ES2648045T3

ES2648045T3 - Producción mejorada de riboflavina

Info

Publication number: ES2648045T3
Application number: ES09751895.5T
Authority: ES
Inventors: Martin Lehmann; Michael Hans; Hans-Peter Hohmann; Dietmar Laudert
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2017-12-28
Anticipated expiration: 2029-11-09
Also published as: CN102209780B; WO2010052319A1; KR20110093847A; CN102209780A; CN103757000A; US20110312025A1; JP5787089B2; EP2186880A1; US10633684B2; EP2356211B1; JP2012507984A; KR101726886B1; EP2356211A1

Abstract

Un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia líder del operón de riboflavina (secuencia líder rib), en donde una secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 42 se ha modificado por introducción de eliminaciones en el extremo 3', en donde el polinucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en: (a) polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 42, que comprenden una eliminación de al menos las secuencias de acuerdo con los nucleótidos 166 a 263 mostradas en la SEQ ID NO: 42, (b) polinucleótidos cuya cadena complementaria hibrida en condiciones restrictivas con el polinucleótido como se define en (a), (c) polinucleótidos que son al menos 95 o 98% idénticos al polinucleótido como se define en (a), y (d) polinucleótidos que son la cadena complementaria del polinucleótido definido en (a) a (c); en donde dicho polinucleótido que codifica dicha secuencia líder rib comprende además una o más mutaciones ribO en el elemento RFN de acuerdo con los nucleótidos 25 a 164 mostrado en la SEQ ID NO:42, y en donde la acumulación del transcrito de ARNm de rib de longitud completa, intacto, aumenta en al menos 5% comparado con una secuencia líder rib no modificada.

Description

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rendimiento, producción y/o eficacia de riboflavina a partir de sustratos como, p. ej., la glucosa. Esto se puede llevar a cabo aumentando la actividad de la secuencia líder rib como se describe en la presente memoria, es decir, disminuyendo el nivel de regulación. Además, un microorganismo como el de la presente invención puede llevar modificaciones adicionales, con la condición de que dichas modificaciones tengan un impacto directo en el rendimiento, producción y/o eficacia de la producción de riboflavina.

Por lo tanto, una realización de la presente invención se refiere a un microorganismo que lleva una secuencia líder rib modificada como se describe en la presente memoria y modificación(es) adicional(es), tal como, p. ej., por sustitución del promotor natural del operón rib por un promotor fuerte (constitutivo o inducible), tal como p. ej., Pspo15

o Pveg. La introducción de dicho promotor fuerte da como resultado un aumento de la producción de riboflavina que es al menos 50%, 75%, 100%, 200%, 250%, 300%, 350%, 500% o incluso más de 1000%, comparado con un microorganismo que lleva una secuencia líder rib modificada en la dirección 3’ del promotor natural. Esto se puede aumentar incluso más por la sobreexpresión de uno o más genes rib, en particular de ribA o por introducción de múltiples copias del operón rib en la célula hospedante, tal como se implementa en la cepa RB50 de B. subtilis (véase, p. ej., el documento EP 405370). Comparado con la producción de riboflavina en B. subtilis RB50, la producción de riboflavina se puede aumentar en al menos 100%, 200%, 250%, 500%, o incluso más de 750% por alteración genética de un microorganismo de modo que lleve una modificación en la secuencia líder rib como se define en la presente memoria fusionada con un promotor fuerte. Un microorganismo que lleva una secuencia líder rib modificada como se define en la presente memoria, opcionalmente combinado con la introducción de un promotor fuerte y/o copia/copias múltiples del operón rib se puede alterar adicionalmente mediante un desacoplamiento del crecimiento de la producción de riboflavina, tal como, p. ej., mediante la introducción de una auxotrofía como se describe en el documento EP 1186664 para, p. ej., biotina, y/o además combinado con la introducción de gen de transcetolasa modificado como se describe, p. ej., en el documento WO 07/051552.

La presente invención proporciona una secuencia líder rib modificada como se define en la presente memoria, que lleva (i) una o más mutaciones ribO en el elemento RFN que corresponde a los nucleótidos 25 a 164 mostrados en la SEQ ID NO: 42 junto con modificaciones en el extremo 3’ de la secuencia líder rib, o (ii) eliminaciones de al menos las secuencias correspondientes de acuerdo con los nucleótidos 166 a 263 mostrados en la SEQ ID NO: 42, en donde dichas secuencias líderes rib están fusionadas con promotores fuertes, tales como p. ej., Pspo15 o Pveg.

Una cepa particular preferida para la producción de riboflavina es B. subtilis. Una cepa más preferida es B. subtilis RB50::[pRF69]n que contiene múltiples (n) copias (por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 copias) de pRF69 que codifica un operón rib modificado con el promotor fuerte Pspo15 para potenciar la transcripción de los genes rib (véase, p. ej., el documento EP 405370 y Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-18, 1999, para la construcción de la cepa y las condiciones de cultivo para dar la producción de riboflavina). B. subtilis RB50 y el plásmido pRF69 pueden estar disponibles en NRRL (número de acceso B 18502) y ATCC (número de acceso ATCC 68338), respectivamente.

De acuerdo con un objeto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un polinucleótido modificado como se ha definido antes o un microorganismo que está genéticamente manipulado con dichos polinucleótidos para la producción de riboflavina.

La invención también se refiere a procedimientos para la expresión de un operón rib (modificado) que incluye una secuencia líder rib modificada en un microorganismo, a procedimientos para la producción de polinucleótidos (modificados) como se ha definido antes, en un microorganismo y a procedimientos para la producción de dichos microorganismos modificados capaces de producir riboflavina. Todos estos procedimientos pueden comprender la etapa de alterar un microorganismo, en donde “alterar” como se usa en la presente memoria abarca el procedimiento de “alterar genéticamente” de modo que se puedan mejorar tanto el rendimiento y/o la productividad de riboflavina como la acumulación de ARNm de rib de longitud completa, intacto, comparado con el microorganismo de tipo natural. El término “alterar” también incluye la generación de polinucleótidos modificados como se describe en la presente memoria, en particular la modificación de la secuencia líder rib. Como se usa en la presente memoria, el “rendimiento de riboflavina mejorado” significa un aumento de al menos 50%, 75%, 100%, 200%, 250%, 300%, 350%, 500% o incluso más de 10000% o 100000% (véase antes), comparado con un microorganismo de tipo natural/no modificado, es decir, un microorganismo que no está genéticamente alterado.

La expresión “genéticamente manipulado” o “genéticamente alterado” significa la alteración científica de la estructura del material genético en un organismo vivo. Implica la producción y uso de ADN recombinante. Más en particular, se usa para distinguir el organismo genéticamente manipulado o modificado del organismo que se encuentra de forma natural. La manipulación genética se puede hacer por una serie de técnicas conocidas en la técnica, tal como, p. ej., sustitución de genes, amplificación de genes, alteración de genes, adición, inserción, eliminación, transfección, transformación usando plásmidos, virus u otros vectores. Un organismo genéticamente modificado, p. ej., microorganismo genéticamente modificado, se denomina a menudo también un organismo recombinante, p. ej., microorganismo recombinante. Un microorganismo genéticamente manipulado lleva una secuencia líder rib modificada como se ha definido antes.

De acuerdo con la invención, se proporciona una célula hospedante genéticamente manipulada/producida de forma recombinante (denominada también célula recombinante o célula transformada) que lleva dicha secuencia líder rib

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modificada como la de la presente invención, de modo que se mejora el rendimiento, producción y/o eficacia de la producción de riboflavina. La célula hospedante se puede seleccionar de un microorganismo capaz de producir riboflavina a partir de una fuente de carbono dada, en particular Bacillus, preferiblemente B. subtilis.

Una “célula transformada” o “célula recombinante” es una célula en la que (o en un ancestro de la cual) se ha introducido, mediante técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención, que conduce a una acumulación mayor y/o potenciada de ARNm de rib de longitud completa, intacto. También incluye la introducción de una o más mutaciones en una secuencia líder rib de tipo natural ya presente en dicha célula. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de microorganismos capaces de producir riboflavina, p. ej., de convertir una fuente de carbono dada en riboflavina como se ha definido antes. Las cepas útiles para llevar a cabo dicho procedimiento de fermentación se han citado antes y se conocen en la técnica.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente purificada hasta homogeneidad.

El término “aislado” significa que el material se saca de su entorno original (p. ej., el entorno natural si se encuentra de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido que se encuentra de forma natural presente en un microorganismo vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido, separado de parte o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos podrían ser parte de una composición y todavía estar aislados en cuanto que dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.

Como se usa en la presente invención, el término “gen” se refiere a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar del ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, p. ej., proteínas implicadas en la síntesis de riboflavina, tal como por ejemplo enzimas de la ruta biosintética de la riboflavina de B. subtilis.

Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, tales como por ejemplo, secuencias no traducidas situadas en los extremos 3’ y 5’ de la región codificante de un gen, tal como, por ejemplo, regiones promotoras, regiones reguladoras y regiones terminadoras importantes para la expresión adecuada y estabilización del polipéptido derivado del mismo.

Como se usa en la presente memoria, los términos “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se pretende que incluyan moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos de oligonucleótidos o derivados (p. ej., nucleótidos de inosina o fosforotioato). Dichos oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de emparejamiento de bases alteradas o mayor resistencia a nucleasas.

Salvo que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de ADN en la presente memoria, se determinaron usando un secuenciador de ADN automático. Por lo tanto, como se conoce en la técnica, para cualquier secuencia de ADN determinada por este procedimiento automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente invención puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente al menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar de forma más precisa mediante otros procedimientos que incluyen métodos de secuenciación manual del ADN, bien conocidos para los expertos en la técnica.

El experto en la técnica es capaz de identificar dichas bases identificadas de forma errónea y sabe cómo corregir dichos errores.

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención independientemente de si están modificados o no están modificados, se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores de la PCR. Está incluido además el uso de polinucleótidos como se describen en la presente memoria, para la potenciación y/o mejora de la función o actividad de secuencias líder rib homólogas en otros organismos que están estrechamente relacionados con Bacillus y como se ha descrito antes como células hospedantes adecuadas. Como se usa en la presente memoria, la expresión “secuencias líder rib homólogas” abarca secuencias líder rib de diferentes organismos de acuerdo con la figura 2 en Vitreschak et al., Nucleic Acid Res 30, 3141-3151, 2002, en donde se han alineado diferentes elementos RFN. Con este alineamiento, el experto en la técnica puede identificar fácilmente partes de la secuencia líder rib que corresponden a las descritas en la presente invención procedentes de B. subtilis con el fin de generar secuencias líder rib modificadas en los organismos citados como se describe en la presente invención.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que puede hibridar en condiciones restrictivas, preferiblemente en condiciones altamente restrictivas, con un polinucleótido como el de la presente invención, tal como por ejemplo, un polinucleótido mostrado en las SEQ ID NO: 42, 52, 53, 67, 68, 69, 70, 71, 81, 82, preferiblemente seleccionado de las SEQ ID NO: 42, 67, 68, 69, 71, 70. Ventajosamente, dicho polinucleótido se

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puede obtener de un microorganismo capaz de producir riboflavina, en particular de Bacillus subtilis.

Como se usa en la presente invención, el término “hibridar” se pretende que describa condiciones para la hibridación y el lavado en las que las secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferiblemente al menos de aproximadamente 85% a 90%, lo más preferiblemente al menos 95% homólogas entre sí, típicamente permanecen hibridadas unas con otras.

Un ejemplo preferido, no limitante, de condiciones de hibridación restrictivas son la hibridación en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 1x SSC, SDS al 0,1% a 50°C, preferiblemente a 55°C, más preferiblemente a 60°C e incluso más preferiblemente a 65°C.

Las condiciones altamente restrictivas incluyen incubaciones a 42ºC durante un periodo de varios días, tal como 2-4 días, usando una sonda de ADN marcada, tal como una sonda de ADN marcada con digoxigenina (DIG), seguido de uno o más lavados en 2x SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente y uno o más lavados en 0,5x SSC, SDS al 0,1% o 0,1x SSC, SDS al 0,1% a 65-68°C. En particular, las condiciones altamente restrictivas incluyen, por ejemplo, de 2 h a 4 días de incubación a 42ºC usando una sonda de ADN marcada DIG con digoxigenina (preparada usando,

p. ej., un sistema de marcaje con DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania) en una solución tal como solución de DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin ADN de esperma de salmón 100 µg/ml, o una disolución que comprende 50% de formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), dodecilsulfato sódico al 0,02%, N-lauroilsarcosina al 0,1%, y reactivo de bloqueo al 2% (Roche Diagnostics GmbH), seguido de lavado de los filtros dos veces durante 5 a 15 minutos en 2x SSC y SDS al 0,1% a temperatura ambiente y después lavando dos veces durante 15-30 minutos en 0,5x SSC y SDS al 0,1% o 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 65-68°C.

El experto en la técnica sabrá qué condiciones aplicar para las condiciones de hibridación restrictivas y altamente restrictivas. Se encuentra fácilmente disponible orientación adicional en relación con dichas condiciones en la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, “Current Protocols in Molecular Biology”, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Además, se pueden preparar oligonucleótidos que corresponden o pueden hibridar con secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, por técnicas sintéticas convencionales, p. ej., usando un sintetizador de ADN automático.

Las expresiones “homología” o “porcentaje de identidad” se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Para el fin de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de ácido nucleico para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de ácido nucleico). A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias [es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones que solapan) x 100]. Preferiblemente, las dos secuencias son de la misma longitud.

El experto en la técnica será consciente del hecho de que están disponibles varios programas de ordenador diferentes para determinar la homología entre las dos secuencias. Por ejemplo, una comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 444-453, 1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.accelrys.com), usando bien una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la técnica apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global para dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.

En otra realización más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.accelrys.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 y 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17, 1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de pesos de restos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

Un método útil para construir un microorganismo como el de la presente invención, es decir, para introducir una secuencia líder rib modificada en la región 5’ no traducida de un gen implicado en la producción de riboflavina, se da en los ejemplos, en donde la introducción de una secuencia líder rib modificada descrita en la presente invención, conduce a trascritos de ARNm de longitud completa, intactos del o de los respectivos genes rib, que además

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fermentación objetivo deseado. La incubación se puede llevar a cabo en un medio rico en nitrógeno, que contiene, por ejemplo, fuentes de nitrógeno orgánico, p. ej., nitratos y sales de amonio, en cuyo caso las células podrán crecer más mientras producen el producto de fermentación deseado. Alternativamente, la incubación se puede llevar a cabo en un medio pobre en nitrógeno, en cuyo caso las células no crecerán sustancialmente, y estarán en un modo de célula en reposo, o modo de biotransformación. En todos los casos, el medio de incubación puede contener también sales inorgánicas, p. ej., sulfato magnésico, sulfato de manganeso, fosfato potásico, y cloruro de calcio. Un ejemplo de un medio adecuado para la producción de riboflavina se describe en el documento WO 04/113510 (VFmedium), que es particularmente útil con respecto a Bacillus.

Los términos “producción” o “productividad” están reconocidos en la técnica e incluyen la concentración de riboflavina formada dentro de un periodo de tiempo dado y un volumen de fermentación dado (p. ej., kg de producto por hora por litro). La expresión “eficacia de la producción” incluye el tiempo necesario para lograr un nivel particular de producción (por ejemplo, cuánto tarda la célula alcanzar una tasa de producción particular de un producto de fermentación). El término “rendimiento” está reconocido en la técnica e incluye la eficacia de la conversión de la fuente de carbono en el producto (es decir, riboflavina). Esto, en general, se escribe como, por ejemplo, kg de producto por kg de fuente de carbono. Por “aumento del rendimiento y/o producción/productividad” del compuesto se entiende que aumenta la cantidad de moléculas recuperadas, o de moléculas recuperadas útiles de este compuesto en una cantidad dada de cultivo a lo largo de una cantidad de tiempo dado.

Los métodos analíticos para determinar el rendimiento/productividad de la riboflavina son conocidos en la técnica. Dichos métodos pueden incluir, pero no se limitan a HPLC o el uso de cepas indicadoras (véase, p. ej., Bretzel et al.,

J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999).

Figuras

La figura 1 muestra la secuencia líder rib de Bacillus subtilis que incluye las regiones flanqueadoras 5' y 3' de la misma. La secuencia líder rib está situada entre las posiciones de nucleótidos 562 a 857. (A) operón rib de tipo natural en donde los elementos reguladores 5' están indicados en negrilla ("ttgcgt"y "tataat", respectivamente) así como inicio de la transcripción ("A") que corresponde al primer nucleótido de la secuencia líder rib como se muestra en la SEQ ID NO: 42. (B) secuencia líder rib en donde las posiciones de las mutaciones ribO tales como la triple ribO, RK41 y RK1a se indican en negrilla. (C) a (I) la secuencia líder rib en donde la posición de la región flanqueadora derecha, terminadora, bucle en horquilla derecha, bucle en horquilla izquierda, eliminación SWITCH, eliminación mro175, y la secuencia líder rib entera respectivamente, se indican subrayadas. Para explicaciones adicionales véase el texto, en particular los ejemplos.

La figura 2 muestra las diferentes etapas para construir un microorganismo genéticamente alterado que lleva un elemento estabilizador de ARNm (St) en la dirección 3’ de un promotor Pspo15 constitutivo fuerte a través de LFH-PCR que está situado en el extremo 5’ del operón rib que comprende los genes ribD, ribE, ribA. Para la selección de microorganismos recombinantes, se usa el casete de resistencia al antibiótico cloranfenicol (Cm). (A) Sustitución del promotor natural por un promotor fuerte usando LFH-PCR. (B) Introducción de elementos estabilizadores del ARNm. Para explicaciones adicionales véase el texto, en particular los ejemplos.

Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención de ninguna forma.

Ejemplos

Los siguientes medios a los que se hace referencia en los ejemplos se describen en el documento WO 04/106557: Medio de caldo de agar sangre triptosa (TBAB), medio de caldo de extracto de levadura-infusión de ternera (VY), 10X sales Spizizen y medio mínimo (MM). Además, se han usado los siguientes medios:

100X Solución de oligoelementos A: 12,5 g de MgCl2·6H2O; 0,55 g de CaCl2; 1,35 g de FeCl2·6H2O; 0,1 g de MnCl2·4H2O; 0,17 g/l de ZnCl2; 0,043 g de CuCl2·2H2O; 0,06 g de CoCl2·6H2O; 0,06 g de Na2MoO4·2H2O; adición hasta 1 l de H2O, tratado en autoclave.

5X Solución salina mínima: K2SO4 0,057 M; K2HPO4·5H2O 0,31 M; KH2PO4 0,22 M; Na-citrato·7H2O 0,017 M; MgSO4. H2O 0,004 M, pH 7,0, tratado en autoclave.

100X Solución de oligoelementos B: 0,55 g de CaCl2; 0,17g de ZnCl2; 0,043 g de CuCl2·2H2O; 0,06 de CoCl2·6H2O; 0,06 g de Na2MoO4·2H2O; adición hasta 1 l de H2O, tratado en autoclave.

Medio de cribado de riboflavina (RSM): 200 ml de 10X sales de Spizizen; 10 ml de 100X solución de oligoelementos A; 2 ml de glucosa al 50%; 36 ml de rafinosa al 25%; 10 ml de extracto de levadura al 10%; adición hasta 1 l de H2O.

Medio mínimo de Spizizen (SMM): 100 ml de 10X sales de Spizizen; 10 ml de glucosa al 50%; 1 ml de glutamato sódico al 40%; 10 ml de solución de oligoelementos A; adición hasta 1 l de H2O.

La producción de riboflavina en matraces de agitación se llevó a cabo como sigue: se inocularon las cepas a partir

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de soluciones madre en glicerol congeladas en 5 ml de medio rico VY y se cultivaron durante la noche a 37ºC con una agitación de 280 rpm. Las células se recogieron por centrifugación y se volvieron a suspender en 1 ml de RSM (véase antes). Se usaron 250 µl de la suspensión de células para la inoculación de 25 ml de RSM en matraces de agitación con deflectores de 250 ml. Después de 48 h de incubación a 39ºC con una agitación de 220 rpm, se extrajeron 500 µl de cultivo y se mezclaron 35 µl de NaOH 4 N con la muestra durante 1 min a temperatura ambiente permitiendo disolver los cristales de riboflavina. Las muestras se neutralizaron por adición de 465 µl de tampón de fosfato potásico 1 M (pH 6,8) y se sedimentaron por centrifugación (5 min, 13200 rpm). El líquido sobrenadante se usó para la determinación por HPLC de las concentraciones de riboflavina y dos productos secundarios: 6,7-dimetil8-ribitil-lumazina (DMRL) y oxolumazina. Además, se extrajo una segunda muestra de cultivo y después de centrifugación (5 min, 13200 rpm) se usó para determinar las concentraciones de la glucosa y rafinosa residual en el medio para el cálculo del rendimiento de riboflavina respecto a la fuente de carbono.

Las muestras de los cultivos de los matraces de agitación se analizaron por HPLC. La cromatografía se llevó a cabo en un sistema de HPLC Agilent 1100 equipado con un inyector automático termostatizado, una matriz de diodos y un detector de fluorescencia. La separación se llevó a cabo en una columna Supelcosil LC-8DB-5µ (150 mm x 4,6 mm) equipada con una precolumna de 4 mm LC-8DB. Se usó una mezcla de ácido acético 0,1 M y metanol como fase móvil. La elución con gradiente se aplicó empezando con 2% de metanol (constante durante 5 min) y continuando hasta 50% de metanol en 15 min. La columna se mantuvo a 20ºC. La señal se registró por UV a 280 nm. La riboflavina se separó bien de las impurezas (p. ej., los productos secundarios: DMRL y oxolumazina) y eluyeron a 15,2 min. La calibración se basa en el material de referencia obtenido de Fluka. El método se calibra de 10 µg/ml a 1 mg/ml de riboflavina.

Además, se analizó la concentración de glucosa y rafinosa en el caldo de cultivo mediante un sistema de HPLC de la serie Agilent 1100 usando una bomba cuaternaria, un inyector automático y un detector de UV y uno de índice de refracción. La separación se logró en una columna CAPCELL PAK NH2 UG80 (4,6 mm x 250 mm, 5 µ) (Shiseido). La temperatura óptima de la columna era 35ºC. La fase móvil era una mezcla de acetonitrilo y agua DI en una relación 65/35. El caudal era 1,0 ml/min y el volumen de inyección se fijó en 5 µl. Se vigiló la señal del índice de refracción y se usó para la detección. El intervalo de calibración para cada compuesto es de 0,5 mg/ml a 30 mg/ml.

Ejemplo 1: Generación de cepas auxótrofas para riboflavina

Para la manipulación genética de la secuencia líder y promotora original del operón de riboflavina de B. subtilis, el promotor de riboflavina, la secuencia líder 5’ y la parte 5’ de ribD (ribG) que codifica el dominio de desaminasa de RibD se sustituyeron por un casete de resistencia a la neomicina (neo) obtenido del plásmido pUB110 (Itaya et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:4410) generando una cepa auxótrofa para la riboflavina de B. subtilis BS3813. El ADN genómico obtenido de la cepa de B. subtilis 1A747 (SPβc, protótrofa), que es un derivado de B. subtilis 168 (trpC2), se ha obtenido del Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210 EE.UU.

Para la construcción de la cepa, se usó la reacción en cadena de la polimerasa de homología flanqueadora larga (LFH-PCR) para generar fragmentos de ADN que contenían el casete de resistencia neo de 1236 pb con la región en la dirección 5’ de 526 pb del promotor Prib natural (flanqueador 5') y el extremo 3’ de 502 pb el gen ribD (flanqueador 3'). Por lo tanto, se amplificaron primero por PCR 3 fragmentos de ADN, el flanqueador 5’, casete de resistencia neo y flanqueador 3’. Los fragmentos de ADN flanqueador 5’ y flanqueador 3’ se generaron como sigue: Se añadieron 1 µl de una solución 100 µM de cebadores p50 (SEQ ID NO: 6) junto con p51 (SEQ ID NO: 7) o cebadores p44 (SEQ ID NO: 4) junto con p45 (SEQ ID NO: 5) a 0,1 µg de ADN cromosómico B. subtilis 1A747 en un volumen de reacción de 50 µl que contenía 1 µl de dNTP 10 mM, 5 µl de 10X tampón y 0,5 µl de polimerasa Pfu (Stratagene). Para la generación del fragmento de ADN que contiene el casete de resistencia neo, se añadieron 1 µl de una solución 100 µM de cebadores p9 (SEQ ID NO: 2) junto con p10 (SEQ ID NO: 3) a 0,05 µg de ADN pUB110 que contiene el casete de resistencia neo en un volumen de reacción de 50 µl que contenía 1 µl de dNTP 10 mM, 5 µl de 10X tampón y 0,5 µl de polimerasa Pfu (Stratagene). Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en 35 ciclos de tres etapas secuenciales: (i) etapa de desnaturalización a 94°C durante 30 s; (ii) etapa de reasociación a 52°C durante 30 s; (iii) etapa de elongación a 72°C durante 1 min. Los ciclos de la PCR estaban precedidos de una etapa de desnaturalización a 95ºC durante 3 min. Los tres productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se extrajeron del gel usando el kit de extracción en gel MinElute (Qiagen). En la reacción de LFH-PCR final, los productos de la PCR purificados (flanqueador 5’, casete de resistencia neo, flanqueador 3’) se ensamblaron: se añadieron 1 µl de una solución 100 µM de cebadores p45 junto con p51, 1 µl del producto de la PCR flanqueador 5’ (50 ng), 1 µl del producto de la PCR flanqueador 3' (50 ng) y 1 µl de casete de resistencia (100 ng) para dar un volumen de reacción final de 50 µl que contenía 1 µl de dNTP 10 mM, 5 µl de 10X tampón y 0,5 µl de polimerasa Pfu (Stratagene). La reacción de LFH-PCR se llevó a cabo en 35 ciclos de tres etapas secuenciales:

(i) etapa de desnaturalización a 94°C durante 30 s; (ii) etapa de reasociación a 52°C durante 30 s; (iii) etapa de elongación a 72°C durante 2,5 min. Los ciclos de la PCR estaban precedidos de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 3 min. El producto de la LFH-PCR ensamblado se purificó usando el kit de purificación de PCR QiaQuick (Qiagen). El producto de la LFH-PCR purificado (2 µg) se usó para la transformación de células competentes de B. subtilis 1A747. Se seleccionaron los transformantes resistentes a la neomicina (Nmr) en placas TBAB que contenían neomicina 2 mg/l y riboflavina 100 mg/l. El genotipo correcto de la cepa auxótrofa para riboflavina y Nmr BS3813 resultante, se confirmó por dos reacciones de PCR usando los cebadores p45 junto con p10, y cebadores p51 junto con p9, y ADN cromosómico de los transformantes como ADN molde. Las reacciones de

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Tabla 5: Producción de riboflavina con cepas de B. subtilis transducidas como se ha indicado, basado en la cepa sobreproductora de riboflavina de B. subtilis RB50 que lleva la secuencia líder rib natural. El rendimiento se da como g de riboflavina por g de fuente de carbono (para una explicación adicional véase el texto).

Cepa: Mutación de la secuencia líder rib Rendimiento [%]

RB50: operón rib de tipo natural 0,46

BS3908: Pveg_triple ribo_del mro175 6,79

BS3922: PSpol5_triple ribO_del mro175 6,47

BS3984: PSpol5_RK41 eliminación terminador 5,24

BS3964: PSpol5_RK41 eliminación SWITCH 7,80

BS3899: Pveg_RK41 eliminación SWITCH 7,67

BS5026: PSpol5_eliminación líder 2,16

Ejemplo 5: Sustitución de la secuencia líder rib natural por un elemento estabilizador del ARNm

La secuencia de ADN del elemento estabilizador de ARNm aprE se distribuyó en dos productos de la PCR. Para la amplificación del producto 1 de la PCR que contiene la región 5’ del operón rib en el extremo 5’ del elemento estabilizador de ARNm aprE, se usaron los cebadores p45 junto con p143' (SEQ ID NO: 33) y el ADN cromosómico de la cepa BS3817 como molde, en condiciones de PCR estándar. Para la amplificación del producto 2 de la PCR que contiene ribD en el extremo 3’ del elemento estabilizador de ARNm aprE, se usaron los cebadores p51 junto con p142 (SEQ ID NO: 32) y el ADN cromosómico de la cepa BS3817 como molde, en condiciones de PCR estándar. En la reacción de LFH-PCR estándar, los productos 1 y 2 de la PCR purificados en gel se ensamblaron en un fragmento de ADN como se ha descrito antes. Se aplicó el mismo método al elemento estabilizador de ARNm grpE con el ADN cromosómico de la cepa BS3817 como molde usando la pareja de cebadores p45/p145' (SEQ ID NO: 35) y la pareja de cebadores p51/p144 (SEQ ID NO: 34) para las dos primeras PCR seguido de la PCR de ensamblaje usando la pareja de cebadores p45/p51 en las condiciones descritas antes. Los productos de la LFH-PCR purificados se transformaron de nuevo en células competentes de B. subtilis BS3813 auxótrofa para riboflavina, en la que la región promotora de la riboflavina y la parte 5’ de ribD se sustituyó por un casete de resistencia a la neomicina. Los transformantes protótrofos para riboflavina se seleccionaron en placas SMM. Los transformantes aislados se suspendieron en 1 ml de solución de NaCl al 0,9% y 100 µl de una dilución de 500 veces de la suspensión de células original en placas de agar TBAB. Se transfirieron colonias individuales a placas de agar TBAB recientes y a placas de agar TBAB complementadas con Nm 2 mg/l y riboflavina 100 mg/l. Los transformantes correctos crecían solo en placas de agar TBAB y por lo tanto eran sensibles a la neomicina. Además, el genotipo se confirmó por la secuenciación del nuevo tramo introducido de ADN. Las cepas resultantes se designaron BS5193 (que lleva la construcción P15ΩaprEribDEAHT) y BS5196 (que lleva la construcción P15ΩgrpEribDEAHT), respectivamente. Se prepararon los lisados de PBS-1 de las cepas BS5193 y BS5196 y se usaron para la transducción de BS3798 (generada en el ejemplo 1). La selección de las células transducidas en placas SMM se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2. Las nuevas cepas transducidas basadas en la cepaBS5193 se denominaron BS5260 y BS5262, respectivamente, la nueva cepa transducida basada en la cepa BS5196 se denominó BS5244.

La producción de riboflavina se analizó en experimentos de matraces agitados como se ha descrito antes. Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6A: Producción de riboflavina con cepas de B. subtilis transformadas como se ha indicado, comparada con la cepa de tipo natural de B. subtilis 1A747 que lleva la secuencia líder rib natural. El rendimiento se da como g de riboflavina por g de fuente de carbono (para una explicación adicional véase el texto).

Cepa: Mutación de la secuencia líder rib Rendimiento [%]

1A747: natural 0,0004

BS3817: PSpol5 0,0163

BS3944: PSpol5_eliminación líder 0,1150

BS5193: PSpol5_aprE 0,1000

BS5196: PSpol5_grPE 0,3700

Tabla 6B: Producción de riboflavina de cepas de B. subtilis transducidas como se ha indicado, comparada con la cepa sobreproductora de riboflavina de B. subtilis RB50 que lleva la secuencia líder rib natural. El rendimiento se da como g de riboflavina por g de fuente de carbono (para una explicación adicional véase el texto).

Cepa: Mutación de la secuencia líder rib Rendimiento [%]

RB50: operón rib de tipo natural 0,46

BS3850: PSpol5 1,57

BS5026: PSpol5_eliminación líder 2,16

BS5260: PSpol5_aprE 2,07

BS5244: PSpol5_grPE 2,99

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se ha descrito antes en ejemplos previos (para explicaciones adicionales véase el texto).

Designación de la mutación de la secuencia líder rib: Molde para el flanqueador 5' Molde para el flanqueador 3'

PSpo15_RK111a: BS3817 BS3817

Pveg_RK111a: BS3811 BS3811

PSpo15_RK111a_eliminación SWITCH: BS3874 BS3874

Pveg_RK111a_eliminación SWITCH: BS3811 BS3867

PSpo15_RK111a_eliminación terminador: BS3871 BS3871

Pveg_RK111a_eliminación terminador: BS3844 BS3844

PSpo15_RK111a_eliminación mro175: BS3817 BSmro175

Pveg_RK111a_eliminación mro175: BS3811 BSmro175

Los productos de la PCR generados para todas las construcciones citadas en la tabla 9 se transforman en BS3813. La selección tiene lugar como se describe en el ejemplo 2 y se usan lisados de las cepas confirmadas para la

5 transducción de BS3798. El rendimiento de riboflavina obtenido en los experimentos de matraces agitados como se ha descrito antes, está en los intervalos para las construcciones de RK41_eliminación SWITCH o triple ribO_eliminación mro175 (véase la tabla 5). Estas cantidades son incluso mayores cuando se usa otro contexto génico de cepa, como se ha descrito, por ejemplo, en el ejemplo 5.

Ejemplo 7: Generación de cepas distintas de B. subtilis que llevan secuencias líder rib modificadas

10 Las construcciones descritas en los ejemplos anteriores se pueden usar para identificar/generar las correspondientes modificaciones en las secuencias líder rib a partir de otras cepas que se sabe que tienen un interruptor ribosómico en el sitio y que son cepas hospedantes adecuadas para la producción de riboflavina.

Las partes correspondientes de las secuencias líder rib no modificadas se identifican en otros organismos de acuerdo con el alineamiento representado en la figura 2 de Vitreschak et al., Nucleic Acid Res 30, 3141-3151, 2002.

15 Las mutaciones por eliminación se generan como se ha descrito antes y opcionalmente se combinan con mutaciones ribO (homólogas a las identificadas en B. subtilis). Las construcciones se pueden combinar además con promotores fuertes u otra modificación conocida de la cepa hospedante como se ha descrito antes con el fin de aumentar la producción de riboflavina en condiciones de cultivo adecuadas que son conocidas para el experto en la técnica.

20 Las construcciones descritas en los ejemplos anteriores se pueden usar para identificar/generar las correspondientes modificaciones en las secuencias líder rib a partir de otras cepas que se sabe que tienen un interruptor ribosómico en el sitio y que son cepas hospedantes adecuadas para la producción de riboflavina.

25 Las mutaciones por eliminación se generan como se ha descrito antes y opcionalmente se combinan con mutaciones ribO (homólogas a las identificadas en B. subtilis). Las construcciones se pueden combinar además con promotores fuertes u otra modificación conocida de la cepa hospedante como se ha descrito antes con el fin de aumentar la producción de riboflavina en condiciones de cultivo adecuadas que son conocidas para el experto en la técnica.

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Claims

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