ES2235239T3

ES2235239T3 - Combinacion de enzimas de proteasa acidas y tampones acidos y su uso.

Info

Publication number: ES2235239T3
Application number: ES97930044T
Authority: ES
Inventors: Scott J. Norton; Glen Gillis; Michael Bishop
Original assignee: Active Organics Inc
Current assignee: Lipotec USA Inc
Priority date: 1996-06-13
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2017-06-13
Also published as: US5976556A; PT921785E; EP1598057A1; WO1997047283A1; EP1598057B1; DE69731955D1; DK0921785T3; ATE552891T1; EP0921785A1; EP0921785A4; JP4681087B2; DE69731955T2; AU3396597A; KR20000016635A; JP2000512298A; US6569437B1; EP0921785B1; JP2007302680A; ES2383682T3; ATE284670T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA ENZIMA DE PROTEASA ACIDA Y UN TAMPON ACIDO, COMPRENDIENDO EL TAMPON ACIDO Y UN VEHICULO FARMACEUTICA O COSMETICAMENTE ACEPTABLE, SIENDO DICHAS COMPOSICIONES UTILES PARA TRATAR ESTADOS, ENFERMEDADES O TRASTORNOS DE LA PIEL.

Description

Combinación de enzimas proteasa ácidas y tampones ácidos y su uso.

1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para mejorar la textura o el aspecto de la piel con composiciones que comprenden al menos una enzima proteasa ácida y un tampón ácido, donde el tampón ácido comprende un ácido y un vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable según la reivindicación 1.

2. Antecedentes de la invención

Está bien fundado que la exfoliación de las capas epidérmicas de la piel humana induce un aumento de la velocidad de la renovación celular epidérmica (E. Phillips, 1995, patente de EE.UU. nº 5.431.913; W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109; 41-B), La epidermis humana está compuesta por múltiples capas de células epiteliales escamosas estratificadas en un estado constante de renovación. Las células nuevas se forman primero en la capa basal, que es la membrana más interna de la epidermis. Estas células se ven desplazadas por la producción de células todavía más nuevas y después se transportan hacia la capa externa de la epidermis, el estrato córneo, donde normalmente se eliminan (exfolian) cada dos a tres semanas. La salud y el aspecto general de la piel humana dependen en gran medida de la velocidad de este proceso.

Ciertas situaciones o trastornos, tal como el envejecimiento o la exposición al ambiente, pueden alterar este proceso normal y pueden conducir a una velocidad en general reducida de renovación celular (Van Scott y Yu, 1984, J. Am. Acad. Dermatol. 11: 867-79). Dado que el tiempo requerido para que una cape celular migre desde la capa basal hasta el estrato córneo aumenta con la edad del sujeto, la velocidad de renovación de las células epidérmicas disminuye. Se ha comunicado que en una persona normal de veinte años de edad, las células de las capas externas de la epidermis se recambian, de media, cada dos semanas, mientras que los intervalos de recambio celular de piel más madura pueden ser hasta de dos veces más prolongados (E. Phillips, 1995, patente de EE.U.U. nº 5.431.913). La disminución de la velocidad de renovación celular por el envejecimiento se puede ver agravada por condiciones ambientales tales como la exposición a la radiación solar u otras condiciones climáticas (K. E. Burke, 1990, Postgraduate Medicine 88 (1): 207-27). Una disminución en la velocidad de la renovación celular aumenta el tiempo durante el que las células de las capas externas de la piel están expuestas a las condiciones ambientales y pueden conducir a un mayor daño y/o a daño acumulado. En ciertos estudios se ha sugerido que una disminución en las velocidades de recambio de células epidérmicas se asocia con un incremento en la cohesión intercorneocitos (Van Scott y Yu, 1989, Cutis 43: 222-28).

Las células de la capa epidérmica se mantienen juntas mediante componentes proteináceos, tales como hemidesmosomas, desmosomas, uniones comunicantes, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y otros componentes presentes en la piel, todos los cuales poseen la capacidad de unirse entre sí y con los componentes celulares. Esta unión entre sí de las células epidérmicas se describe como "cohesión intercorneocitos" y el grado de la fuerza cohesiva implicada se ve afectado por factores tales como la hidratación y el pH. Un aumento de la cohesión intercorneocitos tiene como resultado la hiperqueratinización y se caracteriza por piel gruesa y a menudo seca o escamosa producida por la retención de células epidérmicas. El equilibrio que existe entre la cohesión y las velocidades de recambio celular es responsable del rejuvenecimiento normal de la piel joven y los desequilibrios de estos factores pueden tener como resultado el aspecto envejecido, áspero y poco atractivo de las superficies epidérmicas. La búsqueda de componentes tópicamente activos que equilibren las velocidades de renovación celular y la cohesión intercorneocitos es muy importante en los esfuerzos de investigación dermatológica hoy en día (Van Scott y Yu, 1984, J. Am. Acad. Dermatol. 11: 867-79).

Los recientes avances en este campo de investigación han proporcionado una serie de compuestos ácidos tópicamente activos que son prometedores a este respecto (Yu y col., 1978, patente de EE.UU. nº 4.105.783; Yu y col., 1982, patente de EE.UU. nº 4.363.815). Los tratamientos a largo plazo con estos compuestos ácidos tienen como resultado un aumento de la velocidad de la renovación de células epidérmicas. Se ha documentado bien la eficacia como agentes queratolíticos/de descamación de esos componentes ácidos de los que se sabe que son activos a nivel epidérmico, tales como hidroxi o cetoácidos de bajo peso molecular y sus ésteres. Se sabe que las concentraciones elevadas de estos ácidos (por ejemplo ácidos salicílico y glicólico), así como otros ácidos tales como ácido tricloroacético, poseen capacidad para destruir el tejido en el punto de aplicación (W. L. Epstein, 1990, en Irritant Contact Dermatitis, Jackson y Glodner, eds., Marcel Decker, Inc., Nueva York y Basel, páginas 127-165; Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Sixteenth Ed., Mack Publishing, Inc., Easton, PA. 1980). A concentraciones menores, se ha mostrado que estos ácidos poseen la capacidad para soltar las células muertas en el estrato córneo rico en queratina e interrumpir la cohesión intercorneocitos, con lo que facilitan la descamación; esta actividad se denomina "actividad queratolítica" (Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Sixteenth Ed., Mack Publishing, Inc., Easton, PA. 1980; W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Tolletries 109; 41-8).

La mayoría de los queratolíticos son irritantes cutáneos, incluidos los mencionados anteriormente. Aunque se ha comentado que algunos queratolíticos son más eficaces que otros, una comparación del índice terapéutico de cada uno de estos ácidos muestra poca ventaja de uno sobre otro. El "índice terapéutico" es un método exacto de clasificar la eficacia de estos componentes que tiene en cuenta la eficacia queratolítica del componente así como los niveles de irritación a una concentración dad. Se ha mostrado que incluso niveles bajos de estos componentes (concentración de ácido superior a 4%) producen una significativa irritación cutánea. El uso de niveles incluso menores de estos componentes reduce la irritación, aunque en general reduce la eficacia queratolítica. Además, el uso prolongado de los ácidos reduce la eficacia de la inducción de renovación celular (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41-8). Estos inconvenientes destacan la necesidad de una metodología para intensificar la eficacia queratolítica de estos ácidos a concentraciones no irritantes.

Durante algún tiempo se ha usado la aplicación de enzimas proteolíticas en el tratamiento tópico para, por ejemplo, la eliminación de cicatrices producidas por quemaduras y como complemento del tratamiento antimicrobiano (G. Rodeheaver, 1975, Am. J. Surg. 129 (5): 537-544). Estas enzimas incluyen aquéllas que en general están restringidas a fuentes vegetales, tales como de la papaya (papaína), del higo (ficina) y de la piña (bromelaína). Se han comercializado formulaciones cosméticas que contienen extractos de estas plantas y que se cree que son intensificadoras de la eliminación de las capas epidérmicas externas mediante acción proteolítica. Aunque la especificad del sustrato y el espectro de actividad en relación con el pH sugieren que la acción proteolítica de estas formulaciones debería tener como resultado actividad queratolítica en las capas epidérmicas externas, las aplicaciones de las enzimas proteolíticas previamente usadas en el tratamiento tópico no carecen de inconvenientes.

Esas enzimas (por ejemplo, papaína, bromelaína y ficina) que se usan en la actualidad en aplicaciones cosméticas en general exhiben actividad proteolítica en un amplio abanico de pH, de pH 3 a pH 9 (Glazer y Smith, 1971, en The Enzymes, Vol. 3, P. Boyer, ed., Academic Press, Nueva York, páginas 501-546). Es probable que este amplio abanico de pH de estas enzimas derivadas de plantas sea la causa de al menos algunos de los problemas asociados con la exposición prolongada de la piel. Los sistemas epidérmicos humanos mantienen un gradiente de pH en las capas estratificadas de la piel; se ha comunicado que las capas externas exhiben un pH medio de aproximadamente 5,5 (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Tolletries 109: 41-48). El pH de las capas sucesivas de la epidermis aumenta con la profundidad y alcanzan un pH final cercano al intervalo fisiológico (aproximadamente un pH de 7,4) en la capa dérmica. Dado que las enzimas derivadas de plantas mencionadas antes permanecen activas a lo largo de este gradiente de pH, no hay un control del pH sobre la actividad de estas enzimas vegetales cuando se aplican a la piel.

El grado de actividad terapéutica derivada de la aplicación tópica de las enzimas proteolíticas está gobernado por las características catalíticas intrínsecas de esas enzimas. El amplio intervalo de actividad proteolítica, en relación con el pH, exhibido por las proteasas mencionadas antes (pH 3-9= permite poco o ningún control sobre la actividad proteolítica por parte de la formulación del producto (Glazer y Smith, 1971, en The Enzymes, Vol. 3, P. Boyer, ed., Academic Press, Nueva York, páginas 501-546). Se sabe que las plantas de las que se han obtenido estas enzimas producen dermatitis de contacto irritante con síntomas entre los que se incluyen prurito, edema y formación de ampollas. Se ha postulado que estas enzimas son la principal causa de esos síntomas, posiblemente a causa de las disminuciones excesivas en la cohesión intercorneocitos (W. L. Epstein, 1990, en Irritant Contact Dermatitis, Jackson y Glodner, eds., Marcel Decker, Inc., Nueva York y Basel, páginas 127-165). Las enzimas que se usan en la actualidad en aplicaciones cosméticas pueden exhibir actividad proteolítica dependiente de sustrato en todas las capas de la epidermis. La proteolisis no controlada de las proteínas epidérmicas que sirven para estabilizar la cohesión intercorneocitos podría reducir esta cohesión intercorneocitos en exceso y producir la consiguiente irritación. El ataque proteolítico en la capa basal de la epidermis, donde se origina la renovación celular, podría causar desequilibrios en la velocidad de renovación de células epidérmicas. La formación de ampollas y el edema podrían ser el resultado del ataque proteolítico sin controlar por la acción de esta clase de enzimas en la membrana basal. Esta posibilidad se ve respaldada por el hecho de que se sabe que la inyección de estas enzimas vegetales en la piel de mamíferos produce edema en la piel (Morimoto y col., 1987, Ensho 7 (6): 563-567). Este hallazgo se ha usado para producir edema experimental en investigación dermatológica. Además, los síntomas de dermatitis de contacto irritante que se han enumerado antes son similares a los inducidos por las concentraciones más eficaces de componentes ácidos activos a nivel epidérmico que en la actualidad se usan en aplicaciones tópicas. Por tanto, un abordaje más controlado de la actividad proteolítica en relación con las aplicaciones tópicas debería producir un resultado deseable sin dar lugar a estos efectos secundarios.

Se han comunicado composiciones que contienen una enzima proteolítica, por ejemplo pepsina, y varios ácidos para la disolución de formaciones necróticas densas, formaciones que se ven, por ejemplo, en las quemaduras de tercer grado (patente de la Unión Soviética nº 439288, 2974). No hay indicación acerca de la utilidad de estas composiciones en la intensificación de la exfoliación epidérmicas o de que estas composiciones sean activas sólo durante periodos de tiempo limitados.

3. Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento cosmético según la reivindicación 1 para mejorar la textura y/o el aspecto de la piel. Las composiciones usadas comprenden al menos una proteasa ácida y un tampón ácido. Para los propósitos de esta invención, la proteasa ácida es una enzima que exhibe actividad peptidil hidrolasa (proteolítica) a un pH por debajo del pH medio de la superficie de la piel y es significativamente inactiva a un pH superior o igual al pH medio de la superficie de la piel, que es de aproximadamente 5,5 para seres humanos (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41-8). En varones, el pH medio de la superficie de la piel es de aproximadamente 5,3 y en mujeres es de aproximadamente pH 6 (Ohman y Vahiquist, 1994, Acta Dermato-Venereol. 74 (5): 375-379). Para los propósitos de esta invención, el pH medio de la superficie de la piel (que es un pH de aproximadamente 5,5) incluye, entre otros, variaciones específicas de sexo, de forma que un pH de aproximadamente 5,5 incluye un intervalo de un pH de aproximadamente 5,3, el pH medio de la superficie de la piel de un varón, hasta un pH de aproximadamente 6, el pH medio de la superficie de la piel de una mujer. Preferentemente, a un pH superior o igual al pH medio de la superficie de la piel (aproximadamente un pH de 5,3-6), las proteasas ácidas útiles en esta invención exhiben menos de aproximadamente un 10% de la actividad enzimática que exhiben a sus pH óptimos respectivos que están por debajo del pH medio de la superficie de la piel.

La proteasa ácida puede estar en forma apoenzima, holoenzima, isoenzima o zimógeno. La proteasa ácida componente de la composición puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 75% en peso de la composición final, preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50%, más preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%. La o las proteasas poseen una actividad específica de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 Unidades HUT/mg, según se ha determinado mediante el procedimiento descrito en Food Chemicals CODEX, 3ª ed., (1981), páginas 496-497, National Academy Press, Washington, D. C., modificado como se describe en la Sección 6.1, más adelante. Preferentemente, la o las proteasas poseen una actividad específica de aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 Unidades HUT/mg, más preferentemente de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 Unidades HUT/mg.

El tampón ácido es una composición que cuando se aplica tópicamente a la piel, reduce temporalmente el pH de la superficie de la piel hasta menos de aproximadamente un pH de 5,5, pero no inferior a un pH de aproximadamente 1, preferentemente a un pH de entre 2,5 y aproximadamente 4,5. La composición de tampón ácido comprende al menos un ácido y un transportador, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable. El componente ácido del tampón puede ser uno o más ácidos inorgánicos o uno o más ácidos orgánicos, o cualquier combinación de ácidos inorgánicos y/u orgánicos. El tampón ácido es susceptible de neutralización ha el pH medio de la superficie de la piel en el tiempo por procesos epidérmicos naturales, tales como la transpiración. El tiempo requerido para neutralizar el tampón ácido, y por tanto, inactivar la proteasa, dependerá de la formulación del tampón ácido. Por ejemplo, si el tampón ácido contiene un ácido débil o un agente de amortiguación débil para contrarrestar la alcalinidad relativa de la epidermis produce periodos de tiempo más cortos; si se usa un ácido más fuerte o se emplea un agente de amortiguación más fuerte en el tampón ácido se tiene como resultado periodos de tiempo más prolongado. El componente ácido del tampón puede ser uno o más ácidos inorgánicos o uno o más ácidos orgánicos, o cualquier combinación de ácidos inorgánicos y/u orgánicos y pueden estar presentes en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 95% en peso de la composición final, preferentemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 25%, más preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%.

El control del periodo de tiempo requerido para que el pH de la superficie de la piel retorne a un pH de aproximadamente 5,5 después de la aplicación tópica de una composición de la presente invención permite el control de la actividad de la enzima proteasa. Es a través de este control de la actividad proteolítica que la presente invención supera los inconvenientes y complicaciones que se encontraban en la técnica anterior, tales como el prurito, el ardor, la formación de ampollas, etc., causadas por las enzimas proteolíticas de amplio espectro de pH. El periodo de tiempo necesario para que el pH de la superficie de la piel regrese a un pH de aproximadamente 5,5 está determinado por una serie de factores, incluidos el tipo del trastorno, la enfermedad o la alteración cutáneos que se está tratando y la sensibilidad de la piel del sujeto determinado que se está tratando. Para evitar los inconvenientes y complicaciones encontrados en la técnica anterior, el periodo de tiempo ideal no debería superar aproximadamente 4 horas para ninguna aplicación individual de una composición de la presente invención, preferentemente el periodo de tiempo está entre de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 4 horas, más preferentemente de entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas, más preferentemente de entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente una hora.

Además se debe destacar que las composiciones cosméticas de la presente invención son tales que, cuando se administran a la piel, mejoran la textura o el aspecto de la misma o aumentan la exfoliación epidérmica y/o la renovación de las células epidérmicas, sin producir necesariamente un beneficio o un efecto del tratar o impedir un trastorno, enfermedad o alteración biológica anómala. En este contexto, se pretende que la mejora de la textura o el aspecto de la piel o la intensificación de la exfoliación epidérmica y/o la renovación de células epidérmicas abarque proporcionar a la piel una superficie de aspecto natural y/o de sensación natural de forma que aumente la belleza y/o la suavidad de la piel con respecto a su estado previo al tratamiento.

En una forma de realización preferida para intensificar la exfoliación epidérmica y/o la renovación de células epidérmicas, la composición comprende pepsina y ácido láctico. En esta forma de realización preferida para intensificar la exfoliación epidérmica y/o la renovación celular, la composición comprende aproximadamente un 1% en peso de pepsina con una actividad específica de aproximadamente 1000 Unidades HUT/mg y aproximadamente un 1,5% en peso de ácido láctico. En otra forma de realización preferida más, la composición comprende un 1% en peso de pepsina y un 1% en peso de ácido fosfórico. En otra forma de realización, la composición comprende un 1% en peso de pepsina y un 3% en peso de ácido fosfórico. En otra forma de realización más, la composición comprende un 1% en peso de pepsina y un 1% en peso de ácido cítrico. En otra forma de realización, la composición comprende un 1% en peso de pepsina y un 3% en peso de ácido cítrico.

Sorprendentemente, se ha demostrado que las composiciones y procedimientos de la presente invención poseen efectos cosméticos contra alteraciones cutáneas que hasta ahora no se han conseguido con ácidos, ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos, ácidos salicílicos o proteasas de amplio espectro de pH por sí solos.

3.1. Definiciones

Como se usa en la presente invención, con los siguientes términos se pretende abarcar:

Tampón ácido:: Una composición que comprende un ácido y un transportador, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente activo que cuando se aplica por vía tópica a la piel reduce el pH de la superficie de la piel por debajo de aproximadamente un pH de 5,5 y está sujeta a la neutralización por los procesos cutáneos naturales de forma que los procesos cutáneos naturales, con el tiempo, devuelven el pH de la superficie de la piel a su valor normal (que es de aproximadamente pH 5,5). El componente ácido del tampón puede ser uno o más ácidos inorgánicos o uno o más ácidos orgánicos o cualquier combinación de ácidos inorgánicos y/u orgánicos.

Proteasa ácida:: Una enzima que exhibe actividad peptidil hidrolasa (proteolítica) aun pH por debajo del pH medio normal de la superficie de la piel, que es de aproximadamente pH 5,5 y que es activo de un modo insignificante a un pH mayor que o igual a tal pH medio normal de la superficie de la piel, es decir, una actividad menor de alrededor del 10% a un pH de aproximadamente 5,5 o mayor en comparación con la actividad máxima a pH inferior a aproximadamente 5,5. La proteasa ácida puede estar en forma de apoenzima, holoenzima, isoenzima o zimógeno.

Cosmética:: Una formulación para administrar a la piel, que mejora la textura o el aspecto de la misma sin que necesariamente proporciona un beneficio o un efecto de tratar o prevenir un trastorno o una enfermedad biológica anómala. Tal mejora incluye proporcionar un efecto hidratante temporal a la epidermis de mamífero.

Cantidad eficaz:: Una cantidad de la composición bastante como para inducir significativamente una modificación positiva del trastorno que se va a tratar, pero lo bastante baja como para evitar la aparición de efectos secundarios graves. La cantidad eficaz de la composición variará con el trastorno concreto que se esté tratando, la edad y el estado físico del sujeto que se esté tratando, la gravedad del trastorno, la duración del tratamiento con la composición específica empleada, el transportador cosméticamente aceptable concreto utilizado y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia de los expertos en la técnica.

Renovación celular epidérmica:: Proceso por el cual se formas nuevas células cutáneas en la capa basal, se transportan a la capa externa, el estrato córneo, y después se exfolian y sustituyen por nuevas células cutáneas.

Exfoliación:: La separación y eliminación de las células superficiales de un epitelio o de cualquier superficie tisular.

Atrofia cutánea reguladora:: La evitación, retraso, detención, tratamiento o inversión del proceso de la atrofia en la piel de mamíferos.

Atrofia cutánea:: El adelgazamiento y/o degradación general de la capa de la dermis de la piel de mamíferos que se caracteriza por una disminución de los niveles de colágeno y/o elastina así como por una disminución del número, el tamaño y el potencial de multiplicación de las células fibroblastos. La atrofia cutánea es un resultado natural del proceso de envejecimiento, aunque puede deberse a factores intrínsecos o extrínsecos tales como el envejecimiento cronológico natural, el daño producido por la luz, las quemaduras o el daño producido por productos químicos, o a la exposición a contaminantes o alergenos, por ejemplo el humo de tabaco. La atrofia cutánea a menudo es un efecto secundario indeseable que resulta del tratamiento con ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos o ácidos salicílicos.

La presente invención puede entenderse más completamente mediante referencias a la descripción detallada y los ejemplos ilustrativos con los que se pretende ilustrar las formas de realización no limitantes de la invención.

4. Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama de barras que demuestra el efecto de la velocidad de la renovación celular con diferentes concentraciones de una proteasa ácida (Unidades HUT x 10^{6}/g) (pepsina) con dos cantidades distintas de un tampón ácido (ácido láctico). \blacksquare 1,5% de ácido láctico, \square 3% de ácido láctico.

La figura 2 es un diagrama de barras que demuestra los incrementos porcentuales en las velocidades de exfoliación/renovación celular dadas por varias concentraciones de una proteasa ácida (Unidades HUT x 10^{6}/g) (pepsina) con respecto a las de un tampón ácido solo (ácido láctico) a concentraciones de 1,5% y 3%. \blacksquare 1,5% de ácido láctico, \square 3% de ácido láctico.

La figura 3 es un diagrama de barras que demuestra la diferencia en la actividad de la pepsina y la AFP2000, Solvay, Inc., Elkhart IN, una proteasa ácida derivada de hongos, a varios niveles de pH en el ensayo HUT. \blacksquare AFP 2000, \square pepsina.

5. Descripción detallada de la invención 5.1. Composiciones

La presente invención proporciona nuevas composiciones para mejorar la textura o el aspecto de la piel y/o para intensificar la exfoliación epidérmica, y/o para intensificar la renovación celular epidérmica. Las composiciones comprenden al menos una proteasa ácida y un tampón ácido. Tales composiciones se administran preferentemente por vía tópica, para minimizar los efectos sistémicos o los efectos secundarios indeseables. El inventor no desea limitarse a un modo específico de acción; sin embargo, el inventor cree que con las composiciones de la presente invención alcanzan se llevan a cabo los procedimientos de la presente invención mediante, en primer lugar, la reducción del pH de la superficie de la piel hasta un valor inferior al pH medio de la piel, que es de aproximadamente 5,5 en los seres humanos. La reducción del pH permite la activación del componente proteasa ácida de la composición, que exhibe actividad proteolítica/queratolítica durante el tiempo en el que el pH de la superficie de la piel está por debajo de aproximadamente 5,5. Este periodo de tiempo depende de las condiciones del pH de la piel del individuo y puede regularse mediante la formulación del componente de tampón ácido. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica ajustar la formulación para variar el periodo de tiempo y conseguir el resultado deseado.

Durante este periodo de tiempo, los procesos epidérmicos, por ejemplo la transpiración, neutralizan el tampón ácido de forma que el pH de la superficie de la piel retorna a su valor normal, un pH medio de aproximadamente 5,5. Por tanto, el incremento del pH inactiva la proteasa ácida y la actividad proteolítica/queratolítica cesa, es decir, disminuye en aproximadamente un 90%. El periodo de tiempo durante el cual el pH de la superficie de la piel está por debajo de aproximadamente 5,5 y durante el cual el componente proteasa está activo, es de entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 4 horas, preferentemente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas, más preferentemente de entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora.

Para los propósitos de esta invención, la proteasa ácida es una enzima que exhibe una significativa actividad peptidil hidrolasa (proteolítica) a un pH por debajo de aproximadamente 5,5, que es el pH medio normal de la superficie de la piel, y que está inactiva de forma significativa a un pH de aproximadamente 5,5 o mayor. En varones, el pH medio de la superficie de la piel es de aproximadamente 5,3 y para mujeres es de aproximadamente pH 6. Para los propósitos de esta invención, el pH medio de la superficie de la piel, que es de aproximadamente 5,5, incluye, además de otros, variaciones específicas de sexo, de forma que un pH de aproximadamente 5,5 incluye un intervalo desde aproximadamente pH 5,3, el pH medio de la superficie de la piel de un varón, hasta aproximadamente un pH de 6, el pH medio de la superficie de la piel de una mujer. La proteasa está significativamente inactiva cuando su actividad es igual o inferior al 10% de la actividad en comparación, por ejemplo, con su actividad poco después se su aplicación a la piel, medida mediante la prueba con cloruro de dansilo que se describe en la sección 6.1. Las proteasas ácidas útiles en la presente invención son aquéllas que, en un ensayo in vitro a pH de aproximadamente 5,5 y mayores, exhiben menos de aproximadamente el 10% de la actividad enzimática medida en el mismo ensayo in vitro al pH óptimo (menor de aproximadamente pH 5,5) de la proteasa concreta. Véase, por ejemplo, la sección 6.4, más adelante.

La proteasa ácida puede estar en forma de apoenzima, holoenzima, isoenzima o zimógeno. Además, las proteasas ácidas se pueden aislar de cualquier fuente conocida para el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, bacterias, hongos, células de cultivo celular y animales. La preparación de proteasa ácida puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 75% en peso de la composición final, preferentemente aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50% y más preferentemente aproximadamente 1% a aproximadamente 5%. La o las proteasas poseerán una actividad específica de aproximadamente 1 a aproximadamente 6000 Unidades HUT/mg, preferentemente de aproximadamente 59 a aproximadamente 3000 Unidades HUT/mg y más preferentemente de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 Unidades HUT/mg, según se determina mediante el procedimiento descrito en Food Chemicals CODEX, 3ª ed., (1981), páginas 496-497, National Academy Press. Washington, DC, modificado como se describe más adelante.

Brevemente, en primer lugar se preparan las siguientes soluciones madre: SUSTRATO HEMOGLOBINA, se prepara mezclando 2 g de hemoglobina bovina en 80 ml de agua destilada. A continuación la solución se titula hasta un pH 2 mediante la adición de, por ejemplo, ácido fosfórico y/o ácido cítrico y se añade agua destilada adicional hasta un volumen total de 100 ml. Esta solución se separa en cuatro porciones iguales y cada porción se titula hasta el pH deseado con hidróxido sódico al 50% o ácido clorhídrico al 50%. A continuación, estas soluciones finales se calientan a 30ºC durante 20 minutos y después se filtran a través de lana de vidrio. TCA STOCK se prepara mediante la disolución de ácido tricloroacético en agua destilada hasta una concentración final de TCA al 5% (p/v).

A continuación, para cada muestra en la que se tiene que medir la actividad proteolítica, se preparan tubos marcados como "B" y "T". En cada tubo se introducen 4 ml de la solución de hemoglobina y se colocan a 37ºC, de forma que la muestra se calienta previamente hasta 37ºC. En el tubo "T" se añaden 100 \mug de la solución enzimática, se agita suavemente y se incuba a 37ºC durante 20 minutos. Después, a cada tubo se añaden 10 ml de la solución madre de TCA. Se añade al tubo marcado como "B" una cantidad igual de la enzima, como la que se ha añadido antes al tubo "T", que es el control para la absorbancia de fondo. Se centrifuga cada tubo y cada muestra se filtra a través de un filtro de jeringa y coloca la muestra filtrada en una cubeta de cuarzo para leer la absorbancia a 280 nm. La absorbancia real se determina restando la absorbancia de la muestra "T" de la de fondo. Se puede generar una curva estándar mediante la medición de cantidades conocidas de actividad proteasa.

Se define una unidad HUT de actividad proteolítica como la cantidad de enzima que produce, en un minuto en las condiciones especificadas del ensayo, un hidrolizado cuya absorbancia a 280 nm es la misma que la de una solución que contiene 1,10 \mug por ml de tirosina en ácido clorhídrico 0,006N. Las unidades HUT por gramo se determinan mediante la siguiente fórmula:

HUT/g= (absorbancia a 280 nm x V)/(0,0084 x T x W)

donde V es el volumen final de la solución de prueba, T es el tiempo de reacción en minutos y W es el peso seco de la muestra de enzima original usada en el ensayo en gramos. La concentración de proteína se determina mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, el Ensayo Bradford, que se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994.

Entre los ejemplos de tales proteasas se incluyen, aunque no se limita a ellos, pepsina, catepsina, proteasa ácida urinaria humana, proteasas fúngicas derivadas de Neurospora oryzae, Mucor pusillis, Mucor miehei, Rhizopus chinensis o Endothia pasasilica, proteasas bacterianas rizopuspepsina, penicilopepsina y endotalepsina. Además, las proteasas pueden derivar de procedimientos que implican procedimientos y técnicas de ingeniería genética, ya sea con células embrionarias, maduras o inducidas y productos que incluyan segmentos de ADN, plásmidos, vectores, o expresión de los mismos, o células transformadas, o cultivos puros. Debería entenderse que se pueden usar dos o más proteasas ácidas en combinación de forma que la cantidad combinada en porcentaje de peso está dentro de los intervalos mencionados antes.

El tampón ácido es una composición que cuando se aplica por vía tópica a la piel reduce temporalmente el pH de la superficie de la piel a un pH menor de aproximadamente 5,5. pero no inferior a aproximadamente 1, preferentemente a un pH de aproximadamente 2,5 a un pH de aproximadamente 4,5. La composición de tampón ácido comprende al menos un ácido y un transportador, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable. El componente ácido del tampón es susceptible de neutralización hasta el pH medio normal de la superficie de la piel en el tiempo por la acción de los procesos epidérmicos naturales, por ejemplo por la transpiración. El tiempo requerido para neutralizar el tampón ácido y, por tanto inactivar la proteasa, depende de la formulación del tampón ácido. Por ejemplo, si el ácido y/o agente de amortiguación en el tampón ácido son débiles con respecto a la capacidad neutralizante de la epidermis se tienen como resultado periodos de tiempo más cortos; si se usa un ácido más fuerte o en el tampón ácido se emplea un agente de amortiguación más fuerte se tienen como resultado periodos de tiempo más largos.

El componente ácido del tampón ácido de la composición puede ser uno o más ácidos orgánicos o uno o más ácidos inorgánicos o cualquier combinación de ácidos inorgánicos y/u orgánicos y puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 95% en peso de la composición final, preferentemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 25%, más preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%. El porcentaje en peso del componente ácido dependerá de la intensidad ácida y la molaridad. Además, la cantidad e intensidad del componente ácido de la composición debería ser tal que se produzcan niveles eficaces de actividad proteolítica/queratolítica pero no niveles significativos de irritación cutánea. Además, el componente ácido del tampón ácido puede o no comprender un ácido del que no se haya mostrado que exhiba ninguna actividad queratolítica sino que simplemente proporcione un entorno ácido para la activación de la proteasa. Entre los ejemplos de tales ácidos se incluyen cualquier molécula que pueda manipularse en cualquier composición para tamponar el pH de la epidermis a un pH variable de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 7, incluidos, aunque no limitados a ellos, ácido láctico, ácido sórbico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido glicólico, ácido málico, ácido glucónico, ácido pirofosfórico, ácido trifosfórico, ácido polifosfórico, bisulfato sódico y bisulfato potásico. Debería entenderse que se pueden usar dos o más ácidos en combinación de forma que la cantidad combinada en porcentaje en peso está dentro de los intervalos mencionados anteriormente.

El tampón ácido también contiene un componente que es un transportador, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen bien ejemplos de tales transportadores, vehículos o excipientes farmacéutica o cosméticamente aceptables y se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Eighteen Edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1990. Los expertos en la técnica conocen bien ejemplos de tales transportadores, vehículos o excipientes farmacéutica o cosméticamente aceptables y se pueden encontrar en, por ejemplo, CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, cuarta edición, J. M. Nikitakis, Ed., The Cosmetic, Tolletry and Fragrance Association, Washington D.C., 1991.

Con las composiciones de la presente invención se quieren para aplicación tópica y pueden contener ingredientes transportadores, excipientes o vehículos tales como, por ejemplo, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, isopropil miristato, aceite mineral y mezclas de los mismos, para formar lociones, tinturas, cremas, emulsiones, geles o ungüentos, que son inocuos y farmacéutica, cosmética o dermatológicamente aceptables. Además, si se desea, a las presentes composiciones se pueden añadir hidratantes o humectantes. Ejemplos de tales ingredientes adicionales útiles para composiciones cosméticas se pueden encontrar en CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, cuarta edición, J. M. Nikitakis, Ed., The Cosmetic, Tolletry and Fragrance Association, Washington D.C., 1991.

El control del periodo de tiempo requerido para que el pH de la superficie de la pile vuelva a un pH normal de aproximadamente 5,5 después de la aplicación tópica de una composición de la presente invención permite el control de la actividad de la enzima proteasa. Es a través de este control de la actividad proteolítica mediante el cual la presente invención supera los inconvenientes y complicaciones de la técnica anterior, tales como el prurito, el ardor, la formación de ampollas y otros efectos secundarios indeseables causados por enzimas proteolíticas de amplio espectro de pH. La determinación del periodo de tiempo necesario para que el pH de la piel retorne a un pH normal de aproximadamente 5,5 se determina mediante una serie de factores, incluidos el tipo del trastorno, la enfermedad o la alteración cutánea que se está tratando, el tipo de piel y su localización en el cuerpo y la sensibilidad de la piel del sujeto concreto que se está tratando. Para evitar los inconvenientes y las complicaciones que se encuentran en la técnica anterior, el periodo de tiempo ideal no debería superar aproximadamente 4 horas para cualquier aplicación individual de una composición de la presente invención. El límite de tiempo dependerá de una serie de factores, tales como el propósito de la aplicación, por ejemplo, el mantenimiento diario, la eliminación de la piel seca áspera. Entre otros factores se incluyen el tipo de piel, si es sensible, normal o poco sensible, y el modo de aplicación, por ejemplo una única aplicación, o un lavado continuo o la extensión de una crema o loción. Otro factor es la o las proteasas específicas usadas en el componente de proteasa ácida porque la actividad proteasa es dependiente de sustrato.

5.2. Procedimientos de uso de las composiciones de la presente invención

La presente invención proporciona procedimientos para mejorar la textura y/o el aspecto de la piel. Tales procedimientos comprenden administrar en un área de la piel de un sujeto una cantidad eficaz de una composición de la presente invención, que comprende una enzima proteasa ácida que exhibe actividad proteolítica a un pH por debajo de aproximadamente 5,5 y una actividad insignificante a un pH de o por encima de aproximadamente 5,5 y un tampón ácido que reduce el pH de la superficie de la piel a un pH por debajo de aproximadamente 5,5 durante un periodo de tiempo eficaz para mejorar la textura y/o el aspecto de la piel, estando el tampón ácido sujeto a neutralización por la acción de los procesos epidérmicos naturales.

El procedimiento de administrar una cantidad eficaz de una composición de la presente invención sobre un área de piel es a través de la aplicación tópica. La cantidad del tampón ácido y de proteasa ácida en la composición final y la frecuencia de la aplicación total a la piel pueden variar ampliamente, depende de factores tales como el trastorno cutáneo concreto, la gravedad del trastorno cutáneo, la localización y/o el tipo de piel implicada, la sensibilidad de la piel del sujeto y el grado de tratamiento deseado. Está bien dentro del alcance del experto en la técnica la regulación de las dosis de acuerdo con la necesidad del sujeto. Se ha sugerido como ejemplo que la aplicación tópica varía desde una vez a la semana hasta aproximadamente 4 ó 5 veces al día, preferentemente de aproximadamente 3 veces a la semana a aproximadamente 3 veces al día, más preferentemente de aproximadamente una o dos veces al día. La composición final para la aplicación tópica comprenderá de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 95%, preferentemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 25%, más preferentemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% del componente ácido. La composición final para aplicación tópica comprenderá de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 75%, preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50%, más preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% del componente proteasa ácida. Otro modo preferido de administración es la administración crónica. La administración "crónica", como se usa en la presente memoria descriptiva, significa que el periodo de aplicación tópica puede ser durante la vida del sujeto, preferentemente durante un periodo de al menos aproximadamente un mes, más preferentemente de aproximadamente tres meses a aproximadamente veinte años, más preferentemente de aproximadamente seis meses a aproximadamente diez años, todavía más preferentemente de aproximadamente un año a aproximadamente cinco años, lo que tiene como resultado la mejora de la textura o el aspecto de la piel o la intensificación de la exfoliación epidérmica y/o la renovación de las células epidérmicas o la regulación de los efectos de la atrofia cutánea.

En otra forma de realización de la invención, los procedimientos descritos antes implican la administración a la piel de forma simultánea de una cantidad eficaz de la composición que comprende un tampón ácido y una proteasa ácida y una cantidad eficaz de uno o más agentes de pantalla solar, un agente antioxidante/secuestrante de radicales, un agente quelante, un retinoide, un material de autobronceado y/o un derivado de benzofurano. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "aplicación simultánea" o "simultáneamente" significa administrar los agentes a la piel en el mismo punto del cuerpo a aproximadamente la misma hora, Aunque esto se puede conseguir mediante la administración de los agentes a la piel por separado, el procedimiento preferido es administrar a la piel una composición que comprenda todos los agentes deseados. La cantidad de agente pantalla solar administrada en general varía de aproximadamente 0,02 mg a aproximadamente 1 mg por cm^{2} de piel.

La cantidad de agente quelante administrado en general varía de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente
1 mg, preferentemente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,5 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 0,1 mg por cm^{2} de piel. La cantidad de retinoide administrado en general varía de aproximadamente 0,00001 mg a aproximadamente 0,02 mg por cm^{2} de piel. La cantidad de derivado de benzofurano administrado en general varía de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1 mg por cm^{2} de piel por aplicación, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mg/cm^{2} de piel por aplicación. La cantidad de la composición que comprende un tampón ácido y una proteasa ácida administradas en general varía de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1 mg por cm^{2} de piel por aplicación, preferentemente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,5 mg por cm^{2}, más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 0,25 mg/cm^{2} por aplicación, en función de la gravedad del trastorno que se va a tratar, la sensibilidad de la piel del sujeto, la localización del sitio de tratamiento en el sujeto y la eficacia de los compuestos empleados.

6. Ejemplos

Con el fin de ilustrar de un modo más completo la naturaleza de la invención y la forma de practicar la misma se proporcionan los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes del resto de la descripción o del alcance de la invención de ninguna manera.

En las composiciones y procedimientos descritos en la Sección 8.1. a 6.4. se usaron los siguientes reactivos:

AFP 2000, una proteasa ácida derivada de hongos, Solvay Inc., Elkhart IN; extracto de algas/extracto de aloe, Active Organics, Inc., Dallas TX; alantoína, Sutton Laboratories, Chatham NJ; Arlacel 65, Tensioactivos ICI, Wilmington DE; ácido aspártico, Ajinomoto USA, Inc., Teaneck NJ; BHT, Eastman Kodak, Co., Rochester NY; butilenglicol,
Hoechst Celanese, Co., Charlotte NC; Carbomer, B. F. Goodrich, Co., Brecksville OH; alcohol cetearílico, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; alcohol cetílico, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; ácido cítrico, Roche Vitamins y Fine Chemicals, Nutley NJ; Cosmow-ax, Croda Chemicals, Ltd., Parsippany NJ; ciclometicona, Dow Chemicals USA, Midland MI; dihidroxiacetona, Rona/E. Merck Industries, Hawthorne NY; dimeticona, Dow Chemicals USA, Midland MI; EDTA disódico, Ciba-Geigy Co., Greensboro NC; DL-pantenol, Vitamins y Fine Chemicals, Nutley NJ; etoxidiglicol, Gattefosse S. A., París, Francia; ácido glucónico, Sigma Chemicals, San Louis MO; Glycereth-26, Amerchol Co., Edison NJ; estearato de glicerol, Croda Chemicals, Ltd., Parsippany NJ; ácido láctico USP 88%, Rita Corporation, Woodstock IL; lecitina/ácido aslático, Active Organics, Dallas TX; metil gluceth-20, Amerchol Co., Edison NJ; metilparabeno, Napp Co., Lodi NJ; palmitato de octilo, ICI Surfactants, Wilmington DE; neopentanoato de octildodecilo, ICI Surfactants, Wilmington DE; PEG-75, Lipo Laboratories, Inc., Omaha NE; ácido fosfórico al 85%, Sigma Chemicals, Inc., San Louis MO; polacrilamida/C13-14 isoparafina/laureth-7, Seppic, Co., París, Francia; propilenglicol, Dow Chemicals USA, Midland MI; propilparabeno, Napp Co., Lodi NJ; retinil palmitato, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; ácido salicílico, Kalama Co., Seattle WA; carboximetilcelulosa sódica 7 HXF, Aqualon, Co., Wilmington DE; hialuronato sódico, Active Organics, Dallas TX; esteareth-10, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; acetato de tocoferilo, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; trietanolamina al 98%, BASF Co., Mount Olive NJ y goma xantán, Kelco, San Diego, CA.

6.1. Intensificación de la exfoliación cutánea

Una composición de la presente invención se probó a concentraciones diferentes de la proteasa ácida pepsina,
1: 15.000 NF, American Laboratories, Inc., Omaha, NE, y el ácido láctico del tampón ácido en los antebrazos volar humanos para la intensificación de la exfoliación cutánea y la renovación celular. Se seleccionaron veinte sujetos de edades entre 30 y 50 años y se requirió que detuvieran el uso de cualquier producto en su antebrazo volar, a excepción de los suministrados junto con el procedimiento de prueba (que incluía un jabón sintético) durante 5 días antes y durante el periodo de prueba. Ninguno de los sujetos: (1) estaba embarazada o en periodo de lactancia o con intención de quedarse embarazada durante los tres meses posteriores a la prueba; (2) presentaba una o más enfermedades transmisibles conocidas; (3) estaba participando en otros estudio clínico en el momento de la prueba; (4) padecía psoriasis, dermatitis y/o eccema; (5) estaba tomando un medicamento que es probable que interfiera con los resultados de la prueba, incluidos retinoides, corticosteroides o antibióticos; (6) había tomado retinoides, corticosteroides o antibióticos durante los seis meses anteriores a la prueba y/o (7) había usado productos con tabaco, tenía una piel sensible, presentaba un tipo de piel que se consideró inadecuada para la prueba o presentaba otras características que se considera que es probable que les conviertan inadecuados para la prueba.

En cada antebrazo volar de cada uno de los sujetos se aplicaron parches de cuatro apósitos adhesivos de 2 x 3 cm, a los que se habían aplicado 1-2 g/cm^{2} de cloruro de dansilo al 5% ultrapuro molido en vaselina. Tres de los apósitos de cada antebrazo se usaron como puntos de prueba y el restante se usó como control.

Los cuatro puntos de cada antebrazo de cada sujeto se cubrieron con los apósitos cargados con cloruro de dansilo y se dejaron sin tocar durante 24 horas. Al final del periodo de 24 horas se eliminaron los apósitos, los puntos se lavaron y se confirmó el marcaje con cloruro de dansilo mediante la visualización de una fuente de luz UV de onda larga. Los seis puntos de prueba que no son controles marcados con cloruro de dansilo en cada sujeto recibieron aplicaciones tópicas dos veces al día de 1-2 ml/cm^{2} de una selección aleatorizada de composiciones de prueba descritas en la Tabla I. Tras la aplicación, las composiciones de prueba se frotaron en la piel en los puntos de prueba hasta que los puntos ya no estaban mojados. Después de verificar el marcaje con cloruro de dansilo, los puntos de prueba y los puntos control se dejaron sin cubrir y se trataron del mismo modo, a excepción de que los puntos de prueba recibieron las aplicaciones de prueba y los puntos control no recibieron ninguna composición de prueba.

TABLA I

1

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La exfoliación/queratolisis del estrato córneo se determinó mediante la visualización del marcaje con cloruro de dansilo diariamente bajo una fuente de luz UV de onda larga para medir la eliminación del marcaje. El incremento porcentual de la exfoliación/queratolisis y la renovación celular acompañante del estrato córneo se calculó mediante la siguiente fórmula:

% incremento= \frac{\text{(días para la eliminación del área sin tratar-días para la eliminación del área tratada)}}{\text{días para la eliminación del área sin tratar}} \times 100

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II

2

Los datos recogidos de la prueba se resumen en la Tabla II y en las figuras 1 y 2. Como se puede observar en la Tabla II, columna 5, el ácido láctico tampón ácido poseía algunos efectos positivos queratolíticos/de renovación celular solo [comparar las composiciones de prueba 2 y 8 con la control (composición de prueba 1)] a concentraciones de 1,5% y 3% en peso. Estos efectos positivos queratolíticos/de renovación celular se intensifican de forma significativa en presencia de la proteasa ácida pepsina, (véase las composiciones de prueba 3-7 y 9-13). También es evidente que las intensificaciones dependen de la dosis, es decir, las velocidades de exfoliación/renovación celular en el estrato córneo aumentan a medida que la concentración de la proteasa ácida aumenta, véase la columna 5 de la Tabla II. La figura 1 presenta gráficamente los datos en la columna 5.

La columna 6 de la Tabla II refleja el incremento porcentual de las velocidades de exfoliación/renovación celular dadas por varias concentraciones de la proteasa ácida pepsina sobre la dada por el ácido láctico solo a 1,5% y 3% de concentración en peso. Los datos de la columna 6 se presentan gráficamente en la Figura 2. Es evidente que, aunque el efecto de la proteasa ácida es significativo a ambas concentraciones de ácido láctico empleadas, las mayores intensificaciones porcentuales se dan con la proteasa ácida pepsina a una concentración de ácido láctico de 1,5% en peso.

En la piel de algunos de los sujetos de prueba se observó un bajo nivel de enrojecimiento y tumefacción, en aproximadamente al 75% de los puntos de prueba en la piel a una concentración de ácido láctico del 3% en peso, aunque se observó muy poco a una concentración de ácido láctico de 1,5% en peso. Además, este hallazgo era independiente en gran medida de la presencia de pepsina. Por tanto, se consiguió una exfoliación/renovación celular significativa mediante el uso de un tampón ácido a un nivel bajo no irritante en presencia de una concentración adecuada de una proteasa ácida. En contraste con las proteasas que son activas al intervalo de pH fisiológico, las proteasas ácidas, como se han definido en la presente memoria descriptiva, aplicadas a la piel mantienen su actividad proteolítica sólo hasta que los propios procesos naturales de la piel eleven el pH de la superficie de la piel a su valor normal de aproximadamente 5,5.

6.2. Composiciones para usar en los procedimientos de la presente invención

Las siguientes tablas citan formulaciones de diferentes ejemplos de composiciones de la presente invención. Todas las siguientes composiciones se ajustaron a un pH de aproximadamente 3 a 32 con, por ejemplo, ácido fosfórico diluido o hidróxido sódico, NaOH.

TABLA III

3

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TABLA IV

4

TABLA V

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5

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TABLA VI

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6

TABLA VII

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7

TABLA VIII

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8

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TABLA IX

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9

TABLA X

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10

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6.3. Composición de estabilización

La siguiente composición a pH 9 retiene al menos el 90% de su actividad de proteasa ácida en un periodo de al menos tres meses, durante los cuales la composición se almacenó a 37ºC.

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11

12

6.4. Actividad proteolítica a niveles variables de pH

Se probaron dos enzimas proteasa ácida en un intervalo de valores de pH para determinar si poseían actividad proteolítica a un pH inferior a aproximadamente 5,5 y si la actividad disminuía a menos de aproximadamente el 10% en comparación con su actividad al pH óptimo. La actividad proteolítica se midió mediante la determinación del efecto proteolítico sobre la hemoglobina usando el ensayo HUT como se describe más adelante. Las dos proteasas ácidas fueron pepsina 1: 15.000 NF, a aproximadamente 1000 Unidades HUT/mg, suministrada por American Laboratories, Inc., Omaha NE, y AFP 2000, una proteasa ácida derivada de hongos suministrada por Solvay, Inc., Elkhart IN, a aproximadamente 100 Unidades HUT/mg. El ensayo se llevó a cabo en primer lugar preparando soluciones madre de SUSTRATO HEMOGLOBINA y TCA STOCK. El sustrato hemoglobina se preparó mediante la disolución de 2 g de hemoglobina bovina, Sigma Chemicals, Inc., San Louis MO, en 80 ml de agua destilada. Esta solución se tituló después hasta el pH correcto, bien a pH 2, 3,6, 5,5 ó 6. Para valores de pH entre 1 y 3, se disolvieron 1,8 g de ácido fosfórico hasta una concentración final de 100 mM y el pH se ajustó con hidróxido sódico al 50% o ácido clorhídrico al 50%. Para valores de pH entre 3 y 6, se disolvieron 2 g de ácido cítrico hasta una concentración final de 100 mM y el pH se ajustó con hidróxido sódico al 50% o ácido clorhídrico. Las soluciones se llevaron hasta un volumen final de 100 ml mediante la adición de agua destilada, Los sustratos con diferentes valores de pH se incubaron a 30ºC durante 20 minutos y después se filtraron a través de lana de vidrio. La solución de TCA STOCK se preparó mediante la disolución de 5 g de ácido tricloroacético en 100 ml de agua destilada.

A continuación se prepararon estándar enzimáticos mediante la disolución de 10 mg de pepsina en 10 ml de agua destilada y mediante la disolución de 100 mg de AFP 2000 y 300 mg de ácido cítrico en 8 ml de agua destilada. Esta solución se ajustó después a un pH de aproximadamente 3,5 con HCl 6M de hidróxido sódico al 50% y el volumen final se llevó hasta 10 ml mediante la adición de agua destilada.

Para cada una de las muestras se marcaron cuatro tubos como "B", "T1", "T2" y "T3" y a cada tubo se añadieron 4 ml de la solución de sustrato hemoglobina, y después se colocaron a 37ºC. A cada tubo marcado como "T", es decir a los tubos "T1", "T2" y "T3", se añadieron 100 \mul del estándar enzimático. A continuación se incubaron los tubos durante 20 minutos a 37ºC para pepsina y 30 minutos para AFP 2000. Después a todos los tubos se añadieron 10 ml de solución de TCA stock y al tubo "B" se añadieron 100 \mul de enzima. A continuación los tubos se centrifugaron durante un minuto a 1000 rpm. La muestra de cada tubo se filtró mediante un filtro de jeringa en una cubeta de cuarzo y se tomó la absorbancia a 280 nm. La absorbancia de fondo se dedujo de la de cada tubo "T" y se hizo la media de las absorbancias individuales "T1", "T2" y "T3" para cada enzima a cada pH probado.

La figura 3 demuestra que ambas enzimas eran óptimamente activas a pH 2. Además, ambas enzimas poseían una actividad menor del 10% a pH 5,5 y mayor en comparación con el nivel óptimo a pH 2. Este ensayo claramente demuestra que estas enzimas son enzimas que se pueden usar en la presente invención. Además, al usar tal ensayo puede determinarse qué enzimas adicionales son adecuadas para usar en la presente invención.

Claims

1. Un procedimiento cosmético para mejorar la textura o el aspecto de la piel, que comprende la administración tópica a un sujeto sobre un área de la piel una cantidad eficaz de una composición que comprende: (1) una proteasa ácida que está enzimáticamente activa a un pH por debajo de aproximadamente 5,5 y que es insignificativamente activa a un pH igual o superior a 5,5; y (2) un tampón ácido que comprende un ácido que cuando se aplica a la piel reduce temporalmente el pH de la superficie de la piel hasta por debajo de aproximadamente 5,5, estando el tampón ácido sujeto a la neutralización por la acción de procesos epidérmicos naturales, de forma que el pH de la superficie de la piel, a la que se aplicó el tampón ácido, vuelve a un pH de aproximadamente 5,5.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el componente ácido del tampón ácido se selecciona del grupo constituido por ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos y mezclas de los mismos.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que el ácido orgánico se selecciona del grupo constituido por ácido láctico, ácido cítrico, ácido sórbico, ácido glicólico, ácido málico, ácido glucónico y mezclas de los mismos.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el componente ácido del tampón Es un ácido inorgánico seleccionado del grupo constituido por ácido fosfórico, ácido pirofosfórico, ácido trifosfórico, ácido polifosfórico, bisulfato sódico, bisulfato potásico y mezclas de los mismos.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tampón ácido además comprende un soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el componente soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable del tampón ácido se selecciona del grupo constituido por lociones, tinturas, cremas, emulsiones, geles, ungüentos, agua, crema moldeable en agua, alcohol polivinílico, hidroxietilcelulosa, celulosa, polímero acrílico hidrófilo, emolientes, componentes hidratantes de la piel, estabilizantes enzimáticos, glicerol, tensioactivos, conservantes, agentes espesantes hidrófilos usados en las formulaciones farmacéuticas y mezclas de los mismos.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteasa ácida se selecciona del grupo constituido por proteasas fúngicas, proteasas bacterianas y proteasas de mamífero y sus mezclas.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteasa ácida se selecciona del grupo constituido por pepsina, catepsina, proteasa ácida urinaria humana, rizopuspepsina, penicilopepsina, endotiapepsina y mezclas de las mismas.

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 75% en peso de la composición final.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50% en peso de la composición final.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso de la composición final.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteasa ácida posee una actividad específica total de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 Unidades HUT/mg.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la proteasa ácida posee una actividad específica total de aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 Unidades HUT/mg.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que la proteasa ácida posee una actividad específica total de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 Unidades HUT/mg.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el componente ácido del tampón ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 95% en peso de la composición final.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que el componente ácido del tampón ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 25% en peso de la composición final.

17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que el componente ácido del tampón ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso de la composición final.

18. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el pH de la superficie de la piel está por debajo de 5,5 durante aproximadamente 5 minutos hasta a aproximadamente 4 horas.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el pH de la superficie de la piel está por debajo de 5,5 durante aproximadamente 30 minutos hasta a aproximadamente 2 horas.

20. Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que el pH de la superficie de la piel está por debajo de 5,5 durante aproximadamente 30 minutos hasta a aproximadamente 1 hora.

21. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad del 4% en peso de la composición final con una actividad de 4000 Unidades HUT/mg y el tampón ácido comprende ácido láctico presente en una cantidad del 3% en peso de la composición final.

22. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad del 4% en peso de la composición final con una actividad de 4000 Unidades HUT/mg y el tampón ácido comprende ácido láctico presente en una cantidad del 1,5% en peso de la composición final.

23. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad del 4% en peso de la composición final con una actividad de 4000 Unidades HUT/mg y el tampón ácido comprende ácido cítrico presente en una cantidad del 3% en peso de la composición final.

24. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteasa ácida está presente en una cantidad del 4% en peso de la composición final con una actividad de 4000 Unidades HUT/mg y el tampón ácido comprende ácido láctico presente en una cantidad del 1,5% en peso de la composición final y ácido cítrico presente en una cantidad del 1,5% en peso de la composición final.