ES2236936T3 - Membrana para ser usada en la regeneracion tisular. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de una membrana multi-capa apropiada para la utilización in vivo en la reconstrucción del tejido óseo o cartilaginoso, comprendiendo dicha membrana (i) una capa matriz predominantemente de colágeno II y con una textura abierta de tipo esponja y (ii) por lo menos, una capa barrera con una textura cerrada, relativamente impermeable, estando por lo menos dicha capa barrera hecha predominantemente de colágeno I y III, caracterizado porque dicho procedimiento comprende la aplicación de una lechada de colágeno II a la superficie de la capa barrera, tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, seguido por una liofilización por la cual se proporciona dicha capa matriz de colágeno II con una estructura abierta de tipo esponja.

Description

Membrana para ser usada en la regeneración tisular.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una membrana multi-capa de colágeno, con objeto de utilizarla en la regeneración tisular guiada, para emplearla en particular in vivo en la reconstrucción del tejido óseo o cartilaginoso, a membranas multi-capa capaces de obtenerse así, y en el empleo de dichas membranas para la fabricación de implantes de regeneración tisular guiada.

En la regeneración tisular, se ha confirmado durante largo tiempo que la reconstrucción del tejido cartilaginoso es dificultosa, tal como en las lesiones del cartílago. Las lesiones del cartílago pueden tener lugar en cualquier articulación, aunque las más voluminosas, como las de la rodilla y del tobillo, son las que presentan más riesgo. Dichas lesiones pueden producirse por traumatismos, por situaciones degenerativas o por osteocondritis disecante. Las lesiones del cartílago constituyen un factor mecánico-patológico principal en el desarrollo de la artrosis. La liberación de enzimas conduce a un proceso inflamatorio de las membranas sinoviales que, a su vez, lleva a la abrasión del cartílago y a la destrucción de la superficie articular. Recientes intentos para regenerar el cartílago articular en defectos condrales in vivo incluyen la implantación de condrocitos articulares autogénicos cultivados (CACs). Sin embargo, esta técnica ha tenido un éxito limitado.

Se acepta ahora generalmente que la reconstrucción del tejido requiere de la provisión de una matriz que sirva como una guía para las células, que crecen a lo largo y entre las fibras de la matriz. Más recientemente, se ha propuesto la utilización de los CACs sembrados tanto en matrices naturales capaces de ser resorbidas, como en las sintéticas. Sin embargo, los intentos para reconstruir el tejido cartilaginoso utilizando matrices basadas en el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico y el colágeno I o III, han necesitado que las matrices se cargaran in vitro con condrocitos antes de la implantación. Esto da lugar a complicaciones en términos del cultivo estéril de los condrocitos, esto es, de reacciones inmunológicas inflamatorias por las células gigantes y las células fibroblásticas en la superficie de contacto entre los implantes y el tejido.

El documento de patente WO-A-96/25961 propone un implante matricial basado en el colágeno II que puede injertarse in vivo en el sitio y que se basa en el crecimiento de condrocitos nativos sobre la superficie de la matriz para llevar a cabo la regeneración del cartílago. La capacidad de dicha matriz para llevar a cabo la regeneración completa del tejido cartilaginoso, es, sin embargo, limitada.

El documento de patente WO-A-96/24310 da a conocer un molde basado en un colágeno multi-capa o implante para utilizarlo en la reparación de las lesiones cartilaginosas. El producto se forma combinando una matriz colágena porosa con una membrana densa de colágeno. Se sugiere que esta membrana puede situarse en la superficie de un defecto del cartílago, con objeto de evitar la migración celular desde la placa subcondral y los vasos sanguíneos, mientras que se permite el movimiento y el intercambio de líquidos, nutrientes, citoquinas y otros factores necesarios para la regeneración del cartílago. Se dice que la membrana de colágeno unida permite la unión y el crecimiento de las células, específicamente de los condrocitos, tal como se encuentran habitualmente, en el cartílago articular.

En la práctica, tanto la matriz como la membrana se forman a partir del colágeno I y se unen juntas mediante sutura; se apreciará que esto puede perjudicar las propiedades barrera de la membrana. El producto requerirá en muchos casos el sembrado con condrocitos antes de la implantación, dando lugar a las complicaciones anteriormente indicadas.

Permanece por tanto la necesidad de un injerto matricial multi-capa con propiedades físicas mejoradas que permita el crecimiento hacia dentro exitoso de condrocitos originales y por tanto, la regeneración del cartílago tisular después de la implantación in vivo.

La presente invención se basa en el hallazgo de que un producto multi-capa que tiene dichas propiedades ventajosas puede prepararse aplicando una lechada de colágeno II a una capa barrera de colágeno I y III y liofilizar el producto resultante para convertir la lechada de colágeno II en una capa matriz de tipo esponja, tal como se define más detalladamente a continuación. El producto obtenido de este modo exhibe una buena adherencia entre las capas barrera y matriz. El cartílago, y finalmente el nuevo tejido óseo, pueden reconstruirse utilizando dicho producto, en el que in vivo la matriz de colágeno II se protege no sólo del tejido conjuntivo circundante sino también del defecto cartilaginoso u óseo mediante la capa barrera, que es capaz de evitar el crecimiento hacia dentro no deseado de cualesquiera tejidos circundantes en la matriz.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de una membrana multi-capa apropiada para su utilización in vivo en la reconstrucción de tejido óseo o cartilaginoso, comprendiendo dicha membrana (i) una capa matriz predominantemente de colágeno II y con una textura abierta de tipo esponja y (ii) por lo menos, una capa barrera que presenta una textura relativamente impermeable, siendo dicha capa barrera, por lo menos, de colágeno I y III, comprendiendo dicho procedimiento la aplicación de una lechada de colágeno II a una superficie de una capa barrera tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, seguido por una liofilización, por la que se proporciona dicha capa matriz de colágeno II que posee una estructura de tipo esponja.

La invención proporciona además una membrana multi-capa capaz de ser obtenida mediante el procedimiento anteriormente definido.

Según la invención, una ventaja particular de la membrana que es capaz de prepararse, cuando se utiliza en la reconstrucción tisular, es que las células originales son incapaces de penetrar o crecer en la capa barrera, debido a su textura cerrada y relativamente impermeable.

Aunque no se desea teorizar, se cree que la regeneración con éxito del cartílago requiere que debe impedirse el rápido crecimiento hacia dentro no sólo de las células tisulares nativas, tales como los tejidos conjuntivos, vasos sanguíneos, etc, sino también cualquier nuevo tejido óseo en el sitio defectivo. Esto puede alcanzarse utilizando una membrana de doble capa, que puede prepararse según la invención, que sirve para proteger la matriz de colágeno del crecimiento hacia dentro de las células del tejido original de un lado. Durante la implantación quirúrgica, esto puede utilizarse en combinación con un injerto tisular, por ejemplo, un injerto perióstico, efectivo para impedir el crecimiento hacia adentro de las células tisulares originales a partir del lado opuesto. De este modo, por ejemplo, un injerto perióstico puede inicialmente suturarse en el lugar, de modo que éste proporciona una cubierta sobre el defecto óseo o cartilaginoso. Una membrana bicapa que se prepara según la invención, puede entonces implantarse en el sitio del defecto, de modo que éste permanezca en contacto con el injerto y pueda organizarse de forma que la capa matriz se oriente hacia el defecto óseo. Más preferiblemente, se implanta inicialmente una membrana bicapa que se prepara según la invención en el lugar del defecto con la capa barrera orientada hacia el defecto del hueso o del cartílago. Un injerto perióstico se organiza entonces, de modo que éste permanezca en contacto con la capa matriz. El injerto puede adherirse con un adhesivo biocompatible tal como un pegamento de fibrina, o provisto con pernos polilácticos capaces de reabsorberse, o si es necesario o posible suturarlo de tal forma que éste sirve entonces para proporcionar una barrera impermeable al crecimiento hacia dentro de cualquier tejido conjuntivo circundante.

Se apreciará que puede prepararse según la invención, una membrana de tres capas en la que se provee la capa matriz entre dos capas barrera. Dicha membrana puede ser ella misma efectiva para evitar el crecimiento hacia dentro de cualesquiera células tisulares nativas.

La capa matriz de las membranas que pueden prepararse según la invención, es capaz de actuar como un medio para el crecimiento hacia dentro de condrocitos nativos, efectuando por ello la regeneración del tejido cartilaginoso. Sin embargo, para ayudar posteriormente en la regeneración del tejido cartilaginoso, la capa matriz puede impregnarse con condrocitos, bien antes de o después de la implantación in vivo. Aunque la capa matriz puede impregnarse con condrocitos inmediatamente antes de la implantación, por ejemplo, mediante inyección, se espera que en general, los condrocitos se introducirán en la capa matriz mediante inyección directa de una suspensión de condrocitos después de la implantación. De esta forma, los condrocitos que se encuentran en la capa matriz de la membrana, son capaces de llevar a cabo la regeneración del cartílago y finalmente de nuevo hueso, mientras la capa barrera de la membrana, al mismo tiempo, evita el crecimiento hacia dentro de otros tipos celulares procedentes de los tejidos circundantes.

La obtención de condrocitos que se utilicen de esta forma puede llevarse a cabo a partir de fuentes celulares que incluyen células alogénicas o autogénicas aisladas del cartílago articular, periostio y pericondrio, y células troncales mesenquimáticas (estromáticas) a partir de la médula ósea. Ya que las células alogénicas portan el potencial para la respuesta inmune y las complicaciones infecciosas, es preferible aislar los condrocitos a partir de células autogénicas, especialmente a partir del cartílago articular autogénico. Las técnicas para recuperación de las células son conocidas e incluyen la digestión enzimática o el crecimiento hacia fuera. Las células recuperadas se extienden en el cultivo celular antes de reintroducirlas en el organismo. En general, por lo menos 10^{6} células, preferentemente 10^{7} células por lo menos, se impregnarán en la capa matriz, para proporcionar la regeneración óptima del tejido cartilaginoso.

En general, para la capa matriz de la membrana capaz de prepararse según la invención, es deseable que contenga glicosaminoglicanos (GAGs) tales como ácido hialurónico, condroitín 6-sulfato, sulfato de queratina, sulfato de dermatano, etc, que sirven para proporcionar un medio natural en el que los condrocitos puedan llegar a fijarse y crecer. Aunque es posible incorporar en la matriz glicosaminoglicanos procedentes de distintas fuentes que no tienen necesariamente la misma composición, peso molecular y propiedades fisiológicas que las del cartílago, los glicosaminoglicanos preferidos son los que se extraen del mismo cartílago. En general, la capa matriz contiene preferentemente entre 1 y 10% en peso de glicosaminoglicanos, por ejemplo, de 2 a 6% en peso. Aunque algunos glucosaminoglicanos pueden encontrarse en la capa barrera, la mayor parte se encontrará en la capa matriz.

En los tejidos de colágeno nativo, los GAG's se encuentran, por lo menos en parte, como componentes de los proteoglicanos (PGs). La utilización de GAGs en forma de PGs no es deseable, en vista de los problemas inmunológicos potenciales que pueden presentarse por el contenido proteico de los PGs. Preferentemente, la capa matriz está, de este modo, sustancialmente libre de cualquier proteoglicano. Esto puede alcanzarse, convenientemente, preparando la capa matriz a partir de una mezcla de un material de colágeno II sin telopéptidos, purificado, y de glicosaminoglicanos.

Otros aditivos que pueden también encontrarse en la capa matriz incluyen, por ejemplo, condronectina, laminina, fibronectina, alginato cálcico o ancorina II, para contribuir a la unión de los condrocitos a las fibras de colágeno II, y factores de crecimiento tales como el factor inductor del cartílago (CIF), el factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF), el factor \beta trasformante del crecimiento (TGF\beta), que se encuentran como homodímeros o heterodímeros, y factores morfogenéticos óseos (BMP), tales como el BMP-2 nativo o humano recombinante, el BMP-3 (osteogenina), BMP-4 y BMP-7 (OP-1, proteína-1 osteogénica). BMP-2 afecta independientemente a las dos vías de la formación ósea, la formación directa de hueso, así como a la formación del cartílago, que se elimina entonces y se reemplaza por hueso. Los compuestos de BMPs y colágeno que incluyen la matriz ósea obtenidos mediante extracción a partir del hueso cortical de varias fuentes o de la matriz ósea desmineralizada, están formados por 90% de colágeno y 10% de proteínas no colágenas (NPC) para la actividad BMP o para la condrogénesis inducida por BMP/NCP. La matriz de colágeno insoluble en la matriz ósea y la laminina o la fibronectina, actúan como transportadores para BMPs. Algunos factores de crecimiento pueden encontrarse también en la capa impermeable. Sin embargo, la parte más grande se encontrará en la capa matriz. En general, la membrana contiene entre 100 \mug y 5 mg de factores de crecimiento.

Ventajosamente, la capa barrera está formada por largas fibras de colágeno I y III que están tan estrechamente conectadas que las sustancias de pesos moleculares altos no pueden penetrar esta barrera. Las largas fibras proporcionan una intensa fuerza extensible y de resistencia al desgarro, de forma que el material no sólo constituye una buena membrana de separación, sino que también puede ser fácilmente cosido. Es importante en cirugía que los implantes de membrana puedan coserse o enclavijarse en la posición (correspondiente) y muchas de las membranas que se propusieron anteriormente no proporcionan esta capacidad. La membrana, de acuerdo con la invención, es lo suficiente estable mecánicamente para ser manejada quirúrgicamente para llevar a cabo el injerto.

La capa matriz es muy porosa y puede tener un peso específico tan escaso como 0,02, lo que permite que las células crezcan muy rápidamente en esta capa. Esta capa de la membrana, que contiene también glicosaminoglicanos, se hincha intensamente y puede absorber tanto líquido como un 5000%. Idealmente, la capa matriz proporcionará una estructura de poro (fracción del volumen de poro y tamaño de éste), que permita la adhesión celular y el crecimiento y que las células sembradas mantengan el fenotipo condrocítico, caracterizado por la síntesis de proteínas cartilaginosas específicas. Los tamaños de los poros dependerán del proceso de liofilización utilizado para producir la matriz de colágeno II, pero puede esperarse que sea del orden de entre 10 y 120 \mum, por ejemplo, de 20 a 100 \mum. Opcionalmente, el tamaño del poro deberá estar alrededor de 85 \mum. Dicho tamaño de poro puede obtenerse fácilmente mediante congelación lenta a una temperatura de entre -5 a -10ºC durante 24 horas aproximadamente, seguido por una liofilización, o añadiendo bicarbonato amónico a la lechada antes de la liofilización.

La capa matriz de la membrana se provee preferentemente con material de colágeno II obtenido a partir del cartílago natural, preferentemente cartílago hialino de cerdos.

Aunque el grosor deseado de la capa matriz dependerá de la naturaleza del hueso o del defecto condral que va a ser tratado, en general, puede esperarse que este grosor sea del orden de 2 a 10 mm, por ejemplo, entre 4 y 6 mm. El grosor de la capa barrera es preferentemente de entre 0,2 a 2 mm, por ejemplo, de entre 0,2 a 0,7 mm.

La capa barrera está provista preferentemente por una membrana animal natural que comprende colágeno I y III. Derivándose de un fuente natural, es totalmente capaz de resorberse en el organismo y no forma productos tóxicos de degradación. Dichas membranas poseen también una fuerza de distensión particularmente alta en un estado seco o húmedo, y pueden por tanto, si es necesario, ser suturadas quirúrgicamente. Cuando el material está húmedo, es muy elástico, lo que le permite extenderse sobre los defectos óseos que presentan forma irregular.

Además del colágeno, las membranas animales naturales contienen muchos otros biomateriales, que deben eliminarse. Es conocido el tratamiento de dichas membranas con enzimas disolventes u otras sustancias químicas para llevar a cabo la purificación y la utilización de estas membranas en medicina. La mayoría de estos materiales son demasiado delgados y muy a menudo no son particularmente fáciles de usar. Las fibrillas de colágeno han perdido su carácter original y otras desventajas son que el material tiene a menudo una fuerza insuficiente para utilizarlo como un material capaz de coserse, no posee propiedades de hinchamiento por el agua y no da lugar a diferencias entre el lado carnoso fibroso y el lado granular liso. Se ha encontrado que la forma fibrosa del colágeno de tipo I y III sin telopéptidos, purificado, que es menos soluble y biodegradable, proporciona el material de barrera más ventajoso.

Las membranas que pueden utilizarse para proporcionar la capa barrera del producto capaz de prepararse según la invención, incluyen la membrana del peritoneo a partir de terneros o cerdos que conservan su estructura natural de colágeno. Las membranas peritoneales de los cerdos jóvenes de edades comprendidas entre 6-7 semanas (con pesos de 60-80 kg), son especialmente preferidas.

La capa de barrera comprenderá preferentemente colágeno insoluble nativo puro (no desnaturalizado) y puede prepararse según el procedimiento descrito en la patente WO-A-95/18638. La membrana natural puede ser tratada de este modo, en primer lugar, con álcali, por ejemplo NAOH acuoso a una concentración de entre 0,2 y 4% en peso. Esto sirve para saponificar cualquier grasa y también proteínas que son sensibles a los álcalis. El segundo paso es el tratamiento del material con un ácido, habitualmente un ácido inorgánico tal como HCl. Esto elimina contaminantes sensibles a los ácidos. El material se lava a continuación hasta que el pH es del orden de 2,5-3,5. La membrana tienen entonces un lado liso o granulado y un lado fibroso más laxo. Puede ser beneficioso llevar a cabo algún entrecruzamiento de la membrana mediante calentamiento hasta 100-120ºC.

El material de colágeno II utilizado para proporcionar la capa matriz de la membrana puede obtenerse a partir del cartílago mediante un procedimiento similar al descrito anteriormente en relación con la capa barrera que comprende predominantemente colágeno I y III. Es preferible eliminar el agua del cartílago mediante tratamiento con acetona seguido por extracción de la grasa con un disolvente hidrocarburo, tal como n-hexano, aunque pueden utilizarse los alcanoles tal como etanol, éteres tales como el éter dietílico o los hidrocarburos clorados tal como el cloroformo, o sus mezclas. El material desengrasado se somete entonces a tratamiento con álcali, que saponifica cualquier grasa residual y degrada algunas de las proteínas presentes. Finalmente, al material se deja hinchar en agua y se pasa a través de un molinillo coloidal para producir una lechada.

Para producir la membrana multi-capa, la blanda lechada que contiene el colágeno II se aplica al lado fibroso de la lisa membrana preparada, por ejemplo según WO-A-95/18638. Habitualmente, la membrana se colocará sobre una superficie blanda con el lado granulado hacia abajo, de forma que la lechada del colágeno II puede fácilmente aplicarse, por ejemplo, friccionando en el lado fibroso de la membrana. La lechada forma de este modo una capa de cualquier grosor deseado que se adhiere firmemente a la membrana de colágeno. La doble capa así formada se somete entonces a congelación y a liofilización para proporcionar la deseada estructura de tipo esponja que posee un tamaño de poro deseado. Si es necesario, puede eliminarse algo de la capa matriz para proporcionar una membrana doble de grosor uniforme. Para producir una membrana de tres capas, una segunda membrana lisa se sitúa entonces en la parte superior de la capa matriz con su lado fibroso en contacto con ésta.

La lechada de colágeno II que va a aplicarse a la membrana, contiene en general un 1,0-4,0% en peso del colágeno, ventajosamente un 2-3% en peso. Convenientemente, el valor del pH de esta mezcla deberá ajustarse a 2,5-4,5, ventajosamente a 3,0-4,0.

Ventajosamente, el material de colágeno II puede entrecruzarse después de la fase de liofilización, para estabilizar la capa matriz. Esto sirve también para aumentar la estabilidad mecánica de la capa matriz y para reducir su tasa de resorción por el organismo. Idealmente, el grado de entrecruzamiento deberá ser tal que la tasa de degradación de la matriz se corresponda con la tasa de regeneración tisular. Físicamente, el entrecruzamiento puede llevarse a cabo mediante calentamiento, pero esto debe realizarse cuidadosamente para evitar la pérdida no deseada de la capacidad de resorción. Es preferible el calentamiento hasta temperaturas de 100-120ºC durante un período de tiempo de entre 30 minutos a 5 horas. Más preferentemente, el entrecruzamiento puede realizarse mediante irradiación UV utilizando una lámpara UV, por ejemplo, durante un período de hasta 8 horas.

El material de colágeno II contiene ventajosamente glicosaminoglicanos. Éstos reaccionan en realidad con el colágeno II para llevar a cabo algún entrecruzamiento y produce un producto insoluble. Si es necesario, puede llevarse a cabo un entrecruzamiento posterior mediante calentamiento del material o mediante irradiación UV, tal como se consideró anteriormente. La reacción entre los glicosaminoglicanos y el colágeno puede realizarse a temperaturas ambientales a un pH del orden de 2,5-3,5. La cantidad de glicosaminoglicano puede estar entre el 1 y el 10% en peso. El material puede ser sometido a congelación y liofilización inmediatamente después de dicho tra-
tamiento.

Alternativamente, la formación de la lechada puede llevarse a cabo aumentando el pH de la masa del colágeno II. En este procedimiento, la masa se enfría a alrededor de 4ºC y el valor del pH se aumenta lentamente añadiendo NaOH acuoso frío a 4ºC, hasta un valor pH de 6,5 -7,5. A continuación, la masa se mantiene a temperatura ambiente durante 15-25 horas. En este tiempo, se forma la lechada, y después de esto, la masa puede congelarse y liofilizarse.

Otra alternativa, todavía, es neutralizar la masa del colágeno II hasta un valor de pH 6,8-7,4, a continuación de la eliminación del aire. La mezcla se sitúa en el molde y se incuba durante 25-20 horas a 37ºC. Se desarrolla una fina lechada que puede congelarse y liofilizarse a continuación.

De las propiedades del producto deseado, dependerá cuál de los tres procedimientos anteriores se utilice. El primer procedimiento da lugar al producto más estable. Sin embargo, la precipitación puede producir agregados de material y debe ser llevado a cabo cuidadosamente. El segundo procedimiento da lugar a un producto uniforme y blando que es, sin embargo, más soluble que el producto del primer procedimiento.

En la producción de la lechada, es posible introducir adicionalmente otras sustancias deseables tales como medicamentos, por ejemplo, antibacterianos tales como la taurolidina o antibióticos tales como la gentamicina.

Después de la aplicación de la lechada a la capa barrera, el material se congela. Con objeto de obtener un tamaño reproducible del poro, la congelación debe ser controlada cuidadosamente, debiéndose así cuidar la velocidad y el tiempo de congelación, el valor del pH y el tamaño de partícula. Con objeto de obtener poros muy pequeños, el material puede congelarse mediante shock a temperatura muy baja.

La membrana congelada se liofiliza entonces y se calienta a continuación hasta 110-130ºC. De esta forma, se lleva a cabo algún entrecruzamiento. A continuación, la biomembrana liofilizada puede ajustarse al grosor requerido, de forma que el grosor de la capa matriz sea habitualmente de 2 mm aproximadamente. La doble membrana se esteriliza entonces, por ejemplo, mediante irradiación gamma o con etilenóxido. La esterilización mediante irradiación intensa, por ejemplo, con ^{60}Co, a dosis de 25 kGy puede desactivar los BMPs. En tales circunstancias, la matriz estéril puede impregnarse con BMPs en solución salina estéril antes de la implantación.

La membrana que puede prepararse según la invención, puede utilizarse en medicina de la siguiente forma:

Como material para la regeneración tisular guiada, el crecimiento celular es estimulado por la capa matriz, mientras que la capa barrera inhibe el crecimiento celular no deseado. El contenido en colágeno II de la membrana es particularmente apropiado para la regeneración del tejido cartilaginoso, pero es también apropiado para otros tipos tisulares.

Como material para la reparación de los defectos condrales, es decir, de las lesiones que no penetran la placa subcondral, y en la reparación de defectos osteocondrales.

Contemplada desde otro aspecto, la invención proporciona la utilización de una membrana multi-capa tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, en la fabricación de un implante de regeneración tisular guiada.

Los ejemplos siguientes se dan sólo como ilustración. En los Ejemplos, todas las etapas tienen que llevarse a cabo en condiciones asépticas en, por Ejemplo, cámaras limpias.

Ejemplo 1

(A) Las membranas peritoneales de las terneras jóvenes se liberan completamente a partir de la carne y se lubrifican mediante medios mecánicos, se lavan bajo agua corriente y se tratan con una solución de NaOH al 2% durante doce horas. Las membranas se lavan entonces bajo agua corriente y se acidifican con HCl al 0,5%. Después de que el material se haya acidificado en todo su grosor (alrededor de tres horas), se lava hasta que se obtiene un pH de 3,5. Luego, el material se encogió con solución salina al 7%, se neutralizó con solución de NaHCO_{3} al 1% y se lavó bajo agua corriente. El material se deshidrató entonces con acetona y se deslubrificó con n-hexano.

(B) Cartílago congelado procedente de cerdos recién sacrificados se puso en remojo en agua fría, se lavó a fondo completamente y se purificó mecánicamente de residuos carnosos, huesos y trozos duros. A continuación, el material se lavó durante 30 minutos bajo agua corriente.

A continuación, el material se pulverizó tres veces en un homogeneizador. El tamaño de las partículas ópticas al final de la reducción del tamaño fue de 8 mm aproximadamente.

Los trozos de cartílago se deshidrataron lavando 4 veces con acetona, cada vez durante 8 horas. El cartílago se desengrasó entonces 4 veces extrayéndolo con n-hexano. Cada tratamiento duró por lo menos 8 horas. La proporción de hexano a cartílago fue de 1:10.

Después de desengrasarlo, el cartílago se hinchó en agua de bebida. La proporción de agua:material fue de 10:1. El tiempo de tratamiento fue de 24 horas.

El material se trató entonces con NaOH (5% en peso), por lo cual la proporción del cartílago al líquido fue de 1:4 y el tiempo de tratamiento fue de 32 horas. Durante el tratamiento, los trozos de cartílago se agitaron bien. A continuación, el álcali se lavó del cartílago. El pH original de 14 se redujo por tanto a 9-11. Las impurezas disueltas se lavaron y se separaron del cartílago. El líquido resultante del tratamiento alcalino se recuperó para recoger el glicosaminoglicano.

El material colágeno se trató entonces con HCl fuerte (alrededor del 3% en peso) inicialmente a un valor pH inferior a 1,0. El tiempo de tratamiento fue de 4-6 horas.

A continuación, el material se lavó con agua fría el tiempo suficiente como para que el valor del pH aumentara hasta 3-3,5. Todas las impurezas se eliminaron y el producto era una masa de colágeno libre de sales, apropiada para la producción de una esponja o de otro material de colágeno. Con este objetivo, la masa cartilaginosa puede ser, según el resultado que se pretende, desgaseada, congelada y liofilizada.

El extracto resultante del tratamiento alcalino anterior contenía glicosaminoglicano, álcali, proteínas desnaturalizadas y sales. El extracto de neutralizó en primer lugar con HCl, siendo el valor del pH después de esta neutralización de 6. El extracto se trató entonces con la ayuda de un filtro, principalmente tierra de diatomeas, que tuvo el efecto de eliminar las proteínas desnaturalizadas. El 0,5% en peso de la tierra de diatomeas se introdujo en el extracto y se eliminó mediante filtración junto con las proteínas desnaturalizadas.

El sobrenadante se sometió entonces a ultrafiltración utilizando una membrana con un valor de filtro para un peso molecular de 10.000 daltons aproximadamente. De esta forma, las sales se eliminaron para dejar glicosaminoglicanos purificados.

La solución de glicosaminoglicanos obtenida de esta forma se mezcló con material de colágeno anterior para proporcionar una matriz de colágeno II que contenía glicosaminoglicanos.

La masa de colágeno II tenía las siguientes características:

TG	=	2,8% en peso
GAG	=	3% en peso (calculado sobre la base del colágeno)
Valor del pH 3,5.

(C) La membrana del peritoneo recién preparada, preparada como antes en (A), se empapó uniformemente en agua y se colocó plana sobre una placa de vidrio con el lado fibroso hacia arriba. A continuación, la membrana se humedeció completamente con la masa de colágeno II preparada como antes en (B). La membrana se estiró plana en todas las direcciones, de forma que permaneciera adherida a la placa. La masa de colágeno II se aplicó frotando, de este modo, a la membrana.

La masa muy gruesa se aplicó a la membrana y la placa se dejó durante la noche en la nevera a una temperatura de alrededor de 4ºC. En este período de tiempo, se formó una lechada.

La lechada se congeló bajo las condiciones siguientes:

Temperatura del baño	=	-12ºC
Tiempo	=	40 minutos

A continuación, la lechada congelada se liofilizó y se calentó entonces a 125ºC.

Tiempo de liofilización

=

14 horas.

La capa matriz de colágeno II se escindió a continuación en grosores de 1 mm.

Ejemplo 2

La membrana del peritoneo recién preparada del ejemplo 1(A) se aplicó a una placa de vidrio y la gruesa masa de colágeno II, con las mismas propiedades que en el Ejemplo 1, se aplicó frotando a la membrana. Se diluyeron 50 g de la masa del colágeno II hasta 100 ml con agua destilada, agitándose totalmente. Durante esta agitación, se añadieron lentamente 100 ml de la solución de glicosaminoglicano. El colágeno se precipitó en forma de una masa junto con GAG. Después de la precipitación, la masa se homogenizó y la dispersión así obtenida se aplicó a la membrana. Una lechada que se formó por la noche y la membrana tratada se procesaron posteriormente, tal como se describe en el Ejemplo 1.

Claims (12)

1. Procedimiento para la preparación de una membrana multi-capa apropiada para la utilización in vivo en la reconstrucción del tejido óseo o cartilaginoso, comprendiendo dicha membrana (i) una capa matriz predominantemente de colágeno II y con una textura abierta de tipo esponja y (ii) por lo menos, una capa barrera con una textura cerrada, relativamente impermeable, estando por lo menos dicha capa barrera hecha predominantemente de colágeno I y III, caracterizado porque dicho procedimiento comprende la aplicación de una lechada de colágeno II a la superficie de la capa barrera, tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, seguido por una liofilización por la cual se proporciona dicha capa matriz de colágeno II con una estructura abierta de tipo esponja.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho material de colágeno II procede del cartílago natural.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho material de colágeno II procede del cartílago hialino de los cerdos.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, que comprende además entrecruzar físicamente el material del colágeno II mediante calentamiento o mediante irradiación UV.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la capa o capas barrera proceden de la membrana peritoneal de las terneras o cerdos.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la impregnación de la capa matriz con condrocitos aislados del cartílago articular, periostio, pericardio o células troncales mesenquimáticas de la médula ósea.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además la impregnación de la capa matriz y/o la capa o capas barrera con un glicosaminoglicano.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el glicosaminoglicano es ácido hialurónico, condroitín 6-sulfato, sulfato de queratina o sulfato de dermatano.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la matriz y las capas barrera o capas están libres sustancialmente de proteoglicanos.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la matriz y/o la capa barrera o capas comprenden además condronectina, laminina, fibronectina, alginato cálcico, ancorina II, factores de crecimiento o factores morfogenéticos óseos.

11. Una membrana multi-capa capaz de obtenerse mediante un procedimiento según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Utilización de una membrana, según la reivindicación 11, en la fabricación de un implante de regeneración tisular guiada.