ES2335951B1 - Proteina quimerica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtencion y susaplicaciones. - Google Patents
Proteina quimerica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtencion y susaplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína quimérica aldolasa/quinasa,
procedimiento de
obtención y sus aplicaciones.
obtención y sus aplicaciones.
La presente invención describe una nueva
proteína quimérica que reúne en una única cadena polipeptídica dos
actividades enzimáticas: una aldolasa y una quinasa, útil en la
formación de enlaces C-C entre una cetona donadora y
un aldehído aceptor complementándose el sistema con la regeneración
in situ del ATP. Así, esta proteína quimérica permite
desarrollar nuevos compuestos químicos con actividad biológica, por
ejemplo, carbohidratos y análogos.
Description
Proteína quimérica aldolasa/quinasa,
procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
La presente invención se enmarca en los sectores
Químico y Farmacéutico, más concretamente en el campo de los
biocatalizadores para la formación estereoselectiva de enlaces
C-C, originando carbohidratos y análogos.
El aumento en la demanda de fármacos
enantioméricamente puros por parte de la industria farmacéutica ha
disparado la investigación en síntesis asimétrica en condiciones de
regio- y estereoquímica controladas.
Es particularmente interesante en el caso de
estructuras polihidroxiladas como los hidratos de carbono, donde la
actividad biológica de los compuestos originados a partir de ellos,
depende de la estereoquímica de la molécula. Además, estrategias de
síntesis química clásica pueden resultar muy tediosas al necesitar
múltiples pasos de protección-desprotección que
disminuyen los rendimientos de las reacciones y, muchas veces, dan
lugar a mezclas de productos difíciles de purificar.
Así, los métodos enzimáticos de síntesis de
hidratos de carbono han despertado gran interés en las últimas
décadas ya que permiten un gran control de la regio- y
estereoquímica de los productos, porque usan condiciones de reacción
suaves y eliminan los pasos de
protección-desprotección aumentando así los
rendimientos.
Las aldolasas son enzimas que catalizan la
formación de enlaces C-C mediante una reacción
aldólica entre una cetona y un aldehído. De entre éstas destacan por
su interés sintético las aldolasas dependientes de dihidroxiacetona
fosfato (DHAP). Este grupo está formado por cuatro enzimas -fructosa
1,6-bisfosfato aldolasa, tagatosa
1,6-bisfosfato aldolasa, fuculosa
1-fosfato aldolasa y rhamnulosa
1-fosfato aldolasa- que catalizan la adición
aldólica de la dihidroxiacetona fosfato con un aldehído aceptor
generando 2 nuevos estereocentros cuya estereoquímica viene
determinada por la enzima y no por los sustratos. Otra
característica importante de estas enzimas es que cada una de ellas
da lugar a un producto cuya estereoquímica en los carbonos 3 y 4 es
complementaria de los otros productos (Figura 1); es decir, la
utilización de estas permite obtener los cuatro diastereoisomeros a
partir de un amplio número de aldehídos naturales y no naturales
(García-Junceda, E., García-García,
J. F., Bastida, A., Fernández-Mayoralas, A., 2004.
Bioorg. Med. Chem., 12, 1817-1834). Las aldolasas
dependientes de DHAP han demostrado su utilidad en la síntesis de
carbohidratos, análogos de carbohidratos y otros compuestos no
relacionados con éstos (Machajewski, T. D., Wong, C.-H., 2000.
Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1352-1375; Fessner,
W.-D., Helaine, V., 2001. Curr. Opin. Biotechnol., 12,
574-586).
El principal inconveniente que presenta el uso
en síntesis orgánica a nivel industrial de las enzimas aldolasas
dependientes de dihidroxiacetona fosfato, es la disponibilidad de
este compuesto (DHAP). Por un lado, la DHAP es lábil a pHs neutros o
básicos, siendo éste el rango óptimo para las aldolasas implicadas
en la formación de enlaces C-C, lo que provoca la
disminución de la concentración de la DHAP por degradación durante
el desarrollo de la reacción aldólica y, por otro lado, el precio de
mercado de la DHAP es excesivamente caro para poder ser utilizada a
nivel industrial.
Para intentar solventar la falta de
disponibilidad de la DHAP han sido descritos diversos métodos de
síntesis química y enzimática. Dentro de los métodos químicos se
encuentran aquellos que parten de un dímero de dihidroxiacetona
(DHA) (Jung, S. H., Jeong, J.-H., Miller, P., Wong, C.-H., 1994. J.
Org. Chem., 59, 7182-7184; Charmantray, F., El
Blidi, L., Gefflaut, T., Hecquet, L., Bolte, J., Lemaire, M., 2004.
J. Org. Chem., 69, 9310-9312), o de la
1,3-dibromoacetona dando un precursor estable de la
DHAP (Gefflaut, T., Lemaire, M., Valentín, M.-L., Bolte, J., J. Org.
Chem., 1997, 62, 5920-5922). El principal
inconveniente de estos métodos es que suelen tener costes muy
elevados y/o bajos rendimientos que no suelen superan el 65%.
Otros métodos químicos alternativos para superar
la dependencia de las aldolasas a la DHAP, son la formación in
situ de ésteres de arsenato o vanadato de la DHA que actúan como
miméticos del éster fosfato (D. G. Drueckhammer, J. R. Durrwachter,
R. L. Pederson, D. C. Crans, L. Daniels, C.-H. Wong, J. Org. Chem.
1989, 54, 70-77; R. Schoevaart, F. van Rantwijk, R.
A. Sheldon, J. Org. Chem. 2001, 66, 4559-4562; D. C.
Crans, K. Sudhakar, T. J. Zamborelli, Biochemistry. 1992, 31,
6812-6821). En el uso de estos compuestos también se
han detectado las siguientes objeciones: Aunque el arsenato ha sido
utilizado eficazmente con propósitos sintéticos, su alta toxicidad
impide su aplicación práctica. El vanadato también se ha utilizado
incluso a menores concentraciones que el arsenato, pero el vanadato
tiene una actividad redox que puede interferir con la reacción
aldólica siendo también su alto precio, un factor importante a tener
en cuenta en su utilización práctica.
Recientemente se ha reportado que en tampones de
borato la DHA puede formar reversiblemente un éster borato que puede
ser utilizado como sustrato por la rhamnulosa
1-fosfato aldolasa (M. Sugiyama, Z. Hong, L. J.
Whalen, W. A. Greenberg, C.-H. Wong, Adv. Synth. Catal. 2006, 348,
2555-2559).
Por otra parte, la preparación enzimática de
DHAP se lleva a cabo usualmente acoplada a la reacción catalizada
por la aldolasa. Así, la DHAP puede ser preparada a partir de la
oxidación del L-glicerol 3-fosfato
(L-G3P) catalizada por la glicerofosfato oxidasa,
junto con la descomposición del peróxido de hidrógeno mediada por la
catalasa (Fessner, W.-D., Sinerius, G., 1994. Angew. Chem. Int. Ed.
Engl., 33, 209-212; United States Patent 5683897).
Posteriormente, este sistema de preparación de DHAP ha sido acoplado
con la preparación in situ del D,L-G3P bien
mediante fosforilación del glicerol con la fosfatasa fitasa
(Schoevaart, R., van Rantwijk, F., Sheldon, R. A., 2000. J. Org.
Chem., 65, 6940-6943), o mediante apertura
regioselectiva del epóxido rac-glicidol con fosfato
(Charmantray, F., Dellis, P., Samreth, S., Hecquet, L., 2006.
Tetrahedron Lett., 47, 3261-3263).
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Otras estrategias descritas hasta el momento
para la obtención de DHAP enzimáticamente son:
- la fosforilación de la DHA mediante la
glicerol quinasa utilizando ATP como donador de grupos fosfato
(Wong, C.- H., Whitesides, G. M., 1983. J. Org. Chem., 48,
3199-3205).
- la utilización de la isoenzima I de la enzima
dihidroxiacetona quinasa (DHAK) procedente de la levadura
Schizosaccharomyces pombe IFO 0354 como biocatalizador para
la producción de DHAP con la regeneración in situ del ATP
mediante un sistema basado en la utilización de la acetato quinasa
(Itoh, N., Tujibata, Y., Liu, J. Q., 1999. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 51, 193-200).
- la fosforilación de la DHA catalizada por la
fosfatasa ácida de Shigella flexneri utilizando pirofosfato
como donador y su utilización acoplada a la reacción catalizada por
la aldolasa (Van Herk, T., Hartog, A. F., Schoemaker, H. E., Wever,
R., 2006. J. Org. Chem., 71, 6244-6247).
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Además, los inventores de la presente invención
desarrollaron un sistema multienzimático en el que, partiendo de DHA
se obtiene DHAP mediante la fosforilación catalizada por la
dihidroxiacetona quinasa (DHAK) de Citrobacter freundii CECT
4626 con consumo de ATP; la reacción aldólica se acopla a la
generación in situ de la DHAP y el sistema se completa con la
regeneración del ATP usando acetilfosfato como donador de fosfato y
acetato quinasa (Sánchez-Moreno, I.,
García-García, J. F., Bastida, A.,
García-Junceda, E., 2004, Chem. Commun.,
1634-1635). Este sistema de generación in
situ de DHAP ya ha sido optimizado para la reacción acoplada con
tres aldolasas dependientes de DHAP de utilidad sintética, mostrando
su aplicabilidad con un amplio rango de aldehídos. Este sistema
permite la formación de enlaces C-C catalizada por
aldolasas dependientes de DHAP a partir de la DHA, que es un
compuesto de bajo coste y alta estabilidad. El ATP es utilizado en
concentraciones catalíticas para cebar el sistema. La DHAK de
Citrobacter freundii CECT 4626 tiene una eficiencia
catalítica hacia la DHA muy superior a otros biocatalizadores
empleados en la fosforilación enzimática de DHA. Además, la DHAP es
producida en condiciones no oxidantes que podrían disminuir la
estabilidad del aldehído aceptor. Sin embargo, este sistema adolece
de la necesidad de utilizar 3 biocatalizadores con lo que esto
implica en cuanto al coste de producción y purificación de las tres
enzimas.
Un objeto de la presente invención es una
proteína quimérica que reúne en una única cadena polipeptídica dos
actividades enzimáticas, una actividad quinasa capaz de producir
DHAP a partir de DHA y una actividad aldolasa responsable de la
adición aldólica. Esto supone una simplificación del sistema
multienzimático descrito por lo que facilita y abarata su
utilización.
Un objeto de la presente invención lo constituye
una Proteína quimérica con actividad dihidroxiacetona quinasa y
aldolasa, en adelante Proteína quimérica
DHAK-L-FDA de la invención, que
comprende, al menos:
- i)
- una secuencia de aminoácidos de una dihidroxiacetona quinasa,
- ii)
- una secuencia de aminoácidos de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- iii)
- una secuencia conectora L de las secuencias de aminoácidos de i) y ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización particular de la invención lo
constituye la proteína quimérica de SEQ ID NO: 2.
Otro objeto de la invención lo constituye el
procedimiento de obtención de la proteína quimérica de la invención,
en adelante procedimiento de la invención, y que comprende las
siguientes etapas (ver ejemplo 1):
- -
- diseño de oligonucleótidos específicos conteniendo una secuencia conectora, preferentemente, la secuencia conectora L (Gln-Gly-Gln-Gly-Gln),
- -
- amplificación por PCR por separado del gen dhak (dihidroxiacetona quinasa) de Citrobacter freundii CECT 4626 y de un gen de un enzima con actividad fructosa 1-6 bisfosfato aldolasa, preferentemente el gen fda de Staphylococcus carnosus, incorporando dianas de corte para enzimas de restricción,
- -
- introducción en los extremos 3' de la quinasa y 5' de la aldolasa de la secuencia conectora L. preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln, y purificación de los fragmentos,
- -
- amplificación por PCR de la secuencia de nucleótidos de la Proteína quimérica de la invención, preferentemente la construcción DHAK-L-FDA (SEQ ID NO:1),
- -
- introducción de la secuencia de nucleótidos de la Proteina quimérica en un vector de expresión, transformación de una célula, ya sea eucariota o procariota, y producción y purificación de la proteína resultante, preferentemente la proteína de SEQ ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la invención lo constituye una
secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos
de la proteína quimérica DHAK-L-FDA
de la invención, en adelante secuencia de nucleótidos de la
invención, constituida por una secuencia de nucleótidos que
comprende:
- i)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una dihidroxiacetona quinasa,
- ii)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- iii)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia conectora L intercalada entre las secuencias i) y ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización particular de la invención lo
constituye la secuencia de nucleótidos de la proteína quimérica de
la invención de SEQ ID NO:1.
Otro objeto de la invención lo constituye el uso
de la enzima de la invención, en adelante uso de la invención, en la
formación de enlaces de C-C partiendo de
dihidroxiacetona y diferentes aldehídos, naturales o no naturales,
con el objeto de obtener nuevos compuestos químicos.
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Para solucionar el problema expuesto, los
inventores de la invención han demostrado por primera vez que es
posible elaborar una nueva Proteína quimérica que reúna en una única
cadena polipeptídica actividad dihidroxiacetona quinasa y actividad
aldolasa, unidas con una región conectora L, utilizando de forma
expresa la proteína monomérica secuencia, del gen de la aldolasa de
Staphylococcus carnosus y la secuencia del gen de la
dihidroxiacetona quinasa dependiente de ATP de cualquier
microorganismo habiéndose probado su eficacia en el Ejemplo 1. Esta
proteína quimérica se comporta en estudios de ultracentrifugación
como un dímero de masa molecular 199.853 Da. Además,
sorprendentemente se ha podido constatar que la Proteína quimérica
de la invención sólo mantiene la actividad mencionada cuando
comprende una parte enzimática con actividad aldolasa que proviene
de una forma enzimática original monomérica (como es, por ejemplo,
la aldolasa de Staphylococcus carnosus) mientras que cuando
se utiliza una aldolasa que funciona como tetrámero (como es, por
ejemplo, la aldolasa de E. coli) la Proteína quimérica así
construida forma agregados y no tiene la actividad biológica deseada
(ver Ejemplo 2).
El uso de dicha Proteína quimérica permite la
formación de enlaces C-C entre una cetona donadora y
un aldehído aceptor complementándose el sistema con la regeneración
in situ del ATP, permitiendo de esta manera desarrollar
nuevos compuestos químicos con actividad biológica, por ejemplo
carbohidratos y análogos.
El procedimiento para la formación de enlaces
C-C que forma parte de la presente invención, parte
de la DHA, que es fosforilada por la actividad quinasa de la
Proteína quimérica, con el consumo de ATP para obtener DHAP. A su
vez la DHAP es utilizada por la actividad aldolasa del Proteína
quimérica, para dar lugar al producto de adición aldólica con el
aldehído aceptor. Tanto el ATP como el ADP generado actúan como
inhibidores de la actividad quinasa por lo que, para evitar la
acumulación de ADP, es necesario usar cantidades catalíticas de ATP.
Esto se consigue regenerando in situ el ATP mediante la
acción de la acetato quinasa de E. coli y usando
acetilfosfato como donador de fosfato. Este procedimiento de
formación de enlaces C-C permite utilizar como
producto de partida la DHA, que es un compuesto de bajo coste y alta
estabilidad, y el ATP es utilizado únicamente en concentraciones
catalíticas para cebar el sistema reduciendo también el coste del
proceso.
La DHAP es producida en condiciones no oxidantes
que podrían disminuir la estabilidad del aldehído aceptor y es
utilizada, a medida que se produce, por la aldolasa lo que hace
innecesario su purificación. Además, la nueva proteína quimérica
descrita en esta invención reúne en una única cadena polipeptídica
dos actividades enzimáticas: la quinasa capaz de producir DHAP a
partir de DHA y la actividad aldolasa responsable de la reacción de
condensación aldólica. Esto supone una reducción en el coste del
biocatalizador ya que sólo hay que producir y purificar una única
proteína. Además, la unión de las dos actividades puede promover un
incremento de la "concentración efectiva" de la DHAP en las
cercanías del centro activo de la aldolasa provocando un aumento de
la eficacia catalítica del sistema.
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La Proteína quimérica bifuncional ha probado ya
su eficacia en procesos sintéticos, más concretamente, ha sido
demostrada con aldehídos representativos de un amplio rango
estructural: i) acetaldehído (1) como aldehído alifático más simple;
ii) benziloxiacetaldehído (2) como aldehído con un grupo cromóforo y
iii) 3-(metiltio) propionaldehído (3) como aldehído con heteroátomo
(Ejemplo 1, figura 3). Los resultados obtenidos muestran que el
nuevo Proteína quimérica bifuncional se puede aplicar a la síntesis
de enlaces C-C, siguiendo el procedimiento
siguiente: la DHA, es fosforilada por la actividad quinasa del
Proteína quimérica, con el consumo de ATP para obtener DHAP. A su
vez la DHAP es utilizada por la actividad aldolasa de la Proteína
quimérica, para dar lugar al producto de adición aldólica entre una
cetona donadora y un aldehído aceptor. En la formación de los
enlaces C-C se obtuvieron diferentes conversiones de
aldol y concentraciones de DHAP dependiendo del aldehído aceptor de
partida (Ejemplo 1.2):
- Utilizando acetaldehído se obtiene una
conversión de aldol del 82%, que por ^{1}H-NMR
corresponde a un único diastereoisómero, en 22 horas con una
acumulación de DHAP del 17%.
- Para el benziloxiacetaldehído se obtiene una
conversión del correspondiente aldol del 46% en 20 horas con una
acumulación de DHAP del 6%.
- Con el 3-(metiltio) propionaldehído se obtiene
una conversión de aldol del 64% en 20 horas con una acumulación de
DHAP del 22%.
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Por lo tanto, un objeto de la presente invención
lo constituye una Proteína quimérica con actividad dihidroxiacetona
quinasa y aldolasa, en adelante Proteína quimérica
DHAK-L-FDA de la invención, que
comprende, al menos:
- iv)
- una secuencia de aminoácidos de una dihidroxiacetona quinasa,
- v)
- una secuencia de aminoácidos de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- vi)
- una secuencia conectora L de las secuencias de aminoácidos de i) y ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto particular de la invención lo
constituye la Proteína quimérica de la invención en la que la
secuencia de aminoácidos de la aldolasa es la fructosa
1,6-bifosfato aldolasa monomérica de la bacteria
Staphylococcus carnosus y la dihidroxiacetona quinasa
es la dihidroxiacetona quinasa de la bacteria Citrobacter
freundii cepa CECT 4626 (véase la SEQ ID NO2).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye la Proteína quimérica de la invención en la que la región
conectora L es Gln-Gly Gln-Gly
Gln.
Una realización particular de la invención lo
constituye la proteína quimérica de SEQ ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la invención lo constituye el
procedimiento de obtención de la proteína quimérica de la invención,
en adelante procedimiento de la invención, y que comprende las
siguientes etapas (ver ejemplo 1):
- -
- diseño de oligonucleótidos específicos conteniendo una secuencia conectora, preferentemente, la secuencia conectora L (Gln-Gly-Gln-Gly-Gln),
- -
- amplificación por PCR por separado del gen dhak (dihidroxiacetona quinasa) de Citrobacter freundii CECT 4626 y de un gen de una enzima con actividad fructosa 1-6 bisfosfato aldolasa, preferentemente el gen fda de Staphylococcus carnosus, incorporando dianas de corte para enzimas de restricción,
- -
- introducción en los extremos 3' de la quinasa y 5' de la aldolasa de la secuencia conectora L. preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln, y purificación de los fragmentos,
- -
- amplificación por PCR de la secuencia de nucleótidos de la Proteína quimérica de la invención, preferentemente la construcción DHAK-L-FDA (SEQ ID NO:1),
- -
- introducción de la secuencia de nucleótidos de la Proteína quimérica en un vector de expresión, transformación de una célula, ya sea eucariota o procariota, y producción y purificación de la proteína resultante, preferentemente la proteína de SEQ ID NO:2.
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Otro objeto de la invención lo constituye una
secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos
de la proteína quimérica DHAK-L-FDA
de la invención, en adelante secuencia de nucleótidos de la
invención, constituida por una secuencia de nucleótidos que
comprende:
- iv)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una dihidroxiacetona quinasa,
- v)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- vi)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia conectora L intercalada entre las secuencias i) y ii).
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Otro objeto particular de la invención lo
constituye la secuencia de nucleótidos codificante de la Proteína
quimérica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos de
la aldolasa es la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa
monomérica de la bacteria Staphylococcus carnosus y la
dihidroxiacetona quinasa es la dihidroxiacetona quinasa de la
bacteria Citrobacter freundii cepa CECT 4626 (véase los
distintos genes en la SEQ ID NO:1).
Otro objeto particular de la invención
corresponde a una secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína quimérica de la invención, o de un fragmento de dicha
secuencia, o una secuencia de nucleótidos análoga, o una secuencia
de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial,
o de un fragmento de la misma, donde la secuencia antes descrita
procede de cualquier microorganismo, y que contiene secuencias de
nucleótidos análogas de los dos genes, aldolasa y quinasa, descritos
en la presente invención. Un experto en ingeniería genética y con la
información aquí descrita puede fácilmente aislar y desarrollar
nuevas formas análogas a la descrita en la presente invención por lo
que parte de ésta.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análogo" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las
secuencias de nucleótidos mostradas en la presente invención, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y
que codifique para un péptido
o proteína con actividad similar a la original, es decir, como la proteína quimérica DHAK-L-FDA de la invención.
o proteína con actividad similar a la original, es decir, como la proteína quimérica DHAK-L-FDA de la invención.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos comentada
anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homologa" significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad
de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más
preferentemente de, al menos, un 95%.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye la secuencia de nucleótidos que codifica la región
conectora L de la Proteína quimérica de la invención
(Gln-Gly-Gln-Gly-Gln).
Una realización particular de la invención lo
constituye la secuencia de nucleótidos de la proteína quimérica de
la invención de SEQ ID NO:1.
Otro objeto particular de la invención es un
vector de expresión génica, en adelante vector de expresión
DHAK-L-FDA, que comprende la
secuencia de nucleótidos de la invención, preferentemente la SEQ ID
NO:1, que permite la expresión de dicha construcción en el
citoplasma del microorganismo de la invención, preferentemente, el
vector plasmídico
pET-dhak-l-fda de la
invención (ver Ejemplo).
En general, un vector de expresión comprende,
además de la secuencia de nucleótidos de de interés, al menos, un
promotor que dirige su transcripción (pT7, plac, ptrc, ptac,
pBAD, ptet, etc), al que está operativamente enlazado, y otras
secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan la
transcripción del gen y, en su caso, la traducción del producto de
interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de
transcripción (tlt2, etc.), señal de poliadenilación, origen
de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias
codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc.
Además, pueden incluir otras secuencias que faciliten una mejor
purificación, por ejemplo, una cola de 6 histidinas que facilite su
purificación. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden
seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso
concreto entre plásmidos de expresión de microorganismos que pueden
contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las
células transíectadas o transformadas con el gen o genes de interés.
La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y del tipo
de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de
realización particular de la presente invención dicho vector es un
plásmido. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual que
para la transformación de microorganismos se pueden utilizar
diferentes métodos - transformación química, electroporación,
microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.]. Además de plásmidos, pueden utilizarse otros
vectores como bacteriófagos, en fagémidos, cósmidos, cromosomas
artificiales o integrando1 en cualquier punto del cromosoma o
cromosomas.
Otra realización particular de la invención lo
constituye un vector de expresión
dhak-l-fda en el que el vector
corresponde a un plásmido que comprende como secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO:1, preferentemente los, plásmidos
pET-dhak-1-fda y
pRdkfa (ver Ejemplo 1 y 2).
Otro objeto particular de la invención es una
célula o microorganismo transformado que comprende la secuencia de
nucleótidos o el vector de la invención.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo" se refiere a cualquier microorganismo
natural, incluyendo formas atenuadas, comensales, probióticas,
ambientales, etc. aisladas en la naturaleza o a cualquier cepa o
especie con cualquier tipo de modificación genética, y ya sean estas
modificaciones aisladas mediante selecciones naturales, procesos de
mutagénesis al azar o dirigida, o por técnicas de DNA recombinante,
preferentemente bacterias, hongos, levaduras, algas, plantas y
células de insecto.
Una realización particular de la invención lo
constituye un cepa de Escherichia coli, o de cualquier otra
cepa o especie bacteriana, que comprenda la secuencia de nucleótidos
de la proteína quimérica de la invención.
Los aldehídos y la dihidroacetona pueden formar
parte de estructuras químicas que interesen modificar o
complementar. Ejemplos destacados de estas familias de compuestos
son los iminociclitoles que actúan como inhibidores de glicosidasas
y glicosiltransferasas y por lo tanto pueden tener aplicaciones como
antibióticos, antimetastásicos, antihiperglucémicos, o agentes
inmunoestimulantes. Otros compuestos importantes son: Piperidinas
polihidroxiladas; fagomina; análogos de Epotilona, etc.
Finalmente, otro objeto de la invención lo
constituye el uso del enzima de la invención, en adelante uso de la
invención, en la formación de enlaces de C-C
partiendo de dihidroxiacetona y diferentes aldehídos, naturales o no
naturales, con el objeto de obtener nuevos compuestos químicos.
Otra realización particular de la invención lo
constituye el uso de la invención en el que la enzima utilizado es
el enzima de SEQ ID NO:2.
Figura 1.- Esquema de las reacciones catalizadas
por las cuatro aldolasas dependientes de DHAP: 1)
Fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa; 2)
Tagatosa-1,6-bisfosfato aldolasa; 3)
L-Rhamnulosa-l-fosfato
aldolasa; 4)
L-Fuculosa-1-fosfato
aldolasa.
Figura 2.- Esquema del procedimiento para la
formación de enlaces C-C utilizando la Proteína
quimérica aldolasa/quinasa. 1) Dihidroxiacetona quinasa del Proteína
quimérica fosforila la DHA con el consumo de ATP para obtener DHAP;
2) Fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa
de la Proteína quimérica utiliza la DHAP para dar lugar al producto
de adición aldólica con el aldehído aceptor; 3) Acetato quinasa de
E. coli regenera in situ ATP mediante la acción y
usando acetilfosfato como donador de fosfato.
Figura 3. - Estructura de los aldehídos
utilizados para comprobar la aplicabilidad sintética de la Proteína
quimérica aldolasa/quinasa. (1) Acetaldehído; (2)
benziloxiacetaldehído y (3) 3-(metiltio) propionaldehído.
La Proteína quimérica se construyó utilizando el
método de los cuatro primers o "gene splicing by overlap
extensión" (Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R.
1990, Biotechniques, 8, 528-535) para el cual se
diseñaron primers específicos conteniendo la secuencia conectora L.
La aldolasa de Staphylococcus carnosus es una proteína
monomérica mientras que la quinasa de C. freundii es un
dímero. En una primera PCR se amplificaron por separado los genes
dhak de Citrobacter freundii CECT 4626 y fda
(fructosa 1-6 bisfosfato quinasa) de
Staphylococcus carnosus incorporando dianas de corte para los
de restricción NdeI (en el extremo 5' de dhak) y
XhoI (en el extremo 3' de fda). En los extremos 3' de
dhak y 5' de fda se introdujeron las secuencias
correspondientes a la secuencia conectora L. El conector L es un
pequeño fragmento de cinco aminoácidos
(Gln-Gly-Gln-Gly-Gln)
y se diseñó con el programa LINKER (Crasto, C. J. and Feng, J.-A.,
2001, Prot. Eng. 13, 309-312).
Las condiciones para esta PCR fueron: a) para el
gen dhak-L tampón 10x 1 \muL; MgCl_{2} (50 mM) 0.6
\muL; dNTPs (10 mM) 1 \muL; aditivo 5x 2 \muL; template
(plásmido purificado de E. coli pRSET-dhak
disponible en nuestro laboratorio) 0.15 \muL; H_{2}O 4.5 \muL;
primer NtNdhak (100 \muM) 0.15 \muL; primer CtFdhak (100 \muM)
0.15 \muL; EcotaqPlus (4 U/\muL) 0.45 \muL; b) para el gen
L-fda tampón 10x 1 \muL; MgCl_{2} (50 mM) 0.5 \muL;
dNTPs (10 mM) 0.8 \muL; aditivo 5x 2 \muL; template (dilución
del DNA genómico de Staphylococcus carnosus extraído por
tratamiento de un cultivo de S. carnosus CECT 4491 con
lisozima y lisostaphina) 0.5 \muL; H_{2}O 4.45 \muL; primer
NtFScfda (100 \muM) 0.15 \muL; primer CtScXfda (100 \muM) 0.15
\muL; EcotaqPlus (4 U/\muL) 0.45 \muL. En ambos casos, la
mezcla de reacción se sometió a 25 ciclos de amplificación con las
siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto,
anillamiento a 55ºC durante 1 minuto y elongación a 72ºC durante 2
minutos.
Una vez purificados los fragmentos, se procedió
a realizar la segunda reacción de PCR en la que se consiguieron
fusionar ambas secuencias gracias a la complementariedad del
conector.
En una segunda PCR donde se utilizaron como
molde de DNA los fragmentos amplificados anteriormente, se amplificó
la construcción DHAK-L-FDA (2562
pb). Las condiciones para esta PCR fueron: tampón 10x 1 \muL;
MgCl2 (50 mM) 0.8 \muL; dNTPs (10 mM) 1 \muL; aditivo 5x 2
\muL; template (una disolución mezcla de
dhak-L y L-fda
obtenida en las dos amplificaciones de la PCR anterior en relación
1:1) 0.4 \muL; H_{2}O 4.05 \muL; NtNdhak (100 \muL) 0.15
\muL; CtScXf da (100 \muL) 0.15 \muL; EcotaqPlus (4 U/\muL)
0.45 \muL. La mezcla de reacción se sometió a 25 ciclos de
amplificación. Las condiciones de los ciclos fueron:
desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, anillamiento a 50ºC
durante 1 minuto y elongación a 72ºC durante 3 minutos.
El producto de esta segunda PCR (denominado
DHAK-L-FDA (SEQ ID NO:1) se clonó en
el vector de expresión pET-28b (+) (5.3 kb). Para
ello el producto de PCR se sometió a digestión con los enzimas de
restricción XhoI y NdeI y a ligación de extremos
cohesivos en pET-28b(+) doblemente digerido con los
mismos enzimas. El plásmido
pET-dhak-l-fda (7931
pb) así obtenido se transformó en la cepa BL21(D3E) de E.
coli. Una ventaja adicional del vector pET-28b
(+) es que la proteína se unió a un pequeño péptido en el extremo
N-terminal conteniendo seis histidinas que presentan
alta afinidad por cationes divalentes (Ni^{2+}, Ca^{2+},
Mg^{2+}, etc.), lo cual facilitó la purificación de la proteína
mediante cromatografía de afinidad a iones inmovilizados (IMAC).
Para la sobreexpresión de la protelna quimérica
de la invención se crecieron cultivos de una cepa de Escherichia
coli BL21(D3E) transformada con el plásmido
pET-dhak-l-fda en
medio LB conteniendo 26.3 \mug mL^{-1} de kanamicina. La
expresión de las proteínas se encontraba bajo control del promotor
T7, reconocido de manera específica por la
T7-RNA-polimerasa presente en la
propia cepa de E. coli, siendo ésta inducible con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG). Los cultivos se dejaron toda la noche en agitación a 30ºC.
El extracto celular resultante se trató con lisozima para romper las
células. La expresión de proteínas se estudió analizando el extracto
crudo proteico por SDS-PAGE, que reveló la
existencia de una banda de sobreexpresión debida a la adición de
IPTG en la fracción correspondiente a la proteína soluble.
La purificación del enzima bifuncional
DHAK-L-FDA se realizó mediante
cromatografía de afinidad con resinas de
Ni^{+2}-agarosa utilizando imidazol 0.5 M como
eluyente. Los eluidos se dializaron frente a agua para eliminar el
imidazol y minimizar el contenido en sales para la posterior
liofilización de la proteína. Se comprobó que el proceso de
dialización y liofilización de la proteína no afectó a su actividad
y permitió de esa manera su concentración. La proteína podría
presentarse liofilizada, semi-precipitada en una
suspensión de sulfato amónico al 3,2% e incluso inmovilizada en
resinas de Ni^{2+}-agarosa a través de la cola de
6 histidinas.
Es importante destacar que la Proteína quimérica
mantuvo la actividad de las dos funciones, obteniéndose 180 U de
actividad aldolasa (medida en sentido de reacción retroaldólica) y
125 U de actividad quinasa (medida en sentido de fosforilación) por
litro de cultivo.
La Proteína quimérica presentó una K_{M} para
la fructosa 1,6-bifosfato de 1,686 x 10^{-2} mM y
para la DHA de 2,185x10^{-3} mM. La kcat para cada uno de estos
sustratos es 6,5x10^{3} min^{-1} y 4,7x10^{2} min^{-1}
respectivamente. Por lo tanto la eficacia catalítica de la Proteína
quimérica se situó en el orden de 10^{5} mM^{-1}min^{-1}.
La Proteína quimérica obtenida de la presente
invención se comportó en estudios de ultracentrifugación como un
dímero de masa molecular 199.853 Da. El coeficiente de extinción
molar a 280 nm (\varepsilon^{280}) calculado para la proteína
quimérica fue de 37.610 M^{-1}cm^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
La Proteína quimérica aldolasa/quinasa de la
invención se utilizo para la formación de enlaces
C-C siguiendo el esquema general que se representa
en la Figura 2.
La aplicación sintética de la Proteína quimérica
se probó con los aldehídos (1) acetaldehído; (2)
benziloxiacetaldehido y (3) 3-(metiltio)propionaldehido
(Figura 3).
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen
final de 1,5 mL que contenía: DHA 50 \mumol; aldehído 150
\mumol; MgSO_{4} 12.5 \mumol; ATP 3.4 \mumol; acetilfosfato
100 \mumol; fosfato sódico 60 mM pH 7.5 500 \muL; acetato
quinasa 2.5 U; Proteína quimérica
DHAK-L-FDA (0.5-1 U
actividad aldolasa y 0.25-0.5 U quinasa).
Utilizando acetaldehído se obtuvo una conversión
de aldol del 82%, que por ^{1}H-NMR se observó que
era un único diastereoisómero, en 22 horas con una acumulación de
DHAP del 17%. Para el benziloxiacetaldehído se obtuvo una conversión
del correspondiente aldol del 46% en 20 horas con una acumulación de
DHAP del 6%. Con el 3-(metiltio)propionaldehído se obtuvo una
conversión de aldol del 64% en 2 0 horas con una acumulación de DHAP
del 22%.
El transcurso de la reacción se siguió
espectrofotométricamente mediante valoración de alícuotas de
reacción. Así, la acumulación de DHAP se pudo medir mediante un
ensayo enzimático basado en la reducción de la DHAP catalizada por
la \alpha-glicerofosfato deshidrogenada
(\alpha-GDH) con oxidación concomitante de NADH a
NAD^{+}, monitorizando la bajada de absorbancia a 340 nm
(Bergmeyer, H. U., (1984) Methods of Enzymatic Analysis vol. 2, 3rd
ed.; Verlag Chemie: Deerfield, FL). Los ensayos se realizaron a
temperatura ambiente midiendo la absorbancia a 340 nm durante 15
minutos en una mezcla de reacción de 1 mL que contiene: la alícuota
de reacción; Tris-HC1 40 mM, pH 8.0; NADH 0.2
\mumol y \alpha-GDH/TIM (2 U). Para medir el
consumo de DHA es necesario añadir DHAK 0.375 U; ATP 5 \mumol y
MgSO_{4} 3.75 \mumol a la mezcla de valoración. Por otro lado,
la acumulación de aldol se midió usando la actividad retroaldólica
de la aldolasa. En este caso, fue necesario añadir a la mezcla de
valoración 0.05 U de aldolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de la enzima bifuncional
aldolasa-DHAK se eligieron para la actividad
aldolasa la enzima Fuculosa 1-fosfato aldolasa de
E. coli y para la actividad quinasa la enzima DHAK de
Citrobacter freundii. La aldolasa de E. coli es un
tetrámero, mientras que la quinasa de C. freuundii es un
dímero. Para conseguir la proteína quimérica se siguió el método de
los cuatro primers. Con la primera reacción de PCR se construyeron
los fragmentos correspondientes a los dos genes con el conector
fusionado en los extremos 3' (carboxilo-terminal) en
el caso de la Fuc-IPA y en el extremo 5'
(amino-terminal) de la DHAK. El conector es un
pequeño fragmento de cinco aminoácidos
(Gln-Gly-Gln-Gly-Gln)
y se diseñó con el programa LINKER. Una vez purificados los
fragmentos, se procedió a realizar la segunda reacción de PCR en la
que se consiguió fusionar ambos dominios gracias a la
complementariedad del conector. Este fragmento de 2346 pb se
denominó dkfa. El fragmento se purificó y clonó en el vector
pGEM®-T Easy (3,0 kb) para su secuenciación. Se obtuvieron los
plásmidos pGdkfa (5,3 kb) y se transformó con ellos la cepa
XL1-Blus MRF' de Escherichia coli.
El gen dkfa se subclonó en el vector
pRSET-A (2,9 kb). Mediante digestión del plásmido
pGdkfa02 con XhoI y HindIII se liberó el gen
dkfa, que se ligó con el vector previamente digerido con los
mismos enzimas, obteniéndose el plásmido pRdkfa (5,2 kb), con
el que se transformó la cepa BL21(DE3) de E. coli. Una
ventaja adicional de este vector es que la proteína se produjo
fusionada a un pequeño péptido en el extremo
N-terminal que contenía seis histidinas presentando
una alta afinidad por cationes divalentes (Ni^{+2}, Ca^{2+},
Mg^{2+}, etc.), facilitando de esa forma, la purificación de la
proteína mediante cromatografía de afinidad a iones inmovilizados
(IMAC).
Para la sobreexpresión de la proteína quimérica
se crecieron cultivos de varios clones BL/pRdkfa en medio LB
conteniendo 250 \mug mL^{-1} de ampicilina (LBA). La expresión
de las proteínas se encontraba bajo control del promotor T7,
reconocido de manera específica por la
T7-RNA-polimerasa presente en la
propia cepa de E. coli, siendo esta inducible con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG).
Los cultivos se dejaron toda la noche en
agitación a 30ºC. Posteriormente se realizaron lisis de los cultivos
anteriores con ánimo de separar las proteínas solubles de los
cuerpos de inclusión. El análisis por SDS-PAGE
reveló la existencia de una banda de sobreexpresión debida a la
adición de IPTG en las fracciones correspondientes a los cuerpos de
inclusión (agregados insolubles e inactivos de proteína).
Para intentar replegar los cuerpos de inclusión
se procedió a su desnaturalización/renaturalización con diferentes
métodos in vitro. Primero, el clon que mayor proporción de
proteína recombinante expresaba, se creció en medio LBA, los pellets
que se obtuvieron se separaron de la fracción de proteínas solubles
y se lavaron con una disolución de Tris-HCl 25 mM,
pH 7.7, urea 2 M (50 mL g^{-1} células) y se agitaron a
temperatura ambiente (TA) durante 30 min. Se centrifugaron a 12000 g
durante 30 min. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió en una
disolución de Tris-HCl 25 mM, pH 7.7; urea 2 M;
Tritón X-100 al 0,5% (50 mL g^{-1} células). Se
dejó en agitación a TA durante 20 min y se centrifugó a 12000 g
durante 15 min. El sobrenadante se decantó y los cuerpos de
inclusión se resuspendieron en una disolución del agente
desnaturalizante: Tris-HCl 10 mM, pH 8.0; cloruro de
guanidinio (GdmCl) 6 M o Tris-HCl 10 mM, pH 8.0;
urea 8 M. Se dejaron agitando a temperatura ambiente hasta que se
disolvieron y se centrifugaron a 4000 g durante 30 min. Una vez
purificados y solubilizados los cuerpos de inclusión, se procedió a
su replegamiento mediante la eliminación progresiva del agente
desnaturalizante a través de diálisis. A continuación se mezclaron 5
mL de cuerpos de inclusión solubles con 5 mL de diferentes tampones,
dependiendo de las condiciones de replegamiento de los mismos: A
(Tris-HCl 20 mM pH 7.5), B (Tris-HCl
20 mM pH 7.5; Tritón X-100, 20, C
(Tris-HCl 20 mM pH 7.5; Brij 58, 10%) y D
(Tris-HCl 20 mm pH 7.5; Tritón
X-100, 0,2%; glicerol, 40%). La mezcla de 10 mL se
introdujo en una tripa de diálisis y se lavó en 1 L de tampón
durante 2 h agitando suavemente. Una vez pasado el tiempo, se
recambió el tampón y se dejó 2 h en agitando suave. Después de las
dos horas, el contenido de la tripa se centrifugó a 12000 g durante
30 min y se reservaron los sobrenadantes, que contendrían las
proteínas solubles y plegadas.
En algunos casos se comprobó que la proteína
había replegado. En el resto se observó la aparición de agregados de
proteína, consecuencia de un incorrecto plegamiento. Para comprobar
si el plegamiento era o no correcto y ambos dominios poseían
actividad enzimática se procedió a detectar ambas actividades
mediante un ensayo espectrofotométrico donde fueron ensayadas las
actividades Fuc-1P aldolasa y DHAK, pero no se
detectó ninguna de las dos. Esto podría deberse a que la
construcción no resultó funcional o a que el plegamiento in
vitro no correspondía al plegamiento que pudiese darse in
vivo.
Para comprobar esto último se decidió utilizar
chaperonas moleculares para facilitar el plegamiento de la proteína
de fusión. Se ha descrito, en muchos casos, que el empleo de estas
proteínas favorece el plegamiento in vivo de las proteínas
recombinantes. Con ánimo de ensayarlo, se procedió a la
transformación de la cepa BL/pRdkfa06.2 con dos plásmidos, pAG y
pAKJ que codifican para los sistemas de chaperonas GroEL/GroES y
DnaK/DnaJ, respectivamente. Para ambos plásmidos se obtuvieron
colonias BLpRdkfa/pAG y BLpRdkfs/pAKJ. Se crecieron cultivos de los
diferentes clones positivos en medio LB con 250 \mug mL^{-1} de
ampicilina y 34 \mug mL^{-1} de cloranfenicol. La expresión de
las chaperonas se indujo con L-arabinosa
(L-ara), y posteriormente se indujo la expresión de
la Proteína quimérica mediante adición de IPTG. En ambos casos las
chaperonas resultaron inefectivas para producir el correcto
plegamiento de la proteína quimérica.
Con estos resultados se concluyó que debido a
que las dos proteínas implicadas en fusión de proteínas para la
formación de la proteína quimérica eran proteínas multíméricas, se
forman agregados macromoleculares que resultan insolubles e
inactivos.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNA QUIMÉRICA ALDOLASA/QUINASA,
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P200701589
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión
aldolasa-DHAK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(851)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(551)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento del gen dihidroxiacetona
quinasa de Citrobacter freundii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (552)..(556)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región conectora
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (557)..(851)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento del gen fructosa
1-6 bifosfato aldolasa de Stafilococcus
carnosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Proteína quimérica útil para la formación de
enlaces C-C caracterizado porque comprende,
al menos:
- i)
- una secuencia de aminoácidos de una dihidroxiacetona quinasa,
- ii)
- una secuencia de aminoácidos de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- iii)
- una secuencia conectora L de las secuencias de aminoácidos de i) y ii).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proteína quimérica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia de aminoácidos codificante
de la aldolasa es la de la fructosa 1,6-bifosfato
aldolasa monomérica de la bacteria Staphylococcus carnosus o
de un fragmento de dicha secuencia, o una secuencia de aminoácidos
análoga, o una secuencia de aminoácidos que codifica para una
variante, natural o artificial o de un fragmento de la misma.
3. Proteína quimérica según las reivindicación
1 caracterizada porque la secuencia de aminoácidos
codificante de la dihidroxiacetona quinasa es la de la
dihidroxiacetona quinasa de la bacteria Citrobacter freundii
cepa CECT 4626 o procedente de cualquier microorganismo, o de un
fragmento de dicha secuencia, o una secuencia de aminoácidos
análoga, o una secuencia de aminoácidos que codifica para una
variante, natural o artificial o de un fragmento de la misma.
4. Proteína quimérica según las reivindicación
1 caracterizada porque la secuencia conectora L de
aminoácidos entre las secuencias de la fructosa
1,6-bifosfato aldolasa monomérica y dihidroxiacetona
quinasa, es la secuencia
Gln-Gly-Gln-Gly-Gln.
5. Proteína quimérica según la reivindicación 1
caracterizada por presentar la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de obtención de la proteína
quimérica según las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizado
porque comprende las siguientes etapas:
- -
- diseño de oligonucleótidos específicos conteniendo una secuencia conectora, preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln,
- -
- amplificación por PCR por separado del gen dhak, dihidroxiacetona quinasa, de Citrobacter freundii CECT 4626 y de un gen de un enzima con actividad fructosa 1-6 bisfosfato aldolasa, preferentemente, el gen fda de Staphylococcus carnosus,
- -
- introducción en los extremos 3' de la quinasa y 5' de la aldolasa de la secuencia conectora, preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln, y purificación de los fragmentos,
- -
- amplificación por PCR de la secuencia de nucleótidos del Proteína quimérica de la invención, preferentemente la construcción DHAK-L-FDA, SEQ ID NO:1,
- -
- introducción de la secuencia de nucleótidos del Proteína quimérica en un vector de expresión, transformación de una célula, ya sea eucariota o procariota, y producción y purificación de la proteína resultante, preferentemente la proteína de SEQ ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína quimérica según las reivindicaciones 1 a la 5
caracterizada porque comprende:
- i)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una dihidroxiacetona quinasa,
- ii)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y
- iii)
- una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia conectora L intercalada entre las secuencias i) y ii).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de la aldolasa es la fructosa
1,6-bifosfato aldolasa monomérica de la bacteria
Staphylococcus carnosus y la dihidroxiacetona quinasa es la
dihidroxiacetona quinasa de la bacteria Citrobacter freundii
cepa CECT 4626.
9. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de la aldolasa y de la quinasa pueden contener la
secuencia completa o de un fragmento de dicha secuencia, o una
secuencia de nucleótidos análoga, o una secuencia de nucleótidos que
codifica para una variante, natural o artificial, o de un fragmento
de la misma, procede de cualquier microorganismo.
10. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de la quinasa procede de cualquier microorganismo.
11. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7 caracterizada porque la región conectora L
es la secuencia
Gln-Gly-Gln-Gly-Gln.
12. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7 caracterizada por presentar la secuencia de
nucleótidos SEQ ID NO:1.
13. Vector de expresión caracterizado
porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a la 12, preferentemente un plásmido.
14. Vector de expresión según la reivindicación
13 caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO:1.
15. Célula o microorganismo transformado
caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos
según cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 12 o un vector según
cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14.
16. Célula o microorganismo transformado según
la reivindicación 15 caracterizado porque comprende la
secuencia SEQ ID NO:1.
17. Uso de la proteína quimérica según las
reivindicaciones 1 a la 5 en una reacción de adición aldólica a
partir de una dihidroxiacetona donadora y un aldehído aceptor, para
la obtención de nuevos compuestos químicos.
18. Uso de la proteína quimérica según la
reivindicación 17 caracterizado porque el enzima presenta la
secuencia SEQ ID NO:2.
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|---|---|---|---|
| ES200701589A ES2335951B1 (es) | 2007-06-08 | 2007-06-08 | Proteina quimerica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtencion y susaplicaciones. |
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|---|---|---|---|
| ES200701589A ES2335951B1 (es) | 2007-06-08 | 2007-06-08 | Proteina quimerica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtencion y susaplicaciones. |
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|---|---|
| ES2335951A1 ES2335951A1 (es) | 2010-04-06 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| DE4304097A1 (de) * | 1993-02-11 | 1994-08-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat aus Glycerinphosphat und seine Verwendung in enzymatischen Aldoladditionen |
-
2007
- 2007-06-08 ES ES200701589A patent/ES2335951B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
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| BREUER M and HAUER B. Carbon-carbon coupling in biotransformation. Current Opinion in Biotechnology. 2003, Vol 14, páginas 570-576, todo el documento. * |
| FESSNER WD and HELAINE V. Biocatalytic synthesis of hydroxylated natural products using aldolases and related enzymes. Current Opinion in Biotechnology. 2001, Vol 12, páginas 574-586, todo el documento. * |
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| ES2335951A1 (es) | 2010-04-06 |
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