TW574225B - Aglucone isoflavone enriched vegetable protein extract and protein material, and high genistein and daidzein content materials and process for producing the same - Google Patents

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Description

574225 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明範圍 本發明係關於富含葡萄糖苷配基異黃酮之植物蛋白質萃 取物和蛋白質物質，以及藉著執行兩個步驟之過程，將在 植物蛋白質物質中之異黃酮共軛物轉變爲葡萄糖茹配基異 黃酮的方法，以及高染料木黃酮含量之物質和高黃豆酮含 量之物質，以及從富含葡^糖荅配基異黃酮之蛋白質物質 中提供高染料木黃酮含量之物臂和·高黃豆酮含量之物質的 方法。 發明背景 異黃酮存在於各種豆科植物中，包括諸如大豆之類的植 物蛋白質物質。這些化合物包括黃豆苷（daidzin)、6"-OAc黃豆甞、6"-0Mal黃豆茹、黃豆酮、染料木苷 (genistin)、6n-0Ac染料木甞、6n-0Mal染料木甞、染料木 黃酮、黃豆黃^(glycitin)、6"-0Ac黃豆黃嘗、6n-0Mal黃 豆黃嘗、黃豆黃酮（glycitein)、雞豆黃素（biochanin A)、 7-經基-4f-甲氧異黃酮（formononentin)和擬雌内酉旨 (coumestrol)。通常這些化合物與大豆的固有苦味有關 聯。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 在植物蛋白質物質中的異黃酮包括異黃酮葡萄糖謀（葡 萄糖酮類（glucones ))、異黃酮共耗物和葡萄糖嘗配基異黃 酮。異黃酮葡萄糖苷具有附接在異黃酮部份上的葡萄糖分 子。異黃酮共軛物具有附接在異黃酮葡萄糖苷之葡萄糖分 子上的額外部份，例如6"-0Ac染料木苷含有附接在染料 木甞之葡萄糖分子之6位置處的乙酸基團。葡萄糖甞配基 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 574225 A7 B7 五、發明説明（2 異育酮僅包含一個異黃嗣部份。 大—二含有三”族”異黃酮化合物，具有葡萄糖苷、共軛物 和葡萄糖甞配基成員··染料木黃酮族、黃豆酮族和黃豆黃 酮族。染料木黃酮族包括葡萄糖甞染料木苷；共軛物 OMal染料木染料木答之6"_丙二酸酯）和染料木 甞（染料木甞之6”-乙酸酯）ι ;以及葡萄糖荅配基染料木黃 酮。黃豆酮族包括葡萄糖甞·責豆菩；共軛物6"_〇Mal黃豆 甞和6"-〇Ac黃豆苷；以及葡萄糖甞配基黃豆酮。黃豆酮 族包括葡萄糖菩黃豆黃甞；共軛物6”-〇Mal黃豆黃菩；以 及葡萄糖嘗配基黃豆黃酮。 在商業產品的產製中，諸如植物蛋白質分離物和濃縮 物，焦點已經移開這些物質。例如，在產製大豆蛋白質或 濃縮物的傳統過程中，以含水的鹼性介質來萃取大豆薄 片，大量的異黃酮與大豆蛋白質一起溶解於萃取物中。藉 著將萃取物酸化使蛋白質從萃取物中沉澱，並將其從分離 物或濃縮物中分離出來，留下保存大量已經溶解之異黃酮 的乳漿。保留在酸性沉澱蛋白質中的殘餘異黃酮，通常藉 著徹底的沖洗移除。乳漿和沖洗液通常被拋棄。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 目則已經承5忍在諸如大豆之類的植物蛋白質中所含有的 異黃酮具有醫學上的價値。在醫學評估上，對所有的異黃 酮均感興趣，而葡萄糖:y：配基是最感興趣的特定異黃酮。 染料木黃酮和黃豆酮可明顯地降低心血管的危險因子。 "Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys"，Circulation，90 册，1259 頁（1994 年 i 〇 -5- 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4^格（2IOX297公楚） 574225 A7 _B7_ 五、發明説明（3 ) 月）。亦認爲染料木黃酮和黃豆酮降低了因爲降低或改變 婦女體内内源性雌激素的含量而引起之疾病的症狀，如停 經或經前症侯群。此外，目前已經承認葡萄糖荅配基異黃 酮可抑制人類腫瘤細胞的生長，像是乳癌細胞和前列腺癌 細胞，如同在下列文獻中描述的："Genistein Inhibition of • 1 the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the -Multi-Drug Resistance Gene丨丨， Peterson 和 Barnes，Biochemical and Biophysical Research Communications.第 179 册，第 1 號，661-667 頁，1991 年 8 月 30 日；"Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostrate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation··，Peterson 和 Barnes, The Prostate，第 2 2 册，335-345 頁（1993 );和 "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer’’，Barnes 等人，Mutagens and Carcinogens in the Diet，239-253 頁（1990)。 如同上文提及的，葡萄糖苷配基異黃酮包括黃豆酮、染 料木黃酮和黃、豆酮。這些葡萄糖甞配基類具有下列之通
574225 A7 B7 五、發明説明（4 其中R1、厌2、R3和R4可選自包括Η、0H和〇CH3。染料木 育酮具有其中r1=：〇H ’ R2=H ’ R3=〇H且R4=0H的上式，黃 且明具有其中R1=〇H，R2=H，R3=H且R4=〇H的上式，而 黃豆黃嗣具有其中ri=〇ii，r^ocHs，的上 式。 因此本發明係針對葡萄备嘗配基類和富含這些化合物的 植物蛋白質萃取物和植物蛋白贋物質，還有高染料木黃酮 含量之物質和高黃豆酮含量之物質。本發明亦針對製造富 含葡萄糖#配基之植物蛋白質萃取物、富含葡萄糖替配基 異黃酮之植物蛋白質物質、高染料木黃酮含量之物質和高 黃豆酮含量之物質的方法。 將植物蛋白質異黃酮共軛物轉變爲葡萄糖芬配基異黃酮 的普遍方法是已知的，並在目前正在審理中、〗995年6月 7曰提出申請，屬於本申請案之受託人的美國專利申請案 序列第08/477,102號中提供。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將葡萄糖苷轉變爲葡萄糖苷配基異黃酮的方法也是已知 的。在目前正在審理中、屬於本申請案之受託人的pCT專 利申請案第PCT/US94/10697號中，提供了將異黃酮葡萄糖 嘗轉變爲葡萄糖芬配基異黃_，以便產生富含葡萄糖嘗配 基異黃酮之植物蛋白質萃取物和富含葡萄糖苷配基異黃酮 之植物蛋白質分離物的方法。 在此項技藝中將異黃酮葡萄糖苷轉變爲葡萄糖苷配基異 育酮的其他方法也疋已知的，像是在日本專利申請案 258,669中由Obata等人描述的。這些方法並未提供將異黃 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚1 五、發明説明（5 ) 酮共軛物轉變爲葡萄糖菩配基異黃酮的方法，或提供從富 含葡萄糖甞配基之植物蛋白質分離物中衍生出高染料木黃 酮含量之物質或高黃豆酮含量之物質的方法。此外，這些 方法僅完成中等程度之葡萄糖菩到葡萄糖荅配基類的轉 變，並需要一段相當的時間間隔來完成該中等程度的轉 交。因此，這類方法並不是大規模之商業操作所想要的。 因此，本發明之目的是提供富含·葡萄糖荅配基異黃酮之 植物蛋白質萃取物及其產製方法。 本發明之目的還有提供富含葡萄㈣配基異黃嗣之植物 蛋白質物質及其產製方法。 _本發明的另-個目的{提供高染料木黃酮含量之物質和 高黃豆酮之物質，以及從富含葡萄糖菩配基異黃嗣之植物 蛋白質物質中產製它們的方法。 發明概述 本發明是富含葡萄糖菩配基異黃酮之萃取物，以及從含 _有異黃_共耗物和蛋白質之植物物質中產製它們的方^ 孩万法包括以具有在大約該植物物質中蛋白質的等電點以 上之PH値的含水萃取劑。來萃取含有異黃酮共軛物之植 物物m度和pH値下處理含水的萃取物_段足以將 ，黃=共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖苷的時間。使酵素與異 :酮葡萄糖苷在含水萃取物中，在溫度和#値下接觸2 段足以將異黃酮葡萄糖苷轉變爲葡萄糖苷配基異黃酮 間，來產製富含葡萄糖苷配基異黃酮之萃取物。 在本發明的一個具體實施例中，係在從大約6至大約10 574225 A7 B7 五、發明説明（6 之pH値下完成該萃取作用。萃取劑對植物蛋白質之物質 的較佳重量比是從大約8:1到大約16:1。 在本發明的另一個具體實施例中，係藉著在大約2。〇到 大約121T：的溫度，以及大約6到大約13.5的pH値之下處 理含水的萃取物’將異黃酮共耗物轉變爲異黃酮葡萄糖 答。較佳的轉變作用是在i約P Η値1 1和大約5°C到大約5C C的溫度下完成，或另外是在汰約ρ η値9和大約45°C到大 約75°C的溫度下完成。 在本發明的另一個具體實施例中，藉著使異黃酮葡萄糖 甞與酵素在大約5°C到大約75°C之間的溫度，和在大約3到 大約9之間的pH値之含水萃取物中接觸，將異黃酮葡萄糖 甞轉變爲葡萄糖甞配基異黃酮。該酵素最好是能夠切開 1，4-葡萄糖苷鍵的醣類酶酵素。 ^本發明的另一個具體實施例中，將富含葡萄糖苷配基 異黃酮之萃取物調整到大約是在該萃取物中之蛋白質的等 電點，以便沉澱出含有蛋白質和葡萄糖苷配基異黃酮之 白質物質。 ★實現了異黃酮共軛物到異黃酮葡萄糖苷和異黃酮葡萄糖 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 :到葡萄糖菩配基異黃酮的高轉變率。在一個具體實施例 ，大郅份或更佳的是大體上全部的異黃酮共軛物均轉變 爲葡萄糖苷配基異黃酮。 觀點中，本發明是富含葡萄糖#配基異黃網之 蛋白資物貝’以及㈣生自含有異相共輛物和蛋 植物物的富含異黃_葡萄㈣的蛋白質物質 -9- 五、發明説明（7 ) 葡萄糖#配基異黃酮之蛋白質物質之方法。以具有大約在 植物物質中蛋白質的等電點以上之pH値的含水萃取劑， 來萃取該植物物質。在溫度和印値下處理含水的萃取物 -段足以將異黃酮共轭物轉變爲異黃_葡萄糖答的時間。 從該萃取物中分離含有異黃_葡萄糖答的蛋白質物質，並 使在及蛋白只物質中的異黃酮葡萄糖苷與酵素在pH値和 溫度下接觸一段足以將異黃酮葡萄糖芬轉變爲葡萄糖芬配 基異黃酮的時間。 在另個觀點中，本發明冑富含葡萄糖嘗配基異黃嗣之 萃取物，以及從衍生自含有異黃酮共輕物和蛋白質之植物 f貝的田口異頁酮葡萄糖芸之植物物質中，產製該富含葡 萄糖甞配基異黃酮之萃取物的方法。形成植物物質之含水 、水並在P Η値和度下處理該淤漿一段足以將異黃酮 共耗物轉變爲異黃酮葡萄糖誓的時間。然後以具有大約在 植物物質中蛋白質的等電點以上之ρΗ値的含水萃取劑， 來卒取富含異黃酮葡萄糖誓之植物物質。使在該萃取物中 的異黃酮葡萄糖菩與酵素在ρΗ値和溫度下接觸一段足以 將異黃酮葡萄糖菩轉變爲葡萄糖芬配基異黃酮的時間。 t較佳的具體實施例中，藉著將有效含量之補充酵素加 至卒取物中’使在該萃取物中之異黃嗣葡萄糖菩與酵素接 觸’在此處該補充酵素最好能切開M葡萄糖諸 酶酵素。 一在其他的具體實施例中，從富含葡萄糖芬配基異黃嗣之 卒取物中’藉著將該萃取物的PH値調整到大約爲該蛋白 -10- 本紙張尺度適财關家縣（^^7^7^797公釐) A7
五、發明説明（8 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574225 質之等電點，以便使含有蛋白質和葡萄糖甞配基異黃酮之 蛋白貧物澱’而形成富含葡萄糖甞配基異黃酮之蛋白 質物質。 . 在另一個觀點中’本發明爲富含葡萄糖甞配基異黃酮之 蛋白質物質，以及從衍生自含有異黃酮共軛物和蛋白質之 植物物質的蛋白質物質中·；產製該富含葡萄糖荅配基異黃 _ I蛋白質物質的方法”x具有大約在蛋白質之等電點以 上的pH値的含水萃取劑來萃取該植物物質。藉著將該萃 取物之pH値調整到大約爲該蛋白質之等電點，將含有異 黃酮共軛物之蛋白質物質從萃取物中分離出來。形成該蛋 白質物質之含水淤漿，並spH値和溫度下處理該含水淤 漿一段足以將異黃酮共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖苷的時 間。使在《衆中的異黃酮葡萄㈣與酵素在値和溫 度下接觸m將異黃_葡萄糖菩轉變爲葡萄糖嘗配基 異黃酮的時間。 在較佳的具體實施例中，藉著將有效含量之補充酵素加 至孩淤漿中，使在該淤漿中之異黃酮葡萄糖菩與酵素接 觸，在此處該補充酵素最好是能切開M_葡萄糖 類酶酵素。 在另一個觀點中，本發明爲高染料木黃酮含量之物質， 以及從富含葡萄糖：«：配基異黃_之植物蛋白質物質中回收 該高染料木黃酮含量之物f的方法。提供富含葡萄糖贫配 基異黃酮士植物蛋白質物質，並以含水酒精萃取劑來萃取 之’產生富含葡萄糖苷酉己基異黃酮之萃取物。使該萃取
-11 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574225 五、發明説明（9 與吸附劑物質接觸_段足以從該萃取物中分離高染料 酮含量之物質的時間。 、 ”觀點中，本發明爲高黃豆酮含量之物質，以及 =田含葡萄糖苷配基異黃酮之植物蛋白質物質中產製該高 黃立酮含量之物質的方法：提供富含葡萄糖答配基異黃: <植物蛋白質物質，並以含水酒精萃取劑來萃取之，產生 =葡萄糖芬配基異黃_之萃取物.。使該萃取物與吸附劑 貝接觸—段足以從該萃取物中分離高黃豆嗣含量之物質 的時間。 輕佳具體實施例之説明 較佳之具體實施方法的起始物質是任何植物蛋白質物質 或含有異黃_共耗物和植物蛋白質的植物物質。在較佳的 具體實施例中，起始物質是大豆物質，因爲該方法特別適 用於從大昱物質中產製富含葡萄糖苷配基異黃酮之萃取物 t蛋白貝物t。當在本文中使用"大豆物質詞時，意 指大豆或任何形式的大豆衍生物。最佳的起始物質是已^ 根據此項技藝中之傳統程序，藉著溶劑萃取移除油的大豆 1片除了大旦和大旦物質之外，本方法通常適用於寬鬆 排列的植物蛋白質物質。 依據含有異黃酮共軛物之植物物質的種類，在某些案例 中可旎需要將植物物質加工成精細分開的形式。可能想要 使得在該植物物質中所含有的異黃明化合物能夠接^種 試劑’如同下文中更詳細地描述。可以將該物質磨碎、壓 砰’或另外藉著此項技藝中已知的方法加工。如果植物物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-12 資以下述的形式存在，在該植物物質中之異黃酮化合物可 輕易地接近外在的試劑或反應劑，像是某些植物的小多葉 部份’可能就不需要使該植物物質接受這類的加工。 在第一個操作步驟中，從植物蛋白質物質中萃取包括異 黃酮共軛物的植物蛋白質和異黃酮化合物。以具有在大約 Μ蛋白質物質之等電點以上之p Η値的含水萃取劑來萃取 薄片’較佳的是在大約6·〇到大約1〇 〇的ρ η値，而最佳的 疋大約6.7到大約9.7之ρ Η値。如果需要可以使用諸如氫 氧化鋼、氫氧化鉀和氫氧化鈣之類的典型鹼性試劑，將含 水萃取劑的pH値昇高。想要的異黃酮化合物和植物蛋白 質溶解在該含水萃取物中。 以取大限度回收在該含水萃取物中的這些化合物是較佳 的’控制大且薄片或其他植物蛋白質物質對萃取劑之重量 比成特定含量，以便盡可能地多溶解在該植物物質中的異 更酮。可藉著傳統的萃取程序來完成蛋白質和異黃_的萃 取作用，包括植物蛋白質物質的逆流萃取作用。含水萃取 劑對植物蛋白質物質之重量比最好是從大約8· 1到大約 16:1。在萃取植物蛋白質物質之時，該萃取劑提供了蛋白 質和異黃酮的含水萃取物。 另外，也可以使用兩個_步驟的萃取方法，其中在最初 的萃取作用中，萃取劑對植物蛋白質物質之重量比最好是 大約10:1，而在第二個萃取作用中，萃取劑對植物蛋白質 物貧之重量比最好是大約6:1或更低，以便使在兩個萃取 作用中萃取劑對植物蛋白質物質之混合重量比不超過大約 574225 A7 ___ _B7^ 五、發明説明（11 ) 16··1 i萃取劑對植物蛋白質物質的總重量比。也可以使用 其他的萃取程序，其中萃取劑對植物蛋白質物質之重量比 最好是16:1或更低。 在第一個異黃酮轉變步驟或操作中，將在含水萃取物中 之異育酮共桃物轉變爲異黃酮葡萄糖嘗，產生富含異黃酮 葡萄糖甞的萃取物。已經發現該轉變作用係依據該含水萃 取物之pH値和溫度。 …i . 異黃酮共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖荅之作用的pH値範 圍，是從約6到大約13.5。如有需要應該將該含水萃取物 之pH値調整至想要的PH値，若想要昇高pH値，可利用 適當之驗、苛性試劑或鹼性試劑，若想要降低pH値，可 利用適當的酸或酸性試劑。已經發現將異黃酮共軛物轉變 爲異黃’葡萄糖嘗的作用是被驗性催化的，因此最好是利 用高pH値以完成迅速的轉變。將異黃酮共軛物轉變爲異 黃酮葡萄糖苷的最佳p Η値是大約9到大約i i之ρ η値。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 異黃嗣共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖茹之作用的溫度範 圍’是從約2 C到大約121°C。在此溫度範圍下該轉變作用 迅速地發生，係依據該含水萃取物之p Η値。發明者已經 發現’當ρ Η値是相對高的時，該轉變作用在較低的溫度 下迅速地發生。例如，在ρ Η値約爲1 1時，該轉變作用在 大約5 C到大約5 0 C下迅速地發生。在ρ η値約爲9時，該 轉變作用在大約45°C到大約751的溫度範圍内有效率地發 生。當該含水萃取物之ρ Η値是相對低的時，該轉變作用 在較高的溫度下發生。例如，在ρ Η値約爲6時，該轉變作 -14- 適财關家鮮（CNS ) A4^ ( 21GX297公釐)' 574225 A7 B7 五、發明説明（12 用在大約80°C到大約12Γ(：的溫度範圍内發生。在較佳的 具體實施例中，在大約35°C和大約値下完成該轉 變作用。在其他較佳的具體實施例中，在大約7yc和大約 9之pH値下完成該轉變作用。 在第一個步驟中將異黃酮共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖荅 所需的時間’主要依據所）吏用的p Η値和溫度範圍。這類 轉變時間通常範圍是從大约·15分鐘到數小時或更長。1 越鬲的ρ Η値和越高的溫度下，轉變作用就發生得越快。 在大約9之pH値下，該轉變作用在73乇下大體上在大約4 小時到大約6小時中完成。在最佳的具體實施例中，該異 黃酮共軛物在大約1 1之pH値和大約35°C的溫度下，在大 約3 0分鐘到大約1小時中轉變爲異黃酮葡萄糖茹，較佳的 是大約4 5分鐘。 第一個轉變步骤最好是在含水的系統中進行。其他可與 水相容的成份也可以出現在該系統中，像是低分子量的酒 精及其他可溶於水的溶劑。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第一個異黃酮轉變步驟，非常有效地將至少大部份，而 較佳的是大體上全部的異黃酮共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖 芸。通常是將從大約80%到大約1〇〇%異黃酮共轭物轉變 爲異黃酮葡萄糖:a：。藉著使用先前描述的較佳反應參數， 可能達到95%或更高的轉變。這些高轉變率對於大規模商 業操作是特別有吸引力的。 在第二個異黃酮轉變步驟或操作中，藉著酵素反應將在 第一個轉變步驟中產製的異黃酮葡萄糖荅和先前殘留在含 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " ' ' 574225 A7 ----~~-—---- 五、發明説明（13 ) 水萃取物中的異葡萄糖菩轉變爲葡萄糖#配基異 酮。該轉變從富含異黃酮葡萄㈣之萃取物中產生: 萄糖苷配基異黃酮之萃取物。 已經發現第二個轉變步骤係依據出現在該萃取物中之酵 素的濃度及其特徵。完成該轉變作用所需的酵素，是能夠 在異黃酮葡萄糖菩之異黃酮部份和葡萄糖部份之間的 葡萄糖苷鍵結的酵素。在較佳妁具體實施例中，該酵素爲 能夠切開1，4-葡萄糖苷鍵結的醣類酶、酯酶，或葡萄糖1 澱粉酶酵素。 ° 將異黃酮葡萄糖甞轉變爲葡萄糖荅配基異黃酮所需的酵 素濃度，係依據各種因素，包括出現在該含水萃取物中之 酵素的種類、酵素濃度的分布、酵素的活性，以及在轉變 作用期間該萃取物之pH値和溫度。該酵素可以是原本就 存在於該萃取物中，得自植物蛋白質物質或得自生長在該 萃取物中之微生物。這類原本存在的酵素，在本文中被稱 爲M殘留”酵素，而被加入該萃取物中的酵素，在本文中 則被稱爲”補充"酵素。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在該萃取物中應該存在有足夠的酵素，以便將至少大部 份，而較佳的是大體上全部的異黃酮葡萄糖荅轉變爲葡萄 糖荅配基異黃酮。通常若是在該萃取物中，殘留酵素不足 以完成該轉變作用，則應該在該萃取物中加入補充酵素。 在較佳的具體實施例中，不論在該萃取物中是否有足夠的 殘留酵素，都在該萃取物中加入補充酵素，因爲加入補充 酵素，戲劇化地減少了將葡萄糖甞大體上完全轉變爲葡萄 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574225 A7 -------- - B7 五、發明説明（14 ) '^ ' —- 配基所需的時間。若加入補充酵素，則應該加入補充 括私以便使所存在义酵素的總濃度，以乾重爲基礎，爲該 植物蛋白質物質的大約0.1重量。/。到大約10重量％。 補充酵素係以在所敎之印値和溫度條件下具有最佳 /舌性：成士效益的基礎來選擇之。該補充酵素是能夠切開 在異黃_葡萄糖答之異黃_部份和葡萄糖分子之間鍵結的 酵^像疋把夠切開1，4-葡—萄糖甞鍵結的醣類酶、酯酶和 葡萄糖-澱粉酶。較佳的補充酵素是可購買得到的心和卢_ 葡萄糖苷酶酵素、々-半乳糖苷酶酵素、葡萄糖_澱粉酶酵 素和果膠酶酵素《特佳的是諸如生物果膠酶1001 (最好在 仗約3到約6之p Η値範圍内使用）、生物果膠酶3〇〇1 (最佳 的ρ Η値範圍是從大約3到大約6 )、生物果膠酶〇κ 7〇1 (最 佳的ρΗ値範圍是從大約3到大約6)、生物乳糖酶3〇,〇〇〇 (最佳的ρ Η値範圍是從大約3到大約6 )、中性乳糖酶（最佳 的ρ Η値範圍是從大約6到大約8 )之類的酵素，它們全部 均可購自Quest International，1833第57街，郵政信箱 3917，Sarasota，Florida 34243。特佳的還有乳糖酶 F (最 好是在從約4到大約6之ρ Η値範圍内使用），以及乳糖酶 5 0，0 0 0 (取佳的ρ Η値範圍是從大約4到大約6 )，這兩者可 講自 Amano International Enzyme Co·，Inc·，郵政信箱 1000， Troy，Virginia 22974。其他特佳的補充酵素包括購自 Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, New York，New York 10121 的 G-Zyme G990 (最佳的 pH 値是 從大約4到大約6)和眞菌乳糖酶濃縮物（最佳pH値是從大 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂 574225 A7 經濟部中夬榡準局貝工消費合作、社印製 B7五、發明説明（15 ) 約 4 到大約 6);購自 Novo Nordisk Bioindustrials，Inc.，33 Turner Road, Danbury，Connecticut 06813 的乳糖酵素 (Lactozyme) 30001 (最好是在從約6到大約8的pH値範圍 内使用）和α-Gal 600L (最好是在從約4到大約6·5的pH値 範圍内使用）；購自 Gist Brocades Food Ingredients，Inc.， King of Prussia，Pennsylvania，19406 的 Maxilact 1,2000 (最 好是在從大約4到大約6的値範圍内使用）；以及購自 Pfizer Food Science Group，205 東 42 街，New York, New York 10017的中性乳糖酶（最好是在大約6到大約8的p H値 範圍内使用）。 將異黃酮葡萄糖甞轉變爲葡萄糖甞配基異黃酮的pH値 範圍是從大約3到大約9。所使用之p Η値係依據使用之酵 素的種類，並應該因此來選擇。殘留酵素在大約7到大約 9之pH値範圍内是有活性的，雖然咸相信在轉變期間内該 萃取物的pH値降低。補充酵素在由該酵素之製造者所指 定之最佳p Η値範圍内是有活性的，如同上文所顯示之數 個特定的酵素。代表性的補充酵素在從大約6到大約8之 中性的pH値範圍内，或是在從大約3到大約6之酸性的pH 値範圍内是有活性的。 可將p Η値調整到想要的値，以便經營第二個異黃酮轉 變步驟。在大多數的案例中，藉著加入一或多種適當的 故’像是醋酸、硫酸、鱗酸、氫氣酸或任何其他適當的試 劑，從第一個異黃酮轉變步驟的較高或鹼性pH値中將pH 値降低。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 -18 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 574225 A7 B7 發明説明（16 ) 第二個異黃酮轉變步驟的、 。 欠7，皿度範圍是在從約5°C到大約 75 C。溫度明顯地影響了酵+ Θ J砰I的活性，並因此影響了轉變 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 再f 填_ 衰裝 頁 作用的速率。補充酵素在贼以上是有活性的。例如心
Gal 600L在75X：時是有活性的，然而最好是在較低的溫度 下經營該轉變作用，以避免酵素失活。在較佳的具體實施 例/ ,在大約35°C到大約4yc之間完成該轉變作用。 笫二個異黃酮轉變步驟所需的時間，係依據與酵素有關的 因素，特別是濃度，以及系統的溫度和p H値。在大多數 的案例中，可能在2 4小時内達到大體上完全的轉變作 用，然而，最好加入補充酵素以便顯著地増加反應的速 率。選定的補充酵素、酵素濃度、pH値和溫度，較佳的 是在2小時内引起大體上完全的轉變作用，而最佳的是在 訂 1小時之内。 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 該方法具有非常高程度的轉變，以致於將在該萃取物中 至少大部份，而較佳的是大體上全部的異黃酮葡萄糖苷轉 變爲葡萄糖苷配基形式。"大部份” 一詞意指異黃酮葡萄 糖嘗轉變爲葡萄糖芬配基異黃酮的程度，是至少大約 50%。π大體'上全部"一詞意指異黃酮葡萄糖省:轉變爲葡萄 糖甞配基異黃酮的程度，是至少大約80%，而最佳的是至 少大約90%。這樣高的轉變，基於可信賴的考量，對於商 業應用而言是有吸引力的並令人想要的。 可從富含葡萄糖苷配基異黃酮之萃取物中回收富含葡萄 糖苷配基異黃酮的蛋白質物質。在完成第二個異黃酮轉變 步驟之時，如有需要，藉著加入酸將pH値調整成大約該 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 574225 A7 B7 五、發明説明（17 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 植物蛋白質的等電點，就大豆蛋白質而言，通常是在大約 4.0到大約5.0之間，而較佳的是在大約4 4到大約4 6之 間。從調整過pH値之萃取物中，沉澱出凝乳狀的蛋白 貝。在該凝乳中捕捉到大部份葡萄糖甞配基異黃酮。在沉 澱作用之後，從該萃取物中分離出凝乳或沉澱的蛋白質， 形成富含葡萄糖：y：配基異^酮的蛋白質物質。較佳的是藉 著離心或過濾，從該萃取物中分離洎富含葡萄糖甞配基異 黃_的蛋白質物質。 在大多數較佳的具體實施例中，完全避免已分離之蛋白 質物質的沖洗，或減至最低限度，以便大體上降低葡萄糖 甞配基異黃酮從該蛋白質物質中移出。因此完全避免以水 冲洗該蛋白質物質，或限於以水沖洗一次，此時水對蛋白 貝物質之重量比，在大約2:1到大約6:丨之間，不沖洗經過 沉澱之凝乳，提供了富含想要含量之異黃酮的蛋白質物 負’即使也可完成較廣泛的沖洗但回收較少的異黃酮。 可藉著離心或濃縮或其混合，將已經分離之蛋白質物質 脱水，再以傳統的方法乾燥。並不企圖以特定的脱水方法 來限制較佳具體實施例，雖然最好是利用傳統的脱水和乾 燥技術，像是離心和噴霧乾燥，以便形成無水的蛋白質物 質。 先前描述的較佳具體實施方法，在獲得萃取物之後立刻 使用第一個和第二個異黃酮轉變步驟。本發明也包括一種 方法，其中以具有大約在該蛋白質之等電點以上的p Η値 之含水萃取劑，來萃取含有異黃酮共軛物和蛋白質之植物 請 先 閲 讀 背 δ 1( 寫 本 頁 裝 訂 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公楚 574225 A7 五、發明説明（18 ) 物質；該第-個異黃ig轉變步㈣在該萃取物上進行；從 該萃取物中分離出含有異黃酮葡萄糖苷的蛋白質物質；並 在該蛋白質物質上進行第二個異黃酮轉變步驟。在該方法 中之步驟，可利用與上述相同的一般方法來進行。 本發明更進-步包括-種方法，其中形成含有異黃嗣共 軛物和蛋白質之植物物質^含水淤漿，在該淤漿上進行第 -個異黃酮轉變步驟；以具#1大約在該蛋白質之等電點以 上的pH値之含水萃取劑，來萃取該植物物質；並在該萃 取物中之異黃酮葡萄糖答上進行第二個異黃萌轉變步驟。 該植物物質之含水淤漿最好含有高達2〇重量％的植物物 質。該方法中之步驟，可利用與上述相同的一般方法來進 行。此外，在利用上述方法之第二個異黃酮轉變步驟之 後，可從該萃取物中分離出含有葡萄糖苷配基異黃酮之蛋 白質物質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明亦包括一種方法，其中以具有大約在該蛋白質之 等電點以上的PH値之含水萃取劑，來萃取含有異黃酮共 軛物和蛋白質之植物蛋白質物質；從該萃取物中分離出含 有異黃酮共軛物之蛋白質物質；形成蛋白質物質之含水淤 漿；並在該蛋白質物質之含水淤漿上進行第一個和第二個 異黃酮轉變步驟，該蛋白質物質之含水淤漿最好含有高達 30重量％ I蛋白質物質。該方法中之步驟，可利用與上 述相同的一般方法來進行。 企圖在含有異黃酮共軛物和蛋白質之植物物質的含水淤 漿上、在這類植物物質的萃取物上，以及在分離自這類萃 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ 210X297公釐） 574225 A7 B7 五、發明説明（19 ) 取物之蛋白質物質上進行第一和第二個異黃綱轉變步驟。 本發明包括任何前述步驟的混合，以便形成富含葡萄糖甞 配基異黃酮之萃取物或蛋白質物質。 可從回收（富含葡萄糖菩配基異黃酮的蛋白質物質，來 產製咼染料木黃酮含量之物質和高黃豆酮含量之物質。當 在本文中使用咼染料木黃酮含量之物質時，定義爲連同殘 餘的植物物質一起，至少含有40%染料木黃酮之植物物 質’最佳的是至少90%染料木黃酮，若該高染料木黃酮含 量I物質是從大豆物質中回收，則該殘餘的植物物質便是 殘餘的大豆物質。高黃豆酮含量之物質是連同殘餘的植物 物處起’至少含有黃豆酮之植物物質，若該高黃豆 酮含里之物質是從大豆物質中回收，則該殘餘的植物物質 便是大豆物質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 最初可沖洗富含葡萄糖:y：配基異黃酮之蛋白質物質，並 過濾以移除不想要的鹽類和糖類。將該富含葡萄糖菩配基 異黃酮I蛋白質物質與水混合，此時水以對該蛋白質物質 最咼6:1之比例存在。水應該是冷的，以便使葡萄糖嘗配 基異黃酮在水中的溶解性減到最小，且最好是具有從約5 。(：到約30°C的溫度。將該蛋白質物質在水中混合大約工5 到大約30分鐘，然後利用任何的傳統過濾方法，較佳的 是經由傳統的濾紙來過濾混合物，從水中過濾該蛋白質物 貝如果萵要可避免沖洗和過濾的步驟，以便將葡萄糖菩 配基異黃酮在水沖洗時任何可能的喪失減到最小。 然後利用含水的酒精萃取劑萃取富含葡萄糖甞配基異黃 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 574225
發明説明（2〇 酮6、，白質物質，以便從該蛋白質物質中移除葡萄糖嘗配 土 /、ir酮並產製葡萄糖芬配基異黃酮萃取物。低分子量 的，酉精#如甲醇，特別是乙醇，最適合作爲萃取劑之酒 精成^。已經發現葡萄糖甞配基異黃酮幾乎可溶於所有的 酒精濃度之萃取劑中。當萃取劑含有在大約30%到大約 90:〈間的酒精時，葡萄Λ甞配基異黃酮是特別可溶的， 而取佳的是該萃取劑含有在九約60%到80%之間的酒精。 雖然含水酒精是較佳的溶劑，但是也可以使用其他溶劑， 包括水、乙腈、二氣甲烷、丙酮和醋酸乙酯，來完成從蛋 白質物質中萃取葡萄糖甞配基異黃酮。 ，亥萃取作用係利用最低含量的萃取劑來完成。該萃取劑 對富含葡萄糖荅配基異黃酮之蛋白質物質的重量比不超過 11:1是較佳的。該萃取作用可藉著任何傳統的萃取方法來 進行，包括逆流萃取法或雙重萃取法，其中該混合萃取劑 對該蛋白質物質的重量比不超過11:1。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在較佳的具體實施例中，最初以80%的乙醇來萃取該蛋 白貧物質，其中該萃取劑對蛋白質物質之重量比約爲 6· 1。藉著傳統的分離方法，諸如離心或壓濾器，從該蛋 合貧物貧中分離出萃取劑’並收集萃取物。再度以80%乙 醇萃取該蛋白質物質，其中該萃取劑對蛋白質物質之重量 比約爲4:1。再次收集萃取物，並加至最初收集的萃取物 中。然後以水沖洗該蛋白質物質，其中水對蛋白質物質的 重量比約爲4:1，並將水加至已收集的萃取物中。 雖然可在任何ρ Η値下完成萃取作用，但是該萃取劑最 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 574225
、發明説明（a 好具有大約7到大約ίο之pH値。在較佳的pH値範圍内避 免形成蛋白質凝膠，且如果欲回收該蛋白質物質和葡萄糖 菩配基異黃酮萃取物，在較佳的p Η値範圍内，避免在該 蛋白質物質中形成不想要的胺基酸副產物。 可在咼達該萃取劑之沸點的任何溫度下，完成該萃取作 用較佳的疋在大約25 C到大約70°C下經營。欲從該蛋白 質物質中達成最大的葡萄糖棼配基異黃酮之移除，在大約 50 C到大约7〇 C的溫度下完成該萃取作用是較佳的，最佳 的是大約6(TC。 在萃取作用之後，可藉著使該萃取物與吸附物質接觸一 段足以從該萃取物中分離出高染料木黃酮和高黃豆酮含量 I物的時間，將高染料木黃酮含量之物質和高黃豆酮含量 之物質從該葡萄糖甞配基異黃酮萃取物中分離出來。在較 佳的具體實施例中，藉著逆相高效率液體層析法 (HPLC)。從該萃取物中分離出高染料木黃酮和高黃豆酮 含量之物質。在該萃取物中，從其他異黃酮和雜質中分離 染料木黃酮和黃豆酮，係藉著通過吸附物質之顆粒來洗脱 該萃取物，該吸附物質以化合物專一性之方式，以可釋放 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 =方式結合染料木黃酮、黃豆酮、其他的異黃酮和雜質， 藉此而得以分離每個化合物。 一開始過濾葡萄糖甞配基異黃酮萃取物，以移除可能會 塞住HPLC管柱的不溶物質。可藉著任何傳統的過濾二; 來過濾該萃取物。最好是以傳統的抄過濾方法來過濾該萃 取物，也移除可能在該萃取物中的殘餘蛋白質。 -24 - 574225 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22 ) 藉著以吸附物質之顆粒裝填傳統買得到的HPLC管柱， 來製備HPLC管柱，該吸附物質將是以化合物專一性之方 式，以可釋放之方式結合染料木黃酮、黃豆酮、其他的異 黃酮和雜質。該吸附物質可以是任何逆相HpLC填裝材 料，然而較佳的填裝材料可藉著裝載容量、分離效力和成 本的標準來選擇。一個這、的較佳填裝材料爲可購自Eka
Nobel, Nobel Industries，Sweden 的 Kromasil C18 16 微米 1〇〇 埃（A)的小珠。 使經過過濾的萃取物通過裝填好的HPLC管柱，直到該 管柱的結合位置完全以異黃酮飽和，藉著在得自管柱之流 出液中異黃酮的出現來檢測之。然後可利用極性洗脱液來 洗脱HPLC管柱，以完成分離作用。在較佳的具體實施例 中，該洗脱液爲含水酒精。該含水酒精洗脱液可具有在大 約30%到大約90%之間的酒精含量，而較佳的具有大約 50%酒精之酒精含量，以便對異黃酮提供良好的分離和良 好的溶解性。該酒精較好是甲醇或乙醇，其中在高染料木 黃酮或高黃豆酮含量之產物要用於食品或藥物應用中時， 較佳的是乙醇。 從管柱流出液中收集高染料木黃酮和高黃豆酮含量之物 質。首先從管柱中洗脱出含有黃豆酮的流出溶離份，接著 是黃豆黃酮的溶離份，隨後是較具極性的染料木黃酮溶離 份。當！旦酮和染料木黃_之溶離份從管柱中洗脱出來時 收集它們。如果需要，也可以收集黃豆黃酮的溶離份。 可藉著蒸發移除溶離份中的酒精，隨後可藉著傳統的分 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 574225 A7
請 先 閔 面 5
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574225 A7 B7 五、發明説明（24 ) 苷配基的轉變程度。 實例1 在第一個實驗中，測驗在大豆物質中異黃酮共軛物轉變 爲異黃酮葡萄糖苷。藉著定量異黃酮族之丙二酸酯和乙酸 酯的減少百分比，配合相對應定量相同異黃酮族之葡萄糖 菩的增加百分比，來決定‘變的程度。 藉著以4000克水使4〇〇克磨，細脱脂的大豆薄片形成淤 漿，來製備大豆萃取物。以氫氧化鈉將p H値調整到9.7， 並將該淤漿加熱至38°C 1 5分鐘，並加以攪動。然後離心 該淤漿，並收集該萃取物的上清液。 在不同的p Η値條件和不同的溫度下測驗異黃酮共軛物 到異黃酮葡萄糖苷的轉變作用。以氫氣酸或氫氧化鈉將 600克的萃取物試樣調整到ρΗ値6、7、9和11。關於每個 pH値’將600克的試樣分成兩個3〇〇克的試樣，並將每個 試樣培養在45°C和72.5°C下24小時。對每個試樣在〇、 2、4、6和2 4小時處經營定期的分析，以便決定該試樣的 異黃酮含量。下文的表1顯示在實驗過程中異黃酮的改變 和分布。 27- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4g ( 210X297公釐） (请先閱讀背面之注意事項存填寫本買)
574225 A7 B7 五、發明説明（25) 表1 染抖 6 -〇Mal 6”-〇Ac 染科 6”-〇Mal 6”-〇Ac 黃豆 6”-〇Mal 黃豆 試樣 木¥染料木F染料木¥木黃萌黃豆苷黃豆苷黃豆苷黃SM黃¥黃豆黃苷黃調 PH6.45T： t=0 41 47 0 13 35 4a 1 16 40 37 23 t=10分潼42 49 0 9 . 1 39 49 1 11 41 37 22 t=2小時29 51 0 19 27 49 1 22 37 36 27 t=4<J、時 25 50 0 25 22 49 1 28 36 35 29 t=6小時23 50 0 27 …19" 4δ 1 31 35 35 30 t=24/j、時 15 43 1 40 12 42 0 46 30 32 37 ΡΗ7.451Π t 二0 44 47 0 13 35 4δ 1 16 40 37 23 t=10分鐘43 48 0 9 40 43 1 11 42 36 22 t=2小時33 48 0 13 35 43 1 16 40 37 23 t=孙時37 47 0 16 32 47 1 20 41 36 23 t =6小時36 46 0 18 31 46 1 22 41 35 24 t=24d、時 13 42 0 39 13 41 0 46 31 34 35 ΡΗ9.451Π t=0 44 47 . 0 13 35 48 1 16 40 37 23 t=10分遺46 46 0 3 43 46 1 10 45 33 23 t=2小時51 41 0 8 49 40 1 10 49 30 21 _、時 57 36 0 7 54 35 1 10 52 27 21 t=6小時60 33 0 7 58 31 0 10 54 25 21 t=8小時53 26 0 15 55 25 0 20 50 23 .27 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 pHII.CT t=0 44 47 0 13 35 43 1 16 40 37 23 t=10分鐘73 20 0 8 71 19 0 10 62 19 19 t=2小時 92 0 0 7 91 0 0 9 82 0 *18 t=4d、時 93 0 0 7 90 0 0 10 32 0 18 t=6小時 93 0 0 7 90 0 0 10 81 0 19 t=24/]、時 95 0 0 5 87 0 0 13 78 0 22 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 574225A7B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（26 ) 表1續 染料 6”-0Mal 6”-0Ac 染抖 6”-〇Mal 6”-〇Ac 黃豆 6”-〇Mal 黃豆 試漾 木¥染料木苔染料木¥木黃萌黃豆¥黃豆¥黃豆¥黃豆萌黃¥黃豆黃¥黃雨 pHfi.72.5°C t=0 44 47 0 13 35 43 1 16 40 37 23 t=10分鐘42 43 0 9 .,40 4δ 1 12 40 35 24 t=2小時50 41 0 9 47 40 1 12 47 29 24 t=U、時 50 34 0 9 53 34 1 12 52 23 24 t=6小時61 30 0 9 * 58 " 29* 2 12 53 23 25 t=24<i、時 84 7 0 9 80 6 2 12 66 5 29 〇Η7.72.51Π t=0 44 47 0 13 35 43 1 16 40 37 23 t=10分鐘45 40 0 9 41 47 1 11 43 36 22 t=2小時54 21 0 8 50 38 1 10 47 30 23 時 61 11 0 8 58 30 1 10 52 24 24 匕=6小時67 6 0 8 63 25 1 10 56 20 24 t=24>J、時 90 0 0 5 85 4 1 9 68 4 28 dH9.72.55C t=0 44 47 t=10分鐘53 40 t=2小時73 21 t=4d、時 83 11 t=6小時88 6 t:2#時 96 0 3-7 6 65 4 0 0 0 5 1 5 7 8 8 9 3 2 0 9 9 0 2 2 2 112 373122143 0 0 7 8 7 3 0 4 4 5 6 7 8 6 0 9 9 9 9 11 1 1 ο ο ο ο 433920106 0 〇ΗΠ.72.5°Π t=0 44 47 0 13 35 4θ 1 16 40 37 23 t=10分潼89 3 0 8 87 3 0 9. 79 3 18 t=2小時94 0 0 6 90 0 0 10 81 0 >19 t=‘J、時 94 0 0 6 87 0 0 13 75 3 22 t=6小時94 0 0 6 86 0 0 14 74 3 23 t:2々j、時 95 0 0 3 78 0 2 20 70 4 27 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閲 讀 背 面 I 事項I 再幾 填 寫 本 頁 裝 訂 574225 Α7 Β7 五、發明説明（27) 如同由6”-〇Mal和6"-〇Ac異黃酮共軛化合物的相對濃度 降低，和葡萄糖:y：染料木苷、黃豆苷和黃豆黃荅之相對應 的濃度增加所顯示的，第一個轉變步驟在較高較鹼性的 PH値條件和較高的溫度下是最迅速和完全的。異黃酮共 耗物大體上完全轉變爲異黃酮葡萄糖苷，發生在45Ό和 72.5C的ρΗ9和pHll之試樣中，然而在45°C和72.5Ό的 pHll t試樣中降低了黃豆菩和黃豆黃甞，而在72 的 pHl Κ試樣中降低了黃豆苷和黃豆黃茹。在72 的ρΗ6 和試樣中，該轉變作用也進行至接近完全。藉著在該 萃取物中的殘留酵素將異黃酮葡萄糖苷轉變爲葡萄糖荅配 基異黃_ ’大體上發生在4yc之pH6和7的試樣中，雖然 在這些條件下將異黃酮共軛物轉變爲異黃酮葡萄糖苷並不 是特別有效率的。 實例2 在第二個實驗中，測驗異黃酮葡萄糖甞轉變爲葡萄糖甞 配基異黃_。藉著定量異黃酮族之葡萄糖甞的減少百分 比，配合相對應地定量相同異黃酮族之葡萄糖荅配基的增 加百分比，來決定轉變程度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 從大豆薄片中藉著在大約35X的溫度下，調整大豆萃取 物之p Η値至大約1 1並持續約1小時，來產製富含異黃酮 葡萄糖菩的萃取物。在第一個試樣中，藉著將試樣之ρΗ 値調整到ΡΗ7·0到ΡΗ9·0，並將該試樣留置在45。(：下24小 時’利用存在於富含異黃酮葡萄糖苷之萃取物中的殘留酵 素’來成將異黃_葡萄糖芬轉變爲葡萄糖菩配基異黃 -30-
574225 五、發明説明（28 ) 酮。藉著將下列可購得之插古祕 — 研忖<補无酵素摻入富含異黃_葡 苷之萃取物的試樣中，利用 葡匄糖 補无酵素來7D成異黃酮葡萄撼 甞至葡萄糖苷配基異黃_1A m尹'啊匍匈糖 /、頁酮的轉變作用：生物乳糖酶 30,000、Quest中性乳糖酶、 礼糖酶50,000、生物果膠酶 祕和―1 600。在每個試樣中加入的酵素含量顯示在 下又表2中。將每個試樣調整到使補充酵素爲具有活性的 pH値’ 4.0、4.5或7.0。在從机到机的溫度範園下培 養該試樣。在選定的時間取出試樣並測定異黃酮含量。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝.
、1T •線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ297公釐） 574225 A7 B7 五、發明説明（29 ) 表2 染料 6”-0Mal 6”-0Ac 染料 6fT-〇Ma[ 試漾 木¥染料木¥染料木¥木黃雨黃豆¥黃豆苷 百分比 裔留跆袤，〇H7.0，45C t=0 94 1 1 5 93 1 t 二3 小時 94 1 1 5 93 1 t二6小時 34 1 1 14 „ 86 1 t 二24<]、時 29 1 1 69 42 2 0 豆 黃 Ac¥ -0豆 Ϊ 黃豆6”-0Mal黃豆 黃¥黃豆黃¥黃萌 0 0 12 6 6 3 4 15 75 2 23 75 2 22 73 3 24 45 3 53 » 〇Η9.0 » 4S3C .» Ί - t=0 94 1 1 5 93 1 0 6 75 2 23 t=3小時 94 1 1 5 94 1 0 6 74 2 24 t=6/j、時 93 i 1 5 94 1 0 6 74 2 24 t=24<J、時 0 1 0 99 1 i 4 93 18 5 77 iUlS每50,000，， 50°C 0.12克ywo克萃取物 t=0 100 0 0 0 100 0 0 0 100 〇 0 t=l小時 0 0 0 94 30 0 0 70 40 19 41 牛物乳塘菊30.000,〇糾.5,351^ 0.05克/100克萃取物 t=0 93 4 0 4 43 t=l小時 26 4 0 70 16 t=2小時 10 4 0 85 4 t=3小時 5 4 0 91 0 0 0 6 9 0 4 2 1 1L 5 0 2 7 8 9 9 0 4 1 6 7 8 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 馬 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 rr Gal 600 * dH4.5 » 75Γ w^yioo克萃取物 t=0 91 0 0 9 89 0 0 11 78 0 22 t=24<]、時 1 0 0 99 0 0 2 98 0 0 •100 半物果跽® 100L，〇Η4.0， 5QV (X2M00克午取物 t=0 100 0 0 0 100 0 0 0 100 0 0 t=l小時 67 0 0 33 .58 0 0 42 37 13 0
Quf^t中件轧壊菊 > dH7.0，35t! 0.05W100克萃取物 ρΗ4·5 t=0 93 4 0 4 93 t=l小時 66 4 0 30 66 t=2小時 50 . 4 0 46 51 t=3小時 36 4 0 59 37 t=2‘j、時 1 4 0 95 0 0 3 3 2 0 2 3 4 0 11 ο ο ο ο ο 0 7 7 3 0 0 7 6 5 1 5 16 9 7 3 Φ 5 9 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 574225 五、發明説明（3〇 ) 如同由染料木苷、黃 黃酮、黃豆綱和黃豆音酿ΐ和百旦以分別轉變爲染料木 體上完全轉變爲葡萄糖竑尸π’達成將異黃酮葡萄糖苷太 經由在該萃取物中之損選擇的補允酵素與 地增加了轉變速率，其：古的轉變作用相比較’明顯 小時内有效濃度、溫度和PH値下，在1 小時内70成了大體上完全的轉變作用。 實例>3 . 的！驗中，從富含葡萄糖答配基異黃嗣之萃取物 2匍萄糖芬配基異黃_之蛋白質物質，並從傳統 的卒取物中回收傳統的蛋白質物質。在不同的ρΗ値4〇、 4.5和5.0下’疋出每個萃取物之回收蛋白質物質中的異黃 _含量。 製備富含葡萄糖_基異黃社大豆萃取物，係藉著” 利用含水的鹼性溶液萃取脱脂的大豆薄片；2)將該萃取 物的pH値調整到丨丨，並將該萃取物保留在35。〇下i小 時，以便產製富含異黃酮葡萄糖甞之萃取物；以及3)按 在δ含異更酮葡萄糖嘗之萃取物中的固體之重量計，將 0· 1 °/〇 乳糖酶 50,000 ( Amano International Enzyme Co·)加至 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 該萃取物中’在50°C和ρΗ4·5下處理1小時，產生富含葡 萄糖苷配基異黃酮之萃取物。亦製備傳統的大豆萃取物， 藉著以含水的鹼性溶液萃取脱脂的大豆薄片來製備傳統的 萃取物。 從每個萃取物中獲得含有10克固體的試樣，並將得自 每個萃取物的試樣調整到ρΗ4.5。藉著離心該試樣並從該 -33- 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 574225 萃取物之蛋白質物質，分離PH4.5 蛋白質 13 0 0 傳統蛋白質物質，分離PH4.5 蛋白質 21 58 0 9.7 0.0 0.0 0.0 5.8 0.4 0.0 0.5 1.6 0.7 2.3 0.0 1.2 0.0 0.4 0.4 百分hh 87 0 0 0 100 49 0 51 21 16 55 0 28 0 52 48 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（31 ) 蛋白質物質中慢慢地倒出上清液乳漿，而從每個試樣中分 離出蛋白質物質。然後定出從每個試樣中分離出之蛋白質 物質的異黃酮含量。下文的表3顯示以毫克計之每個試樣 的總異含量’以及在每個試樣之蛋白質物質中存在的 異黃酮族中每一類型異黃酮的百分比。 表3 染料 6”-0Mal 6”-0Ac 染科-，6”-〇Ac 黃豆 6，，-〇Mal 黃豆 試樣 木Η"染科木呈'染科木互木貝萌貝S穿黃豆百黃豆黃豆萌黃*g·黃豆黃s黃萌 萃取物之蛋白質物質，分離PH4.5 蛋白質 L4 0.0 0.0 傳統蛋白質物質，分離PH4.5 蛋白質 L6 4.3 0.0 比較得自富含葡萄糖甞配基異黃酮之萃取物的蛋白質物 質和得自傳統萃取物之蛋白質物質的異黃酮含量，可以看 見比起得自傳統萃取物之蛋白質物質，得自富含葡萄糖甞 配基異黃酮之萃取物的蛋白質物質含有明顯較高含量的葡 萄糖苷配基異黃酮，特別是染料木黃酮的黃豆酮。得自傳 統萃取物之蛋白質物質含有相當大量的異黃酮共軛物，這 在富含葡萄糖甞配基異黃酮之蛋白質物質中是缺乏的，係 因爲在富含葡萄糖苷配基異黃酮的萃取物中， 輥物轉變爲葡萄糖誓配基異黃一 I、 在上文的實例中，所有表示6"-OMal-染料木荅、6"-〇Ac- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-34- 574225 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32 ) 染料木甞、6"-〇Mal-黃豆：y：、6"-0Ac-黃豆苷、黃豆黃苷、 6n-0Mal-黃豆黃甞和黃豆黃酮的百分比均是計算値。百分 比表示或酵素濃度，係從在各個試樣中每100克固體的商 業酵素製品之克數來計算。下列是在大豆產品中定量異黃 酮之方法的説明。藉著將0.75克的試樣（喷霧乾燥或磨細 的粉末）與5 0毫升80/20之甲醇/水的溶劑混合，從大豆產 品中萃取異黃酮。在室溫下利凋軌道振盪器振盪該混合物 2小時。在2小時之後，藉著通過Whatman 42號濾紙過 ✓慮’移除殘餘的不溶物質。以4毫升水和1毫升乙醇稀釋5 毫升的濾液。 藉著HPLC (高效率液體層析法）利用Hewlett Packard C18 Hypersil逆相管柱分離已經萃取出的異黃酮。將異黃酮注 入管柱中，並以始於88%甲醇、1〇〇/0水和2%冰醋酸，終於 98%甲醇和2%冰醋酸的溶劑梯度來洗脱。以〇 4毫升/分鐘 之流速，將所有的異黃酮·染料木:y：、6"_〇_乙醯基染料木 苷、6”-〇-丙二醯基染料木甞、染料木黃酮、黃豆苷、6、 〇-乙酿基更旦嘗、6"-0-丙二酿基黃豆嘗、黃豆酮、黃豆 黃甞及其衍生物和黃豆黃酮-清楚地分解。藉著uv吸光度 在260毫微米處檢測峰値。藉著hPLC-質譜儀進行峰値的 確認。 藉著使用購自 Indofine Chemical Company，Sommerville， NJ的純標準物（染料木苷、染料木黃酮、黃豆苷和黃豆酮） 來完成定量作用。對每個上述的化合物計算反應因數（積 分面積/濃度），並用來定量未知的試樣。關於共軛形式， f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}
35- 574225
、發明説明（S3 其/又有可買得到的純標準物，假設其反應因數爲親代分子 冬反應因數，但從分子量差異方面來修正。假設黃豆黃菩 的反應因數是染料木#的反應因數，並從分子量之差異來 认正^方法提供每個異黃酮的定量。爲求方便，如果所 =的共_式都被轉變成它們各自的非共軏形式，則可計 具全料染料木黃酮、全部的黃豆酮和全部的黃豆黃嗣， 廷些化合物的總和重量”這些總和也可藉著使 支共概形式的酸水解作用來直接測量之。 轉 如下定義提出申請之本發明的具體實施例 或特權。 專有的特性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}
-36 -

Claims (1)

  1. 574225
    第086112184號專利申請案 中文申请專利範圍替換本(92年12月) 申請專利範圍
    1. 種k植物物質中產製冨含葡萄糖苷配基異黃酮之萃取 物的方法，其包括： ”第轉變步驟，以具有在該植物物質中之該蛋白質之 等電點以上的pH值的含水萃取劑，來萃取含有異黃酮共 輛物和蛋白質的植物物質； 一在2°C到121。〇的溫度和6到13 5的1311值下處理該含水 萃取物，一段足以將該異黃酮共軛物轉變為異黃酮葡萄 糖甞的時間；並 於第二轉變步驟下在5。(：到75。〇的溫度和3到9的pH值 下：，，使能切«萄料鍵結的帛素與在該含水萃取物中 =该異買酮匍萄糖贫接觸’持續—段足以將該異黃嗣葡 匄糖苷轉變為葡萄糖甞配基異黃酮的時間。 2. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中在從^⑴之印 值下冗成該萃取作用。 3. 根據中請專利範圍第Η之方法，其中在印值為9和45 C到75 C的恤度下處理孩含水萃取物，以便將該異黃嗣 共輛物轉變為異黃酮葡萄糖荅。 1據申請專利範圍第Μ之方法，其中在pH值為 C到5 0 C的溫度下處理士贫π A， 茨σ水卒取物，以便將該異黃酮 共輛物轉變為異黃酮葡萄糖菩。 5·根據申請專利範圍第η之方法，其中使酵素盘該異黃 =葡萄料接觸，包括將有效含量的補充酵素加至該含 有異黃酮葡萄糖：y：的含水萃取物中。 6.根據申請專利範圍第5項之方法，其中該補充酵素係選 574225 Λ 8 Β8
    自包括α-半乳糖嘗酶酵素、心半乳糖甘酶酵素、葡萄 糖-澱粉酶酵素、果膠酶酵素及其混合物。 7. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中加人該補充酵 素，使得出現在該含水萃取物中的酵素總濃《，以乾重 之基礎，為該植物物質之自〇.1重量％到1〇重量〇/ 8. 根據中請專利範圍第i項之方法，纟中該植物㈣包括 大豆物質。 9.根據中請專利範圍第丨項之m中將大部份的該異 黃酮共軛物和該異黃酮葡萄糖苷轉變為葡萄糖苷配基異 黃酮。 K).根據申請專利範圍第！項之方法，其中將大體上全部的 該異黃酮共軛物和該異黃酮葡萄糖茹轉變為葡萄糖甞配 基異黃酮。 11.根據申請專利範圍第1項之方法，更包括了將該富含葡 萄糖苷配基異黃酮之萃取物的PH值調整成為該蛋白質 之等電點，以便使含有蛋白質和葡萄糖茹配基異黃酮之 蛋白質物質沉澱出來。 12·根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中避免沖洗該蛋白 質物質。 13.根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中以按重量計，含 量低於該經過沉澱之蛋白質物質之6倍的水沖洗該蛋白 質物質。 14· 一種從植物物質中產製富含葡萄糖甞配基異黃g同之蛋白 質物質的方法，其包括： -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 574225 Λ8 B8 C8 D8 申請專利範園 第一轉變步驟，以具有在該植物物質中之該蛋白質之 等電點以上的Ρ Η值的含水萃取劑，來萃取含有異黃酮共 輛物和蛋白質的植物物質； 在2 C到121的溫度和6到13.5的pH值下處理該含水 萃取物 段足以將該異黃酮共輛物轉變為異黃i同葡萄 糖钻的時間； 從孩含水萃取物中分離出含有該異黃酮葡萄糖站之蛋 白質物質；並 於第二轉變步驟下在5。〇到751的溫度和3到9的pH值 下’使在該蛋白質物質中之該異黃酮葡萄糖嘗與能夠切 開葡萄糖苷鍵結的酵素接觸，持續一段足以將該異黃酮 葡萄糖芬轉變為葡萄糖甞配基異黃酮的時間。 15·根據申請專利範圍第1 4項之方法，其中在從6到丨〇之 p H值下完成該萃取作用。 16.根據申請專利範圍第14項之方法，其中在9到 值和5°C到75 °C的溫度下處理該含水萃取物，以便將該 異黃S同共軛物轉變為該異黃酮葡萄糖荅。 Π.根據中請專利範圍第14項之方法，纟中從該含水萃取物 中分離出含有該異黃酮葡萄糖:y：之蛋白質物質，更包括 將該含水萃取物之pH值調整成為該蛋白質物質的等電 ”、’占以便使泫蛋白質物質從該萃取物中沉殿出來。 18· j據申請專利範圍第14項之方法，其中使在該蛋白質物 質中之該異黃酮葡萄糖棼與酵素接觸，包括將有效含量 之補充酵素加至該蛋白質物質中。
    裝
    -3- 74225 '申請專利範圍 19·根據申請專利範圍第18項之方法，其中該補充酵素係選 、c括α -半乳糖芸酶酵素、万_半乳糖荅酶酵素、葡萄 糖-澱粉酶酵素、果膠酶酵素及其混合物。 2〇· ^據申請專利範圍第1 8項之方法，纟中以乾重為基礎， Χ佔咸蛋白質物質之〇· i重量％到丨〇重量％的濃度，將該 補充酵素加至該蛋白質物質中。 21·根據中請專利範圍第則之方法，其中該植物物質為大 豆物質。 U· ^據申請專利範圍第1 4項之方法，其中將大部份的該異 黃鋼共輛物轉變為葡萄糖-配基異黃酮。 23·根據申請專利範圍第丨4項之方法，其中將大體上全部的 邊異黃|同共軛物轉變為葡萄糖甞配基異黃酮。 24· 一種從植物物質中產製富含葡萄糖茹配基異黃酮之蛋白 質物質的方法，其包括： 第轉變步驟’以具有在該植物物質中之該蛋白質之 等電點以上的p Η值的含水萃取劑，來萃取含有異黃酮共 幸厄物和蛋白質的該植物物質； 從該萃取物中分離含有該異黃酮共軛物之蛋白質物 質； 形成該蛋白質物質的含水淤漿； 在2 C到12 1 C的溫度和6到1 3 · 5的ρ Η值下處理該含水 於漿，一段足以將該異黃g同共輛物轉變為異黃酮葡萄糖 芬的時間；並 於第二轉變步驟下在5°C到75。(：的溫度和3到9的pH值 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）
    :二使在該含水於装中之該異黃酮葡萄糖芬與能夠切開 鍵結的酵素接觸，持續—段以將該異黃晒葡 珣糖甘轉變為葡萄糖苷配基異黃酮的時間。 25·根據中請專利範㈣24項之方法，其中係自6到1〇之 P Η值下冗成該萃取作用。 26·Ϊ據申請專利範圍第24項之方法，其中係藉著將該萃取 八艾ΡΗ值碉整成為該蛋白質之等電點，從該萃取物中 刀離及蛋白貝物質，以便使該蛋白質物質從該萃取物中 沉澱出來。 2巧據申請專利範圍第24項之方法，其中該含水於聚含有 同達3 0重量％的該蛋白質物質。 沒根據申請專利範圍第24項之方法，其中係自9到^之 P Η值和5 c到75 c的溫度下處理該含水於漿，以便將該 異黃i同共軛物轉變為異黃酮葡萄糖苷。 Μ·根據中請專利範圍第則之方法，其中使在該含水於聚 中之該異黃酮葡萄糖苷與酵素接觸，包括將有效含量的 補充酵素加至該淤漿中。 3〇.根據中請專利第29項之方法，其中該補充酵素係選 自包括α_半乳糖苷酶酵素、半乳糖苷酶酵素、葡萄 糖-殿粉酶酵素、果膠酶酵素及其混合物。 31.根據申請專利範圍第29項之方法，丨中以乾重為基礎， 以佔孩植物物質之〇· 1重量％到丨〇重量％的濃度，將該補 充酵素加至該萃取物中。 32.根據申請專利範圍第24項之方法，其中該植物物質包栝
    装
    -5-
    574225 A8 138 C8 D8 六、申請專利範圍 大豆物質。 33. 根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中將大部份的該異 黃酮共輛物轉變為葡萄糖嘗配基異黃酮。 34. 根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中將大體上全部的 該異黃酮共軛物轉變為葡萄糖苷配基異黃酮。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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