ES2251959T3

ES2251959T3 - Procedimiento de produccion de coenzima q10.

Info

Publication number: ES2251959T3
Application number: ES00902071T
Authority: ES
Inventors: Hideyuki Matsuda; Makoto Kawamukai; Yajima Kazuyoshi; Yasuhiro Ikenaka; Kenichi Nishi; Junzo Hasegawa; Satomi Takahashi
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: NO20004991D0; WO2000047746A1; CA2325009A1; DE60023800T2; EP1070759A4; AU2325200A; NO20004991L; EP1070759B1; DE60023800D1; EP1070759A1; JP4307609B2; ATE309368T1; US6461842B1; JP2000228987A

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína que tiene actividad decaprenil difosfato sintasa, comprendiendo dicho polinucleótido (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Núm. 1, o (b) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Núm. 1, dichas condiciones de hibridación rigurosas comprenden hibridar a 60ºC y lavar en 1 x SSC suplementado con SDS al 0, 1% mientras la temperatura se aumenta de 60ºC a 75ºC.

Description

Procedimiento de producción de coenzima Q_{10}.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir coenzima Q_{10}, que puede ser utilizado como agente farmacéutico y similares. Con más detalle, La presente invención se refiere a un procedimiento para producir coenzima Q_{10} aislando un gen que codifica una enzima responsable de biosintetizar la cadena lateral del coenzima Q_{10}, la enzima clave en la ruta biosintética del coenzima Q_{10}, es decir la decaprenil difosfato sintasa, a partir de una bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae, y transferir dicho gen a un microorganismo para producir el coenzima Q_{10}.

Técnica anterior

Industrialmente, el coenzima Q_{10} ha sido producido aislando un coenzima de plantas tales como el tabaco y alterando sintéticamente la cadena lateral.

Además, era conocido que el coenzima Q_{10} es producido por una amplia variedad de organismos incluyendo de microorganismos tales como bacterias y levaduras, a plantas y animales superiores. Se cree que uno de los procedimientos más eficaces para producir coenzima Q_{10} es un procedimiento que comprende cultivar el microorganismo y extraer el compuesto del cultivo. Dicho procedimiento ha sido utilizado también en la producción industrial de coenzima Q_{10}. No obstante, los procedimientos conocidos anteriores no proporcionan suficiente productividad debido a su bajo rendimiento o complicado manejo.

Aunque existen algunas diferencias entre las rutas procariótica y eucariótica para la biosíntesis de coenzima Q_{10}, ambas rutas constan de complicadas reacciones de múltiples etapas en las que están implicadas muchas enzimas. Básicamente constan de las tres etapas siguientes; sintetizar difosfato de decaprenilo, que es utilizado para la cadena lateral de prenilo de el coenzima Q_{10}; sintetizar ácido parahidroxibenzoico, que es utilizado para el anillo de quinona; y unir esos dos componentes y convertir los sustituyentes sucesivamente para dar el coenzima Q_{10}. Se entiende que la reacción, que determina la longitud de la cadena lateral y se cree que es la etapa limitante de la velocidad en la ruta biosintética, es decir, la reacción en la que está implicada la decaprenil sintasa, es la reacción más importante. Por consiguiente, con el fin de producir coenzima Q_{10} eficazmente, podría ser una buena idea aislar el gen de la decaprenil difosfato sintasa, el gen clave en la ruta biosintética, y utilizar dicho gen para mejorar la productividad. Uno de los candidatos potenciales para las fuentes de genes es una bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae, que produce una cantidad relativamente grande de coenzima Q_{10}.

Hasta ahora, los genes de la ácido decaprenilfosfórico sintasa habían sido aislados de diversos microorganismos incluyendo Schizosaccaromyces pombe (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. H09-173076) y Gluconobacter suboxidans (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. H10-57072). No obstante, estos no muestran suficiente productividad de coenzima Q_{10} y por consiguiente, la técnica no había logrado todavía el cultivo, el aislamiento o la purificación eficaz con esos microorganismos. Por consiguiente, se ha deseado aislar un gen de dicha enzima a partir de un microorganismo que tenga esta capacidad para producir coenzima Q_{10}.

Problemas a resolver por la invención

La presente invención ha sido realizada para resolver el problema anteriormente mencionado de la menor productividad. El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir coenzima Q_{10} eficazmente por medio de un microorganismo, mediante el aislamiento de un gen que codifica la enzima que sintetiza la cadena lateral de el coenzima Q_{10} de una bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae y utilizar el gen.

Según la presente invención, el gen de la decaprenil difosfato sintasa, el gen clave en la ruta biosintética de el coenzima Q_{10}, fue aislado a partir de una bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae. Se ha logrado una producción eficaz de coenzima Q_{10} transfiriendo el gen a un microorganismo tal como Escherichia-coli y expresándolo allí.

Compendio de la invención

Los autores de la presente invención han intentado aislar en gen de la decaprenil difosfato sintasa a partir de una bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae que produce una cantidad relativamente grande de coenzima Q_{10} y han tenido éxito al aislar dicho gen.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un ADN que comprende una secuencia de ADN de la Sec ID Núm. 1, o una secuencia que tiene una deleción, adición o inserción de una o más bases en la secuencia y codifica la decaprenil difosfato sintasa. La presente invención también proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la Sec. ID Núm. 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, adición o inserción de uno o más aminoácidos en dicha secuencia y que tiene la actividad de la decaprenil difosfato sintasa; y un ADN que codifica dicha secuencia de aminoácidos.

La presente invención también proporciona un procedimiento para producir coenzima Q_{10} que comprende las etapas de transferir la secuencia de ADN anteriormente descrita a un microorganismo huésped y cultivar el microorganismo. El microorganismo huésped utilizado en la presente invención no está limitado pero es preferiblemente Escherichia coli. Se bien una Escherichia coli normal produce coenzima Q_{8}, según la presente invención, Escherichia coli puede ser modificada para producir coenzima Q_{10}.

Además, la presente invención proporcionar un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN anteriormente descrita. El vector de expresión de la presente invención puede ser construido utilizando cualquier sistema de vectores conocido. Por ejemplo, se proporciona pQAD-1, que es construido transfiriendo el gen de la Sec ID Núm. al sistema del vector de expresión pUCNT conocido.

Según la presente invención, también se proporciona un microorganismo huésped transformado con la secuencia de ADN anteriormente descrita. Para el microorganismo huésped en la presente invención se utiliza preferiblemente Escherichia coli.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un mapa de restricción del plásmido pQAD1 que contiene el gen de la decaprenil difosfato sintasa.

La Figura 2 muestra un diagrama de la cromatografía líquida de alta velocidad que detecta el coenzima Q_{10} producido por E. coli recombinante que comprende el gen de la decaprenil difosfato sintasa.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Los autores de la presente invención han estudiado intensamente para aislar el gen deseado de la bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae, que produce una cantidad relativamente grande de coenzima Q_{10}, y han tenido éxito al obtener un fragmento de dicho gen por medio de una técnica PCR.

Los autores de la presente invención compararon los genes de la decaprenil difosfato sintasa y los genes de la poliprenil difosfato sintasa, enzimas análogas a la primera que participan en la biosíntesis de cadenas de prenilo más largas para proporcionar coenzimas Q que tienen diferente longitud de la cadena lateral; y basándose en las regiones homólogas entre aquellas secuencias, diseñaron varios cebadores para la PCR. Se sometieron a ensayo diferentes combinaciones de los cebadores obtenidos para determinar las condiciones de la PCR. Se ha encontrado que se amplificaba un fragmento de 400 pb de la enzima deseada a partir del gen cromosómico de Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) utilizando DPS-1 (5'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-3') y DPS-2 (5'-AAGGATCCTCRTCNAC
NARYTGRAA-3') (donde R representa A o G, Y representa C o T, y N representa G, A, T o C) como cebadores de la PCR, llevando a cabo el procedimiento de la PCR a 94ºC durante 1 minuto, después 25 ciclos del ciclo térmico a 94ºC 1 min. \rightarrow 50ºC 1 min. \rightarrow 75ºC 1 min. Esto fue confirmado secuenciando el gen obtenido.

Con el fin de obtener el gen completo de dicha enzima, en la siguiente etapa, el gen cromosómico de Agrobacterium sp. KNK 712 (FERM-BP-1900) fue digerido con la enzima de restricción EcoRI y los fragmentos obtenidos fueron transferidos al vector fago \lambda para proporcionar un banco de fagos recombinante. Las placas fueron transferidas después a un filtro de nailon y el filtro fue sometido a hibridación en placa con el fragmento de la PCR aislado y después, se pudo obtener un clon que comprendía el gen de la decaprenil difosfato sintasa completo.

Se determinó la secuencia de bases del gen de la decaprenil difosfato sintasa contenido en el clon obtenido para dar la secuencia de la Sec. ID Núm. 1. La secuencia de aminoácidos se dedujo de la secuencia de bases contenida en las regiones que tenían las secuencias características para la decaprenil difosfato sintasa.

Con el fin de expresar el gen de la decaprenil difosfato sintasa, se requiere ligar dicho gen en un vector en una región aguas abajo de un promotor apropiado. Por ejemplo, se puede construir un vector de expresión escindiendo un fragmento de ADN que contenga el gen deseado por medio de enzimas de restricción o amplificando el fragmento que codifica la enzima por medio de PCR, transfiriendo después el fragmento a un vector que tenga un promotor. Por ejemplo, un sistema vector de expresión pUNCT (descrito en WO94/03613) puede ser transfectado con dicho gen para proporcionar un vector de expresión pQAD1 para el gen de la decaprenil difosfato sintasa.

Después se puede utilizar un microorganismo apropiado para producir coenzima Q_{10} transformándolo con dicho vector de expresión para la enzima. Por ejemplo, una Escherichia coli, que produzca coenzima Q_{8} originalmente, puede ser transformado mediante pQAD1, el vector de expresión para el gen de la decaprenil difosfato sintasa, para producir una cantidad de coenzima Q_{10} significativamente mayor, que no es producida originalmente, que la cantidad de producción de coenzima Q_{8}.

La Escherichia coli transformada, Escherichia coli HB101 pQAD1 fue consignada en el National Institute of Bioscience and Human-Techonology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry con el número de acceso FERM BP-6538.

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El gen proporcionado por la presente invención puede ser utilizado solo o puede ser también transferido simultáneamente a un microorganismo con otro gen biosintético y expresado allí para producir un mejor efecto.

Según el procedimiento de la presente invención para producir coenzima Q_{10}, el microorganismo huésped transformado con el gen puede ser cultivado para producir coenzima Q_{10}. Las condiciones de cultivo no están limitadas y pueden ser determinadas dependiendo del microorganismo huésped seleccionado. Las condiciones para cultivar diferentes microorganismos huésped son bien conocidas en la técnica. Una vez completado el cultivo, los microorganismos huésped pueden ser cosechados y el coenzima Q_{10} puede ser aislado y purificado por medio de un procedimiento apropiado. El método para aislar los coenzimas Q del microorganismo huésped es bien conocido en la técnica.

Ejemplos

La presente invención será descrita con más detalle por medio de los siguientes ejemplos. Los ejemplos tiene el propósito de explicar y no limitan el alcance de la invención de ningún modo.

Ejemplo 1

Se preparó un ADN cromosómico de Agrobacterium sp. KNK712 mediante el método de Marmur, J. Mol. Biol. Vol. 3, págs. 208-218 (1961). Los cebadores de la PCR fueron diseñados basándose en la homología de las secuencias entre el ADN y el gen de la ácido prenilfosfórico sintasa de cadena larga conocido, para dar dos cebadores DPS-1 (5'-AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-3') y DPS-2 (5'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3'). Donde, R representa A o G, Y representa C o T, y N representa G, A, T o C. Se someten al ciclo térmico de la PCR (94ºC 1 min. \rightarrow (25 ciclos a 94ºC 1 min. \rightarrow 50ºC 1 min. \rightarrow 70ºC 1 min) \rightarrow 4ºC 1 min. La mezcla amplificada fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Un fragmento de 400 pb fue escindido del gel y purificado por medio del estuche de extracción de ADN (Takara Co.), y después se determinó la secuencia de bases de ADN del fragmento por medio de un secuenciador de ADN (tipo 373 A, Appliedbiosystems Co.) con un estuche para la secuencia de ADN (ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit con ADN polimerasa Amplitaq®, FS) según las instrucciones del proveedor. Como resultado, se obtuvo una secuencia de bases correspondiente a los nucleótidos 514 a 905 de la Sec ID Núm. 1. La secuencia de aminoácidos traducida desde la secuencia de bases tenía regiones "VGDFLLG" y "EGEVLQL" que eran características de la enzima sintética de difosfato de prenilo que tenía una larga cadena de prenilo. Por consiguiente, los autores de la presente invención confirmaron que el gen obtenido era parte del gen de la decaprenil difosfato sintasa.

Ejemplo 2

El ADN cromosómico de Agrobacterium sp. KNK712 (0,25 mg) fue sometido a amplificación mediante PCR con los cebadores NQE (que tenía la secuencia 5'-AAGTCCACCGCCCGCACGATCT-3') y NQE-12 (que tenía la secuencia 5'-CCGAGGTTCATGCCGTAGGATTTT). Se llevó a cabo la PCR a 94ºC 1 min. \rightarrow (25 ciclos a 94ºC 1 min. \rightarrow 50ºC 1 min. \rightarrow 70ºC 1 min) \rightarrow 4ºC 1 min. La mezcla amplificada fue separada mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, un fragmento de 320 pb fue escindido del gel y después el fragmento fue purificado por medio del estuche de extracción de ADN (Takara Co.). Veinticinco nanogramos del fragmento de ADN obtenido se marcaron con dCTP[\alpha-P^{32}] por medio del sistema de marcaje Megaprime® (Amersham Co.).

Ejemplo 3

El ADN cromosómico de Agrobacterium sp. KNK712 fue digerido con las enzimas de restricción EcoRI, Sac I, Not I y Xho I, y separado mediante electroforesis en gel de agarosa. Después, el gel fue desnaturalizado por medio de una solución alcalina (NaOH 0,5 M \cdot NaCl 1,5 M) y neutralizado (Tris 0,5 M \cdot HCl (pH 7,5)). Se colocó un filtro Highbond N+ (Amersham Co.) sobre el gel y las bandas de ADN sobre el gel fueron transferidas al filtro mediante transferencia Southern con 10 x SSC. El filtro obtenido se secó y se fijó a 80ºC durante 2 horas, y después, el filtro se prehibridó a 60ºC, durante 4 horas en la solución de prehibridación (15 ml de 20 x SSC (NaCl 3 M, citrato trisódico dihidratado, pH 7,0), 5 ml de SDS (dodecilsulfato de sodio) al 10%, 5 ml de 50 x solución de Denhardt (10 g/l de FicolR Tipo 400, (Pharmacia), 10 g/l de polivinilpirrolidona y 10 g/l de seralbúmina bovina (Fracción V, Sigma)), 0,5 ml de ADN de esperma de salmón de 10 mg/ml (desnaturalizado calentando a 95ºC durante 5 minutos y extinguido sobre hielo) y 24,5 ml de agua).

Las sondas marcadas se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y se extinguieron sobre hielo, y se añadieron a la solución de prehibridación que contenía el filtro prehibridado. La hibridación se llevó a cabo a 60ºC durante 22 horas. El filtro hibridado se lavó dos veces a la temperatura ambiente con 5 x SSC suplementado con SDS al 0,5%, y después con 1 x SSC suplementado con SDS al 0,1% mientras la temperatura subía de 60ºC a 75ºC. El filtro se secó y se expuso adhiriéndolo a la película de rayos X, y después se desarrollaron las bandas de color negro.

Como resultado, las sondas hibridaban fuertemente con el fragmento EcoRI de aproximadamente 2,7 kb, el fragmento Sac I de aproximadamente 4,7 kb, el fragmento Not I de aproximadamente 8,3 kb, y el fragmento Xho I de aproximadamente 4,7 kb.

Ejemplo 4

Un ADN cromosómico de Agrobacterium sp. KNK712 se cortó con la enzima de restricción EcoRI, se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, después se escindió un fragmento de ADN de 7 kb y se purificó para dar el fragmento de ADN para la clonación. El fragmento de ADN obtenido se insertó en el estuche del fago \lambda-ZAP II (Stratagene Co.) en el sitio EcoRI y se empaquetó utilizando el estuche de empaquetamiento in vitro (Amersham Co.). Después, E. coli XL 1-Blue MRF' se infectó con el fago. Las células infectadas se cultivaron en placa sobre medio de cultivo en placa NZY (5 g/l de NaCl, 2 g/l de MgSO_{4}/7H_{2}O, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de amina NZ, 18 g/l de agar (pH 7,5) junto con medio de agar blando NYZ (el mismo que el del medio de cultivo en placa NYZ excepto porque la cantidad de agar es de 8 g/l) y se cultivaron para desarrollar las placas. Las placas fueron transferidas al filtro Highbond N+ (Amersham Co.). El filtro fue desnaturalizado con una solución alcalina (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M), neutralizado (Tris 0,5 M \cdot HCl (pH 7,5), NaCl 1,5 M), y fijado a 80ºC durante 2 horas.

Veinticuatro filtros obtenidos como antes fueron prehibridados y después hibridados con las sondas marcadas según un procedimiento similar al Ejemplo 3, y los filtros obtenidos se lavaron. Después de secar, los filtros se expusieron a rayos X adhiriéndolos a las películas de rayos X. Las placas de los fagos correspondientes a los puntos de color negro desarrollados fueron aisladas. Los fagos aislados fueron infectados en E. coli según el método anteriormente descrito. Las placas obtenidas fueron transferidas al filtro e hibridadas de nuevo para confirmar. Se seleccionaron doce cepas del fago.

Se llevó a cabo la PCR utilizando una suspensión de los fagos respectivos y los fragmentos NQE-11 y NQE-12 anteriormente mencionados. Se encontraron fragmentos de ADN de 320 pb en ocho cepas de ellos. Se prepararon fagémidos con dos cepas de las 8 utilizando \lambda-ZAP Phage Kit según las instrucciones de los proveedores.

Ejemplo 5

Utilizando los dos ADN de los fagémidos obtenidos de este modo, se determinó la secuencia de bases del ADN del gen de la decaprenil difosfato sintasa según un procedimiento similar al ejemplo 1. Entre los ADN insertados, se determinó un fragmento con una secuencia de bases de ADN de aproximadamente 1,6 kb. La secuencia obtenida se muestra en los listados de secuencias de la Sec. ID Núm. 1. Una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de bases se muestra como la Sec. ID Núm. 2.

Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las de la decaprenil difosfato sintasa derivada de Gluconobacter suboxydans (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública H10-57072) y se encontró que mostraban una homología en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 47% y una homología en la secuencia de ADN de aproximadamente el 60%. Los resultados se muestran en las Figs. 3, 4 y 5. las secuencias fueron comparadas también con la decaprenil difosfato sintasa derivada de Schizosaccaromyces pombe y se encontró que mostraban homologías del 30% en los aminoácidos y del 46% en el ADN.

Ejemplo 6

Con el fin de escindir la región codificadora de la decaprenil difosfato sintasa del fagémido preparado anteriormente, se llevó a cabo la PCR utilizando cebadores de ADN sintéticos NQE-22 (que tenía la secuencia 5'-AGT
CAAGCTTCAGCTCACCCGGTCGATC-3') y NQE-23 (que tenía la secuencia 5'-AGCTCATATGATACCGCTG
GAAGACAGC-3') según el mismo procedimiento que en el ejemplo 3. El fragmento obtenido fue cortado con las enzimas de restricción NdeI y Hind III y el fragmento obtenido fue transferido al vector de expresión pUCNT (WO94/03613) para dar el vector de expresión pQAD1 para el fosfato de decaprenilo. El mapa de restricción de pQAD1 se muestra en la Fig. 1. En esta figura, DPS representa la región codificadora

\hbox{de la decaprenil
difosfato sintasa.}

Ejemplo 7

El vector de expresión preparado de este modo para la decaprenil difosfato sintasa se añadió a E. coli HB101, las células se sacudieron durante la noche en 10 ml de medio LB a 37ºC y después, se recogieron (3.000 rpm, 20 minutos).

Las células recogidas se suspendieron en 1 ml de ácido sulfúrico al 3%, se calentaron a 120ºC durante 30 minutos, se les añadieron 2 ml de hidrato de sodio acuoso al 14% y se calentaron a 120ºC durante 15 minutos adicionales. La mezcla tratada de este modo se extrajo añadiendo 3 ml de hexano/isopropanol (10:2) y se centrifugó. Se separaron 1,5 ml de la fase del disolvente orgánico y se evaporaron hasta sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en 0,5 ml de etanol y 20 \mul de la solución se analizaron se analizaron con un sistema de cromatografía de líquidos de alta velocidad (LC-10A; Shimadz Co.). Para la elución, se utilizó una columna en fase reversa (YMC-pack ODS-A, 250 x 4,6 mm, S-5 \mum, 120A) y como disolvente para la fase móvil se utilizó etanol/metanol. El coenzima Q_{10} producido fue controlado mediante la absorbancia a una longitud de onda de 275 nm. Los resultados se muestran en la Fig. 2. Como resulta evidente de la Fig. 2, la Escherichia coli recombinante obtenida introduciendo y expresando el gen de la decaprenil difosfato sintasa produce coenzima Q_{10}, que no es producido por la cepa de tipo salvaje.

La cepa de E. coli recombinante obtenida, Escherichia coli HB101 pQAD1 fue consignada en el National Institute of Bioscience and Human-Techonology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry en 1 de Octubre de 1.996, (Núm. de Acceso FERM BP-6538).

Aplicabilidad industrial

En la presente invención, se aisló un gen que codifica la decaprenil difosfato sintasa, la enzima clave en el sistema biosintético de el coenzima Q_{10}, a partir de la bacteria perteneciente a la familia Rhizobiaceae y se determinó la secuencia de nucleótidos. Además, los autores de la presente invención tuvieron éxito al introducir en gen obtenido en Escherichia coli y al expresar el mismo. Mediante la utilización del gen y del procedimiento de la presente invención, el coenzima Q_{10}, que puede ser utilizado para fabricar composiciones farmacéuticas y similares, puede ser preparado eficazmente.

Referencia a los microorganismos consignados

Escherichia coli HB101 pQAD1 fue consignada en el National Institute of Bioscience and Human-Techonology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry en 1 de Octubre de 1.996. Se le asignó el Núm. de Acceso FERM BP-6538.

<110> KANEKA CORPORATION

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<120> Método para preparar Coenzima Q_{10}

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<130> 661688

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<150> JP 11/32657

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<151> 10-02-1999

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<160> 2

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<210> 1

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<211> 1586

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<212> ADN

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<213> Agrobacterium sp.

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 335

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<212> aminoácido

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<213> Agrobacterium Sp.

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<400> 2

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6

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Claims

1. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína que tiene actividad decaprenil difosfato sintasa, comprendiendo dicho polinucleótido (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Núm. 1, o (b) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Núm. 1, dichas condiciones de hibridación rigurosas comprenden hibridar a 60ºC y lavar en 1 x SSC suplementado con SDS al 0,1% mientras la temperatura se aumenta de 60ºC a 75ºC.

2. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1, que codifica una decaprenil difosfato sintasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Núm. 2.

3. Un procedimiento para producir coenzima Q_{10} que comprende transformar un microorganismo huésped con el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, cultivar el microorganismo huésped transformado, y aislar el coenzima Q_{10}.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, donde el microorganismo huésped es Escherichia coli.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, donde el microorganismo huésped transformado es Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538).

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2.

7. El vector de expresión según la reivindicación 6, donde el vector de expresión es pQAD1 contenido en Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538).

8. Un microorganismo huésped transformado con el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones
1 - 2.

9. El microorganismo según la reivindicación 8, que es Escherichia coli.

10. El microorganismo según la reivindicación 9, donde la Escherichia coli es Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538).

11. Un microorganismo huésped transformado con el vector de expresión según la reivindicación 6.

12. El microorganismo según la reivindicación 11, que es Escherichia coli.

13. El microorganismo según la reivindicación 12, donde la Escherichia coli es Escherichia coli HB101 pQAD1 (FERM BP-6538).

14. Una proteína aislada que es codificada por el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2 y que tiene una actividad decaprenil difosfato sintasa.

15. Una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Núm. 2 y tiene una actividad decaprenil difosfato sintasa.