ES2147660T5 - Extracto proteinico vegetal enriquecido con isoflavonas agluconicas y material proteinico, y materiales con alto contenido en daidceina y genisteina y proceso para producir los mismos. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN MATERIAL PROTEICO Y UN EXTRACTO PROTEICO VEGETAL ENRIQUECIDO CON AGLUCONA ISOFLAVONA, ASI COMO UN MATERIAL CON UN ELEVADO CONTENIDO EN GENISTEINA Y UN MATERIAL CON UN ELEVADO CONTENIDO EN DAIDZEINA. LOS CONJUGADOS DE ISOFLAVONA EN UN MATERIAL VEGETAL SE CONVIERTEN EN GLUCOSIDOS DE ISOFLAVONA MEDIANTE EL TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL A UNA TEMPERATURA Y UN PH DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO SUFICIENTE PARA LLEVAR A CABO LA CONVERSION. LOS GLUCOSIDOS DE ISOFLAVONA SE CONVIERTEN EN GLUCOSA ISOFLAVONAS MEDIANTE REACCION ENZIMATICA. EL MATERIAL VEGETAL SE EXTRAE CON UN EXTRACTANTE ACUOSO QUE POSEE UN PH POR ENCIMA DE APROXIMADAMENTE EL PUNTO ISOELECTRICO DE UNA PROTEINA EN LA MATERIA VEGETAL, PARA EXTRAER LA PROTEINA Y LAS ISOFLAVONAS ANTES O DESPUES DE LA CONVERSION DE LOS CONJUGADOS DE ISOFLAVONA EN LOS GLUCOSIDOS DE ISOFLAVONA O LA CONVERSION DE LOS GLUCOSIDOS DE ISOFLAVONA EN GLUCOSA ISOFLAVONA. SE PRODUCE UN MATERIAL PROTEICO ENRIQUECIDO CON AGLUCONA ISOFLAVONA MEDIANTE LA PRECIPITACION DE LA PROTEINA Y DE LAS AGLUCONA ISOFLAVONAS DEL EXTRACTO. PUEDE PRODUCIRSE UN MATERIAL CON UN ELEVADO CONTENIDO EN GENISTEINA O UN MATERIAL CON UN ELEVADO CONTENIDO EN DAIDZEINA A PARTIR DEL EXTRACTO PROTEICO ENRIQUECIDO CON AGLUCONA ISOFLAVONA O DEL MATERIAL PROTEICO ENRIQUECIDO CON AGLUCONA ISOFLAVONA MEDIANTE LA SEPARACION DEL MATERIAL CON UN ELEVADO CONTENIDO EN GENISTEINA O CON UN ELEVADO CONTENIDO EN DAIDZEINA DEL EXTRACTO O DEL MATERIAL PROTEICO.
Description
Extracto proteínico vegetal enriquecido con
isoflavonas aglucónicas y material proteínico, y materiales con alto
contenido en daidceína y genisteína y proceso para producir los
mismos.
La presente invención se refiere a un extracto
proteínico y material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas
aglucónicas, y a métodos para obtenerlos a base de ejecutar un
proceso de dos pasos para convertir conjugados isoflavónicos de un
material proteínico vegetal en isoflavonas aglucónicas, y a un
material con alto contenido de genisteína y un material con alto
contenido de daidceína, y a métodos para obtenerlos a partir de un
material proteínico enriquecido con isoflavonas aglucónicas.
Las isoflavonas se dan en una variedad de
plantas leguminosas, incluyendo materiales proteínicos vegetales
tales como la soja. Estos compuestos incluyen daidcina,
6''-OAc daidcina, 6''-OMal daidcina,
daidceína, genistina, 6''-OAc genistina,
6''-OMal genistina, geniesteína, glicitina,
6''-OAc-glicitina,
6''-OMal glicitina, gliciteína, biocanina A,
formononentina y cumestrol. Estos compuestos están típicamente
asociados con el inherente sabor amargo de las habas de soja.
Las isoflavonas que están presentes en los
materiales proteínicos vegetales incluyen glucósidos isoflavónicos
(glucones), conjugados isoflavónicos e isoflavonas aglucónicas. Los
glucósidos isoflavónicos tienen una molécula de glucosa unida a una
mitad de isoflavona. Los conjugados isoflavónicos tienen mitades
adicionales unidas a la molécula de glucosa de un glucósido
isoflavónico, y así por ejemplo, la 6''-OAc
genistina contiene un grupo acetato unido a la posición seis de la
molécula de glucosa de la genistina. Las isoflavonas aglucónicas
constan solamente de una mitad de isoflavona.
La soja contiene tres "familias" de
compuestos isoflavónicos que tienen correspondientes miembros
glucosídicos, conjugados y aglucónicos: la familia de la
genisteína, la familia de la daidceína, y la familia de la
gliciteína. La familia de la genisteína incluye la genistina
glucosídica; los conjugados 6''-OMal genistina
(6''-malonato-éster de genistina) y
6''-OAc genistina (6''-acetato-éster
de genistina); y la genisteína aglucónica. La familia de la
daidceína incluye la daidcina glucosídica; los conjugados
6''-OMal daidcina y 6''-OAc
daidcina; y la daidceína aglucónica. La familia de la gliciteína
incluye la glicitina glucosídica; el conjugado
6''-OMal glicitina; y la gliciteína aglucónica.
En la fabricación de productos comerciales,
tales como aislados y concentrados proteínicos vegetales, la
atención se ha centrado en retirar estos materiales. Por ejemplo,
en un proceso convencional para la fabricación de un aislado o
concentrado de proteína de soja en el cual escamas de soja son
sometidas a extracción con un medio alcalino acuoso, las
isoflavonas son en gran parte solubilizadas en el extracto junto con
proteína de soja. La proteína es precipitada a partir del extracto
por acidificación del extracto, y es separada para formar un
aislado o un concentrado, dejando un suero que retiene gran parte de
las isoflavonas solubilizadas. Las isoflavonas residuales que han
quedado en la proteína precipitada con ácido son habitualmente
retiradas a base de exhaustivo lavado. Son típicamente desechados
el suero y los restos de lavado.
Recientemente ha sido reconocido que las
isoflavonas contenidas en proteínas vegetales tales como la soja
tienen un valor medicinal. Mientras que todas las isoflavonas son de
interés en la evaluación médica, los aglucones son las isoflavonas
específicas que son del máximo interés. La genisteína y la daidceína
pueden reducir de manera importante los factores de riesgo
cardiovascular. "Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma
Lipids of Female Monkeys", Circulation, vol. 90, p. 1259
(oct. 1994). Se piensa también que la genisteína y la daidceína
reducen los síntomas de afecciones ocasionadas por niveles reducidos
o alterados de estrógeno endógeno en las mujeres, tales como el
síndrome de la menopausia o el síndrome premenstrual. Además,
recientemente ha sido reconocido que las isoflavonas aglucónicas
pueden inhibir el crecimiento de células cancerosas humanas tales
como las células del cáncer de mama y las células del cáncer de
próstata, como se describe en los artículos siguientes:
"Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells,
Independence from Estrogen Receptors and the
Multi-Drug Resistance Gene", de Peterson y
Barnes, Biochemical and Biophysical Research Communications,
Vol. 179, Nº 1, pp. 661-667, 30 de agosto de 1991;
"Genistein and Biochanin A inhibit the Growth of Human Prostrate
Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine
Autophosphorylation", de Peterson y Barnes, The Prostate,
Vol. 22, pp. 335-345 (1993); y "Soybeans Inhibit
Mammary Tumors in Models of Breast Cancer", de Barnes, y otros,
Mutagens and Carcinogens in the Diet, pp.
239-253 (1990).
Como se ha señalado anteriormente, las
isoflavonas aglucónicas incluyen la daidceína, la genisteína y la
gliciteína. Estos aglucones tienen la fórmula general
siguiente:
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}
y R^{4} pueden seleccionarse de entre los miembros del grupo que
consta de H, OH y
OCH_{3}.
La genisteína tiene la fórmula anteriormente
indicada, donde R^{1}=OH, R^{2}=H, R^{3}=OH y R^{4}=OH, la
daidceína tiene la fórmula anteriormente indicada, donde R^{1}=OH,
R^{2}=H, R^{3}=H y R^{4}=OH, y la gliciteína tiene la fórmula
anteriormente indicada, donde R^{1}=OH, R^{2}=OCH_{3},
R^{3}=H y R^{4}=OH.
Por consiguiente, la presente invención está
dirigida a los aglucones y al enriquecimiento de un extracto
proteínico vegetal y de un material proteínico vegetal con estos
compuestos, y también a un material con un alto contenido de
genisteína y a un material con un alto contenido de daidceína. La
presente invención está también dirigida a métodos para fabricar un
extracto proteínico vegetal enriquecido con aglucones, un material
proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas, un
material con alto contenido de genisteína, y un material con alto
contenido de daidceína.
Son conocidos procesos para convertir glucósidos
en isoflavonas aglucónicas. En la WO95/10530 se aporta un proceso
para convertir glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas
para fabricar un extracto proteínico vegetal enriquecido con
isoflavonas aglucónicas y un aislado proteínico vegetal enriquecido
con isoflavonas aglucónicas.
Son también conocidos en la técnica otros
procesos para convertir glucósidos isoflavónicos en isoflavonas
aglucónicas, tal como se describe en la Solicitud de Patente
Japonesa 258.669 concedida a Obata, y otros Tales procesos no
prevén la conversión de conjugados isoflavónicos en isoflavonas
aglucónicas, ni aportan un material con alto contenido de
genisteína ni un material con alto contenido de daidceína derivados
de un aislado proteínico vegetal enriquecido con aglucones. Además,
estos procesos alcanzan tan sólo un moderado grado de conversión de
los glucósidos en aglucones, y requieren un considerable período de
tiempo para alcanzar este moderado grado de conversión. Por
consiguiente, tales procesos no son deseables para operaciones
comerciales a gran escala.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es el de aportar un extracto proteínico vegetal
enriquecido con isoflavonas aglucónicas y un proceso para
fabricarlo.
Es además objeto de la presente invención
aportar un material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas
aglucónicas, y un proceso para fabricarlo.
Es además un adicional objeto de la presente
invención aportar un material con alto contenido de genisteína y un
material con alto contenido de daidceína, y procesos para
fabricarlos a partir de un material proteínico vegetal enriquecido
con isoflavonas aglucónicas.
La invención es como se define en la
reivindicación 1.
En una realización de la invención, la
extracción es llevada a cabo a un pH de aproximadamente 6 a
aproximadamente 10. Preferiblemente, la relación en peso de
extractor a material proteínico vegetal es de aproximadamente 8:1 a
aproximadamente 16:1.
En otra realización de la invención, los
conjugados isoflavónicos son convertidos en glucósidos isoflavónicos
a base de tratar el extracto acuoso a una temperatura de
aproximadamente 2ºC a aproximadamente 121ºC y a un valor pH de
aproximadamente 6 a aproximadamente 13,5. Preferiblemente, la
conversión es efectuada a un pH de aproximadamente 11 y a una
temperatura de aproximadamente 5ºC a aproximadamente 50ºC, o bien y
como alternativa, a un pH de aproximadamente 9 y a una temperatura
de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 75ºC.
En otra realización adicional de la invención,
los glucósidos isoflavónicos son convertidos en isoflavonas
aglucónicas a base de poner a los glucósidos isoflavónicos en
contacto con una enzima en el extracto acuoso a una temperatura de
entre aproximadamente 5ºC y aproximadamente 75ºC y a un valor pH de
entre aproximadamente 3 y aproximadamente 9. Preferiblemente, la
enzima es una enzima sacaridasa capaz de partir los enlaces
1,4-glucosídicos.
En otra realización de la invención, el pH del
extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas es ajustado
aproximadamente al punto isoeléctrico de la proteína presente en el
extracto para precipitar un material proteínico que contiene
proteína e isoflavonas aglucónicas.
Son alcanzados altos porcentajes de conversión
de conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos, y de
glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas. En una
realización, los conjugados isoflavónicos son convertidos en su
mayoría y con preferencia prácticamente en su totalidad en
isoflavonas aglucónicas.
En otro aspecto, la invención es como se define
en la reivindicación 13.
En otro aspecto adicional, la invención es como
se define en la reivindicación 24.
En una realización preferida, los glucósidos
isoflavónicos presentes en el extracto son puestos en contacto con
una enzima a base de añadir una cantidad eficaz de una enzima
suplementaria al extracto, siendo la enzima suplementaria
preferiblemente una enzima sacaridasa, que es capaz de partir los
enlaces 1,4-glucosídicos.
En otra realización, un material proteínico
enriquecido con isoflavonas aglucónicas es formado a partir del
extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas a base de ajustar
el pH del extracto aproximadamente al punto isoeléctrico de la
proteína para precipitar un material proteínico que contiene
proteína e isoflavonas aglucónicas.
En una realización preferida, los glucósidos
isoflavónicos presentes en la lechada son puestos en contacto con
una enzima a base de añadir una cantidad eficaz de una enzima
suplementaria a la lechada, siendo la enzima suplementaria
preferiblemente una enzima sacaridasa, que es capaz de partir los
enlaces 1,4-glucosídicos.
Un material con alto contenido de genisteína se
puede recuperar a partir de un material proteínico vegetal
enriquecido con isoflavonas aglucónicas. Es aportado un material
proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas, y el
mismo es extraído con un extractor de alcohol acuoso para producir
un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas. El extracto es
puesto en contacto con un material adsorbente durante un tiempo
suficiente para separar del extracto un material con alto contenido
de genisteína.
Un material con alto contenido de daidceína se
puede producir a partir de un material proteínico vegetal
enriquecido con isoflavonas aglucónicas. Es aportado un material
proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas, y el
mismo es extraído con un extractor de alcohol acuoso para producir
un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas. El extracto es
puesto en contacto con un material adsorbente durante un tiempo
suficiente para separar del extracto un material con alto contenido
de daidceína.
El material de partida del proceso de las
realizaciones preferidas es cualquier material proteínico vegetal o
material vegetal que contenga conjugados isoflavónicos y una
proteína vegetal. En una realización preferida, el material de
partida es un material de haba de soja, puesto que el proceso es
particularmente adecuado para la fabricación de extractos y
materiales proteínicos enriquecidos con isoflavonas aglucónicas a
partir de material de haba de soja. En el sentido en el que se la
utiliza en la presente memoria, la expresión "material de haba de
soja" se refiere a habas de soja o a cualquier tipo de derivado
de soja. El material de partida más preferido es el consistente en
escamas de soja de las cuales ha sido retirado el aceite por
extracción con disolvente según procedimientos convencionales de la
técnica. El presente proceso es aplicable en general a un amplio
conjunto de materiales proteínicos vegetales, además de a la soja o
a los materiales de soja.
Dependiendo del tipo de material de planta
vegetal que contenga los conjugados isoflavónicos, en algunos casos
puede ser necesario procesar el material vegetal para dejarlo en una
forma finamente dividida. Esto puede ser deseable para hacer que
los compuestos isoflavónicos contenidos en el material vegetal sean
accesibles para los diversos reactivos que se describen más
detalladamente a continuación. El material puede ser molido,
triturado o procesado de otras maneras por métodos convencionales
conocidos en la técnica. Si el material vegetal está en un estado
tal que los compuestos isoflavónicos presentes en el material
vegetal son fácilmente accesibles para los reactivos o reactantes
externos, como es el caso de los pequeños trozos foliares de ciertas
plantas, puede no ser necesario someter al material vegetal a tal
procesamiento.
En un primer paso u operación, son extraídos del
material proteínico vegetal proteína vegetal y compuestos
isoflavónicos, incluyendo conjugados isoflavónicos. Las escamas son
sometidas a extracción con un extractor acuoso que tiene un pH
situado aproximadamente por encima del punto isoeléctrico del
material proteínico, preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,0
a aproximadamente 10,0, y con la máxima preferencia, a un pH de
aproximadamente 6,7 a aproximadamente 9,7. Si es necesario, para
elevar el pH del extractor acuoso pueden emplearse típicos
reactivos alcalinos tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico
e hidróxido cálcico. Los deseados compuestos isoflavónicos y
proteínas vegetales son solubilizados en el extracto acuoso.
Para maximizar la recuperación de estos
compuestos en el extracto acuoso, se prefiere que la relación en
peso de las escamas de soja o de los otros materiales proteínicos
vegetales al extractor sea controlada para ser ajustada a niveles
específicos para solubilizar la mayor cantidad posible de las
isoflavonas presentes en el material vegetal. La extracción de las
proteínas y de las isoflavonas puede ser efectuada por
procedimientos de extracción convencionales, incluyendo la
extracción en contracorriente del material proteínico vegetal,
preferiblemente a una relación en peso de extractor acuoso a
material proteínico vegetal de aproximadamente 8:1 a
aproximadamente 16:1. Tras haber extraído el material proteínico
vegetal, el extractor proporciona un extracto acuoso de proteína e
isoflavonas.
\newpage
Como alternativa, puede ser utilizado un proceso
de extracción de dos pasos, en el cual preferiblemente la relación
en peso de extractor a material proteínico vegetal es en una
extracción inicial de aproximadamente 10:1, y la relación en peso
de extractor a material proteínico vegetal es en una segunda
extracción de aproximadamente 6:1 o menos, con lo que la relación
en peso combinada de extractor a material proteínico vegetal en
ambas extracciones no sobrepasa una relación en peso total de
extractor a material proteínico vegetal de aproximadamente 16:1.
Pueden ser también utilizados otros procedimientos de extracción en
los cuales la relación en peso de extractor a material proteínico
vegetal es preferiblemente de 16:1 o menos.
En un primer paso u operación de conversión
isoflavónica, los conjugados isoflavónicos presentes en el extracto
acuoso son en una mayoría convertidos en glucósidos isoflavónicos
para producir un extracto enriquecido en glucósidos isoflavónicos.
Se ha comprobado que la conversión es dependiente del pH y de la
temperatura del extracto acuoso.
La gama de valores pH para la conversión de los
conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos va de
aproximadamente 6 a aproximadamente 13,5. De ser necesario, el pH
del extracto acuoso debería ser ajustado al pH deseado con una
adecuada base o con un adecuado agente cáustico o reactivo básico si
el pH debe ser incrementado, o bien, si el pH debe ser reducido,
con un adecuado ácido o reactivo ácido. Se ha comprobado que la
conversión de conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos
es catalizada por las condiciones básicas, y por consiguiente lo
más preferido es utilizar un alto pH para lograr una conversión
rápida. El pH más preferido para la conversión de los conjugados
isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos es un pH de
aproximadamente 9 a aproximadamente 11.
La gama de temperaturas para la conversión de
los conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos va de
aproximadamente 2ºC a aproximadamente 121ºC. La gama de temperaturas
dentro de la cual la conversión tiene lugar con facilidad depende
del pH del extracto acuoso. Los inventores han comprobado que la
conversión tiene lugar con facilidad a las temperaturas situadas en
la región inferior de la gama cuando el pH es relativamente alto.
Por ejemplo, a un pH de aproximadamente 11 la conversión tiene lugar
rápidamente y con un buen rendimiento a una gama de temperaturas de
aproximadamente 5ºC a aproximadamente 50ºC. A un pH de
aproximadamente 9, la conversión tiene lugar con un buen
rendimiento dentro de una gama de temperaturas de aproximadamente
45ºC a aproximadamente 75ºC. Cuando el pH del extracto acuoso es
relativamente bajo, la conversión tiene lugar a temperaturas más
altas. Por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6, la conversión
tiene lugar dentro de una gama de temperaturas de aproximadamente
80ºC a aproximadamente 121ºC. En una realización preferida, la
conversión es efectuada a aproximadamente 35ºC y a un pH de
aproximadamente 11. En otra realización preferida, la conversión es
efectuada a una temperatura de aproximadamente 73ºC y a un pH de
aproximadamente 9.
El período de tiempo requerido para la
conversión de los conjugados isoflavónicos en glucósidos
isoflavónicos en el primer paso de conversión depende primariamente
de la gama de valores pH y de temperaturas utilizada. Tales tiempos
de conversión van típicamente de aproximadamente 15 minutos a varias
horas o períodos más largos. La conversión tiene lugar más
rápidamente a un pH elevado y a una temperatura elevada. A un pH de
aproximadamente 9, la conversión es prácticamente completa en un
período de tiempo de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6
horas a 73ºC. En una realización sumamente preferida, los conjugados
isoflavónicos son convertidos en glucósidos isoflavónicos en un
período de tiempo de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1
hora, y con preferencia de aproximadamente 45 minutos, a un pH de
aproximadamente 11 y a una temperatura de aproximadamente 35ºC.
El primer paso de conversión es preferiblemente
llevado a cabo en un sistema acuoso. Pueden estar asimismo
presentes en el sistema otros componentes compatibles con el agua,
tales como alcohol de bajo peso molecular y otros disolventes
solubles en agua.
El primer paso de conversión isoflavónica es
notablemente eficaz, convirtiendo una mayoría de aproximadamente un
80% a aproximadamente un 100% de los conjugados isoflavónicos en
glucósidos isoflavónicos. Mediante la utilización de los parámetros
de reacción preferidos anteriormente descritos, es posible alcanzar
conversiones del 95% o más. Estos altos porcentajes de conversión
son particularmente atractivos para las operaciones comerciales a
gran escala.
En un segundo paso u operación de conversión
isoflavónica, los glucósidos isoflavónicos producidos en el primer
paso de conversión, así como los glucósidos isoflavónicos
previamente residentes en el extracto acuoso, son convertidos en
isoflavonas aglucónicas por reacción enzimática. La conversión
produce un extracto enriquecido en isoflavonas aglucónicas a partir
del extracto enriquecido con glucósidos isoflavónicos.
Se ha comprobado que el segundo paso de
conversión es dependiente de la concentración de enzimas presente
en el extracto, y de sus características. Las enzimas requeridas
para llevar a cabo la conversión son enzimas que son capaces de
partir el enlace glucosídico entre la mitad isoflavónica y la
molécula de glucosa de los glucósidos isoflavónicos. En una
realización preferida, las enzimas son enzimas sacaridasa, esterasa
o glucoamilasa capaces de partir los enlaces
1,4-glucosídicos.
La concentración de enzimas requerida para
convertir los glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas
es dependiente de una variedad de factores que incluyen el tipo de
enzimas presentes en el extracto acuoso, la distribución de
concentraciones de enzimas, las actividades de las enzimas y el pH y
la temperatura del extracto durante la conversión. Las enzimas
pueden estar inherentemente presentes en el extracto derivándose ya
sea del material proteínico vegetal o bien de crecimiento microbiano
en el extracto. A tales enzimas inherentemente presentes se las
denomina en la presente enzimas "residuales", y a las enzimas
que son añadidas al extracto se las denomina en la presente enzimas
"suplementarias".
Debería estar presente en el extracto enzima
suficiente para convertir al menos una mayoría, y con preferencia
prácticamente la totalidad, de los glucósidos isoflavónicos en
isoflavonas aglucónicas. En general, si las enzimas residuales
presentes en el extracto son insuficientes para llevar a cabo la
conversión, deberían ser añadidas al extracto enzimas
suplementarias. En una realización preferida, son añadidas al
extracto enzimas suplementarias independientemente de si están
presentes en el extracto suficientes enzimas residuales, puesto que
la adición de enzimas suplementarias reduce espectacularmente el
tiempo necesario para llevar a cabo una conversión prácticamente
completa de los glucósidos en aglucones. Si son añadidas enzimas
suplementarias, las enzimas suplementarias deberían ser añadidas de
forma tal que la concentración total de enzima presente sea de
aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 10% en peso del
material proteínico vegetal, sobre una base de material seco.
Las enzimas suplementarias son seleccionadas
sobre la base de la actividad óptima a las condiciones de pH y de
temperatura seleccionadas, y de la rentabilidad. Las enzimas
suplementarias son enzimas que son capaces de partir el enlace
entre la mitad isoflavónica y la molécula de glucosa de los
glucósidos isoflavónicos, tales como las enzimas sacaridasa,
esterasa y glucoamilasa, que son capaces de partir los enlaces
1,4-glucosídicos. Son enzimas suplementarias
preferidas enzimas alfa- y beta-glucosidasa, enzimas
beta-galactosidasa, enzimas
gluco-amilasa y enzimas pectinasa que están a la
venta en el mercado. Son particularmente preferidas enzimas tales
como las denominadas Biopectinase 100L (que es preferiblemente
utilizada a una gama de valores pH de aproximadamente 3 a
aproximadamente 6), Biopectinase 300L (gama óptima de valores pH de
aproximadamente 3 a aproximadamente 6), Biopectinase OK 70L (gama
óptima de valores pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 6),
Biolactase 30,000 (gama óptima de valores pH de aproximadamente 3 a
aproximadamente 6) y Neutral Lactase (gama óptima de valores pH de
aproximadamente 6 a aproximadamente 8), todas las cuales son
suministradas por la Quest International, 1833 57th Street, Post
Office Box 3917, Sarasota, Florida 34243. Son también especialmente
preferidas las enzimas denominadas Lactase F (que es preferiblemente
utilizada a una gama de valores pH de aproximadamente 4 a
aproximadamente 6) y Lactase 50,000 (gama óptima de valores pH de
aproximadamente 4 a aproximadamente 6), que son ambas suministradas
por la Amano International Enzyme Co., Inc., Post Office Box 1000,
Troy, Virginia 22974. Otras enzimas suplementarias particularmente
preferidas incluyen las denominadas G-Zyme G990 (pH
óptimo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6) y Enzeco Fungal
Lactase Concentrate (pH óptimo de aproximadamente 4 a
aproximadamente 6), suministradas por la Enzyme Development
Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, New York, New York 10121;
Lactozyme 3000L (que es preferiblemente utilizada a una gama de
valores pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8) y
Alpha-Gal 600L (que preferiblemente es utilizada a
una gama de valores pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5),
suministradas por la Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., 33 Turner
Road, Danbury, Connecticut 06813; Maxilact L2000 (que es
preferiblemente utilizada a una gama de valores pH de
aproximadamente 4 a aproximadamente 6), suministrada por la Gist
Brocades Food Ingredients, Inc., King of Prussia, Pennsylvania,
19406; y Neutral Lactase (que es preferiblemente utilizada a una
gama de valores pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8),
suministrada por la Pfizer Food Science Group, 205 East 42nd
Street, New York, New York 10017.
La gama de valores pH para la conversión de los
glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas va de
aproximadamente 3 a aproximadamente 9. El pH que es utilizado
depende primariamente del tipo de enzima utilizado, y debería ser
seleccionado en consecuencia. La enzima residual es activa dentro de
una gama de valores pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, si
bien se cree que el pH del extracto es reducido a lo largo de la
conversión. Las enzimas suplementarias son activas dentro de una
gama óptima de valores pH especificada por el fabricante de la
enzima, como se ha indicado anteriormente para varias enzimas
específicas. Típicamente, las enzimas suplementarias son activas ya
sea dentro de una gama de valores pH neutros de aproximadamente 6 a
aproximadamente 8, o bien dentro de una gama de valores pH ácidos de
aproximadamente 3 a aproximadamente 6.
El pH puede ser ajustado a un valor deseado para
llevar a cabo el segundo paso de conversión isoflavónica. En la
mayoría de los casos, el pH es reducido a partir del pH
relativamente alto o básico del primer paso de conversión
isoflavónica por medio de la adición de uno o varios ácidos
adecuados tales como ácido acético, ácido sulfúrico, ácido
fosfórico, ácido clorhídrico o cualquier otro reactivo adecuado.
La gama de temperaturas para el segundo paso de
conversión isoflavónica va de aproximadamente 5ºC a aproximadamente
75ºC. La temperatura afecta de manera importante la actividad de las
enzimas, y por consiguiente, al porcentaje de conversión. Las
enzimas suplementarias pueden ser activas por encima de 70ºC, siendo
así que por ejemplo la enzima Alpha-Gal 600L es
activa a 75ºC, si bien se prefiere llevar a cabo la conversión a
temperaturas más bajas para evitar la desactivación de las enzimas.
En una realización preferida, la conversión es efectuada a una
temperatura de entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente
45ºC.
El tiempo requerido para el segundo paso de
conversión isoflavónica depende de factores relacionados con las
enzimas, y particularmente de la concentración, y de la temperatura
y del pH del sistema. En la mayoría de casos, es posible conseguir
una conversión prácticamente completa dentro de un período de tiempo
de 24 horas, si bien se prefiere que sea añadida enzima
suplementaria para incrementar espectacularmente la velocidad de la
reacción. La enzima suplementaria, la concentración de enzima, el pH
y la temperatura seleccionados preferiblemente dan lugar a una
conversión prácticamente completa en 2 horas, y con la máxima
preferencia en 1 hora.
Los muy altos grados de conversión con este
proceso son tales que los glucósidos isoflavónicos presentes en el
extracto son convertidos en la forma aglucónica al menos en una
mayoría, y con preferencia en su práctica totalidad. La expresión
"una mayoría" se refiere a un grado de conversión de glucósidos
isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas de al menos
aproximadamente un 50%. La expresión "en su práctica totalidad"
se refiere a un grado de conversión de los glucósidos isoflavónicos
en isoflavonas aglucónicas de al menos aproximadamente un 80%, y
con la máxima preferencia, de al menos aproximadamente un 90%.
Tales altos porcentajes de conversión de manera fiable son
notables, y son deseables para las aplicaciones comerciales.
Un material proteínico enriquecido con
isoflavonas aglucónicas puede ser recuperado a partir del extracto
enriquecido con isoflavonas aglucónicas. Una vez concluido el
segundo paso de conversión isoflavónica, el pH es ajustado mediante
la adición de ácido, de ser necesario, aproximadamente al punto
isoeléctrico para la proteína vegetal, que para la proteína de soja
está en general entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,0, y
con preferencia, entre aproximadamente 4,4 y aproximadamente 4,6. La
proteína es precipitada a partir del extracto de pH ajustado en
forma de una cuajadura. Una porción importante de las isoflavonas
aglucónicas es capturada en la cuajadura. A continuación de la
precipitación, la cuajadura o proteína precipitada es separada del
extracto para formar un material proteínico enriquecido con
isoflavonas aglucónicas. Preferiblemente, el material proteínico
enriquecido con isoflavonas aglucónicas es separado del extracto por
centrifugación o filtración.
En la realización más preferida, se evita por
completo o se minimiza el lavado del material proteínico separado,
a fin de reducir considerablemente la remoción de las isoflavonas
aglucónicas del material proteínico. Por consiguiente, el lavado
del material proteínico con agua puede ser evitado por completo, o
puede ser limitado a un único lavado con agua durante el cual la
relación en peso de agua a material proteínico es de entre
aproximadamente 2:1 y aproximadamente 6:1. La ausencia de lavado de
la cuajadura precipitada proporciona un material proteínico
enriquecido con los deseados niveles de isoflavonas, a pesar de que
podría ser llevado a cabo un lavado más extensivo con una menor
recuperación de isoflavonas.
El material proteínico separado puede ser
deshidratado por centrifugación o concentración o por una
combinación de ambas, y es secado de una manera convencional. No se
pretende que la realización preferida sea limitada por una
determinada forma de deshidratación, si bien se prefiere utilizar
técnicas de deshidratación y secado convencionales tales como la
centrifugación y el secado por pulverización para formar un material
proteínico secado.
El proceso de las realizaciones preferidas
anteriormente descritas utiliza ambos pasos de conversión
isoflavónica primero y segundo inmediatamente después de haber sido
obtenido un extracto. La presente invención incluye también un
proceso en el cual un material vegetal que contiene conjugados
isoflavónicos y proteína es extraída con un extractor acuoso que
tiene un pH que está situado aproximadamente por encima del punto
isoeléctrico de la proteína; el primer paso de conversión
isoflavónica es llevado a cabo sobre el extracto; un material
proteínico que contiene glucósidos isoflavónicos es separado del
extracto; y el segundo paso de conversión isoflavónica es llevado a
cabo sobre el material proteínico. Los pasos en este proceso pueden
ser llevados a cabo de la misma manera general como la que se ha
descrito anteriormente.
La presente invención incluye además un proceso
en el cual es formada una lechada acuosa de un material vegetal que
contiene conjugados isoflavónicos y proteína; el primer paso de
conversión isoflavónica es llevado a cabo sobre la lechada acuosa;
el material vegetal es extraído con un extractor acuoso que tiene un
pH situado aproximadamente por encima del punto isoeléctrico de la
proteína; y el segundo paso de conversión isoflavónica es llevado a
cabo sobre los glucósidos isoflavónicos en el extracto. La lechada
acuosa de material vegetal contiene preferiblemente hasta un 20% en
peso de material vegetal. Los pasos de este proceso pueden ser
llevados a cabo de la misma manera general como la que se ha
descrito anteriormente. Además, un material proteínico que contiene
isoflavonas aglucónicas puede ser separado del extracto tras el
segundo paso de conversión isoflavónica de la manera descrita
anteriormente.
La presente invención incluye también un proceso
en el cual un material proteínico vegetal que contiene conjugados
isoflavónicos y proteína es extraído con un extracto acuoso que
tiene un pH situado aproximadamente por encima del punto
isoeléctrico de la proteína; un material proteínico que contiene
conjugados isoflavónicos es separado del extracto; es formada una
lechada acuosa de material proteínico; y los pasos de conversión
isoflavónica primero y segundo son llevados a cabo sobre la lechada
acuosa de material proteínico. La lechada acuosa de material
proteínico contiene preferiblemente hasta un 30% en peso de material
proteínico. Los pasos de este proceso pueden ser llevados a cabo de
la misma manera general como la que se ha descrito
anteriormente.
Se contempla que ambos pasos de conversión
isoflavónica primero y segundo podrían ser llevados a cabo sobre
una lechada acuosa de material vegetal que contenga conjugados
isoflavónicos y proteína, sobre un extracto de tal material
vegetal, y sobre un material proteínico separado de tal extracto. La
presente invención incluye la combinación de cualquiera de los
pasos precedentes para formar un extracto o material proteínico
enriquecido con isoflavonas aglucónicas.
Un material con alto contenido de genisteína y
un material con alto contenido de daidceína pueden ser fabricados a
partir del material proteínico enriquecido con isoflavonas
aglucónicas recuperado. En el sentido que se le da en la presente,
un material con alto contenido de genisteína está definido como un
material vegetal que contiene al menos un 40% de genisteína, y con
la máxima preferencia al menos un 90% de genisteína, junto con
material vegetal residual, que es material residual de soja si el
material con alto contenido de genisteína es recuperado a partir de
un material de haba de soja. Un material con alto contenido de
daidceína contiene al menos un 40% de daidceína junto con material
vegetal residual, que es material de haba de soja si el material
con alto contenido de daidceína es recuperado a partir de un
material de haba de soja.
El material proteínico enriquecido con
isoflavonas aglucónicas puede ser inicialmente lavado y filtrado
para retirarle las sales y los azúcares indeseables. El material
proteínico enriquecido con isoflavonas aglucónicas es mezclado con
agua, estando el agua presente en hasta una relación de 6:1 al
material proteínico. El agua debería ser fría para minimizar la
solubilidad de las isoflavonas aglucónicas en el agua, y tiene
preferiblemente una temperatura de aproximadamente 5ºC a
aproximadamente 30ºC. El material proteínico es mezclado en el agua
por espacio de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos, y
entonces el material proteínico es filtrado para separarlo del agua
utilizando cualquier medio de filtración convencionales,
preferiblemente filtrando la mezcla a través de papel de filtro
convencional. El paso de lavado y filtración puede evitarse, si se
desea, para minimizar toda pérdida potencial de isoflavonas
aglucónicas en el agua residual de lavado.
El material proteínico enriquecido con
isoflavonas aglucónicas puede ser entonces extraído con un extractor
de alcohol acuoso para retirar las isoflavonas aglucónicas del
material proteínico y producir un extracto de isoflavonas
aglucónicas. En calidad de componente alcohólico del extractor se
prefieren alcoholes de bajo peso molecular tales como metanol, y
particularmente etanol. Se ha comprobado que las isoflavonas
aglucónicas son solubles a casi todas las concentraciones de
alcohol del extractor. Las isoflavonas aglucónicas son
particularmente solubles cuando el extractor contiene entre
aproximadamente un 30% de alcohol y aproximadamente un 90% de
alcohol, y cuando con la máxima preferencia el extractor contiene
entre aproximadamente un 60% de alcohol y aproximadamente un 80% de
alcohol. A pesar de que el disolvente preferido es de alcohol
acuoso, para llevar a cabo la extracción de las isoflavonas
aglucónicas del material proteínico pueden ser utilizados otros
disolventes, incluyendo agua, acetonitrilo, cloruro de metileno,
acetona y acetato de etilo.
La extracción es efectuada utilizando una
cantidad mínima de extractor. Se prefiere que la relación en peso
de extractor a material proteínico enriquecido con isoflavonas
aglucónicas no exceda de 11:1. La extracción puede ser llevada a
cabo por cualquier método de extracción convencional, incluyendo la
extracción en contracorriente, o una doble extracción en la que la
relación en peso de los extractos combinados al material proteínico
no exceda de 11:1.
En una realización preferida, el material
proteínico es inicialmente extraído con un 80% de etanol, siendo la
relación en peso de extractor a material proteínico de
aproximadamente 6:1. El extractor es separado del material
proteínico por un medio convencional para separación, tal como una
centrifugadora o un filtro prensa, y es recogido el extracto. El
material proteínico es extraído con un 80% de etanol, siendo la
relación en peso de extractor a material proteínico de
aproximadamente 4:1. El extractor es recogido de nuevo y añadido al
extracto inicial recogido. El material proteínico es entonces lavado
con descarga de agua, siendo la relación en peso de agua a material
proteínico de aproximadamente 4:1, y el agua es añadida a los
extractos recogidos.
A pesar de que la extracción puede ser efectuada
a cualquier pH, se prefiere que el extractor tenga un pH de
aproximadamente 7 a aproximadamente 10. La formación de gel
proteínico es evitada dentro de la gama preferida de valores pH, y,
si el material proteínico debe ser recuperado así como el extracto
de isoflavonas aglucónicas, la formación de subproductos
aminoácidos indeseables dentro del material proteínico es evitada
dentro de la gama preferida de valores pH.
La extracción puede ser efectuada a cualquier
temperatura hasta el punto de ebullición del extractor, y
preferiblemente es llevada a cabo a una temperatura de entre
aproximadamente 25ºC y aproximadamente 70ºC. Para llevar a cabo la
máxima extracción de isoflavonas aglucónicas a partir del material
proteínico, se prefiere que la extracción sea efectuada a una
temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC, y con la
máxima preferencia, de aproximadamente 60ºC.
A continuación de la extracción, un material con
alto contenido de genisteína y un material con alto contenido de
daidceína pueden ser separados del extracto de isoflavonas
aglucónicas a base de poner al extracto en contacto con un material
adsorbente durante un tiempo suficiente para separar del extracto
los materiales con alto contenido de genisteína y con alto
contenido de daidceína. En una realización preferida, los materiales
con alto contenido de genisteína y con alto contenido de daidceína
son separados del extracto por Cromatografía de Líquidos de Gran
Precisión (HPLC) de fase invertida. La genisteína y la daidceína son
separadas de otras isoflavonas e impurezas en el extracto a base de
eluir el extracto a través de partículas de un material adsorbente
que fija de manera liberable la genisteína, la daidceína, las otras
isoflavonas y las impurezas de manera específica en cuanto a los
compuestos, permitiendo con ello que sea separado cada uno de los
compuestos.
El extracto de isoflavonas aglucónicas es
inicialmente filtrado para retirar el material insoluble que pudiese
obstruir una columna de HPLC. El extracto puede ser filtrado por
cualquier método de filtración convencional. Con la máxima
preferencia, el extracto es filtrado en un proceso de
ultrafiltración convencional, que retira también la proteína
residual que pudiese estar presente en el extracto.
Una columna de HPLC es preparada a base de
rellenar una columna de HPLC convencional comercialmente disponible
con un material adsorbente particulado que fijará de manera
liberable la genisteína, la daidceína, las otras isoflavonas y las
impurezas de manera específica en cuanto a los compuestos. El
material adsorbente puede ser cualquier material de relleno para
HPLC de fase invertida, si bien un material de relleno preferido
puede ser elegido según los criterios de capacidad de carga,
eficacia de separación y coste. Uno de estos materiales de relleno
preferidos es el Kromasil C18 en perlas de 16 \mum 100 \ring{A},
que es suministrado por la Eka Nobel, Nobel Industries, Suecia.
El extracto filtrado es pasado a través de la
columna de relleno de HPLC, hasta que todos los sitios de fijación
de la columna están plenamente saturados con isoflavonas, lo cual se
detecta por medio de la aparición de isoflavonas en el efluente que
sale de la columna. La columna de HPLC puede ser entonces eluída con
un eluyente polar para llevar a cabo la separación. En una
realización preferida, el eluyente es un alcohol acuoso. El
eluyente de alcohol acuoso puede tener un contenido de alcohol de
entre aproximadamente un 30% y aproximadamente un 90% de alcohol, y
tiene preferiblemente un contenido de alcohol de aproximadamente un
50%, para proporcionar tanto una buena separación como una buena
solubilidad de las isoflavonas. El alcohol es preferiblemente
metanol o etanol, prefiriéndose el etanol cuando los materiales que
constituyen el producto con alto contenido de genisteína o con alto
contenido de daidceína deben ser utilizados en aplicaciones
alimentarias o medicinales.
Los materiales con alto contenido de genisteína
y con alto contenido de daidceína son recogidos a partir del
efluente de la columna. Una fracción de efluente que contiene
daidceína es eluída y sale de la columna en primer lugar, seguida
por una fracción de gliciteína, que es seguida por la fracción de
genisteína, más polar. Las fracciones de daidceína y de genisteína
son recogidas a medida que son eluídas y salen de la columna. Si se
desea, puede recogerse también la fracción de gliciteína.
El alcohol presente en las fracciones puede ser
retirado por evaporación, tras lo cual los materiales con alto
contenido de genisteína y con alto contenido de daidceína, y un
material con alto contenido de gliciteína, pueden ser recuperados
por métodos de separación convencionales tales como los de
centrifugación o filtración. El material con alto contenido de
genisteína recuperado contiene al menos un 40% de genisteína, y
preferiblemente al menos un 90% de genisteína, junto con material
vegetal residual, que es material residual de soja si la genisteína
es recuperada a partir de un suero de soja. El material con alto
contenido de daidceína recuperado contiene al menos un 40% de
daidceína, junto con material vegetal residual.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ilustra a continuación más detalladamente la
presente invención mediante los ejemplos siguientes, en los que se
utilizó un material de haba de soja en calidad de material vegetal.
Los ejemplos pretenden ser ilustrativos, y no deberá interpretarse
que los mismos limitan o de otro modo restringen el alcance de la
invención en modo alguno.
Como se ha señalado anteriormente, la expresión
material de haba de soja incluye las "familias" genisteínica,
daidceínica y gliciteínica de isoflavonas que tienen los
correspondientes miembros glucosídicos, conjugados y aglucónicos,
conteniendo la familia genisteínica los conjugados
6'-OMal genisteína y 6''-OAc
genisteína, la genisteína glucosídica y la genisteína aglucónica;
conteniendo la familia daidceínica los conjugados
6''-OMal daidcina y 6''-OAc
daidcina, la daidcina glucosídica y la daidceína aglucónica; y
conteniendo la familia gliciteínica los conjugados
6''-OMal glicitina, la glicitina glucosídica y la
gliciteína aglucónica. En las tablas siguientes, las
concentraciones relativas de las isoflavonas están medidas como
porcentaje de una familia de isoflavonas. Por ejemplo, en la
familia genisteínica: % de genistina + % de 6''-OMal
genistina + % de 6''-OAc genistina + % de
genisteína = 100%. El grado de conversión de conjugados en
glucósidos y de glucósidos en aglucones puede ser determinado a
base de comparar los porcentajes de cada tipo de compuesto en una
familia de isoflavonas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer experimento se examina la
conversión de conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos
en un extracto de soja. El grado de conversión es determinado por la
disminución cuantitativa del porcentaje de ésteres de malonato y
acetato de una familia de isoflavonas, unida a un correspondiente
incremento cuantitativo del porcentaje del glucósido de la misma
familia de isoflavonas.
Es preparado un extracto de soja haciendo una
lechada de 400 g de escamas de soja desgrasadas finamente molidas
con 4000 g de agua. El pH es ajustado a 9,7 con hidróxido sódico, y
la lechada es calentada a 38ºC por espacio de 15 minutos con
agitación. La lechada es entonces centrifugada, y el extracto es
recogido como supernatante.
La conversión de conjugados isoflavónicos en
glucósidos isoflavónicos es examinada a distintas condiciones de pH
y a distintas temperaturas. Muestras de 600 g del extracto son
ajustadas a un pH de 6, 7, 9 y 11 con ácido clorhídrico o hidróxido
sódico. Para cada pH, la muestra de 600 g es dividida en dos
muestras de 300 g, y estas muestras son incubadas a 45ºC y 72,5ºC
por espacio de 24 horas. Son llevados a cabo análisis periódicos de
cada muestra a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas para determinar el
contenido de isoflavonas de las muestras. La siguiente Tabla 1
muestra el cambio y la distribución de las isoflavonas a lo largo
del experimento.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
Como indican las disminuciones de las
concentraciones relativas de los compuestos conjugados isoflavónicos
6''-OMal y 6''-OAc y los
correspondientes incrementos de las concentraciones de los
glucósidos genistina, daidcina y glicitina, el primer paso de
conversión es el más rápido y completo a condiciones de pH más alto,
es decir más básico, y a temperaturas situadas dentro de la gama
más alta. En las muestras de pH 9 y pH 11 tiene lugar una
conversión prácticamente completa de los conjugados isoflavónicos en
glucósidos isoflavónicos tanto a 45ºC como a 72,5ºC, si bien la
daidcina y la glicitina fueron degradadas a pH 9 y a 72,5ºC. La
conversión llega también a ser casi completa en las muestras de pH
6 y de pH 7 a 72,5ºC. En las muestras de pH 6 y de pH 7 es
producida una importante conversión de los glucósidos isoflavónicos
en isoflavonas aglucónicas por la enzima residual en el extracto a
45ºC, si bien la conversión de los conjugados isoflavónicos en
glucósidos isoflavónicos no resulta particularmente eficaz bajo
estas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo experimento es examinada la
conversión de glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas.
El grado de conversión es determinado por la disminución
cuantitativa del porcentaje del glucósido de una familia de
isoflavonas unida a un correspondiente incremento cuantitativo del
porcentaje del aglucón de la misma familia de isoflavonas.
Se produce a partir de escamas de soja un
extracto enriquecido con glucósidos isoflavónicos a base de ajustar
el pH de un extracto de soja a aproximadamente 11 a una temperatura
de aproximadamente 35ºC por espacio de aproximadamente 1 hora. En
las primeras muestras, la conversión de los glucósidos isoflavónicos
en isoflavonas aglucónicas es efectuada utilizando la enzima
residual presente en un extracto enriquecido con glucósidos
isoflavónicos a base de ajustar el pH de las muestras a pH 7,0 y pH
9,0 y manteniendo las muestras a 45ºC por espacio de 24 horas. La
conversión de los glucósidos isoflavónicos en isoflavonas
aglucónicas es efectuada utilizando enzimas suplementarias a base
de dosificar muestras de un extracto enriquecido con glucósidos
isoflavónicos con las siguientes enzimas suplementarias que están a
la venta en el mercado: Biolactase 30,000, Quest Neutral Lactase,
Lactase 50,000, Biopectinase 100L y Alpha Gal 600. En la siguiente
Tabla 2 está indicada la cantidad de enzima añadida a cada muestra.
Cada muestra es ajustada a un pH al cual es activa la enzima
suplementaria, siendo dicho pH de 4,0, 4,5 o 7,0. Las muestras son
incubadas a temperaturas que van de 35ºC a 75ºC. Son tomadas
muestras a intervalos de tiempo seleccionados, y se mide su
contenido de isoflavonas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
Tal como pone de manifiesto la conversión de
genistina, daidcina y glicitina en genisteína, daidceína y
gliciteína, respectivamente, se consigue una conversión
prácticamente completa de los glucósidos isoflavónicos en
isoflavonas aglucónicas. Las enzimas suplementarias seleccionadas
incrementan notablemente la velocidad de conversión en comparación
con la conversión llevada a cabo por la enzima residual presente en
el extracto, obteniéndose una conversión prácticamente completa en
1 hora a una concentración, una temperatura y un pH eficaces.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento, un material proteínico
enriquecido con isoflavonas aglucónicas es recuperado a partir de
un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas, y un material
proteínico convencional es recuperado a partir de un extracto
convencional. El contenido de isoflavonas en los materiales
proteínicos recuperados de cada extracto es determinado a un pH de
separación de 4,0, 4,5 y 5,0.
Es preparado un extracto de soja enriquecido con
isoflavonas aglucónicas a base de 1) extraer escamas de soja
desgrasadas con una solución alcalina acuosa; 2) ajustar el pH del
extracto a 11 y mantener el extracto a 35ºC por espacio de 1 hora
para producir un extracto enriquecido con glucósidos isoflavónicos;
y 3) añadir un 0,1% de Lactase 50,000 (Amano International Enzyme
Co.) en peso de sólidos en el extracto enriquecido con glucósidos
isoflavónicos al extracto, que es entonces tratado a 50ºC y a un pH
de 4,5 por espacio de 1 hora para producir el extracto enriquecido
con isoflavonas aglucónicas. Es también preparado un extracto de
soja convencional, siendo el extracto convencional preparado a base
de extraer escamas de soja desgrasadas con una solución alcalina
acuosa.
De cada extracto es obtenida una muestra que
contiene 10 g de sólidos, y las muestras de cada extracto son
ajustadas a un pH de 4,5. De cada muestra es separado un material
proteínico a base de centrifugar la muestra y decantar el suero
supernatante del material proteínico. Entonces es determinado el
contenido de isoflavonas del material proteínico separado de cada
muestra. La siguiente Tabla 3 indica el contenido total de
isoflavonas en miligramos por muestra y el porcentaje de cada tipo
de isoflavona de una familia de isoflavonas presente en el material
proteínico de cada una de las muestras.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
Comparando el contenido de isoflavonas del
material proteínico obtenido del extracto enriquecido con
isoflavonas aglucónicas y del material proteínico obtenido del
extracto convencional, puede verse que el material proteínico
obtenido del extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas
contiene cantidades considerablemente mayores de las isoflavonas
aglucónicas, y en particular de genisteína y daidceína, en
comparación con el material proteínico obtenido del extracto
convencional. El material proteínico obtenido del extracto
convencional contiene considerables cantidades de conjugados
isoflavónicos que están ausentes en el material proteínico
enriquecido con isoflavonas aglucónicas debido a la conversión de
los conjugados isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas en el
extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas.
En los ejemplos anteriores, todos los
porcentajes indicados para
6''-OMal-genistina,
6''-OAc-genistina,
6''-OMal-daidcina,
6''-OAc-daidcina, glicitina,
6''-OMal-glicitina y gliciteína son
valores calculados. Los porcentajes indicados o la concentración de
enzima son calculados a partir de gramos de preparación enzimática
comercial por cada 100 gramos de sólido en cada muestra. A
continuación se describe un método para cuantificar las isoflavonas
en los productos de soja. Las isoflavonas son extraídas de los
productos de soja a base de mezclar 0,75 gramos de muestra (secada
por pulverización o polvo finamente molido) con 50 ml de disolvente
de metanol/agua a 80/20. La mezcla es sacudida por espacio de 2
horas a temperatura ambiente con un sacudidor orbital. Tras 2 horas,
los materiales no disueltos restantes son retirados por filtración
a través de papel de filtro Whatman Nº 42. Cinco ml del filtrado
son diluidos con 4 ml de agua y 1 ml de metanol.
Las isoflavonas extraídas son separadas por HPLC
(Cromatografía de Líquidos de Gran Precisión) utilizando una
columna de fase invertida Hewlett Packard C18 Hypersil. Las
isoflavonas son inyectadas sobre la columna y eluídas con un
gradiente de disolvente comenzando con un 88% de metanol, un 10% de
agua y un 2% de ácido acético glacial y terminando con un 98% de
metanol y un 2% de ácido acético glacial. A un caudal de 0,4 ml/min.
son claramente resueltas todas las isoflavonas, o sea las
denominadas genistina,
6''-0-acetilgenistina,
6''-0-malonilgenistina, genisteína,
daidcina, 6''-0-acetildaidcina,
6''-0-malonildaidcina, daidcina,
glicitina y sus derivados y gliciteína. La detección de picos es
por absorbencia ultravioleta a 260 nm. La identificación de los
picos fue llevada a cabo mediante espectrómetro de masas para
HPLC.
La cuantificación se consigue a base de utilizar
patrones puros (genistina, genisteína, daidcina y daidceína)
adquiridos a la Indofine Chemical Company, Sommerville, NJ. Los
factores de respuesta (área integrada/concentración) son calculados
para cada uno de los compuestos anteriormente indicados, y son
utilizados para cuantificar las muestras desconocidas. Para las
formas conjugadas para las cuales no están disponibles patrones
puros, se supone que los factores de respuesta son los de la
molécula progenitora, pero se les efectúa la corrección
correspondiente a la diferencia de peso molecular. Se supone que el
factor de respuesta para la glicitina es el de la genistina
corregido en correspondencia con la diferencia de peso molecular.
Este método proporciona las cantidades de cada isoflavona
individual. Para mayor comodidad, pueden ser calculadas la
genisteína total, la daidceína total y la gliciteína total, y
dichos valores representan el peso agregado de estos compuestos si
todas las formas conjugadas son convertidas en sus respectivas
formas no conjugadas. Estos totales pueden ser también medidos
directamente por un método según el que se utiliza hidrólisis ácida
para convertir las formas conjugadas.
Claims (48)
-
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1. Un proceso para fabricar un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas a partir de un material vegetal, que comprende:extraer un material vegetal que contiene conjugados isoflavónicos y proteína con un extractor acuoso que tiene un pH situado aproximadamente por encima del punto isoeléctrico de dicha proteína en dicho material vegetal;en un primer paso de conversión, tratar dicho extracto acuoso a una temperatura de 2ºC a 121ºC y a un pH de 9 a 11 durante un tiempo suficiente para convertir del 80% al 100% de dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos; yen un segundo paso de conversión, añadir una cantidad efectiva de una enzima suplementaria capaz de partir los enlaces glucosídicos en contacto con dichos glucósidos isoflavónicos en dicho extracto acuoso a una temperatura de 5ºC a 75ºC y a un pH de 3 a 9 durante un tiempo suficiente para convertir dichos glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas. - 2. Un proceso según la reivindicación 1, en el que la extracción es efectuada a un pH de 6 a 10.
- 3. Un proceso según la reivindicación 1, en el que dicho extracto acuoso es tratado a un pH de aproximadamente 9 y a una temperatura de 45ºC a 75ºC para convertir dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos.
- 4. Un proceso según la reivindicación 1, en el que dicho extracto acuoso es tratado a un pH de aproximadamente 11 y a una temperatura de 5ºC a 50ºC para convertir dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos.
- 5. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enzima suplementaria es una enzima alfa-galactosidasa, una enzima beta-galactosidasa, una enzima gluco-amilasa, una enzima pectinasa, o una combinación de las mismas.
- 6. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enzima suplementaria es añadida de forma tal que la concentración total de enzima presente en dicho extracto acuoso es de un 0,1% a un 10% en peso de dicho material vegetal sobre una base de material seco.
- 7. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho material vegetal comprende un material de haba de soja.
- 8. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos conjugados isoflavónicos y dichos glucósidos isoflavónicos son en una mayoría convertidos en isoflavonas aglucónicas.
- 9. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos conjugados isoflavónicos y dichos glucósidos isoflavónicos son convertidos prácticamente en su totalidad en isoflavonas aglucónicas.
- 10. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además ajustar el pH de dicho extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas aproximadamente al punto isoeléctrico de dicha proteína para precipitar un material proteínico que contiene proteína y dichas isoflavonas aglucónicas.
- 11. Un proceso según la reivindicación 10, en el que se evita el lavado de dicho material proteínico.
- 12. Un proceso según la reivindicación 1, en el que dicho material proteínico es lavado con agua en una cantidad en peso que es menor que aproximadamente 6 veces el peso de dicho material proteínico precipitado.
- 13. Un proceso para fabricar un material proteínico enriquecido con isoflavonas aglucónicas a partir de un material vegetal, cuyo proceso comprende:extraer un material vegetal que contiene conjugados isoflavónicos y proteína con un extractor acuoso que tiene un pH situado aproximadamente por encima del punto isoeléctrico de dicha proteína presente en dicho material vegetal;en un primer paso de conversión, tratar dicho extracto acuoso a una temperatura de 2ºC a 121ºC y a un pH de 9 a 11 durante un tiempo suficiente para convertir del 80% al 100% de dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos;separar de dicho extracto acuoso un material proteínico que contiene dichos glucósidos isoflavónicos; yen un segundo paso de conversión, poner dichos glucósidos isoflavónicos presentes en dicho material proteínico en contacto con una enzima capaz de partir los enlaces glucosídicos a una temperatura de 5ºC a 75ºC y a un pH de 3 a 9 durante un tiempo suficiente para convertir dichos glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas, donde contactar con la enzima suplementaria comprende la adición de una cantidad efectiva de una enzima suplementaria a dicho material proteínico.
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- 14. Un proceso según la reivindicación 13, en el que dicha extracción es efectuada a un pH de 6 a 10.
- 15. Un proceso según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que dicho extracto acuoso es tratado a una temperatura de 5ºC a 75ºC para convertir dichos conjugados isoflavónicos en dichos glucósidos isoflavónicos.
- 16. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el paso de separar de dicho extracto acuoso un material proteínico que contiene dichos glucósidos isoflavónicos comprende además la operación de ajustar el pH de dicho extracto acuoso aproximadamente al punto isoeléctrico de dicho material proteínico para precipitar dicho material proteínico de dicho extracto.
- 17. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha enzima suplementaria es una enzima alfa-galactosidasa, una enzima beta-galactosidasa, una enzima gluco-amilasa, una enzima pectinasa, o una combinación de las mismas.
- 18. Un proceso según la reivindicación 16, en el que dicha enzima suplementaria es añadida a dicho material proteínico en una concentración de un 0,1% a un 10% en peso de dicho material proteínico, sobre una base de material seco.
- 19. Un proceso según la reivindicación 13, en el que dicho material vegetal es un material de haba de soja.
- 20. Un proceso según la reivindicación 13, en el que una mayoría de dichos conjugados isoflavónicos son convertidos en isoflavonas aglucónicas.
- 21. Un proceso según la reivindicación 13, en el que prácticamente la totalidad de dichos conjugados isoflavónicos son convertidos en isoflavonas aglucónicas.
- 22. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material vegetal extraído está en forma de una lechada acuosa que contiene proteína y conjugados isoflavónicos.
- 23. Un proceso según la reivindicación 22, en el que dicha lechada acuosa contiene hasta un 20% en peso de dicho material vegetal.
- 24. Un proceso para fabricar un material proteínico enriquecido con isoflavonas aglucónicas a partir de un material vegetal, cuyo proceso comprende:extraer un material vegetal que contiene conjugados isoflavónicos y proteína con un extractor acuoso que tiene un pH situado aproximadamente por encima del punto isoeléctrico de dicha proteína presente en dicho material vegetal;separar de dicho extracto un material proteínico que contiene dichos conjugados isoflavónicos;formar una lechada acuosa de dicho material proteínico;en un primer paso de conversión, tratar dicha lechada acuosa a una temperatura de 2ºC a 121ºC y a un pH de 9 a 11 durante un tiempo suficiente para convertir del 80% al 100% de dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos; yen un segundo paso de conversión, poner dichos glucósidos isoflavónicos presentes en dicha lechada acuosa en contacto con una enzima capaz de partir los enlaces glucosídicos a una temperatura de 5ºC a 75ºC y a un pH de 3 a 9 durante un tiempo suficiente para convertir dichos glucósidos isoflavónicos en isoflavonas aglucónicas, donde el contactar dichos glucósidos con una enzima comprende la adición de una cantidad efectiva de una enzima suplementaria a dicha lechada.
- 25. Un proceso según la reivindicación 24, en el que la extracción es efectuada a un pH de 6 a 10.
- 26. Un proceso según la reivindicación 24, en el que dicho material proteínico es separado de dicho extracto a base de ajustar el pH de dicho extracto aproximadamente al punto isoeléctrico de dicha proteína para precipitar dicho material proteínico de dicho extracto.
- 27. Un proceso según la reivindicación 24, en el que dicha lechada acuosa contiene hasta aproximadamente un 30% en peso de dicho material proteínico.
- 28. Un proceso según la reivindicación 24, en el que dicha lechada acuosa es tratada a una temperatura de 5ºC a 75ºC para convertir dichos conjugados isoflavónicos en glucósidos isoflavónicos.
- 29. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicha enzima suplementaria es una enzima alfa-galactosidasa, una enzima beta-galactosidasa, una enzima gluco-amilasa, una enzima pectinasa, o una combinación de las mismas.
- 30. Un proceso según la reivindicación 29, en el que dicha enzima suplementaria es añadida a dicha lechada acuosa en una concentración de un 0,1% a un 10% en peso de dicho material vegetal, sobre una base de material seco.
- 31. Un proceso según la reivindicación 24, en el que dicho material vegetal es un material de haba de soja.
- 32. Un proceso según la reivindicación 24, en el que una mayoría de dichos conjugados isoflavónicos son convertidos en isoflavonas aglucónicas.
- 33. Un proceso según la reivindicación 24, en el que prácticamente la totalidad de dichos conjugados isoflavónicos son convertidos en isoflavonas aglucónicas.
- 34. Un proceso según cualquier reivindicación precedente, que comprende además:extraer el material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas con un extractor para producir un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas; yponer dicho extracto en contacto con un material adsorbente durante un tiempo suficiente para separar de dicho extracto un material con alto contenido de genisteína.
- 35. Un proceso según la reivindicación 34, en el que dicho extractor es un alcohol acuoso que contiene de un 30% a un 90% de alcohol.
- 36. Un proceso según la reivindicación 34, en el que dicho extractor tiene un valor pH aproximadamente igual al punto isoeléctrico de dicha proteína presente en dicho material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas.
- 37. Un proceso según la reivindicación 34, en el que dicho material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas es extraído con dicho extractor, donde una relación en peso de extractor a material no excede de aproximadamente 11:1.
- 38. Un proceso según la reivindicación 34, en el que dicho extracto es eluído a través de dicho material adsorbente con un eluyente para poner dicho extracto en contacto con dicho material adsorbente para separar de dicho extracto un material con alto contenido de genisteína fijando de manera diferencialmente liberable dicha genisteína presente en dicho extracto a dicho material adsorbente.
- 39. Un proceso según la reivindicación 34, en el que dicho material con alto contenido de genisteína contiene al menos un 40% de genisteína.
- 40. Un proceso según la reivindicación 39, en el que dicho material con alto contenido de genisteína contiene al menos un 90% de genisteína.
- 41. Un proceso según la reivindicación 34, que comprende además retirar de dicho extracto material proteínico vegetal residual.
- 42. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, que comprende además:extraer el material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas con un extractor para producir un extracto enriquecido con isoflavonas aglucónicas; yponer dicho extracto en contacto con un material adsorbente durante un tiempo suficiente para separar de dicho extracto un material con alto contenido de daidceína.
- 43. Un proceso según la reivindicación 42, en el que dicho extractor es un alcohol acuoso que contiene de un 30% a un 90% de alcohol.
- 44. Un proceso según la reivindicación 42, en el que dicho extractor tiene un valor pH aproximadamente igual al punto isoeléctrico de dicha proteína presente en dicho material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas.
- 45. Un proceso según la reivindicación 42, en el que dicho material proteínico vegetal enriquecido con isoflavonas aglucónicas es extraído con dicho extractor, donde una relación en peso de extractor a material no excede de aproximadamente 11:1.
- 46. Un proceso según la reivindicación 42, en el que dicho extracto es eluído a través de dicho material adsorbente con un eluyente para poner dicho extracto en contacto con dicho material adsorbente para separar de dicho extracto un material con alto contenido de daidceína fijando de manera diferencialmente liberable dicha daidceína a dicho material adsorbente.
- 47. Un proceso según la reivindicación 42, en el que dicho material con alto contenido de daidceína contiene al menos un 40% de daidceína.
- 48. Un proceso según la reivindicación 42, que comprende además retirar de dicho extracto material proteínico vegetal residual.
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