ES2235527T3

ES2235527T3 - Derivados de acido ureido-tiobutirico como agonistas ppar.

Info

Publication number: ES2235527T3
Application number: ES99950913T
Authority: ES
Inventors: Peter Jonathan Glaxo Wellcome Inc. BROWN; James Mood Chapman; Jeffrey Alan Oplinger; Ludwig William Stuart; Timothy Mark Willson; Zhengdong Wu
Original assignee: University of South Carolina; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: University of South Carolina; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: WO2000023407A3; ATE284853T1; GB9822473D0; US6306854B1; DE69922703T2; AU6350699A; JP2002527496A; EP1149063A2; EP1149063B1; DE69922703D1; WO2000023407A2

Abstract

Un compuesto de fórmula (1), o un éster o sal en el que m es de 0 a 20, R6 se selecciona del grupo constituido por hidrógeno y y R8 se selecciona del grupo constituido por en las que y es 0, 1, o 2, cada alq es independientemente hidrógeno o grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, cada grupo R es independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, -NO2, fenilo, alquilo o fluoroalquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y el cual puede contener heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno, o azufre y el cual puede contener grupos funcionales tales como cetona o éster, cicloalquilo que contiene de 3 a 7 átomos de carbono, o dos grupos R unidos a átomos de carbono adyacentes pueden, junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, formar un anillo alifático o aromático o un sistema multianillo, y donde cada anillo representado no tiene más de 3 grupos alquilo o grupos R que no son hidrógeno.

Description

Derivados de ácido ureido-tiobutirico como agonistas PPAR.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ciertos compuestos activadores de PPAR-alfa, procedimientos para su preparación, composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos, y usos de los compuestos como agentes terapéuticos.

La obesidad se puede describir como un estado de excesiva acumulación de grasa corporal, y se considera ampliamente que es un problema grave de salud pública. El tratamiento de la obesidad continúa siendo un problema.

Ciertos compuestos fibratos se describen en el documento WO92/10468. Se dice que tales compuestos son útiles en la prevención y el tratamiento de la aterosclerosis.

La publicación PCT WO95/18533 describe procedimientos para identificar activadores y antagonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas ("PPAR") y activadores del receptor gamma del ácido retinoico. La descripción discute el tratamiento de la obesidad.

Breve descripción de la invención

Brevemente, en un aspecto, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (1) y ésteres, sales, y derivados fisiológicamente funcionales de los mismos

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en el que m es de 0 a 20, R^{6} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno y

2

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y R^{8} se selecciona del grupo que consta de

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en las que y es 0, 1, ó 2, cada alq es independientemente hidrógeno o grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, cada grupo R es independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, -NO_{2}, fenilo, alquilo o fluoroalquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y el cual puede contener heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno, o azufre y el cual puede contener grupos funcionales tales como cetona o éster, cicloalquilo que contiene de 3 a 7 átomos de carbono, o dos grupos R unidos a átomos de carbono adyacentes pueden, junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, formar un anillo alifático o aromático o un sistema multianillo, y donde cada anillo representado no tiene más de 3 grupos alquilo o grupos R que no son hidrógeno. Preferiblemente, los compuestos de la fórmula (1) son compuestos activadores de PPAR-alfa.

Los compuestos de fórmula (1) son generalmente compuestos activadores de PPAR-alfa, y por lo tanto son útiles en el tratamiento de una enfermedad, factor de riesgo, o afección, mediado por PPAR-alfa, en particular, obesidad y dislipidemia. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención se proporciona el uso del compuesto activador de PPAR-alfa de fórmula (1) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, factor de riesgo, o afección, mediado por PPAR-alfa, en particular, obesidad y dislipidemia.

La invención proporciona adicionalmente compuestos de fórmula (1) para usar en terapia, y composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (1).

La invención proporciona también procedimientos para preparar los compuestos y composiciones farmacéuticas de la invención.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el término alquilo o las palabras que contienen términos tales como fluoroalquilo, pueden ser bien de cadena lineal o bien de cadena ramificada. Por ejemplo, un grupo alquilo de 3 carbonos puede ser bien n-propilo o bien i-propilo.

Descripción detallada de la invención

Preferiblemente, los compuestos de fórmula (1) son compuestos activadores de PPAR-alfa. Más preferiblemente los compuestos son aquellos que, además de ser compuestos activadores de PPAR-alfa, son activadores selectivos de PPAR-alfa. Mediante "compuesto activador de PPAR" o "activador de PPAR", o similares, se quiere decir aquellos compuestos los cuales logran una activación del 50% del PPAR-alfa humano ("hPPAR") (en el ensayo de transfección descrito más adelante en este documento) a concentraciones de 10^{-5} M o menos, como se ejemplifican en los ejemplos de trabajo. Mediante selectivo, se quiere decir aquellos compuestos los cuales activan selectivamente PPAR-alfa por encima de PPAR-gamma tal que la razón

\frac{CE_{50} PPAR-gamma}{CE_{50} PPAR-alfa}

es al menos 10, como se ejemplifica en los ejemplos de trabajo. Más preferidos son aquellos compuestos tales que esta relación es al menos 100.

Preferiblemente, cada R^{6} y R^{8} no tienen más de 2 grupos R y no más de 2 grupos alq que sean distintos de hidrógeno. Más preferiblemente, todos los grupos R y todos los grupos alq son hidrógeno.

Compuestos particularmente preferidos son aquellos donde y es 0, m es de 0 a 6, y cada alq y cada grupo R es hidrógeno.

Ejemplos de compuestos adecuados de fórmula (1) son

ácido 2-(4-(2-(1-(4-bifeniletil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

ácido 2-(4-(2-(1-(2-(4-morfolinofenil)etil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

ácido 2-(4-(2-(1-(ciclohexanobutil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

ácido 2-(4-(2-(1-heptil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

ácido 2-(4-(2-(1-(2-cloro-4-(2-trifluorometilfenil)fenilmetil)-3-(ciclohexil)ureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

y ésteres, sales, y derivados fisiológicamente funcionales de los mismos.

Compuestos particularmente preferidos de fórmula (1) son

ácido 2-(4-(2-(1-(2-(4-morfolinilfenil)etil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

y ésteres, sales, y derivados fisiológicamente funcionales de los mismos.

Los compuestos de esta invención se pueden preparar en una diversidad de formas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (1) se pueden preparar haciendo reaccionar los compuestos de fórmulas (2), (3), y (4),

5

para dar compuestos de la invención de fórmula (1) en los que R^{6}, R^{8}, y m son como se definen anteriormente. Las rutas sintéticas se ilustrarán también en los ejemplos de trabajo más adelante en este documento.

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de la misma. Las sales preferidas de compuestos de fórmula (1) son aquellas que son fisiológicamente aceptables. Sin embargo, las sales no fisiológicamente aceptables están dentro del alcance de la invención y sus sales fisiológicamente aceptables y derivados fisiológicamente funcionales.

Los "derivados fisiológicamente funcionales" referidos en el presente documento son compuestos los cuales se convierten in vivo a un compuesto de fórmula (1) o una de sus sales fisiológicamente aceptables.

Muchos de los compuestos de esta invención contendrán uno o más estereocentros. La presente invención incluye todos los posibles estereoisómeros, tautómeros, e isómeros geométricos de los compuestos, incluyendo composiciones ópticamente enriquecidas igual que las mezclas racémicas. Cuando se desea una composición enantioméricamente enriquecida, se puede obtener bien por resolución del producto final o mediante síntesis estereoespecífica de cualquier material de partida enantioméricamente puro o cualquier intermedio conveniente. La resolución del producto final, un intermedio, o un material de partida se puede efectuar mediante un procedimiento adecuado. Véase, por ejemplo, Stereochemistry of Carbon Compounds, por E.L. Eliel (McGraw Hill) y Tables of Resolving Agents, por S.H. Wilen.

La referencia a "tratamiento" incluye profilaxis igual que tratamiento de enfermedades o síntomas establecidos. Además, se apreciará que la cantidad de un compuesto de la invención requerida para usar en tratamiento variará con la naturaleza de la afección que se esté tratando y la edad y la afección del paciente y será en última instancia a la discreción del médico o veterinario que atiende.

Alfa-, gamma- y PPAR-delta son subtipos de PPAR reconocidos. Los PPAR se conocen por unirse a sus genes diana como heterodímeros con RXR. La presente invención proporciona compuestos activadores de PPAR-alfa para usar en el tratamiento de obesidad, dislipidemia, y otras enfermedades, afecciones, o factores de riesgo mediados por PPAR-alfa. Más particularmente, la presente invención proporciona activadores de PPAR-alfa útiles en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, obesidad, inflamación, cáncer, soriasis, pancreatitis, y diversos factores de riesgo de enfermedades. Más preferiblemente los compuestos activadores de PPAR-alfa son selectivos. Los factores de riesgo de enfermedades pueden incluir dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, e hipercolesterolemia. Véase, por ejemplo, K.M: Anderson, y col., An Updated Coronary Risk Profile, AHA Medicla/Scientific Statement Science Advisory, vol. 83, páginas 356-362 (1991), W.P. Castilli, The Triglyceride Issue: A View From Farmingham, Am. Heart J., vol. 112, páginas 432-437 (1986), M. Austin, Plasma Triglyceride and Coronary Heart Disease, Arterioesclerosis and Thrombosis, vol. 11, páginas 2-14 (1991), y J.J. Genest, y col., Prevalence of Familial Lipoprotein Disorders in Patients With Premature Coronary Artery Disease, vol. 85, páginas 2025-2033 (1992). Los agonistas de PPAR-alfa han mostrado tener actividad antitumoral. Véase, por ejemplo, Wahli y col., Nature (1996), 384, 39-43. Se ha mostrado que los agonistas de PPAR-alfa tienen actividad aterosclerótica. Véase, por ejemplo, Staels y col., Nature (1998), página 790.

Una medida clínica y epidemiológica y para la clasificación de obesidad es el Índice de Masa Corporal (BMI) el cual se define como peso en kilogramos dividido por el cuadrado de la altura en metros. Típicamente, un BMI de 25-30 se considera como sobrepeso y >30 como obeso. El tratamiento de acuerdo a la presente invención se refiere generalmente a un descenso de BMI a menos de aproximadamente 29 a 31. Se apreciará sin embargo por personas expertas en la técnica que la obesidad es inherentemente difícil de clasificar, y que el punto de corte para la definición de obesidad es necesariamente arbitrario, en parte porque la gordura corporal es un continuo. Sin embargo, en términos generales el tratamiento de acuerdo con la presente invención previene o alivia deseablemente la obesidad en una extensión como resultado de la cual ya no hay más un riesgo sanitario significativo para el paciente.

La cantidad de un activador PPAR-alfa la cual se requiere para lograr el efecto biológico deseado, por supuesto, dependerá de un número de factores, por ejemplo, el modo de administración y la afección clínica precisa del receptor. En general, la dosis diaria estará en el intervalo de 0,01 mg-1 g/kg, típicamente 0,1-100 mg/kg. Una dosis intravenosa puede, por ejemplo, estar en el intervalo de 0,001 mg a 0,1 g/kg, típicamente de 0,01 mg a 10 mg/kg, la cual se puede administrar convenientemente como una infusión de 0,1 \mug a 1 mg, por minuto. Los fluidos de infusión adecuados para este propósito pueden contener, por ejemplo, de 0,01 \mug a 0,1 mg, por mililitro. Las dosis unitarias pueden contener, por ejemplo, de 0,01 \mug a 1 g de una activador de PPAR-alfa. Así las ampollas para la inyección pueden contener, por ejemplo, de 0,01 \mug a 0,1 g y formulaciones de dosis unitarias administrables oralmente, tales como comprimidos o cápsulas, pueden contener, por ejemplo, de 0,1 mg a 1 g.

Un compuesto de esta invención se puede emplear en el tratamiento de una enfermedad o afección como el compuesto per sé, pero se presenta preferiblemente con un vehículo aceptable en la forma de una formulación farmacéutica. El vehículo debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no debe ser dañino para el receptor. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y se formula preferiblemente con el activador como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, un comprimido el cual puede contener del 0,05% al 95% en peso del activador.

Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, bucal (por ejemplo, sublingual) y parenteral (por ejemplo subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa).

Las formulaciones adecuadas para administración oral se pueden presentar en unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, pastillas o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de activador de PPAR-alfa; como un polvo o gránulos, como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o agua en aceite. En general, las formulaciones se preparan mezclando uniformemente e íntimamente el activador activo de PPAR-alfa con un vehículo líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, conformar el producto. Por ejemplo, un comprimido se puede preparar comprimiendo o moldeando un polvo o gránulos del activador PPAR-alfa opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos se pueden preparar por compresión, en una máquina adecuada, el compuesto en una forma libre de flujo, tal como un polvo o gránulos mezclados opcionalmente con un agente de unión, lubricante, diluyente inerte y/o agente(s) activo(s) de superficie/dispersión. Los comprimidos moldeados se pueden hacer moldeando, en una máquina adecuada, el compuesto en polvo mezclado con un diluyente líquido inerte.

Las formulaciones adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen pastillas que comprenden un activador PPAR-alfa en una base condimentada, usualmente sacarosa y goma arábiga o goma de tragacanto, y pastillas que comprenden el activador en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.

Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente preparaciones acuosas estériles de activador de PPAR-alfa, preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor deseado. Estas preparaciones se administran preferiblemente intravenosamente, aunque la administración se puede efectuar también por medio de inyección subcutánea, intramuscular, o intradérmica. Tales preparaciones pueden prepararse convenientemente mezclando el activador con agua y volviendo a la disolución resultante estéril e isotónica con la sangre. Las composiciones inyectables de acuerdo con la invención contendrán generalmente de 0,1 a 5% p/p del activador.

Las formulaciones adecuadas para aplicación rectal se presentan preferiblemente como supositorios de dosificación unitaria. Estos se pueden preparar administrando un activador PPAR-alfa con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y después conformar la mezcla resultante.

Las formulaciones adecuadas para aplicación tópica a la piel preferiblemente toman la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, pulverizador, aerosol, o aceite. Los vehículos los cuales se pueden usar incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, y combinaciones de dos o más de los mismos. El activador PPAR-alfa está presente generalmente a una concentración de 0,1 a 15% p/p de la composición, por ejemplo, de 0,5 a 2%.

Experimental

Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar, aunque no para limitar, la invención. Cada uno de los siguientes ejemplos de la invención mostró un 50% de activación de hPPAR-alfa a concentración de 10^{-5} M o menos y son, por lo tanto, activadores de hPPAR-alfa. Es posible preparar una gran variedad de los compuestos de fórmula (1) usando procedimientos sintéticos de fase sólida convencionales tales como los ilustrados en los siguientes ejemplos de trabajo. Los compuestos preparados se pueden entonces rastrear para determinar su actividad y selectividad usando el ensayo de transfección descrito más adelante en este documento. Usando estas técnicas, alguien puede determinar fácilmente que compuestos de fórmula (1) son activadores de PPAR-alfa y que compuestos de fórmula (1) son activadores selectivos de PPAR-alfa. Además, el altamente eficiente ensayo de unión descrito más adelante en este documento se puede usar para revisar con antelación rápidamente grandes números de compuestos y aquellos compuestos que muestran unirse pueden después rastrearse en actividad y selectividad.

Intermedio 1

2-(4-bromofeniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una mezcla de 4-bromotiofenol (100 g; 0,53 moles) e hidróxido de potasio (29,5 g; 0,53 moles) en etanol (1000 ml) se agitó hasta que todo el material se hubo disuelto. El 2-bromoisobutirato de t-butilo (117,6 g; 0,53 moles) se añadió gota a gota durante 30 minutos, manteniendo la temperatura por debajo de 55ºC. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora, enfriándose después a 23ºC. El precipitado (KBr) se eliminó por filtración y el disolvente se evaporó. El residuo se fraccionó entre agua (1000 ml) y cloruro de metileno (500 ml) y la fase orgánica se separó, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó para proporcionar un sólido blanco. La cristalización de hexano proporcionó un sólido blanco (119,85 g, 68%).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,41 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 7,35 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 1,40 (s, 15H).

Intermedio 2

2-(4-(2-ftalimidoetenil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una mezcla del intermedio 1 (50 g; 150 mmoles), N-vinilftalimida (27,2 g; 157 mmol), acetato de paladio (1,68 g; 7,5 mmol), tri-o-tolilfosfina (3,07 g; 15 mmoles) y trietilamina (42 ml) en un tubo sellado se calentó con cuidado hasta que todos los sólidos se hubieron disuelto calentándose después a 110ºC durante 15 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se fraccionó entre HCl 2 N (300 ml) y acetato de etilo (300 ml) y se filtró a través de celite. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano-CH_{2}Cl_{2} como eluyente para proporcionar un sólido amarillo (43,14 g, 68%).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,90 (dd, 2H, J = 3,3 Hz, J' = 5,4 Hz), 7,76 (dd, 2h, J = 3,3 Hz, J'= 5,4 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 15,3 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,41 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,37 (d, 1H, J = 15,3 Hz), 1,45 (s, 6H), 1,43 (s, 9H).

Intermedio 3

2-(4-2-ftalimidoetil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 2 (43,1 g; 100 moles) en THF (600 ml) se añadió a una suspensión de catalizador de Wilkinson (cloruro de tris(trifenilfosfina)rodio) (5 g) en etanol (100 ml) y la mezcla se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno ((137895,2 pascales) 20 psi) durante 5 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano-CH_{2}Cl_{2} como eluyente para proporcionar un sólido marrón claro (37 g).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,82 (dd, 2H, J = 3,4 Hz, J' = 5,6 Hz), 7,70 (dd, 2H, J = 3,4 Hz, J' = 5,6 Hz), 7,41 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,20 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 3,91 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,98 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 1,40 (s, 9H), 1,39 (s, 6h).

Intermedio 4

2-(4-(2-aminoetil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 3 (29,3 g; 69 mmoles) en etanol (500 ml) se trató con hidrato de hidracina (20 g; 350 mmoles) y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora y se dejó permanecer a 23ºC durante 15 horas. El sólido resultante se eliminó por filtración, el disolvente se evaporó, y el residuo se fraccionó entre NaOH 1 N (150 ml) y éter (1300 ml). La fase orgánica se separó y se lavó con NaOH 1 N (100 ml) y salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar un aceite (19,9 gr; 97%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,42 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,14 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 2,98 (a, 2H), 2,78 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,51 (a, 2H), 1,41 (s, 15H).

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Intermedio 5

2-(4-(2-(fluoren-9-ilmetiloxicarbonilaminoetil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 4 (37,9 g; 130 mmoles) en dioxano (100 ml) se trató con una disolución de carbonato de sodio (13,6 g; 130 moles) en agua (200 ml) seguida por una suspensión de Fmoc-Osu (43,3 g; 130 mmoles) en dioxano (100 ml) y la mezcla se agitó a 23ºC durante 5 horas. El disolvente orgánico se evaporó y el residuo se acidificó con HCl 1 N. El material orgánico se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 200 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía usando 15, después 20% de EtOAc-hexano como eluyente para proporcionar un caucho (49,3 g, 74%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,77 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,57 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,44 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,31 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 7,13 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 4,77 (m, 1H), 4,42 (d, 2H, J = 6,8 Hz), 4,21 (t, 1H, J = 6,8 Hz), 3,44 (c, 2H, J = 6,4 Hz), 2,81 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 1,44 (s, 6H), 1,42 (s, 9H).

Intermedio 6

Ácido 2-(4-(2-(fluoren-9-ilmetiloxicarbonilamino)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

Una disolución de intermedio 5 (27,1 g; 52 mmoles) en TFA (135 ml) y CH_{2}Cl_{2} (135 ml) se agitó a 23ºC durante 5 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (200 ml) y se lavó con agua (3 x 150 ml) y salmuera (2 x 100 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para proporcionar un sólido de fusión baja (22,9 g; 95%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}; complicado por rotámeros) \delta 9,25 (a, 1H), 7,76 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 7,56 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 7,46 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,39 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 7,30 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 7,13 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 4,88 (a, 0,6 H), 4,54 (a, 0,4 H), 4,40 (d, 1,2 H, J = 6,8 Hz), 4,19 (t, 0,8 H, J = 6,8 Hz), 3,43 (c, 1,2 H, J = 6,4 Hz), 3,17 (a, 0,8 H), 2,80 (t, 1,2 H, J = 7,2 Hz), 2,53 (a, 0,8 Hz), 1,50 (s, 6H). Encontrado por análisis: C, 68,97; H, 6,04; N, 2,95. C_{27}H_{27}NO_{4}S \cdot 5 H_{2}O requiere: C, 68,91; H, 6,00; N, 2,98%.

Intermedio 7

Intermedio 6 cargado sobre resina SASRIN®

Una disolución de intermedio 6 (9,66 g, 20,93 mmoles), 4-dimetilaminopiridina (256 mg; 2,093 moles) y diisopropilcarbodiimida (2,635 g; 20,88 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) se agitó a 23ºC durante 10 minutos. Se añadió la resina SASRIN® (4,7 g; 0,89 mmol/g; 4,186 mmoles) y la disolución resultante se agitó a 23ºC durante 1,5 horas. La resina se filtró y se lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml), después se suspendió en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) y se trató con diisopropiletilamina (7 ml) y anhídrido isovalérico (4 ml). Después de agitar a 23ºC durante 1 hora, la resina se filtró y lavó con CH_{2}Cl_{2}
(3 x 75 ml), DMF (3 x 75 ml), MeOH (3 x 75 ml) después CH_{2}Cl_{2} (3 x 75 ml) y se secó a vacío. La carga de resina se determinó mediante análisis estándar FMOC (0,3-0,43 mmoles/g).

Intermedio 8

N-(ciclohexilbutanoil)-2-(4-(2-aminoetil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución del intermedio 4 (77 g, 260,6 mmoles) y ácido ciclohexanobutanoico (66,55 g; 390,9 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (500 ml) se trató con HOBT \cdot H_{2}O (20 g; 130,7 mmoles) y diisopropilcarbodiimida (112,6 g; 521,2 mmoles) (112,6 g; 521 mmoles) y la disolución resultante se agitó a 23ºC durante 15 horas. La disolución se lavó con disolución NaHCO_{3} saturada, HCl 1 N y salmuera y la fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano al 20% como eluyente para proporcionar un sólido blanco (100,7 g; 86%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,42 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,13 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 5,87 (sa, 1H), 3,49 (c, 2H, J = 6,8 Hz), 2,81 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 2,12 (t, 2H, J = 7,6), 1,73-1,52 (m, 7H), 1,41 (s, 15H), 1,26-1,07 (m, 6H), 0,84 (m, 2H).

Intermedio 9

2-(4-(2-ciclohexilbutilamino)etil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 8 (5 g; 5,92 moles) en THF (50 ml) se trató con una disolución 1 M de borano en THF (40 ml; 40 mmoles) y la mezcla permitió permanecer a 23ºC durante 15 horas. El exceso de borano se destruyó mediante la adición cuidadosa de n-butanol (20 ml) y la disolución resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. El disolvente se evaporó, el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc después MeOH-EtOAc al 10% como eluyente para proporcionar un aceite (3,78 g; 66%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,41 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,14 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 2,84 (m, 4H), 2,61 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 2,05 (a, 1H), 1,65 (m, 6H), 1,41 (s, 15 H), 1,33-1,07 (m, 6H), 0,82 (m, 2H).

Intermedio 10

2-(4-(2-(1-(ciclohexanobutil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Se permitió a una disolución de intermedio 9 (5 g; 11,5 mmoles) y ciclohexilisocianato (1,73 g; 13,8 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) permanecer a 23ºC durante 18 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano como eluyente para proporcionar un sólido blanco (5,3 g, 83%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,42 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 4,01 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 3,61 (m, 1H), 3,39 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,03 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,83 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,90 (m, 2H), 1,74-1,52 (m, 8H), 1,42 (s, 15H), 1,50-0,96 (m, 15H), 0,85 (m, 2H).

Ejemplo 1 Ácido 2-(4-(2-(1-(ciclohexanobutil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

Se permitió a una disolución de intermedio 9 (5 g; 8,96 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) y TFA (40 ml) permanecer a 23ºC durante 4 horas. El disolvente se evaporó para proporcionar un semisólido, el cual se purificó mediante cromatografía usando MeOH-CH_{2}Cl_{2} como eluyente para proporcionar un sólido blanco (3,7 g; 82%). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 9,05 (a, 1H), 7,44 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,15 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 4,28 (a, 1H), 3,63 (sa, 1H), 3,41 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 3,01 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 2,83 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 1,89 (m, 2H), 1,72-1,52 (m, 8H), 1,42 (s, 6H), 1,52-0,95 (m, 15H), 0,85 (m, 2H).

El siguiente ejemplo se preparó usando los procedimientos señalados para la preparación del ejemplo 1.

Ejemplo 2 Ácido 2-(4-(2-(1-(4-bifeniletil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico Procedimiento general Procedimiento de síntesis en fase sólida general para la preparación de ácidos 2-(4-(2-(ureido sustituido)etilo)feniltio)-2-metilpropiónicos

Se suspendieron 40 mg de intermedio 7 (0,43 mmol/g) en 1 ml de piperidina al 20% en DMF durante 30 minutos. La disolución se desecó y la reina se lavó con DMF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, CH_{2}Cl_{2}, THF y DMF. Se añadió una disolución de un ácido carboxílico (1 M en DMF, 0,17 ml), HOBT (1 M en DMF, 0,17 ml) y DIC (1 M en DMF, 0,17 ml). La suspensión se mezcló y después se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas. La disolución se desecó y la resina se lavó con DMF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, CH_{2}Cl_{2}, y THF. Se añadió una disolución de BH_{3}\cdotTHF (1 M en THF, 0,52 ml). La suspensión se mezcló y después se mantuvo a temperatura ambiente durante 18 horas. La disolución se secó y la resina se lavó con DMF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, CH_{2}Cl_{2}, THF yCH_{2}Cl_{2}. La resina resultante se suspendió en 1 ml de TFA al 10% en CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La disolución se filtró y el filtrado se evaporó para proporcionar el ácido 2-(4-(2-(ureido sustituido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico.

Usando el procedimiento general, el siguiente ejemplo se sintetizó a partir del intermedio 7.

Ejemplo 3 Ácido 2-(4-(2-(1-(2-cloro-4-(2-trifluorometilfenil)fenilmetil)-3-(ciclohexil)ureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

Intermedio 11

Ácido 2-(4-(2-(fenilmetiloxicarbonilamino)etil)fenoxi)-2-metilbutanoico

Una disolución de 4-(2-(fenilmetiloxicarbonilamino)etil)fenol (5,74 g; 21,16 mmoles) en 2-butanona (17 ml) y cloroformo (6 g) se añadió gota a gota a una mezcla de hidróxido de sodio (9,0 g; 225 mmoles) y 2-butanona (67 ml) manteniendo mientras la temperatura de reacción por debajo de 30ºC. La mezcla se dejó agitar a 30ºC durante 4 horas. Se añadió éter (100 ml) y el sólido resultante se recogió mediante filtración y se lavó con éter (100 ml). El sólido se disolvió en agua (70 ml) y cualquier éter residual se eliminó mediante evaporación. El ácido clorhídrico 1 N se añadió para ajustar el pH a 1, y el aceite resultante se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Los extractos combinados se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron para proporcionar un aceite amarillo (3,82 g; 49%).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,26 (s, 5H), 7,09 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 6,88 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,09 (s, 2H), 4,75 (sa, 1H), 3,42-3,44 (m, 2H), 2,75 (t, 2H, J = 6,7 Hz), 1,92-2,00 (m, 2H), 1,47 (s, 3H), 1,04 (t, 3H, J = 2,6 Hz). Espectrometría de masas ES^{-}, m/e (M + H)^{+} = 372.

Intermedio 12

2-(4-(2-(fenilmetiloxicarbonilamino)etil)fenoxi)-2-metilbutirato de metilo

Una disolución de intermedio 11 (2,0 g; 5,38 mmoles) en dimetilformamida (12 ml) se trató con carbonato de potasio (2,23 g; 16,14 mmoles) y yoduro de metilo (1,54 g; 10,76 mmoles) y la mezcla resultante se agitó a 23ºC durante 2 horas. La mezcla se filtró y el sólido recogido se lavó con acetato de etilo (70 ml). El filtrado se lavó con salmuera (4 x 50 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice usando hexano, después acetato de etilo-hexano al 33% como eluyente para proporcionar un sólido incoloro (1,27 g; 61%).

RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,31 (m, 5H), 7,06 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,68 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 4,98 (s, 2H), 3,67 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 2,62 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 1,86 (m, 2H), 1,38 (s, 3H), 0,86 (t, 3H, J = 7,3 Hz). Espectrometría de masas ES^{+}, m/e (M+Na)^{+} = 408.

Intermedio 13

Sal acetato 2-(4-(2-(aminoetil)fenoxi)-2-metilbutirato de metilo

Una disolución de intermedio 12 (1,27 g; 3,29 mmoles) en metanol (50 ml) y ácido acético (0,4 g) se trató con paladio al 10% sobre carbono y se agitó en una atmósfera de hidrógeno (344.738 pascales (50 psi)) durante 2 horas. El catalizador se filtró a través de celite y el disolvente se evaporó para proporcionar un aceite amarillo en rendimiento cuantitativo (1,04 g).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,06 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,77 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,70 (sa, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,02 (sa, 2H), 2,82 (m, 2H), 1,99 (s, 3H), 1,92 (m, 2H), 1,48 (s, 3H), 0,96 (t, 3H, J = 7,4 Hz). Espectrometría de masas ES^{+}, m/e (M+H)^{+} = 252.

Intermedio 14

2-(4-(2-(2,4-dinotrofenilsulfonilamino)etil)fenoxi)-2-metilbutirato de metilo

Una disolución de intermedio 13 (2 g; 6,42 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) se trató con disolución de bicarbonato sódico saturada y la capa orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (5 x 50 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron para proporcionar la base libre como un aceite amarillo (1,61 g; 100%). Este se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) y se trató con piridina (0,45 g; 5,61 mmoles) y cloruro de 2,4-dinitrofenilsulfonilo (1,5 g; 5,61 mmoles), y la mezcla se dejó agotar a 23ºC durante 3 horas. Se añadió agua (60 ml) y la fase orgánica se separó, se lavó con agua (3 x 40 ml) y bicarbonato de sodio saturado (40 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano al 15-20% como eluyente para proporcionar un sólido amarillo claro (1,38 g; 51%).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,63 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 8,49 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J' = 2,3 Hz), 8,07 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,89 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,54 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,34 (t, 1H, J = 5,3 Hz), 3, 78 (s, 3H), 3,48 (q, 2H, J = 8,3 Hz), 2,75 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 1,92 (m, 2H), 1,42 (s, 3H), 0,93 (t, 3H, J = 7,5 Hz).

Intermedio 15

2-(4-(2-((2,4-dinitrofenilsulfonil)(hept-2-en-1-il))amino)etil)fenoxi)-2-metilbutirato de metilo

Una disolución de intermedio 14 (315 mg, 0,654 mmoles) en THF (15 ml) se trató con trifenilfosfina (343 mg; 0,654 mmoles), hept-2-en-1-ol (150 mg; 1,308 mmoles) y dietilazocarboxilato (228 mg, 1,308) y la mezcla se dejó agitar a 23ºC durante 1 hora. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano al 10-15% como eluyente para proporcionar un semisólido (400 mg; >100%). TLC y RMN muestra que el compuesto deseado está presente junto con 1,2-(dietilcarbonil)hidracina.

Intermedio 16

2-(4-(2-(hept-2-en-1-ilamino)etil)fenoxi)-2-metilbutanoato de metilo

Una disolución de intermedio 15 (400 mg; 0,654 mmoles) en CH_{2}Cl_{2}(5 ml) se trató con trietilamina (132 mg; 1,308 mmoles) y ácido mercaptoacético (78 mg; 0,85 mmoles) y la mezcla se dejó agitar a 23ºC durante 1 hora. La mezcla se diluyó con EtOAc (30 ml) y se lavó con agua (3 x 20 ml) y bicarbonato de sodio acuoso (30 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano al 10%, después EtOAc-hexano al 50%, después MeOH como eluyente para proporcionar un aceite (177 mg; 78% de intermedio
24).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,06 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 6,75 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 5,59 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,30 (d, 2H, J = 6,3 Hz), 2,87 (m, 4H), 1,96 (m, 4H), 1,47 (s, 3H), 1,28 (m, 5H), 0,96 (t, 3H, J = 7,6 Hz), 0,86 (t, 3H, J = 6,9 Hz).

Intermedio 17

2-(4-(2-(1-hept-2-enil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)fenoxi)-2-metilbutirato de metilo

Una disolución de intermedio 17 (157 mg, 0,452 mmoles) en cloruro de metileno (5 ml) se trató con 2,4-difluorofenilisocianato (140 mg; 0,904 mmoles) y la mezcla se dejó permanecer a 23ºC durante 18 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice usando acetato de etilo-hexano al 10%, después acetato de etilo-hexano al 15% como eluyente para proporcionar un semisólido amarillo (212 mg; 93%). Contaminado con bis-(2,4-difluorofenil)urea la cual co-eluye en columna.

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,85 (sa, 1H), 8,02 (m, 1H), 7,09 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,77-6,90 (m, 4H), 5,70 (m, 1H), 5,36 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 2,84 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 1,55 (sa, 1H), 1,46 (s, 3H), 1,25-1,35 (m, 5H), 0,96 (t, 3H, J = 7,3 Hz), 0,88 (t, 3H, J = 7,4 Hz). Espectrometría de masas IC/AP^{+}, m/e (M+H)^{+} = 503.

Precursor de radioligando Ácido 2-(4-(2-(1-hept-2-enil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)fenoxi)-2-metilbutanoico

Una disolución de intermedio 17 (370 mg; 0,736 mmoles) en metanol (15 ml) se trató con NaOH 1 N (7,5 ml) y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. La mezcla se acidificó con HCl 1 N y se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice usando acetato de etilo-hexano al 20%, después acetato de etilo como eluyente para proporcionar un aceite canela (280 mg; 78%).

RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,95-8,09 (m, 1H), 7,14 (d, 2H, J = 7,1 Hz), 6,90 (d, 2H, J = 7,4 Hz), 6,81 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 5,66 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 3,56 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,87 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,00 (m, 4H), 1,44 (s, 3H), 1,27 (m, 6H), 1,03 (t, 3H, J = 7,3 Hz), 0,88 (t, 3H, J = 7,3 Hz). Espectrometría de masas ES^{-}, m/e (M+H)^{+} = 489.

Radioligando Ácido 2-(4-(2-(2,3-ditritio-1-heptil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)fenoxi)-2-metilbutanoico

Una disolución del precursor de radioligando (10 mg) en DMF anhidro (3,5 ml) se transfirió a un vaso de reacción conteniendo Pd/C al 10% (9,8 mg). El vaso de reacción se evaporó y desgasificó por medio de un ciclo de congelación-descongelación-evacuación y después se expuso al gas tritio (10,1 Ci). Después de 4 horas, la mezcla se filtró través de celite, se evaporó y el residuo se disolvió en acetronitrilo. Una parte de esta disolución (0,8 ml; 26,6 mCi) se purificó mediante HPLC (Dynamax C8, 25 minutos de gradiente desde acetonitrilo:TFA al 0,1% 4:1 hasta acetonitrilo:TFA al 0,1% 9:1, 235 nm). Las fracciones que contienen material puro se combinaron y evaporaron bajo nitrógeno. El residuo se redisolvió en acetonitrilo para proporcionar una disolución del compuesto título (82,0 Ci/mmol, pureza radioquímica, 99%).

El radioligando superior se usó en el ensayo de unión descrito anteriormente para mostrar que los compuestos que fueron activos en el ensayo de transfección fueron también ligandos para PPAR-alfa.

Radioligando en frío Ácido 2-(4-(2-(1-heptil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)fenoxi)-2-metilbutanoico

Una disolución del precursor de radioligando (10 mg) en DMF anhidro (3,5 ml) se transfirió a un vaso de reacción que contiene Pd/C al 10% (9,8 mg). El vaso de reacción se evacuó y desgasificó por medio de un ciclo congelación-descongelación-evacuación y después se expuso al gas hidrógeno. Después de 4 horas, la mezcla se filtró y a través de celite y se evaporó. El residuo se purificó por medio de cromatografía usando MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 2% como eluyente para proporcionar un caucho (7 mg).

Intermedio 18

Propionato de terc-butil-2-[4-(2-(2-(4-morfolinilfenil)-1-oxoetil)aminoetil)feniltio-2-metilo

A una disolución de intermedio 4 (3,54 g, 12 mmol) y ácido (4-morfolinilfenil)acético (3,1 g, 14 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (200 ml) se añadió clorhidrato de 1-(3.dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (2,7 g; 14 mmol). La mezcla se agitó durante 4 horas a 23ºC. Después de diluir con CH_{2}Cl_{2}, la disolución se lavó dos veces con agua (100 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), se evaporó, y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para producir un sólido de color canela claro (4,5 g, 75%). Espectro de masas (ES^{+}) 499,1 (MH^{+}, 60%), 521,1 (M+Na^{+}, 100%); RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,36 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,05 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 6,99 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 6,84 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,36 (sa, 1H), 3,87 (t, 4H, J = 4,8 Hz), 3,45 (s, 2H), 3,42 (c, 2H, J = 6,4 Hz), 3,15 (t, 4H, J = 4,8 Hz), 2,72 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,42 (s, 15 H).

Intermedio 19

2-(4-(2-(1-(2-(4-morfolinilfenil)etil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

A una disolución a 0ºC THF (75 ml) de intermedio 18 (3,88 g, 7,78 mmol), se añadió complejo BH_{3}\cdotTHF 1 M en THF (54,4 ml; 54,4 mmol). La disolución se dejó agitar durante 5 horas calentando mientras gradualmente a 23ºC. Después de enfriar a 0ºC, se añadió MeOH (50 ml) gota a gota y la disolución se concentró a sequedad. El aceite resultante se sometió a reflujo durante 30 minutos con n-butanol (50 ml) en la presencia de 4 ml (exceso) de ciclohexilisocianato. En enfriamiento y concentración, el producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice usando EtOAc al 20%-80% en hexanos como eluyente para producir un aceite incoloro, viscoso (2,8 g; 60%). Espectro de masas (ES^{+}) 610,1 (MH^{+}, 60%), 632,1 (M+Na^{+}, 50%); RMN-^{1}H (d_{6}-DMSO) \delta 7,33 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,18 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 7,02 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 6,82 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 5,63 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 3,69 (t, 4H, J = 4,5 Hz), 3,4-3,2 (m, pico 5H más agua), 3,00 (t, 4H, J = 4,5 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 2,57 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 1,65 (m, 4H), 1,53 (d, 1H, J = 12,7 Hz), 1,32 (s, 9H), 1,3 (s, 9H), 1,3 (s, 9H), 1,2-1,0 (m, 5H).

Ejemplo 4 Ácido 2-(4-(2-(1-(2-(4-morfolinofenil)etil)-3-ciclohexilureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

A una disolución de intermedio 19 (2,75 g, 4,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) a 0ºC se añadieron 60 ml de TFA:CH_{2}Cl_{2} 1:1. La disolución se agitó a 60 minutos, después se calentó a 23ºC y se agitó 60 minutos adicionales. Después de la concentración a sequedad, el producto en bruto como una disolución en MeOH/CH_{2}Cl_{2} se neutralizó a pH = \sim7 con disolución NH_{4}OH/MeOH. La mezcla bifásica se separó, la fase acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} y los compuestos orgánicos combinados se secaron (Na_{2}SO_{4}) y concentraron. La cromatografía en gel de sílice que eluye con CH_{2}Cl_{2}, después con MeOH al 1%-20% en CH_{2}Cl_{2}, dio un aceite de color granate. Un segundo flujo a través de un lecho corto de gel de sílice con MeOH al 10% en EtOAc: CH_{2}Cl_{2}eliminó la mayoría del color para producir un sólido espumoso de color canela claro (2,05 g; 82%). Espectro de masas (ES^{+}) 554,1 (MH^{+}, 100%), 576,1 (M+Na^{+}, 90%); RMN-^{1}H (d_{6}-DMSO) \delta 7,33 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,18 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,04 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 6,82 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 5,63 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 3,7 (t, 4H, J = 4,7 Hz), 3,3 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 3,23 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,00 (t, 4H, J = 4,6 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,58 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 1,66 (m, 4H), 1,54 (d, 1H, J = 12,7 Hz), 1,31 (s, 6H), 1,2-1,0 (m, 5H).

Intermedio 20

N-heptanoil-2-(4-(2-aminoetil)feniltio)-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 4 (297 mg, 1,006 mmoles) y ácido heptanoico (196 mg; 1,51 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (7 ml) se trató con HOBT \cdotH_{2}O (77 mg, 0,5 mmoles) y diisopropilcarbodiimida (253 mg; 2,012 moles) y la disolución resultante se agitó a 23ºC durante 15 horas. La disolución se lavó con disolución de NaHCO_{3}, HCl 1 N y salmuera y la fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano al 20% como eluyente para proporcionar un caucho (241 mg). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,37 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,07 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 5,35 (sa, 1H), 3,44 (m, 2H), 2,75 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,28 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 2,05 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 1,47-1,59 (m, 3H), 1,35 (m, 13H), 1,19 (m, 6H), 0,8 (m, 3H).

Intermedio 21

2-(4-(2-(1-heptil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)feniltio-2-metilpropionato de t-butilo

Una disolución de intermedio 20 (241 mg; 0,592 mmoles) en THF (5 ml) se trató con una disolución 1 M de borano en THF (4 ml; 4 mmoles) y la mezcla se dejo permanecer a 23ºC durante 15 horas. El borano en exceso se destruyó mediante la adición cuidadosa de metanol y la disolución resultante se calentó a reflujo durante 30 minutos. El disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y se trató con 2,4-difluorofenilisocianato (184 mg; 1,184 mmoles) y permitió permanecer a 23ºC durante 15 horas. La mezcla se lavó con HCl 2 N y la fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía usando EtOAc-hexano como eluyente para proporcionar un aceite (270 mg). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,03 (m, 1H), 7,77 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,18 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 6,83 (m, 2H), 6,34 (sa, 1H), 3,52 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,19 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,59 (m, 2H), 1,41 (m, 13H), 1,3 (m, 9H), 0,88 (m, 3H).

Ejemplo 5 Ácido 2-(4-(2-(1-heptil-3-(2,4-difluorofenil)ureido)etil)feniltio)-2-metilpropiónico

Una disolución de intermedio 21 (270 mg; 0,506 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (3 ml) y TFA (3 ml) se dejo permanecer a 23ºC durante 4 horas. El disolvente se evaporó para proporcionar un semisólido (240 mg). RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,99 (m, 1H), 7,45 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 7,20 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 6,82 (m, 2H), 6,34 (sa, 1H), 3,53 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,16 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,20 (a, 2H), 1,85 (a, 2H), 1,75-1,52 (m, 4H), 1,42 (s, 6H), 1,45-1,15 (m, 11H), 0,87 (t, 3H, J = 6,8 Hz).

Ensayo de unión

Para generar un plásmido de expresión bacteriana para el dominio de unión a ligando de hPPAR-alfa, el cDNA que codifica los dominios bisagra y de unión a ligando de hPPAR-alfa (aminoácidos 167-468) se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa y el producto amplificado se insertó en fase dentro del plásmido pGEX-2T (Pharmacia). Se confirmó la secuencia de la región amplificada de hPPAR-alfa. Se expreso GST-hPPAR-alfa en células BL21(DE3)plysS y extractos preparados congelando-descongelando las células en tampón de lisis bacteriana (10 mM Tris, pH 8,0, 250 mM de KCl, DTT 1 mM, tritón X-100 al 1%) seguido por centrifugación a 40.000 x g durante 30 minutos. El glicerol se añadió a los extractos bacterianos a una concentración final del 10%. Los extractos bacterianos se dializaron extensivamente frente al tampón de lisis bacteriana que contiene glicerol al 10%. Los ensayos de unión incluyen 50 \mug de extractos bacterianos (que contienen GST-hPPAR-alfa), 60 nM de radioligando, y bien 10 \muM de radioligando frío (o ejemplo comparativo) o vehículo solo (DMSO al 0,1%, concentración final) en tampón que contiene Tris 10 mM (pH 8,0), KCl 50 mM, DTT 10 mM. Las reacciones de unión se incubaron a 4ºC durante 2-3 horas. La radiactividad unida se separó de la radiactividad libre mediante elución a través de columnas desaladoras proteicas Sephadex G-25 de 1 ml (Boehringer Mannheim). La radiactividad unida eluyó en el volumen inactivo de la columna y se cuantificó mediante recuento de centelleo líquido.

Resultados (los datos representan la media de ensayos llevados a cabo por triplicado y se presentan como dpm)

Sin competidor	140000
+ 10 \muM radioligando en frío	25000
Unión específica	115000

Ensayo de transfección Plásmidos: quimera GAL4-hPPAR-alfa e indicadores UAS-tk-SPAP

Las construcciones de expresión GAL-4-hPPAR-alfa y GAL-4-gamma-hPPAR contienen la secuencia de iniciación de traducción y los aminoácidos 1-76 del receptor glucocorticoide fusionados a los aminoácidos 1-147 del factor de transcripción GAL-4 de la levadura (S. cerevisiae) en el vector de expresión pSG5 (Stratagene). Los aminoácidos 167-468 de hPPAR-alfa o los aminoácidos 194-475 gamma-hPPAR se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando la polimerasa Vent (New England Biolabs) y C-terminal insertado a las secuencias GAL-4. El indicador UAS-tk-SPAP contiene 5 copias del sitio de unión GAL4 insertadas dentro de pG12-tk-SPAP (Berger y col., 1988).

Ensayo de transfección: indicador SPAP

Las células CV-1 se cultivaron en placas en medio DME suplementado con suero fetal bovino deslipidizado al 10% a una densidad de 2,4 x 10^{4} células por pocillo en una placa de 96 pocillos (Costar) 16-24 horas antes de la transfección. En general, 8,0 ng de plásmido indicador, 25,0 ng de vector de expresión de \beta-galactosidasa (pCH110, Pharmacia), y 2,0 g de vector de expresión GAL-4-hPPAR-alfa o GAL-4-gamma-hPPAR se mezclaron con el DNA vehículo (pBluescript, Strategene) a un total de 80 ng de DNA por pocillo en un volumen de 10 ml de medio optiMEM I (Life Technologies). A éste, se añadió una segunda mezcla, conteniendo 9,3 ml de medio optiMEM I y 0,7 ml de LIPOFECTAMINE^{TM} (Life Technologies). Después de 30 minutos se añadieron 80 ml adicionales de medio optiMEM I y la mezcla combinada se aplicó después a las células. 16 horas más tarde el medio se cambió a medio DME suplementado con suero fetal bovino deslipidizado al 10% e inactivado mediante calor a una concentración de 10^{-5} M. Después de la incubación durante 24 horas, la actividad SPAP y la actividad \beta-galactosidasa se midieron añadiendo directamente al medio 200 ml de mezcla sustrato (o-nitrofenil \beta-D-galactopiranosido (Sigma) 16 mM, difosfato de fluoresceína 120 mM (sondas moleculares), Tritón X-100 0,16%, dietanolamina 160 mM a pH = 9, NaCl 44,8 mM, y 0,8 mM de MgCl_{2}). Alternativamente, las actividades fosfatasa alcalina y \beta-galactosidasa se midieron por separado usando protocolos estándar. Brevemente, las células se lisaron añadiendo 25 ml de tritón X-100 al 0,5% al sobrenadante. Se añadieron 200 ml de reactivo sustrato de \beta-galactosidasa ((o-nitrofenil \beta-D-galactopiranosido 36 mM, MgCl_{2} 1,25 mM, NaCl 2,8 mM, \beta-mercaptoetanol 4,4 M) o 200 ml de reactivo sustrato de fosfatasa alcalina (p-nitrofenilfosfato 2,5 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, NaCl 28 mM, dietanolamina 1 M a pH 8,5) a 40 ml de lisado celular, y se incubaron durante 1 hora. La actividad alcalina fosfatasa se expresó como porcentaje máximo de inducción obtenido para el compuesto de referencia BRL49653, conforme a la actividad \beta-galactosidasa la cual sirvió como un patrón de control interno para eficiencia de transfección.

Referencias; véase, por ejemplo, Berger, J., y col., (1988), Gene 66, 1-10

Cada uno de los cinco ejemplos mostró un 50% de activación de hPPAR-alfa a concentraciones de 10^{-5} M o menos. Estos cinco ejemplos también activan selectivamente PPAR-alfa por encima de PPAR-gamma de forma que la relación de actividad, como se explica anteriormente en este documento, es al menos 10. Los ejemplos 1, 2 y 3 tuvieron relaciones de actividad mayores que 100.

Los siguientes datos de roedores se produjeron usando ejemplo 5. El propósito del experimento es demostrar que los activadores de PPAR-alfa son útiles para el tratamiento de la obesidad, y dislipidemia.

Modelo de dislipidemia inducido por la dieta

Ratas macho delgadas Zucker y ratas hembra fa/fa Zucker se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento. La aleatorización se basó en una concentración de triglicérido en suero después de tres meses con la dieta alta en grasas TEKLAD. Dosificar con el ejemplo 5 o el vehículo apropiado, mediante alimentación con sonda oral, comenzó después de 4 meses de alimentación alta en grasas. Se obtuvieron semanalmente glucosa en plasma, lactato, insulina en suero y concentraciones lipídicas, comenzando en el día 4 hasta el 48 después de la iniciación de la terapia. Los datos metabólicos de cada grupo de tratamiento se recogieron semanalmente. Las determinaciones de Dexascan de la composición de masa corporal obtenidas después de 4 meses de la dieta alta en grasas sirvieron de nivel basal. Los cambios en la composición de masa corporal debidos a terapia se determinaron repitiendo las medidas al final del estudio.

Tratamiento del grupo A Vehículo dosificado dos veces al día (aproximadamente a las 8 am y las 4 pm).

Tratamiento del grupo B Ejemplo 5 (0,1 mg/kg) dosificado dos veces al día.

Tratamiento del grupo C Ejemplo 5 (0,3 mg/kg) dosificado dos veces al día.

Los resultados se resumen en las dos tablas siguientes.

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Claims

1. Un compuesto de fórmula (1), o un éster o sal

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y R^{8} se selecciona del grupo constituido por

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en las que y es 0, 1, ó 2, cada alq es independientemente hidrógeno o grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, cada grupo R es independientemente hidrógeno, halógeno, ciano, -NO_{2}, fenilo, alquilo o fluoroalquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y el cual puede contener heteroátomos tales como nitrógeno, oxígeno, o azufre y el cual puede contener grupos funcionales tales como cetona o éster, cicloalquilo que contiene de 3 a 7 átomos de carbono, o dos grupos R unidos a átomos de carbono adyacentes pueden, junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos, formar un anillo alifático o aromático o un sistema multianillo, y donde cada anillo representado no tiene más de 3 grupos alquilo o grupos R que no son hidrógeno.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es un activador del receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es un activador selectivo del receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas.

4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que cada R^{6} y cada R^{8} no tiene más de 2 grupos R y no más de 2 grupos alq que sean distintos de hidrógeno.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que y es 0, m es de 0 a 6, y cada alq y cada grupo R es hidrógeno.

6. Los compuestos de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho compuesto es

o un éster, sal, o derivado fisiológicamente funcional de los mismos.

7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que dicho compuesto es

o un éster, sal, o derivado fisiológicamente funcional de los mismos.

8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para usar en terapia.

9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, factor de riesgo, o afección mediado por el receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la enfermedad, factor de riesgo, o afección es, o está asociado con, enfermedad de Alzheimer, obesidad, dislipidemia, aterosclerosis, o diabetes.

12. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de obesidad o dislipidemia.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho compuesto se coadministra con un ligando del receptor retinoide X.