ES2221280T3 - Procedimiento para la preparacion de acido pantotenico por amplificacion de secuencias de nucleotidos que codifican cetopantoatoreductosa. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de acido pantotenico por amplificacion de secuencias de nucleotidos que codifican cetopantoatoreductosa.Info
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Abstract
La invención se refiere a la producción de microorganismos que superproducen ácido pantoténico, útil como vitamina en, por ejemplo, alimentos y medicinas, mediante sobreexpresión de secuencias que codifican la cetopantotenato-reducta. La invención se refiere a la producción y mejora de los organismos que producen el ácido pantoténico (I) mediante amplificación (particularmente sobreexpresión) de las secuencias (I) que codifican la cetopantotenato-reductasa (KPR) especialmente el gen panE, bien individualmente o conjuntamente. Opcionalmente también se amplifica el gen ilvC.
Description
Procedimiento para la preparación de ácido
pantoténico por amplificación de secuencias de nucleótidos que
codifican cetopantoato-reductasa.
El ácido pantoténico representa una vitamina
comercialmente significativa que se utiliza en cosmética, medicina,
alimentación humana y alimentación animal.
El ácido pantoténico puede prepararse por
síntesis química o por biotecnología por fermentación de
microorganismos adecuados en soluciones nutrientes apropiadas. En la
síntesis química, la DL-pantolactona es un compuesto
importante. Se prepara en un procedimiento de varias etapas a partir
de formaldehído, isobutiraldehído y cianuro. En otras etapas del
procedimiento se separa la mezcla racémica y se condensa la
D-pantolactona con \beta-alanina,
obteniéndose ácido D-pantoténico.
La ventaja de la preparación fermentativa
mediante microorganismos radica en la formación directa de la forma
D estereoisomérica deseada.
Distintos tipos de bacterias como, por ejemplo,
Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes, y también levaduras
como, por ejemplo, Debaromyces castellii, pueden producir
ácido D-pantoténico, tal como se indica en el
documento EPA 0 493 060, en una solución nutriente que contiene
glucosa, ácido DL-pantoico y
\beta-alanina. El documento EPA 0 493 060 muestra,
además, que en el caso de Escherichia coli se mejora la
formación de ácido D-pantoténico mediante la
amplificación de genes de la biosíntesis de ácido pantoténico
contenidos en los plásmidos pFV3 y pFV5, en una solución nutriente
que contiene glucosa, ácido DL-pantoico y
\beta-alanina.
El documento EPA 0 590 857 y la patente
estadounidense 5.518.906 describen mutantes derivados de la cepa
IFO3547 de Escherichia coli, como FV5714, FV525, FV814,
FV521, FV221, FV6051 y FV5069 que presentan resistencias contra
diferentes antimetabolitos como ácido salicílico, ácido
\alpha-cetobutírico, ácido
\beta-hidroxiaspártico,
O-metiltreonina y ácido
\alpha-cetoisovaleriánico, y producen ácido
pantoico en una solución nutriente que contiene glucosa, y ácido
D-pantoténico en una solución nutriente que contiene
glucosa y \beta-alanina. En el documento EPA 0 590
857 y la patente estadounidense 5.518.906 se muestra además que,
después de la amplificación de los genes de la biosíntesis del ácido
pantoténico contenidos en el plásmido pFV31, en las cepas antes
mencionadas se mejora la producción de ácido
D-pantoico en una solución nutriente que contiene
glucosa y la producción de ácido D-pantoténico en
una solución nutriente que contiene glucosa y
\beta-alanina.
En el documento WO 97/10340 se muestra, además,
que en cepas de Escherichia coli que forman ácido pantoténico
puede seguirse incrementando la producción de ácido pantoténico al
aumentar la actividad de la enzima acetohidroxiácido sintasa II, una
enzima de la biosíntesis de valina.
El documento Database Biosis [Online]
Biossciences Information Service, Filadelfia, PA, EE.UU.; 1983
Primerano D. A.: "Role of Aceto Hydroxy acid isomero reductase in
Biosynthesis of Pantothenic-acid in
Salmonella-Typhimurium" nº de acceso a la
base de datos PREV198376072046 XP002170048 y Journal of
Bacteriology, Vol. 153, nº 1983, páginas 259-269,
ISSN: 0021-9193. En este documento se describe el
papel que desempeña el acetohidroxiácido
isómero-reductasa en la transformación del
cetopantoato en pantoato.
Los autores de la invención tenían por misión
poner a disposición nuevas bases para un procedimiento mejorado para
la preparación de ácido pantoténico.
La vitamina ácido pantoténico representa un
producto comercialmente significativo que se utiliza en cosmética,
medicina, alimentación humana y alimentación animal. Por lo tanto,
existe un interés general de poner a disposición procedimientos
mejorados para la preparación de ácido pantoténico. Cuando en el
siguiente texto se hace mención a ácido
D-pantoténico o ácido pantoténico o pantotenato,
ello no implica sólo el ácido libre, sino también las sales del
ácido D-pantoténico como, por ejemplo, la sal de
calcio, de sodio, de amonio o de potasio.
Es objeto de la invención un procedimiento para
la preparación de ácido D-pantoténico por
fermentación de microorganismos que producen este ácido,
caracterizado porque se usan microorganismos, en los que se
sobreexpresan las secuencias de nucleótidos gen panE que codifican
la cetopantoato-reductasa y eventualmente, en forma
adicional, el gen ilvC.
En el procedimiento se realizan las siguientes
etapas:
- a)
- fermentación de microorganismos seleccionados del grupo de bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, levaduras y hongos, en los que se sobreexpresan al menos las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima cetopantoato-reductasa,
- b)
- concentración del ácido pantoténico en el medio o en las células de los microorganismos,
- c)
- aislamiento del ácido pantoténico.
El término "incremento" describe el aumento
de la actividad intracelular de una o de varias enzimas que son
codificadas por el correspondiente ADN, al elevar el número de
copias del o de los genes, al utilizar un promotor potente o un gen
que codifica una enzima correspondiente con una elevada actividad
específica y, eventualmente, al combinar estas medidas.
Se encontró que, en caso de sobreexpresión del
gen panE junto con los genes panB, panC y panD, se mejora aún más
la formación del ácido pantoténico. Para lograr la sobreexpresión
puede aumentarse el número de copias de los correspondientes genes
por medio de vectores plásmidos como, por ejemplo, pBR322
(Sutcliffe, COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY
1979, 43: 77-90) o pUC19 (Viera, Gene 1982
19:259-268), o puede mutarse la región del promotor
y de la regulación situada más arriba del gen estructural. Un
ejemplo conocido de ello es la mutación lac-UV5 del
promotor lac (Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die
Gentechnologie (Editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990). Del
mismo modo actúan los casetes de expresión que se introducen más
arriba del gen estructural. Este método se usó, por ejemplo, en
LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193
(1993) y en el documento PCT/US97/13359.
De modo alternativo, puede lograrse además una
sobreexpresión de los respectivos genes por modificación de la
composición de los medios y la realización del cultivo. Ejemplo de
ello es la muy conocida regulación de la expresión del operón lac
mediante glucosa y lactosa. Los autores de la invención
descubrieron, además, que la sobreexpresión del gen panE resulta
ventajosa en cepas que presentan mutaciones de resistencia contra
metabolitos y antimetabolitos como, por ejemplo, resistencia contra
L-valina. Además, se halló que la sobreexpresión del
gen panE resulta ventajosa en cepas que poseen mutaciones
defectuosas en genes de vías metabólicas como, por ejemplo, el gen
avtA o ilvE, que convierten los precursores del ácido pantoténico o
disminuyen la formación del ácido pantoténico.
De los microorganismos que son objeto de la
presente invención puede obtenerse ácido pantoténico a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón,
celulosa o a partir de glicerina y etanol. En este caso se trata de
hongos, levaduras o, en especial, de bacterias
Gram-positivas, por ejemplo del género
Corynebacterium, o de bacterias
Gram-negativas como, por ejemplo, las
Enterobacteriaceae. En la familia de las
Enterobacteriaceae debe mencionarse especialmente el género
Escherichia con la especie Escherichia coli. Dentro de
la especie Escherichia coli se incluyen las así llamadas
cepas K-12 como, por ejemplo, las cepas MG1655 o
W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and
Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press,
Washington D.C.)) o la cepa de tipo salvaje IFO3547 de
Escherichia coli (Instituto para la fermentación, Osaka,
Japón) y mutantes derivados de ellas. En el caso del género
Corynebacterium debe nombrase especialmente la especie
Corynebacterium glutamicum, conocida en el mundo científico
por su capacidad de formar aminoácidos. A esta especie pertenecen
cepas de tipo salvaje como, por ejemplo, Corynebacterium
glutamicum, ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067,
Corynebacterium melassecola ATCC17965 y otros.
Para el aislamiento del gen ilvC y del gen panE
se produce en primera instancia un mutante, por ejemplo de
Escherichia coli, que porta una mutación en el gen ilvC y en
el gen panE.
La secuencia de nucleótidos del gen ilvC de
Escherichia coli es conocida (Wek y Hatfield, Journal of
Biological Chemistry 261, 2441-2450 (1986)). También
se conocen métodos para aislar ADN cromosómico (Sambrook et
al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989)). Mediante la elección de cebadores
adecuados puede amplificarse el gen ilvC con ayuda de la reacción en
cadena de la polimerasa (Innis et al., PCR protocols. A guide
to methods and applications, 1990, Academic Press). A continuación,
se lo incluye en un vector plásmido. Como vectores plásmidos se
consideran aquellos que se pueden replicar en los correspondientes
microorganismos. Para Escherichia coli se tienen en cuenta,
por ejemplo, los vectores pSC101 (Vocke y Bastia, Proceedings of the
National Academy of Science USA. 80 (21), 6557-6561
(1983)) o pKK223-3 (Brosius y Holy, Proceedings of
the National Academy of Science USA 81, 6929 (1984)), para
Corynebacterium glutamicum, por ejemplo el vector pJC1
(Cremer et al., Mol. Gen. Genet. 220:478-480
(1990)) o pEKEx2 (Eikmanns et al., Gene
102:93-98 (1991)) o pZ8-1 (Memoria
de Patente Europea 0 375 889) y, para Saccharomyces
cerevisiae, por ejemplo el vector pBB116 (Berse, Gene 25:
109-117 (1983)) o pDG1 (Buxton et al., Gene
37: 207-214 (1985)) para la presente invención.
Métodos para introducir fragmentos de ADN en vectores plásmidos se
describen en Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Métodos para la
transformación y la electroporación se describen en Tauch et
al. (FEMS Microbiology Letters 123:343-347
(1994)). Un ejemplo de una cepa transformada de este tipo es la cepa
MG1655/pFE32 de Escherichia coli. El plásmido pFE32 contiene
el gen ilvC de MG1655 que se introdujo en el vector pBR322. Otro
ejemplo de una cepa transformada de este tipo es la cepa
ATCC13032/pFE91 de Corynebacterium glutamicum. El plásmido
pFE91 contiene el ilvC de ATCC13032 que se introdujo en el vector
pECm3. El plásmido pECm3 es un derivado del plásmido pECm2 (Tauch,
1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-348),
cuyo gen resistente a la canamicina se eliminó mediante una
restricción de BglII y BamHI con posterior religación.
Para introducir una mutación en el gen ilvC que
anule su función, puede introducirse por ejemplo una supresión o
inserción en el mismo. Para generar una supresión, con ayuda de
enzimas de restricción adecuadas y posterior unión de los extremos
resultantes, puede eliminarse una parte interna de la secuencia de
nucleótidos del gen estructural. El gen ilvC mutado de esta forma
carece de función. Del mismo modo puede introducirse un segundo gen
en el gen ilvC que codifica una resistencia a un antibiótico. El gen
ilvC mutado de este modo también carece de función. El gen ilvC
mutado de esa forma puede introducirse a continuación en un
microorganismo y reemplazarse en su cromosoma por el gen de tipo
salvaje. En la bibliografía se conocen métodos para realizar esta
sustitución de genes. Para Escherichia coli puede aplicarse
el método descrito por Hamilton et al. (Journal of
Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), que se basa en
mutantes de replicación del plásmido pSC101 sensibles a la
temperatura. Un plásmido de este tipo es, por ejemplo, pMAK705. Para
Corynebacterium glutamicum puede emplearse el método de
sustitución de genes descrito por Schwarzer y Pühler (BIO/TECHNOLOGY
9, 84-87 (1991)), en el que se utilizan vectores
plásmidos no replicativos. Para Saccharomyces cerevisiae se
describe un método de sustitución dirigida de genes en Roca et
al. (Nucleic Acid Research 20(17),
4671-4672 (1992)).
Un gen ilvC mutado puede prepararse, por ejemplo,
a partir de un gen ilvC de tipo salvaje, de la siguiente manera. El
plásmido pFE32 se compone de pBR322, en cuyo sitio de corte por
restricción BamHI se introdujo el gen ilvC de tipo salvaje. En el
sitio de corte KpnI del gen ilvC de pFE32 se introdujo el gen aacC1
que codifica la resistencia contra el anti-biótico
gentamicina (Schweizer, BioTechniques 15 (5),
831-834 (1993)). El plásmido pFE33 obtenido de este
modo contiene el alelo ilvC::aacC1, que ya no puede formar un
producto funcional del gen ilvC. El alelo ilvC::aacC1 se extrajo del
plásmido pFE33 y se introdujo en el sitio de corte SphI del plásmido
pMAK705, formándose el plásmido pDB1. El plásmido pDB1 es un vector
plásmido capacitado para la sustitución de alelos que, por una
parte, se compone de pMAK705 y, por la otra, del alelo ilvC::aacC1.
El plásmido pDB1 se utilizó según el método descrito por Hamilton
et al., para reemplazar el gen ilvC de tipo salvaje presente
en MG1655 por el alelo ilvC::aacC1. La cepa formada de este modo se
denominó FE4.
Para el aislamiento de un mutante de FE4, que
porta una mutación en el gen panE, se sometió la cepa FE4 a una
mutagénesis del transposón con el transposón Tn5. El transposón Tn5
se describe en Auerswald (COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON
QUANTITATIVE BIOLOGY 45, 107-113 (1981)). El método
de la mutagénesis del transposón se describe, por ejemplo, en el
manual de Miller, A: Short Course in Bacterial Genetics, A
Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and
Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992). El
método se describe, además, en Simon (Gene 80,
161-169 (1998)) y también en el manual de Hagemann:
Gentechnologische Arbeitsmethoden (Editorial Gustav Fischer, 1990) y
muchas otras publicaciones de acceso público. Además, también pueden
producirse mutantes después de la mutagénesis con luz ultravioleta o
después del tratamiento con un producto químico que produce mutación
como, por ejemplo,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
Entre los mutantes así obtenidos pueden aislarse, después de la
verificación de las necesidades de sustancias de crecimiento,
especialmente de la necesidad de ácido pantoténico, aquellos
mutantes que llevan una mutación en un gen de la biosíntesis del
ácido pantoténico. Son de especial interés aquellos mutantes que
requieren ácido pantoténico que, como sustancia de crecimiento, no
pueden elaborar cetopantoato, pero sí pantoato, mutando así en el
gen panE que codifica la cetopantoato-reductasa (EC
1.1.1169). Un ejemplo de ello es la cepa FE5 obtenida de este modo
que, además de la mutación ilvC::aacC1, también porta una mutación
panE::Tn5.
Los microorganismos que portan una mutación
defectuosa en el gen ilvC y panE como, por ejemplo, la cepa FE5 de
Escherichia coli, pueden utilizarse como huéspedes de
clonación para aislar el gen ilvC y el gen panE de especial interés,
o de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas con actividad
de cetopantoato-reductasa.
Para ello, se crea un banco de genes del
microorganismo de interés. La creación de bancos de genes se detalla
en libros de texto y manuales de conocimiento general. Como ejemplo
se citan el manual de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el
Manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un banco de
genes conocido es el de la cepa W3110 de E. coli K12, creado
por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)).
Entretanto, ya pueden adquirirse comercialmente los bancos de genes
de diferentes microorganismos como, por ejemplo, un banco de genes
de la cepa Sp63 de Saccharomyces pombe de la empresa
Stratagene (Heidelberg, Alemania) en el plásmido lambda FIX II
(Elgin, Strategies 4:6-7(1991)), un banco de
genes de la cepa W1485 de Escherichia coli de la empresa
CLONTECH (Heidelberg, Alemania) en el plásmido pGAD10 (Kitts,
CLONTECH (Heidelberg, Alemania) Vectors On Disc versión 1.3, 1994),
cuya secuencia de nucleótidos es accesible bajo el número de acceso
a GenBank U13188. El banco de genes formado de la manera descrita
con anterioridad puede introducirse luego por transformación en el
huésped FE5 anteriormente descrito. Así, a modo de ejemplo, se
introdujo por transformación el banco de genes pGAD10 de W1485 en la
cepa FE5, y se estudiaron los transformantes obtenidos en cuanto a
su capacidad de crecer en un medio nutriente exento de ácido
pantoténico. Las inserciones contenidas en el ADN del plásmido de
los transformantes prototróficos obtenidos del ácido pantoténico
pueden estudiarse por determinación de la secuencia de nucleótidos.
Pueden consultarse métodos para la determinación de secuencias de
nucleótidos, por ejemplo, en Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Science USA 74:5463-5467
(1977)). Pueden asignarse secuencias de nucleótidos a genes mediante
ensayos de homología. La comparación con secuencias de nucleótidos
de los bancos de datos EMBL y GenBank, que puede realizarse mediante
el servicio por correo electrónico BLAST (Altschul, Journal of
Molecular Biology 215, 403-410 (1990)) ofrece una
posibilidad para esta búsqueda de homología. Un ejemplo de un
transformante de este tipo es la cepa FE5/pFEbankl6 de
Escherichia coli que porta el gen panE de la cepa MG1655 de
E. coli.
El gen panE aislado e identificado del modo
descrito puede llevarse luego a expresión en el microorganismo
deseado. Para ello, se amplifica mediante vectores plásmidos. Éstos,
a su vez, pueden estar equipados con estructuras de señales que
procuran una transcripción y traducción eficientes. Una sinopsis de
los vectores de expresión se encuentra, por ejemplo, en el libro de
texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die
Gentechnologie (Editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o en
Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Además, pueden introducirse
en el cromosoma señales de expresión como, por ejemplo, el promotor
tac situado más arriba del gen panE. Métodos de este tipo se
describen en el documento WO 98/04715. El gen panE que debe
expresarse puede extraerse del fragmento de ADN cromosómico clonado
o puede amplificarse nuevamente con ayuda de la reacción en cadena
de la polimerasa. La cantidad de
cetopantoato-reductasa presente en el microorganismo
en cuestión puede determinarse con ayuda del método descrito por
Shimizu et al. (Journal of Biological Chemistry 263:
12077-12084 (1988)). Un ejemplo de una cepa de este
tipo es la cepa MG1655/pFE65 de Escherichia coli. El plásmido
pFE65 se compone del vector pKK223-3, en cuyo sitio
de corte por restricción EcoRI se introdujo el gen panE de
Escherichia coli MG1655.
De acuerdo con la invención resultó ventajoso
realizar la sobreexpresión de uno o varios genes de la biosíntesis
del ácido pantoténico adicionalmente al gen panE que codifica la
cetopantoato-reductasa. Aquí pertenecen los genes
que codifican las enzimas cetopantoatohidroximetiltransferasa (EC
4.1.2.12),
aspartato-1-descarboxilasa (EC
4.1.1.11) y pantotenato-sintetasa (EC 6.3.2.1). En
Escherichia coli, estos genes se denominan panB, panD y panC
(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual
and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1992)). Para ello, los genes pueden
introducirse en diferentes vectores plásmidos compatibles. En
Bartolome et al. (Gene 102, 75-78 (1991)) se
describen ejemplos de ello. Además, puede aumentarse la expresión
del gen por modificación de las estructuras de señales cromosómicas
situadas más arriba. Además, los correspondientes genes pueden
ordenarse sucesivamente bajo el control de un promotor común,
incorporarse en un vector plásmido e introducirse en un
microorganismo adecuado. Un ejemplo de ello es la cepa MG1655/pFE80
de Escherichia coli. El plásmido pFE80 se compone del
plásmido pKK223-3 que contiene los genes panB, panD,
panC y panE en el orden indicado. Situado más arriba del gen panB
está contenido el promotor tac como señal de expresión en pFE80.
Además resultó ventajoso sobreexpresar el gen
panE y la unidad de expresión compuesta por los genes panB, panD,
panC y panE, en cepas hospedantes, que contienen mutaciones
cromosómicas.
Pueden utilizarse mutaciones de forma individual
o conjunta, que provocan resistencias contra productos metabólicos
como, por ejemplo, L-valina o ácido
\alpha-cetoisovaleriánico o contra análogos de
productos metabólicos como, por ejemplo, ácido
\beta-hidroxiaspártico u
O-metiltreonina. Mutantes de este tipo aparecen
espontáneamente o pueden producirse después de la mutagénesis con
luz ultravioleta o después del tratamiento con un producto químico
que provoca la mutación como, por ejemplo,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
y luego seleccionarse en placas de agar que contienen la
correspondiente sustancia. Los procedimientos para provocar la
mutación y para la selección son de conocimiento general y pueden
consultarse, entre otros, en Miller (A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1992)) o en el "Manual of Methods for General Bacteriology" de
la American Society for Bacteriology (Washington D.C., Estados
Unidos). Un ejemplo para un mutante de este tipo es la cepa FE6 de
Escherichia coli, que se aisló como mutante de la cepa MG1655
resistente a L-valina de producción espontánea.
Además, pueden desecharse las reacciones
metabólicas codificadas cromosómicamente que son deliberadamente
desfavorables o interferentes. Para ello se incluyen inserciones o
deleciones en los correspondientes genes y los genes o alelos
mutados de esta manera se introducen en el cromosoma del huésped en
cuestión. Pueden usarse los métodos que se describieron previamente
para la mutación del gen ilvC. Un ejemplo de un mutante de este tipo
es la cepa FE7 de Escherichia coli, que porta una mutación
avtA::aadB en el cromosoma. Aquí se trata de la cepa MG1655, en cuyo
gen avtA se introdujo el gen aadB del plásmido pHP45\omega que
media resistencia contra estreptomicina (Prentki y Krisch, Gene 29,
303-313 (1984)).
En las cepas hospedantes preparadas de este modo
puede entonces sobreexpresarse el gen panE solo o en combinación con
otros genes. Ejemplos de ello son las cepas FE6/pFE80 y
FE7/pFE80.
Los microorganismos preparados según la invención
pueden cultivarse de forma continua o discontinua en el
procedimiento por tandas o de alimentación en tandas o de
alimentación en tandas repetitiva para la producción de ácido
pantoténico. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se describe
en el manual de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o
en el manual de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de
cultivo que debe emplearse debe responder de modo adecuado a los
requerimientos de los respectivos microorganismos. Se hallan
descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos en el
"Manual of Methods for General Bacteriology" de la American
Society for Bacteriology (Washington D.C., Estados Unidos, 1981).
Como fuente de carbono pueden utilizarse azúcares e hidratos de
carbono como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa,
maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas como, por
ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de maní y grasa
de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido
esteárico y ácido linólico, alcoholes como, por ejemplo, glicerina y
etanol, y ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético. Estas
sustancias pueden utilizarse solas o como mezcla. Como fuente de
nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan
nitrógeno tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de
carne, extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja
y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como
mezcla. Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico,
dihidrógeno-fosfato de potasio o
hidrógeno-fosfato dipotásico o las correspondientes
sales con contenido en sodio. El medio de cultivo debe contener,
además, sales metálicas tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio
o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento.
Finalmente, pueden utilizarse sustancias de crecimiento esenciales,
tales como aminoácidos y vitaminas, adicionalmente a las sustancias
antes mencionadas. Al medio de cultivo pueden añadirse, además,
precursores del ácido pantoténico tales como
\beta-alanina o ácido cetopantoico y sus sales.
Las mencionadas sustancias de uso pueden añadirse al cultivo en
forma de una tanda única o suministrarse de modo adecuado durante el
cultivo.
Para el control del pH del cultivo se usan de
forma adecuada compuestos de carácter básico, tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco, o compuestos de carácter
ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar
la producción de espuma pueden utilizarse agentes antiespumantes
tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos o
aceites siliconados. Para mantener la estabilidad de plásmidos
pueden añadirse al medio sustancias adecuadas que actúan de modo
selectivo, por ejemplo antibióticos. A fin de mantener condiciones
aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que
contengan oxígeno tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del
cultivo varía, por lo general, entre 20ºC y 50ºC y, preferentemente,
entre 25ºC y 45ºC. El cultivo se continúa hasta tanto se haya
formado un máximo de ácido pantoténico. Este objeto se logra,
habitualmente, en períodos de 10 horas a 160 horas.
La concentración del ácido pantoténico formado
puede determinarse con procedimientos conocidos (Velisek;
Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)).
Se depositaron los siguientes microorganismos en
la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares
(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen - DSMZ,
Braunschweig, Alemania) según el Tratado de Budapest:
\bullet cepa FE5 de Escherichia coli K12
como DSM12378
\bullet cepa MG1655/pFE32 de Escherichia
coli K12 como DSM12413
\bullet cepa MG1655/pFE65 de Escherichia
coli K12 como DSM12382
\bullet cepa MG1655/pFE80 de Escherichia
coli K12 como DSM12414
\bullet cepa FE6 de Escherichia coli K12
como DSM12379
\bullet cepa FE7 de Escherichia coli K12
como DSM12380
Con el procedimiento según la invención se brinda
al especialista una nueva herramienta para mejorar de manera
dirigida la formación de ácido pantoténico de microorganismos.
La presente invención se explica a continuación
con mayor detalle con ayuda de ejemplos de realización.
A partir de la secuencia de nucleótidos para el
gen ilvC en MG1655 de E. coli K12,
(EMBL-GenBank: nº de acceso M87049) se sintetizaron
cebadores de PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Alemania)). Un fragmento
de ADN de un tamaño de aprox. 1500 pb pudo amplificarse con estos
cebadores mediante el método de PCR estándar de Innis et al.
(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic
Press). El ADN cromosómico de MG1655 de E. coli K12 utilizado
para la PCR se aisló mediante el kit NucleoSpin C + T
(Macherey-Nagel (Düren, Alemania), descripción del
producto NucleoSpin C + T, Art. nº 740952). El tamaño se determinó
por separación electroforética (30 minutos, 10 V/cm) en un gel de
agarosa al 0,8%.
Cebadores de PCR para el gen ilvC de E.
coli:
| ilvC1 | 5'- AGAAGCACAACATCACGAGG-3' |
| ilvC2 | 5'- CTCCAGGAGAAGGCTTGAGT-3' |
El producto de PCR del gen ilvC se transformó en
el plásmido pCR®2.1 y en la cepa TOP10F' de E. coli
(Invitrogen (Leek, Países Bajos), descripción del producto Original
TA Cloning® Kit, Cat. no. KNM2030-01).
El éxito de la clonación se comprobó mediante la
escisión del ADN del plásmido pCR®2.1ilvC con las enzimas de
restricción EagI (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania),
descripción del producto EagI, código nº
27-0885-01), EcoRI (Pharmacia
Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto EcoRI, código
nº 27-0884-03) y KpnI (Pharmacia
Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto KpnI, código
nº 27-0908-01). Para ello se aisló
el ADN del plásmido por medio del kit QIAprep Spin Plasmid (QIAGEN
(Hilden, Alemania), Cat. nº 27106) y se separó después de la
escisión en un gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm).
Para el aislamiento del gen ilvC del plásmido
pCR®2.1ilvC, se escindió el ADN del plásmido aislado con las enzimas
HindIII (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del
producto HindIII, código nº
27-0860-01) y XbaI (Pharmacia
Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto XbaI, código
nº 27-0948-01), se separó la tanda
de escisión en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se
aisló el fragmento de ilvC de 1,5 kpb con ayuda del kit
GLASSMAX®(GIBCO BRL (Eggenstein, Alemania), descripción del producto
GLASSMAX® Spin Cartridges, Cat. nº 15590-052). El
fragmento de ilvC aislado se ligó con el plásmido pMAK705 también
escindido de HindIII y XbaI (Hamilton et al., Journal of
Bacteriology 1989, 171: 4617-4622) mediante ADN
ligasa de T4 (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción
del producto ADN ligasa de T4, código nº
27-0870-03) y la cepa DH5\alphamcr
de E. coli (Grant, Proceedings of the National Academy of
Science 1990, 87: 4645-4649) se sometió a
electroporación con la tanda de ligación (Tauch, FEMS Microbiology
Letters 1994, 123: 343-347). La selección de células
portadoras de plásmido se realizó mediante la extensión en placas de
la tanda de electroporación sobre agar LB (Lennox, Virology 1955, 1:
190), que estaba mezclado con 25 \mug/ml de cloranfenicol (Sigma
(Deisenhofen, Alemania), código nº C 0378) y se incubó durante 24
horas a 30ºC. El plásmido buscado pudo identificarse después del
aislamiento del ADN y la escisión de control con una posterior
electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm), con
las enzimas HindIII, XbaI y KpnI en un clon, y fue denominado
pFE30.
Para el aislamiento del gen ilvC a partir del
plásmido pFE30 se escindió el ADN aislado del plásmido con la enzima
BamHI (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del
producto BamHI, código nº
27-0868-03), se separó la tanda de
escisión en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló
el fragmento de ilvC de 1,5 kpb mediante el kit GLASSMAX®. El
fragmento de ilvC aislado se ligó con el plásmido pBR322 también
escindido de BamHI (Sutcliffe, COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON
QUANTITATIVE BIOLOGY 1979, 43:77-90) mediante ADN de
ligasa T4 y la cepa DH5\alphamcr de E. coli se sometió a
electroporación con la tanda de ligación. La selección de células
portadoras de plásmido se realizó extendiendo en placas la tanda de
electroporación con agar LB, que estaba mezclado con 100 \mug/ml
de ampicilina (Sigma (Deisenhofen, Alemania), código nº A 9518) y se
incubó durante 24 horas a 37ºC. Se inocularon las colonias obtenidas
paralelamente a LB + agar con ampicilina y LB + (5 \mug/ml)
tetraciclina (Sigma (Deisenhofen, Alemania), código nº T3383). Se
aisló el ADN de colonias sensibles a la tetraciclina mediante el kit
QIAprep Spin Plasmid y se verificó el éxito de la clonación mediante
una escisión de BamHI y KpnI y posterior separación en gel de
agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm). El plásmido construido fue
denominado pFE32.
En el sitio de corte KpnI del plásmido pFE32 se
clonó un gen aacC1 y el plásmido obtenido se denominó pFE33. El gen
aacC1 se aisló para ello a partir de un gel de agarosa (30 minutos,
10 V/cm), en el que se separó una tanda de restricción de KpnI del
plásmido pMS255 (Becker, Gene 1995, 162: 37-39). La
ligación se realizó con ADN ligasa de T4. Después de electroporar la
tanda de ligación en la cepa DH5\alphamcr se seleccionaron los
transformantes en agar PA (Sambrook, Molecular cloning, 2ª edición,
Cold Spring Harbor, 1989), que estaba mezclado con 10 ug/ml de
gentamicina (Sigma (Deisenhofen, Alemania), código nº G3632). Se
aisló el ADN de colonias resistentes a gentamicina mediante el kit
QIAprep Spin Plasmid y se verificó el éxito de la clonación mediante
una escisión de BamHI y KpnI y posterior separación en gel de
agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm).
El fragmento de ilvC::aacC1 se escindió del
plásmido pFE33 por medio de restricción de SphI (Pharmacia Biotech
(Freiburg, Alemania), descripción del producto SphI, código nº
27-0951-01), se separó en gel de
agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló con el kit
GLASSMAX®. El fragmento se ligó con el plásmido pMAK705 escindido de
SphI mediante ADN ligasa de T4, se sometió a electroporación la
tanda de ligación en la cepa DH5\alphamcr y se seleccionaron
transformantes por incubación en PA+agar con gentamicina durante 24
horas a 30ºC. Se aisló el ADN de colonias resistentes a gentamicina
mediante el kit QIAprep Spin Plasmid Kit y se verificó el éxito de
la clonación mediante una escisión de SphI y EcoRI y posterior
separación en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm). El
plásmido construido fue denominado pDB1.
Con ayuda del plásmido pDB1 se reemplazó en la
cepa MG1655 de E. coli K12 el gen ilvC cromosómico por el
fragmento de ilvC::aacC1 interrumpido. Para el reemplazo de genes se
utilizó un método modificado según Hamilton et al. El
plásmido pDB1 se introdujo mediante electroporación en la cepa
MG1655 de E. coli K12 y luego se incubaron los transformantes
para la selección de cointegrados a 42ºC durante 24 horas en agar
LB-cloranfenicol. Las colonias obtenidas se
aplicaron para su individualización nuevamente sobre el mismo medio
y se incubaron a 42ºC durante 24 horas. Para la desintegración del
plásmido se incubaron colonias individuales en 5 ml de medio líquido
LB a 42ºC durante 24 horas, y a continuación se extendió en placas
una serie de diluciones del medio líquido en agar
LB-cloranfenicol. Este serie de diluciones se incubó
a 30ºC durante 24 horas. Para la curación del plásmido se aplicaron
colonias individuales obtenidas de la serie de diluciones en 3
aplicaciones sucesivas de colonias individuales en agar LB a 42ºC en
cada caso durante 24 horas. Para el control del fenotipo se
inocularon las colonias individuales obtenidas paralelamente sobre
placas de agar con los siguientes medios: medio E (Vogel, Journal of
Biological Chemistry 1956, 218: 97-106) + glucosa
(0,4%), medio E + glucosa (0,4%) (Sigma (Deisenhofen, Alemania),
código nº G8270)+ 50 \mug/ml de isoleucina (Sigma (Deisenhofen,
Alemania), código nº I7268), medio E + glucosa (0,4%) + 50 \mug de
cetoisovalerato (ICN (Eschwege, Alemania), código nº 151395), medio
E + glucosa (0,4%) + 50 \mug/ml de isoleucina + 50 \mug de
cetoisovalerato, medio PA + gentamicina y medio LB + cloranfenicol.
Estos medios se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Entre 150
colonias individuales ensayadas se encontró una cuyo fenotipo indicó
la sustitución del gen ilvC cromosómico por el fragmento de
ilvC::aacC1. Esta cepa fue denominada FE4.
La cepa FE4 se cultivó en 5 ml de medio líquido
LB + MgSO_{4} 10 mM + maltosa al 0,2% (Sigma (Deisenhofen,
Alemania), código nº M5885) (LBMgMal) a 37ºC hasta una densidad
óptica de 0,5. La medición de la densidad óptica se realizó con un
fotómetro Novaspec II de Pharmacia (Freiburg, Alemania) a una
longitud de onda de 660 nm. Se separaron por centrifugación 2 ml de
la solución bacteriana durante 5 min a 3000 rpm (centrífuga Beckmann
Modelo J2-21, rotor JA-17). Después
de recoger el sedimento con 0,5 ml de medio líquido LBMgMal se
mezcló la suspensión con 30 \mul de lisado de \lambda::Tn5
(Simon, Gene 1989, 80(1):161-169), aprox.
10^{8} bacteriófagos. Este lisado se aisló de la cepa C600 de
E. coli K12 (Appleyard, Genetics 1954,
39:440-452) según el método de Hagemann
(Gentechnologische Arbeitsmethoden, Editorial Gustav Fischer, 1990:
14-18). La suspensión con el lisado de
\lambda::Tn5 se incubó durante 45 minutos a 30ºC. Después de
separar por centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos, se recogió
el sedimento en 10 ml de PA + pirofosfato 10 mM y se incubó durante
3 horas a 37ºC. La solución bacteriana se aplicó como serie de
diluciones sobre una placa con medio E-agar +
glucosa (0,4%) + 25 \mug/ml de canamicina + 50 \mug/ml de
isoleucina + 50 \mug/ml de cetoisovalerato + 50 \mug/ml de
pantotenato y se incubó a 37ºC durante 48 horas. De forma paralela
se inocularon colonias individuales en medio E-agar
+ glucosa (0,4%) + 25 \mug/ml de canamicina + 50 \mug/ml de
isoleucina + 50 \mug/ml de cetoisovalerato + 50 \mug/ml de
pantotenato y en medio E-agar + glucosa (0,4%) + 25
\mug/ml de canamicina + 50 \mug/ml de isoleucina + 50 \mug/ml
de cetoisovalerato y se incubó a 37ºC durante 48 horas. Entre 14000
colonias individuales inoculadas pudo identificarse una, denominada
FE5, que se desarrolló en medio E-agar + glucosa
(0,4%) + 25 \mug/ml de canamicina + 50 \mug/ml de isoleucina +
50 \mug/ml de cetoisovalerato + 50 \mug/ml de pantotenato, pero
en el medio E-agar + glucosa (0,4%) + 25 \mug/ml
de canamicina + 50 \mug/ml de isoleucina + 50 \mug/ml de
cetoisovalerato.
Juntamente con las cepas SJ2 de E. coli
(Jakowski, Genetic Stock Center, Universidad de Yale), que porta una
mutación en el gen panB, MW6 (Williams, Genetic Stock Center,
Universidad de Yale), que porta una mutación en el gen panC, y DV9
(Vallari, Journal of Bacteriology 1985,
164:136-142), que porta una mutación en el gen panD,
así como un tipo salvaje, se aplicaron las cepas FE4 y FE5 sobre
placas con medios de base suplementados de modo diferente (medios
E-agar + glucosa (0,4%) + 50 \mug/ml de isoleucina
+ 50 \mug/ml de cetoisovalerato; en el caso de SJ2, DV9 y MW6,
adicionalmente 50 \mug/ml de tiamina), y se incubaron a 37ºC
durante 48 horas. Como suplementos adicionales se utilizaron
pantotenato (sal de calcio), cetopantoato (sal de sodio),
\beta-alanina (Sigma (Deisenhofen, Alemania),
código nº A7752) y pantoato (sal de potasio). El cetopantoato se
preparó a partir de cetopantolactona por tratamiento con cantidades
equimolares de NaOH a 60ºC y posterior concentración por
evaporación. Se sintetizó la cetopantolactona según Ojima et
al. (Organic Synthesis 63, 18 (1985)). Se obtuvo pantoato a
partir de pantoil-lactona (Sigma (Deisenhofen,
Alemania), código nº P2625) según el método de Primerano y Burns
(Journal of Bacteriology 1983, 153: 259-269). El
resultado del ensayo de crecimiento (Tabla 1) mostró que la cepa FE4
se desarrolló de forma diferente en todos los medios de base
suplementados. La cepa FE5 sólo se desarrolló en medios que estaban
suplementados con pantotenato o pantoato, pero no en medios de base
que estaban mezclados con cetopantoato.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En la cepa FE5 se insertó por electroporación la
W1485 de E. coli K12 MATCHMAKER Genomic Library (CLONTECH
(Heidelberg, Alemania), Cat. nº XL4001AB). La E. coli K12
MATCHMAKER Genomic Library contiene el ADN cromosómico de W1485 de
E. coli K12 como inserciones de un tamaño promedio de 1,0 kpb
en el plásmido pGAD10, variando aquí el tamaño de las distintas
inserciones entre 0,5 - 3,0 kpb (CLONTECH (Heidelberg, Alemania)).
La selección de los transformantes se efectuó mediante la aplicación
en placas con medio E-agar + glucosa (0,4%) + 100
\mug/ml de ampicilina + 50 \mug/ml de isoleucina + 50 \mug/ml
de cetoisovalerato. De 20 colonias obtenidas se aisló el ADN del
plásmido mediante el kit QIAprep Spin Plasmid. Mediante una escisión
de EcoRI del ADN del plásmido y posterior separación en gel de
agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm) se mostró que, en el caso de
los plásmidos, se trataba de 20 vectores pGAD10 con inserciones de
diferente tamaño. De la secuenciación (IIT Biotech (Bielefeld,
Alemania)) de las inserciones resultó, por comparaciones de
homología con el programa BLAST (Alt-schul, Journal
of Molecular Biology 1990, 215: 403-410), que las
inserciones en 7 casos contenían un gen ilvC completo y en 13 casos
un marco de lectura abierto, que fue denominado "similar a
Salmonella typhimurium apbA" (EMBLGenBank: nº de acceso
U82664). Este marco de lectura abierto se denominó panE.
Para la sobreexpresión del gen ilvC se utilizó el
plásmido pFE32 (véase el Ejemplo 1). La región de codificación del
gen ilvC en el plásmido pFE32 está bajo el control del promotor tet
codificado por el plásmido pBR322. El plásmido pFE32 se electroporó
en la cepa MG1655 de E. coli K12 y se seleccionaron
transformantes en agar LB, que estaba mezclado con 100 \mug/ml de
ampicilina, después de una posterior incubación durante 24 horas a
37ºC. La cepa obtenida fue denominada MG1655/pFE32.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos para el
gen panE en MG1655 de E. coli K12 se sintetizaron cebadores
de PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Alemania)). Un fragmento de ADN de
un tamaño aprox. de 1000 pb pudo amplificarse con estos cebadores
mediante el método PCR estándar a partir de ADN cromosómico de
MG1655 de E. coli K12. El ADN cromosómico de MG1655 de E.
coli K12 utilizado para la PCR se aisló mediante el kit
NucleoSpin C + T. El tamaño se determinó mediante separación por
electroforesis en gel (30 minutos, 10 V/cm) en un gel de agarosa al
0,8%.
Cebadores de PCR para el gen panE de E.
coli:
| panE1 | 5'- AGGAGGACAATGAAAATTAC-3' |
| panE2 | 5'- TCAGTCTCTTCACTACCAGG-3' |
El producto de PCR del gen panE se transformó en
el plásmido pCR®2.1 y en la cepa TOP1OF' de E. coli
(Invitrogen (Leek, Países Bajos), descripción del producto
Original TA Cloning® Kit, Cat. nº KNM2030-01). Se
verificó el éxito de la clonación mediante escisión del ADN del
plásmido pCR®2.1panE con las enzimas de restricción EcoRI e HincII
(Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto
HincII, código nº 27-0858-01). Para
ello se aisló el ADN del plásmido mediante el kit QIAprep Spin
Plasmid y se separó después de la escisión en un gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm).
Para el aislamiento del gen panE a partir del
plásmido pCR®2.1panE se escindió el ADN aislado del plásmido con la
enzima EcoRI, se separó la tanda de escisión en gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló el fragmento panE de 1,0 kpb
con ayuda del kit GLASSMAX®. El fragmento panE aislado se ligó con
el plásmido pKK223-3 también escindido de EcoRI
mediante ADN ligasa de T4 y la cepa DH5\alphamcr de E. coli
se sometió a electroporación con la tanda de ligación. La selección
de células portadoras de plásmido se efectuó extendiendo la tanda de
electroporación en una placa de agar LB, que estaba mezclado con 100
\mug/ml de ampicilina, y posterior incubación durante 24 horas a
37ºC. El plásmido buscado pudo identificarse después del aislamiento
del ADN y la escisión de control, con posterior electroforesis en un
gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm), con las enzimas EcoRI
e HincII en un clon, denominándose pFE65.
La región de codificación del gen panE se
encuentra en el plásmido pFE65 bajo el control del promotor tac
codificado por el plásmido pKK223-3. El plásmido
pFE65 se insertó por electroporación en la cepa MG1655 de E.
coli K12 y se seleccionaron transformantes en agar LB, que
estaba mezclado con 100 \mug/ml de ampicilina, y posterior
incubación durante 24 horas a 37ºC. La cepa obtenida fue denominada
MG1655/pFE65 de E. coli K12.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos para el
gen panB, el gen panC y el gen panD en MG1655 de E. coli K12
(EMBL-GenBank: nº de acceso L17086) se sintetizaron
cebadores de PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Alemania)). Con los
cebadores de panB pudo amplificarse un fragmento de ADN de aprox.
800 pb de tamaño, con los cebadores de panD, un fragmento de ADN de
aprox. 400 pb de tamaño mediante el método de PCR estándar a partir
de ADN cromosómico de MG1655 de E. coli K12. Con los
cebadores de panC pudo amplificarse un fragmento de ADN de aprox.
850 pb de tamaño mediante un método de PCR modificado a partir de
ADN de MG1655 de E. coli K12. La polimerasa Taq fue
reemplazada por la polimerasa Pfu y se modificaron
correspondientemente las condiciones de tampón en la preparación de
PCR (STRATAGENE (Heidelberg, Alemania), descripción del producto
Pfu-Polymerase, código nº 600135). El ADN
cromosómico de MG1655 de E. coli K12 utilizado para la PCR se
aisló mediante el kit NucleoSpin C + T. Se determinó el tamaño de
todas las amplificaciones a través de la separación por
electroforesis en gel (30 minutos, 10 V/cm) en un gel de agarosa al
0,8%.
Cebadores de PCR para el gen panB de E.
coli:
| panB1 | 5'- AGGATACGTTATGAAACCGA-3' |
| panB2 | 5'- ACAACGTGACTCCTTAATGG-3' |
Cebadores de PCR para el gen panC de E.
coli:
| panC1 | 5'- AGGAGTCACGTTGTGTTAAT-3' |
| panC2 | 5'- AAGTATTACGCCAGCTCGAC-3' |
Cebadores de PCR para el gen panD de E.
coli:
| panD1 | 5'- AGGTAGAAGTTATGATTCGC-3' |
| panD2 | 5'- TAACAATCAAGCAACCTGTA-3' |
El producto de PCR del gen panB se transformó en
el plásmido pCR®2.1 y en la cepa TOP10F' de E. coli
(Invitrogen (Leek, Países Bajos)). El éxito de la clo nación del
producto de PCR de panB se verificó por escisión del ADN del
plásmido pCR®2.1panB con las enzimas de restricción EcoRI, EcoRV
(Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto
EcoRV, código nº 27-0934-01) y PvuII
(Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del producto
PvuII, código nº 27-0960-01). Para
ello, se aisló el ADN del plásmido por medio del kit QIAprep Spin
Plasmid y se separó después de la escisión en un gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm). El producto de PCR del gen
panD se transformó en el plásmido pCR®2.1 y en la cepa TOP10F' de
E. coli (Invitrogen (Leek, Países Bajos)). El éxito de la
clonación del producto de PCR de panD se verificó después de la
escisión del ADN del plásmido pCR®2.1panD con las enzimas de
restricción EcoRI, EcoRV e HincII. Para ello, se aisló el ADN del
plásmido por medio del kit QIAprep Spin Plasmid y se separó después
de la escisión en un gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm).
El producto de PCR del gen panC se insertó por electroporación en
el plásmido pUC19 (Viera, Gene 1982 19:259-268) y en
la cepa DH5\alphamcr de E. coli. El éxito de la clonación
del producto de PCR de panC se verificó por escisión del ADN del
plásmido pUCl9panC con las enzimas de restricción EcoRI, HindIII y
SalI (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania), descripción del
producto SalI, código nº
27-0882-01). Para ello, se aisló el
ADN del plásmido por medio del kit QIAprep Spin Plasmid y se separó
después de la escisión en un gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10
V/cm). El plásmido construido fue denominado pFE60.
Para el aislamiento del gen panB a partir del
plásmido pCR®2.1panB se escindió el ADN aislado del plásmido con la
enzima EcoRI, se separó la tanda de escisión en gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló el fragmento panB de 800 pb de
tamaño con ayuda del kit GLASSMAX®. El fragmento panB aislado se
ligó con el plásmido pKK223-3 también escindido de
EcoRI mediante ADN ligasa de T4 y la cepa DH5\alphamcr de E.
coli se sometió a electroporación con la tanda de ligación. La
selección de células portadoras de plásmido se efectuó mediante
extensión de la tanda de electroporación en placas de agar LB, que
estaba mezclado con 100 \mug/ml de ampicilina, y posterior
incubación durante 24 horas a 37ºC. El plásmido buscado pudo
identificarse después del aislamiento de ADN y escisión del control,
con posterior electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos,
10 V/cm), con las enzimas de restricción EcoRI, EcoRV y PvuII en un
clon, denominándose pFE40. La región de codificación del gen panB se
encuentra en el plásmido pFE40 bajo el control del promotor tac
codificado por el plásmido pKK223-3.
Para el aislamiento del gen panD a partir del
plásmido pCR®2.1panD se escindió el ADN aislado del plásmido con la
enzima EcoRI, la tanda de escisión se separó en gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se asiló el fragmento panD de 400 pb de
tamaño con ayuda del kit GLASSMAX®. El fragmento panD aislado se
ligó con el plásmido pKK223-3 también escindido de
EcoRI, mediante ADN ligasa de T4 y la cepa DH5\alphamcr de E.
coli se sometió a electroporación con la tanda de ligación. La
selección de células portadoras de plásmido se realizó mediante la
extensión de la tanda de electroporación en placas de agar LB, que
estaba mezclado con 100 \mug/ml de ampicilina, y posterior
incubación durante 24 horas a 37ºC. El plásmido buscado pudo
identificarse después del aislamiento del ADN y escisión del
control, con posterior electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30
minutos, 10 V/cm), con las enzimas EcoRI, EcoRV e HincII en un
clon, denominándose pFE50. La región de codificación del gen panD se
encuentra en el plásmido pFE50 bajo el control del promotor tac
codificado por el plásmido pKK223-3.
El gen panC se aisló mediante una escisión de
HindIII-SmaI (Pharmacia Biotech (Freiburg,
Alemania), descripción del producto SmaI, código nº
27-0942-01) del plásmido pFE60, para
ello se separó la tanda de escisión en gel de agarosa al 0,8% (30
minutos, 10 V/cm) y se aisló el fragmento panC de 850 pb de tamaño
con ayuda del kit GLASSMAX®. El fragmento panC aislado se ligó con
el plásmido pFE50 también escindido de HindIII y SmaI, mediante ADN
ligasa de T4 y la cepa DH5\alphamcr de E. coli se sometió a
electroporación con la tanda de ligación. La selección de células
portadoras de plásmido se realizó mediante la extensión de la tanda
de electroporación en placas de agar LB, que estaba mezclado con 100
\mug/ml de ampicilina, y posterior incubación durante 24
horas a 37ºC. El plásmido buscado puedo identificarse después del
aislamiento del ADN y escisión del control, con posterior
electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm), con
las enzimas EcoRI, EcoRV, SmaI, HindIII e HincII en un clon,
denominándose pFE52. La región de codificación del gen panD y del
gen panC se encuentra en el plásmido pFE52 bajo el control del
promotor tac codificado por el plásmido pKK223-3 y
forman un operón.
En el sitio de corte EcoRI del plásmido pFE52 que
sigue al promotor tac se clonó el gen panB, denominándose el
plásmido obtenido pFE70. Para ello, el gen panB se aisló en un gel
de agarosa (30 minutos, 10 V/cm), en el que se separó una tanda de
restricción de EcoRI del plásmido pFE40. La ligación se efectuó con
ADN ligasa de T4. Después de la electroporación de la tanda de
ligación en la cepa SJ2, se seleccionaron los transformantes en
medio E-agar, que estaba mezclado con 0,4% de
glucosa, 100 \mug/ml de tiamina y 100 \mug/ml de ampicilina. Se
aisló ADN de colonias resistentes a ampicilina por medio del kit
QIAprep Spin Plasmid y se verificó el éxito de la clonación
mediante una escisión de EcoRI, EcoRV, SmaI, HindIII e HincII y
posterior separación en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10
V/cm). La región de codificación del gen panB, del gen panD y del
gen panC se encuentra en el plásmido pFE70 bajo el control del
promotor tac codificado por el plásmido pKK223-3 y
forman un operón.
El gen panE se aisló mediante una escisión de
HindIII-SphI (Pharmacia Biotech (Freiburg,
Alemania), descripción del producto SphI, código nº
27-0951-01) del plásmido pFE65, para
ello se separó la tanda de escisión en gel de agarosa al 0,8% (30
minutos, 10 V/cm) y se aisló el fragmento panE con ayuda del kit
GLASSMAX®. El fragmento panE aislado se ligó con el plásmido pFE70
también escindido de HindIII y parcialmente escindido de SphI,
mediante ADN ligasa de T4 y la cepa FE5 se sometió a electroporación
con la tanda de ligación. La selección de células portadoras de
plásmido se realizó mediante la extensión de la tanda de
electroporación en medios E-agar + glucosa (0,4%) +
50 \mug/ml de isoleucina + 50 \mug/ml de cetoisovalerato, que
estaba mezclado con 100 \mug/ml de ampicilina y posterior
incubación durante 48 horas a 37ºC. El plásmido pudo identificarse
después del aislamiento del ADN y escisión del control, con
posterior electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10
V/cm), con las enzimas EcoRI, EcoRV, SphI, HindIII e HincII en un
clon y se denominó pFE80. La región de codificación del gen panB,
del gen panD, del gen panC y del gen panE se encuentran en el
plásmido pFE80 bajo el control del promotor tac codificado por el
plásmido pKK223-3 y forman un operón.
El plásmido pFE80 se sometió a electroporación en
la cepa MG1655 de E. coli K12 y se seleccionaron
transformantes en agar LB, que estaba mezclado con 100 \mug/ml de
ampicilina, y posterior incubación durante 24 horas a 37ºC. La cepa
obtenida fue denominada MG1655/pFE80.
La cepa MG1655 de E. coli K12 se aplicó
sobre una placa con el medio E-agar, que estaba
mezclado con 0,4% de glucosa y 100 \mug/ml de valina (Sigma
(Deisenhofen, Alemania), V0258). Al cabo de 48 horas de incubación a
37ºC se pudo aislar una colonia. Esta cepa fue denominada FE6. El
plásmido pFE80 se insertó por electroporación en la cepa FE6 y se
seleccionaron transformantes en agar LB, que estaba mezclado con 100
\mug/ml de ampicilina, y posterior incubación durante 24 horas a
37ºC. La cepa obtenida fue denominada FE6/pFE80.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos para el
gen avtA (EMBL-GenBank: nº de acceso Y00490) en
MG1655 de E. coli K12, se sintetizaron cebadores de PCR (MWG
Biotech (Ebersberg, Alemania)). Pudo amplificarse un fragmento de
ADN de aprox. 1,6 kpb de tamaño con estos cebadores mediante el
método de PCR estándar a partir del ADN cromosómico de MG1655 de
E. coli K12. El tamaño se determinó mediante separación por
electroforesis en gel (30 minutos, 10 V/cm) en un gel de agarosa al
0,8%.
Cebadores de PCR para el gen avtA de E.
coli:
| avtA1 | 5'- TGCTCTCTCTCAACGCCGAA-3' |
| avtA2 | 5'- GAAGCCGCCAACCAGGATAA-3' |
El producto de PCR del gen avtA se transformó en
el plásmido pCR®2.1 y en la cepa TOP10F' de E. coli
(Invitrogen (Leek, Países Bajos)). El éxito de la clonación se
comprobó mediante escisión del ADN del plásmido pCR®2.1avtA con las
enzimas de restricción EcoRI y SmaI. Para ello, se aisló el ADN del
plásmido por medio del kit QIAprep Spin Plasmid y se separó después
de escisión en un gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm). En
el sitio de corte SmaI del plásmido pCR®2.1avtA se clonó un gen aadB
y el plásmido obtenido se denominó pFE23. Para ello, se aisló el gen
aadB de un gel de agarosa (30 minutos, 10 V/cm), en el que se separó
una tanda de restricción de SmaI del plásmido pHP45\Omega
(EMBL-GenBank: nº de acceso K02163). La ligación se
efectuó con ADN ligasa de T4. Después de la electroporación de la
tanda de ligación en la cepa DH5\alphamcr, se seleccionaron los
transformantes en PA-agar, que estaba mezclado con
20 \mug/ml de estreptomicina (Sigma (Deisenhofen, Alemania),
código nº S6501). Se aisló el ADN de colonias resistentes a
estreptomicina por medio del kit QIAprep Spin Plasmid y se comprobó
el éxito de la clonación mediante una escisión de EcoRI y SphI y
posterior separación en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10
V/cm).
El fragmento avtA::aadB se escindió del plásmido
pFE23 mediante restricción de EcoRI, se separó en gel de agarosa al
0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló con el kit GLASSMAX®. El
fragmento se ligó con el plásmido pMAK705 escindido parcialmente de
EcoRI, mediante ADN ligasa de T4, la tanda de ligación se insertó
por electroporación en la cepa DH5\alphamcr y se seleccionaron
transformantes mediante incubación en agar LB + 20 \mug/ml de
estreptomicina + 25 \mug/ml de cloranfenicol durante 24 horas a
30ºC. Se aisló el ADN de colonias resistentes a estreptomicina y
cloranfenicol por medio del kit QIAprep Spin Plasmid y se comprobó
el éxito de la clonación mediante una escisión de SphI y EcoRI en
gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm). El plásmido construido
fue denominado pFE24.
Con ayuda del plásmido pFE24 se sustituyó en la
cepa MG1655 de E. coli K12 el gen avtA cromosómico por el
alelo avtA::aadB. Para la sustitución de genes de aplicó un método
modificado según Hamilton et al. El plásmido pFE24 se insertó
por electroporación en la cepa MG1655 de E. coli K12,
posteriormente se incubaron los transformantes para su selección en
cointegrados en agar LB - cloranfenicol a 42ºC durante 24 horas. Las
colonias obtenidas se aplicaron nuevamente para su individualización
sobre el mismo medio y se incubaron a 42ºC durante 24 horas. Para la
desintegración del plásmido se incubaron colonias individuales en 5
ml de medio líquido LB a 42ºC durante 24 horas, y luego se extendió
una serie de diluciones del medio líquido en placas de agar LB con
cloranfenicol. Esta serie de diluciones se incubó a 30ºC durante 24
horas. Para la curación del plásmido se cultivaron colonias
individuales obtenidas de la serie de diluciones en 3 aplicaciones
sucesivas de colonias individuales sobre agar LB a 42ºC en cada caso
durante 24 horas.
Para el control del fenotipo se inocularon
paralelamente las colonias individuales obtenidas en placas de agar
con medio LB + 20 \mug/ml de estreptomicina y medio LB + 25
\mug/ml de cloranfenicol. Estos medios se incubaron durante 48
horas a 37ºC. Entre 250 colonias individuales ensayadas se encontró
una, cuyo fenotipo indicaba el reemplazo del gen avtA cromosómico
por el fragmento avtA::aadB. Esta cepa fue denominada FE7.
El plásmido pFE80 se insertó por electroporación
en la cepa FE7 y se seleccionaron transformadores en agar LB, que
estaba mezclado con 100 \mug/ml de ampicilina, y posterior
incubación durante 24 horas a 37ºC. La cepa obtenida se denominó
FE7/pFE80.
La actividad específica de la
cetopantoato-reductasa se determinó según el método
descrito en Shimizu et al. (Journal of Biological Chemistry
263: 12077-12084 (1988)). Para ello, se obtuvieron
extractos de células de las distintas cepas mediante un dispositivo
Hybaid RiboLyser (Heidelberg, Alemania) y del equipo RiboLyser Kit
Blue. La actividad de la cetopantoato-reductasa de
los extractos se determinó mediante el consumo de NADPH al añadir
cetopantoato. Para la cepa MG1655 de E. coli K12 se determinó
una actividad específica de la
cetopantoato-reductasa de 6,5 mU/mg, para la cepa
MG1655/pFE65 de E. coli K12, una actividad de 22,0 mU/mg. En
el caso de la cepa FE5 no pudo medirse actividad alguna.
Se ensayó la formación de pantotenato por las
cepas MG1655, MG1655/pFE32, MG1655/pFE65, MG1655/pFE80, FE6/pFE80 y
FE7/pFE80 en cultivos por lotes. Como medio de cultivo se utilizó el
medio E con glucosa (0,4%) como fuente de carbono, descrito por
Vogel (Journal of Biological Chemistry 1956, 218:
97-106). La composición del medio utilizado está
representado en la Tabla 2.
| Compuesto | Concentración |
| MnSO_{4} * 7H_{2}O | 0,2 g/l |
| Monohidrato de ácido cítrico | 2,0 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 10,0 g/l |
| NaNH_{4}HPO_{4} * H_{2}O | 3,5 g/l |
Se llenaron matraces Erlenmeyer de 250 ml con 25
ml del medio nutritivo indicado y se inoculó la tanda. Al cabo de un
tiempo de incubación de 48 horas a 37ºC, se determinaron la densidad
óptica y la concentración de pantotenato. Para la determinación de
la densidad celular se utilizó la densidad óptica con un fotómetro
Novaspec II Photometer de la empresa Pharmacia (Freiburg, Alemania)
a una longitud de onda de medición de 580 nm. Se determinó el
contenido de pantotenato en el sobrenadante de cultivo filtrado de
modo estéril. La determinación de pantotenato (como sal de calcio)
se realizó con ayuda de la cepa Lactobacillus plantarum ATCC®
8014 según las instrucciones del manual "DIFCO MANUAL" de la
empresa DIFCO (Michigan, Estados Unidos; 10ª Edición,
1100-1102 (1984)). El resultado se resume en la
Tabla 3.
La formación de pantotenato por las cepas MG1655,
MG1655/pFE32, MG1655/pFE65 al añadir cetopantoato se verificó en el
cultivo por lotes. Para ello, el medio descrito en el Ejemplo 8 se
suplementó con 50 \mug/ml de cetopantoato. Las demás condiciones
de ensayo son como las indicadas en el Ejemplo 8. El resultado se
resume en la Tabla 4.
Se aisló ADN cromosómico de C. glutamicum
ATCC 13032 tal como se describió en Tauch et al. (Plasmid,
33:168-179, 1995) y se escindió parcialmente con la
enzima de restricción Sau3A (Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania),
descripción del producto Sau3A, código nº
27-0913-02). Se aislaron fragmentos
de ADN en un intervalo de tamaño de 7-9 kb con ayuda
del kit "Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids" (Macherey
y Nagel, Düren, Alemania; Cat. Nº 740584) y se ligó en el sitio de
corte BamHI desfosforilado del vector pUC19 (Viera et al.,
1982, Gene, 19:259-268; MBI Fermentas, Lituania). La
ligación se realizó tal como se describió por Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor),
incubándose la mezcla de ADN con T4-Ligase
(Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) durante la noche. Esta
mezcla de ligación se insertó a continuación por electroporación
(Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters,
123:343-348) en la cepa DH5aMCR de E. coli
(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences
U.S.A., 87:4645-4649) y se extendió en placas de
agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 mg/ml de ampicilina.
Al cabo de la incubación durante 24 h a 37ºC pudo obtenerse el banco
de genes de C. glutamicum mediante el reaislamiento del ADN
del plásmido según el "método de lisis alcalina" de Birnboim y
Doly (1997, Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523) a
partir de los transformantes. Con este banco de genes se sometieron
a electroporación células competentes de la cepa FE5 de E.
coli, que es portadora de mutaciones en el gen panE e ilvC. La
tanda de electroporación se lavó a continuación de la fase de
regeneración (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological
Letters, 123:343-347) dos veces con medio E (Vogel y
Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry,
218:97-106). La selección de los transformantes se
realizó mediante extensión en placas de medio E-agar
+ glucosa (0,4%) + 100 \mug/ml de ampicilina + 50 \mug/ml de
isoleucina + 50 \mug/ml de cetoisovalerato. De 4 colonias
obtenidas se aisló el ADN del plásmido con ayuda del kit QIAprep
Spin Plasmid. Mediante una escisión de XbaI del ADN del plásmido y
posterior separación en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm)
se demostró que en el caso de los plásmidos se trataba de vectores
pUC19 con inserciones de aprox. 6,5 kpb de tamaño. De la
secuenciación de las inserciones con posteriores comparaciones de
homología con ayuda del programa BLAST (Altschul, Journal of
Molecular Biology 1990, 215: 403-410) resultó que
las inserciones en todos los casos contenían un gen ilvC completo de
C. glutamicum (EMBL-GenBank: nº de acceso
L09232). Uno de estos plásmidos fue denominado pFE90.
Para la expresión del gen ilvC de C.
glutamicum en C. glutamicum ATCC13032 se utilizó el
plásmido pECm3. El plásmido pECm3 es un derivado del plásmido pECm2
(Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters,
123:343-348), cuyo gen de resistencia a canamicina
se eliminó mediante una restricción de BglII (Pharmacia Biotech
(Freiburg, Alemania), descripción del producto BglII, código nº
27-0946-02) y una restricción de
BamHI con posterior religación. Los plásmidos pECm2, así como pECm3,
están en condiciones de replicarse tanto en E. coli, como
también en C. glutamicum. Para el aislamiento del gen ilvC a
partir del plásmido pFE90 (Ejemplo 11) se escindió el ADN aislado
del plásmido con la enzima XbaI (Pharmacia Biotech (Freiburg,
Alemania), descripción del producto XbaI, código nº
27-0948-01), se separó la tanda de
escisión en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm) y se aisló
el fragmento de ilvC de 6,5 kpb con ayuda del kit GLASSMAX®. El
fragmento de ilvC aislado se ligó con el plásmido pECm3 también
escindido de XbaI mediante ADN ligasa de T4 y la cepa FE5 de E.
coli se sometió a electroporación con la tanda de ligación. La
selección de células portadoras de plásmido se realizó extendiendo
la tanda de electroporación en placas de agar LB, que estaba
mezclado con 50 \mug/ml de cloranfenicol, y posterior incubación
durante 24 horas a 37ºC. El plásmido buscado pudo identificarse
después del aislamiento de ADN y escisión del control, con posterior
electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (30 minutos, 10 V/cm), con
la enzima XbaI en un clon, denominándose pFE91.
El plásmido pFE91 se insertó por electroporación
en la cepa C. glutamicum ATCC13032 y se seleccionaron
transformantes en agar LB, que estaba mezclado con 7,5 \mug/ml de
cloranfenicol, y posterior incubación durante 48 horas a 30ºC. La
cepa obtenida se denominó C. glutamicum ATCC13032/pFE91.
La formación de pantotenato mediante la cepa
ATCC13032/pFE91 de C. glutamicum se ensayó en medio CGXII
(Keilhauer et al., 1993, Journal of Bacteriology,
175:5595-5603) con 10 mg/ml de cloranfenicol,
denominado en lo que sigue medio de ensayo de C. glutamicum.
Este medio está representado en la Tabla 5. Se inocularon en cada
caso 50 ml de medio de ensayo de C. glutamicum recién hecho
con un cultivo de 16 horas de preparación (medio de ensayo de C.
glutamicum, 30ºC, 150 rpm) con una D.o._{580} de 0,1. Después
de una incubación de 48 horas a 30ºC y 150 rpm, se separaron las
células por centrifugación durante 10 minutos a 5000 x g, el
sobrenadante se filtró en condiciones de esterilidad y se determinó
la concentración de pantotenato. Se determinó la densidad celular
tal como se describió en el Ejemplo 9.
La determinación del pantotenato (como sal de
calcio) se realizó con ayuda de la cepa Lactobacillus
plantarum ATCC® 8014 según instrucciones del manual "DIFCO
MANUAL" de la empresa DIFCO (Michigan, Estados Unidos; 10ª
Edición, 1100-1102 (1984)). El resultado está
representado en la Tabla 6.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos del
marco de lectura YHR063c de Saccharomyces cerevisiae (Nº de
acceso U00061 del National Center for Biotechnology, Bethesda, MD,
Estados Unidos), se sintetizaron los siguientes cebadores de PCR
(MWG-Biotech, Ebersberg, Alemania). El comienzo o el
final del marco de lectura se indican mediante un punto (.):
\bullet oJD539 (5' EcoRI-NotI
INICIO):
5'- GCG CGA ATT CAG ATC CGC GGC CGC AAA GAG GAG
AAA TTA ACT.ATG ACT GCA CCA CAC AGA AG -3'
\bullet oJD540 (3' SpeI-PstI
DETENCIÓN):
5'- CGC GAC TAG TCT GCA G.TC AGT CCT TTC TCC AGT
CAC-3'
Como plantilla sirvió el ADN genómico de la cepa
JD242 de S. cerevisiae que se aisló según el método de C.
Guthrie y G.R. Fink (Guide to yeast genetics and molecular biology,
Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, San Diego, CA,
1991). Esta cepa es un segregante haploide de la cepa diploide
SC288C (Winston et al., Yeast 11, 53 y sigs. (1995)), cuyo
genoma fue secuenciado (Goffeau et al., Science 274, pág.
546, (1996)). El análisis de tetradeno se realizó según el método de
C. Guthrie y G.R. Fink (Guide to yeast genetics and molecular
biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, San Diego,
CA, 1991). La cepa JD242 es auxotrófica para leucina (alelo
leu2\Delta1) y uracilo (alelo ura3-52). Pudo
amplificarse un fragmento de ADN de aprox. 1,2 kB de tamaño
utilizando el kit "High Fidelity Expand Polymerase" de la
empresa Roche (Mannheim) mediante 28 ciclos de PCR, en las
condiciones indicadas por el fabricante. El tamaño se determinó
mediante separación por electroforesis en un gel de agarosa al
0,8%.
Para la expresión del marco de lectura YHR063c en
S. cerevisiae se incorporó el producto amplificado por PCR en
el vector pendulante pJDCEX2 de E. coli - S.
cerevisiae (Figura 8 y Dohmen et al., 1995, Journal of
Biological Chemistry 270, 18099-18109).
El producto de PCR se restringió en primer lugar
con EcoRI y SpeI (AGS, Heidelberg, Alemania). A continuación se
mezcló con ADN de pJDCEX2, que había sido tratado con EcoRI y XbaI
(AGS, Heidelberg, Alemania) y se ligó con ADN ligasa de T4 (Roche,
Mannheim, Alemania). La tanda de ligación se transformó en la cepa
XL1-Blue de E. coli (Bullock et al.,
1987, Biotechniques 5, 376). Los transformantes se obtuvieron
mediante selección en agar LB, que contenía 150 \mug/ml de
ampicilina (Sigma, Deisenhofen, Alemania). El ADN del plásmido de
los clones resistentes a ampicilina se preparó mediante lisis
alcalina (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). El ADN aislado
del plásmido es ensayó luego mediante restricción con NotI y PstI y
posterior separación en gel de agarosa al 0,8%. El plásmido con la
estructura deseada recibió el nombre de pJD-YHR063c
(Figura 9). La secuencia del producto de PCR clonado en
pJD-YHR063c se verificó mediante secuenciación con
los oligonucleótidos oJD105 y oJD106.
\bullet oJD105 (T-CYC1):
5'- GAAGTCATCGAAATAG-3'
\bullet oJD106 (P-CUP1):
5'-TCGTTTCTGTCTTTTTC-3'
Para la expresión del marco de lectura YHR063c en
E. coli se utilizó el plásmido pKK223-3
(Brosius y Holy, Proceedings of the National Academy of Science, USA
81, 6929 (1984)). Para ello, en primer lugar se restringió el
plásmido pJD-YHR063c con EcoRI y PstI (AGS,
Heidelberg, Alemania). El fragmento YHR063c de aprox. 1,2 kB de
tamaño, después de la separación por electroforesis en un gel de
agarosa al 0,8%, se recortó del mismo y se aisló el ADN por medio
del kit QiaexII Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Alemania). A
continuación se ligó en el plásmido pKK223-3 con ADN
ligasa de T4 (Roche, Mannheim, Alemania), que había sido abierto con
EcoRI y PstI. La tanda de ligación se transformó en la cepa
XL1-Blue de E. coli (Stratagene, LaJolla, CA,
Estados Unidos). Se obtuvieron transformantes por selección en medio
LB, que contenía 150 \mug/ml de ampicilina (Sigma, Deisenhofen,
Alemania). El ADN del plásmido de los clones resistentes a
ampicilina se preparó mediante lisis alcalina (Sambrook et
al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Se verificó el éxito de la clonación
mediante restricción con EcoRI y PstI y posterior separación en gel
de agarosa al 0,8%. El plásmido con la estructura deseada recibió el
nombre pKK-YHR063c.
Para el análisis de la función panE del marco de
lectura YHR063c de S. cerevisiae se verificó si la expresión
de este marco de lectura puede complementar la necesidad de ácido
pantoténico de la cepa FE5 de E. coli (Ejemplo 1). Esta cepa
se mutó en los loci del gen panE e ilvC. Para ello, en primer lugar
se transformó la cepa FE5 con el plásmido
pKK-YHR063c.
A continuación, se ensayó el crecimiento de la
cepa FE5/pKK-YHR063c sobre agar mínimo M9 (Sambrook
et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989), que se había suplementado con 50
\mug/ml de cetoisovalerato (Kiv) y 50 \mug/ml de isoleucina
(Ile), en función de la adición de pantotenato (50 \mug/ml). Como
control negativo sirvió la cepa FE5/pKK223-3 y, como
control positivo, la cepa FE4/pFE65 (Ejemplo 4). La Tabla 7 muestra
el resultado del ensayo: el marco de lectura YHR063c de S.
cerevisiae contenido en el plásmido pKK-YHR063c
complementa la mutación doble panE-ilvC de la cepa
FE5 de E. coli. El marco de lectura YHR063c cumple la función
de un gen panE.
La cepa JD242 de S. cerevisiae (véase el
Ejemplo 14) se transformó con los plásmidos pJDCEX2 y
pJD-YHR063c según el método de Dohmen et al.
(Dohmen et al., Yeast 7, 691 (1991)). La selección de
transformantes se realizó en un medio mínimo exento de leucina con
agar al 1,8% (véase la Tabla 8a,b).
Como medio nutritivo se utilizó un ácido
pantoténico -variante libre del medio mínimo base nitrogenada para
levaduras (Yeast Nitrogen Base (YNB)) descrito en el Manual Difco
(Michigan, Estados Unidos, 10ª Edición, 1100-1102
(1984)). Adicionalmente, contenía glucosa (2%), uracilo (40
\mug/ml), CuSO_{4} (150 \muM) para la inducción del promotor
P_{CUP1} de pJDCEX2 y pJD-YHR063c, suplemento -Leu
Drop-Out de la empresa CLONTECH (Heidelberg,
Alemania, Cat. nº 8605-1) (650 \mug/ml) y los
suplementos cetopantoato (100 \mug/ml) y
\beta-alanina (100 \mug/ml). La composición del
medio utilizado se representa en las Tablas 8a y b.
Se llenaron matraces Erlenmeyer de 250 ml con 50
ml del medio nutritivo, se inoculó la tanda con ayuda de un asa de
inoculación con una colonia individual de una placa de agar (véanse
las Tablas 8a,b) y se incubó a 30ºC y 175 rpm durante 72 horas. Con
este precultivo se inocularon 50 ml del mismo medio nutritivo en un
matraz Erlenmeyer de 250 ml con el precultivo de modo que la
densidad óptica (580 nm) fue de 0,5. Al cabo de un período de
incubación de 24 horas a 30ºC y 175 rpm, se determinó la densidad
óptica con un fotómetro Novaspec II de la empresa Pharmacia
(Freiburg, Alemania) a una longitud de onda de medición de 580 nm.
Para ambos cultivos fue de 4,0. La actividad específica de la
cetopantoato-reductasa de las cepas JD242/pJDCEX2 y
JD242/pJD-YHR063c de S. cerevisiae se
determinó según el método descrito en Shimizu et al. (Journal
of Biological Chemistry 263: 12077-12084
(1988)).
Para ello, se obtuvieron extractos celulares de
las distintas cepas mediante un equipo Hybaid RiboLyser (Heidelberg,
Alemania) y del equipo RiboLyser Kit Red. La actividad de la
cetopantoato-reductasa de los extractos se determinó
mediante el consumo del NADPH al añadir cetopantoato. El contenido
proteico se determinó según el método de Bradford (Bradford,
Analytical Biochemistry 72, 248 y sigs. (1976)). Para la cepa de
control JD242/pJDCEX2 se determinó una actividad específica de la
cetopantoato-reductasa de 3 mU/mg de proteína y,
para la cepa JD242/pJD-YHR063c, una actividad
específica de 386 mU/mg de proteína.
La formación de pantotenato mediante las cepas
JD242/pJDCEX2 y JD242/pJD-YHR063c de S.
cerevisiae se ensayó mediante un cultivo por lotes.
Se llenaron matraces Erlenmeyer de 250 ml con 50
ml del medio nutritivo indicado en las Tablas 8a,b, se inoculó la
tanda con ayuda de un asa de inoculación con una colonia individual
de una placa de agar (véanse las Tablas 8a,b) y se incubó a 30ºC y
175 rpm durante 72 horas. Con este precultivo se inocularon 50 ml
del mismo medio nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con el
precultivo de modo que la densidad óptica (580 nm) fue de 0,5. Al
cabo de un período de incubación de 24 horas a 30ºC y 175 rpm, se
determinaron la densidad óptica (580 nm) y la concentración de
pantotenato. Para la determinación de la densidad celular se midió
la densidad óptica con un fotómetro Novaspec II Photometer de la
empresa Pharmacia (Freiburg, Alemania) a una longitud de onda de
medición de 580 nm. El contenido en pantotenato se determinó en el
sobrenadante de cultivo filtrado en condiciones estériles.
La determinación del pantotenato (como sal de
calcio) se realizó con ayuda de la cepa Lactobacillus
plantarum ATCC® 8014 según las indicaciones del manual "DIFCO
MANUAL" de la empresa DIFCO (Michigan, Estados Unidos; 10ª
Edición, 1100-1102 (1984)). El resultado se resume
en la Tabla 9.
Se adjuntan las siguientes figuras:
\bullet Figura 1: Mapa del plásmido pDB1
\bullet Figura 2: Mapa del plásmido pGAD10
\bullet Figura 3: Mapa del plásmido
pFEbank16
\bullet Figura 4: Mapa del plásmido pFE32
\bullet Figura 5: Mapa del plásmido pFE65
\bullet Figura 6: Mapa del plásmido pFE80
\bullet Figura 7: Mapa del plásmido pFE91
\bullet Figura 8: Mapa del plásmido pJDCEX2
\bullet Figura 9: Mapa del plásmido
pJD-YHR063c
En el caso de la indicación de números de pares
de bases se trata de valores aproximados que se obtienen en el marco
de la capacidad de reproducción.
Las abreviaturas utilizadas en las figuras tienen
el siguiente significado:
| rrnBT1T2: | terminador de la transcripción del gen rrnB |
| Ptac: | promotor tac |
| P AHD1: | promotor del gen ADH1 de Saccharomyces cerevisiae |
| T ADH1: | terminador del gen ADH1 de Saccharomyces cerevisiae |
| repts: | origen de la replicación termosensible |
| ilvC: | zona de codificación del gen ilvC |
| ilvC': | zona 5' del gen ilvC |
| 'ilvC: | zona 3' del gen ilvC |
| panB: | zona de codificación del gen panB |
| panC: | zona de codificación del gen panC |
| panD: | zona de codificación del gen panD |
| panE: | zona de codificación del gen panE |
| Amp: | gen resistente a ampicilina |
| tet': | zona 5' del gen tet |
| 'tet: | zona 3' del gen tet |
| Cm: | gen de resistencia a cloranfenicol |
| Gm: | gen de resistencia a gentamicina |
| Gal4: | regulador para genes inducibles por galactosa de Saccharomyces cerevisiae |
| pbs: | pares de bases |
| LEU2: | gen de deshidrogenasa de beta-isopropilmalato de Saccharomyces cerevisiae |
| 2\mu: | secuencias del plásmido 2\mu endógeno de Saccharomyces cerevisiae |
| Ap^{R}: | gen de beta-lactamasa |
| P-CUP1: | promotor del gen CUP1 de Saccharomyces cerevisiae (metalotioneína) |
| T-CYC1: | terminador del gen CYC1 (citocromo C) de Saccharomyces cerevisiae |
| ORF: | marco de lectura abierto |
| SD: | secuencia de Shine-Dalgarno |
| EcoRI: | sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI |
| EcoRV: | sitio de corte de la enzima de restricción EcoRV |
| HincII: | sitio de corte de la enzima de restricción HincII |
| HindIII: | sitio de corte de la enzima de restricción Hindi |
| KpnI: | sitio de corte de la enzima de restricción KpnI |
| SalI: | sitio de corte de la enzima de restricción SalI |
| SmaI: | sitio de corte de la enzima de restricción SmaI |
| SphI: | sitio de corte de la enzima de restricción SphI |
| PvuII: | sitio de corte de la enzima de restricción PvuII |
| NotI: | sitio de corte de la enzima de restricción NotI de Norcardia otitidis-cavarium |
| SpeI: | sitio de corte de la enzima de restricción SpeI de Shpaerotilus spec. |
| XbaI: | sitio de corte de la enzima de restricción XbaI de Xanthomonas badrii |
| PstI: | sitio de corte de la enzima de restricción PstI de Providencia stuartii |
Claims (40)
1. Procedimiento para la preparación de ácido
D-pantoténico por fermentación de microorganismos
productores de este ácido, caracterizado porque se utilizan
microorganismos en los que se sobreexpresan secuencias de
nucleótidos (gen panE) que codifican la
cetopantoato-reductasa.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se sobreexpresan secuencias de
nucleótidos (gen panE) que codifican la
cetopantoato-reductasa de E. coli.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, caracterizado porque se expresa el gen panE en los
microorganismos por vectores plásmidos.
4. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque, para lograr la
sobreexpresión, se utiliza como promotor la mutación
lac-UV5 del promotor lac o el promotor tac.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utilizan microorganismos en los
cuales se elimina el gen avtA.
6. Procedimiento de acuerdo con La reivindicación
1, caracterizado porque se utilizan microorganismos en los
que se elimina el gen ilvE.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utilizan microorganismos en los
que se sobreexpresa adicionalmente el gen ilvC.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se utilizan microorganismos de los
géneros Corynebacterium y E. coli, en los cuales se
sobreexpresa adicionalmente el gel ilvC de Corynebacterium
glutamicum.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se sobreexpresa adicionalmente uno o
varios de los genes seleccionados del grupo:
- 9.1 el gen panB que codifica la cetopantoato-hidroximetiltransferasa,
- 9.2 el gen panD que codifica la aspartato-descarboxilasa,
- 9.3 el gen panC que codifica la pantotenato-sintetasa.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan
microorganismos seleccionados del grupo:
- 10.1 bacterias Gram-negativas,
- 10.2 bacterias Gram-positivas,
- 10.3 hongos,
- 10.4 levaduras.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque, en el caso de los
microorganismos Gram-negativos, se trata de
Enterobacteriaceae.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque, en el caso de los
microorganismos, se trata de la especie Escherichia coli.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque, en el caso de los
microorganismos Gram-positivos, se trata de
microorganismos del género Corynebacterium.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan los
microorganismos que portan una resistencia a
L-valina.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque se utiliza la cepa
FE7 que porta una mutación avtA::aadB en el cromosoma.
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 ó 12, caracterizado porque se utilizan las
cepas Saccharomyces cerevisiae JD242 o E. coli FE5, en
las cuales se eleva la actividad intracelular de la enzima
cetopantoato-reductasa por sobreexpresión del marco
de lectura YHR063c de la especie Saccharomyces
cerevisiae.
\newpage
17. Vector plásmido pFE91 que porta el gen ilvC
de Corynebacterium glutamicum, caracterizado por el
mapa de restricción reproducido en la Figura 7.
18. Vector plásmido pJD-YHR063c
que contiene el marco de lectura YHR063c de Saccharomyces
cerevisiae, caracterizado por el mapa de restricción
reproducido en la Figura 9.
19. Vector plásmido pFE80, caracterizado
por el mapa de restricción reproducido en la Figura 6 y depositado
en la cepa MG1655/pFE80 de E. coli K12 bajo la denominación
DSM 12414.
20. Vector plásmido pFE65, caracterizado
por el mapa de restricción reproducido en la Figura 5 y depositado
en la cepa MG1655/pFE65 de E. coli K12 bajo la denominación
DSM 12382.
21. Vector plásmido pFE32, caracterizado
por el mapa de restricción reproducido en la Figura 4 y reproducido
en la cepa MG1655/pFE32 de E. coli K12 bajo la denominación
DSM 12413.
22. Cepa FE6 de E. coli K12 que porta una
mutación de resistencia a valina, depositada bajo la denominación
DSM 12379.
23. Cepa FE7 de E. coli K12, en la que el
gen avtA está sustituido por un fragmento avtA::aadB, depositada
bajo la denominación DSM 12380.
24. Microorganismos productores de ácido
pantoténico (célula hospedante) de los géneros E. coli o
Corynebacterium que contienen uno de los vectores plásmidos
de acuerdo con las reivindicaciones 19 a 21 y, eventualmente, una o
varias resistencias a metabolitos y/o antimetabolitos.
25. Procedimiento para la preparación de ácido
pantoténico, caracterizado porque se llevan a cabo las
siguientes etapas:
- a)
- fermentación de microorganismos seleccionados del grupo de bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, hongos y levaduras, en los cuales se sobreexpresan al menos las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima cetopantoato-reductasa,
- b)
- concentración del ácido pantoténico en el medio o en las células de los microorganismos,
- c)
- aislamiento del ácido pantoténico.
26. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque, en el caso de las
bacterias Gram-negativas, se trata de
Enterobacteriaceae.
27. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, caracterizado porque se trata de bacterias
del género Escherichia.
28. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque, en el caso de las
bacterias Gram-positivas, se trata de
microorganismos del género Corynebacterium.
29. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 28, caracterizado porque, en el caso de las
bacterias del género Corynebacterium, se trata de la especie
Corynebacterium glutamicum.
30. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque en la etapa a) se
añaden ácido cetopantoico o \beta-alanina.
31. Procedimiento para la identificación del gel
panE de un microorganismo, caracterizado porque
- 1.
- en la cepa FE5 de E. coli, depositada como DSM12378, que porta una mutación defectuosa en el gen panE, se introduce por transformación un banco de genes de los microorganismos de interés,
- 2.
- se ensaya la capacidad de los transformantes de crecer en un medio nutritivo exento de ácido pantoténico, y
- 3.
- se ensayan las inserciones contenidas en el ADN del plásmido de los transformantes prototróficos obtenidos del ácido pantoténico por determinación de las secuencias de nucleótidos.
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