HUT52166A - Process for producing monoclonal antibodies - Google Patents

Process for producing monoclonal antibodies Download PDF

Info

Publication number
HUT52166A
HUT52166A HU891940A HU194089A HUT52166A HU T52166 A HUT52166 A HU T52166A HU 891940 A HU891940 A HU 891940A HU 194089 A HU194089 A HU 194089A HU T52166 A HUT52166 A HU T52166A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
antigen
fragment
antibodies
cells
Prior art date
Application number
HU891940A
Other languages
English (en)
Inventor
Magda Gutowski
David Arthur Johnson
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT52166A publication Critical patent/HUT52166A/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/861—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgG3, IgG4, IgA, or IgY
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/862—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgE or IgD
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
    • Y10S530/864—Monoclonal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány új, tumorral társult antigénnel foglalkozik, amely sejt-felületi antigén és sokféle karcinómában van jelen, ideértve a pikkelyes sejt karcinómákat és adenokarcinómámákat. A találmány foglalkozik továbbá az antigénnel reaktív antitestekkel, hibridóma sejtvonalakkal, amelyek a jelen találmány szerinti antitesteket előállítják, és eljárásokkal az antitestek felhasználására rák diagnózisában és kezelésében.
A rosszindulatú daganatok korai diagnózisa és a tumortípus azonosítására kritikus a karcinóma klinikai kezelésében. A jelen találmány humán karcinóma sejteken kifejezett antigénnel reaktív monoklonális antitesteket foglal magában. Bár karcinómákkal reaktív monoklonális antitestek előállítását egy sor irodalmi hely leírja £4,708,930 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás; 157,613 számú európai szabadalmi közzétételi irat; Mazauric és munkatársai: Cancer Research 42, 150 (1982);
Brenner és munkatársai: Cancer Research 42, 3187(1982); Mulshine és munkatársai: The Journal of Immunology 13161, 497(1983); és Masuka és munkatársai: Japanese Journal fór Cancer Research 76(5), 386(1985)] , a jelen találmány szerinti antigénnel reaktív monoklonális antitestet eddig még nem írták le. A tüdő, fej és nyak pikkelyes karcinómái, valamint a végbél és tüdő adenokarcinómái fejezik ki ezt az antigént, ennek megfelelően reagálnak a jelen találmány szerinti antitestekkel. Az L/1C2 antigén széles eloszlása humán karcinómákon a jelen találmány jelentős diagnosztikus és terápiás alkalmazását demonstrálja.
A jelen találmány egy lényegében tiszta, tumorral társult glikoprotein antigénre irányul, ahol a nevezett antigén molekulatömege 110000-140000 dalton tartományban van, amint ezt SDB3 • ·· • «· · • ·· •· · • · ·
PAGE-val (nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélelektroforézis) meghatározzuk redukáló körülmények között; ez az antigén a fej, nyak és tüdő hámsejtjeiből kiemelkedő humán pikkelyes karcinóma sejtek felületén van jelen; ez az antigén fogékony immunkicsapásra azzal az antitesttel, amelyet az L/1C2 hibridóma sejtvonal termel.
Meglepő módon az L/1C2 antigén internalizálódik a találmány szerinti antitestek kötését követően. Az L/1C2 antigén internalizálása a jelen találmány terápiás kiviteli módjának fontos szempontja annyiban, hogy lehetővé teszi onkolitikus ágensek, amelyek a találmány szerinti antitestekhez vannak kötve, intracelluláris szolgáltatását; az onkolitikus ágensek így az L/1C2 antitestekhez kötődnek és az antigén-antitest komplex ez után endocitózison megy keresztül.
A találmány olyan hibridóma sejtvonalakra is irányul, amelyek a fentebb ismertetett, tumorral társult glikoprotein antigénnel reaktív antitesteket termelnek.
A jelen találmány olyan antitestekre is irányul, amelyek reaktívak a fentebb ismertetett, tumorral társult glikoprotein antigénnel.
A jelen találmány L/1C2 antigén jelenlétének valamely mintában való kimutatására szolgáló eljárásra is irányul; az eljárás abban áll, hogy a mintához olyan antitestet adunk, amely reaktív a fentebb ismertetett, tumorral társult antigénnel, majd mérjük az antitest reaktivitását a mintához.
A jelen találmány szerinti antitestek különösen alkalmasak citotoxikus ágensek szolgáltatására in vivő az L/1C2 antigént kifejező tumorokhoz. A citotoxikus ágensek szignifikáns növekedést mutatnak hatékonyságban, amikor a jelen találmány szerinti antitestekhez vannak kötve.
1. ábra. Az L/1C2 antigén és az L/1C2 monoklonális antitest nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézises elemzése (SDS-PAGE). A mintákat elektroforézisnek vetjük alá egy poliakrilamid mátrixon nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében. A vándorlási távolságokat összehasonlítjuk ismert molekulatömegű fehérjékkel, hogy megállapítsuk az antitest alegységek és az antigén molekulatömegét. Az EDS-PAGE-t reduláló körülmények között végezzük, hogy disszociáljuk a diszulfid híd alegységeket. A panel: Coomassie kékkel festett, redukáló körülmények között futott 7-15 % gradiens gél, amely A fehérjével tisztított L/1C2 antitest egyedi nehéz és könnyű láncait mutatja. B panel: Immun-kicsapott( Hglükózamin-jelzett L/1C2 antigén, amely 7-15 % gélen van elemezve redukáló körülmények között, autoradiogramja a molekulatömeg standardokkal együtt. A bemutatott számok a standard molekulatö- _3 megeit képviselik 10 -mai szorozva. Egy IgG3 mielóma negatív kontroll nem immunprecipitál azonosítható antigéneket.
2. ábra. L/1C2 reaktivitás sejtosztályozó elemzése kiválasztott tumor antigénekkel. USCLS-1; M21; és T222 célsejteket inkubálunk szuszpenzióban L/1C2-vel vagy IgG3 mielóma kontroll immunglobulinnal (m-IgG3), amint jelezzük. A kimutató reagens fluoreszceinnel jelzett kecske F(ab') anti-egér IgG és IgM. Az átlagos csatorna fluroeszcenciát jelezzük.
3. ábra. Az L/1C2 antitestek internalizációjának kinetikáját a T222 sejteken levő L/1C2 antigénhez való kötést követően UV mikroszkópiával tárjuk fel. Ennek az elemzésnek a részleteit a 10. példában tárjuk fel. Az A panel a membrán-festés fényes, gyűrű• · * .ί ······· .
...........
' L . 1
- 5 szerű fluoreszcenciás jellemzőit tárja fel a 0. időpontnál. A B panel, amely a 105 perces időponthoz tartozik, elemzése a sejt szegélyénél levő festés csomóit tárja fel. A C panel, amely a 135 perces időponthoz tartozik, csak intracelluláris festést tár fel, jelezve, hogy az L/1C2 antitest internalizálódott.
4. ábra. A T222 xenograftok növekedését mutatjuk be meztelen egér.xenograft modellen, amelyet a 12. példában írunk le. Az A panel az L/1C2-DAVLBHYD hatékonyságát mutatja be a T222 tumorok növekedésének elfojtásában. A B panel kontroll csoport, ahol DAVLBHYD-t konjugálunk olyan immunglobulinhoz, amely nem kötődik a tumorsejtekhez. A C panel szabad gyógyszer kontroll, amely azért van itt, hogy a DAVLBHYD aktivitás összehasonlítása lehetséges legyen az A panel L/1C2 antigénreaktív immunkonjugátumaival és a ”B” panel nem-L/1C2 antigén-reaktív immunkonjugátumaival.
Az L/1C2-nek nevezett antigént immun-kicsapással izolálhatjuk
H glükózaminnal bioszintetikusán jelzett humán karcinóma sejtvonalak extraktumaiból. Az L/1C2 antigén glikoprotein, amely 110000 és 140000 dalton molekulatömeg-tartományban levő molekulatömeggel bír, amint ezt redukáló SDS-PAGE gradiens gélen meghatározzuk.
A jelen találmány szerinti hibridóma sejtvonalakat előállíthatjuk immunogén anyagként humán karcinóma eredetű sejtvonalat alkalmazva immunológiailag ide alkalmas lépsejtek aktiválására. A lépsejteket egér mielóma sejtekkel végzett fúzióval nem-pusztulóvá tesszük. A hibrid sejteket, amelyeket hibridómának nevezünk, vagy hibridóma sejtvonalakat, amelyek a fúzió eredményeképpen jönnek létre, ezután szelektáljuk és L/1C2 antigénnel, amely egy sor humán karcinóma sejtvonalon jelentkezik, való reaktivitásra átvizsgáljuk; a humán karcinóma sejtvonalak körül néhányat az alábbi 1.
·· ·« · ♦ · · · · • · · · · • ♦ *···* • ·· · ·· · táblázatban mutatunk be.
1. TÁBLÁZAT
Az L/1C2 antigén reprezentatív eloszlása humán karcinóma sejt-
vonalakon
Se jtvonal
Eredet/megjegyzés Membrán fluoreszcencia
Pikkelyes karcinómák
FADU Torok +
ME180 Méhnyak(epidermoid) +
T222 Tüdő +
USCLS-1 Tüdő +
5637 Hólyag +
Átmeneti sejt karcinómák
T24 Hólyag +
RT4 Hólyag(papi11óma) +
J82 Hólyag +/-
TCCSUP Hólyag + '
Adenokarcinómák
WiDr
Végbél
HT29
Végbél
SK-CO-1
Végbél(aszcitesz)
U.CLA/P3
Tüdő ·· ·· · • · · · · • ·· · · • · · ···· •·· · ·· ·
DU145
PC3
Melanómák
M21
M14
Prosztata
Prosztata +
+/Bőr
Bőr
Nem-transzformált sejtvonalak
FLOW 2000 Embrió tüdő fibroblaszt
Detroit 551 Bőr fibroblaszt
Az 1 . táblázatban a nyilvánvaló membrán fluoreszcenciát ( + ) jellel jelöljük; a gyenge fluoreszcenciát (+/-) jellel; és negatív reaktivitást pedig (-) jellel. Az összes meghatározást mielóma fehérje negatív kontrollokhoz viszonyítva végzünk. A cél-sejtvonalakat, ideértve az alábbi vonalakat, az American Type Culture Collection-tói (Rockville, Maryland 20852, ATCC) kapjuk; ezek: FaDu (ATCC HTB43), 5637 (ATCC HTB9), ME180 (ATCC HTB33), SK-CO-1 (ATCC HTB39), PC3 (ATCC CRL1435), DU145 (ATCC HTB81), T24 (ATCC HTB4), RT4 (ATCC HTB2), HT29 (ATCC HTB81), J82 (ATCC HTB1), TCCS U.P (ATCC HTB5), és WiDr (ATCC CCL218). További sejtvonalak még: T222 ^Masui és munkatársai: Cancer 44(3), 1002-7(1984)]; M14 ^Chee és munkatársai: Cancer Research 36(4), 1503-1509(1976)]; UCLA/P3 £Varki és munkatársai: Cancer Research 44, 681-687(1984)]; és M21 Morton és munkatársai: öurgery 64(1), 233-240(1968) . A Flow2000-t a Flow Laboratories, Inc.-tői (7655 Old Springhouse Road, McLean,
Virginia 22101) kapjuk.
Az 1. táblázat jól mutatja be az L/1C2 antigén széleskörű eloszlását a felhám-eredetű tumorokból származó sejtvonalakon· A találmány szerinti antitestek reaktivitását a sejtvonalakkal EpicsCoulter Mark IV sejtelemző berendezést (Coulter Electronics, Hialeh , Florida) alkalmazva· becsüljük meg, a gyártó által megadott munkamenet szerint. Az áramlási citometriás elemzés eredményeit a mellékelt ábrák közül a 2. ábrában adjuk meg. Friss humán tumor kórtani mintáit és normál szöveteket értékelünk, hogy bemutassuk a jelen találmány diagnosztikai eljárásait. Az L/1C2 antigén normál szövet eloszlásait az immun-peroxidáz (antitest-enzim konjugátum) eljárást alkalmazva a 6. példában mutatjuk be.
A 2. táblázat az L/1C2 antigén széleskörű eloszlását mutatja be különböző szerv-eredetű karcinómákon.
2. TÁBLÁZAT
Humán tumorszövet immun-peroxidáz festése a bemutatás célját szolgáló L/1C2 antitesttel
Reaktívak száma/
Tumor Vizsgált szám
Tüdő pikkelyes karcinómák15/15
Fej- és nyak pikkelyes karcinómák12/12
Végbél karcinómák17/17
Tüdő karcinómák7/7
Mell karcinómák 9/1étpetefészek karcinómák6/8
Prosztata karcinómák4/5
Limfóma0/1
Melanóma 0/2 • · ·»···* * β ...... · · ··.
♦
- 9 A normál humán szövetek értékelése feltárja, hogy az L/1C2 antigén kifejeződik számos szerv edényein, csatornáin és tubulusain, a szervek közé értve pl. a májat és a vesét. Ez kifejeződik a bél és a hörgő hám felszínein is. A mind normál, mind tumor szöveteket tartalmazó végbél mintákban a tumorszövet intenzívebben festődik, mint a normál végbélszövet.
A hibridóma technikát, amelyet eredetileg Kohler és Milstein írt le fNatúré, 495-497 (1975)J, alkalmazhatjuk olyan hibridóma sejtvonalak előállítására, amelyek kiválasztási terméke, a monoklonális antitest, reaktív az L/1C2 antigénnel. A jelen találmány szerinti hibridóma sejtek előállításának általános módszerét az 1. példában írjuk le, amely az L/1C2 hibridóma sejtvonal megalkotására vonatkozik; ez ATCC B9682 deponálási számon rendelkezésre áll az American Type Culture Collection-nál, Rockville, Maryland 20852. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a jelen találmány, amelyben az L/1C2 antitest és hibridóma sejtvonal benne foglaltatik, számtalan lehetőséget nyújt hibridómák előállítására, és így a jelen találmány szerinti antitestek előállítására .
Az L/1C2 antitest a jelen találmány esetében csak bemutatás céljára szolgál, és minden antitest, amely reaktív az L/1C2 antigénnel, tekintet nélkül a faj-eredetre vagy immunglobulin osztály vagy alosztály megnevezésére, ide értve az IgG, IgA, IgM, IgE és IgD megnevezéseket, a jelen találmány oltalmi körén belül van. A jelen találmány továbbá magában foglalja az L/1C2 antitestek antigén-kötő fragmentumait. Az L/1C2 antigénhez való kötési képesség a jelen találmány szerinti antitestek általános jellemzője.
Amint fentebb tárgyaltuk, a jelen találmány szerinti antites···»
• · · · • · • ···
- 10 teket megalkothatjuk és izolálhatjuk immunizálással, hibridómák előállításával, és antitestek azonosításával tumor sejtvonalakhoz való reaktivitás segítségével és hasonló L/1C2 antitest eloszlású normál szövetekhez való reaktivitás segítségével. A jelen találmány továbbá eszközt is nyújt a jelen találmány szerinti antitestek azonosítására, amely nem igényli antitest-reaktivitás meghatározását nagyszámú tumorral és normál szövettel. A jelen találmány szerinti antitesteket immun-kicsapással és versengő kötési tanulmányokkal azonosíthatjuk, az L/1C2 sejtvonalak által termelt L/1C2 antitestet alkalmazva.
Hasonló vándorlási mintákat, amelyeket akkor kapunk, amikor az L/1C2 monoklonális antitestekkel immun-kicsapásokat végzünk, amint ezt a 2. példában leírjuk, alkalmazhatunk az antigén azonosságának felismerésére. Az azonosság bizonyítékát megszerezhetjük olyan módon, hogy az antigént a sejtkivonatból kimerítjük valamely antitest fölöslegben levő mennyiségét alkalmazva és megfigyeljük, a másik antitest képességének hiányát, hogy kicsapjon egy antigént a kezelt extraktumból. Ugyanúgy azokban a példákban, ahol az antitestek azonos vagy szorosan társult epitóphoz kötődnek, az egyes antitestek versengenek a másikkal az L/1C2 antigénhez való kötődésért. A versengő kötéssel kapcsolatos tanulmányokat a 4. példában ismertetjük.
Antitest készítmények kezelése proteolitikus enzimekkel, pl. papainnal vagy pepszinnel antitest fragmentumokat alakít ki, ide értve a Fab és F(ab’)2 fajtákat, amelyek megőrzik az antigén-kötő aktivitást. A jelen találmány szerinti antitestek kezelésé ilyen enzimekkel ennek megfelelően alkalmazható a jelen találmány szerinti L/1C2 kötő fragmentumok kialakítására. A jelen találmány • ·
- 11 szerinti antitestek antigén-kötő fragmentumainak előállítását és ezek gyógyászati alkalmazhatóságát a 17. példában mutatjuk be. Az L/1C2 antitestek antigén-kötő fragmentumai különösen alkalmasak a jelen találmány gyógyászati felhasználásaiban.
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a jelen találmány szerinti antitestek és antitest fragmentumok a jelen találmány kulcs-sajátosságai. A találmány szerinti L/1C2 hibridóma sejt szolgál annak a DNS-nek előnyös forrásaként, amely a találmány ilyen antigén-kötő területét kódolja. Ezt a DNS-t rekombináns DNS technológia révén olyan DNS-hez rögzíthetjük, amely bármilyen kívánt aminosavgyök szekvenciát kódol, így alakítva ki egy olyan új hibrid vagy kiméra DNS szekvenciát, amely egy hibrid, vagy kiméra fehérjét kódol. Ilyen módon olyan jelen találmány szerinti kiméra antitesteket is kaphatunk, amelyben az antitest egyik része az egyik fajtából származik és az antitest másik része egy másik fajtából származik. A jelen találmány magában foglal tehát minden olyan kiméra molekulát, amely L/1C2 antigénkötő területet tartalmaz.
A jelen találmány szerinti antitesteket, beleértve az L/1C2 antitestet, alkalmazhatjuk immunológiai vizsgálatokban, hogy diagnosztizáljuk karcinóma jelenlétét emberi szövet mintákban. Betegek biopsziás és nekropsziás mintáit értékeljük karcinóma jelenlétére a jelen találmány szerinti L/1C2 antitesteket alkalmazva. A jelen találmány szerinti antitesteket jelezhetjük kimutatható (detektor) csoportokkal, ezek közé értve a fluoreszcens jelzéseket, enzim-jelzéseket, és radioaktív jelzéseket, hogy azonosítsuk az L/1C2 antigént kifejező karcinómákat. A találmányban alkalmazott detektor csoportok között találjuk fluoreszcens jel• · • · • ·· · · · · · ·· ·· · · ·· • ···· · ·· · · ··· zésként a fluoreszceint, enzim-jelzésként a peroxidázt és radio1 25 aktív jelzésként a -jódot.
További fluoreszcens jelzések között, amelyeket hasznosíthatunk ebben a találmányban, találjuk a rodamint, fikoeritrint és további,fluoreszcens energiát kibocsátó vegyületeket, de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik. További enzim-jelzések között, amelyeket hasznosíthatunk ebben a találmányban, találjuk a glükóz-oxidázt és alkálikus foszfatázt, de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik. További radioaktív jelzések között, amelyeket hasz131 111 nosíthatunk ebben a találmányban, találjuk a jódot és indiumot, de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik. Azok, akik a szakterületen jártasak, jól tudják, hogy a fentebb említett jelzések csak a bemutatás céljait szolgálják ahhoz a sokféle jelzéshez, amelyek a jelen találmányban alkalmazhatók. Az L/1C2 antigénreaktív antitestek származékot képezhetnek biotinnal való konjugálással is (7. példa), és alkalmazhatók bizonyos avidin-fajták, amelyek kimutathatóvá lettek téve fluoreszcens jelzésekhez, enzim jelzésekhez vagy radioaktív jelzésekhez való konjugálással, hozzáadása után sokféle immun-kémiai és immun-hisztológiai felhasználásra. Egy karcinóma-kimutatási és diagnosztizálási eljárást, a jelen találmány szerinti antitesteket alkalmazva, a 6. példa mutat be.
rinti olyan antitestek általános jellemzőit, amelyek kötődnek az
L/1C2 antigénhez. Az L/1C2 (ATCC HB9682) hibridóma sejtvonal ál tal termelt L/1C2-reaktív antitest speciális jellemzői között találjuk az alábbi fizikai jellemzőket: rágcsáló IgG3 izotípus, amint ezt a 8. példában meghatározzuk; termelés egyetlen immunglo·· ·· · • · · · · • ·· · • · · ·<
• · · · · ·
- 13 bulinként, amelyet az ATCC B9682 L/1C2 sejtvonal kiválaszt (lásd az 1. ábrát az SDS-PAGE elemzésnél); és 10 mg/ml koncentrációban oldódás PBS-ben.
Az L/1C2 antitest terápiás alkalmazhatóságát ennek az antitestnek a citotoxikus gyógyszer-konjugátumait alkalmazva állapítjuk meg. Megállapítjuk továbbá, hogy még a nem módosított antitest is mutat in vitro aktivitást. Az L/1C2 antitestnek azt a képességét, hogy gátolja a tumorsejt növekedését, a 3. táblázatban foglaljuk össze. Az in vitro tumorsejt növekedési vizsgálat részleteit a 9. példában ismertetjük.
3. TÁBLÁZAT
In vitro tumorse jt növekedés 1 gátlása
Koncentráció CPM +/- S.E. % változás P
L/1C2
1 00 jiÁg/ml 57,144 +/- 7,242 -92 0,001
10 424,406 +/- 98,658 -41 0,05
1 595,578 +/- 109,209 -19 n. sz.
0 736,567 +/- 19,026 - -
L4/KS
1 OOjiá g/ml 698,823 +/- 81,625 -8 n. sz.
10 656,286 +/- 43,969 -13 n. sz.
1 709,928 +/- 12,1271 -6 n. sz.
0 758,271 +/- 18,931 — —
l 1 - 14 -
Bleomicin
szulfát
1 0/tg/ml 89,906 +/- 13,685 -85 0,01
0 648,327 +/- 109,017 - -
1A T222 pikkelyes karcinóma célsejtekbe 3 beépült H-leucin be-
ütés/perc (CPM) értékét jelöljük. A minták nagy száma ebben a vizsgálatban szükségessé teszi, hogy 1-nél több szövettenyésztő lemezt alkalmazunk. Ennek megfelelően mindegyik vizsgáló reagenst negatív kontroll üregek saját készletével hasonlítunk össze, hogy kiszámítsuk a százalékos gátlást. A P értékeket a Studentféle t-tesztet alkalmazva határozzuk meg. Ebben a vizsgálatban pozitív kontrollként bleomicint alkalmazunk.
n.sz. = nem szignifikáns
S.E. = standard hiba
A 3· táblázat az L/1C2 antitest és az L4/KS antitest olyan képességeinek összehasonlítását szemlélteti, hogy mennyire gátolják in vitro a tumorsejt növekedést. Pontosabban a 3· táblázat a módosítatlan L/1C2 antitestnek azt a képességét mutatja be akár 10 g/ml koncentrációnál, hogy szignifikánsan gátolja a T222 L/1C2 antigén pozitív tumor sejtvonal növekedését. Az L4/K8 antitest £.Startling és munkatársai: J. Cell. Biochem. 11B. szupplementum, 192(1984)}, amely a KS1/4 antigénhez kötődik Jj/arki és munkatársai: Cancer Rés. 44, 681(1984)}, szintén kifejeződik a T222 tumor sejtvonalon. Az L4/KS antitest az L/1C2 antitesttel ellentétben nem hatásos a T222 sejtek növekedésének gátlásában.
Abból a célból, hogy megértsük a nem módosított L/1C2 anti• - · · ··· ·:·· ·····:· : ...· t
- 15 test új képességét a tumor sejtnövekedés gátlásában, kísérleteket végzünk, hogy meghatározzuk a komplement rögzítés és antigén internalizáló részesedését. A vizsgálatot, amelynek kitanítása a 9. példában található, olyan szérumot alkalmazva hajtjuk végre, amelyet 56°C hőmérsékleten 30 percig melegítettünk, hogy a komplement aktivitás hő-inaktiválását idézzük elő. Ennek a találmánynak az eredményei azt jelzik, hogy a komplement rögzítés nem ad magyarázatot a citotoxicitás nem módosított antitesttel megfigyelt szintjére. Ezek az adatok egybevágnak a 3· táblázatban található adatokkal, amennyiben az L4/KS IgG2a izotípusú; az olyan antitest alosztály, amelyről ismeretes, hogy nagy mértékben alkalmas a komplement rögzítésben.
Abból a célból, hogy értékeljük az L/1C2 antitest kötésének következményeit egy antigén-pozitív tumor sejtvonalhoz, kifejlesztettük a 10. és 11. példában leírt vizsgálatot.
A 10. példa kitanítást ad a fluoreszceinnel jelzett, az L/1C2 antigénnel reaktív antitestek alkalmazására az L/1C2 antitest internalizáció kinetikájának értékelésére ennek kötését követően az L/1C2 antigénhez a sejt felületén. A 3· ábra mutatja be ennek a megközelítésnek az eredményeit az antitest internalizáció követésére. Megjegyzendő a 3· ábrában, hogy a 0 percnél (A panel) fényes gyűrű-szerű fluoreszcencia nyilvánvalóan látható, amely a membrán topográfiájára jellemző. Ezzel ellentétben 105 perces inkubálást követően 37°C hőmérsékleten (B panel) a gyűrű-szerű fluoreszcencia csökken, miközben a fluoreszcencia fényes csomói válnak nyilvánvalóvá a sejt szélén. Végül 135 perc után (C panel) a fényes gyűrű-szerű fluoreszcencia már nincs jelen, de nyilvánvalóan láthatóvá válik az intracelluláris fluoreszcencia. Az
intracelluláris festődés azt jelzi, hogy az L/1C2 antitestek internalizálódtak az L/1C2 antigénhez való kötődés eredményeképpen.
A 11. példában leírt vizsgálat eredményei azt jelzik, hogy
25 a I-vel jelzett L/1C2 antitest internalizálódott. A radioaktí van jelzett antitestek alkalmazását a 10. példa fluoreszcens technikájából származó internalizációs adatok bizonyítására úgy végezzük, hogy nem veszünk figyelembe semmiféle szerepet, amelyet a sejt-felület kötött L/1C2 antitestek kereszt-kötése a fluoreszceinnel jelzett második reagenssel (anti-egér immunglobulin) játszhat az internalizáció indukálásában. Ennek a vizsgálatnak az eredményeit a 4. táblázatban mutatjuk be. A 4. táblázat adatai világosan demonstrálják, hogy az L/1C2 internalizálódik az L/1C2 antigénhez való kötődésre.
4. TÁBLÁZAT
Az L/1C2 antitest internalizálásának értékelése ^2^I-L/1C2 antitestet alkalmazva
0°C
átlag +/átlag +/standard hiba standard hiba
56,770+/-3069
Nem-disszociáiható
56,746+/-1,734
11,398+/- 859
5,514+/-64 beütések^
125
A I-L/1C2 összes cpm-je az összes sejttel társult radioakti vitás mértéke, amely magában foglalja mind a sejtfelületi, mind az internalizált 2^I-L/1C2-t.
·· ·· · ···· ΛΛλλ • · · · · ·*** .::. ·::·:··· r
125
A nem-disszociálható beütések azoknak a I-L/1C2-knek a mértékét jelentik, amelyek internalizálódtak, ennek megfelelően nem kerülnek a kis pH-jú glicin puffer által előidézett disszociáció hatása alá, amelyről pedig jól ismert, hogy elroncsolja az antigén/antitest kötést.
A mechanizmus, amellyel az L/1C2 antitest gátolja a sejtnövekedést, meghatározatlan marad, de vélhető, hogy az L/1C2 antigén növekedési faktor receptor. Hasonló adatokról már számoltak be az internalizációval és sejtnövekedés-gátlással kapcsolatban, anti-epidermális növekedési faktor receptor (EGF) antitesteket alkalmazva ^Mosui és munkatársai: Cancer Rés. 46, 5592 (1986)], a versengő kötési tanulmányok és a sejtvonal-eloszlás elemzése azonban nem veszik figyelembe az L/1C2 antitest kötést az EGF receptorhoz .
Annak jelentőségét, hogy egy antitest internalizálva lesz egy tumor-sejt antigénhez való kötéskor, fel tudják becsülni azok, akik a szakterületen jártasak. Egy immunkonjugátum (antitest-citotoxikus gyógyszer) hatékonysága nagy részben függ ennek képességétől, hogy a citotoxikus szert toxikus formában adja le vagy a citotoxikus szert a tumor helyénél bocsássa ki, így lehetővé tegye a citotoxikus szer számára, hogy elpusztítsa a tumorsejteket. Egy antitest internalizálása a tumorsejtekhez való kötődéskor a citotoxikus szer intracelluláris szolgáltatását biztosítja. Egy citotoxikus szer intracelluláris szolgáltatása ennek megfelelően előnyös szolgáltatási rendszer egy citotoxikus szer számára.
Egy sor citotoxikus gyógyszert kapcsoltak már sikeresen an-
titestekhez. Blair és munkatársai |_J. Immunoi. Methods 59, 129 (1983)J és Ghase és munkatársai [Methods in Enzymolology 93., 280 (1983)] adnak áttekintést a citotoxikus gyógyszerek kapcsolásáról antitestekhez. A jelen találmány szerinti előnyös monoklonális antitest-citotoxikus gyógyszer konjugátumok (immunkonjugátumok) között találjuk azokat, amelyeket oxidált L/1C2 antitestek reagáltatásával alkottak meg a vinka alkaloidok hidrazin származékaival. Ezeket a lehetséges rákellenes immunkonjugátumokat lényegében a 247 792 számon közzétett európai szabadalmi közzétételi irattal összhangban készítik (közzétéve 1987. december 2án); ennek kitanítását referenciaként építjük be a jelen bejelentésbe. A 247,792 számú európai szabadalmi közzétételi irat kitanításai olyan immunkonjugátumok megalkotását ismertetik, amelyek nem tartalmazzák az L/1C2 antitestet. A jelen találmány 13· példája ismerteti vinka hidrazidok rögzítésének munkamenetét az L/1C2 antitesthez. Utalást tehetünk a 247,792 európai szabadalmi közzétételi iratra, amely vinka intermedierek alőállításával és a konjugációs eljárással kapcsolatban alapos tárgyalást ad, és tárgyal immunkonjugátum-készítményekről, de ezek mások, mint a jelen találmány előnyös terápiás kiviteli módjában alkalmazott L/1 C2-4-dezacetil-vinblasztin-3~karbohidrazid.
L/1C2-4-dezacetil-vinblasztin-3-karbohidrazidot(L/1 C2-DAVLBHYB)| vagy hígítóként használt PB8-t vezetünk be intravénásán meztelen egerekbe a 12. példában leírt egér xenográf modellben. Egereket kezelünk vagy L/1C2-DAVLBHYD-del, vagy DAVLBHYD-del, vagy PBS-sel a 11., 15., 17., 22., 25. és 29. napon a tumor-beültetés után, hogy kialakítsuk a 4. ábrában bemutatott adatokat.
• · · *··
A 4. ábra adatai bemutatják az L/1C2-nek azt a képességét, hogy megsokszorozza a DAVLBHYD gyógyászati hatását. Az L/102DAVLBHYD konjugátumokat alkalmazzuk azokban a kísérletekben, amelyekből a 4. ábra adatai származnak. Az L/1C2-DAVLB immunkonjugátumokat úgy határozzuk meg, hogy 5,7:1 (DAVLBHYD:L/102) átlagos konjugációs aránnyal bírjon. Az alábbiakban leírt adagok az egyes kezelések DAVLBHYD tartalmára utalnak. 1,0 mg/kg és 0,5 mg/kg közti DAVLBHYD adagok (A panel) tumor visszafejlődést idéznek elő, amikor a DAVLB-t L/102 DAVLBHYD immunkonjugátumként vezetjük be (A panel), míg a szabad DAVLBHYD (C panel) azonos adagolásnál csupán késlelteti a tumor növekedését, ahogy a terápia folyamatban van. Az L/1C2-DAVLBHYD immunkonjugátumnak az a képessége, hogy megsemmisíti a T222 karcinómát 1,0 mg/kg vinka-tartalomnál, nyilvánvaló a 4. ábra felső paneljában. A relatív hatékonyságok összehasonlítása feltárja, hogy az L/1C2-DAVLBHYD lényegesen jobb a szabad DAVLBHYD-nál mind az 1,0 mg/kg, mind a 0,5 mg/kg szinteknél a tanulmány során. A B panel olyan adatokat ad meg, amelyek azt mutatják, hogy a DAVLBHYD konjugálása egy antitesthez, amely nem kötődik a T222 sejtekhez, hatástalan a T222 sejtek növekedésének késleltetésében. Az L/1C2 antigén-reaktív immunkonjugátumok, mint pl. az L/1C 2-DAVLBHYDjhatékonyabbak a T222 tumorsejtvonal elfojtásában, mint a szabad gyógyszer azonos dózisszinten, vagy az olyan immunkonjugátumok, amelyek nem reagálnak az L/1C2 antigénnel. Az adatok, amint fentebb ismertettünk, bemutatják a terápiás szerepet az L/102 antigén-kötő immunkonjugátumoknál.
További tanulmányok ismertetik az L/102 antitestet hordozóként más citotoxikus vegyületek szállításához L/102 antigén pozitív tumorsejtekhez. Immunkonjugátumokat alkotunk meg, amelyekben
metotrexátot kapcsolunk össze az L/1C2 antitesttel mind a 13· példában tárgyalt hidrazid kötéssel, mind kapcsolók alkalmazásával, hogy hidrolizálható hidat képezzünk az L/1C2 antitest és a metotrexát között. A metotrexát származék-képzését metotrexát-/-hidraziddá a 14. példa A. fejezete tárgyalja. A metotrexát-y -hidrazidot az oxidált L/1C2 antitesthez konjugáljuk lényegében a 13· példában található kitanítással összhangban. A metotrexát- y-hidrazid helyettesítése a 13· példa 4-dezacetil-vinblasztin-3-karboxihidrazidja helyett az L/1C2-metotrexát immunkonjugátumot eredményezi, amely alkalmas gyógyászati felhasználásra. Ezeket az immunkonjugátumokat értékeljük in vivő tumorellenes aktivitásra a meztelen egér xenograft modellben, amelyet a 12. példában részletezünk. Ebben a tanulmányban egereket kezelünk vagy L/102 metotrexát- -hidraziddal , vagy metotrexáttal, vagy hígítóval a 3·,
6. és 9. napon a tumor-beültetés után. Az adatokat az alábbi 5. táblázatban tüntetjük fel és a tumor gátlás százalékában fejezzük ki a csak hígítóval kezelt állatokban látható növekedéshez viszonyítva .
5. TÁBLÁZAT
L/1C2-metotrexát-^-hidrazid in vitro aktivitása a szabad metotrexáttal összehasonlítva ·
Adagolás a metotrexát tartalomra alapozva L/1 C2-metotrexát-/-hidrazid 6 mg/kg mg/kg
1,5 mg/kg
Százalékos tumor gátlás • ·
Szabad metotrexát mg/kg mg/kg
1,5 mg/kg
Az 5. táblázat bemutatja a metotrexát megnövekedett hatékonyságát, amikor a metotrexát L/1C2 antigén-reaktív immunkonjugátumként irányul a tumor-helyre. Az 5,1:1 mól konjugációs arányt (metotrexát/L/1C2 antitest) az immunkonjugátumnál kettős hullámhoszszúságú UV elemzéssel határozzuk meg 280 és 370 nm-nél.
A további kísérletek bemutatják az L/1C2 antitest és antigénkötő fragmentumai alkalmazhatóságát citotoxikus ágensek szállítására, amikor kovalensen vannak rögzítve az L/1C2-höz vagy F(ab')g fragmentumaihoz hidrolizálható kapcsolók útján. A 14.-17. példák ismertetik az ilyen immunkonjugátumok előállítását és értékelését.
A fentebb ismertetett adatok bemutatják az L/1C2 antitest vagy antigén-kötő fragmentumai terápiás hasznosíthatóságát, amikor sokféle kapcsolási technikával citotoxikus gyógyszerekhez vannak kötve. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a kötés az L/1C2 antigénhez a jelen találmány szerinti antitestek általános jellemzője és az ATCC B9682 által termelt antitestektől eltérőftalálmányunk szerinti antitestek működőképesek abból a szempontból is,hogy a citotoxikus ágenseket az L/1C2 antigén pozitív tumorokhoz célozzák. Figyelembe kell venni a jelen találmány szerinti L/1C2 antigén-kötő antitestek affinitásaiban levő különbözőségeket, és általában minél nagyobb az antitest affinitása, annál hatékonyabb az antitest abból a szempontból, hogy becélozza a citotoxikus ágenseket a tumorokhoz in vivő. Az L/1C2 antigén reaktív antitesteket tartalmazó immunkonjugátumok közül a vinka alkaloidok származékait, a metotrexátot és az L/1C2 antitestet csak azért mutatjuk be példaszerűen, hogy elősegítsük a jelen találmány szerinti antitestek terápiás hasznosságának megértését. A jelen találmány szerinti antitestek terápiás alkalmazása nem korlátozódik kizárólag ezekre a citotoxikus ágensekre, amelyeket bemutatás céljára ismertetünk. A további citotoxikus ágensek között, amelyek felhasználhatók a jelen találmány szerint gyógyászati célra, találjuk pl. az adriamicint, ricint, ricin A láncot, diftéria toxint, Pseudomonas exotoxint, scirpenolt, diacetoxi-scirpenolt, alf a-amani'tint, mitomicin C-t, abrint, gelonint, alkörmös vírusellenes fehérjét, 5-fluoro-uracilt, és hasonlókat. Sokféle kapcsolási technológia áll rendelkezésre a citotoxikus ágensek rögzítésére a jelen találmány szerinti antitestekhez, ilyenek pl. azok, amelyek a 4,671,958 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban és a 243,929 számú európai szabadalmi közzétételi iratban vannak leírva; ezek az irodalmi helyek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe.
A jelen találmány szerinti L/1C2 antigén-kötő monoklonális antitestek alkalmazása az in vivő tumorok megjelenítésére szintén a jelen találmány keretébe tartozik. Az olyan elemek, mint az indium, ólom, rénium, technécium, jód, gallium, leutécium, asztatin, bizmut, bór, platina, ezüst, kobalt, yterbium, ruténium, higany, szkandium, bróm, foszfor és yttrium izotópjai lehetnek példák olyan izotópokra, amelyeket a jelen találmány szerinti antitestek radioaktív jelzésére alkalmazhatunk.
A radioizotópok, pl. azok, amelyeket felsoroltunk a tumor megjelenítésénél, alkalmazhatók terápiás felhasználásban is, amikor a jelen találmány szerinti L/1C2 antigén-kötő antitestekhez • · rögzítjük ezeket. Az L/1C2 antigén-kötő antitest-radioizotóp immunkon jugátumok alkalmazását is a jelen találmány keretébe tartozónak tekintjük.
KIVITELI PÉLDÁK
Az itt következő, nem korlátozó jellegű példákat azért írjuk le, hogy segítséget nyújtsunk a találmány megértéséhez.
1. PÉLDA
L/1C2 reaktív hibridóma sejtvonalak megalkotása
A. Immunizálás
A monoklonális antitestek előállításához a módszertant Kohler és Milstein vezették be ^Natúré 256, 495(1975)J, és most már megalapozott eljárás a szakterületen. Gaflre és Milstein már újabb összefoglaló munkája j^a Methods in Enzymology című kiadványban, 73· kötet; szerkesztők: Langone és Van Vunakis, 3-46. oldal, kiadó: Academic Press, New York (1981) összegzi az eredeti eljárás javításait, megadva a szükséges berendezések és reagensek részleteit, és részletesen ismertetve az egyes lépéseket a monoklonális antitestek előállítására. Egy immunogén kiválasztása csak az L/1C2 antigént tartalmazó sejtvonalakra, tumor mintákra vagy ezek komponenseire korlátozódik.
Az USCLS-1 pikkelyes sejt eredetű sejtvonalat, amelyet Fernstein és munkatársai írtak le [^Cancer Research 46, 2970-2977(1986)J, szaporítjuk szövettenyészetben és alkalmazzuk L/1C2 antigén forrásaként. Az USCLS-1 sejtvonal csak bemutatás céljára szolgál, és bármilyen sejtvonalat, amely az L/1C2 antigént fejezi ki (lásd az 1. táblázatot) alkalmazhatunk. Fiatal felnőtt BALB/C egerek θ
hetenként kapnak intraperitoneális injekcióban 5.10 USCLS-1 sejtet négy héten keresztül. A negyedik injekció után 21 nappal az • ·
- 24 θ egereket újból immunizáljuk 5·10 USCLS-1 sejttel. Az egereket csak bemutatás céljából alkalmazzuk; azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az immunsejtek forrásaként alkalmazott fajtákban nincs korlátozás. Más fajokról, beleértve embereket, patkányokat és hörcsögöket, is ismert, hogy alkalmasak erre a célra, és elméletileg más fajokat, pl. nyulakat, kecskéket, juhokat, sertéseket, csirkéket és majmokat is alkalmazhatunk. Az L/1C2 immunogén forrásként alkalmazott UöCLS-1 sejteket a szövettenyészet szubsztrátumból tripszin-EDTA kezelést £Grand Island Biological Company (GIBCO), 3175 Staley Road, Grand Island, New York 14072] alkalmazva nyerjük ki.
B. Splenociták előállítása
Öt nappal a végső immunizálás után az immunizált BALB/C egereket a méhnyaknál felmetsszük és etanollal öblítjük. A lépeket aszeptikusán kinyerjük és kis, steril tálkába helyezzük splenocita-készítéshez. A lépeket szétzúzzuk, a splenocitákat jéghideg, Dulbecco által módosított Eagle tápközegbe (DME; Gibco) bocsátjuk ki. A sejteket a csomókból pipettázással eloszlatjuk és centrifugacsőbe visszük át, és a csöveket öt percre jégre helyezzük. A leülepedett anyagot eldobjuk és a sejtszuszpenziót egy másik csőbe viszük át. A splenocitákat 200 g-nél 5-7 percen át végzett centrifugálással üledékbe visszük. Az így létrejövő sejtüledéket 5 ml jéghideg(0,17 mól/l-es NH^Cl-ben szuszpendáljuk és jégre helyezzük 10 percre, hogy megkönnyítsük az eritrociták szétesését. 5 ml jéghideg DME-t adunk hozzá és a keveréket ezután 200 g-nél centrifugáljuk 5-7 percen át. Az eritrocitáktól megszabadult splenocita üledéket a felülúszó leszívásával mossuk és újra szuszpendál juk 1 0 ji^l DME-ben.
C. Mielóma sejtek előállítása
A HL-1 Friendly-mielóma-653 sejteket (Ventrex Laboratories P.O.Box 9701, Portland, Maine 04013) választjuk ki fúziós partnerként való felhasználásra az U8CL8-1 reaktív splenocita készítményhez. Ezeket a sejteket a Ventrex-től szerezzük be és a szolgáltató útmutatásai szerint tartjuk fenn. A fúzió előtt két nap2 pal a mielóma sejteket 75 cm -es szövettenyésztő lombikokba viszszük át, hogy biztosítsuk azt a lóg fázisú növekedést, amely fontos a sikeres hibridóma-kialakításhoz.
Bár a sejtfúzióhoz a HL-1 Friendly-653 sejtek az előnyösek, a jelen találmány céljaira más hagyományos, egér-eredetű, jól ismert és bevezetett mielóma sejtvonalak is alkalmazhatók, pl. P3X63-Ag8-U1(P3U1); 8P2/0-Ag14(SP-2); P3-X63~Ag8-6.5.3(X63·6.5.3); P>3-X63-Ag8(X63) ; P3-NS-1 -Ag4(N8-1 ) , MPC11-45.6 TGI.7(MPC-11); és 8194/5XX0.BU1(8194) sejtvonalak £lásd Gaflre és Milstein a Methods in Enzymology 73B. kötetében; szerkesztők: Langone és Vu.nakis (1981)].
D. 8ejtfúzió
A splenocitákat és mielóma-sejteket 200 g-nél, 5 percen át 4°C hőmérsékleten végzett centrifugálással mossuk, ezután a felülúszót leszívjuk és a sejteket újra szuszpendáljuk DME-ben. 3 DME mosási lépés után a sejteket megszámoljuk és ezzel párhuzamosan az életképességet is értékeljük tripán kék kizárással. Ahogyan itt használjuk, a sejtszámok kizárólag életképes sejtekre vonatkoznak (vagyis azokra, amelyek tripán kékkel nem festődnek).
7
1,5.10 mielóma sejtet adunk 3,0.10 splenocitához egy 50 ml-es centrifuga csőben. A sejteket 200 g-nél centrifugáljuk 5 percen át 4°C hőmérsékleten, és a felülúszót olyan mértékben leszívjuk, amennyire csak lehetséges, a nélkül, hogy az üledékből sejteket
veszítenénk. A sejtüledéket azután gyengéd ütögetéssel fellazítjuk s csőről. 1,5 ml fúziós közeget (összetételét lásd a későbbiekben) adunk hozzá 37°C hőmérsékleten, a cső tartalmát gyengéden összekeverjük, majd a csövet keverés nélkül hagyjuk 30 másodpercig. Ezután cseppenként 37°C hőmérsékletre felmelegített DME-t adunk hozzá gyengéd keverés mellett, a térfogatot lassan 20 ml-re emelve. További 30 ml 37°C hőmérsékletű DME-t adunk hozzá. Óvato san kell dolgozni, miközben hígítjuk a keveréket, hogy elkerüljük a sejt aggregátumok összetörését. A fúziós terméket 200 g-nél centrifugáljuk 5 percen át és gyengéden újra szuszpendáljuk 60 ml HL-1 tenyésztő tápközegben (Ventrex), amely 20 %- borjúembrió szérumot (Gibco) és 1xHAT-ot is tartalmaz.
A HAT hipoxantin,aminopterin és timidin keveréke, ezt alkalmazzuk a splenocita/mielóma hibridek kiválasztására. A HAT és : PEG400 készítmény (fúziós tápközeg) készítését az alábbiakban is mertetjük .
HAT(100X)
Hipoxantin(1 000 /.mól/1)
Aminopterin(100 /mól/1) Timidin (300 /mól/1)
Mennyiség/25 ml mg mg
18,25 mg
Az elkészítéshez ezeket feloldjuk külön-külön 1-5 csepp 1 n
NaOH-ban, egymással összekeverjük, csövekbe öblítjük és 25 ml térfogatra töltjük fel DME-vel. A HAT-ot 1:100 arányban hígítjuk tápközegben felhasználáshoz. A HAT kereskedelmi forgalomban is kapható a Gibco-nál.
A fúziós tápközeget az alábbiak szerint készítjük. 20 g PEG
4000-t (J.T.Baker Chemical Co., 222 Red School Lane, Phillipsburg, ··· • · · · · • · · · · • · ····· · ·*·· ·· · *
-27autoklávozunk
New Yersey 08865)7^00 ml-es lombikban. Hozzáadunk 28 ml steril Dulbecco-féle PBS tápközeget (Gibco), amely 15 % DMSO-t is tartalmaz, összekeverjük, és 4°C hőmérsékleten tároljuk.
E. Tápláló (feeder) sejtek előállítása ml jéghideg DME-t injektálunk BALB/C egér peritoneális üregébe 18. kaliberű tűt alkalmazva. A peritoneális üreget felkavarjuk és a peritoneális mosófolyadékot eltávolítjuk. A peritoneális sejteket jéghideg centrifugacsőbe helyezzük és 250 g-nél centrifugáljuk 5 percen át. A felülúszó leszívatását követően a sejteket újra szuszpendáljuk 2 ml jéghideg HL-1 tápközegben (Ventrex), és jégre helyezzük.
F. A hibridómák szövettenyésztése
A tápláló (feeder) sejteket (peritoneális mosott sejtek) egyesítjük a sejtfúziós keverékkel és összekeverjük. Két csepp/ üreg sejtkeveréket adunk egy 96 üreges szövettenyésztő lemez üregeibe. Nedvesített, 37°C hőmérsékletű, 5 % CO2 atmoszférájú inkubátort alkalmazunk a sejt-fúziós termékek fenntartására. Az öszszes üreg térfogatát 200^1-re növeljük HL-1-el (Ventrex), amely 20 % borjúembrió szérumot (Gibco) és 1xHAT-ot is tartalmaz.
G. Antigén-fajlagos hibridómák kiválasztása
Amikor makroszkópikusan a kiónok nyilvánvalóan láthatóvá lesz nek a 96 üreges lemezeken, 50 ^Ml-es alikvotokat veszünk ki és értékelünk antigén-reaktivitásra. A felülúszók kötődését USCLS-1-. hez, amely L/1C2 pozitív célpont, és M21-hez, amely melanóma eredetű sejtvonal és L/1C2 negatív^radioimmunassay-val (RIA) határozzuk meg ^Morton és munkatársai: Surgery 64(1 ), 233-240 (1968)J, ezt az eljárást a későbbiekben részletezzük. Más L/1C2 pozitív vagy negatív célsejteket is alkalmazhatunk, amelyeket pl. az 1. táblázatban mutatunk be.
·· ·· · • · · · · • ♦· · · • · · ···· ··· · ·« · «··· ···· • · • · · ·
Az USCLS-1 és M21 sejtvonalakat a szövettenyészet szubsztrátumból CPEG-vel [l36 mmól/1 NaCl, 2,7 mmől/1 KC1, 8 mmól/1 Na^PO^,
1,5 mmól/1 KHgPO^, 0,5 mmól/1 EDTA, 5,6 mmól/1 glükóz (pH 7,3)J 15 percen át 37°C hőmérsékleten végzett kezeléssel kinyerjük és PBS-sel (GIBCO) mossuk. 1,5-10 sejtet diszpergálunk rugalmas 96 üreges lemez üregeibe, amelyek poli-L-lizinnel vannak burkolva az alábbiak szerint. 50/11 1 mg/ml-es (PBS-ben) poli-L-lizin hidrobromidot (Sigma Chemical Company, P.O.Box 14500, St.Louis, Missouri 63178) pipettázunk a lemez egyes üregeibe. A lemezeket azután legalább 45 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, de 4°C hőmérsékleten is tárolhatjuk. A sejtek hozzáadása előtt a lemezt kétszer öblítjük PBS-sel. A kötetlenül maradt sejteket PBS-sel lemossuk, a megmaradó sejteket 0,1 %-os (PBS-ben) glutáraldehiddel fixáljuk. A nem reagált glutáraldehidet 0,1 % glicinnel blokkoljuk, és a lemezeket mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal, amely 10 % borjúembrió szérumot és 0,05 % NaN^-at is tartalmaz, és ugyanebben tároljuk is. A foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat (PBS) 0,01 mól/l-es nátrium-foszfát, amely 0,15 mól/1 NaCl-t is tartalmaz.
A RIA vizsgálatot úgy végezzük, hogy a hibridóma felülúszókat inkubáljuk a vizsgáló sejtvonallal 1 órán át szobahőmérsékleten (mintegy 22°C). A meg nem kötött antitesteket erőteljes mo1 25 sással eltávolítjuk, és 100000 cpm I nyúl-anti egér IgG-t, amely a klóramin-T eljárással van jelezve £_ezt Herzenberg és Herzenberg írják le a Handbook of Experimental Immunology című szakkönyv-*ben, szerkesztő: Weir D.M., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)], adunk hozzá, majd inkubáljuk további 1 órán át szobahőmérsékleten. Az üregeket PBS-sel mossuk és az egyes üre« · · · · · · • ·· ·« · ··· • · · ···· · * «····· · · ··· t
- 29 gekben megmaradó radioaktivitás mennyiségét autoradiográfiával és gamma számlálóval meghatározzuk. Az autoradiográfiás elemzés abból áll, hogy a 96 üreges lemezt röntgenfilmre helyezzük és megjegyezzük azokat az üreg-számokat, amelyek megfelelő radioaktivitást tartalmaznak, hogy a filmet exponálják. Az exponálási idő az autoradigráfiánál 6 órától az egy éjszakán át tartó időtartamig változhat. Az USCLö-1-gyel reaktív, de az M21-gyel nem reaktív antitesteket termelő hibridómákat tekintjük érdekesnek és tovább elemezzük. Az ATCC B9862 L/1C2 hibridóma sejtvonal USCLS-1-gyel reaktív és M21-gyel nem reaktív. Az L/1C2-t kétszer szubklónozzuk Coulter auto-klónozó berendezést (Coulter Electronics, Hialek, Florida) alkalmazva a gyártó ajánlásai szerint, hogy biztosítsuk az L/1C2 hibridóma sejtvonal monoklonális voltát.
H. Az L/1C2 reaktív antitestek által felismert tumor-eredetű sejtvonalak meghatározása
Az L/1C2 olyan hibridóma, amely alkalmas a jelen találmány szerinti sejtvonalak szemléltetésére. Az ez által a hibridóma által termelt L/1C2 antitestet tumor sejtvonalak panelja elleni reaktivitással értékeljük. Az átvizsgáláshoz közvetett immunfluoreszcenciás vizsgálatot alkalmazunk. A vizsgálati keverék az alábbiakból áll: egy cél sejtvonal, amelyet az új, L/1C2 tumorral társült antigén jelenlétére értékelünk, hibridóma felülúszó (L/1C2reaktív antitestek forrása), egy szekunder antitest reagens, amely fluoreszceinnel van jelezve és egér immunglobulinokra fajlagos. Az erre a célra alkalmas szekunder antitest reagensek több gyártónál is rendelkezésre állnak, ezek pl.: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., P.O.Box 683, Avondale, Pennsylvania 19311; v
Miles Research Products. Miles Laboratories, Inc., 1121 Myrtle, • · · • ··· • ·
Βοχ 2000, Elkhart, Indiana 46515·
A cél sejtvonalat szövettenyészetben növesztjük olyan körülményeket alkalmazva, amelyek a szakterületen jól ismertek. A vizsgálat előtt a sejteket eltávolítjuk a szubsztrátumból tripszin/EDTA val (Gibco). 5.10° sejtet mosunk centrifugálással és DME-ben vég zett újra szuszpendálással, és reagáltatjuk hibridóma felülúszókkal 12x75 mm-es csövekben 1 órán át 4°C hőmérsékleten. A sejtet a nem reagált antitesttől mentessé tesszük centrifugálással egy borjúembrió szérum alárétegzés segítségével. A célsejteket újra szuszpendáljuk egy kecske-F(ab'^-anti egér (IgG + IgM) FITC (fluo reszcein izotiocianát konjugátumból amely a Tago Laboratories- tői (Burlingame, Kalifornia 94010) szerezhető bej álló szekunder reagensben, és ezt alkalmazzuk 1:50 végső hígításban. A vizsgá lati anyagot 4°C hőmérsékleten tartjuk 1 órán át. A célsejteket a nem kötött szekunder reagenstől centrifugálással különítjük el egy borjúembrió szérum elárétegzésen keresztül. A szérumot leszívjuk, és a sejteket Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatot (HBSS, G-ibco) alkalmazva mossuk. A sejteket ismét mossuk HBSS-ben, újra szuszpendáljuk szövettenyésztő tápközegben, és 4°C hőmérsékleten tartjuk az UV fluoreszcens mikroszkópiával való vizsgálathoz. A sejtekből alikvotokat festünk számláláshoz propidium-jodiddal (10^/tg/ml HBSS-ben), hogy igazoljuk, hogy az antitest-festett sejtek élő sejtek (a propidium—jodid szelektíven festi az elpusztult sejteket). Az élő sejteket, amelyek klasszikus felületi gyűrűszerű fluoreszcenciát mutatnak, pozitívnak tekintjük L/1C2 antigénre .
Egy másik módszer szerint a mintákat fluoreszcenciára értékeljük Epics-Coulter Mark IV sejt-elemzővel (Coulter Electronics), ·· ·· · ···· ···· • · · · · · · • ···· · ··· • ······· · ···« ·· ♦ · ···
- 31 » olyan módszertant alkalmazva, amely a szakterületen jól ismert. Egy másik átvizsgálási stratégiát tumor-reaktív kiónokhoz Galfre és Milstein kitanításai részleteznek £ a Methods in Enzymology című műben, 73. kötet, szerkesztők: Lang.one és Van Vunakis, 3-46 oldal; Academic Press, New York (1981)^.
I. Humán patológiás minták értékelése a jelen találmány szerinti antitesteket alkalmazva
A szöveti- és tumor antitest eloszlást immun-peroxidázos munkamenetet alkalmazva értékeljük, az avidin-biotin technika egy módosítását alkalmazva. Humán szövetek fagyasztott részeit 4-6 /(_mre hasítjuk zselatinnal borított fedőlemezekre, levegőn szárítjuk és acetonban fixáljuk 5 percen át. Az elő-inkubálást követően 5 %os lószérumban, a részeket (metszeteket) egymás után inkubáljuk L/1C2 antitesttel, majd biotinilezett ló-anti-egér Ig-vel (Vectorlabs, Burlingame, Kalifornia), és avidinnak és torma-peroxidáznak a komplexével, az egyes lépések között olyan foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (pH 7,2-7,4) mosva, amely 1 % szarvasmarha szérum albumint is tartalmaz. Az összes komponens optimális hígításait tapasztalati úton határozzuk meg a Checkerboard titrálással, amely a szakterületen közönséges eljárás. A szint 3,3'-diamino-benzidint alkalmazva fejlesztjük ki, és a metszeteket ellen-festjük hematoxilinnel. Ennek eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze.
J. L/1C2 antitest tisztítás mikronos szűrést követően (Millipore) az antitestet affinitással tisztítjuk aszcitesz folyadékból A fehérje Sepharose oszlopon (Pharmacia Fine Chemicals, Divisiőn of Pharmacia Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Yersey 08854). A mosó *« · • · · · · · · • ·« · · · ··· • ······· · • ·· · ·· · · ···
- 32 puffer 0,01 mól/literes Na-foszfát (pH 8,0), és az eluálást lépcsőzetes gradienst alkalmazva hajtjuk végre 0,1 mól/1 foszfát-pufferral (pH 3,5). Az eluált frakciókat azonnal semlegesítjük 1 mól/1 trizma pufferral (öigma) (pH 7,4) és dializáljuk olyan 0,01 mól/1 Na-foszfáttal (pH 7,4) szemben, amely 0,15 mól/1 NaCl-t is tartalmaz (PBS). Az antitest készítményeket szűréssel sterilizáljuk 0,22 mikronos szűrőn át (Millipore Corporation, Ashley Road, Bedford, Massachussets 01730) és 4°C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig .
K. Az L/1C2 antitest előállítása
Az L/1C2 hibridóma jól nő aszciteszként pristannal előgerjesztett BALB/C egerekben, 5-6 mg antitestet termelve. Az L/1C2 tisztítása A fehérje kromatográfiát alkalmazva 70-90 % közti tartományban levő kitermelést ad, és 90 %-nál nagyobb tisztaságot eredményez, amint ezt SDS-PAGE-val elemezzük Laemmli és munkatársai kitanítása szerint ^Natúré (London) 227, 680 (1970)J, és Ooomassie kék festéssel elemezzük (1A . ábra). A tisztított L/1C2 antitest kiváló oldhatóságot mutat PBS-ben, amelyben 10 mg/l-nél nagyobb koncentrációkat lehet elérni a kicsapódással járó veszteségek nélkül.
Az L/1C2 antigén jellemzése
Az L/1C2 antitest által immun-kicsapott antigén jellemzőit radioaktívan jelzett 5637. sejteket (ATCC HTB9) alkalmazva határozzuk meg. Az 5637. sejtvonal megfelelően illusztrálja az L/1C2 antigén pozitív karcinómákat, de az 1. táblázatban felsorolt L/1C2 pozitív sejtvonalak bármelyike alkalmas lehet. A sejteket szövettenyészetben növesztjük 50-73 %-os összefolyásig, és a rögzített sejteket kétszer mossuk steril, foszfáttal pufférőit fizi« ·♦ · · • · ·····* ······ · ·
- 33 ου olőgiás sóoldatban (PBS; pH 7,4; Gibco). 1 mCi J -glükózamint (New England Nuclear, 549 Albany Street, Boston, Massachussets 02118, 617-482-9595) hígítunk tenyésztő tápközegben és hozzáadjuk a lombikhoz, 24 órával később a metabolikusan jelzett sejteket kétszer mossuk hideg PBS-sel és 20 percen át extraháljuk jégen PBS-sel, amely 0,02 % nátrium-azidot, 2 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot, 1 % Nonidet Ρ-40-et (Sigma) és 0,1 % lauril-szulfátot is tartalmazt15000 g-nél 15 percen át, majd 100000 g-nél 1 órán át végzett centrifugálást követően (mindkettőt 4°C hőmérsékleten) a radioaktívan jelzett felülúszó extraktumokat felhasználásig fagyasztva tároljuk. Felhasználás előtt az extraktumokat A fehérje Sepharose-val (Protein A Sepharose, Sigma) inkubáljuk, hogy eltávolítsuk a nem-fajlagos kötőanyagokat. Közvetett immun-kicsapást hajtunk végre 50/\g-ig L/1C2 antitestet adva 1.10' cpm sejtextraktumhoz, és a keveréket 4°C hőmérsékleten négy órán át inkubálva 100/ig 20 %-os mosott A fehérje Sepharose-t (Sigma) £lP pufferban (PBS + 1 % BSA +0,1 % Nénidet P-40)] adunk azután a csőbe, amelyet azután gyengéden rázatunk további négy órán át. A komplexbe vitt antigént, antitestet és A fehérje Sepharose-t kétszer IP pufferral végzett centrifugálással, majd kétszer csak PBS-sel végzett centrifugálással mossuk. Az utolsó mosás után az üledéket SDS-PAGE-val elemezzük.
Az immun-kicsapott antigén molekulatömegmeghatározásához a referencia-fehérjék az alábbiak: lizozim (14 400), szója tripszin inhibitor (21 500), szénsavanhidridáz (31 000), ovalbumin (45 000), szarvasmarha szérum albumin (66 200), foszforiláz B (92 500), béta-galaktozidáz (116 250) és miozin (200 000). Az alkalmazott molekulatömeg-markereket készlet formában kapjuk a Bio-Rad Labora• · · · · · · • ·· « · · · · · • 9 9 99·· « « ······ · · ···
- 34 tories-től (2200 Wright Avenue, Richmond, Kalifornia 94804).
Az elkülönült mintákat tartalmazó lap-géleket Coomassie kékkel festjük, hogy láthatóvá tegyük a molekulatömeg-markereket, majd a géleket autoradiográfiának vetjük alá, hogy láthatóvá tegyük a jelzett antigént (1 . ábra, B. fejezet).
3. PÉLDA
L/1C2 antitestek előállítása
Fagyasztott L/1C2 antitestek ampulláit az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland) szerezhetjük be ATCC B9682 számon. Az élő sejteket az ampulla tartalmának felengedtetésével kapjuk meg, 37°C hőmérsékletű vízfürdőben, miközben az ampullát sodorgatjuk, hogy megkönnyítsük a gyors és egyenletes felengedtetést. A sejtszuszpenziót 1:2 arányban felhígítjuk kiegyensúlyozott sóoldattal £Balanced Salt öolution (BSS-Gibco)J és 200 g-nél centrifugáljuk egy szérum alárétegzésen keresztül, hogy a sejteket megszabadítsuk a kriogén közegtől. A sejtüledék fölötti anyag leszivatását követően a sejteket kinyerjük, hígítjuk szérummal és antibiotikumokkal kiegészített szövettenyésztő tápközeggel, amint ez a szakterületen ismert, és sejttenyészetet hozunk létre standard körülmények között (37°C, 5 % COg). A sejt
5 tenyésztése során ajánlatos a sejtkoncentrációt 1.10 - 7.10 sejt/ml között tartani, bár a tenyészet mérsékelt változtatásokat jól tűr.
L/1C2 antitesteket//tg/ml mennyiségekben nyerhetünk ki szövettenyészetekből. Egy másik módszer szerint antitest-termelést hatékonyabban végezhetünk az L/1C2-t aszcitesz tumorként kialakítva rágcsáló-fajokon. Az antitest termelést és a kinyerési eljárásokat részletesen ismerteti Gaflre és Milstein kiváló össze«* * • ·· · · · ·· • ······» « ··· · ·· · · ··· Λ
- 35 foglalása £Methods in Enzymology. 73B. kötet, szerkesztők: Langone és Van Vunakis, 43-45 oldal (Academic Press, New York, 1981)”].
4. PÉLDA
Az antitest kötés meghatározása a jelen találmány szerinti antigénekhez
Annak meghatározását, vajon az L/102 antigén pozitív célpontokkal reagáló monoklonális antitestek kötődnek-e az L/102 antigénhez, vagy versengő kötési kísérletekkel, vagy immun-kicsapásos elemzéssel végezzük. A versengő kötési kísérletek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A kísérletnek ebben a típusában egy ismeretlen antigén-fajlagosságú antitestet olyan vizsgálatba visszük, ahol L/102 antitest jelzett formáját mutatjuk ki. Az L/1C2 antitest kötés gátlása azt jelzi, hogy a szóban forgó antitest kötődik az L/102 antigénhez.
A. Versengő vizsgáltok
Egy versengő radioimmunassay vizsgálatban (RIA) L/102 antitesteket állítunk elő és izolálunk A fehérje kromatográfiát alkalmazva, amint ezt az 1. példában részleteztük, és radioaktívan jelezzük I-t alkalmazva Tsu és Herzenberg kitanítását alkalmazva £Selected Methods in Cellular Immunology, szerkesztők: Mishell és Shiigi, 373-380 oldal (W.H. Freeman and Company kiadása, San Francisco)^. Az 1. táblázatban felsorolt, L/1C2 antigént kifejező sejtvonalak bármelyike alkalmas célsejt a versengő RIA vizsgálathoz. Az L/102 antigént szolgáltató sejtvonalat szövettenyészetben növesztjük, amíg a kívánt sejtszámot elérjük. A sejteket a sejt-szubsztrátumból CPEG kezeléssel felszabadítjuk, majd
R mossuk PBS-sel. 1,5.10 sejtet diszpergálunk rugalmas 96 üreges lemezek üregeibe, amelyeket előzőleg poli-L-lizinnel (Sigma) • ·
burkoltunk be. A rögzítetlenül maradt sejteket PBS-sel kimossuk; a megmaradó sejteket 0,1 %-os glutáraldehiddel fixáljuk (2 csepp/ üreg, 5 percig, szobahőmérsékleten). Az el nem reagált glutáraldehidet 0,1 % glicinnel blokkoljuk, és a lemezeket PBS-sel (amely és ugyanebben tároljuk.
A célsejt-lemezek előállításához való kitanításokat Starling és munkatársai írják le Starling és munkatársai: Cancer Research 46(1), 367-374 (1986); Starling és munkatársai: Journal of Supramolecular Structure 11(4), 563-577 (1979)], ezek az irodalmi
125 helyek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe ..A IL/1C2 antitest optimális hígításait empirikusan határozzuk meg, és a vizsgálat alkalmazásra kész versengő rendszerként a hibridóma felülúszó hozzáadására.
125
A versengő vizsgálatra, I-L/1C2-t és hibridóma vizsgáló mintákat alkalmzva, másik eljárást találhatunk Tsu és Herzenberg kitanításaiban £Selected Methods in Cellular Immunology, szerkesztők: Mishell és Shiigi, 390-394 oldal (W.H. Freeman and Company, San Francisco)].
B. Antigén-fajlagos immunkicsapásos elemzés
Radioaktívan jelzett celluláris komponensek immun-kicsapását is alkalmazhatjuk annak megállapítására, vajon egy antitest reagál-e a jelen találmány szerinti L/1C2 antigénnel. A 2. példa kitanítását képező eljárást alkalmazzuk a jelen találmány antitestjei által kötött antigén jellemzésére. A vándorlási minták öszszehasonlítása, amelyeket akkor kapunk, amikor immunkicsapást végzünk L/1C2 antitesttel vagy más antitesttel, feltárja, ha két különböző antitestnek antigén-azonossága van. A versengő kötési ·· ·· · ···· ···· • · · · · · · • ·· · · · ··· • ······· · ···· ·· · · ···
- 37 kísérletek és az immun-kicsapási tanulmányok kombinálása egy másik eszközt nyújt annak megállapítására, vajon az antitestek reagálnak-e a jelen találmány szerinti antitestekkel.
5. PÉLDA
Az L/1C2 antigénnel reaktív poliklonális antitestek előállítása
A hagyományos antiszérumok előállítása mind oldható, mind részecske (celluláris) antigénekre jól ismert a szakterületen. A poliklonális antitest előállítása egy idegen anyag injektálását követi egy immunológiailag kompetens gerinces fajba. Ideálisan az antiszérum-termelőként szolgáló állatokat ismételten kihívásnak vetjük alá, amíg az optimális humorális válaszkészséget el nem érjük, amelyet próba-vérvételekkel mérhetünk. Bármiféle L/1C2 antigén pozitív anyag megfelel immunológiai célokra. Az így létrejött antiszérumok reaktivitását az L/1C2 antigén irányában úgy határozhatjuk meg, amint ezt a 4. példa kitanítása tartalmazza.
6. PÉLDA
Karcinómák kimutatása és diagnózisa
Az L/1C2 monoklonális antitestet, amely a jelen találmány szerinti antitestek jó példája, alkalmazzuk diagnosztikus eszközként a Borowitz és munkatársai által leírt ^American Journal of Clinical Pathology 79(3), 387-391 (1983)] avidin-biotin immunperoxidázos technika módosított változatát alkalmazva.
Szövetek fagyasztott részeiből 4-6jA,m-es metszeteket hasítunk zselatinnal fedett fedőlemezekre, és acetonnal fixáljuk 5 percen át. Az 5 % lószérummal végzett előinkubálás után a metszeteket egymás után inkubáljuk L/1C2 antitesttel, ezt követően biotinilezett ló-anti-egér Ig-vel (Vectorlabs ), majd avidin és torma-peroxidáz komplexével, az egyes lépések között mosást vé·· ·· · ···· ···« • · · · · · · • ·· · 9 9 ··· • · · ···· · · ···· «« · · ··· gezve olyan foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS; pH 7,2-7,4), amely 1 % szarvasmarha szérum albumint is tartalmaz. Színt fejlesztünk ki 3,3'-diamino-benzidint alkalmazva, és a metszeteket ellen-festjük hematoxilinnel.
7. PÉLDA
Kimutató (detektor) csoportok konjugálása a jelen találmány szerinti antitestekhez
A 6. példa kitanítása szerinti eljárást módosítjuk úgy, hogy eltüntessük az igényt a második antitestre (biotinilezett ló-anti-egér lg), közvetlenül biotinilezve az L/1C2 antitestet. Az L/1C2 antitestet A fehérje kromatográfiát alkalmazva tisztítjuk, sómentesítjük 0,1 mól/l-es NaHCO^-ba, pH-ját 8,5-8,6-ra állítjuk be 0,1 mól/literes NaHCO^-mal, dialízissel vagy Sephadex G25 oszloppal (Sigma). A G25 kész oszlopai kereskedelmi forgalomban kaphatók a Pharmacia Chemical Co.-nél PD10 oszlop néven. Az L/1C2 antitesteket 1 mg/ml koncentrációra állítjuk be 0,1 mól/1 NaHCO^-mal (pH 8,5-8,6). N-hidroxi-szukcinimid-biotint (Pierce Chemical Co., P.O.Box 117, Rockford, Illinois 61105) gyorsan feloldunk DMSO-ban 1 mg/ml koncentrációban, és 120/tl/m£ L/1C2 antitestet adunk hozzá, és azonnal összekeverjük. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten állni hagyjuk 4 órán át. A konjugált antitestet elválasztjuk az el nem reagált N-hidroxi-szukcinimido-biotintól vagy dialízissel, vagy Sephadex 025 oszlopon való áteresztéssel. A kimutatást megkönnyítjük a biotinilezett L/1C2 antitest reakciójával fluoreszcens részét radioaktív anyagfajták vagy enzimek avidin-konjugátumaival. Az avidin-biotin rendszerek alkalmazása a kimutatáshoz a szakterületen széles körben elterjedt, és a fentebb említett avidin-konjugátumok kereskedelmi forgalomban • · · · » • ·· · · • · · ···· ···· ·· « ···· ···· • · • ··· • · is kaphatók több szállítónál.
A fluoreszcens jelzések rögzítését közvetlenül a jelen találmány szerinti antitestekhez pl. azokkal az eljárásokkal hajthatjuk végre, amelyek az alábbi irodalmi helyen le vannak írva: Selected Methods in Cellular Immunology szerkesztők: Mishell és Shiogi, kiadó: Freeman and Company, San Francisco, 292-302 oldal (1980) ; ez az irodalmi hely referenciaként van beépítve a jelen be jelentésbe.
8. PÉLDA
Izotípus meghatározás
Az L/1C2 hibridóma (ATCC B9862) által termelt L/1C2 antitest izotípusát IgG -nak határozzuk meg. Ehhez a meghatározáshoz a HyClone Laboratoriestől beszerzett rágcsáló monoklonális al-izotipizálási készletet és a gyártó által megadott útmutatásokat alkalmazzuk .
9. PÉLDA
In vitro tumor sejtnövekedés gátlás
1.10 célsejtet osztunk el egy 96 üreges szövettenyésztő lemez (Costar) üregeibe és inkubáljuk leucin-hiányos tápközegben (leucin-mentes DME + 13y<g/nil L-leucin, 29,2 ^g/ml L-glutamin, 50jvvg/ml gentamicin és 10 % dializált borjuembrió szérum) 16 órán át 37°C hőmérsékleten nedvesített inkubátorban, amely 5 % COg-t tartalmaz. Az összes szövettenyésztő reagenst a Gibco Laboratories-től szerezzük be. A tápközegeket azután aszeptikusán eltávolítjuk és antitest-hígításokat adunk hozzá 200(/41 leucin-hiányos tápközegben. A lemezeket 48 órán át inkubáljuk, ekkor a tápközeget eltávolítjuk és helyettesítjük leucin-hiányos tápközeggel (Gibco), amely úgy van kiegészítve, hogy 4^<Ci J -leucin • · (NEN) koncentrációt érjünk el üregenként. A lemezeket 24 órára visszatesszük az inkubátorba. A makromolekulákba beépült radioaktivitást automatizált sejtkinyerő berendezést és folyadékszcintillációs technikát alkalmazva határozzuk meg.
10. PÉLDA
Az L/1C2 internalizálása T222 tumorsejtekbe, UV mikroszkópiával értékelve
T222 sejteket nyerünk ki szövettenyésztő lombikokból tripszin/EDTA (Gibco) kezeléssel, amíg a sejtekről megfigyeljük, hogy leválnak a lombikról. A sejteket kétszer mossuk Hank féle kiegyensúlyozott sóoldattal [ Hanks Balanced Balt Solution (HBSS, Gibco)]. 1.10° sejtet átviszünk 12 x 75 mm-es csövekbe, centrifugálással üledékbe visszük, és a HBSS-t leszívjuk. 50^1 L/1C2-t (5/fg/ml) adunk csövenként és jégen inkubálunk 30 percen át. Az inkubálást követően a sejteket kétszer mossuk HBSS-sel, hogy eltávolítsunk minden L/1C2-t, majd az utolsó mosás után a HBSS-t leszívjuk. 50 ^4.1, f luoreszceinnel kötött kecske F(ab' )p-anti-egér IgG-t (Tago) adunk hozzá, a keveréket összekeverjük és jégre helyezzük 30 perces inkubáció-időtartamra. A sejteket azután kétszer mossuk HBSS-sel, hogy eltávolítsunk minden el nem reagált, fluoreszceinnel kötött kecske F(ab')2 anti-egér IgG-t, és ezt tekintjük a vizsgálat zéró időpontjának ebben a vizsgálatban.
. PÉLDA
Az L/1C2 internalizálása T222 tumorsejtekbe ^^I-L/1C2 endocitózissal értékelve
Tisztított L/1C2-t jelzünk ^^I-vel, lodobeads-ot (Pierce alkalmazva
Chemical Co., Rockford, Illinois)Va gyártó útmutatásai szerint.
125
A I-L/1C2 internalizációját értékeljük, miközben a sejtüledék• ···· ·
- 41 125 r ben levő cpm-et tekintjük internalizált I-L/1C2-nek| Malzku és munkatársai: Cancer Research 43, 3848 (1986)j. Röviden, 1.1Οθ célsejtet reagáltatunk 200000 cpm jelzett antitesttel 90 percig 0° vagy 37°C hőmérsékleten, négyszer mossuk, és szuszpendáljuk 0,5 ml glicin pufferban £ 0,05 mól/1 glicin.HCl (pH 2,8) és 0,1 mól/1 NaCl] hogy disszociáljuk a sejtfelületi kötött immunglobulint. Centrifugálást követően a felülúszóban vagy a sejtüledékben levő radioaktivitást meghatározzuk. A radioaktivitási számo1 25 kát a felülúszóban tekintjük a sejtfelületi kötött I-L/1C2nek.
12. PÉLDA
Meztelen egér xenograft átvizsgálás tumorellenes aktivitás értékeléséhez
Vérfrissített meztelen egereket szerzünk be a Charles River Breeding Laboratories-től (Boston, Massachussets), amelyek steril lamináris levegőáramlási rendszerű berendezésekben vannak tartva és steril vízzel, valamint steril élelmiszerekkel vannak itatva illetve etetve ad libitum. Mintegy 2 hónapos egereket szubkután inokulálunk a jobb lágyékba 1.10 tumorsejttel 0,2 ml PBS-ben. A vegyületeket, amelyeket tumorellenes hatékonyságra értékelünk, steril PBS-ben intravénás beadáshoz előkészítjük, és óvatosan adjuk be az állatoknak, hogy elkerüljük a vizsgálati állatok sérülését az injekció helyén.
A kezelés hatékonyságát a tumor méretének megfigyelésével határozzuk meg. A tumor méreteit később két dimenzióban vesszük fel, és a tömeget a ^(hosszúság)(szélesség^)/2J képlet alapján számítjuk ki. A tumor növekedésének gátlását a kontroll állatokban, amelyek csak PBS-t kapnak, levő tumorok növekedéséhez viszo • · · • · ·
- 42 nyitjuk. 10 egérből álló csoportokat alkalmazunk minden kezeléshez és kontroll csoporthoz. Bár a meztelen egerek az előnyös rágcsálók ehhez a vizsgálathoz, különböző vizsgálatok jól mutatják más rágcsálók immun-visszaszorítását is vagy besugárzással, vagy immunszupresszánsokkal, hogy blokkolják a gazda-állat immunológiai válaszkészségét. A T222 sejtek különösen előnyös humán tumor sejtvonalak a meztelen egér xenograft modellhez, de minden humán tumor sejtvonal, amely L/102 antigént fejez ki és reprodukálhatóan alkot tumorokat meztelen egerekben, szintén előnyös lehet.
13. PÉLDA
L/1C2-4-dezacetil-vinblasztin-3-karboxi-hidrazid előállítása
A. Az L/1C2 antitestek oxidálása
L/1C2 antitestet kimerítően dializálunk 0,1 mól/1 Na-acetát pufferban (pH 5,6; acetát puffer), majd 10 mg/l-re hígítjuk (össztérfogat 15,7 ml), és hagyjuk kiegyensúlyozódni mintegy 0°C hőmérsékleten jeges vízfürdőben. 535 mg Na-perjodátot (méta) adunk hozzá szilárd anyag formájában és a reakciókeveréket gyengéden kevertetjük, amíg a Na-perjodát oldatba megy. Az élénk kevertetést elkerüljük, mivel ez károsítaná az antitestet. A reakciókeveréket mintegy 21 percen át kevertetjük jégfürdőben, miközben alumíniumfóliával befedjük, hogy megakadályozzuk a fény bejutását a keverékhez. A 21 perces inkubálást követően 1/41 12,5 mól/l-es etilénglikolt (vízben) adunk hozzá, hogy az oxidációt befejezzük. Az összeállt anyagot eltávolítjuk a reakciókeverékből centrifugálással és a tiszta oldatot Sephadex G25 gélszűrő oszlopon (44 g Sephadex G25; 2,5 x 50 cm-es oszlop), amelyet előzőleg acetát pufferral kiegyensúlyoztunk, kromatografáljuk .Az oszlopról az első csúcsot összegyűjtjük és 2,77 mg/ml-re hígítjuk acetát puf e · · · ·
- 43 ferral. A fehérjekoncentrációt 280 nm-nél mért ultraibolya abszorbanciával határozzuk meg, 1,43 extinkciós együtthatót becsülve 1 mg/ml-es antitest oldathoz.
B. Az oxidált L/1C2 antitest konjugálása 4-dezacetil-vinblasztin3~karboxi-hidrazid-szulfáthoz
A fenti A. lépésből származó oxidált L/1C2-höz (2,77 mg/ml acetát pufferban, 55 ml teljes térfogatban) keverés közben 0-2°C hőmérsékleten 238 mg 4-dezacetil-vinblasztin-3-karboxi-hidrazidszulfátot adunk (amelyet úgy készítünk, ahogyan ezt a 247,792 számú európai szabadalmi leírás ismerteti). Amikor a 4-dezacetilvinblasztin-3-karboxi-hidrazid szulfát feloldódik, a keveréket fóliával beborítjuk, hogy a fénytől védjük, és hideg szobába (4°C) visszük át, ahol ezt 16 órán át kevertetjük. A reakciókeveréket azután centrifugálással derítjük és Sephadex G25 szűrőoszlopon kromatografáljuk (67 g Sephadex G—25; 2,5 x 75 cm-es oszlop, előzőleg PBS-sel kiegyensúlyozva). Frakciókat gyűjtünk és az első csúcsot egyesítjük és fehérjére, valamint gyógyszer-koncentrációra értékeljük UV spektroszkópiával 280 nm-nél és 270 nm-nél. Az immunkonjugátumokat 4°C hőmérsékleten tároljuk 0,2 /< -os szűrővel (Millipore) végzett sterilezés után.
14. PÉLDA
L-1C2-propionil-3-amino-karbonil-4-benzaldehid-metotrexát-hidrazid előállítása
A. Metotrexát-y-hidrazid előállítása
100 ml-es lombikhoz 1,61 g (10 mmól) L-glutaminsav-5-metilésztert adunk. Ehhez 60 ml t-butil-acetátot adunk és a keveréket addig kevertetjük, amíg a komponensek össze nem keverednek. Ehhez azután cseppenként 1,58 g (11 mól) 70 %-os perklórsavat adunk * · · · · · · • ·· · ♦ ···· * · *·«··· · ···· ·· · · ···
- 44 folyt onos keverés mellett. A keveréket hagyjuk kevertetni nitrogén alatt két napon át, majd ezt extraháljuk 100 ml 0,5 n sósavoldattal három részletben. A vizes rétegeket egyesítjük és semlegesítjük 30 g nátrium-bikarbonáttal. A semleges oldatot három részletben extraháljuk dietil-éterrel, összesen 150 ml-lel, és a szerves rétegeket egyesítjük és konyhasó oldattal mossuk. A mosott szerves oldatot azután nátrium-szulfáttal víztelenítjük és szobahőmérsékleten vákuumban bepároljuk, így kapunk 1,18 g (5,4 mmól) tiszta, olajos oldatot, amelyet L-glutaminsav 5-metil-1-t-butildiészternek azonosítunk.
Egy kemencében szárított 100 ml-es lombikhoz hozzáadunk 0,92 ml (6,6 mmól) trietil-amint, 1 ml (6,6 mmól) dietil-cianofoszfátot és 49 ml dimetil-formamidot, amelyet frissen desztilláltunk vákuumban bárium-oxidról. A kevertetett oldathoz 506 mg (1,3 mmól)
2,4-diamino-6-^N-metil-N-(4-karboxi-fenil)-aminoJ-pteridin-trihid rátot adunk. Amikor a köztes termék feloldódik a keverés révén, a keveréket 80°C hőmérsékletre melegítjük, majd 0,20 ml (1,4 mmól) trietil-amint és 342 mg, fentiek szerint készített L-glutaminsav-diésztert adunk hozzá 1 ml dimetil-formamidban. A keveréket azután két órán át 80°C hőmérsékleten kevertetjük, majd lehűtjük és az oldószert vákuum alatt eltávolítjuk. A maradékot felvesszük 300 ml kloroformban, majd 5 %-os nátrium-bikarbonát oldatban mossuk. A vizes réteget kloroformmal extraháljuk és a szerves rétegeket egyesítjük, nátrium-szulfáttal víztelenítjük, és koncentráljuk vákuum alatt, így 1,35 g narancsszínű olajat kapunk, amelyet 150 g szilikagélen kromatografálunk, kloroformban levő 10 % metanollal eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és koncentráljuk, hogy 645 mg metotrexát-diész • ·
- 45 tért kapjunk, ahol a ^-karboxicsoport metilészter formában van, és az c(-karboxicsoport t-butilészter formában van.
A fenti köztes terméket egyesítjük ugyanennek az anyagnak egy másik tételével, hogy összesen 697 mg-ot (1,3 mmól) tegyen ki, és feloldjuk 12 ml metanolban. Ehhez 170 mg (5,3 mmól) vízmentes hidrazint adunk és a keveréket szobahőmérsékleten kevertetjük nitrogén alatt hat napon át. Ezután az oldószert vákuum alatt eltávolítjuk és a maradékot 150 g szilikagélen kromatografáljuk, kloroformban levő 15 % metanollal eluálva, hogy 470 mg (0,9 mmól) metotrexát-ol-t-butilészter-^-hidrazidot kapjunk.
A fenti köztes terméket feloldjuk 120 ml 1 n sósavoldatban, és 55°C hőmérsékleten melegítjük 50 percen át. Ezután ezt koncentráljuk vákuum alatt szilárd halmazállapotig, és a maradékot felvesszük 80 ml 0,01 mól/l-es ammónium-acetátban (pH 8). Az oldatot három napon át 4°C hőmérsékleten tartjuk, majd 300 ml Sephadex Fást Flow Q-n (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey) kromatografáljuk, gradiens-eluciót alkalmazva a közvetlen az előzőekben alkalmazott puffer (A puffer) és 1,0 mól/1 ammóniumacetát (pH 8) (B puffer) között. A terméket tartalmazó frakciókat, amelyek 100 % B” puffernál eluálódnak, egyesítjük, és ismételten liofilezzük, hogy eltávolítsuk az ammónium-acetát nyomait. A kitermelés 326 mg (0,7 mmól) metotrexát-^-hidrazid.
B. A kapcsoló 3-(4-formil-fenil-karbonil-amino)-propionsav, Nszukcinimido-észter előállítása
Egy 250 ml-es lombikba 3 g (20 mmól) 4-karboxi-benzaldehidet és 2,3 g (20 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet adunk 100 ml dioxánban. A keveréket 5-10 percen át kevertetjük, majd 4,1 g (20 mmól) diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. A keveréket 1 órán át ke46 vertetjük szobahőmérsékleten, majd szűrjük. A szűrletet bepároljuk vákuum alatt, hogy 9,4 g fehér, szilárd anyagot kapjunk, amelyet 25 ml forró izopropanolból átkristályosítunk. A köztes terméket izopropanollal dörzsöljük, így kapunk 2,1 g (8,5 mmól) kívánt terméket, vagyis 4-karboxi-benzaldehid-N-szukcinimid-észtert.
A köztes termék további tételeit állítjuk elő, és összesen 10 g (40 mmól) N-szukcinimido-észtert adunk 3,6 g (40 mmól)^-alaninnak 40 ml 1 n nátrium-hidroxiddal és 100 ml vízzel képzett oldatához. A pH-t 8 fölött tartjuk, miközben a keveréket 1,5 órán át kevertetjük. A keveréket azután szűrjük és a szűrletet savassá (pH 1,9) tesszük 2 n sósavoldattal. Ezt háromszor extraháljuk összesen 150 ml etil-acetáttal, és a szerves rétegeket egye sítjük, majd konyhasóoldattal mossuk. A szerves réteget ezután nátrium-szulfáton víztelenítjük és vákuum alatt bepároljuk, így kapunk 4,6 g (21 mmól) fehér, szilárd 3-(4-formil-fenil-karbonilamino)-propionsavat.
100 mg (0,45 mmól) fenti köztes terméket, 103 mg (0,5 mmól) diciklohexil-karbodiimidet, 57,5 mg (0,5 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet és 10 ml dioxánt adunk egy kis lombikhoz, és a keveréket szobahőmérsékleten kevertetjük nitrogén alatt. A reakció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiával követjük, és 75 mg (0,36 mmól) további diciklohexil-karbodiimidet és 45 mg (0,4 mmól) további N-hidroxi-szukcinimidet adunk hozzá. Négy óra múlva a reakciókeveréket szűrjük, és a szűrletet vákuum alatt szárazra pároljuk. A nem tiszta termék 200 mg-ját kapjuk meg, amelyet 30 g szilikagélen kromatografálunk, diklór-metánban levő 5 % izopropanollal eluálva. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk, így kapunk 81 mg (0,25 mmól) kívánt köztes terméket, • · • ·· ·· · ··· • · ······ · ···· ·· · · ··· ' - 47 kevésbbé szennyezett formában.
C. Az L/1C2 antitest kapcsolása a kapcsoló propionil-3-amino-karbonil-4-benzaldehidhez
Egy 100 ml-es lombikhoz szobahőmérsékleten hozzáadjuk 1026 mg (6,8 jÁmól) L/1C2 antitest oldatát 76,1 ml 0,34 mól/l-es borát pufferban (pH 8,6), majd 14,1 mg (44 /Amól) aktív észtert (amelyet 3. készítményként kaptunk) 3,3 ml acetonitrilben. A keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezt ezután 90 g Sephadex G25-ön (Pharmacia) kromatografáljuk, 0,1 mól/1 nátrium-acetáttal eluálva (pH 5,6). A frakciókat ultraibolya elemzéssel értékeljük 258 és 280 nm-nél, és a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, hogy 948 mg (6,3/írnél) kívánt terméket kapjunk 111,5 ml olyan oldat formájában, amely 8,5 mg/ml koncentrációjú. A származékká alakított antitest konjugációs aránya 4,8 mól kapcsoló/1 mól antitest .
D. L/1C2 antitest propionil-3-amino-karbonil-4-benzaldehid konjugálása metotrexát-y-hidraziddal
A fenti 4. készítmény 55,6 ml-es részletét, amely 472 mg (3,1 mól) származékká alakított antitestet tartalmaz, további 87 ml 0,1 mól/l-es nátrium-acetáttal (pH 5,6) hígítjuk.
Metotrexát-^-hidrazid 101 mg (216/tmól)-nyi részletét felvesszük 7,2 ml acetonitrilben és 21,6 ml 1 mól/literes monobázisos kálium-foszfát pufferban. Mintegy 1 ml 5 n nátrium-hidroxidot adunk az oldathoz, és ezt az oldatot azután az antitest oldathoz adjuk. A reakciókeveréket savassá (pH 5,8) tesszük jégecettel, és 16 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Ezt azután centrifugáljuk és a felülúszót két 90 g-os Sephadex 025 oszlopon kromatografáljuk, fiziológiásán pufferolt konyhasóoldat·· ·· · ········ • · · · · · · • ·· · · ···· • ······· · •··· ·« · · ··· ' ' - 48 tál eluálva.
Összesen 202,8 ml oldatot gyűjtünk a kromatográfiás munkaműveletből, amelyet ultraibolya spektroszkópiával elemzünk, a spektrumot 280 és 370 nm-nél vizsgálva. Az elemzés azt mutatja, hogy az oldat 0,018 mg/ml metotrexátot és 1,87 mg/ml antitestet tartalmaz .. A konjugációs arány így 3,0, mólarányban kifejezve.
A termék oldatát vákuum-dialízissel koncentráljuk fiziológiásán pufferőit sőoldattal szemben hidegben, az ebben a példában kapott termék-oldatot egyesítve 212 ml hasonló futásból származó termék-oldattal. A térfogatot dialízissel 108 ml-re csökkentjük.
15. PÉLDA
L/1C2 antitest propionil-3-amino-karbonil-4-benzaldehid konjugátuma metotrexát-y-hidraziddal - a reakciókörülmények módosítása abból a célból, hogy különböző konjugációs arányú konjugátumokat alakítsunk ki
A 14. példában leírt konjugációs munkamenetet ismételjük meg négyszer olyan körülmények között, amelyek a 14. példában vázolt körülményektől csupán annyiban térnek el, ahogyan az alábbiakban leírjuk.
A. Metotrexát-Y~hidrazid 0,67 mg-os adagját, 67 yv(l 0,1 mól/l-es nátrium-acetátban (pH 5,6) és 33^1 acetonitrilben feloldva, egyesítjük 1 ml olyan oldattal, amely 2,2 mg 14. példa szerinti (C. fejezet) köztes terméket tartalmaz 0,1 mól/1 nátrium-acetátban, és a keveréket 11 órán át állni hagyjuk. Ezt azután 5,9 g Biogel P6-on (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia 94804) kromatografáljuk, hogy 5 ml olyan konjugátum-oldatot kapjunk, amelyben 0,6 mg kívánt konjugátum található 3,2 mól metotrexát/1 mól antitest konjugációs aránnyal.
• · ···· · • · ··· ···
B. Ugyanolyan mennyiségű metotrexát-^-hidrazid oldatot, mint amennyit a 15· példa A. fejezetében alkalmaztunk, egyesítünk 0,95 ml köztes termék oldattal, amelyet a 14. példa C.
fejezetében kaptunk, és amely 0,42 mg köztes terméket tartalmaz, és a keveréket érán át állni hagyjuk. Ezt ugyanúgy kromatografáljuk, mint a
15. példa A. fejezetében, így kapunk 4,75 ml konjugátum-oldatot, amely 0,11 mg konjugátumot tartalmaz 5,4 mól metotrexát/mól L/1C2 antitest konjugációs aránnyal.
C. Metotrexát--hidrazid 0,7 mg-os adagját 50^1 acetonitrilben és 100jvvl 1 mól/l-es foszfát-pufferban (pH 5,8) oldva egyesítjük 2,2 mg 14. példa szerinti (C. fejezet) köztes termékkel, amely 1 ml 0,1 mól/literes nátrium-acetát oldatban (pH 5,6) van oldva. A keveréket 11 órán át állni hagyjuk. Ezt azután úgy kromatografáljuk, mint a 15. példa A. fejezetében, hogy 5,3 ml kon jugátum-oldatot kapjunk, amely 1,3 mg konjugátumot tartalmaz 3,3 mól metotrexát/1 mól antitest konjugációs aránnyal.
D. Metotrexát-^-hidrazid 0,7 mg-os adagját 50^1 acetonitrilben és 150J^l 1 mól/literes foszfát pufferban (pH 5,8) oldva egyesítjük 2,2 mg 14. példa (C. fejezet) szerinti köztes termékkel, amely 1 ml 0,1 mól/l-es nátrium-acetátban van. A keveréket 14 órán át állni hagyjuk, majd olyan módon kromatografáljuk, mint a 15· példa A. fejezetében, hogy 5,3 ml konjugátum-oldatot kapjunk, amely 1,7 mg konjugátumot tartalmaz 3,3 mól metotrexát/1 mól L/1C2 antitest konjugációs aránnyal.
A fentebb leírt konjugációs folyamat változatai kialakítanak egy olyan rendszert, amellyel a gyógyszer rögzítésének mértékét az L/1C2 antitesthez szabályozni lehet. Az előnyös konjugációs arányokat általában a gyógyszerek maximális számának tekintjük, • · • · · · · • · · ···« *··· «· · amennyi csak a rögzítésben elérhető a nélkül, hogy jelentős csökkenés lépne fel az L/1C2 antitest antigén-kötő tulajdonságaiban.'
16. PÉLDA
A. L/1C2 antitest karbonil-4-benzaldehid köztes termék előállítása
-N-szukcinimid-észtérből
4-karboxi-benzaldehid^ 0,31 mg-os adagot készítünk a 14. példa B. fejezetében leírt eljárás szerint. Ezt feloldjuk 100/41 dimetil-formamidban és hozzáadjuk 18,9 mg L/1C2 antitesthez 2,1 ml 0,34 mól/literes borát pufferban (pH 8,6). A keveréket 1,5 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten, majd kromatografáljuk 6 g Biogel P6-on, 0,1 mól/1 nátrium-acetáttal (pH 5,6) eluálva. Az oldat 6,2 ml-es részletét kapjuk meg, ezt ultraibolya spektrum segítségével vizsgáljuk 256 és 280 nm-nél mérve. Az elemzés azt jelzi, hogy 16,1 mg származékká alakult antitestet kapunk 2,6 mg/ml koncentrációban, 5,2 mól kapcsoló/1 mól antitest konjugációs aránnyal.
B. L/1C2 antitest karbonil-4-benzaldehidnek metotrexát-y^hidraziddal képzett konjugátumának előállítása ml oldatot, amely a 16. példa A. fejezetéből származik, és amely 10,4 mg (0,069 mól) származékká alakult antitestet tartalmaz, egyesítünk 3,2 mg (6,8 mól) metotrexát-y-hidraziddal, amely 250/^1 dimetil-formamidban van. A keveréket 6 órán át hagyjuk állni szobahőmérsékleten, majd hűtőbe helyezzük. Két nap múlva a keveréket centrifugáljuk és a felülúszót Bio-Gel P6-on kromatografáljuk, fiziológiásán pufferolt konyhasőoldattal eluálva, így kapunk 8,5 ml oldatot, amelyet ultraibolya spektrum alapján elemzünk, 280 és 370 nm-nél mérve. Az elemzés azt mutatja, hogy a termék 6,4 mól gyógyszer/1 mól antitest aránnyal bír, és azt, hogy az oldat 0,64 mg/ml konjugátumot tartalmaz.
A terméket azon képessége alapján értékeljük, hogy gátolja
99 · ···· • · · · · · • · · · · · • · · ···· · ······ · ·
9
I l , > *
- 51 a T222 tumorsejtek növekedését szövettenyészetben, amint ezt a 9. példában leírtuk. Úgy találjuk, hogy a konjugátum a sejtnövekedés 70 % gátlását alakítja ki 0,35jA.g koncentrációnál, a metotrexát koncentrációra számítva.
17. PÉLDA
L/1C2 antigén kötő fragmentumok és konjugátumaik előállítása
A. L/1C2 F(ab1)qfragmentum
Az L/1C2 antitest FCabOg fragmentumát úgy készítjük el, hogy
2,4 ml pepszin-oldatot, amely 12,6 mg pepszin/ml koncentrációjú, hozzáadunk 1,5 g L/1C2 antitesthez, amely 270 ml fiziológiásán pufferolt konyhasóoldatban van. A keveréket 37°C hőmérsékleten tartjuk 2 óra 20 percen át, majd a reakciót trietanol-amin hozzáadásával leállítjuk. A terméket azután kromatográfiával koncentráljuk, Sepharose Fást Flow oszlopon, 0,15 mól/1 nátrium-acetáttal eluálva. A F(ab')£-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és dialízissel koncentráljuk, így kapunk 100 ml termék-oldatot, amely 992 mg-ot tartalmaz az L/1C2 antitest F(ab')g fragmentumából.
B. L/1C2 antitest FCal·1)^ fragmentum propionil-3-amino-karbonil-
4-benzaldehid köztes termék előállítása
A jelen bejelentés 17. példájának A. fejezetében készített L/1C2 F(ab')g fragmentumot dializáljuk 0,34 mól/1 borát pufferbe (pH 6,8), így kapunk 23 mg (0,23 mól) F(ab')g fragmentumot
3,8 ml oldat formájában. Ezt az oldatot egyesítjük 0,44 mg (1,4 mól) 3-(4-formi1-fenil-karbonil-amino)propionsav-N-szukcinimidészterrel, amely 102^<1 acetonitrilben van. A keveréket egy órán át kevertetjük szobahőmérsékleten, majd- az oldatot kromatografáljuk 11 g Sephadex G25-ből álló oszlopon, 0,1 mól/1 nátriumacetáttal eluálva (pH 5,6). A terméket tartalmazó frakciókat • · · · · · · • ·· · · · ··· ♦ · · ···· · · ···· ·· · · ··· egyesítjük, így kapunk 19 mg (0,19/Amól) származékká alakított antitest fragmentumot, 2,8 mól kapcsoló/1 mól antitest konjugációs aránnyal, 9,6 ml oldatban.
C. L/1C2 F(ab')2 fragmentum propionil-3-amino-karboni benzaldehidnek metotrexát-y-hidraziddal alkotott konjugátumának előállítása
2,7 ml származékká alakított antitest fragmentum oldatot, amelyet a fenti B. fejezet szerint állítottunk elő, és amely 8 mg (0,08 származékká alakított antitest fragmentumot tartal
maz, hozzáadunk 0,47 ml 1 mól/literes foszfát pufferhoz (pH 5,6). Ehhez az oldathoz 3,7 mg (7,9jv\m°l) metotrexát-J'-hidrazidot adunk, amely minimális mennyiségű 0,1 mól/l-es nátrium-acetátban van feloldva. A keverék pH-ját visszaállítjuk 5,6-ra híg sósavoldattal és a keveréket 17 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Ezután ezt centrifugáljuk, és a felülúszót 11 g Sephadex G25-öt tartalmazó oszlopon kromatografáljuk, fiziológiásán pufferolt konyhasóoldattal eluálva. Az ultraibolya elemzés azt mutatja, hogy
5,8 mg konjugátumot kapunk 0,95 mg/ml anyagot tartalmazó oldat formájában 2,1 mól metotrexát/1 mól L/1C2 antitest konjugációs aránnyal.
A konjugátumot az in vitro tumorsejt-növekedés gátlási vizsgálatban megvizsgáljuk T222 tumorsejtekkel szemben, amint ezt a
9. példában leírtuk, és úgy találjuk, hogy 22 %-os mértékben gátolja a sejtek növekedését 0,046/tg/ml koncentrációnál, és 83 %os mértékben gátol 0,46^ig/ml koncentrációnál; a számításokat a metotrexát-Y-hidrazid tartalomra végezve.

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. ) Tumorral társult glikoprotein antigén azzal jellemezve, hogy lényegében tiszta formában van, az említett antigénnek a molekulatömege 110000-14000 dalton közti tartományban van a redukáló körülmények közt végzett SDS-PAGE eljárás szerint meghatározva, továbbá a fej, nyak és tüdő hámszöveti sejtjeiből kifejlődő humán pikkelyes karcinóma sejtek felületén van jelen, és fogékony az L/ 1C2 hibridóma sejtvonal által termelt antitesttel való immun-kicsapásra.
  2. 2. ) Hibridóma-sejtvonal azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban oltalmazni kívánt glikoprotein antigénnel reaktív antitestet termel .
  3. 3. ) A 2. igénypont szerinti hibridóma sejtvonal azzal jellemezve, hogy ez L/1C2 sejtvonal.
  4. 4. ) Antitest azzal jellemezve, hogy ez az 1. igénypontban oltalmazott, tumorral társult glikoprotein antigénnel reaktív antitest.
  5. 5. ) Antitest azzal jellemezve, hogy ez a 2. igénypont hibridóma sejtvonala által termelt antitest.
  6. 6. ) A 4. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy ez kiméra antitest.
  7. 7. ) A 4. vagy 5· igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy ez IgG antitest.
  8. 8. ) A 7· igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy ez L/1C2 antitest.
  9. 9. ) Antitest molekula azzal jellemezve, hogy a 4-8.igénypontok bármelyike szerinti antitest antigén-kötő területét tartalmazza.
  10. 10. ) Fab fragmentum azzal jellemezve, hogy a 4-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest fragmentuma.
    • · • · • ··· • · · · · • ·· · · • · · ···· · * ···· «* · · ···
    1 i , · *
  11. 11. ) FCabOg fragmentum azzal jellemezve, hogy ez a 4-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest fragmentuma.
  12. 12. ) Eljárás L/1C2 antigén jelenlétének kimutatására valamely mintában, azzal jellemezve, hogy (a) az említett mintához az 1. igénypontban oltalmazni kívánt, tumorral társult glikoprotein antigénnel reaktív antitestet adunk; és (b) az említett antitest reaktivitását mérjük az említett mintához.
  13. 13·) Rákellenes szer humán karcinóma kezelésében való felhasználásra azzal jellemezve, hogy a 4-11. igénypontok bármelyikében oltalmazni kívánt, radioaktív elemmel kapcsolt antitestből, vagy antitest-molekulából vagy fragmentumból, és valamely biológiai toxinból vagy rákellenes gyógyszerből áll.
  14. 14. ) A 13. igénypont szerinti rákellenes szer azzal jellemezve, hogy az említett biológiai toxin diftéria-toxin vagy ricin, vagy a rákellenes gyógyszer metotrexát, vinka alkaloid vagy adriamicin.
  15. 15. ) A 13. vagy 14. igénypont szerinti rákellenes szer azzal jellemezve, hogy az említett antitest, antitest-molekula vagy fragmentum az L/1C2 monoklonális antitest, amely az ATCC B9682 kiválasztási terméke.
  16. 16. ) Eljárás humán karcinóma gyógyászati kezelésére azzal jellemezve, hogy egy embernek a 13-15. igénypontok bármelyike szerinti rákellenes szert adunk be.
  17. 17. ) Eljárás az 5.-11. igénypontok bármelyike szerinti antitest, antitest-molekula vagy fragmentum előállítására azzal jellemezve, hogy (a) a 2. vagy 3· igénypontok szerinti hibridóma sejtvonalat monoklonális antitest kiválasztására késztetjük; (b) az említett monoklonális antitestet tisztítjuk; és (c) kívánt esetben az említett tisztított antitestet papin vagy pepszin proteolitikus en- zimmel hasítjuk, ha Fab vagy F(ab') fragmentumot kívánunk előállítani .
  18. 18.) Eljárás a 13.-15. igénypontok bármelyike szerinti rákellenes szer előállítására azzal jellemezve, hogy egy 4.-11. igénypontok bármelyike szerinti antitestet, antitest-molekulát vagy fragmentumot radiaktív elemmel, biológiai toxinnal vagy rákellenes szerrel összekapcsolunk.
HU891940A 1988-04-22 1989-04-21 Process for producing monoclonal antibodies HUT52166A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18465988A 1988-04-22 1988-04-22
US07/259,679 US5171666A (en) 1988-04-22 1988-10-19 Monoclonal antibodies reactive with a cell-surface gylcoprotein expressed on human carcinomas

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT52166A true HUT52166A (en) 1990-06-28

Family

ID=26880357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU891940A HUT52166A (en) 1988-04-22 1989-04-21 Process for producing monoclonal antibodies

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5171666A (hu)
EP (1) EP0338846A3 (hu)
JP (1) JPH0235097A (hu)
KR (1) KR900015756A (hu)
CN (1) CN1037925A (hu)
AU (1) AU612824B2 (hu)
DK (1) DK191989A (hu)
HU (1) HUT52166A (hu)
IL (1) IL90017A0 (hu)
NZ (1) NZ228837A (hu)
PT (1) PT90323A (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5134075A (en) * 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5171665A (en) * 1989-04-17 1992-12-15 Oncogen Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
ZA914625B (en) * 1990-06-22 1993-02-24 Lilly Co Eli In vivo targeting with bifunctional antibodies
CA2044421C (en) * 1990-11-27 2005-06-21 Thomas Hyatt Duffy Squamous cell carcinoma-like immunoreactive antigen from human female urine
JPH06145196A (ja) * 1992-11-10 1994-05-24 Tosoh Corp 癌細胞が分泌する蛋白質
US5424402A (en) * 1993-10-18 1995-06-13 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Non-destructive method for radiolabelling biomolecules by halogenation
US5482040A (en) * 1994-04-14 1996-01-09 The Ohio State University Research Foundation Biostaging of adenocarcinomas utilizing radiolabeled tumor-associated glycoprotein antibodies
US6348194B1 (en) * 1995-11-13 2002-02-19 Ixsys Incorporated Tumor specific internalizing antigens and methods for targeting therapeutic agents
EP0923738A1 (en) 1996-06-11 1999-06-23 Advanced Research &amp; Technology Institute Methods and compositions for the use of apurinic/apyrimidinic endonucleases
US6406917B1 (en) 1996-06-11 2002-06-18 Advanced Research And Technology Institute Methods and compositions for the use of apurinic/apyrimidinic endonucleases
AU2003220091B2 (en) * 2002-03-08 2006-02-16 Emory University Novel curcuminoid-factor VIIa constructs as suppressors of tumor growth and angiogenesis
US20050069551A1 (en) * 2002-03-08 2005-03-31 Emory University Cytotoxic compound-protein conjugates as suppressors of tumor growth and angiogenesis
CA2836927A1 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
AU2015224535B2 (en) * 2011-06-21 2017-07-20 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132769A (en) * 1974-10-30 1979-01-02 Osther Kurt B Cancer antigen, cancer therapy, and cancer diagnosis
US4713352A (en) * 1981-08-31 1987-12-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Reseach Monoclonal antibody panel for early diagnosis and therapy of renal carcinoma
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
CA1320689C (en) * 1984-03-30 1993-07-27 Alain Schreiber Monoclonal antibody specific for human basal cell surface antigen
US4708930A (en) * 1984-11-09 1987-11-24 Coulter Corporation Monoclonal antibody to a human carcinoma tumor associated antigen
US5019497A (en) * 1984-11-09 1991-05-28 Lennart Olsson Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies
US4814275A (en) * 1985-05-13 1989-03-21 E.I. Dupont De Nemours And Company Monoclonal hybridoma antibody specific for a human epithelial antigen
US4816402A (en) * 1986-01-07 1989-03-28 Northwestern University Murine hybridoma and diagnostic antibody produced thereby
EP0232871A3 (en) * 1986-02-07 1989-03-15 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Human monoclonal antibody, hybridoma producing the same and its use
US4912031A (en) * 1987-10-23 1990-03-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for detecting carcinomatous and precarcinomatous colo-rectal disease

Also Published As

Publication number Publication date
AU612824B2 (en) 1991-07-18
KR900015756A (ko) 1990-11-10
DK191989D0 (da) 1989-04-20
JPH0235097A (ja) 1990-02-05
US5171666A (en) 1992-12-15
EP0338846A2 (en) 1989-10-25
EP0338846A3 (en) 1990-03-28
AU3330689A (en) 1989-10-26
DK191989A (da) 1989-10-23
PT90323A (pt) 1989-11-10
NZ228837A (en) 1991-08-27
CN1037925A (zh) 1989-12-13
IL90017A0 (en) 1989-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240026027A1 (en) Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
Chang et al. Isolation and characterization of a monoclonal antibody, K1, reactive with ovarian cancers and normal mesothelium
JP2589682B2 (ja) ヒト非▲下−▼小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体および抗原
DE69735368T2 (de) Behandlung und diagnose von krebs
KR910000956B1 (ko) 인체의 비-소세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원
Schrijvers et al. MAb U36, a novel monoclonal antibody successful in immunotargeting of squamous cell carcinoma of the head and neck
BR112020004231A2 (pt) anticorpos anti-cd166 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
US5242813A (en) Mouse monoclonal antibodies specific for normal primate tissue, malignant human cultural cell lines human tumors
US20030082188A1 (en) Treatment of prostate cancer by inhibitors of NCAM2
US5817313A (en) Monoclonal antibodies and conjugates thereof useful for the treatment of cancer
AU612824B2 (en) Monoclonal antibodies
JP2001503601A (ja) 前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体
JP2000505787A (ja) 中皮抗原及びそれを標的化するための方法及びキット
JP2005538682A (ja) カルボキシックアンヒドラーゼｉｘ（ｃａｉｘ）腫瘍抗原に対する抗体
BR112020014380A2 (pt) Anticorpo anti-mesotelina e conjugado de fármaco anticorpo do mesmo
JPH09501571A (ja) モノクローナル抗体
JP2021530436A (ja) Ａｘｌを標的とする抗体および抗体−薬物複合体ならびにその製造方法と使用
LU86786A1 (fr) Anticorps monoclonaux et antigene du carcinome pulmonaire humain a cellules non petites et de certains autres carcinomes humains
JP2820256B2 (ja) メチルトリチオ抗腫瘍剤のターゲテッド形態
TW201905000A (zh) 含有抗globo h抗體之抗體－藥物共軛物及其用途
JPH08506801A (ja) Ｃｄ４４エキソン６に対応するペプチド、そのペプチドに特異的な抗体、および、腫瘍診断にそれらの抗体を使用する方法
JP2004536578A (ja) 腫瘍ターゲティング用の抗−ｍｕｃ−１単鎖抗体
JP2555028B2 (ja) ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体
US6270978B1 (en) Immunomethods for isolating and indentifying human influx peptide transporter
AU8071187A (en) Monoclonal paratopic molecule directed to human ganglioside gd2