WO2000047746A1 - Procede de production de coenzyme q10 - Google Patents

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WO2000047746A1
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diphosphate synthase
seq
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Hideyuki Matsuda
Makoto Kawamukai
Reika Yajima
Yasuhiro Ikenaka
Kenichi Nishi
Junzo Hasegawa
Satomi Takahashi
Original Assignee
Kaneka Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure

Definitions

  • the present invention relates to Coenzyme which is used as a medicine or the like. Related to the manufacture of. For more information, Koenzim. Is a key enzyme involved in the biosynthesis of yeast.
  • a gene encoding a side chain synthase that is, a gene encoding decaprenyl diphosphate synthase, is isolated from a bacterium belonging to the family aceae, and introduced into a microorganism to obtain coenzyme.
  • the method for generating a side chain synthase that is, a gene encoding decaprenyl diphosphate synthase
  • Koenzym Q i The most effective method is to cultivate microorganisms and extract this substance from the microorganisms, which are known to be produced by a very wide range of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast to higher plants and animals. It is considered to be one of the two manufacturing methods, and is also used in actual industrial production. However, with these methods, the productivity was not good due to the low yield and the complicated operation.
  • Coenzym Q The biosynthetic pathways of some organisms differ slightly between prokaryotes and eukaryotes, but all are produced by multi-step complex reactions involving many enzymes. Basically, there are basically three steps: Koenzim Q ⁇ .
  • genes of decaprenyl diphosphate synthase include:
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems relating to production, and it is intended to provide a coenzyme Q i derived from a bacterium belonging to the family 73 ⁇ 4i iaceae. By isolating the side chain synthesis gene and using it, it can be used by microorganisms. The aim is to produce efficiently.
  • a bacterium belonging to the family 1 ⁇ 2iz ⁇ iaceae is used.
  • the gene is introduced into a microorganism such as Escherichia coli and expressed, thereby obtaining a congenium. Can be produced efficiently.
  • the present inventors have proposed Koenzim Q 1 . Were produced in relatively large amounts, and repeated studies were conducted to isolate the decaprenyl diphosphate synthase gene from bacteria belonging to the family Rhizobiaceae, and succeeded in isolating the gene.
  • the present invention provides a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a DNA having a deletion, addition, or insertion of one or more bases with respect to this sequence and having a DNA sequence encoding decaprenyl diphosphate synthase. I do.
  • the present invention also relates to a tandem having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence having a deletion, addition, or insertion of one or more amino acids with respect to this sequence and having decaprenyl diphosphate synthase activity.
  • the present invention also provides DNA and DNA encoding this amino acid sequence.
  • the present invention further comprises a step of introducing the DNA sequence into a host microorganism and culturing the host microorganism. And a method for producing the same.
  • the host microorganism used in the method of the present invention is not particularly limited, but Escherichia is preferably used.
  • the Koeshizaimu Q for the production of normal £ sc? Ar'a3 ⁇ 4ia co i is a Koenza I-time Q 8, by the method of the present invention, Koenzaimu. Can be produced.
  • the present invention provides an expression vector containing the above DNA sequence.
  • the expression vector of the present invention any of conventionally known vector systems may be used.
  • pQAD'l obtained by introducing the sequence of SEQ ID NO: 1 into an expression vector pUCNT is provided.
  • the present invention also provides a host microorganism transformed with the above DNA sequence. Escherichia is preferably used as the host microorganism of the present invention.
  • FIG. 1 shows a restriction map of pQAD1, a plasmid having a decaprenyl diphosphate synthase gene.
  • Figure 2 shows Coenzyme Qi produced in recombinant E. coli into which the gene for decaprenyl diphosphate synthase was introduced.
  • Fig. 2 shows a chart in which was detected by high-speed liquid mouth chromatography.
  • the present inventors have proposed Koenzim Q. Investigations for isolating this enzyme gene from bacteria belonging to the family Rhizobiaceae, which produces relatively large amounts of, produced a fragment of the gene by the PCR method.
  • the chromosomal gene of Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) was cut with the restriction enzyme EcoRI and inserted into a lambda phage vector to obtain a recombinant phage live. A rally was made. After transferring the plaque to a nylon membrane and performing plaque hybridization using the labeled PCR fragment, a clone having the full length of the decaprenyl diphosphate synthase gene can be obtained.
  • the gene downstream of an appropriate promoter In order to express the decaprenyl diphosphate synthase gene, it is necessary to connect the gene downstream of an appropriate promoter.For example, a DNA fragment containing the gene is cut out with a restriction enzyme, or the enzyme is encoded by PCR. By amplifying only the gene portion and then inserting it into a vector having a promoter, the expression vector can be obtained.
  • a specific example is the expression vector p
  • pQAD1 an expression vector for the decaprenil diphosphate synthase gene
  • UCNT UCNT
  • pQAD1 an expression vector for the decaprenil diphosphate synthase gene
  • pQAD1 an expression vector for the decaprenyl diphosphate synthase gene
  • the enzyme is not originally produced by Escherichia coli.
  • convert the production amount of Koen Zaimu Q 8 E. coli is produced originally to significant amounts production exceeding much ⁇ ? Wear.
  • This Escherichia coli ⁇ Escherichia coli HB101P QAD1 is the Ministry of International Trade and Industry, FERM BP-65838 has been deposited with the National Institute of Technology.
  • a better effect can be expected by using the gene provided by the present invention alone or introducing it into a microorganism and expressing it at the same time as other genes involved in biosynthesis.
  • Koenzaimu Q i Q of the present invention by culturing a host microorganism obtained by introducing a gene, Koenzaimu. Is produced.
  • the culture conditions for the host microorganism are not particularly limited, and may be appropriately determined depending on the selected host. Such cultivation conditions are well known to those skilled in the art.
  • the host microorganism is recovered and condensed by an appropriate method. Is isolated and purified. Methods for isolating Enzymes Q from host microorganisms are well known to those skilled in the art.
  • Example 1 Chromosomal DNA of Agrobacterium sp. KNK712 was prepared by the method of Marmur et al. (J. Mol. Biol., Vol. 3, pp. 208-218, (1961)).
  • Primers DPS-1 (5, -AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT-3 ') and DPS-2 (5'-AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3'), which are used for PCR, were designed based on homology with the gene of a known long-chain prenyl diphosphate synthase. .
  • R indicates A or G
  • Y indicates C or T
  • ⁇ indicates G, A, T or C.
  • PCR (94 ° C, 1 minute— (94 ° C, 1 minute ⁇ 50 ° C, 1 minute ⁇ 70 ° C, 1 minute): 25 cycles repeated ⁇ 4 ° C) was performed, and 0 Analyzed by 8% agarose gel electrophoresis.
  • the obtained fragment of about 40 Obp was excised from the gel, purified using a DNA extraction kit (Takara Shuzo), and the DNA base sequence was sequenced by DNA sequencer DNA (373A, Applied Biosystems).
  • Example 2 A primer for PCR NQE-11 (having the sequence of 5'-AAGTCCACCGCCCGCACGATCT-3 ') and 0.25 g of chromosomal DNA of Agrobacterium sp.
  • PCR using (5'-CCGAGGTTCATGCCGTAGGATTTT sequence) (94 ° C, 1 minute ⁇ (94 ° C, 1 minute ⁇ 4O, 1 minute ⁇ 60 ° C, 2 minutes): 25 cycles repeated—60 (5 ° C, 5 minutes ⁇ 4 ° C), perform gel electrophoresis with 4% Nusieve 4: 1 agarose (Takara Shuzo), cut out a fragment of about 320 bp from the gel, and extract DNA from DNA (Takara Shuzo) Purified using About 25 ng of this DNA fragment was labeled with [ ⁇ -32P] d CTP using a Megaprime TM DNA labeling system (Amersham).
  • Example 3 The chromosomal DNA of Agrobacterium sp. KNK712 was cut with restriction enzymes EcoR I, Sac I, Not I, and Xho I, and electrophoresis was performed using 0.8% agarose gel. The gel was denatured with alkali (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl), neutralized (0.5 M Tris ⁇ HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl), and then Hybond N + fino letter (Amersham) was transferred to a gel and subjected to Southern transfer using 10 XSSC.
  • alkali 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
  • neutralized 0.5 M Tris ⁇ HCl (pH 7.5), 1.5 M NaCl
  • Hybond N + fino letter (Amersham) was transferred to a gel and subjected to Southern transfer using 10 XSSC.
  • prehybrid soy solution (20 XSSC (3 M NaCl, 0.3 M trisodium citrate. Dihydrate, pH 7.0), 15 ml, 5 ml of 10% SDS (sodium dodecyl sulfate), 5 OX Denhardt's solution (10 g / 1 ficoll (Ficol® Type 400, Pharmacia), 1 Og / 1 polybierpyrrolidone, 10 g / l ⁇ serum albumin (Fraction V, Sigma) 5 ml, 10 mg / ml salmon sperm DNA (heated at 95 ° C for 5 minutes, quenched in ice and thermally denatured) 0.5 °, 24.5 ml of water at 60 ° C, 4 hours Prehybridized probe is heated at 95 ° C for 5 minutes, quenched in ice, added to the prehybridized solution of the prehybridized filter, and
  • This filter was washed twice at room temperature with a solution containing 0.5% SDS added to 5XSSC, and then gradually heated from 60 ° C to 75 ° C using a solution containing 1% SDS added to 1XSSC. It was washed while raising. After drying this filter, the filter was exposed to light by closely adhering to an X-ray film, and a band exposed to black was detected. As a result, a fragment of about 7.2 kb cut with the restriction enzyme EcoR I, about 4.7 kb cut with Sac I, about 8.3 kb cut with Not I, and about 4.7 kb cut with Xho I was strongly hybridized.
  • Example 4 The chromosome DNA of Agrobacterium sp.KNK7 12 was cut with a restriction enzyme EcoRI, and gel electrophoresis was performed with 0.8% agarose.
  • the A fragment was excised from the gel and purified to prepare a DNA fragment used for cloning.
  • This DNA fragment was incorporated into the EcoRI site of the phage using a ZAPRII phage kit (Strategene) and packaged with an in vitro packaging kit (Amersham). Then, infect E. coli XL1-Blue MRF and infect NZY plate medium (5 g / l NaCl, 2 g / 1 MgS04 ⁇ 7H20, 3 ⁇ 4g / 1 yeast extract, 1 Og / 1 NZamine, 18 g / 1 agar ( pH7.5)) and overlaid with NZY soft agar medium (NZG plate agar only 8 g / 1) to form plaques.
  • NZY soft agar medium NZY soft agar medium
  • prehybridization and hybridization using a labeled probe were performed in the same manner as in Example 3, and the filters were washed. After this filter was dried, it was exposed to X-ray film in close contact with it, and phage plaques corresponding to black-exposed spots were separated. The phage of the separated plaque was infected with Escherichia coli in the same manner as described above to form a plaque, copied to a filter, re-hybridized, and confirmed. As a result, 12 strains of phage could be selected.
  • phagemid was prepared for the two strains according to the instruction manual of the ⁇ -ZAPRII phage kit.
  • Example 5 The DNA base sequence of the gene of decaprenyl diphosphate synthase was sequenced using the two prepared phagemid DNAs in the same manner as in (Example 1). The nucleotide sequence of about 1.6 kb DNA of the inserted DNA fragment was determined, and the result of ⁇ is shown in Sequence Listing, SEQ ID NO: 1. Also predicted from this DNA sequence The resulting amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 1 shows a restriction map of the obtained expression vector, pQAD1.
  • DPS means the coding region of decaprenyl diacid.
  • Expression vector pQAD1 of the prepared decaprenyl diphosphate synthase gene was introduced into Escherichia coli HB101, and cultured with shaking at 37 ° C and culture medium at 110111 in 8 medium. The bacteria were collected by centrifugation (3000 rpm, 20 minutes).
  • the cells were suspended in 1 ml of a 3% aqueous sulfuric acid solution, and heat-treated at 120 ° C for 30 minutes.
  • the resulting recombinant Escherichia coli strain ⁇ scAaric a coli HB101 pQAD1 was deposited on October 1, 1999 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (Accession number: FERM BP- 6538).
  • Coenzym Q i A gene encoding decaprenyl diphosphate synthase, a key enzyme involved in the biosynthesis of Escherichia coli, was isolated from Bacillus / family bacteria and sequenced. In addition, they were successfully introduced into E. coli and expressed. Coenzyme used as a drug or the like by using the gene and the method of the present invention. Can be manufactured efficiently.
  • Escherichia coli HB101 pQAD1 was deposited on October 1, 1999 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry.
  • the accession number is FERM BP-6538.

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Description

明 細 書 コヱンザィム 。の製造法
技術分野
本発明は、 医薬品等として用いられているコェンザィム 。の製造に関する。 さらに詳細には、 コェンザィム 。の生合成に関するキー酵素であるコェンザ ィム 。側鎖合成酵素、 すなわちデカプレニルニ燐酸合成酵素をコードする遺 伝子を^ り aceae科に属する細菌より単離し、 これを微生物に導入することに よりコェンザィム 。を生成させる方法に関する。
背景技術
従来のコェンザィム Q ι。の製造法は、 タバコなどの植物由来のコェンザィム を単離してその側鎖長を合成法により調製する等によって工業的には生産されて いる。
また、 コェンザィム Q i。は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るき わめて幅広い生物により生産されることが知られている力 微生物を培養してそ の菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、 実際の工業的な生産にも用いられている。 し力 しながら、 これらの方法では、 生 成量が少なかったり、 操作が煩雑であったりして、 生産性が良くなかった。 コェンザィム Q 。の生物による生合成経路にっ 、ては、 原核生物と真核生物 では一部異なっているが、 いずれも多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応に よって生成されている。 し力 し、 基本的には大きく 3つのステップ、 すなわち、 コェンザィム Q ι。のプレニル側鎖のもとになるデカプレニルニ燐酸を合成する ステップ、 キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、 そして、 これらの 2つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコェンザィム 。を完成させるステップよりなっている。 これらの反応の中で、 生合成反応 全体の律速であると言われ、 コェンザィム Q 。の側鎖の長さを決定している反 応、 すなわちデカプレニルニ憐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考え られる。 そこで、 コェンザィム Q 1 0を効率よく生産させる為には、 生合成に関 与するキ一遺伝子、 デカプレニルニ燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に 利用することが有効であると考えられるが、 その遺伝子源としてはコェンザィム
。を比較的多量に生産している
Figure imgf000004_0001
な候補と なる。
これまでにデカプレニルニ燐酸合成酵素の遺伝子としては、
Schizosaccaro yces pombe (特開平 9—1 7 3 0 7 6 ) Gl uconoba cter suboxydans (特開平 1 0 - 5 7 0 7 2 ) などいくつかの種類の微生物より分離さ れているが、 本来これらの微生物ではコェンザィム Q 。の生産性が十分とはレヽ えず、 これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。 そ こで、 さらにコェンザィム 。を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離 することが望まれていた。.
発明が解決しようとする課題
本発明は、 上記の生産に関する問題を解決するべく、 7¾i iaceae科に属する 細菌由来のコェンザィム Q i。の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用すること により、 微生物によってコェンザィム 。を効率よく生産することを目的とす る。
上記目的を達成する為に、 本発明では、 まず、 ½iz^iaceae科に属する細菌よ りコェンザィム 。の生合成に関与するキー遺伝子、 デカプレニルニ憐酸合成 酵素の遺伝子を単離した。 そして、 該遺伝子を大腸菌などの微生物に導入して発 現させることにより、 コェンザィム 。を効率よく生産させることが可能とな つた。
発明の開示
本発明者らは、 コェンザィム Q 1。を比較的多量に生産 て、、る Rhizobiaceae 科に属する細菌からデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子を分離するための検討を 重ね、 該遺伝子を分離することに成功した。
即ち本発明は、 配列番号 1に記載の D N A配列、 およびこの配列に対し 1また は複数の塩基の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素をコード する D N A配列を有する D N Aを提供する。 本発明はまた、 配列番号 2に記載の アミノ酸配列、 およびこの配列に対し 1または複数のアミノ酸の欠失、 追加、 挿 入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列を有するタン パク質、 さらにこのアミノ酸配列をコードィ匕する DN Aを提供する。
本発明はさらに、 上記 DN A配列を宿主微生物に導入し、 該宿主微生物を培養 する工程を含む、 コェンザィム 。の製造方法を提供する。 本発明の方法にお いて用いる、 宿主微生物としては特に限定されないが、 Escherichia が好適 に用いられる。 通常の £sc?ar'a¾ia co iの産生するコェシザィム Qは、 コェンザ ィム Q8であるが、 本発明の方法によって、 コェンザィム 。を産生させること が可能となった。
さらに本発明は、 上記 DN A配列を含有する発現べクタ一を提供する。 本発明 の発現ベクターは、 従来知られているベクター系いずれを用いても良く、 例えば 発現用べクタ一 pUCNTへ配列番号 1の配列を導入してなる、 p QAD'lが提 供される。
本発明は、 上記 DNA配列にて形質転換された宿主微生物もまた、 提供する。 本発明の宿主微生物としては、 Escherichia が好適に用いられる。
図面の簡単な説明
図 1はデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子を持つプラスミ ド、 p QAD lの 制限酵素地図を示す。
図 2はデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌において、 生産されたコェンザィム Q i。を高速液体ク口マトグラフィ一によつて検出した チャートを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 コェンザィム Q 。を比較的多量に生産している Rhizobiaceae 科に属する細菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、 P C R 法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。
既知のデカプレニルニ燐酸合成酵素、 及び本酵素と類縁で鎖長の違うコェンザ ィム Qの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニルニ燐酸合成酵素の遺伝子の 配列を比較し、 その相同性の高 、領域について PCRプライマーを各種合成した。 そしてこれらのプライマ一を種々組み合わせ、 PCRの条件をいろいろ検討した ところ、 プライマー DPS - 1 (5' -AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT- 3 ' )及 U¾PS - 2 (5' -AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3 ' )を用い （なお、 ここで示した配列中の、 Rは Aまたは G、 Yは Cまたは T、 そして Nは G、 A、 Tまたは Cを示す。 ） 、 PCRを 9 4°C、 1分間の熱処理の後、 94°C、 1分→50°C、 1分→70°C、 1分のサイ クルを 25回繰り返すことにより、 ^ 科に属する細菌、
Agrobacterium sp. KNK71 2 (FERM BP- 1 900) の染色体遺伝子から本酵素 遺伝子の約 400 bpの断片が増幅してくることを、 その遺伝子の塩基配列を角晰 することにより明らかにした。
そこで次に本酵素遺伝子の全長を取得するために、 Agrobacterium sp. KNK 7 1 2 (FERM BP- 1 900 )の染色体遺伝子を制限酵素 EcoRIで切断し、 ラムダファ —ジベクターに挿入して組換えファージライブラリーを作製した。 そのプラーク をナイロン膜に転写した後、 標識した該 PCR断片を用いてプラークハイブリダ ィゼーシヨンを行えば、 デカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローン を取得することができる。
得られたクローンに含まれるデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子について塩基 配列の決定を行ったところ、 配列表、 配列番号 1に示した配列を持つことが明ら かとなり、 この配列から予想できるァミノ酸配列にはデカプレニルニ燐酸合成酵 素の遺伝子として特徴的な配列がみられた。
デカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、 適当なプロモータ —の下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、 例えば遺伝子を含む D N A 断片を制限酵素によって切り出したり、 P C Rによって酵素をコードする遺伝子 部分のみを増幅させたりした後、 プロモーターを持つベクターに挿入することに より発現べクタ一とすることができる。 具体的な例としては、 発現用ベクター p
UCNT (WO 94/03 6 1 3に記載） に該遺伝子を挿入すれば、 デカプレニ ルニ燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、 p QAD 1を作製することができる。 そして、 該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコ ェンザィム Q10の生産に利用することが可能となる。 例えば、 デカプレニルニ 燐酸合成酵素遺伝子の発現べクター、 p Q AD 1を大腸菌に導入した場合には、 大腸菌が本来は生産しないコェンザィム 。を、 大腸菌が本来生産するコェン ザィム Q 8の生産量を遙かに上回る著量生産するように変換 ^？きる。 この大腸菌 ^^Escherichia coli HB 1 0 1 p QAD lは通商産業省、 工業技術院、 生命 工学工業技術研究所に FERM BP- 6 53 8として寄託されている。
本発明で提供される遺伝子は単独で用いるほか、 他の生合成に関与する遺伝子 と同時に微生物に導入して発現させることにより、 さらに良い効果が期待できる。 本発明のコェンザィム Q i Qの製造法においては、 遺伝子を導入した宿主微生 物を培養して、 コェンザィム 。を産生させる。 宿主微生物の培養条件として は、 特に限定的ではなく、 選択した宿主に応じて適宜決定すればよレ、。 かかる培 養条件は当業者によく知られている。 培養後、 宿主微生物を回収し、 適当な方法 にてコェンザィム 。を単離、 精製する。 宿主微生物からコェンザィム Q類を 単離する方法は、 当業者によく知られている。
実施例
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 以下の実施例は発明の説 明のためのものであり、 本発明をいかなる意味においても制限するものではなレ、。
(実施例 1) Agrobacterium sp. KNK71 2の染色体 DNAを Marmurらの方法 (J.Mol.Biol.,第 3卷、 208頁- 21 8頁、 （1 96 1年）） で調製した。 既知 の長鎖プレニルニ燐酸合成酵素の遺伝子との相同性から P C Rに用いるプライマ 一 DPS - 1 (5, -AAGGATCCTNYTNCAYGAYGAYGT- 3 ' )及ひ DPS- 2 (5' - AAGGATCCTCRTCNACNARYTGRAA-3 ' ；)を設計した。 なお、 ここで示した配列中の、 R は Aまたは G、 Yは Cまたは T、 そして Νは G、 A、 Tまたは Cを示す。 これらを用いて P CR(94°C、 1分—（94°C、 1分→50°C、 1分→70°C、 1分）： 25サイク ル繰り返し→ 4 °C)を行い、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動により分析した。 そ して得られた約 40 Obpの断片をゲルより切り出して DNA抽出キット（宝酒造 製）を用いて精製した後、 D N A塩基配列を DN Aシークェンサ一（3 73 A型、 アプライドバイオシステム社製）を用い、 DNAシークェンスキット （アプライ ドバイオシステム社製、 ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit With AmpliTaqR DNA polymerase, FS)を使用して、 その取り扱い 説明書に従って反応を行い配列を決定した。 その結果、 配列表、 配列番号 1の 5 1 4から 905までの塩基配列に示す配列が得られた。 この翻訳配列に長鎖プレ 二ル鎖を持つプレニルニ憐酸合成酵素に特徴的な領域の配列" VGDF LLG" および" EGEVLQL" が見出せたことにより、 得られた配列はデカプレニル 二燐酸合成酵素の遺伝子の一部であることが同定された。
(実施例 2) Agrobacterium sp. 匿 7 1 2の染色体 DNA0. 2 5 gを用い、 PCR用のプライマ一 NQE- 1 1 (5' -AAGTCCACCGCCCGCACGATCT- 3 ' の配列を持 つ）及び NQE- 1 2 (5' - CCGAGGTTCATGCCGTAGGATTTTの配列を持つ）を用いて P C R (94°C、 1分→(94°C、 1分→4O 、 1分→60°C、 2分）： 25サイクル繰 り返し— 60°C、 5分→4°C)を行い、 4% Nusieve 4 : 1 ァガロース（宝酒造 製）によるゲル電気泳動を行い、 約 3 20 bpの断片をゲルより切り出して DN A 抽出キット（宝酒造製）を用いて精製した。 この DNA断片約 25ngを用い、 メガ プライム TM · DNAラベリングシステム （アマシャム社製） を用いて 〔α- 3 2 P〕 d CTPで標識した。
(実施例 3) Agrobacterium sp. KNK 7 1 2の染色体 DNAを制限酵素 EcoR I、 Sac I、 Not I、 Xho Iで切断し、 0. 8 %ァガロースゲルを用いた電気泳動を行つ た。 このゲルをアルカリ（0. 5M NaOH、 1. 5M NaCl)で変成させ、 中和（0. 5M Tris · HCl(pH7. 5)、 1. 5M NaCl)した後、 ハイボンド N +フイノレター（アマシ ャム社製）をゲルに重ね、 1 0 XSSCを用いてー晚、 サザントランスファ一させ た。 そのフィルターを乾燥し、 80°Cで 2時間焼付けを行った後、 プレハイプリ ダイズ液 （20 XSSC (3M NaCl、 0. 3 Mクェン酸 3ナトリウム . 2水和物、 pH 7. 0) 1 5ml, 1 0% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム） 5ml、 5 O X Denhardt's液 （ 1 0 g/1 フイコール（FicolR Type 400、 フアルマシア社）、 1 Og/1ポリビエルピロリ ドン、 1 0g/l ゥシ血清アルブミン（Fraction V、 シグマ 社)） 5 ml, 10 mg/ml サケ精子 D N A ( 95°Cで 5分間加熱後、 氷中で急冷 し熱変成したもの） 0. 5ml、 水 24. 5ml) を用いて 60°C、 4時間プレハイ 標識したプロ一ブを 9 5 °Cで 5分間加熱後、 氷中で急冷し、 プレハイブリダイ ズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に'添加し、 60 °Cで 22時間ハイ プリダイズさせた。 このフィルターを 5 X S S Cに 0. 5% SDSを添加した 溶液を用い室温で 2回洗浄後、 1 XS S Cに 0. 1% SDSを添加した溶液を 用い 60°Cから 75°Cまで徐々に を上げながら洗浄した。 このフィルタ一を 乾燥後、 X線フィルムに密着させて感光させ、 黒く感光したバンドを検出した。 その結果、 制限酵素 EcoR Iで切断した約 7. 2 k b、 Sac Iで切断した約 4. 7 k b、 Not Iで切断した約 8. 3 k b、 Xho Iで切断した約 4. 7 k bの断片に強く ハイブリダィズしていた。
(実施例 4) Agrobacterium sp. KNK7 1 2の染色体 D N Aを制限酵素 EcoR I で切断し、 0. 8%ァガ口一スによるゲル電気泳動を行い、 約 7 k b付近の DN
A断片をゲルより切り出して精製することにより、 クロ一ン化に用いる DNA断 片を調製した。 この DNA断片を； - ZAPRIIファージキット （ストラテジーン社 製） を用いてそのファージの EcoR Iサイトに組み込み、 インビトロパッケージン グキット（アマシャム社製）でパッケ一ジングを行つた。 そして、 大腸菌 XL 1 - Blue MRFに感染させて NZY平板培地（5g/l NaCl, 2 g/1 MgS04 · 7H20, ¾ g/1 酵母エキス， 1 Og/1 NZァミン、 1 8 g/1 寒天 （pH7. 5 ))上に NZY軟寒天培地 (NZY平板培地の寒天のみ 8 g/1)とともに重層し、 てプラークとした。 これをハ ィボンド N +フィルタ一（アマシャム社製）にトヲンスファーしアル力リ（0. 5M Na0H、 1. 5 M NaCl)で変成した後、 中和（ 0. 5 M Tris · HC1 (pH 7. 5 )、 1. 5 M NaCl)、 乾燥し、 80。Cで 2時間焼付けを行つた。
焼き付け後のフィルター 24枚を用い、 実施例 3と同様にプレハイブリダィゼ ーシヨン、 標識したプロ一ブを用いたハイブリダィゼーシヨンを行い、 このフィ ルタ一を洗浄した。 このフィルタ一を乾燥後、 X線フィルムに密着させて感光さ せ、 黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。 この分離 したプラークのファ一ジを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてプラークとし、 フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、 確認を行つたところ、 1 2株のファージが選択できた。
このファージの懸濁液を用い、 上記の NQE- 1 1及び NQE- 1 2を用い PC Rを行 つたところ、 8株に 32 Obpの DNA断片が検出できた。 そこで λ -ZAPRIIファ ージキットの取り扱い説明書に従って、 2株についてファ一ジミ ドを調製した。
(実施例 5) 調製した 2株のファージミ ド DNAを用いて、 デカプレニルニ燐 酸合成酵素の遺伝子の D N A塩基配列を （実施例 1 ) と同様の方法で配列決定し た。 挿入 DNA断片のうちの、 約 1. 6kbの DNAについてその塩基配列を決定 したが、 ^の結果を配列表、 配列番号 1に示す。 また、 この DN A配列から予測 されるァミノ酸配列を配列番号 2に示した。
得られた配列を、 特開平 1 0-5 70 7 2に記載の 6 "co/jo6aciar suboxydans のデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子と比較したところ、 ァミノ酸配列では、 約 4 7%、 DNA配列では約 6 0%の相同性を有していた。 図 3、 図 4および図 5 にその結果を示す。 また、 特開平 9-1 73 0 7 ら \こ tSMの Schizosaccharomyces 由来のデカプレニルニ燐酸合成酵素と比較したところ、 ァミノ酸では 3 0。/o、 DNAでは 4 6%の相同性を有していた。
(実施例 6) 調製したファージミドよりデカプレニルニ燐酸合成酵素をコードす る遺伝子部分のみを切り出す為、 合成 DNAプライマー NQE- 2 2 (5 ' - AGTCAAGCTTCAGCTCACCCGGTCGATC- 3 ' の配列を持つ）及 QE- 2 3 ( 5， - -
AGCTCATATGATACCGCTGGAAGACAGC- 3 ' の配列を持つ）を用いて実施例 3と同様に P CRを行い、 制限酵素 Ndel及ひ Hindlll 切断した後、 発現用ベクター p UCN T (WO 94/0 3 6 1 3に記載） に挿入してデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝 子の発現ベクター、 p QAD lを作製した。 得られた発現べクタ一、 p QAD l の制限酵素地図を図 1に示す。 なお、 DP Sはデカプレニルニ憐酸のコード領域 を意味する。
(実施例 7) 作製したデカプレニルニ燐酸合成酵素遺伝子の発現べクタ一 p QAD 1を大腸菌 HB 1 0 1に導入し、 1 01111のし8培地で3 7°C、 ー晚振と う培養し、 菌を遠心分離（300 0回転、 20分間）で集めた。
この菌体を 1 m 1の 3 %硫酸水溶液に懸濁し、 1 20 °C、 3 0分間熱処理後、
2 m 1の 1 4 %水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に 1 2 0 °C、 1 5分間熱処 理した。 この処理液に 3 m 1のへキサン ·ィソプロパノ一ル（1 0： 2)を添カロし て抽出し、 遠心分離の後、 その有機溶媒層 1 , 5 mlを分離し、 減圧条件で溶媒を 蒸発させて乾固した。 これを 0. 5 mlのエタノールに溶解し、 その 20 1を高速 液体ク口マトグラフィー (島津製作所製、 LC- 1 0 A)により分析した。 分離には逆 相カラム（YMC - pack 0DS-A, 2 5 0 X 4. 6 mm, S— 5 m, 1 20 A)を用い、 エタ ノ—ル.メタノール（2 : 1)を移動相の溶媒として使用して分離させ、 2 75nm の波長の吸光度で生成したコェンザィム Q ,。を検出した。 結果を図 2に示した。 図 2に示すように、 デカプレニルニ憐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させるこ とによって、 組換え大腸菌では、 大腸菌が本来生産しないコェンザィム 。を、 生産するようになったことが分かった。
得られた組換え大腸菌株 ^scAaric a coli HB 1 0 1 p QAD 1は通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成 1 0年 1 0月 1 日に寄託した （受託 番号 FERM BP- 6538 ) 。
産業上の利用可能性
コェンザィム Q i。の生合成に関するキー酵素、 デカプレニルニ燐酸合成酵素 をコードする遺伝子を/ 科の細菌より単離し、 配列決定を行った。 ま た、 これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。 本発明の遺伝子および 方法を用いることにより、 医薬品等どして用いられているコェンザィム 。を 効率的に製造することができる。
寄託された微生物への言及
Escherichia coli HB 1 0 1 pQAD 1は通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に平成 1 0年 1 0月 1日に寄託した。 受託番号は FERM BP- 6538 である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 · 配列番号 1に記載の DNA配列、 およびこの配列に対し 1または複数の塩 基の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素をコードする DNA 配列を有する DNA。
2. 配列番号 2に記載のァミノ酸配列、 およぴこの配列に対して 1または複数 のアミノ酸の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有す るアミノ酸配列をコード化する DNA。
3. 配列番号 2に記載のァミノ酸配列、 お上びこの配列に対して 1または複数 のアミノ酸の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有す るアミノ酸配列を有するタンパク質。
4. 配列番号 1に記載の D N A配列、 およびこの配列に対し 1または複数の塩 基の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素をコードする DN A 配列を有する D N Aを宿主微生物へ導入し、 該宿主微生物を培養する工程を含む、 コェンザィム Q i。の製造方法。
5. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 およびこの配列に対して 1または複数 のアミノ酸の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有す るァミノ酸配列をコード化する D N Aを宿主微生物へ導入し、 該宿主微生物を培 養する工程を含む、 コェンザィム 。の製造方法。
6. 宿主微生物が ?c eric!ia coliである、 請求項 4または 5記載の方法。
7. Escherichia coli HB 1 0 1 Q AD 1 (FRPM BP- 653 8)を培養するこ とを含む、 請求項 6記載の方法。
8. 配列番号 1に記載の DN A配列、 およびこの配列に対し 1または複数の塩 基の欠失、 追加、 揷入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素をコードする DN A 配列を有する DNAを含有する、 発現ベクター。
9. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 およびこの配列に対して 1または複数 のアミノ酸の欠失、 追加、 揷入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有す るアミノ酸配列をコード化する DN Aを含有する、 発現ベクター。
1 0. 発現べクタ一 pUCNTに DNA配列を導入してなる、 請求項 8または 9記載の発現べクタ一 p QAD 1。
1 1 . 酉己列番号 1に記載の D N A配列、 またはこの配列に対して 1または複数 のアミノ酸の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有す るタンパク質をコードする D N A配列を有する D N Aにて形質転換された、 宿主 微生物。
1 2 . 配列番号 2に記載のァミノ酸配列、 およびこの配列に対して 1または複 数のアミノ酸の欠失、 追加、 挿入を有し、 デカプレニルニ燐酸合成酵素活性を有 するアミノ酸配列をコード化する D N Aにて形質転換された、 宿主微生物。
1 3 . Escherichia を形質転換して得られる、 請求項 1 1または 1 2記載 の微生物。
1 4 . Escherichia coli H B 1 0 1 p Q A D 1 (FERM BP— 6 5 3 8 )である、 請求項 1 3記載の微生物。
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