ES2226440T3

ES2226440T3 - Derivados de propanolamina enlazados biliares para el tratamiento de trastornos del metabolismo de los lipidos.

Info

Publication number: ES2226440T3
Application number: ES99947385T
Authority: ES
Inventors: Siegfried Stengelin; Alfons Enhsen; Heiner Glombik; Werner Kramer; Eugen Falk
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-09-18
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: EP1117676A1; ZA200102586B; AR035003A1; HUP0103570A2; CA2346085A1; EP1117676B1; ATE273991T1; WO2000020437A1; BR9915019A; CN1227259C; US6180618B1; HUP0103570A3; PT1117676E; TR200100897T2; HK1040717A1; JP4598953B2; AU757366B2; KR20010075511A; DE19845403B4; DK1117676T3

Abstract

Compuestos de la fórmula I, **(Fórmula)** GS un grupo ácido cólico de la fórmula **(Fórmula)** R1 un enlace a X, OH; R2 un enlace a X, OH, O-alquilo(C1-C6), NH-alquil(C2-C6)-SO3H, N(CH3)-CH2-CH2-SO3H, NH-alquil(C1-C6)-COOH; N(CH3)-alquil(C1-C6)-COOH; con la condición que R1 y R2 no tengan al mismo tiempo el siguiente significado R1 un enlace a X, y R2 un enlace a X; R3, R4, independientemente entre sí, H, OH **(Fórmula)** o un enlace; l, m, n, independientemente entre sí, 0 o 1; L alquilo(C1-C6), fenilo; AA1, AA2, independientemente entre sí, un radical aminoácido o un radical aminoácido sustituido una o varias veces con un grupo protector del aminoácido.

Description

Derivados de propanolamina enlazados con ácidos biliares para el tratamiento de trastornos del metabolismo de los lípidos.

El invento se refiere a derivados sustituidos de propanolamina y a sus sales farmacéuticamente tolerables y sus derivados fisiológicos funcionales.

Se han descrito ya múltiples clases de principios activos para el tratamiento de la adiposis y de las perturbaciones del metabolismo de los lípidos:

- adsorbentes polímeros tales como, por ejemplo, colestiramina

- benzotiacepinas (documento WO 93/16055)

- dímeros y conjugados del ácido cólico (documento EP 0 489 423)

- amidas del ácido 4-amino-2-ureido-pirimidin-5-carboxílico (documento EP 0 557 879).

El invento tenía por misión poner a disposición otros compuestos que desplegaran un efecto terapéutico hipolipidémico utilizable.

Por consiguiente, el invento se refiere a compuestos de la fórmula I,

1

en la cual significan

GS: un grupo ácido cólico de la fórmula

2

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{2}: un enlace a X, OH, O-alquilo(C_{1}-C_{6}), NH-alquil(C_{2}-C_{6})-SO_{3}H, N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}-SO_{3}H, NH-alquil(C_{1}-C_{6})-COOH; N(CH_{3})-alquil(C_{1}-C_{6})-COOH;

con la condición que R^{1} y R^{2} no tengan al mismo tiempo el siguiente significado

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

R^{3}, R^{4},: independientemente entre sí, H, OH;

3

\quad: o un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6}), fenilo;

AA_{1}, AA_{2},: independientemente entre sí, un radical aminoácido o un radical aminoácido sustituido una o varias veces con un grupo protector del aminoácido;

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

Preferidos son los compuestos de la fórmula I, en los cuales uno o varios restos tienen respectivamente el siguiente significado:

GS: un grupo del ácido cólico de la fórmula

4

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

5

o un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6}), fenilo;

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

Son particularmente preferidos los compuestos de la fórmula I, en los cuales uno o varios restos tienen respectivamente el siguiente significado:

GS: un grupo ácido cólico de la fórmula

6

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{2}: un enlace a X, OH, O-alquilo(C_{1}-C_{6}), NH-alquil(C_{2}-C_{6})-SO_{3}H, NH-alquil(C_{1}-C_{6})-COOH;

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

7

\quad: o un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6});

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

Por la expresión alquilo se entienden cadenas de hidrocarburos lineales o ramificadas.

Bajo la expresión aminoácidos o, respectivamente, radicales aminoácido, se entienden las formas estereoisómeras, es decir las formas D o L de los siguientes compuestos:

alanina	glicina	prolina
cisteína	histidina	glutamina
ácido aspártico	isoleucina	arginina
ácido glutámico	lisina	serina
fenilalanina	leucina	treonina
triptófano	metionina	valina
tirosina	asparagina

ácido 2-aminoadípico	ácido 2-aminoisobutírico
ácido 3-aminoadípico	ácido 3-aminoisobutírico
beta-alanina	ácido 2-aminopimélico
ácido 2-aminobutírico	ácido 2,4-diaminobutírico
ácido 4-aminobutírico	desmosina
ácido piperidínico	ácido 2,2-diaminopimélico
ácido 6-aminocaproico	ácido 2,3-diaminopropiónico
ácido 2-aminoheptanoico	N-etilglicina
2-(2-tienil)-glicina	3-(2-tienil)-alanina
penicilamina	N-metilglicina

N-etilasparagina	N-metilisoleucina
Hidroxilisina	6-N-metillisina
alo-hidroxilisina	N-metilvalina
3-hidroxiprolina	norvalina
4-hidroxiprolina	norleucina
isodesmosina	ornitina
alo-isoleucina	ácido 11-aminoundecanoico

La forma abreviada de escribir los aminoácidos se efectuó según el modo de escribir generalmente habitual (véase Schröder, Lübke, The Peptides, tomo I, Nueva York 1965, páginas XXII-XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, tomo XV/1 y 2, Stuttgart 1974). El aminoácido D-Asp representa la forma D del ácido aspártico. Según su naturaleza química los péptidos son amidas de ácido y, en caso de hidrólisis, se descomponen en aminoácidos.

Por la expresión grupos protectores de aminoácidos se deben entender grupos adecuados con los que se protegen los grupos funcionales de las cadenas laterales de los radicales aminoácido (véase, por ejemplo, T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición, John Wiley and Sons, Nueva York 1991).

Grupos protectores de aminoácidos preferidos son: t-butiloxi-carbonilo (BOC), 9-fluorenilmetoxi-carbonilo
(Fmoc), benciloxi-carbonilo (Z), 2-(3,5-dimetoxifenil)prop-2-iloxicarbonilo (Ddz), metilo, t-butilo, tritilo, S-t-butilo, t-butilamino-carbonilo.

El invento se refiere, además, a procedimientos para la preparación de compuestos de la fórmula I, los cuales se caracterizan por los siguientes esquemas de reacción (esquemas 1 a 4):

Procedimiento A

Esquema 1

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Los compuesto de tipo IV se obtienen haciendo reaccionar iminas o-, m- o p-sustituidas de tipo II con la cetona III. La reacción se puede llevar a cabo, por ejemplo, mezclando los dos compuestos en sustancia, sin disolventes, y subsiguiente calentamiento, o en un disolvente adecuado tal como etanol, tetrahidrofurano (THF), tolueno, diglimas o tetradecano, a temperaturas de 20ºC a 150ºC.

Los cetocompuestos de tipo IV se reducen con NaBH_{4} o con otro agente reductor adecuado a hidroxicompuestos de tipo V, en un disolvente adecuado tal como, por ejemplo, metanol, THF o THF/agua, a temperaturas comprendidas entre -30ºC y +40ºC. En la reducción resultan generalmente dos mezclas de isómeros (racematos) como productos principales. Los diferentes racematos se pueden separar entre sí por cristalización fraccionada o por cromatografía en gel de sílice. El grupo nitro en los compuestos de tipo V se puede reducir por métodos conocidos tales como, por ejemplo, hidrogenación catalítica con Pd o Pd sobre carbón y H_{2} en metanol.

Los compuestos racémicos de tipo VI, así obtenidos, se pueden seguir separando en sus enantiómeros. La separación de los racematos de VI en enantiómeros de tipo VII se puede llevar a cabo por cromatografía en columna con material quiral o por procedimientos conocidos en la bibliografía con reactivos coadyuvantes ópticamente activos (véase J. Org. Chem. 44, 1979, 4891).

Esquema 2

9

De forma correspondiente al esquema 2, las aminas aromáticas de tipo VI o VII (racemato o enantiómero puro) se pueden hacer reaccionar con un aminoácido por conocidos procedimientos estándar de acoplamiento de péptidos, para obtener derivados VIII. Como procedimiento es adecuado, por ejemplo, el acoplamiento con TOTU y trietilamina en DMF. (Véase bibliografía: G. Breipohl, W. König, documento EP 0460446; W. König, G. Breipohl, P. Pokorny, M. Birkner en E. Giralt y D. Andreu (comp.) Peptides 1990, Escom, Leiden, 1991, 143-145). Los radicales AA_{1} y AA_{2} tienen el significado citado en la fórmula I. La función amino del aminoácido se ha provisto con un grupo protector, por ejemplo Fmoc, el ácido carboxílico no está protegido.

En el caso de aminoácidos con grupos funcionales en la cadena lateral, éstos están protegidos de forma correspondiente, bien sea temporalmente durante la síntesis o bien para su permanencia en los compuestos conformes al invento.

Para llegar al derivado VIII se separa el grupo protector de la función amino, por ejemplo en el caso de Fmoc en una mezcla de DMF y piperidina. Se obtienen conjugados de dipéptidos IX, si partiendo de compuestos de tipo VIII, se repite la secuencia de reacción (a) acoplamiento de un aminoácido, (b) desprotección.

Esquema 3

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Los derivados de ácido cólico de tipo X se pueden preparar a partir de ésteres del ácido 3-aminocólico por acoplamiento con ácidos alquildicarboxílicos o arildicarboxílicos o sus derivados tales como, por ejemplo, anhídrido del ácido succínico, según procedimientos conocidos (por ejemplo documentos EP 0614908, EP 0489423). Estos compuestos (X) se hacen reaccionar con amino-compuestos de tipo VI, VII, VIII o IX según procedimientos estándar de acoplamiento de péptidos. Después de la reacción de acoplamiento, por saponificación de la función alquiléster de la parte de ácido cólico, se obtienen los compuestos de tipo XI.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 4

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Los aminocompuestos de tipo VI, VII, VIII o IX se pueden hacer reaccionar con la función ácido carboxílico de los ácidos cólicos. Aquí se utilizan igualmente conocidos procedimientos de acoplamiento de péptidos, por ejemplo acoplamientos en presencia de TOTU y trietilamina o con diciclohexilcarbodiimida, hidroxi-benzotriazol y trietilamina en THF. Según estos procedimientos se pueden obtener los compuestos de tipo XII.

En virtud de su mayor solubilidad en agua, las sales farmacéuticamente tolerables son particularmente adecuadas para aplicaciones medicinales frente a los compuestos de partida o, respectivamente, de base. Estas sales tienen que presentar un anión o catión farmacéuticamente tolerable. Sales por adición de ácidos farmacéuticamente tolerables de los compuestos conformes al invento son sales de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico, sulfónico y sulfúrico, así como de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glicólico, isotiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, metanosulfónico, succínico, p-toluenosulfónico, tartárico y trifluoroacético. Para fines medicinales se utiliza de modo particularmente preferido la sal de cloro. Sales adecuadas con carácter básico farmacéuticamente tolerables son sales de amonio, sales de metales alcalinos (tales como las sales de sodio y potasio) y sales de metales alcalinotérreos (tales como las sales de magnesio y calcio).

Las sales con un anión farmacéuticamente no tolerable pertenecen igualmente al marco del invento como productos intermedios útiles para la preparación o purificación de las sales farmacéuticamente tolerables y/o para la utilización en aplicaciones no terapéuticas, por ejemplo en aplicaciones in vitro.

Los compuestos conformes al invento se pueden presentar también en diferentes formas polimorfas, por ejemplo como formas polimorfas cristalinas y amorfas. Todas las formas polimorfas de los compuestos conformes al invento pertenecen al marco del invento y son un aspecto más del invento.

A continuación, todas las remisiones a "compuesto o compuestos conformes a la fórmula (I)" se refieren a los compuestos de la fórmula (I) como se han descrito anteriormente, así como a sus sales, solvatos y derivados fisiológicamente funcionales como los aquí descritos.

La cantidad de una sustancia conforme a la fórmula (I), que es necesaria para alcanzar el efecto biológico deseado, depende de una serie de factores, por ejemplo del compuesto específico elegido, de la utilización que se pretende, del tipo de administración y del estado clínico del paciente. En general, la dosis diaria se encuentra en el intervalo de 0,3 mg hasta 100 mg (típicamente de 3 mg a 50 mg) por día y kilogramo de peso corporal, por ejemplo 3-10 mg/kg/día. Una dosis intravenosa se puede situar, por ejemplo, en el intervalo de 0,3 mg a 1,0 mg/kg, la cual se puede administrar adecuadamente en forma de infusión de 10 ng a 100 ng por kilogramo y minuto. Soluciones para infusión adecuadas para estos fines pueden contener, por ejemplo, desde 0,1 ng a 10 mg, típicamente desde 1 ng hasta 10 mg por mililitro. Las dosis individuales pueden contener, por ejemplo, desde 1 mg hasta 10 g de principio activo. Por consiguiente, las ampollas para inyecciones pueden contener, por ejemplo, desde 1 mg hasta 100 mg, y las formulaciones de dosis individual administrables por vía oral tales como, por ejemplo, comprimidos o cápsulas, pueden contener, por ejemplo, desde 1,0 a 1000 mg, típicamente desde 10 a 600 mg. En el caso de sales farmacéuticamente tolerables los citados datos ponderales se refieren al peso del ion benzotiazepina derivado de la sal. Para la profilaxis o terapia de los estados anteriormente citados, los compuestos conformes a la fórmula (I) se pueden utilizar propiamente como compuesto pero, preferentemente, se presentan con un soporte adecuado en forma de una composición farmacéutica. Naturalmente, el soporte tiene que ser tolerable en el sentido de que sea compatible con los demás componentes de la composición y no sea perjudicial para la salud del paciente. El soporte puede ser una sustancia sólida o un líquido o ambas cosas y se formula preferentemente con el compuesto como dosis individual, por ejemplo como comprimido, el cual puede contener desde 0,05% a 95% en peso del principio activo. Otras sustancias farmacéuticamente activas pueden estar igualmente presentes, inclusive otros compuestos conformes a la fórmula (I). Las composiciones farmacéuticas conformes al invento se pueden preparar según uno de los métodos farmacéuticos conocidos, los cuales consisten esencialmente en mezclar los componentes con soportes y/o coadyuvantes farmacológicamente tolerables.

Composiciones farmacéuticas conformes al invento son aquellas que son adecuadas para su administración por vía oral, rectal, tópica, peroral (por ejemplo sublingual) y parenteral (por ejemplo subcutánea, intramuscular, intradermal o intravenosa), aun cuando el modo de administración más adecuado depende en cada caso individual de la clase y gravedad del estado a tratar y de la clase de compuesto conforme a la fórmula (I) utilizado en cada caso. También las formulaciones en forma de grageas y las formulaciones retardadas en forma de grageas pertenecen al marco del invento. Preferidas son las formulaciones resistentes a los ácidos y a los jugos gástricos. Recubrimientos adecuados, resistentes a los jugos gástricos, abarcan al acetatoftalato de celulosa, acetatoftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y los polímeros aniónicos del ácido metacrílico y éster metílico del ácido metacrílico.

Compuestos farmacéuticos adecuados para su administración por vía oral se pueden presentar en unidades separadas como, por ejemplo, cápsulas, cápsulas de oblea, comprimidos para chupar o comprimidos, los cuales contienen en cada caso una determinada cantidad del compuesto conforme a la fórmula (I); como polvos o granulados; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite-en-agua o agua-en-aceite. Como ya se ha mencionado, estas composiciones se pueden preparar por cualquier método farmacéutico adecuado que abarque una etapa en la cual se ponen en contacto el principio activo y el soporte (el cual puede consistir en uno o varios componentes adicionales). En general, las composiciones se preparan por mezcladura equilibrada y homogénea del principio activo con un soporte líquido y/o un soporte sólido finamente dividido, después de lo cual el producto, en caso necesario, se conforma. Así, por ejemplo, se puede preparar un comprimido prensando o conformando un polvo o granulado del compuesto, eventualmente con uno o varios componentes adicionales. Los comprimidos prensados se pueden preparar en una máquina adecuada formando comprimidos del compuesto que fluye de forma libre tal como, por ejemplo, un polvo o granulado, eventualmente mezclado con un aglutinante, agente de deslizamiento, diluyente inerte y/o un o (varios) agentes tensioactivos/dispersantes. Los comprimidos conformados se pueden preparar por moldeo del compuesto en forma de polvo, humedecido con un diluyente inerte líquido, en una máquina adecuada.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para una administración por vía peroral (sublingual) abarcan comprimidos para chupar que contienen un compuesto conforme a la fórmula (I) con una sustancia saborizante, habitualmente sacarosa, y goma arábiga o tragacanto, y pastillas que abarcan el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración por vía parenteral abarcan preferentemente preparados acuosos estériles de un compuesto conforme a la fórmula (I), los cuales son preferentemente isotónicos con la sangre del receptor previsto. Estos preparados se administran preferentemente por vía intravenosa, aun cuando la administración se puede efectuar también como inyección por vía subcutánea, intramuscular o intradermal. Estos preparados se pueden preparar preferentemente mezclando el compuesto con agua, y la solución obtenida se esteriliza y se hace isotónica con la sangre. Composiciones inyectables conformes al invento contienen en general desde 0,1 a 5% en peso del compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración por vía rectal se presentan preferentemente como supositorios de dosis individual. Éstos se pueden preparar mezclando un compuesto conforme a la fórmula (I) con uno o varios soportes sólidos convencionales, por ejemplo manteca de cacao, y conformando la mezcla que se origina.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración por vía tópica sobre la piel se presentan preferentemente en forma de pomada, crema, loción, pasta, esprai, aerosol o aceite. Como soportes se pueden utilizar vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes y combinaciones de dos o más de estas sustancias. El principio activo se encuentra en general en una concentración de 0,1 a 15% en peso de la composición, por ejemplo de 0,5 a 2%.

También es posible una administración por vía transdermal. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicaciones transdermales se pueden presentar en forma de parches individuales adecuados para un estrecho contacto de larga duración con la epidermis del paciente. Tales parches contienen adecuadamente el principio activo en una solución acuosa eventualmente tamponada, disuelto y/o disperso en un agente adherente o disperso en un polímero. Una adecuada concentración de principio activo es aproximadamente de 1% hasta 35%, de preferencia aproximadamente 3% hasta 15%. Como una posibilidad particular, el principio activo se puede liberar por electrotransporte o toforesis iónica, tal como se describe por ejemplo en Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986).

El invento se refiere a compuestos de la fórmula I en forma de sus racematos, mezclas racémicas y enantiómeros puros, así como a sus diastereoisómeros y mezclas de ellos.

Los compuestos de la fórmula I y sus sales farmacéuticamente tolerables y derivados fisiológicamente funcionales se caracterizan por sus efectos favorables sobre el metabolismo de los lípidos. Los compuestos se pueden emplear solos o en combinación con otros principios activos hipolipemiantes.

Los compuestos se adecúan para la profilaxis, así como especialmente para el tratamiento de perturbaciones del metabolismo de los lípidos, especialmente de la hiperlipidemia. Los compuestos de la fórmula I son igualmente adecuados para influir sobre el nivel de colesterol en suero, así como para la prevención y el tratamiento de manifestaciones arterioscleróticas.

Los siguientes resultados confirman la eficacia farmacológica de los compuestos conformes al invento.

El ensayo biológico de los compuestos conformes al invento tuvo lugar determinando la inhibición de la absorción de [^{3}H]-taurocolato en vesículas de la membrana en borde de cepillo del íleon del conejo. El ensayo de inhibición se llevó a cabo como sigue:

1. Preparación de vesículas de la membrana con borde en cepillo del íleon del conejo

La preparación de vesículas de la membrana con borde en cepillo a partir de las células intestinales del intestino delgado se efectuó con el denominado método de precipitación con Mg^{2+}. Conejos macho de Neozelanda (peso corporal 2 a 2,5 kg) se sacrificaron por inyección intravenosa de 0,5 ml de T61®, una solución acuosa de 2,5 mg de tetracaína HCl, 100 mg de embutramida y 25 mg de yoduro de mebezonio. El intestino delgado se extrajo y se lavó con solución fisiológica salina enfriada con hielo. Las 7/10 partes terminales del intestino delgado (medido en sentido oral-rectal, es decir el íleon terminal, el cual contiene el sistema de transporte activo del ácido cólico dependiente de Na^{+}) se utilizaron para la preparación de las vesículas de la membrana en borde de cepillo. Los intestinos se congelaron en bolsas de plástico a -80ºC bajo nitrógeno. Para la preparación de las vesículas de la membrana, los intestinos congelados se descongelaron en un baño de agua a 30ºC. La mucosa se separó por raspado y se suspendió en 60 ml de tampón Tris/HCl 12 mM (pH 7,1)/manita 300 mM, EGTA 5 mM/10 mg/l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo/1mg/l de inhibidor de tripsina de semillas de soja (32 u/mg)/0,5 mg/l de inhibidor de tripsina de pulmón de bovino (193 u/mg)/5 mg/l de bacitracina, enfriado con hielo. Después de diluir a un volumen de 300 ml con agua destilada enfriada con hielo se homogeneizó, bajo refrigeración con hielo, con un Ultraturrax (18 varillas, IKA Werk Staufen, Alemania) durante 3 minutos al 75% de potencia máxima. Tras añadir 3 ml de solución de MgCl_{2} 1 M (concentración final 10 mM) se dejó reposar exactamente durante 1 minuto a 0ºC. Por adición de Mg^{2+} las membranas celulares se agregan y precipitan con excepción de las membranas en borde de cepillo. Tras 15 minutos de centrifugación a 3000 x g (5.000 rpm, rotor SS-34) se desechó el precipitado y el sobrenadante, que contiene las membranas en borde de cepillo, se centrifugó durante 30 minutos a 48.000 x g (20.000 rpm, rotor SS-34). El sobrenadante se desechó, el precipitado se volvió a homogeneizar en 60 ml de tampón Tris/HCl 12 mM (pH 7,1)/manita 60 mM, EGTA 5 mM con un homogeneizador Potter Elvejhem (Braun, Melsungen, 900 rpm, 10 emboladas). Tras la adición de 0,1 ml de solución de MgCl_{2} 1M y 15 minutos de incubación a 0ºC se centrifugó de nuevo durante 15 minutos a 3.000 x g. A continuación, el sobrenadante se centrifugó nuevamente durante 30 minutos a 48.000 x g (20.000 rpm, rotor SS-34). El precipitado se recogió en 30 ml de tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/manita 300 mM, y con 20 emboladas se volvió a suspender homogéneamente, a 1.000 rpm, en un homogeneizador Potter Elvejhem. Después de 30 minutos de centrifugación a 48.000 x g (20.000 rpm, rotor SS-34) el precipitado se recogió en 0,5 a 2 ml de tampón Tris/Hepes (pH 7,4)/manita 280 mM (concentración final 20 mg/ml) y se volvió a suspender con ayuda de una jeringuilla para tuberculina con una aguja 27 Gauge. Las vesículas o bien se utilizaron inmediatamente después de su preparación para ensayos de transporte o se almacenaron en porciones de 4 mg a -196ºC bajo nitrógeno líquido.

2. Inhibición de la absorción de [^{3}H]-taurocolato dependiente de Na^{+} en vesículas de la membrana en borde de cepillo del íleon

La absorción de sustratos en las vesículas de la membrana en borde de cepillo descritas anteriormente se determinó mediante la técnica denominada de filtración de membranas. 10 \mul de la suspensión de vesículas (100 \mug de proteína) se pipetearon en forma de gotas en la pared de un tubito para incubación de poliestireno (11 x 70 mm), el cual contenía el medio de incubación con los correspondientes ligandos (90 \mul). El medio de incubación contenía 0,75 \mul = 0,75 \muCi [^{3}H(G)]-taurocolato (actividad específica: 2,1 Ci/mmol)/0,5 \mul de taurocolato 10 mM/8,75 \mul de tampón de transporte de sodio (Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/manita 100 mM/NaCl 100 mM) (Na-T-P) o, respectivamente, 8,75 \mul de tampón de transporte de potasio (Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/manita 100 mM/KCl 100 mM)(K-T-P) y 80 \mul de la respectiva solución inhibidora, disuelta según el experimento en tampón Na-T o, respectivamente, tampón K-T. El medio de incubación se filtró a través de un filtro de membrana de fluoruro de polivinilideno (SYHV LO 4NS, 0,45 \mum, 4 mm \phi, Millipore, Eschborn, Alemania). Mezclando las vesículas con el medio de incubación se inició la medición del transporte. La concentración de taurocolato en la tanda de incubación era 50 \muM. Transcurrido el tiempo de incubación deseado (habitualmente 1 minuto) se detuvo el transporte por adición de 1 ml de solución de parada enfriada con hielo (Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/KCl 150 mM). La mezcla formada se filtró inmediatamente con succión bajo un vacío de 25 a 35 mbar a través de un filtro de membrana de nitrato de celulosa (ME 25, 0,45 \mum, 25 mm de diámetro, Schleicher & Schuell, Dassell, Alemania). El filtro se lavó ulteriormente con 5 ml de solución de parada, enfriada con hielo.

Para la medición de la absorción del taurocolato marcado radiactivamente se disolvió el filtro de membrana con 4 ml de agente de centelleo Quickzint 361 (Zinsser Analytik GmbH, Frankfurt, Alemania) y se midió la radioactividad por medición del centelleo en líquido en un aparato de medición TriCarb 2500 (Canberra Packard GmbH, Frankfurt, Alemania). Los valores medidos se obtuvieron como dpm (descomposiciones por minuto) después del calibrado del aparato con ayuda de muestras estándar y después de la corrección de la quimioluminiscencia eventualmente existente.

Los valores de control se obtuvieron en cada caso en Na-T-P y K-T-P. La diferencie entre la absorción en Na-T-P y K-T-P proporcionó la parte de transporte dependiente del Na^{+}. Como CI_{50} Na^{+} se designó la concentración de inhibidor, en la cual la parte de transporte dependiente del Na^{+} se había inhibido en un 50%, referido al control.

Los datos farmacológicos abarcan una serie de ensayos en la cual se examinó la interacción de los compuestos conformes al invento con el sistema de transporte del ácido cólico en el intestino delgado terminal. Los resultados se han recopilado en la Tabla 1.

La Tabla 1 muestra los valores de medida de la inhibición de la absorción de [^{3}H]-taurocolato en vesículas de la membrana en borde de cepillo del íleon del conejo. Se indican los cocientes de los valores CI_{50Na} de la sustancia de referencia como desoxicolato de tauroqueno (TCDC) y de la respectiva sustancia de ensayo.

TABLA 1

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Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar con más detalle el invento, sin limitarlo a los productos y las formas de realización descritos en los ejemplos.

Ejemplo 1

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A 50 g (0,54 mol) de picolina en 770 ml de tetrahidrofurano se añadieron gota a gota, a -55ºC, 366 ml de n-butil-litio al 15% en n-hexano. Se calentó hasta la temperatura ambiente y nuevamente se enfrió a -55ºC. Se añadieron lentamente gota a gota 77 g de N,N-dimetilbenzamida (0,52 mol) en 570 ml de tetrahidrofurano, a continuación se calentó hasta la temperatura ambiente y aún se agitó durante 1 h. Tras la adición de 550 ml de ácido clorhídrico 1 N se extrajo con acetato de etilo (3 veces), las fases orgánicas se secaron con MgSO_{4} y se concentraron por evaporación. Por destilación del residuo se obtuvieron 47,5 g (47%) de producto. Punto de ebullición 134-136ºC/0,28 mbar.

14

20,0 g (0,13 mol) de o-nitrobenzaldehído, 12,5 (0,13 mol) de 2-aminopiridina y 0,3 g de ácido p-toluenosulfónico se calentaron a reflujo en 150 ml de tolueno durante 2,5 h en el separador de agua. La solución se enfrió, el precipitado formado se filtró con succión y se secó.

Rendimiento:	18,1 g (60%) de producto
Punto de fusión:	93-95ºC
C_{12}H_{9}N_{3}O_{2} (227)	EM (FAB) 228	M+H^{+}

15

12,0 g (61 mmol) de la cetona del Ejemplo 1a y 15,0 g (66 mmol) de la imina del Ejemplo 1b se calentaron durante 45 min en baño de vapor. La mezcla de reacción se disolvió en etanol bajo calentamiento. Después de enfriar, el precipitado se filtró con succión y se recristalizó en etanol.

Rendimiento:	11,8 g (46%) de producto
C_{25}H_{20}N_{4}O_{3} (424,2)	EM (FAB) 425	M+H^{+}

\vskip1.000000\baselineskip

16

8,0 g (18,8 mmol) del cetocompuesto del Ejemplo 1c se disolvieron en 300 ml de tetrahidrofurano/agua 10:1, se mezclaron con 4,67 g de borohidruro de sodio y se agitaron durante 2 h a la temperatura ambiente. A continuación, la solución se concentró por evaporación, el residuo se mezcló con 100 ml de ácido clorhídrico 2 N y se calentó en baño de vapor hasta que todo se hubo disuelto. Después de enfriar, se basificó con solución de NaOH 4 N y se extrajo con acetato de etilo (2 veces). Las fases orgánicas se secaron con MgSO_{4} y se concentraron por evaporación. El residuo se cromatografió en gel de sílice (heptano/acetato de etilo 1:1). Como producto se obtuvieron dos compuestos racémicos.

1ª fracción: 3,9 g (48%) del racemato no polar (Ejem. 1 d/1)

C_{25}H_{22}N_{4}O_{3} (426,2)

EM (FAB) 427

M+H^{+}

2ª fracción: 2,5 g (31%) del racemato polar (Ejem. 1 d/2)

C_{25}H_{22}N_{4}O_{3} (426,2)

EM (FAB) 427

M+H^{+}

17

2,5 g (5,86 mmol) del racemato no polar del Ejemplo 1 d/1 se disolvieron en 300 ml de metanol, se mezclaron con aproximadamente 20 mg de Pd/C 10% y, bajo atmósfera de H_{2}, se hidrogenaron a la temperatura ambiente. Se separó por filtración del catalizador y la solución se concentró por evaporación. El residuo se cromatografió en gel de sílice (n-heptano/acetato de etilo 7:13).

Rendimiento:	1,9 g (82%) de producto
C_{25}H_{24}N_{4}O (396,22)	MS (FAB) 397	M+H^{+}

18

100 mg del compuesto racémico del Ejemplo 1e se separó en los enantiómeros por HPLC preparativa. La separación se efectuó a través de una columna Chiral-Pak CSP (razón social Daicel, Düsseldorf) con n-hexano/etanol 4:1.

Como primera fracción se obtuvieron 40 mg del (-)-enantiómero (Ejem. 1f/1) y, como 2ª fracción, 40 mg del (+)-enantiómero (Ejem. 1f/2).

19

4,0 g (10,1 mmol) del aminocompuesto del Ejemplo 1e (racemato no polar), 4,85 g (10,3 mmol) de N-Fmoc-D-Lys(BOC)OH, 4,0 g (12,2 mmol) de TOTU y 2,7 ml de trietilamina se disolvieron en 300 ml de dimetilformamida y se agitaron durante 2 h a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo (2 veces) con acetato de etilo. Las fases orgánicas se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron por evaporación. El residuo se disolvió en 150 ml de dimetilformamida/piperidina 2:1 para la separación del grupo Fmoc y se agitó durante 1 h a la temperatura ambiente. Se vertió sobre agua, se extrajo (3 veces) con acetato de etilo. Las fases orgánicas se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron por evaporación. La cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol 9:1) proporcionó 4,0 g (63,5%) de producto.

C_{36}H_{44}N_{6}O_{4} (624,3)

EM (FAB) 625

M+H^{+}

20

5,0 g (11,86 mmol) de éster metílico del ácido 3\beta-aminocólico (solicitud de patente europea EP 0614908), 1,3 g (13 mmol) de anhídrido del ácido succínico y 16,5 ml de trietilamina se disolvieron en 75 ml de tetrahidrofurano y se agitaron durante 1 h a la temperatura ambiente. La solución se concentró por evaporación. El residuo se disolvió en agua, se acidificó con ácido clorhídrico y se extrajo con acetato de etilo (3 veces). Las fases orgánicas se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron por evaporación.

Rendimiento:	5,8 g (94%)
C_{29}H_{47}NO_{7} (521,3)	MS (FAB) 528	M+Li^{+}

21

4,6 g (6,4 mmol) del compuesto del ejemplo 1g, 3,45 g (6,6 mmol) del derivado de ácido cólico del Ejemplo 1h, 1,2 ml de trietilamina, 2,16 g (16 mmol) de hidroxibenzotriazol y 2,56 g de diciclohexilcarbodiimida (12,4 mmol) se disolvieron en 250 ml de tetrahidrofurano y se agitaron durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se concentró por evaporación, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con solución de NaHCO_{3}. Las fases orgánicas se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron por evaporación. La cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol 19:1, después 9:1) proporcionó 3,1 g (43%) de producto.

C_{65}H_{89}N_{7}O_{10} (1127,7)

MS (FAB) 1134,7

M+Li^{+}

22

3,1 g (2,75 mmol) del éster metílico del Ejemplo 1i se disolvieron en 200 ml de etanol, se mezclaron con 31 ml de solución 1N de NaOH y se agitaron durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se concentró por evaporación, el residuo se disolvió en agua y se lavó con solución saturada de NaH_{2}PO_{4}. Se extrajo con acetato de etilo (2 veces), las fases orgánicas se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron por evaporación. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice (diclorometano/metanol 4:1).

Rendimiento:	2,25 g (73%)
C_{64}H_{87}N_{7}O_{10} (1113,7)	MS (FAB) 1120,7	M+Li^{+}

23

1,5 g (1,35 mmol) del compuesto del Ejemplo 1j y 0,81 ml de trietilamina se mezclaron a 0ºC con 0,48 ml de éster etílico del ácido clorofórmico y se agitaron durante 10 min. Después se añadieron 0,6 g de taurina disueltos en 30 ml de solución 0,1 N de NaOH, y se agitaron durante 24 h a la temperatura ambiente. La mezcla se concentró por evaporación, el residuo se disolvió en un poco de agua y se vertió en solución saturada de NaH_{2}PO_{4}. Se extrajo con acetato de etilo (3 veces), las fases orgánicas se secaron con MgSO_{4} y se concentraron por evaporación. Tras la cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol 4:1, después metanol) se obtuvieron 0,98 g (60%) de conjugado de taurina.

C_{66}H_{92}N_{8}O_{12}S (1270,7)

MS (FAB) 1243,6

M+Na^{+}

Ejemplo 2

24

2,5 g (6,31 mmol) del aminocompuesto del Ejemplo 1e (racemato no polar), 2,2 g (6,52 mmol) de Fmoc-L-prolina, 2,5 g (7,62 mmol) de TOTU y 1,7 ml de trietilamina se disolvieron en 100 ml de dimetilformamida y se agitaron durante 3 h a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró por evaporación hasta la mitad de su volumen, se mezcló con agua y se extrajo con acetato de etilo (3 veces). Las fases orgánicas se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron por evaporación. Tras la cromatografía en gel de sílice (acetato de etilo/n-heptano 7:3) se obtuvieron 3,85 g (85%) de producto.

Este producto intermedio (3,6 g) protegido con Fmoc se disolvió en 110 ml de piperidina/DMF 1:10 y se agitó durante 1 h a la temperatura ambiente. La mezcla se concentró por evaporación y se cromatografió sobre gel de sílice (diclorometano/metanol 19:1, después 9:1).

Rendimiento:	1,8 g (72,5%)
C_{30}H_{31}N_{5}O_{2} (493,2)	EM (FAB) 494	M+H^{+}

25

1,7 g (3,44 mmol) del compuesto del Ejemplo 2a se agitaron durante 4 h a la temperatura ambiente, en 150 ml de DMF, con 1,4 g (3,61 mmol) de Fmoc-L-fenilalanina, 1,9 g (5,80 mmol) de TOTU y 1,0 ml de trietilamina. La mezcla de reacción se concentró por evaporación y el residuo se cromatografió en gel de sílice (acetato de etilo/n-heptano 4:1). Se obtuvieron dos fracciones:

1ª fracción: 1,28 g (43%) del diastereoisómero no polar (Ejem. 2 b/1)

C_{54}H_{50}N_{6}O_{5} (862,4)

EM (FAB) 863,4

M+H^{+}

2ª fracción: 0,82 g (28%) del diastereoisómero polar (Ejem. 2 b/1)

C_{54}H_{50}N_{6}O_{5} (862,4)

EM (FAB) 863,4

M+H^{+}

26

0,8 g (0,93 mmol) del compuesto del Ejemplo 2b/2 se disolvieron en 33 ml de DMF/piperidina 10:1 y se agitaron durante 1 h a la temperatura ambiente. Después de concentrar por evaporación, el residuo se cromatografió en gel de sílice (dicloro-metano/metanol 19:1, después 9:1).

Rendimiento:	0,35 g (59%)
C_{39}H_{40}N_{6}O_{3} (640,3)	EM (FAB) 641,3	M+H^{+}

27

0,5 g (0,78 mmol) del compuesto del Ejemplo 2c, 0,45 g (0,86 mmol) del derivado de ácido cólico del Ejemplo 1h se hicieron reaccionar según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1i. Se obtuvieron 0,38 g (43%) de producto.

C_{68}H_{85}N_{7}O_{9} (1143,6)

EM (FAB) 1144,6

M+H^{+}

28

0,31 g (0,27 mmol) del éster metílico del Ejemplo 1d se disolvieron en 30 ml de etanol, se mezclaron con 3,0 ml de solución 1 N de NaOH y se agitaron durante 12 h a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró por evaporación y el residuo se cromatografió en gel de sílice (diclorometano/metanol 4:1).

Rendimiento:	220 mg (72%)
C_{67}H_{83}N_{7}O_{9} (1129,6)	EM (FAB) 1130,6	M+H^{+}

Ejemplo 3

29

0,3 g (0,78 mmol) de 3-(4-aminofenil)-1-fenil-2-piridin-2- -il-3-(piridin-2-ilamino)propano-1-ol (preparación análoga al Ejemplo 1e), 0,34 g (0,83 mmol) de ácido ursocólico, 0,34 g (2,52 mmol) de hidroxibenzotriazol, 0,41 g (2 mmol) diciclohexilcarbodiimida y 0,15 ml de trietilamina se agitaron en 50 ml de tetrahidrofurano durante 2 días a la temperatura ambiente. Tras finalizar la reacción, las sustancias sólidas se separaron por filtración. La solución se concentró por evaporación y el residuo se cromatografió en gel de sílice (diclorometano/metanol 9:1, después 17:3). Se obtuvieron 0,33 g (55%) de producto.

C_{49}H_{62}N_{4}O_{5} (786,5)

EM (FAB) 787,5

M+H^{+}

Partiendo de los correspondientes compuestos de partida se obtuvieron los Ejemplos 4 a 14 análogamente a los Ejemplos 1 a 3.

Ejemplo 4

30

C_{49}H_{62}N_{4}O_{5} (787,1)

EM (FAB) 788,1

M+H^{+}

Ejemplo 5

(diastereoisómero no polar)

31

C_{53}H_{67}N_{5}O_{7} (886,2)

EM (FAB) 887,2

M+H^{+}

Ejemplo 6

32

C_{54}H_{69}N_{5}O_{7} (900,2)

EM (FAB) 901,2

M+H^{+}

Ejemplo 7

(diastereoisómero polar)

33

C_{53}H_{67}N_{5}O_{7} (886,2)

EM (FAB) 887,2

M+H^{+}

Ejemplo 8

34

C_{53}H_{67}N_{5}O_{7} (886,2)

EM (FAB) 887,2

M+H^{+}

Ejemplo 9

35

C_{60}H_{81}N_{7}O_{8} (1028,4)

EM (FAB) 1029,4

M+H^{+}

Ejemplo 10

36

C_{59}H_{79}N_{7}O_{8} (1014,3)

EM (FAB) 1015,3

M+H^{+}

Ejemplo 11

37

C_{67}H_{83}N_{7}O_{9} (1130,5)

EM (FAB) 1031,5

M+H^{+}

Ejemplo 12

38

C_{64}H_{87}N_{7}O_{10} (1114,4)

EM (FAB) 1115,4

M+H^{+}

Ejemplo 13

39

C_{68}H_{85}N_{7}O_{9} (1144,5)

EM (FAB) 1145,5

M+H^{+}

Ejemplo 14

40

C_{66}H_{90}N_{8}O_{11} (1171,5)

EM (FAB) 1172,5

M+H^{+}

Claims

1. Compuestos de la fórmula I,

41

en la cual significan

GS: un grupo ácido cólico de la fórmula

42

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

R^{3},R^{4},: independientemente entre sí, H, OH;

43

\quad: o un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6}), fenilo;

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

2. Compuestos de la fórmula I conformes a la reivindicación 1, caracterizados porque en ella significan

GS: un grupo del ácido cólico de la fórmula

44

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

45

\quad: un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6}), fenilo;

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

3. Compuestos de la fórmula I conformes a la reivindicación 1 o 2, caracterizados porque en ella significan

GS: un grupo ácido cólico de la fórmula

46

R^{1}: un enlace a X, OH;

R^{1}: un enlace a X, y

R^{2}: un enlace a X;

47

\quad: o un enlace;

l, m, n,: independientemente entre sí, 0 o 1;

L: alquilo(C_{1}-C_{6});

así como sus sales farmacéuticamente tolerables.

4. Medicamento que contiene uno o varios de los compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Medicamento que contiene uno o varios de los compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, y uno o varios principios activos hipolipemiantes.

6. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 para su aplicación como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de perturbaciones del metabolismo de los lípidos.

7. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 para su aplicación como medicamento para el tratamiento de la hiperlipidemia.

8. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 para su aplicación como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de manifestaciones arterioscleróticas.

9. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 en combinación con al menos otro principio activo hipolipemiante para su aplicación como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de perturbaciones del metabolismo de los lípidos.

10. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 en combinación con al menos otro principio activo hipolipemiante como medicamento para el tratamiento de la hiperlipidemia.

11. Compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 en combinación con al menos otro principio activo hipolipemiante para su aplicación como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de manifestaciones arterioscleróticas.

12. Procedimiento para la preparación de un medicamento que contiene uno o varios de los compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el principio activo se mezcla con un soporte farmacéuticamente adecuado, y esta mezcla se lleva a una forma adecuada para su administración.

13. Utilización de los compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de perturbaciones del metabolismo de los lípidos.

14. Utilización de los compuestos conformes a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hiperlipidemia.