ES2247617T3

ES2247617T3 - Procesos para recuperar las isoflavonas de las mezclas de soja.

Info

Publication number: ES2247617T3
Application number: ES97304076T
Authority: ES
Inventors: Doyle H. Waggle; Barbara A. Bryan
Original assignee: Archer Daniels Midland Co
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: EP0812837B8; RU2219785C2; US20030129263A1; US6495141B2; JPH1067770A; EP0812837B1; AU720462B2; DE69734042D1; ATE302767T1; US5919921A; KR100412117B1; MX9704375A; US20020072591A1; EP1659119A1; CN1174839A; US6680381B1; US6323018B1; US6664382B2; US6706292B2; TW474930B

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA LA RECUPERACION DE ISOFLAVONAS Y DERIVADOS DE LAS MISMAS A PARTIR DE MELAZAS DE SOJA. EN UNA PRIMERA REALIZACION, SE DESCRIBE UN METODO EN EL CUAL LAS ISOFLAVONAS SE RECUPERAN SIN NINGUNA CONVERSION SIGNIFICATIVA DE LOS CONJUGADOS DE ISOFLAVONA EN OTRAS FORMAS. EN UNA SEGUNDA REALIZACION, SE DESCRIBE UN METODO POR EL CUAL LOS CONJUGADOS DE ISOFLAVONA SE CONVIERTEN EN GLUCOSIDOS EN EL MATERIAL DE LA SOJA ANTES DE SU RECUPERACION. EN UNA TERCERA REALIZACION, SE DESCRIBE UN METODO EN EL CUAL LAS ISOFLAVONAS SE CONVIERTEN EN SU FORMA AGLUCON EN EL MATERIAL DE SOJA Y ANTES DE SU RECUPERACION. ASIMISMO, SE DESCRIBEN VARIOS PRODUCTOS ENRIQUECIDOS EN ISOFLAVONA OBTENIDOS DE VARIAS MELAZAS.

Description

Procesos para recuperar las isoflavonas de las mezclas de soja.

La presente invención se refiere a procesos para recuperar las isoflavonas de las melazas de soja. Además, la invención se refiere a los productos resultantes que contienen isoflavonas.

Las isoflavonas están presentes en una variedad de plantas leguminosas, incluyendo los materiales de proteína vegetal tales como las semillas de soja. Estos compuestos incluyen la daidzina, la 6''-OAc-daidzina, la 6''-OMal-daidzina, la daidzeina, la genistina, la 6''-OAc-genistina, la 6''-OMal-genistina, la genisteina, la glicitina, la 6''-OAc-glicitina, la 6''-OMal-glicitina, la gliciteina, la biochanina A, la formononentina, y el coumestrol. Se asocian típicamente estos compuestos con el gusto innato y amargo de las semillas de soja.

Las isoflavonas en los materiales de semillas de soja incluyen los glucósidos de isoflavona (gluconas), los conjugados de isoflavona y las isoflavonas con aglucona. Los glucósidos de isoflavona tienen una molécula de glucosa enlazada a una parte de isoflavona. Los conjugados de isoflavona tienen partes adicionales enlazadas a la molécula de glucosa de un glucósido de isoflavona, por ejemplo, la 6''-OAc-genistina contiene un grupo acetato enlazado a la posición seis de la molécula de glucosa de la genistina. Las isoflavonas con aglucona consisten meramente en una parte de isoflavona.

La soja contiene tres "familias" de compuestos de isoflavona que tienen los miembros glucósido, conjugado, y aglucona correspondientes: la familia de la genisteina, la familia de la daidzeina, y la familia de la gliciteina. La familia de la genisteina incluye el glucósido genistina; los conjugados 6''-OMal-genistina (el éster 6''-malonato de la genistina) y 6''-OAc-genistina (el éster 6''-acetato de la genistina); y la genisteina con aglucona. La familia de la daidzeina incluye el glucósido daidzina; los conjugados 6''-OMal-daidzina y 6''-OAc-daidzina; y la aglucona daidzeina. La familia de la gliciteina incluye el glucósido glicitina; el conjugado 6''-OMal-glicitina; y la aglucona gliciteina.

En la producción de productos comerciales, tales como los concentrados de proteína vegetal, el objetivo ha sido eliminar estos materiales. Por ejemplo, en un proceso convencional para la producción de un concentrado de proteína de soja en que se extraen las escamas de soja con un ácido acuoso o un alcohol acuoso para eliminar los materiales solubles en agua de las escamas de soja, se solubilizan muchas de las isoflavonas en el extracto. El extracto de los materiales solubles en agua, incluyendo las isoflavonas, son melazas de soja. Las melazas de soja son un material subproducto en la producción del concentrado de proteína de soja que se descarta típicamente. Las melazas de soja, por lo tanto, son una fuente económica y deseable de isoflavonas, considerando que se pueden separar las isoflavonas de las melazas de soja.

Se ha reconocido recientemente que las isoflavonas contenidas en los materiales de proteína vegetal tales como las semillas de soja tienen valor medicinal. Las isoflavonas con aglucona son de interés particular. La genisteina y la daidzeina pueden reducir significativamente los factores de riesgo cardiovascular. "Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys", Circulation, vol. 90, pág. 1259 (octubre 1994). También se cree que la genisteina y la daidzeina reducen los síntomas de condiciones causadas por niveles reducidos o alterados de estrógeno endógeno en mujeres, tales como la menopausia o el síndrome premenstrual. Además, se ha reconocido recientemente que las isoflavonas con aglucona pueden inhibir el crecimiento de las células cancerosas humanas, tales como las células de cáncer de pecho y las células de cáncer de próstata, tal como se describe en los siguientes artículos: "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene" por Peterson y Barnes, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 179, núm. 1, págs. 661-667, 30 de agosto, 1991; "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation" por Peterson y Barnes, The Prostate, vol. 22, págs. 335-345 (1993); y "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer" por Barnes y col., Mutagens and Carcinogens in the Diet, págs. 239-253 (1990).

Las isoflavonas con aglucona tienen la siguiente fórmula general:

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donde, se pueden seleccionar R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} a partir del grupo que consiste en H, OH y OCH_{3}.

La genisteina tiene la fórmula de arriba donde R^{1}=OH, R^{2}=H, R^{3}=OH, y R^{4}=OH, la daidzeina tiene la fórmula de arriba donde R^{1}=OH, R^{2}=H, R^{3}=H, y R^{4}=OH, y la gliciteina tiene la fórmula de arriba donde R^{1}=OH, R^{2}=OCH_{3}, R^{3}=H, y R^{4}=OH.

En consecuencia es hacia las isoflavonas y hacia la recuperación de un material enriquecido en isoflavona a partir de las melazas de soja hacia donde se dirige la presente invención. Se dirige además la presente invención hacia glucósidos de isoflavona e isoflavonas con aglucona - hacia la conversión de isoflavonas de las melazas de soja en glucósidos de isoflavona e isoflavonas con aglucona, y hacia la recuperación de un material enriquecido con glucósido de isoflavona y un material enriquecido en isoflavona con aglucona a partir de las melazas de soja.

Se conoce un proceso general para convertir los conjugados de isoflavona de proteínas vegetales en isoflavonas con aglucona, y se proporciona en la siguiente solicitud pendiente U.S. Ser. Núm. 08/477.102 solicitada el 7 de junio de 1995, que posee el cesionario de la presente solicitud.

Se conocen otros procesos en la técnica para convertir glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona, tal como se describe en la Japanese Patent Application 258.669 por Obata et al. Tales procesos no proporcionan la recuperación de un material enriquecido en isoflavona a partir de las melazas de soja. Tales procesos tampoco proporcionan la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos con isoflavona o en isoflavonas con aglucona. Además, estos procesos sólo consiguen una extensión moderada de conversión de glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona, y requieren un período sustancial de tiempo para efectuar esta conversión de extensión moderada.

Por lo tanto es un objetivo de la presente invención proporcionar un material enriquecido en isoflavona y un proceso para producir lo mismo a partir de las melazas de soja.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un material enriquecido en glucósido de isoflavona y un proceso para producir lo mismo a partir de las melazas de soja.

Es todavía otro objetivo de la presente invención proporcionar un material enriquecido en isoflavona con aglucona y un proceso para producir lo mismo a partir de las melazas de soja.

La presente invención es un material enriquecido en isoflavona y un proceso para recuperar lo mismo a partir de un material de melazas de soja que contiene isoflavonas. El método comprende proporcionar un material de melazas de soja que contiene isoflavonas, y separar la torta del material de melazas de soja a un pH y a una temperatura suficientes para causar que la mayoría de las isoflavonas estén contenidas en la torta, donde el pH es desde aproximadamente 3,0 hasta aproximadamente 6,5 y la temperatura es desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC durante la separación. La torta es un material enriquecido en isoflavona.

En una representación, se forma un material de isoflavona enriquecido en glucósido a partir de la torta de material enriquecido en isoflavona. Se forma una suspensión acuosa del material enriquecido en isoflavona. Se trata la suspensión a una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC y a un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5 durante un tiempo suficiente para convertir los conjugados de isoflavona en el material enriquecido en isoflavona en glucósidos de isoflavona. Entonces se puede separar de la suspensión una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona.

En otra representación, se forma un material enriquecido en isoflavona con aglucona a partir de la torta de material enriquecido en isoflavona. Se forma una suspensión acuosa de material enriquecido en isoflavona. Se trata la suspensión a una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC y a un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5 durante un tiempo suficiente para convertir los conjugados de isoflavona en el material enriquecido en isoflavona en glucósidos de isoflavona. Se pone en contacto un enzima capaz de romper enlaces 1,4-glucósido con los glucósidos de isoflavona en la suspensión a una temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 75ºC y a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9 durante un tiempo suficiente para convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se puede separar de la suspensión una torta de material enriquecido en isoflavona con aglucona.

En otro aspecto, la presente invención es un material enriquecido en glucósido de isoflavona y un proceso para recuperar lo mismo de las melazas de soja. Se tratan las melazas de soja a una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC y a un valor de pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 13,5 durante un tiempo suficiente para convertir los conjugados de isoflavona contenidos en las melazas de soja a glucósidos de isoflavona. Se separa del material de melazas de soja una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona a un pH y a una temperatura suficientes para causar que la mayoría de los glucósidos de isoflavona estén contenidos en la torta.

En otro aspecto, la presente invención es un material enriquecido en isoflavona con aglucona, y un proceso para recuperar lo mismo de las melazas de soja. Se tratan las melazas de soja a una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC y a un valor de pH de entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5 durante un período de tiempo suficiente para convertir los conjugados de isoflavona contenidos en las melazas de soja en glucósidos de isoflavona. Se pone en contacto un enzima capaz de romper enlaces 1,4-glucósido con los glucósidos de isoflavona en el material de melazas de soja a una temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 75ºC y a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9 durante un tiempo suficiente para convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se puede separar del material de melazas de soja una torta de material enriquecido en isoflavona con aglucona a un pH y a una temperatura suficientes para causar que la mayoría de las isoflavonas con aglucona estén contenidas en la torta.

El material de partida para los procesos que se describen aquí son melazas de soja. Las melazas de soja son un subproducto de varios procesos comerciales que implican semillas de soja o derivados de las semillas de soja, tales como los procesos para producir extractos de proteínas, suero de proteína, y productos de concentrados de proteína. De acuerdo con esto, se producen las melazas de soja en grandes cantidades hasta tal extensión que las melazas de soja son una comodidad relativamente económica.

Se considera generalmente que las melazas de soja son los productos solubles de soja que se han eliminado de los insolubles lavando con alcohol o ácido. Las melazas de soja son típicamente una mezcla acuosa que contiene aproximadamente un 50% o más de sólidos que comprenden aproximadamente un 6% (basado en el peso total de las melazas de soja) de proteína, aproximadamente un 3% de ceniza, aproximadamente un 5% de grasa, y aproximadamente un 36% de carbohidratos. También se conocen las melazas de soja en la técnica como los productos solubles de la semilla de soja. Se refiere el "material de melazas de soja" tal como se usa aquí el término a una composición que contiene melazas de soja, y/o derivados de melazas de soja tales como un material de melazas de soja enriquecido en glucósido de isoflavona y un material de melazas de soja enriquecido en isoflavona con aglucona. De acuerdo con esto, se usan estos términos aquí de forma intercambiable.

En una representación preferida, se produce el material de partida de las melazas de soja a partir de escamas de soja desgrasadas de las que se ha eliminado el aceite mediante extracción del disolvente de una manera convencional. Se extraen las escamas de soja desgrasadas con agua que se ha ajustado hasta un pH acídico, preferiblemente desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 5, mediante la adición de uno o más ácidos adecuados tales como el ácido acético, el ácido sulfúrico, el ácido fosfórico, el ácido clorhídrico o cualquier otro reactivo adecuado. Preferiblemente la relación del extractante acídico respecto a las escamas de soja es desde aproximadamente 16:1 hasta aproximadamente 20:1 en peso. Para mejorar la eficacia de la extracción, se puede elevar la temperatura del extractante por encima de la temperatura ambiente, preferiblemente entre aproximadamente 32ºC y aproximadamente 55ºC. Después de la extracción, se elimina el extracto de las melazas de soja de los productos insolubles de soja.

En otra representación, se extraen las escamas de soja desgrasadas con alcohol acuoso para producir el material de partida de las melazas de soja. Preferiblemente, se extraen las escamas con aproximadamente un 80% de etanol acuoso a una relación desde aproximadamente 16:1 hasta aproximadamente 20:1 en peso de extractante respecto a las escamas de soja. Se puede elevar la temperatura del alcohol extractante por encima de la temperatura ambiente, preferiblemente desde aproximadamente 32ºC hasta aproximadamente 55ºC, para mejorar la eficacia de la extracción. Entonces se elimina el extracto de melazas de soja de los productos insolubles de soja para proporcionar el material de partida de las melazas de soja.

Se puede recuperar un material enriquecido en isoflavona a partir del material de partida de las melazas de soja. Se puede diluir el material de melazas de soja con agua hasta un contenido en sólidos desde aproximadamente un 6% hasta aproximadamente un 13%, con un 13% siendo más preferido. La dilución del material de melazas de soja no es un requerimiento para el proceso; sin embargo, diluir el material de melazas de soja relativamente espeso facilita el procesado del material.

Se trata el material de melazas de soja, preferiblemente diluido, a un pH y a una temperatura en la cual se separarán la mayoría de las isoflavonas de las melazas de soja al realizar un procedimiento de separación. Se trata el material de melazas de soja a un pH desde aproximadamente 3,0 hasta aproximadamente 6,5 y a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC para maximizar la insolubilidad de las isoflavonas en las melazas de soja. Se pueden separar las isoflavonas de las melazas de soja a valores de pH fuera del rango preferido y a temperaturas por encima de 35ºC; sin embargo, estas condiciones son menos preferidas puesto que se separan menos isoflavonas de las melazas de soja en el procedimiento de separación. Se puede ajustar el pH de las melazas de soja con un reactivo acídico o básico convencional adecuado, si es necesario. Se prefiere más que se ajuste el pH de las melazas de soja hasta aproximadamente un 4,5. También se prefiere congelar o enfríar las melazas de soja hasta una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC, y más preferiblemente hasta una temperatura desde aproximadamente 4ºC hasta aproximadamente 7ºC.

Entonces se somete el material de melazas de soja a un procedimiento de separación para separar una torta de material enriquecido en isoflavona del material de melazas de soja. Se lleva a cabo la separación mientras se mantiene el material de melazas de soja bajo las condiciones de pH y de temperatura que se han descrito.

En una representación, se separa la torta de material enriquecido en isoflavona centrifugando las melazas de soja y decantando el sobrenadante de la torta. Se lleva a cabo preferiblemente la centrifugación a aproximadamente 3.000 hasta aproximadamente 10.000 rpm durante aproximadamente 30 minutos desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC.

En otra representación, se puede separar la torta enriquecida en isoflavona del material de melazas de soja mediante filtración. Se realiza la filtración preferiblemente en las condiciones de pH y de temperatura que se han descrito previamente, más preferiblemente a un pH de aproximadamente 4,5 y a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC.

En otro aspecto de la presente invención, se puede recuperar una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona a partir de las melazas de soja. Se obtiene un material de partida de melazas de soja tal como se describió arriba. Aunque no es un requerimiento, se prefiere que se diluya el material de melazas de soja hasta un contenido en sólidos de desde aproximadamente un 6% hasta aproximadamente un 13%, y más preferiblemente aproximadamente un 13%, para facilitar el procesado del material.

Entonces se lleva a cabo una operación de conversión sobre las melazas de soja para convertir los conjugados de isoflavona en las melazas de soja en glucósidos de isoflavona. Una porción sustancial de las isoflavonas en las melazas de soja son los conjugados de isoflavona, en consecuencia la conversión incrementa sustancialmente la cantidad de glucósidos de isoflavona en el material de melazas de soja. Se ha encontrado que la conversión era dependiente del pH y de la temperatura de las melazas de soja.

El rango de pH para la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona en las melazas de soja es desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5. Se debería ajustar el pH de las melazas de soja hasta el pH deseado, si es necesario, con una base adecuada, agente cáustico, o un reactivo básico si se va a elevar el pH, o, si se va a disminuir el pH, con un ácido o un reactivo ácido adecuado. Se ha encontrado que la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona está catalizada por base, y de este modo es más preferible utilizar un pH elevado para conseguir una conversión rápida. El pH más preferido para la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona es un pH desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11.

El rango de temperatura para la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona en las melazas de soja es desde 2ºC hasta aproximadamente 120ºC. El rango de temperatura en que la conversión ocurre fácilmente depende del pH del material de las melazas de soja. Los inventores han encontrado que la conversión ocurre fácilmente a temperaturas menores cuando el pH es relativamente elevado. Por ejemplo, a un pH de aproximadamente 11 la conversión ocurre rápidamente y eficientemente en un rango de temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 50ºC. A un pH de aproximadamente 9 la conversión ocurre eficientemente dentro de un rango de temperatura desde 45ºC hasta aproximadamente 75ºC. Cuando el pH de las melazas de soja es relativamente bajo, la conversión ocurre a temperaturas mayores. Por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6, la conversión ocurre dentro de un rango de temperatura desde aproximadamente 80ºC hasta aproximadamente 120ºC. En una representación preferida, se efectúa la conversión a aproximadamente 35ºC y a un pH de aproximadamente 11. En otra representación preferida, se efectúa la conversión a una temperatura de aproximadamente 73ºC y a un pH de aproximadamente 9.

El período de tiempo que se requiere para la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona depende principalmente del pH y del rango de temperatura que se utiliza en las melazas de soja. Tales tiempos de conversión típicamente están en el rango desde aproximadamente 15 minutos hasta varias horas o más. La conversión ocurre más rápidamente a un pH mayor y a una temperatura mayor. A un pH de aproximadamente 9, la conversión es sustancialmente completa en aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 6 horas a 73ºC. En una representación más preferida, se convierten los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona en aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 1 hora, preferiblemente 45 minutos aproximadamente, a un pH de aproximadamente 11 y a una temperatura de aproximadamente 35ºC.

La conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona es remarcablemente eficiente, convirtiendo como mínimo una mayoría, y preferiblemente sustancialmente todos los conjugados de isoflavona presentes en los glucósidos de isoflavona. Se refiere el término una "mayoría" a una extensión de la conversión de como mínimo un 50% aproximadamente. Se refiere el término "todos sustancialmente" a una extensión de la conversión de como mínimo un 80% aproximadamente, y más preferiblemente como mínimo un 90% aproximadamente.

Siguiendo la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona, se puede separar una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona del material de melazas de soja. Se trata el material de melazas de soja a un pH y a una temperatura en que se separarán la mayoría de los glucósidos de isoflavona del material de melazas de soja en el procedimiento de separación. Se mantiene en una representación preferida el material de melazas de soja a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6,5, más preferiblemente aproximadamente 4,5, y a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC, y más preferiblemente desde aproximadamente 4ºC hasta aproximadamente 7ºC, durante el proceso de separación. Se puede ajustar el pH del material de melazas de soja con un reactivo acídico o básico convencional adecuado, si es necesario.

Se puede efectuar la separación mediante métodos convencionales para separar los sólidos de un líquido. Se separa preferiblemente la torta enriquecida en glucósido de isoflavona mediante centrifugación o filtración tal como se describió arriba respecto a separar una torta enriquecida con isoflavona a partir de un material de melazas de soja.

En incluso otro aspecto de la invención, se puede recuperar una torta de material enriquecido en isoflavona con aglucona a partir de melazas de soja. Se obtiene un material de partida de melazas de soja tal como se describió arriba, preferiblemente diluido con agua hasta un contenido en sólidos desde aproximadamente un 6% hasta aproximadamente un 13%. Se trata el material de partida de melazas de soja para convertir los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona tal como se describió arriba.

Se lleva a cabo entonces una operación de conversión enzimática en el material de melazas de soja enriquecidas en glucósido de isoflavona poniendo en contacto un enzima adecuado con glucósidos de isoflavona en el material de melazas de soja a un pH y a una temperatura adecuados para convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. El proceso de conversión en dos pasos convierte efectivamente sustancialmente todos los conjugados de isoflavona y los glucósidos de isoflavona en el material de melazas de soja en isoflavonas con aglucona, incrementando sustancialmente la cantidad de isoflavonas de aglucona en el material de melazas de soja.

Se ha encontrado que la conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona es dependiente de una variedad de factores incluyendo el tipo de enzimas presente en el material de melazas de soja, la distribución de las concentraciones de enzimas, las actividades de los enzimas, y el pH y la temperatura del material de melazas de soja durante la conversión. Los enzimas que se requieren para efectuar la conversión son enzimas capaces de romper el enlace glucosídico entre la parte isoflavona y la molécula de glucosa de los glucósidos de isoflavona. En una representación preferida, los enzimas son los enzimas sacaridasa, esterasa, o gluco-amilasa capaces de romper enlaces 1,4-glucósido. Los enzimas pueden estar presentes inherentemente en el material de melazas de soja, o pueden ser enzimas disponibles comercialmente que se añaden sobre el material de melazas de soja. Se refieren aquí los enzimas inherentemente presentes como enzimas "residuales", y se refieren aquí los enzimas que se añaden sobre las melazas de soja como enzimas "complementarias".

Debería estar presente suficiente enzima en el material de melazas de soja para convertir como mínimo una mayoría, y preferiblemente todo sustancialmente, de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Generalmente, si los enzimas residuales en el material de melazas de soja son insuficientes para efectuar la conversión, se deberían añadir enzimas complementarias en el material de melazas de soja. En una representación preferida, se añaden los enzimas complementarias sobre el material de melazas de soja sin tener en cuenta si están presentes suficientes enzimas residuales en el material de melazas de soja puesto que la adición de enzimas complementarias disminuye dramáticamente el tiempo necesario para efectuar una conversión sustancialmente completa de los glucósidos en agluconas. Si se añaden enzimas complementarias, se deberían añadir enzimas complementarias de modo que la concentración total de enzima presente es desde aproximadamente un 0,1% hasta aproximadamente un 10% en peso de los sólidos en el material de melazas de soja sobre una base seca.

Se seleccionan los enzimas complementarias en base a la actividad óptima en condiciones de pH y de temperatura seleccionadas, y la efectividad del coste. Los enzimas complementarias son enzimas capaces de romper el enlace entre la parte de isoflavona y la molécula de glucosa de los glucósidos de isoflavona, tales como los enzimas sacaridasa, esterasa, y gluco-amilasa capaces de romper enlaces 1,4-glucósido. Los enzimas complementarias preferidos son enzimas alfa- y beta-glucosidasa disponibles comercialmente, enzimas beta-galactosidasa, enzimas gluco-amilasa, y enzimas pectinasa. Se prefieren particularmente los enzimas tales como la Biopectinasa 100L (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6), la Biopectinasa 300L (rango de pH óptimo desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6), la Biopectinasa OK 70L (rango de pH óptimo desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6), la Biolactasa 30.000 (rango de pH óptimo desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6), la Lactasa Neutra (rango de pH óptimo desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8), los cuales están todos disponibles en Quest International, 1833 57th Street, Post Office Box 3917, Sarasota, Florida 34243. También se prefieren especialmente la Lactasa F (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6), y la Lactasa 50.000 (rango de pH óptimo desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6), ambos disponibles en Amano International Enzyme Co., Inc., Post Office Box 1000, Troy, Virginia 22974. Otros enzimas complementarias que se prefieren particularmente incluyen el G-Zyme G990 (pH óptimo desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6) y el Enzeco Fungal Lactase Concentrate (pH óptimo desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6) disponibles en Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, New York, New York 10121; el Lactozyme 3000L (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8), y el Alpha-Gal 600L (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6,5), disponible en Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., 33 Turner Road, Danbury, Connecticut 06813; el Maxilact L2000 (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6), disponible en Gist Brocades Food Ingredients, Inc., King of Prussia, Pennsylvania, 19406; y la Lactasa Neutra (que se utiliza preferiblemente en un rango de pH desde aproximadamente 6 hasta
aproximadamente 8), disponible en Pfizer Food Science Group, 205 East 42nd Street, New York, New York 10017.

El rango de pH para la conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona es desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9. El pH que se utiliza depende primariamente del tipo de enzima que se usa, y se debería seleccionar de acuerdo con ello. El enzima residual es activo dentro de un rango de pH desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 9, aunque se cree que se disminuye el pH del material de melazas de soja durante el curso de la conversión. Los enzimas complementarias son activos dentro de un rango de pH óptimo especificado por el fabricante del enzima, tal como se muestra arriba para varios enzimas específicos. Típicamente los enzimas complementarias son activos ya sea en un rango de pH neutro desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8, o en un rango de pH acídico desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6.

Se puede ajustar el pH del material de melazas de soja hasta un valor deseado para conducir la conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se reduce el pH en muchos ejemplos a partir del pH relativamente elevado o básico que se requiere para convertir los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona mediante la adición de uno o más ácidos adecuados tales como el ácido acético, el ácido sulfúrico, el ácido fosfórico, el ácido clorhídrico, o cualquier otro reactivo adecuado.

El rango de temperatura del material de melazas de soja para la conversión de glucósidos en agluconas es desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 75ºC. La temperatura afecta significativamente a la actividad de los enzimas, y en consecuencia, a la velocidad de conversión. Los enzimas complementarias pueden ser activos por encima de 70ºC, por ejemplo el Alpha-Gal 600L es activo a 75ºC; sin embargo, se prefiere conducir la conversión a temperaturas bajas para evitar la desactivación de los enzimas. En una representación preferida, se efectúa la conversión entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 45ºC.

El tiempo que se requiere para la conversión de los glucósidos en agluconas depende de factores relacionados con el enzima, particularmente la concentración, y la temperatura y el pH del sistema. En muchos casos es posible conseguir una conversión sustancialmente completa en 24 horas; sin embargo, se prefiere que se añada el enzima complementario para incrementar dramáticamente la velocidad de la reacción. El enzima complementario seleccionado, la concentración de enzima, el pH y la temperatura causarán preferiblementte una conversión sustancialmente completa en aproximadamente 2 horas, y más preferiblemente en aproximadamente 1 hora.

La conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona es remarcablemente eficiente, convirtiendo como mínimo una mayoría, y preferiblemente sustancialmente todos los glucósidos presentes en agluconas. Se refiere el término "una mayoría" a una extensión de conversión de como mínimo un 50% aproximadamente. Se refiere el término "sustancialmente todos" a una extensión de conversión de como mínimo aproximadamente un 80%, y más preferiblemente como mínimo aproximadamente un 90%.

Siguiendo la conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona, se puede separar una torta de material enriquecido en isoflavona con aglucona del material de melazas de soja. Se trata el material de melazas de soja a un pH y a una temperatura en que se separará la mayoría de las isoflavonas de aglucona del material de melazas de soja en un procedimiento de separación. Preferiblemente, se mantiene el material de melazas de soja a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6,5, más preferiblemente aproximadamente 4,5, y a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC, y más preferiblemente desde aproximadamente 4ºC hasta aproximadamente 7ºC, durante el proceso de separación. Se puede ajustar el pH del material de melazas de soja con un reactivo ácido o básico convencional adecuado, si es necesario.

Se puede efectuar la separación mediante medios convencionales para separar sólidos de un líquido. Se separa preferiblemente la torta enriquecida en isoflavona con aglucona mediante centrifugación o filtración tal como se describió arriba respecto a separar una torta enriquecida en isoflavona de un material de melazas de soja.

También se puede producir un material enriquecido en isoflavona con aglucona a partir de un material enriquecido en isoflavona que se ha recuperado a partir de melazas de soja, donde se describe arriba el proceso para recuperar un material enriquecido en isoflavona a partir de melazas de soja. Se añade agua sobre la torta de material enriquecido en isoflavona recuperado para formar una suspensión de material enriquecido en isoflavona. Se diluye preferiblemente la suspensión hasta aproximadamente desde un 6% hasta un 13% en sólidos, aunque se puede usar un mayor contenido en sólidos. Entonces se convierten los conjugados de isoflavona en la suspensión en glucósidos de isoflavona tratando la suspensión bajo las mismas condiciones que se describieron arriba respecto a convertir los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona en melazas de soja. En particular, se trata la suspensión a un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5, preferiblemente desde aproximadamente pH 9 hasta aproximadamente pH 11, y una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC durante un período desde aproximadamente 15 minutos hasta varias horas. Se trata más preferiblemente la suspensión a un pH de aproximadamente 11 y a una temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 50ºC, preferiblemente aproximadamente 35ºC, durante un período de aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 1 hora; o a un pH de aproximadamente 9 y a una temperatura desde aproximadamente 45ºC hasta aproximadamente 75ºC, preferiblemente 73ºC aproximadamente, durante un período desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 6 horas. Si se desea, se puede separar un material enriquecido en glucósido de isoflavona de la suspensión de una manera similar a la separación de un material enriquecido en isoflavona a partir de las melazas de soja que se describieron arriba.

Entonces se convierten los glucósidos de isoflavona en la suspensión en isoflavonas con aglucona bajo las mismas condiciones que se describieron arriba respecto a convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona en el material de melazas de soja. En particular, se ponen en contacto los glucósidos de isoflavona en la suspensión con un enzima capaz de romper la unión glucosídica entre la parte de isoflavona y la molécula de glucosa de los glucósidos de isoflavona bajo condiciones adecuadas de pH y de temperatura durante un período de tiempo suficiente para convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se describen arriba los enzimas preferidos, las condiciones de pH, las temperaturas, y los períodos de tiempo. Se puede separar un material enriquecido en isoflavona con aglucona de la suspensión de una manera similar a la separación de un material enriquecido en isoflavona a partir de las melazas de soja que se describieron arriba.

También se puede producir un material enriquecido en isoflavona con aglucona a partir de un material enriquecido en glucósido de isoflavona que se ha recuperado a partir de un material de melazas de soja, donde se describe arriba el proceso para recuperar un material enriquecido en glucósido de isoflavona a partir de un material de melazas de soja. Se añade agua sobre la torta recuperada del material enriquecido en glucósido de isoflavona para formar una suspensión de material enriquecido en glucósido de isoflavona. Preferiblemente se diluye la suspensión hasta aproximadamente desde un 6% hasta aproximadamente un 13% en sólidos, aunque se puede usar un contenido en sólidos mayor. Se convierten los glucósidos de isoflavona en la suspensión en isoflavonas de aglucona de la misma manera que se describió arriba respecto a la suspensión enriquecida en glucósido de isoflavona que se formó a partir de una suspensión enriquecida en isoflavona. Se puede separar un material enriquecido en isoflavona con aglucona de la suspensión después de la conversión de una manera similar a la separación de un material enriquecido en isoflavona a partir de las melazas de soja que se describieron arriba.

Experimental

Se ilustra la presente invención con más detalle mediante los ejemplos siguientes. Se pretende que los ejemplos sean ilustrativos, y no se deben interpretar como limitantes o de otro modo restrictivos del alcance de la invención de ningún modo.

Tal como se indicó arriba, los materiales de soja, incluyendo las melazas de soja, incluyen las "familias" de isoflavonas de la genisteina, la daidzeina y la gliciteina que tienen los miembros glucósido, conjugado, y aglucona correspondientes, donde la familia de la genisteina contiene los conjugados 6''-OMal-genistina, 6''-OAc-genistina, el glucósido genistina, y la aglucona genisteina; la familia de la daizeina contiene los conjugados 6''-OMal-daidzina, 6''-OAc-daidzina, el glucósido daidzina, y la aglucona daidzeina; y la familia de la gliciteina incluye el conjugado 6''-OMal-glicitina, el glucósido glicitina, y la aglucona gliciteina; En los siguientes ejemplos se miden las concentraciones relativas de las isoflavonas ya sea como una concentración total de una familia de isoflavonas, o como porcentajes individuales de cada isoflavona en una familia de isoflavonas. Por ejemplo, la concentración total de la familia de la genisteina de isoflavonas es la suma de las concentraciones de 6''-OMal-genistina; 6''-OAc-genistina, genistina, y genisteina, y se determina el porcentaje de cada una de las isoflavonas en la familia de la genisteina relativo a las isoflavonas de la otra familia de la genisteina: % genistina + % 6''-OMal-genistina + % 6''-OAc-genistina + % genisteina = 100%.

Ejemplo 1

En un primer experimento, se examina la recuperación de un material enriquecido en isoflavona a partir de melazas de soja a varias concentraciones de melazas de soja. Se mide la concentración total de cada familia de isoflavonas en una muestra de melazas de soja que tiene una concentración seleccionada, en una torta que se ha separado de las muestras de melazas de soja de acuerdo con el método de la invención, y en el suero líquido del que se elimina la torta mediante el procedimiento de separación.

Se analizan las melazas de soja para la concentración total de todas las formas de isoflavonas presentes. Se diluyen las muestras de las melazas de soja con agua hasta un contenido de sólidos de un 28% (dilución 1:2), un 13,7% (dilución 1:4), y un 6,6% (dilución 1:8). Se ajusta el pH de todas las muestras hasta un 4,5. Entonces se centrifugan las muestras tratadas a una velocidad alrededor de 3000 rpm durante 30 minutos para separar y producir suero del líquido y porciones de torta de las muestras. Se centrifuga un conjunto de muestras a una temperatura de 0,6ºC. Se centrifugan las muestras que tienen un 28% y un 13,7% de sólidos de melazas de soja a una temperatura de 60ºC para la comparación con las muestras que tienen la misma concentración de sólidos de melazas de soja que se separan a 0,6ºC. Se analiza el líquido resultante y las porciones de torta de las muestras para la concentración total de todas las formas de isoflavonas presentes.

La Tabla 1 establece las concentraciones de isoflavonas en las diversas fracciones de torta y de líquido que se han obtenido a partir de la prueba que se ha descrito previamente. Los totales indicados son los totales de todas las formas de la isoflavona particular que incluyen las formas de los conjugados, el glucósido, y la aglucona que se expresan en mg de isoflavona por gramo de torta o de sólidos de fracción líquida.

TABLA 1

Muestra	Genisteina Total	Daidzeina Total	Gliciteina Total
	(familia) mg/g	(familia) mg/g	(familia) mg/g
Material de Partida de Melazas
de Soja No Separado	6,1	4,8	1,0
Dilución 1:2
\hskip0.5cm (28% sólidos)	2,8	3,0	0,6
\hskip0.5cm Suero separado a 0,6°C
Dilución 1:2
\hskip0.5cm Torta separada a 0,6°C	16,9	10,9	1,9
Dilución 1:2
\hskip0.5cm Suero separado a 60°C	3,8	4,0	0,8

TABLA 1 (continuación)

Muestra	Genisteina Total	Daidzeina Total	Gliciteina Total
	(familia) mg/g	(familia) mg/g	(familia) mg/g
Dilución 1:2
\hskip0.5cm Torta separada a 60°C	14,1	8,2	1,5
Dilución 1:4
\hskip0.5cm (13,7% sólidos)	3,0	3,4	0,7
\hskip0.5cm Suero separado a 0,6°C
Dilución 1:4
\hskip0.5cm Torta separada a 0,6°C	18,3	11,0	2,0
Dilución 1:4
\hskip0.5cm Suero separado a 60°C	4,4	4,3	0,8
Dilución 1:4
\hskip0.5cm Torta separada a 60°C	13,4	7,2	1,5
Dilución 1:8
\hskip0.5cm (6,6% sólidos)
\hskip0.5cm Suero separado a 0,6°C	4,3	4,5	0,9
Dilución 1:8
\hskip0.5cm Torta separada a 0,6°C	20,1	10,2	2,1

En todas las muestras separadas, la concentración de isoflavonas es significativamente mayor en la torta que en el material de partida de las melazas de soja y mucho mayor que la concentración de isoflavonas en los sólidos de la fracción de suero del líquido. Las muestras que se separaron a 0,6ºC contenían una concentración mayor de isoflavonas en la torta que las muestras correspondientes que se separaron a 60ºC, que tenían concentraciones mayores de isoflavonas en los sólidos de la fracción de suero.

Ejemplo 2

En otro experimento, se examina la recuperación de un material enriquecido en glucósido de isoflavona a partir de melazas de soja. Se convierten los conjugados de isoflavona en las melazas de soja en glucósidos de isoflavona, y se separa una torta enriquecida en glucósido de isoflavona del material de melazas de soja. Se determina la extensión de la conversión por la disminución cuantitativa del porcentaje y de la concentración de ésteres de malonato y acetato de una familia de isoflavonas acoplada con un incremento cuantitativo correspondiente del porcentaje del glucósido de la misma familia de isoflavonas.

Se analiza el material de partida de las melazas de soja para la concentración de compuestos de isoflavonas individuales. Se hacen dos muestras de material de melazas de soja diluyendo las melazas de soja con agua en las siguientes proporciones: 1:4 (100 g de melazas + 300 g de agua); y 1:8 (50 g de melazas + 350 g de agua). Se ajusta el pH de las muestras hasta 11, y se mantuvo la temperatura de las muestras a 35ºC durante 30 minutos. Entonces se ajusta el pH de las muestras hasta 4,5 y se ajusta la temperatura hasta 4ºC. Se centrifugan las mezclas a 10.000 rpm a 4ºC para separar las mezclas de melazas en una torta y en un suero líquido. Se analizan el suero y la torta para la concentración de compuestos de isoflavona individuales.

La Tabla 2 ilustra el cambio en las proporciones entre las diversas formas de isoflavonas resultantes de la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona según se comparó con el material de partida de las melazas de soja. Se indican las concentraciones de isoflavona como partes por millón (ppm) en la muestra, y como porcentajes de la cantidad total de la isoflavona particular (el total de las formas de conjugado, glucósido, y aglucona) dentro de la porción de líquido o de torta.

TABLA 2a

Muestra	Genistina	6''-OMAL- Genistina	6''-OAC- Genistina	Genisteina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	4678	1329	0	88
\hskip0.5cm % isoflavona	77	22	0	1
Dilución 1:4
Suero
\hskip0.5cm ppm	2221	17	0	30
\hskip0.5cm % isoflavona	98	1	0	1
Dilución 1:4
Torta
\hskip0.5cm ppm	28621	68	0	261
\hskip0.5cm % isoflavona	99	0	0	1
Dilución 1:8
Suero
\hskip0.5cm ppm	2852	24	0	36
\hskip0.5cm % isoflavona	98	1	0	1
Dilución 1:8
Torta
\hskip0.5cm ppm	27517	101	0	272
\hskip0.5cm % isoflavona	99	0	0	1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2b

Muestra	Daidzina	6''-OMAL- Daidzina	6''-OAC- Daidzina	Daidzeina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	3533	928	210	84
\hskip0.5cm % isoflavona	74	20	4	2
Dilución 1:4
Suero
\hskip0.5cm ppm	2652	179	29	21
\hskip0.5cm % isoflavona	92	6	1	1
Dilución 1:4
Torta
\hskip0.5cm ppm	16133	192	0	232
\hskip0.5cm % isoflavona	97	1	0	1
Dilución 1:8
Suero
\hskip0.5cm ppm	3356	187	0	27
\hskip0.5cm % isoflavona	94	5	0	1
Dilución 1:8
Torta
\hskip0.5cm ppm	12617	138	0	245
\hskip0.5cm % isoflavona	97	1	0	2

TABLA 2c

Muestra	Glicitina	6''-OMAL- Glicitina	Gliciteina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	500	105	360
\hskip0.5cm % isoflavona	52	11	37
Dilución 1:4
Suero
\hskip0.5cm ppm	341	28	0
\hskip0.5cm % isoflavona	92	8	0
Dilución 1:4
Torta
\hskip0.5cm ppm	1442	0	66
\hskip0.5cm %isoflavona	96	0	4
Dilución 1:8
Suero
\hskip0.5cm ppm	406	28	0
\hskip0.5cm % isoflavona	94	6	0
Dilución 1:8
Torta
\hskip0.5cm ppm	1146	0	0
\hskip0.5cm % isoflavona	100	0	0

En todas las muestras sometidas a condiciones para la conversión de los conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona el porcentaje de glucósidos de isoflavona en ambas porciones de torta y de líquido es significativamente mayor que en la muestra de melazas de soja sin convertir correspondiente, y el porcentaje de los conjugados de isoflavona correspondiente en las muestras es significativamente menor, demostrando que se convierte una porción grande de conjugados de isoflavona en su forma glucósido. Además, durante una separación se separa una proporción grande de isoflavonas de glucósido en la torta para formar un material enriquecido en glucósido de isoflavona, como se puede ver a partir de las concentraciones relativas del material de partida de melazas de soja y las porciones de suero y de torta de cada muestra.

Ejemplo 3

En otro experimento, se examina la conversión de isoflavonas en isoflavonas con aglucona en las melazas de soja. Se convierten los conjugados de isoflavona en las melazas de soja en glucósidos de isoflavona, y entonces se convierten los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se determina la extensión de la conversión de los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona por la disminución cuantitativa de la concentración de glucósido de una familia de isoflavonas acoplada con un incremento cuantitativo correspondiente del porcentaje de aglucona de la misma familia de isoflavonas.

Se diluye el material de partida de melazas de soja 1:4 con agua y se analiza para la concentración de compuestos de isoflavona individuales. Entonces se ajusta el pH de las melazas hasta 11. Se mantienen las melazas de soja a temperatura ambiente durante 1 hora para producir un material de melazas de soja enriquecido en glucósido. Se analiza el material de melazas de soja enriquecido en glucósido para la concentración de compuestos de isoflavona individuales. Se preparan cuatro muestras a partir del material de melazas de soja enriquecido en glucósido después de que se ajuste el pH del material hasta 4,5. Se inocula cada muestra con un enzima, donde se añaden los siguientes enzimas sobre las muestras, respectivamente, en un 10% en peso de los sólidos de melazas en cada muestra: G-Zyme 990, Biopectinasa 100L, Lactasa 50.000, y Alpha-Gal 600L. Entonces se tratan las muestras a 50ºC durante 6 horas para formar un material de melazas de soja enriquecido en isoflavona con aglucona. Entonces se analizan las melazas de soja enriquecidas en isoflavona con aglucona para el contenido de isoflavona.

La Tabla 3 ilustra la distribución entre las diversas formas de isoflavonas resultantes de la prueba que se ha descrito previamente. Se indican las concentraciones de isoflavona como partes por millón (ppm) en la muestra, y como porcentajes de la cantidad total de la isoflavona particular (el total de las formas del conjugado, el glucósido, y la aglucona).

TABLA 3a

Muestra	Genistina	6''-OMAL- Genistina	6''-OAC- Genisteina	Genistina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	4678	1329	0	88
\hskip0.5cm % isoflavona	77	22	0	1
Melazas de Soja ricas
en Glucósidos
\hskip0.5cm ppm	6763	0	0	104
\hskip0.5cm % isoflavona	98	0	0	2
G-Zyme 990, 10%
\hskip0.5cm ppm	3903	0	0	1993
\hskip0.5cm % isoflavona	66	0	0	44
Biopectinasa 100L, 10%
\hskip0.5cm ppm	2865	0	0	2919
\hskip0.5cm %isoflavona	50	0	0	50
Lactasa 50.000 10%
\hskip0.5cm ppm	0	0	0	4601
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	0	100
Alpha-Gal 600L 10%
\hskip0.5cm PPm	28	0	0	4566
\hskip0.5cm % isoflavona	1	0	0	99

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3b

Muestra	Daidzina	6''-OMAL- Daidzina	6''-OAC- Daidzina	Daidzeina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	3533	928	210	84
\hskip0.5cm % isoflavona	74	20	4	2
Melazas de Soja ricas
en Glucósidos
\hskip0.5cm ppm	4377	0	0	43
\hskip0.5cm % isoflavona	99	0	0	1
G-Zyme 990, 10%
\hskip0.5cm ppm	840	0	82	2331
\hskip0.5cm %isoflavona	27	0	2	71
Biopectinasa 100L, 10%
\hskip0.5cm ppm	541	0	94	2701
\hskip0.5cm % isoflavona	16	3	81
Lactasa 50.000 10%
\hskip0.5cm ppm	0	0	92	2875
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	3	97
Alpha-Gal 600L 10%
\hskip0.5cm ppm	0	0	89	2882
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	3	97

TABLA 3c

Muestra	Glicitina	6''-OMAL-Glicitina	Gliciteina
Melazas de Soja
\hskip0.5cm ppm	500	105	360
\hskip0.5cm % isoflavona	52	11	37
Melazas de Soja ricas
en Glucósidos
\hskip0.5cm ppm	433	0	0
\hskip0.5cm % isoflavona	100	0	0
G-Zyme 990, 10%
\hskip0.5cm ppm	346	0	114
\hskip0.5cm % isoflavona	75	0	25
Biopectinasa 100L, 10%
\hskip0.5cm ppm	195	0	237
\hskip0.5cm % isoflavona	45	0	55
Lactasa 50.000 10%
\hskip0.5cm ppm	0	0	366
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	100
Alpha-Gal 600L 10%
\hskip0.5cm ppm	0	0	356
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	100

\vskip1.000000\baselineskip

El contenido de isoflavona con aglucona de las muestras que se han tratado enzimáticamente es significativamente mayor que las melazas de soja y el material de melazas de soja enriquecido en glucósido, indicando que el tratamiento enzimático convertía cantidades sustanciales de isoflavonas de glucósido en isoflavonas con aglucona. La selección del enzima adecuado, la concentración de enzima, el pH y la temperatura para la conversión permite la conversión de sustancialmente todos los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona, tal como se demostró por la distribución de isoflavona en las muestras de Lactasa 50.000 y Alpha-Gal 600L.

Ejemplo 4

En un experimento final, se examina el contenido de isoflavona de un material enriquecido en isoflavona, un material enriquecido en glucósido de isoflavona, y un material enriquecido en isoflavona con aglucona y se compara la distribución de las isoflavonas en los materiales. Se diluyen las melazas de soja hasta una proporción 1:4 con agua. Se ajusta una muestra de las melazas de soja diluidas hasta un pH de 4,5, se congela hasta una temperatura de 0,6ºC en un baño de hielo durante 30 minutos, y se centrifuga a una velocidad de 3000 rpm durante 30 minutos para separar una torta de material enriquecido en isoflavona. Entonces se ajustan las melazas de soja diluidas restantes hasta un pH de 11 con hidróxido de sodio y se tratan a 50ºC durante 1 hora para convertir conjugados de isoflavona en las melazas en glucósidos de isoflavona. Se ajusta una muestra de melazas enriquecida en glucósido hasta un pH de 4,5, se congela hasta una temperatura de 0,6ºC en un baño de hielo durante 30 minutos, y se centrifuga a una velocidad de 3000 rpm durante 30 minutos para separar una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona. Entonces se ajustan las melazas de soja diluidas restantes hasta un pH de 11 con hidróxido de sodio y se tratan a 50ºC durante 1 hora para convertir los conjugados de isoflavona en las melazas en glucósidos de isoflavona. Se ajusta una muestra de las melazas enriquecidas en glucósido hasta un pH de 4,5, se enfría hasta una temperatura de 0,6ºC en un baño de hielo de 30 minutos, y se centrifuga a una velocidad de 3000 rpm durante 30 minutos para separar una torta de material enriquecido en glucósido de isoflavona. Se ajusta el material de melazas de soja enriquecido en glucósido de isoflavona restante hasta un pH de 4,5, y se añade el enzima G-Zyme 990 sobre el material a una concentración de 2,6 g de enzima/100 g de material de melazas. Entonces se tratan el enzima y el material de melazas de soja enriquecido en glucósido de isoflavona a 50ºC desde 18 hasta 20 horas para convertir los glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona. Se enfría una muestra del material de melazas de soja enriquecido en isoflavona con aglucona hasta una temperatura de 0,6ºC en un baño de hielo durante 30 minutos, y se centrifuga a una velocidad de 3000 rpm durante 30 minutos para separar una torta de material enriquecido en isoflavona con aglucona. Entonces se analizan las tortas recuperadas de material enriquecido en isoflavona, material enriquecido en glucósido de isoflavona, y material enriquecido en isoflavona con aglucona para el contenido de isoflavona.

La Tabla 4 de abajo muestra la distribución de isoflavonas en las tortas de material enriquecido en isoflavona, material enriquecido en glucósido de isoflavona, y material enriquecido en isoflavona con aglucona. Se indica la distribución de isoflavonas como porcentajes de la cantidad total de la isoflavona particular (el total de las formas del conjugado, el glucósido, y la aglucona).

TABLA 4a

Muestra	Genistina	6''-OMAL-Genistina	6''-OAC-Genistina	Genisteina
Material rico en Isoflavona
\hskip0.5cm % isoflavona	83	16	0	1
Material rico en Glucósido
\hskip0.5cm % isoflavona	99	0	0	1
Material rico en Aglucona
\hskip0.5cm % isoflavona	3	0	0	97

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TABLA 4b

Muestra	Daidzina	6''-OMAL-Daidzina	6''-OAC-Daidzina	Daidzeina
Material rico en Isoflavona
\hskip0.5cm % isoflavona	81	12	5	1
Material rico en Glucósido
\hskip0.5cm % isoflavona	99	0	0	1
Material rico en Aglucona
\hskip0.5cm % isoflavona	0	0	0	100

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4c

Muestra	Glicitina	6''-OMAL-Glicitina	Gliciteina
Material rico en Isoflavona
\hskip0.5cm % isoflavona	40	8	52
Material rico en Glucósido
\hskip0.5cm % isoflavona	95	0	5
Material rico en Aglucona
\hskip0.5cm % isoflavona	54	18	28

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede ver la efectividad de los pasos de conversión en la distribución de isoflavonas de los materiales. El material enriquecido en glucósidos de isoflavona contiene cantidades significativamente mayores de glucósidos de isoflavona que el material enriquecido en isoflavona y el material de isoflavona con aglucona, que tiene un contenido de isoflavona que está comprendido casi completamente por glucósidos de isoflavona. El material enriquecido en isoflavona con aglucona contiene cantidades significativamente mayores de isoflavonas con aglucona que el material enriquecido en glucósidos de isoflavona y el material enriquecido en isoflavona, teniendo un contenido en isoflavonas que está comprendido casi completamente por isoflavonas con aglucona.

En los ejemplos de arriba, todos los porcentajes que se indicaron para 6''-OMal-genistina, 6''-OAc-genistina, 6''-OMal-daidzina, glicitina, 6''-OMal-glicitina, y gliciteina son valores calculados. Lo siguiente es una descripción de un método para cuantificar isoflavonas en productos de soja. Se extraen las isoflavonas a partir de productos de soja mezclando 0,75 gramos de muestra (polvo secado con pulverizador o finamente molido) con 50 ml de disolvente metanol/agua 80/20. Se agita la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente con un agitador orbital. Después de 2 horas, se eliminan los materiales no disueltos restantes mediante filtración a través de un papel de filtro Whatman núm. 42. Se diluyen cinco ml del filtrado con 4 ml de agua y 1 ml de metanol.

Se separan las isoflavonas extraídas mediante HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficacia) usando una columna de fase inversa Hewlett Packard C18 Hypersil. Se inyectan las isoflavonas en la columna y se eluyen con un gradiente de disolvente partiendo de un 88% de metanol, un 10% de agua, y un 2% de ácido acético glacial y acabando con un 98% de metanol y un 2% de ácido acético glacial. A una velocidad de flujo de 0,4 ml/min, se resuelven claramente todas las isoflavonas - genistina, 6''-O-acetilgenistina, 6''-O-malonilgenistina, genisteina, daidzina, 6''-O-acetildaidzina, 6''-O-malonildaidzina, daidzina, glicitina y sus derivados y gliciteina. La detección de picos es mediante absorbancia UV a 260 nm. Se llevó a cabo la identificación de los picos mediante un espectrómetro de masas-HPLC.

Se consigue la cuantificación usando estándares puros (genistina, genisteina, daidzina y daidzeina) que se obtuvieron a partir de Indofine Chemical Company, Sommerville, NJ. Se calculan los factores de respuesta (área integrada/concentración) para cada uno de los compuestos de arriba y se usan para muestras desconocidas cuantitativas. Para las formas conjugadas para las que no están disponibles los estándares puros, se asume que los factores de respuesta son aquéllos de la molécula madre pero que se han corregido para la diferencia de peso molecular. Se asume que el factor de respuesta para la glicitina es aquél para la genistina que se ha corregido para la diferencia de peso molecular. Este método proporciona las cantidades de cada isoflavona individual. Por conveniencia, se puede calcular la genisteina total, la daidzeina total y la gliciteina total, y representa el peso agregado de estos compuestos si se convierten todas las formas conjugadas en sus formas no conjugadas respectivas. También se pueden medir estos totales directamente mediante un método que usa la hidrólisis ácida para convertir las formas conjugadas.

Claims

1. Un proceso para obtener un material enriquecido en isoflavona a partir de melazas de soja que comprende separar dicho material enriquecido en isoflavona a partir de un material de melazas de soja que contiene isoflavonas, a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6,5 y a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC efectivo para causar que se separe una mayoría de las isoflavonas con el material enriquecido en isoflavona en forma de una torta.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde se separa dicho material enriquecido en isoflavona de dicho material de melazas de soja a un pH de aproximadamente 4,5.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además formar una mezcla acuosa de material de melazas de soja que tiene un contenido en sólidos desde aproximadamente un 3% hasta aproximadamente un 28% antes de separar dicho material enriquecido en isoflavona a partir de dicho material de melazas de soja.

4. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde se separa dicho material enriquecido en isoflavona de dicho material de melazas de soja por centrifugación.

5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, donde se lleva a cabo dicha centrifugación mientras dicho material de melazas de soja está a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC y a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6,5.

6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, donde se separa dicho material enriquecido en isoflavona de dicho material de melazas de soja por filtración.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6, donde se lleva a cabo dicha filtración mientras el material de melazas de soja está a una temperatura desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 10ºC y a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6,5.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 que además comprende:

formar una suspensión acuosa de dicho material enriquecido en isoflavona separado, conteniendo dicho material enriquecido en isoflavona conjugados de isoflavona; y

tratar dicha suspensión a una temperatura y a un pH durante un período de tiempo suficiente para convertir dichos conjugados de isoflavona en dicha suspensión en glucósidos de isoflavona para formar una suspensión enriquecida en glucósido de isoflavona.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8 donde dicha suspensión acuosa de material enriquecido en isoflavona tiene un contenido en sólidos desde aproximadamente un 6% hasta aproximadamente un 13%.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, donde se trata dicha suspensión a un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13,5 y a una temperatura desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 120ºC durante un período desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas para convertir dichos conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, donde se trata dicha suspensión a un pH desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 11 a una temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 75ºC durante un período desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6 horas para convertir dichos conjugados de isoflavona en glucósidos de isoflavona.

12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 8 hasta la 11, comprendiendo además, después de convertir dichos conjugados de isoflavona en dichos glucósidos de isoflavona, poniendo en contacto un enzima con dichos glucósidos de isoflavona en dicha suspensión a una temperatura y a un pH durante un período de tiempo suficiente para convertir dichos glucósidos de isoflavona en isoflavonas con aglucona para formar una suspensión enriquecida en isoflavona con aglucona.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, donde se pone en contacto dicho enzima con dichos glucósidos de isoflavona en dicha suspensión a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9 y a una temperatura desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 75ºC durante como mínimo 1 hora.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, donde poner en contacto un enzima con dichos glucósidos de isoflavona en dicha suspensión comprende añadir una cantidad efectiva de un enzima complementario sobre dicha suspensión.

15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho enzima complementario comprende un enzima sacaridasa capaz de romper enlaces 1,4-glucósido.

16. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15, que comprende además separar un material enriquecido en isoflavona con aglucona de dicha suspensión.