学。图3给出了利用这种方法检测抗体内在化的结果。图3中值得注意的是，在0分钟时（图A），膜局部解剖形状所特有的亮环样荧光很明显。相反，于37℃下保温105分钟后（图B），环样荧光减弱，而细胞周边有明显的亮荧光束。最后，在135分钟时（图C），不再有亮环样荧光，但细胞内荧光变得明显了。细胞内染色表明，L/1C2抗体的内在化是与L/1C2抗原结合的结果。
实例11所述测定的结果表明，125I标记的L/1C2抗体被内在化。用放射标记的抗体来证实这一得自实例10荧光技术的内在化数据，以排除细胞表面结合的L/1C2抗体被荧光化的第二种试剂（抗小鼠免疫球蛋白）交联在诱导内在化过程中可能起到的任何作用。表4给出了此测定的结果。表4的数据清楚地证实，L/1C2在与L/1C2抗原结合后内在化。
表4
用125I-L/1C2抗体评价L/1C2抗体的内在化
0℃    37℃
平均值+/-标准误差    平均值+/-标准误差
125I-L/1C2 56，770+/-3，069 56，746+/-1，734
的总cpm1
不能解离的    11，398+/-859    5，514+/-64
计数2
1 125I-L/1C2的总cpm为与细胞相联的总放射性的量度，它应该既包括细胞表面的125I-L/1C2，也包括内在化的125I-L/1C2。
2不能解离的计数是内在化的125I-L/1C2的一种量度，这种125I-L/1C2由于内在化而不易被低pH甘氨酸缓冲液解离，而这种缓冲液已公知能破坏抗原/抗体结合。
L/1C2抗体抑制细胞生长的机制尚不明确，但据预计L/1C2抗原可能是一种生长因子受体。有人报导了用抗表皮生长因子（EGF）受体抗体得到的有关内在化和细胞生长抑制作用的类似数据（Mosui，et    al.，Cancer    Res.45：5592，1986），但竞争性结合试验和细胞系分布的分析排除了L/1C2抗体与EGF受体结合的可能性。
本领域专业人员将会认识到抗体在与肿瘤细胞抗原结合后发生内在化的意义。免疫结合物（抗体-胞毒药物）的有效性主要取决于它命中肿瘤细胞的能力，其次取决于它提供毒性形式的胞毒剂或在肿瘤部位释放胞毒剂，从而使胞毒剂杀伤肿瘤细胞的能力。抗体与肿瘤细胞结合后的内在化，造成了胞毒剂的细胞内释放。因此胞毒剂的这种细胞内释放将是一个优选的胞毒剂释放系统。
现已成功地将许多不同的胞毒药物连接到了抗体上。有人综述了连接胞毒药物与抗体的方法（Blair    et    al.，J.Immunol.Mothods    59∶129，1983;Ghase    et    al.，Methods    in    Enzymology，93∶280，1983）。本发明优选的单克隆抗体-胞毒药物结合物（免疫结合物）包括那些由氧化型L/1C2抗体与长春花生物碱的肼衍生物反应产生的免疫结合物。这些强效抗癌免疫结合物的制备方法基本按1987年12月2日公开的欧洲专利公告247，792，其公开内容列为本文参考文献。欧洲专利公告247，792公开了含有L/1C2抗体的免疫结合物的构建方法。本发明的实例13公开了将长春花碱酰肼与L/1C2抗体连接的方法。可参考欧洲专利公告247，792就长春花碱中间体的制备、结合方法、及免疫结合物制剂所作的详细讨论，但该专利没有讨论此处用作本发明优选治疗方案的L/1C2-4-脱乙酰基-长春花碱-3-羧基酰肼。
在实例12中所描述的小鼠异种移植模型中，将L/1C2-4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼（L/1C2-DAVLBHYD）或游离的4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼（DAVLBHYD）或用作稀释剂的PBS静脉施用于裸鼠。用L/1C2-DAVLBHYD、DAVLBHYD或PBS在肿瘤埋植后的第11、15、17、22、25和29天处理小鼠，得到图4所示的数据。
图4的数据证实了L/1C2抗体增强DAVLBHYD治疗效果的能力。实验中使用了L/1C2-DAVLBHYD结合物，由该实验得到了图4的数据。经测定，L/1C2-DAVLB免疫结合物的平均结结合比为5.7∶1（DAVLBHYD∶L/1C2）。以下所述的剂量指单次治疗的DAVLBHYD含量。在以L/1C2-DAVLBHYD免疫结合物的形式施用DAVLB时，1.0mg/kg和0.5mg/kgDAVLBHYD的剂量（图A）就造成肿瘤的退化，而同一剂量的游离DAVLBHYD（图C）在进行治疗时仅仅阻滞肿瘤的生长。在图4的上图中明显可见，在长春花碱含量为1.0mg/kg时，L/1C2-DAVLBHYD免疫结合物能根除T222癌。相对效力的比较表明，在整个实验中，在1.0mg/kg和0.5mg/kg的浓度下，L/1C2-DAVLBHYD都优于游离的DAVLBHYD。图B给出的数据表明，如果DAVLBHYD与一种不与T222细胞结合的抗体结合，则对阻滞T222细胞生长无效。能与L/1C2抗原反应的免疫结合物，如L/1C2-DAVLBHYD，比同等剂量水平的游离药物或不能与L/1C2抗原反应的免疫结合物更能有效地抑制T222肿瘤细胞系。上述数据说明了L/1C2抗原结合性免疫结合物的治疗作用。
进一步的研究确立了L/1C2抗体可作为一种向L/1C2抗原阳性肿瘤细胞释放其它胞毒化合物的载体。构建了一些免疫结合物，其中有将氨甲蝶呤与L/1C2抗体偶联，偶联方法有的是实例13中所讨论的酰肼连键，也有的是利用某些连接基团在L/1C2抗体和氨甲蝶呤之间形成一个可水解的桥键。将氨甲蝶呤衍生为氨甲蝶呤-γ-酰肼的方法在实例14的A部分中讨论。基本按实例13的方法使氨甲蝶呤-γ-酰肼与氧化型L/lC2抗体结合。用氨甲蝶呤-γ-酰肼代替实例13的4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼，使得L/1C2-氨甲蝶呤免疫结合物可用于某些治疗应用。以裸鼠异种移植模型评价这些免疫结合物的体内抗癌活性，细节见实例12。在该实验中，于肿瘤埋植后的第3、6和9天，用L/1C2氨甲蝶呤-γ-酰肼、氨甲蝶呤或稀释剂处理小鼠。以下表5中所列的数据以相对于对仅用稀释剂处理动物时所观察到的生长的肿瘤抑制百分比表示。
表5
L/1C2-氨甲蝶呤-γ-酰肼与游
离氨甲蝶呤的体外活性比较
以氨甲蝶呤含量计的剂量    肿瘤抑制百分比
L/1C2-氨甲蝶呤-γ-酰肼    6mg/kg    97
3mg/kg    99
1.5mg/kg    94
游离氨甲蝶呤    6mg/kg    32
3mg/kg    -4
1.5mg/kg    23
表5的结果说明了在氨甲蝶呤作为L/1C2抗原反应性免疫结合物命中肿瘤部位时，其效力大大增加。在280和370nm处作双波长紫外分析，测得该免疫结合物的结合比为，每摩尔L/1C2抗体5.1摩尔氨甲蝶呤。
进一步的实验说明了L/1C2抗体和其抗原结合片段释放胞毒剂的用途，这些胞毒剂通过可水解的连接基团与L/1C2或其F（ab′）2片段共价相连。实例14至17公开了这些免疫结合物的制备和评价方法。
以上列出的数据证实了L/1C2抗体或其抗原结合片段在用各种不同的连接技术与胞毒药物连接后具有治疗用途。本领域专业人员将会认识到，与L/1C2抗原结合是本发明抗体的一个一般特性;与ATCC    B9682产生的抗体不同的是，这些本发明抗体还能起到使胞毒剂命中L/1C2抗原阳性肿瘤的作用。应该考虑到L/1C2抗原与本发明抗体结合的亲和性的某些变化，一般说来，抗体亲和性越高，抗体就越能有效地使胞毒剂命中体内肿瘤。提供含有L/1C2抗原反应性抗体、L/1C2抗体、长春花生物碱衍生物和氨甲蝶呤的免疫结合物，只是为了有利于对本发明抗体治疗用途的理解。本发明抗体在治疗上的应用决不仅限于那些用来说明本发明的胞毒剂。其它能用于本发明治疗应用的胞毒剂包括，例如，亚德里亚霉素、蓖麻蛋白、蓖麻蛋白A链、双翅目昆虫毒素、假单胞菌外毒素、灯心醇（Scirpenol）、二乙酰氧基灯心醇、α鹅膏菌素、丝裂霉素C、红豆因、凝胶素（gelonin）、商陆抗病毒蛋白、5-氟尿嘧啶等。其它的许多连接方法，如美国专利4，671，958和EPO公告243，929所公开的方法，也可用来使胞毒剂与本发明抗体相连，这些方法列为本文参考文献。
应用本发明的L/1C2抗原结合性单克隆抗体进行体内肿瘤成像也在本发明的范围内。可用来放射标记本发明抗体的同位素有下列元素的同凰兀侯鳌⑶Α健⒌狻亍濉㈨痢㈩椤⑴稹⒉⒁㈩堋睢㈩伞⒐㈩帧濉⒘住㈩啤?
放射性同位素，例如上述用于肿瘤成像的同位素，在与本发明的L/1C2抗原结合性抗体相连时，可用于治疗应用中。因此，由L/1C2抗原结合性抗体-放射性同位素免疫结合物组成的治疗剂的应用也在本发明的范围内。
实例
为便于理解本发明，提供下列非限制性实例。
实例1
L/1C2反应性杂交瘤细胞系的构建
A.免疫
单克隆抗体的制备方法由Kohler和Milstein介绍（Nature    256∶495，1975），该方法现已是本领域内的成熟技术。有一篇较新的综述（Gaflre    and    Milstein，Methods    in    Enzymology，73：3-46，1981，Langone    and    Van    Vunakis，ed.，Academic    Press，New    York）概述了原始方法的某些改进，详细介绍了所需的仪器和试剂，详细叙述了制备单克隆抗体的步骤。免疫原的选择仅限于细胞系、肿瘤样品、或它们的含有L/1C2抗原的任何成份。
以组织培养法繁殖来自鳞状上皮细胞癌的细胞系USCLS-1（Fernstein，et al.，Cancer Research 46：2970-2977，1986），并用作L/1C2抗原的来源。USCLS-1细胞系仅仅是说明性的，任何表达L/1C2抗原的细胞系（见表1）都可以采用。取已成年的年青BALB/C小鼠，每周腹腔内注射5×106个USCLS-1细胞，共注射4周。第四次注射21天后，用5×106个USCLS-1细胞对小鼠进行再免疫。对该方法来说，小鼠仅仅是说明性的，专业人员知道，对用作免疫细胞来源的物种并没有什么限制。已知另一些物种，包括人、大鼠和仓鼠较为适用，但理论上任何物种都可以使用，包括家兔、山羊、绵羊、猪、鸡和猴。利用胰蛋白酶EDTA（Gibco，3175    Staley    Road，Grand    Island，New    York    14072）处理法，从组织培养基质中回收用作L/1C2抗原的免疫原性来源的USCLS-1细胞。
B.脾细胞的制备
最后一次免疫5天后，将免疫的BALB/C小鼠断头并用乙醇冲洗。无菌收集脾脏并置于一个无菌小培养皿中，供脾细胞制备之用。挑开脾脏，使脾细胞释放到冰冷的Dulbecco氏修改的Eagle培养基（DME-Gibco）中。通过抽吸使细胞团分散，并将细胞移入一离心管，将该管在冰中放置5分钟。弃去沉降物，将细胞悬浮液移入第二个离心管中。以200g离心5至7分钟沉降脾细胞。将得到的细胞沉淀悬浮于5ml冰冷的0.17M NH4Cl中，在冰上放置10分钟，以促进细胞的破碎。加入5ml冰冷的DME，然后将该混合物以200g离心5至7分钟。吸出上清液后，将清除了红细胞的脾细胞沉淀再悬浮于10ml DME中进行洗涤。
C.骨髓瘤细胞的制备
选择HL-1TMFriendly骨髓瘤-653细胞（Ventrex Laboratories，P.O.Box 9701，Portland，Maine 04013）用于与USCLS-1反应性脾细胞制备物融合。这些细胞得自Ventrex，并按供货商的说明书保存。在融合前两天，将骨髓瘤细胞移入75cm2组织培养瓶中，使其达到对数期生长，这对于成功生成杂交瘤是很重要的。
虽然对细胞融合来说优选的骨髓瘤是HL-1TMFriendly653细胞，但一些已经建立的来自小鼠的常规骨髓瘤细胞系也可用于本发明的目的，这些细胞包括，
P3-X63-Ag8-U1（P3U1），SP2/O-Ag14（SP-2），
P3-X63-Ag8-6.5.3（X63.6.5.3），p3-X63-Ag8（X63），
P3-NS-1-Ag4（NS-1），MPC11-45.6    TGI.7（MPC-11），and
S194/5XXO.BU1（S194）（见Gaflre    and    Milstein，1981，in
“Methods    in    Enzymology”Vol.73B，Langone    and    Van    Vunakis，ed.）。
D.细胞融合
用下列方法洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞：于4℃下以200g离心5分钟，然后吸出上清液，将细胞再悬浮于DME中。用DME洗涤3次后，对细胞进行计数，同时用台盼蓝排除法估算成活率。这里所用的细胞数目一词仅指活细胞（不被台盼蓝染色的细胞）。在50ml离心管中的3.0×107个脾细胞中加入1.5×107个骨髓瘤细胞。将细胞于4℃下以200g离心5分钟，尽可能完全地吸出上清液又不损失沉淀中的细胞。然后轻轻拍打离心管使细胞沉淀松动。于37℃下加入1.5ml融合介质（配制方法见下），轻轻搅拌内容物，将离心管静置30秒。然后滴加预热至37℃的DME并伴以轻轻搅拌，使内容物的体积缓慢达到20ml。再加入30ml 37℃的DME。稀释混合物时必须注意避免打碎细胞团块。将融合物以200g离心5分钟，然后小心地再悬浮于60ml含20%胎牛血清（Gibco）和1×HAT的HL-1TM培养基（Ventrex）中。
用HAT来选择脾细胞/骨髓瘤杂交细胞。HAT是次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的混合物。以下给出了HAT和PEG4000（融合介质）制备物的配制方法。
HAT（100X）    量/25ml
次黄嘌呤（1000μM）    34mg
氨基蝶呤（100μM）    11mg
胸苷（300μM）    18.25mg
制备时，将3种物质分别溶于1至5滴1N    NaOH中，把它们混合在一起，用DME冲洗试管并加至体积为25ml。使用时用培养基以1∶100稀释HAT。HAT也可从Gibco买到。
融合介质可用如下方法制备。将20g    PEG    4000（J.T.Baker    Chemical    Co.，222    Red    School    Lane，Phillipsburg，New    Jersey    08865）装在100ml瓶中进行高压灭菌。加入28ml含15%DMSO的无菌Dulbecco氏PBS（Gibco），混合后于4℃下贮存。
E.喂养细胞的制备
用18号针头将10ml冰冷的DME注射到BALB/C小鼠的腹腔内。搅动腹腔，取出腹腔洗涤液。将腹腔细胞置于冰冷的离心管中，以250g离心5分钟。吸出上清液后，将细胞再悬浮于2ml冰冷的HL-1培养基（Ventrex）中并放置在冰上。
F.杂交瘤的组织培养
将喂养细胞（洗下的腹腔细胞）与细胞融合混合物合并并混合。向96孔组织培养平板中每孔加入2滴细胞混合物。利用潮湿的37℃培养箱加含5%CO2的空气来保存细胞融合产物。加含20%胎牛血清（Gibco）和1×HAT的HL-1（Ventrex）使所有小孔的体积都增至200μl。
G.抗原特异性杂交瘤的选择
在96孔平板中明显出现肉眼可见的克隆时，取50μl等份样品评价其抗原反应活性。利用放射免疫测定法（RIA）测定上清液与USCLS-1（一种L/1C2阳性靶细胞系）和M21（一种得自黑瘤的L/1C2阴性细胞系）的结合（Morton    et    al.，Surgery    64（1）：233-240，1968），该方法详述如下。也可以采用其它L/1C2阳性或阴性靶细胞系，包括表1中的细胞系。
通过用CPEG（136mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、0.5mM EDTA、5.6mM葡萄糖，pH7.3）于37℃下处理15分钟，并用PBS（Gibco）洗涤，从组织培养基中收集USCLS-1和M21细胞系。将1.5×105个细胞分置于96孔弹性平板中，这些平板预先用如下方法用聚L-赖氨酸包被。在平板的每个小孔中加入50μl 1mg/ml聚L-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma Chemical Company，P.O.Box14508，St.Louis，Missouri 63178）在PBS中的溶液。然后将该平板于室温下保温至少45分钟，但也可在4℃下贮存。加入细胞前，将平板用PBS冲洗两次。用PBS洗去尚未结合的细胞。留下的细胞用0.1%戊二醛的PBS溶液固定。用0.1%甘氨酸封闭未反应的戊二醛，将平板用含10%胎牛血清和0.05% NaN3的磷酸缓冲盐溶液洗涤并贮存在该溶液中。磷酸缓冲盐溶液（PBS）为含0.15M NaCl的0.01M磷酸钠。
用下列方法进行RIA测定：在室温下（约22℃）将杂交瘤上清液与试验细胞系一起保温1小时。充分洗涤除去未结合的抗体，加入用Chloramine T方法（Herzenberg and Herzenberg，Handbook of Experimental Immunology，1978，D.M.Weir，ed.Blackwell Scientific Publications，Oxford）标记的100，000cpm125I-兔抗小鼠IgG，于室温下再保温1小时。用PBS洗涤各小孔，利用放射自显影和伽马计数器测定每小孔中剩余放射性的量。放射自显影分析过程包括，把96孔平板放在X光胶片上，观察所含放射性足以使胶片曝光的小孔数。放射自显影的曝光时间从6小时到过夜不等。产生能与USCLS-1反应但不能与M21反应的抗体的杂交瘤克隆被认为是所要的克隆，并对其进行进一步的分析。L/1C2杂交瘤细胞系ATCC ＃B9862能与USCLS-1反应，不能与M21反应。用Coulter （Coulter Electronics，Hialeh，FL）亚克隆仪按厂家推荐方法将L/1C2亚克隆两次，以确保L/1C2杂交瘤细胞系的单克隆性。
H.被L/1C2反应性抗体识别的来自肿瘤的细胞系的测定
L/1C2是本发明细胞系的说明性杂交瘤。评价由此杂交瘤产生的L/1C2抗体对一组肿瘤细胞系的反应活性。用间接免疫荧光测定法进行筛选。测定混合物包括：一种需测定是否存在新的L/1C2肿瘤相关抗原的靶细胞系;杂交瘤上清液（L/1C2反应性抗体的来源）;一种用荧光素标记的、并特异于小鼠免疫球蛋白的第二抗体试剂。适用的第二抗体试剂可从多处买到，如Jackson    ImmunoResearch    Laboratories，Inc.，P.O.Box    683，Avondale，Pennsylvania    19311，and    Miles    Research    Products，Miles    Laboratories，Inc.，1121    Myrtle，Box2000，Elkhart，Indiana    46515.
利用本领域内公知的条件以组织培养法培养靶细胞系。测定前，从加有胰蛋白酶/EDTA（Gibco）的培养基中取出细胞。通过离心并再悬浮于DME中洗涤5×106个细胞，并使细胞与杂交瘤上清液在12×75mm试管中于4℃反应1小时。通过下铺一层胎牛血清进行离心而洗去细胞中未反应的抗体。将靶细胞再悬浮于第2试剂羊F（ab′）2抗小鼠（IgG+IgM）FITC（荧光素异硫氰酸酯）结合物（得自Tago Laboratories，Burlingame，CA 94010）中，并最终以1∶50稀释而使用。将试验材料于4℃下维持1小时。通过下铺一层胎牛血清进行离心而将靶细胞与未结合的第二试剂分开。吸出血清，用Hanks平衡盐溶液（HBSS，Gibco）洗涤细胞。将细胞再用HBSS洗涤一次，再悬浮于组织培养基中，保持在4℃下以便用紫外荧光显微术进行观察。取等份细胞样品用propidium iodide（10μg/mlHBSS溶液）复染，进一步证实抗体染色的细胞为活细胞（propidium iodide选择性地染色死细胞）。显示出经典的表面环样荧光的活细胞被认为是L/1C2抗原阳性。
此外，也可用Epics-Coulter
Figure 891025251_IMG4
Mark IV 细胞分析仪（Coulter Electronics），利用本领域内公知的方法评价样品的荧光。另一些筛选肿瘤反应性克隆的方法详述于文献中（Galfre and Milstein，Methods in Enzymology，73：3-46，1981，Langone and Van Vunakis，ed.，Academic Press，New York）。
I.利用本发明抗体评价人体病理样品
利用修改的抗生物素蛋白-生物素技术，用免疫过氧化物酶法评价组织和肿瘤抗原分布。将冰冻的人体组织块切成4-6μm大小，放在用明胶包被的载玻片上，风干，在丙酮中固定5分钟。加5%马血清预保温后，将组织块依次与L/1C2抗体、生物素化的马抗小鼠Ig（Vectorlabs，Burlingame，CA）、抗生物素蛋白与辣根过氧化物酶的复合物进行保温，在这些保温步骤之间用含1%牛血清清蛋白的磷酸缓冲盐溶液pH7.2-7.4洗涤。所有成分的最佳稀释度都通过本领域内常用的“棋盘”滴定法由经验来确定。用3，3′-二氨基联苯胺显色，将组织块用苏木精复染。结果概括于表2。
J.L/1C2抗体的纯化
经5微米滤膜过滤（Millipore）后，将腹水液加到A蛋白Sepharose柱（Pharmacia    Fine    Chemicals，Division    of    Pharmacia    Inc.，800    Centennial    Avenue，Piscataway，New    Jersey    08854）上，对抗体进行亲和纯化。洗涤缓冲液为0.01M磷酸钠（pH8.0），用0.1M磷酸钠缓冲液（pH3.5）进行梯度洗脱。洗脱出的各组分用1M    Trizma缓冲液（Sigma）（pH7.4）迅速中和，并用0.01M磷酸钠（pH7.4）加0.15M    NaCl（PBS）进行透析。将抗体制备物通过0.22微米滤膜（Millipore    Corporation，Ashby    Road，Bedford，Massachuetts    01730）过滤而灭菌，于4℃下贮存备用。
K.L/1C2抗体的制备
L/1C2杂交瘤作为腹水在喂过鲨肝油烷的BALB/C小鼠体内生长良好，产生5-6mg/ml抗体。利用A蛋白层析而纯化的L/1C2产率在70-90%范围内，经SDS-PAGE（Laemmli，Nature（London）227∶680，1970）和考马斯蓝染色（图1A）鉴定，所得纯度大于90%。纯化的L/1C2抗体在PBS中具有极好的溶解性，在其中的浓度可达10mg/ml以上而不会由于沉淀而损失。
实例2
L/1C2抗原的定性
利用放射标记的5637细胞（ATCC ＃HTB9）测定由L/1C2抗体免疫沉淀的抗原的性质。5637细胞系是L/1C2抗原阳性癌的一种说明性细胞系，表1中的任何L/1C2阳性细胞系都是适用的。以组织培养法将细胞培养至50-75%汇合，将附着的细胞用无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）pH7.4（Gibco）洗两次。将1mCi3H-葡糖胺（New England Nuclear，549 Albany Street，Boston，Massachusetts 02118，617-482-9595）在培养基中稀释，加到培养瓶中。24小时后，将代谢标记的细胞用冷PBS洗两次，然后用含有0.02%叠氮钠、2mM苯甲磺酰氟、1%Nonidet P-40（Sigma）和0.1%十二烷基硫酸的PBS在冰上提取20分钟。以15，000g离心15分钟，以100，000g离心1小时（离心温度都为4℃），然后将放射标记的上清提取液冰冻贮存备用。使用前，将提取液与A蛋白Sepharose
Figure 891025251_IMG7
（Sigma）一起保温以除去非特异结合物。如下进行间接免疫沉淀：在1×107cpm标记细胞提取液中加入50μg L/1C2抗体，将该混合物于4℃下保温4小时。然后向管中加入IP缓冲液（PBS、1% BSA、0.1% Nonidet P-40
Figure 891025251_IMG8
）中的100μg20%洗过的A蛋白Sepharose
Figure 891025251_IMG9
（Sigma），然后再轻轻振荡4小时。加IP缓冲液离心两次，再只加PBS离心两次，以此来洗涤抗原、抗体和A蛋白Sepharose 的复合物。最后一次洗涤后，用SDS-PAGE分析沉淀物。
对免疫沉淀出的抗原进行分子量测定所用的标准蛋白包括：溶菌酶（14，400）、大豆胰酶抑制剂（21，500）、碳酸酐酶（31，000）、卵清蛋白（45，000）、牛血清清蛋白（66，200）、磷酸化酶B（92，500）、β-半乳糖苷酶（116，250）、肌球蛋白（200，000）。所用的分子量标记以试剂盒形式得到（Bio-Rad    Laboratories，2200    Wright    Avenue，Richmond，California    94804）。
用考马斯蓝染色含有经过分离的样品的平板凝胶，显现出分子量标记，然后将凝胶进行放射自显影，显现出标记的抗原（图1，B）。
实例3
L/1C2抗体的制备
可从ATCC（Rockville，MD）得到L/1C2杂交瘤的冻干瓶，登记号为ATCC ＃B9682。在37℃水浴中融化瓶中内容物，同时转动该瓶以促进快速和均匀融化，从而回收到活细胞。将细胞悬浮液用平衡盐溶液（BSS-Gibco）以1∶2稀释，下铺血清层以200g离心，从而从冷冻介质中分离出细胞。吸出细胞沉淀上面的物料后，收集细胞，用本领域常用的添加有血清和抗生素的组织培养基稀释，并在标准条件下（37℃，5%CO2）进行细胞培养而使其生长繁殖。在细胞培养过程中，最好保持细胞浓度为1×105-7×105个细胞/ml，但某些适度的变化也是完全可以接受的。
可以从组织培养物中以μg/ml的量回收L/1C2抗体。也可以使L/1C2在啮齿动物体内建立为腹水肿瘤而以更高的产率产生抗体。抗体的制备和收集方法详述于一篇极好的综述中（Gaflre    and    Milstein，Methods    in    Enzymology，73B：43-45，1981，Langone    and    Van    Vunakis，ed.，Academic    Press，New    York）。
实例4
测定与本发明抗原结合的抗体
测定与L/1C2抗原阳性靶细胞系反应的抗体是否与L/1C2抗原结合时，可以利用竞争性结合实验，也可以用免疫沉淀分析。竞争性结合实验对专业人员来说是已知的。在这类实验中，于检测标记形式L/1C2抗体的测定中引入一种未知抗原特异性的抗体。L/1C2抗体结合的抑制就表明未知抗体与L/1C2抗原结合。
A.竞争性测定
在竞争性放射免疫测定（RIA）中，如实例1所述用A蛋白层析法制备和分离抗体，并按Tsu和Herzenberg所述（Selected Methods in Cellular Immunology，P.373-380，ed.Mishell and Shiigi，W.H.Freeman and Company，San Francisco）用125I进行放射标记。任何如表1所列的表达L/1C2抗原的细胞系对竞争性RIA来说都是合适的靶细胞。以组织培养法培养表达L/1C2抗原的细胞系，直到达到所要求的细胞数目。通过CPEG处理从细胞基质中释放出细胞并用PBS洗涤。将1.5×105个细胞分置于96孔弹性板中，弹性板预先用聚L-赖氨酸（Sigma）包被。用PBS洗去尚未附着的细胞，留下的细胞用0.1%戊二醛（2滴/孔）于室温下固定5分钟。用0.1%甘氨酸封闭未反应的戊二醛，用含10%胎牛血清和0.05%NaN2的PBS洗涤弹性板并将弹性板保存在该溶液中。
靶细胞平板的制备方法见文献（Starling et al.，Cancer Research 46（1）：367-374，1986;Starling et al.，Journal of Supramolecular Structure 11（4）：563-577，1979），这些文献列为本文参考文献。由经验确定125I-L/1C2抗体的最佳稀释度，加入杂交瘤上清液后，该测定系统就可以用作竞争系统。
另一种利用125I-L/1C2和杂交瘤试样进行竞争性测定的方法见于文献（Tsu and Herzenberg，Selected Methods in Cellular Immunology，ed.，Mishell and Shiigi，p 390-394，W.H.Freeman and Company，San Francisco）。
B.抗原特异性的免疫沉淀分析
也可以利用放射标记的细胞组分的免疫沉淀来确定一种抗体是否与本发明的L/1C2抗原反应。用实例2所述的方法对本发明抗体所结合的抗原进行定性。对用L/1C2抗体或另一种抗体进行免疫沉淀所得到的迁移图谱进行比较，将揭示出两种不同的抗体是否具有抗原同一性。将竞争性结合实验和免疫沉淀研究结合起来，提供了另一种确定抗体是否与本发明抗原反应的手段。
实例5
与L/1C2抗原反应的多克隆
抗体的制备
针对可溶性抗原和颗粒性（细胞）抗原的常规抗血清的制备方法都是本领域的公知技术。在对任何具有免疫能力的脊椎动物注射外源物质后都会产生多克隆抗体。理想情况是，对用来产生抗血清的动物反复给予抗原，直到试验性放血后测定已达到最适的体液反应性为止。对免疫目的来说，任何L/1C2抗原阳性物质都是适合的。得到的抗抗血清对L/1C2抗原的反应活性可以如实例4所述进行测定。
实例6
癌的检测和诊断
利用修改的抗生物素蛋白-生物素免疫过氧化物酶技术（Borowitz，et    al.，American    Journal    of    Clinical    Pathology    79（3）：387-391，1983），将本发明的说明性抗体L/1C2单克隆抗体作为诊断工具来使用。
将冰冻的组织块切成大小为4-6μm，加到明胶包被的载玻片上，风干后，用丙酮固定5分钟。与5%马血清一起预保温后，将组织块依次与L/1C2抗体、生物素化的马抗小鼠Ig（Vectorlabs）和抗生物素蛋白与辣根过氧过物酶的复合物一起保温，在这些保温步骤之间用含1%牛血清清蛋白的磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH7.2-7.4）洗涤。用3，3′-二氨基联苯胺显色，将组织块用苏木精复染。
实例7
检测基团与本发明抗体的结合
实例6所述的方法易于通过直接使L/1C2抗体生物素化而进行修改，从而省去了对第二抗体（生物素化的马抗小鼠Ig）的需要。利用A蛋白层析法纯化L/1C2抗体，利用透析或SephadexG25
Figure 891025251_IMG11
（Sigma）脱盐，而使抗体进入0.1M NaHCO3，用0.1M NaHCO3调pH至8.5-8.6。制备好的G25柱可从Pharmacia化学公司作为PD10 柱买到。将L/1C2抗体在0.1M NaHCO3（pH8.5-8.6）中的浓度调整到1mg/ml。将N-羟基琥珀酰亚胺基生物素（Pierce Chemical Co.，P.O.Box 117，Rockford，Illinois61105）快速溶解于DMSO中，使其浓度为1mg/ml，加入120μl/mg的L/1C2抗体并迅速混合。将反应混合物于室温下放置4小时。结合的抗体可以利用透析法或使其通过Sephadex G25 而使其与未反应的N-羟基琥珀酰亚胺基生物素分开。生物素化的L/1C2抗体与荧光半分子、放射性物质或酶的抗生物素蛋白结合物反应后，便有利于进行检测。抗生物素蛋白-生物素检测体系的使用在本领域内得到广泛应用，上述的抗生物素蛋白结合物可从许多厂家买到。
可以利用文献所述方法使荧光标记物直接与本发明抗体相连（Selected    Methods    in    Cellular    Immunology，P    292-302，1980，Mishell    and    Shiigi，ed.，Freeman    and    Company，San    Francisco），此文献列为本文参考文献。
实例8
同型的测定
由L/1C2杂交瘤（ATCC    ＃B9862）产生的L/1C2抗体的同型被测定为IgG3。进行这一测定时使用的是得自HyClone    Laboratories的鼠类单克隆亚同型分类试剂盒及该公司所提供的说明书。
实例9
肿瘤细胞体外生长的抑制
将1×104个靶细胞分置于96孔组织培养平板（Costar）的每个小孔中，于37℃下，在含有5%CO2的潮湿培养箱中培养16小时，培养基为亮氨酸缺陷型培养基（无亮氨酸的DME加13μg/ml L-亮氨酸、29.2μg/ml L-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和10%透析过的胎牛血清）。所有组织培养试剂都得自Gibco Laboratories。然后无菌除去培养基，加入在200μl亮氨酸缺陷型培养基中的抗体稀释液。将平板培养48小时，此时除去培养基而换用添加有3H-亮氨酸（NEN）的亮氨酸缺陷型培养基（Gibco），使每小孔达到4μCi。将平板再放回培养箱中培养24小时。利用自动细胞收集仪和液闪技术测定掺入大分子中的放射性。
实例10
利用紫外显微技术评价L/1C2
在T222肿瘤细胞中的内在化
用胰酶/EDTA（Gibco）处理T222细胞，直到观察到细胞与培养瓶脱离为止，以此方法从组织培养瓶中收集T222细胞。将细胞用Hanks平衡盐溶液（HBSS（Gibco））洗涤两次。将1×106个细胞移入12×75mm离心管，离心沉降，吸出HBSS。每管加入50μl L/1C2（5μg/ml），在冰上保温30分钟。保温后，将细胞用HBSS洗两次，除去所有未结合的L/1C2，最后一次洗涤后吸出HBSS。加入50μl荧光素标记的羊F（ab′）2抗小鼠IgG（Tago），然后混合内容物并放在冰上保温30分钟。然后将细胞用HBSS洗两次，除去所有未反应的荧光素标记羊F（ab′）2抗小鼠IgG，将这一时刻认为是测定时间的零点。
实例11
利用125I-L/1C2内吞作用评价L/1C2
在T222肿瘤细胞中的内在化
利用Iodobeads（Pierce Chemical Co.，Rockford IL），按厂家推荐方法用125I标记纯化的L/1C2。在评价125I-L/1C2的内在化时，认为细胞沉淀中的cpm为内在化的125I-L/1C2（Malzku et al.，Cancer Research 43∶3848，1986）。简单地说就是，使1×106个靶细胞与200，000cpm标记的抗体在0℃或37℃下反应90分钟，洗涤4次，悬浮于0.5ml甘氨酸缓冲液（0.05M甘氨酸-HCl，pH2.8和0.1M NaCl）中，以解离细胞表面结合的免疫球蛋白。离心后，测定上清液或细胞沉淀中的放射性。认为上清液中的放射性计数是细胞表面结合的125I-L/1C2。
实例12
为评价抗肿瘤活性而进行的裸鼠
异种移植筛选
将得自Charles River Breeding Laboratories（Boston，MA）的远交裸鼠圈在超净工作台中，不定时地给予无菌水和食物。取约2月龄的裸鼠，在右胁皮下接种0.2ml PBS中的1×107个肿瘤细胞。在无菌PBS中制备待评价抗肿瘤效力的化合物供静脉施用，施用时注意尽量减少试验动物注射部位的创伤和感染。
通过检查肿瘤的大小确定疗效。后来在两个方向上测量肿瘤，用下列公式计算出大小：长度×宽度2/2。计算出相对于只给予PBS的对照组动物体内肿瘤生长的肿瘤生长抑制作用。所有处理组和对照组都以10只鼠为一组。
裸鼠对本试验体系来说是优选的啮齿动物，但各种不同的研究也用辐射或免疫抑制剂对其它啮齿类进行免疫抑制，从而阻断宿主动物的免疫反应性。T222细胞对裸鼠异种移植模型来说是优选的人肿瘤细胞系，但只有那些表达L/1C2抗原并可重复地在裸鼠体内建立肿瘤的人肿瘤细胞系才有可能也是优选的。
实例13
L/1C2-4-脱乙酰基长春花碱-3-
羧基酰肼的制备
A.L/1C2抗体的氧化
将L/1C2抗体在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.6（乙酸缓冲液）中彻底透析，稀释至浓度为10mg/ml（总体积为15.7ml），使其在冰水浴中平衡至约0℃。加入535mg固体（偏）高碘酸钠，轻轻搅拌反应混合物，直到高碘酸钠溶解，因剧烈搅拌会损害抗体，所以要避免。将反应混合物在冰浴中搅拌约21分钟，同时用铝箔盖好防止光照混合物。保温21分钟后，加入1μl 12.5M乙二醇（水溶液）终止氧化反应。通过离心从反应混合物中除去聚集物，将澄清的溶液在Sephadex G-25 凝胶过滤柱（44g Sephadex-G25
Figure 891025251_IMG15
，2.5×50cm柱）上进行层析，该柱预先用乙酸缓冲液平衡。收集从柱中流出的第一个峰，用乙酸缓冲液稀释至2.77mg/ml。利用280nm紫外吸收测定蛋白浓度，假定1mg/ml抗体溶液的消光系数为1.43。
B.氧化型L/1C2抗体与4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼硫酸盐的结合
向前面步骤A得到的于约0°-2℃下搅拌的氧化型L/1C2抗体（2.77mg/ml在乙酸缓冲液中的溶液，总体积为55ml）中，加入238mg4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼硫酸盐（按EPO公告247，792公开的方法制备）。在4-脱乙酰基长春花碱-3-羧基酰肼硫酸盐溶解后，将该混合物包在铝箔中防止光照，并移至冷室（4℃）中，在冷室中搅拌约16小时。然后通过离心澄清反应混合物，并在Sephadex G-25凝胶过滤柱（67g Sephadex G-25
Figure 891025251_IMG16
，2.5×75cm柱）上进行层析，该柱预先用PBS平衡。收集各组分，收集第一个峰并利用双波长紫外分光光度法在280nm和270nm处测定蛋白和药物浓度。通过0.2μm过滤灭菌（Millipore）后，于4℃下贮存免疫结合物。
实例14
L/1C2丙酰基-3-氨基羰基-4-
苯甲醛-氨甲蝶呤酰肼的制备
A.氨甲蝶呤-γ-酰肼的制备
在100ml烧瓶中加入1.61g（10毫摩尔）L-谷氨酸5-甲基酯。向其中加入60ml乙酸叔丁基酯，搅拌该混合物至两种化合物充分混合。然后在连续搅拌下向其中滴加1.58g（11毫摩尔）70%高氯酸。使该混合物在氮气下搅拌两天，然后用100ml0.5N盐酸分三次萃取。合并水层并用30g碳酸氢钠中和。该中性溶液用三份乙醚（总体积为150ml）萃取，合并有机层并用盐水洗涤。然后将洗涤后的有机溶液用硫酸钠干燥，室温下真空蒸发，得到1.18g（5.4毫摩尔）清彻油状物，鉴定为L-谷氨酸5-甲基-1-叔丁基二酯。
向经过烘箱干燥的100ml烧瓶中加入0.92ml（6.6毫摩尔）三乙胺、1ml（6.6毫摩尔）氰基膦酸二乙酯和49ml在真空下用氧化钡新蒸出的二甲基甲酰胺。向搅拌的溶液中加入506mg（1.3毫摩尔）2，4-二氨基-6-〔N-甲基-N-（4-羧基苯基）氨基〕蝶啶三水合物。当该中间体已伴随搅拌而溶解后，将该混合物加热至80℃，然后加入溶解于1ml二甲基甲酰胺中的0.2ml（1.4毫摩尔）三乙胺和342mg上面制备的L-谷氨酸二酯。将该混合物于80℃下搅拌2小时，然后冷却并真空除去溶剂。将残渣溶于300ml氯仿中，用5%碳酸氢钠溶液洗涤。用氯仿萃取水层，合并有机层，用硫酸钠干燥，真空浓缩，得1.35g橙色油状物，将其在150g硅胶上层析，用10%甲醇在氯仿中的溶液洗脱。合并含产物的级分并浓缩，得645mg氨甲蝶呤二酯，其中的γ-羧基为甲基酯形式，α-羧基为叔丁基酯形式。
将上述中间体与另一批同样的中间体合并，总量为697mg（1.3毫摩尔）。将其溶于12ml甲醇中。向其中加入170mg（5.3毫摩尔）无水肼，将该混合物于室温和氮气氛下搅拌6天。然后真空除去溶剂，将残渣在150g硅胶上进行层析，用15%甲醇的氯仿溶液洗脱，得到470mg（0.9毫摩尔）氨甲蝶呤-α-叔丁酯-γ-酰肼。
将上述中间体溶于120ml    1N盐酸中，于55℃下加热50分钟。然后真空浓缩成固体，将残渣溶解于80ml    0.01M    pH8的乙酸铵中。将该溶液于4℃下贮存3天，然后在300ml    Sepharose    Fast    Flow    Q（Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ）上进行层析，用上面刚刚用过的同一缓冲液（缓冲液A）和1.0M    pH8的乙酸铵（缓冲液B）以梯度方式进行洗脱。合并在100%缓冲液B中洗脱出的含产物级分，反复冰冻干燥以除去少量乙酸铵。产量为326mg（0.7毫摩尔）氨甲蝶呤-γ-酰肼。
B.连接基团-3-（4-甲酰苯基羰基氨基）丙酸N-琥珀酰亚胺基酯
在250ml烧瓶中加入100ml二噁烷中的3g（20毫摩尔）4-羧基苯甲醛和2.3g（20毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺。将该混合物搅拌5-10分钟，然后加入4.1g（20毫摩尔）二环己基碳二亚胺。将该混合物在室温下搅拌1小时，然后过滤。真空蒸发滤液，得9.4g白色固体，用25ml热异丙醇重结晶。用异丙醇研制该中间产物，得2.1g（8.5毫摩尔）所需的4-羧基苯甲醛的N-琥珀酰亚胺基酯。
制备另外几批中间产物，将总共10g（40毫摩尔）N-琥珀酰亚胺基酯加到3.6g（40毫摩尔）β-丙氨酸在40ml    1N氢氧化钠和约100ml水中的溶液中。将该混合物搅拌1.5小时，同时保持pH在8以上。然后将该混合物过滤，滤液用2N盐酸酸化至pH1.9。用总共150ml的乙酸乙酯萃取3次，合并有机层并用盐水洗涤。然后用硫酸钠干燥有机层，真空蒸发，得4.6g（21毫摩尔）白色固体，即3-（4-甲酰苯基羰基氨基）丙酸。
在一个小烧瓶中加入100mg（0.45毫摩尔）上述中间体、103mg（0.5毫摩尔）二环己基碳二亚胺、57.5mg（0.5毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺和10ml二噁烷，在室温和氮气下搅拌该混合物。利用薄层层析法观察反应进程，再加入75mg（0.36毫摩尔）二环己基碳二亚胺和45mg（0.4毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺。4小时后，过滤反应混合物，真空蒸发滤液至固体。得到约200mg不纯的产物，在30g硅胶上进行层析，用5%异丙醇的二氯甲烷溶液洗脱。合并含产物的级分，蒸发得81mg（0.25毫摩尔）略微不纯形式的所需中间体。
C.使L/1C2抗体与连接基团-丙酰基-3-氨基羰基-4-苯甲醛偶联
于室温下，向100ml烧瓶中加入1026mg（6.8微摩尔）抗体L/1C2在76.1ml    0.34M硼酸缓冲液pH8.6中的溶液，接着加入14.1mg（44微摩尔）“制备3”得到的活性酯在3.3ml乙腈中的溶液。将该混合物于室温下搅拌1小时。然后在90g    Sephadex    G25（Pharmacia）上进行层析，用pH5.6的0.1M乙酸钠洗脱。通过在258nm和280nm处进行紫外分析测定各级分，合并含产物级分，得948mg（6.3微摩尔）所需产物，其形式为浓度为8.5mg/ml的111.5ml溶液。衍生化抗体的结合比为每摩尔抗体4.8摩尔连接基团。
D.抗体L/1C2丙酰基-3-氨基羰基-4-苯甲醛与氨甲蝶呤-γ-酰肼的结合
从“制备4”的产物中取含472mg（3.1微摩尔）衍生化抗体的55.6ml的一部分，另用87ml    0.1M乙酸钠pH5.6稀释。
将一份101mg（216微摩尔）的氨甲蝶呤-γ-酰肼溶于7.2ml乙腈和21.6ml    1M磷酸二氢钾缓冲液中。向该溶液中加入约1ml    5N氢氧化钠，然后将溶液加到抗体溶液中。用冰乙酸将反应混合物酸化至pH5.8，于室温下搅拌16小时。然后离心，将上清液在两个90g    Sephadex    G25层析柱上进行层析，用生理缓冲盐水洗脱。
由层析收集总量为202.8ml的溶液，利用紫外光谱法进行分析，观察280nm和370nm处的光谱。分析表明，该溶液中含有0.018mg/ml氨甲蝶呤和1.87mg/ml抗体。因此结合比按摩尔数计为3.0。通过在低温下对生理缓冲盐水进行真空透析使产物溶液浓缩，将本实例的产物溶液与由类似操作得到的212ml产物溶液合并。通过透析使体积减少到108ml。
实例15
抗体L/1C2丙酰基-3-氨
基羰基-4-苯甲醛与氨甲蝶呤
-γ-酰肼的结合物-改变反应条件以
生成各种不同结合比的结合物
将实例14所述的结合反应操作重复四次，反应条件与实例14所述条件的不同仅在于以下几点。
A.将一份0.67mg的氨甲蝶呤-γ-酰肼溶于67μl    0.1M乙酸钠pH5.6和33μl乙腈中，将该溶液与1ml含2.2mg实例14C部分的中间体在0.1M乙酸钠中的溶液合并，使该混合物静置11小时。然后在5.9g    Biogel    P6（Bio-Rad    Laboratories，Richmond，CA    94804）上进行层析，得5ml结合物溶液，其中含有0.6mg所需结合物，其结合比为每摩尔抗体3.2摩尔氨甲蝶呤。
B.将实例15A部分所用等量的氨甲蝶呤-γ-酰肼溶液与0.95ml含0.42mg实例14C部分中间体的溶液，使该混合物放置11小时。如实例15A部分所述进行层析，得4.75ml结合物溶液，其中含有0.11mg结合物，其结合比为每摩尔L/1C2抗体5.4摩尔氨甲蝶呤。
C.将溶于50μl乙腈和100μl    1M磷酸缓冲液pH5.8中的一份0.7mg的氨甲蝶呤-γ-酰肼，与溶于1ml    0.1M乙酸钠pH5.6中的2.2mg实例14C部分中间体合并。使该混合物放置11小时。然后如实例15A部分所述进行层析，得5.3ml结合物溶液，其中含有1.3mg结合物，其结合比为每摩尔抗体3.3摩尔氨甲蝶呤。
D.将溶于50μl乙腈和150μl    1M磷酸缓冲液pH5.8中的一份0.7mg的氨甲蝶呤-γ-酰肼，与2.2mg实例14C部分中间体在1ml    0.1M乙酸钠中的溶液合并。使该混合物放置14小时，然后如实例15A部分所述进行层析，得5.3ml结合物溶液，其中含有1.7mg结合物，其结合比为每摩尔L/1C2抗体3.3摩尔氨甲蝶呤。
上述结合反应操作的变化建立了一个体系，借助此体系可以控制药物与L/1C2抗体结合的程度。一般认为优选的结合比是在不造成L/1C2抗体的抗原结合性质明显下降的情况下所能连接的药物的最大数目。
实例16
A.抗体L/1C2羰基-4-苯甲醛中间体的制备
如实例14B部分所述，制备一份0.31mg的4-羧基苯甲醛N-琥珀酰亚胺基酯。将其溶解于100μl二甲基甲酰胺中，并将其加到18.9mg抗体L/1C2在2.1ml    0.34M硼酸缓冲液pH8.6中的溶液中。于室温下搅拌该混合物1.5小时，然后在6g    Biogel    P6上层析，用0.1M乙酸钠pH5.6洗脱。得到一份6.2ml的溶液，对其进行紫外分析，观察256nm和280nm处的光谱。分析表明，得到16.1mg衍生化抗体，浓度为2.6mg/ml，其结合比为每摩尔抗体5.2摩尔连接基团。
B.抗体L/1C2羰基-4-苯甲醛与氨甲蝶呤-γ-酰肼的结合物的制备
将4ml得自实例16A部分的含有10.4mg（0.069微摩尔）衍生化抗体的溶液，与3.2mg（6.8微摩尔）氨甲蝶呤-γ-酰肼在250μl二甲基甲酰胺中的溶液合并。使该混合物于室温下放置6小时，然后放在冰箱中。两天后，离心该混合物，取上清液在Bio-Gel    P6上进行层析，用生理缓冲盐水洗脱，得8.5ml溶液，对其进行紫外分析，观察280和370nm处的光谱。分析表明，该产物的结合比为每摩尔抗体6.4摩尔药物，该溶液中含有0.64mg/ml结合物。
如实例9所述，评价该产物抑制组织培养中的T222肿瘤细胞生长的能力。发现该结合物在浓度为0.035μg/ml（以氨甲蝶呤含量计）时，对细胞生长产生70%抑制。
实例17
L/1C2抗原结合片段及其结合物的制备
A.抗体L/1C2F（ab′）2片段
用如下方法制备抗体L/1C2的F（ab′）2片段：在1.5gL/1C2抗体在270ml生理缓冲盐水中的溶液中，加入2.4ml含12.6mg胃蛋白酶/ml的胃蛋白酶溶液。将该混合物于37℃下放置2小时20分钟，然后加入三乙胺停止反应。然后通过在Sepharose Fast Flow柱上层析而浓缩产物，用0.15M乙酸钠洗脱。合并含F（ab′）2的级分，通过透析而浓缩，得100ml产物溶液，其中含有992mg抗体L/1C2的F（ab′）2片段。
B.抗体L/1C2F（ab′）2片段丙酰基-3-氨基羰基-4-苯甲醛中间体的制备
将本实例17A部分制备的L/1C2F（ab′）2片段透析到0.34M硼酸缓冲液pH8.6中，得23mg（0.23微摩尔）F（ab′）2片段，其形式为3.8ml溶液。将该溶液与0.44mg（1.4微摩尔）3-（4-甲酰苯基羰基氨基）丙酸N-琥珀酰亚胺基酯在102μl乙腈中的溶液合并。将该混合物于室温下搅拌1小时，然后将该溶液在11g Sephadex G25的柱上进行层析，用0.1M乙酸钠pH5.6洗脱。合并含产物级分，得19mg（0.19微摩尔）衍生化抗体片段，其结合比在9.6ml溶液中为每摩尔抗体2.8摩尔连接基团。
C.L/1C2F（ab′）2片段丙酰基-3-氨基羰基-4-苯甲醛与氨甲蝶呤-γ-酰肼的结合物的制备。
向2.7ml前面B部分制备的含8mg（0.08微摩尔）衍生化抗体片段的溶液中，加入0.47ml    1M磷酸缓冲液pH5.6。向该溶液加入溶于最少量0.1M乙酸钠中的3.7mg（7.9微摩尔）氨甲蝶呤-γ-酰肼。用稀盐酸将混合物的pH调回至5.6，于室温下搅拌该混合物17小时。然后离心，取上清液在11g    Sephadex    G25的柱上进行层析，用生理缓冲盐水洗脱。紫外分析表明，得到了5.8mg结合物，其形式为含0.95mg/ml结合物的溶液，其结合比为每摩尔L/1C2抗体2.1摩尔氨甲蝶呤。
如实例9所述，在肿瘤细胞体外生长抑制测定中测试结合物对T222肿瘤细胞的活性，发现结合物在浓度为0.0046μg/ml时抑制该细胞的生长达22%，在浓度为0.046μg/ml时抑制生长83%（浓度以氨甲蝶呤-γ-酰肼含量计）。

Claims (18)

1、一种基本纯净形式的肿瘤相关糖蛋白抗原，所述抗原具有下列性质：利用SDS-PAGE在还原条件下测得分子量在110，000-140，000道尔顿范围内；存在下于源于头；颈和肺上皮细胞的人鳞状上皮癌细胞表面；能被由杂交瘤细胞系L/1c2产生的抗体免疫沉淀。
2、一种杂交瘤细胞系，它产生能与权利要求1所述的糖蛋白抗原反应的抗体。
3、权利要求2的杂交瘤细胞系，其特征在于，它为L/1C2。
4、一种能与权利要求1所述的肿瘤相关糖蛋白抗原反应的抗体。
5、一种由权利要求2的杂交瘤细胞系产生的抗体。
6、权利要求4的抗体，其特征在于，它是一种嵌合抗体。
7、权利要求4或5的抗体，其特征在于，它是一种IgG抗体。
8、权利要求7的抗体，其特征在于，它是L/1C2抗体。
9、一种含有权利要求4-8中任一项的抗体的一个抗原结合区的分子。
10、一个权利要求4-8中任一项的抗体的Fab片段。
11、一个权利要求4-8中任一项的抗体的F（ab′）2片段。
12、一种检测样品中是否存在L/1C2抗原的方法，它包括：（a）向所述样品中加入一种抗体，该抗体能与权利要求1所述的肿瘤相关糖蛋白抗原反应;（b）测定所述抗体与所述样品的反应活性。
13、一种用于治疗人体癌症的抗癌剂，它含有权利要求4-11中任一项所述的抗体、分子或片段，它们与一种放射性元素、生物毒素或溶癌药物偶联。
14、一种如权利要求13所述的抗癌剂，其特征在于，生物毒素为双翅目昆虫毒素或蓖麻蛋白，或者溶癌药物为氨甲蝶呤、一种长春花生物碱或亚德里亚霉素。
15、一种如权利要求13或14所述的抗癌剂，其特征在于，所述抗体、分子或片段为ATCC＃B9682的分泌产物单克隆抗体L/1C2。
16、一种治疗人体癌症的方法，它包括给人体施用一种如权利要求13-15中任一项所述的抗癌剂。
17、一种制备如权利要求5-11中任一项所述的抗体、分子或片段的方法，它包括：（a）使权利要求2或3所述的杂交瘤细胞系分泌一种单克隆抗体;（b）纯化所述单克隆抗体;（c）如需制备Fab或F（ab′）片段，可视需要用蛋白水解酶木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割所述纯化抗体。
18、一种制备如权利要求13-15中任一项所述的抗癌剂的方法，它包括：使一种如权利要求4-11中任一项所述的抗体、分子或片段与一种放射性元素、生物毒素或溶癌剂偶联。
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