ES2218638T3 - Uso de inhibidores de la histona-descarboxilasa para tratar la fibrosis. - Google Patents
Uso de inhibidores de la histona-descarboxilasa para tratar la fibrosis.Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE LA FIBROSIS. SEGUN LA INVENCION, SE DESCUBRIO DE FORMA SORPRENDENTE QUE CONCENTRACIONES SUBMICROMOLARES DE UN INHIBIDOR DE LA HISTONA DESACETILASA, Y EN PARTICULAR DE LA TRICOSTATINA A, INHIBEN INTENSAMENTE TRES CARACTERISTICAS PRINCIPALES DE LA DIFERENCIACION MIOFIBROBLASTICA DE CELULAS ESTRELLADAS HEPATICAS CULTIVADAS Y DE FIBROBLASTOS DE LA PIEL: (1) LA SINTESIS DE COLAGENO DE TIPO I Y III, LOS COLAGENOS PREDOMINANTES EN LA FIBROSIS DEL HIGADO Y DE OTROS ORGANOS; (2) LA PROLIFERACION CELULAR; Y (3) LA EXPRESION DE LA AL} MUSCULO LISO, UN MARCADOR PARA MIOFIBROBLASTOS DIFERENCIADOS. ESTOS RESULTADOS INDICAN QUE LA TRICOSTATINA A ES UN POTENTE AGENTE ANTIFIBROGENICO, TOTALMENTE DIFERENTE DE CUALQUIER OTRO COMPUESTO TERAPEUTICO DESCRITO PREVIAMENTE.
Description
Uso de inhibidores de la
histona-descarboxilasa para tratar la fibrosis.
El invento se refiere a una composición
farmacéutica para usar en el tratamiento de fibrosis, por ejemplo
fibrosis hepática, cirrosis y enfermedades fibróticas dérmicas
tales como cicatrices hipertróficas, queloides y contractura de
Dupuytren.
La fibrosis en general es un proceso que se
caracteriza por deposición excesiva de tejido conectivo en órganos
tales como piel, pulmón, corazón, hígado, páncreas, riñón, etc.
La fibrosis hepática en un proceso patológico
caracterizado por deposición excesiva de proteínas de tejido
conectivo. Más que una entidad de enfermedad única, es un proceso
que resulta de diversas enfermedades, que incluyen hepatitis viral,
proceso de hígado alcohólico, esquistosomiasis, etc. Sin reparar en
la causa inicial de la enfermedad, el parénquima hepático se
sustituye progresivamente por tejido conectivo, dando por resultado
el deterioro de las funciones hepáticas.
La fibrosis dérmica es un proceso patológico
caracterizado por deposición excesiva de proteínas de tejido
conectivo en la dermis. La fibrosis dérmica resulta de una variedad
de lesiones dérmicas que incluyen trauma mecánico, heridas por
quemado, inflamación crónica o autoinmunidad crónica. Sin reparar en
la causa inicial, se espesa la dermis de la piel.
Hasta la fecha, no existe realmente un
medicamento terapéutico eficaz para el tratamiento de las
enfermedades fibróticas.
Las células hepáticas estrelladas son las
principales células productoras de tejido conectivo, tanto en
hígados normales como fibróticos. En la situación normal, las
células estrelladas sirven como punto de almacenaje de vitamina A.
Estas células son quiescentes, muestran poca actividad
proliferativa, y expresan un espectro limitado de proteínas de
tejido conectivo. En hígados heridos o fibróticos, sin embargo, las
células estrelladas pierden sus gotitas de grasa y cambian su
fenotipo en células parecidas a miofibroblastos. Estas células
parecidas a miofibroblastos son células "activadas", muestran
alta actividad proliferativa, y producen grandes cantidades de
colágenos y otras proteínas de matriz extracelular.
De acuerdo con esto, este tipo de células es el
blanco lógico para la intervención terapéutica. Los compuestos con
efecto antifibrótico en las células estrelladas serán una
prometedora molécula candidata para el tratamiento de la fibrosis
hepática y la cirrosis.
Los fibroblastos de la piel normal son
quiescentes. Sintetizan cantidades controladas de proteínas de
tejido conectivo y tienen baja actividad proliferativa. Después del
daño en la piel, estas células se activan, es decir, proliferan,
expresan \alpha-actina del músculo liso y
sintetizan grandes cantidades de proteínas de tejido conectivo. Las
células activas se llaman a menudo miofibroblastos.
Según el invento, se encontró sorprendentemente
que concentraciones submicromolares de un inhibidor de
histona-desacetilasa, y en particular, de
tricostatina A, inhiben fuertemente tres características principales
de la diferenciación miofibroblástica de células estrelladas
hepáticas cultivadas y de fibroblastos dérmicos:
(1) síntesis de colágenos tipo I y III, los
colágenos predominantes en la fibrosis del hígado y en muchos otros
órganos;
(2) proliferación celular; y
(3) expresión de \alpha-actina
del músculo liso, un marcador para miofibroblastos diferenciados.
Estos resultados indican que la tricostatina A es un potente agente
antifibrogénico, totalmente diferente de cualquier otro compuesto
terapéutico descrito anteriormente.
El presente invento se dirige al uso de un
inhibidor de histona-desacetilasa o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis.
Se conocen normalmente seis compuestos como
inhibidores de histona-desacetilasa. Los
inhibidores de histona-desacetilasa son sustancias
que provocan una inhibición de la actividad de las
histona-desacetilasas, dando por resultado la
hiperacetilación de las histonas, que comprenden:
- -
- trapoxina
- -
- tricostatina A, B, C
- -
- Na-Butirato
- -
- Apicidina A (tetrapéptido cíclico)
- -
- HC-toxina (tetrapéptido cíclico)
- -
- Clamidocina
El butirato sódico es un ácido graso de 4
carbonos natural que inhibe la histona-desacetilasa
de una manera no competitiva, y requiere concentraciones
milimolares para sus actividades biológicas. La tricostatina A y la
trapoxina son inhibidores específicos de la
histona-desacetilasa, y son mucho más potentes que
el butirato sódico, siendo eficaces en el intervalo
submicromolar.
La descripción en esta solicitud se dirige en
particular a la tricostatina A como un ejemplo no limitante, y
nunca se intenta limitar el alcance del invento.
La tricostatina A o derivados de la misma se
describen por ser útiles como un agente antifibrótico para el
tratamiento de la fibrosis. Las formulaciones farmacéuticas y el
uso de compuestos de Tricostatina A también se describen.
La tricostatina A es un agente antifungicida
aislado originalmente de Streptomyces hygroscopicus por
Tsuji et al. (J. Antibiot 29:1-6, 1976). La
tricostatina A también es útil como un agente anticancerígeno
(Cancer Res 47:3688-3691, 1987) y un agente
antiprotozóico (J. Antibiot 41:461-468, 1988). En
el curso de experimentos se descubrió que la Tricostatina A tiene un
fuerte efecto antifibrótico en las células estrelladas hepáticas
que son las principales células productoras de tejido conectivo en
el hígado.
Yoshida et al. (vol. 177, número 1, 1988,
págs. 122-131) muestra que la tricostatina A (TSA)
inhibe la proliferación de fibroblastos y menciona que el butirato
sódico se ha mostrado anteriormente que actúa como tal inhibidor
también en células 3Y1.
De manera similar, Yoshida (vol. 265, número 28,
1990, págs. 17174-17179) muestra que la tricostatina
A (TSA) inhibe la proliferación de fibroblastos y menciona que el
butirato sódico se ha mostrado anteriormente que actúa como tal
inhibidor también en las células 3Y1.
Finalmente, Kijima (vol. 268, número 30, 1993,
págs. 22429-22435) muestra que la trapoxina provoca
la detención del ciclo celular en los fibroblastos 3Y1 y presenta
que la tricostatina A además del n-butirato
indujeron la detención específica de G1 y G2 en el ciclo celular de
los fibroblastos 3Y1 de rata.
La tricostatina A puede obtenerse en forma de
sales farmacéuticamente aceptables. Como tales sales
farmacéuticamente aceptables, pueden usarse mientras no afecten de
manera adversa los efectos farmacológicos deseados de los
compuestos. La selección y la producción pueden hacerse por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, como una sal farmacéuticamente
aceptable, puede usarse una sal de metal alcalino tal como sal
sódica o una sal de potasio, una sal de metal alcalinotérreo tal
como sal de calcio o una sal de magnesio, una sal con una base
orgánica tal como una sal de amonio, o una sal con una base orgánica
tal como una sal de trietilamina o una sal de etanolamina.
Los sujetos a tratar por el presente invento
incluyen tanto seres humanos como animales.
El agente antifibrótico del presente invento
puede administrarse de forma oral o no oral. En el caso de
administración oral, puede administrarse en la forma de cápsulas
suaves o rígidas, pastillas, gránulos, polvos, disoluciones,
suspensiones o similares. En el caso de administración no oral,
pueden administrarse en la forma de ungüentos o disolución en
inyección, formulaciones de infusión en gota, supositorios por lo
cual la absorción continua por membrana puede mantenerse en la
forma de sólido, líquido viscoso o suspensión. La selección del
método para la preparación de estas formulaciones y los vehículos,
agentes desintegrantes o suspensores, puede hacerse fácilmente por
los expertos en la técnica. El agente antifibrótico del presente
invento puede contener una sustancia adicional que tiene
actividades antifibróticas, además de la Tricostatina A o sus sales
farmacéuticamente aceptables.
La cantidad de los ingredientes activos en la
composición del presente invento puede variar dependiendo de la
formulación, pero es normal de 0,1 a 50% en peso sin tener en
cuenta la manera de administración. La dosis se determina teniendo
en consideración la edad, sexo y síntoma de la enfermedad del
sujeto, el efecto terapéutico deseado, el periodo de
administración, etc. Sin embargo, preferiblemente una dosis diaria
del ingrediente activo es de 0,05 a 100 mg para un adulto.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar el presente invento, y no deben construirse como
limitantes del mismo.
Se preparó tricostatina A,
7-[4-(dimetilamino)fenil]-N-hidroxi-4,6-dimetil-7-oxo-2,4-heptadienamida,
a partir del caldo de cultivo de Streptmyces platensis número 145.
Se compró butirato sódico de Sigma (St. Louis, MO, USA). Las
disoluciones del surtido de Tricostatina A se prepararon en etanol
(2 mg/ml), se almacenaron a -20ºC, y se diluyeron como se necesitó
para cada experimento. La concentración final de etanol en el medio
fue 0,0016%. Las disoluciones de surtido de butirato sódico (100
mmoles/l) se prepararon en agua destilada, y se diluyeron como se
necesitó.
La actividad antifibrótica de la Tricostatina A y
el butirato sódico se probó usando cultivos de células estrelladas
hepáticas.
Las células estrelladas se aislaron de ratas
Wistar adultas (400-550 g) mediante digestión
enzimática del hígado con colagenasa/pronasa/ADNasa seguida de
centrifugación por gradiente de densidad en Nicodenz (Nycomed, Oslo,
Noruega).
Después del aislamiento, las células se
suspendieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado
con 10% de suero fetal de ternero, 100 U/ml de penicilina, y 100
\mug/ml de estreptomicina, y se cultivó a 37ºC en una atmósfera
humidificada con 5% de CO_{2} y 95% de aire.
Al día 3, las células se expusieron a
Tricostatina A (1-100 mmoles/l) durante 24 h.
Durante las 24 h posteriores, las células se marcaron
metabólicamente con 25 \muCi/ml de Trans
^{35}S-marca (actividad específica de
^{35}S-metionina > 1.000 Ci/mmol, ICN
Biomedicals, Costa Mesa CA) mientras se continuó la exposición a
los compuestos. Después del marcado, el medio se recogió y se
sometió a inmunoprecipitación usando anticuerpos contra los
colágenos tipo I y III y la \alpha-actina del
músculo liso. Los precipitados se fraccionaron mediante
SDS-PAGE y la radioactividad de bandas específicas
se midió mediante la tecnología de Imagen de Fósforo. Para el
efecto a nivel mARN, las células se expusieron a 100 nmoles/l de
Tricostatina A durante 24 h. El ARN se extrajo entonces y se
analizó mediante análisis de hibridación Northern.
La Tabla 1 h 2 muestran los resultados que se
expresaron como valor de porcentaje respecto al cultivo de control,
respectivamente para Tricostatina A y butirato sódico. Notar la
supresión dependiente de la dosis de la síntesis de colágenos tipo
I y III por Tricostatina A. Además, notar la fuerte supresión de
\alpha-actina del músculo liso, un marcador de
activación de las células estrelladas.
| 100 nM | 10 nM | 1 nM | |
| Colágeno I | 37,9 \pm 5,6 | 68,9 \pm 4,7 | 91,7 \pm 9,5 |
| Colágeno III | 30,1 \pm 9,6 | 73,2 \pm 20,9 | 71,9 \pm 21,0 |
| \alpha-actina del ML | 15,5 \pm 7,4 | 54,4 \pm 5,3 | 87,6 \pm 0,3 |
El butirato sódico suprimió la
\alpha-actina del músculo liso menos eficazmente,
con reducción del 50% a una concentración de 1 mmol/l. La
inhibición de la síntesis de colágeno tipo III y
\alpha-actina del músculo liso indicó que la
Tricostatina A era más potente que el butirato en 5 órdenes de
magnitud.
| 10^{-3} M | 10^{-4} M | 10^{-5} M | |
| Colágeno I | 107,8 \pm 9,8 | 127,9 \pm 16,2 | 92,8 \pm 11,7 |
| Colágeno III | 67,9 \pm 19,1 | 90,6 \pm 42,2 | 109,4 \pm 31,1 |
| \alpha-actina del ML | 50,0 \pm 19,9 | 91,6 \pm 23,4 | 97,9 \pm 24,4 |
\newpage
Las células estrelladas hepáticas se aislaron y
cultivaron como se describe en el Ejemplo 1. Las células se
expusieron a 100 nmoles/l de Tricostatina A durante 24 h. Luego se
extrajo el ARN y se analizó mediante análisis de hibridación
Northern.
Al día 3, las células se expusieron a 100
nmoles/l de Tricostatina A o 1 mmol/l de butirato sódico durante 24
h. El ARN total se extrajo por el método de Chomczynski y Sacchi.
Se realizó la hibridación Northern usando sondas de cADN marcadas
con P para procolágeno \alpha_{1} (I) de rata (fragmento de 1,6
kb Pst I), procolágeno \alpha_{1} (III) de rata (fragmento de
0,5 kb Hind III/EcoRI), y
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa
(GAPDH) (fragmento de 0,5 kb XbaI/HindIII). Para la
\alpha-actina del músculo liso, se usó una sonda
de cARN correspondiente a la región 5'-no traducida
del mARN de \alpha-actina del músculo liso de
ratón, como se describe anteriormente. Los resultados se
cuantificaron mediante Imagen de Fósforo y se corrigieron por
GAPDH.
Los resultados al nivel de mARN se muestran en la
Tabla 3. Los niveles de colágeno tipo III y del mARN de la
\alpha-actina del músculo liso se suprimieron a
una extensión similar a la del nivel de proteína. Por otro lado,
sólo se observó una modesta tendencia a la supresión para el
colágeno tipo I, sugiriendo que la supresión del colágeno tipo I
fue principalmente post-translacional.
| 100 nM | |
| Colágeno I | 79,3 \pm 13,5 |
| Colágeno III | 39,0 \pm 13,5 |
| \alpha-actina del ML | 20,6 \pm 15,4 |
Finalmente, el solicitante examinó los efectos de
la Tricostatina A y el butirato sódico en la proliferación de las
células estrelladas, ya que la alta actividad proliferativa es una
de las principales características de la diferenciación
miofibroblástica.
Las células se cultivaron por triplicado o
cuadruplicado en placas de 24 pocillos (Costar). Las células al día
2 se expusieron a 0,01-1 mmoles/l de butirato
sódico o 1-100 nmoles/l de Tricostatina A durante
los 4 días posteriores. El medio de cultivo y los compuestos de
prueba se sustituyeron cada día. El día 6, las células se
tripsinizaron y se contaron en un hemocitómetro.
La Tricostatina A mostró a 100 nmoles/l un fuerte
efecto supresivo en la proliferación. La Tabla 4 resume estos
resultados del conteo de células.
| Control | Tricostatina A 10^{-7} M | Tricostatina A 10^{-8} M | Tricostatina A 10^{-9} M |
| 23,7 \pm 1,9 | 16,2 \pm 1,0 | 22,0 \pm 3,0 | 22,9 \pm 1,0 |
| Control | Butirato 10^{-3} M | Butirato 10^{-4} M | Butirato 10^{-5} M |
| 23,9 \pm 2,0 | 20,4 \pm 0,2 | 22,2 \pm 0,7 | 21,1 \pm 2,0 |
Finalmente se cultivaron células por triplicado o
cuadruplicado en placas de 24 pocillos. Al día 4, las células se
expusieron a 0,01-1 mmoles/l de butirato sódico o
1-100 nmoles/l de Tricostatina A durante 24 h.
Posteriormente, se cambió el medio y las células se incubaron
adicionalmente durante 20 h con las mismas concentraciones de
butirato sódico o Tricostatina A en presencia de 10 \muCi/ml de
[^{3}H]-timidina (actividad específica 25 Ci/mmol,
10 \muCi/ml). La radioactividad incorporada en el ácido
perclórico al 2%/etanol al 95%/fracción insoluble, se midió
mediante conteo de destello. Cultivos paralelos incubados con
[^{3}H]-timidina en presencia de 10 mmoles/l de
hidroxiurea proporcionaron el valor de salida, que se restó de cada
medida. Los datos finales se normalizaron para el número de células
que se determinó por tripsinización de pocillos paralelos. La Tabla
5 muestra los resultados expresados en cpm/célula.
| Control | Tricostatina A 10^{-7} M | Tricostatina A 10^{-8} M | Tricostatina A 10^{-9} M |
| 10,0 \pm 0,8 | 1,3 \pm 0 | 9,9 \pm 0,4 | 9,6 \pm 0,4 |
| Control | Butirato 10^{-3} M | Butirato 10^{-4} M | Butirato 10^{-5} M |
| 9,9 \pm 0,4 | 6,2 \pm 0,2 | 9,5 \pm 0,3 | 9,5 \pm 0,2 |
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos de ratas
Wistar macho (300-400 g) mediante la técnica de
explantación como se describe anteriormente. Todas las ratas se
alimentaron ad libitum, y recibieron cuidado humano de
acuerdo con las directrices de la institución para el cuidado y uso
de animales de laboratorio en investigación. Las células se
hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% de
suero fetal de ternero, y se cultivaron a 37ºC en una atmósfera
humidificada con 5% de CO_{2} y 95% de aire. Cuando el cultivo
llegó a ser confluente, las células se tripsinizaron y se pusieron
de nuevo en placas en matraces de cultivo de 75 cm^{2} en una
relación de separación de 1:4. Los experimentos se llevaron a cabo
usando células confluentes entre los pasos 5 y 9. Experimentos
preliminares han mostrado que bajo estas condiciones, los
fibroblastos dérmicos habían adquirido el fenotipo de miofibroblasto
al tiempo de los experimentos, como se evidenciaba por su gran
tamaño, fibras de fuerte resistencia, y expresión de
\alpha-actina del músculo liso.
\alpha-actina del músculo liso.
Los cultivos confluentes de fibroblastos dérmicos
se expusieron a 1, 10 y 100 nmmoles/l de tricostatina A durante 24
h. Para el experimento de TGF-\beta_{1}, las
células se expusieron a 5 ng/ml de TGF-\beta_{1}
recombinante humano (Calbiochem) y/o 100 nmoles/l de tricostatina A
durante 24 h. Después de la exposición inicial de 24 h de estos
compuestos, las células se marcaron metabólicamente durante 24 h
con 50 \muCi/ml de Trans ^{35}S-marca
(actividad específica de
^{35}S-metionina > 1.000 Ci/mmol, ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) en presencia de vitamina C (50 \mug/ml) (Merck) y \beta-aminopropionitrilo (64 \mug/ml) (Sigma), mientras se continuaba la exposición a tricostatina A y/o TGF-\beta_{1}. Los medios o las capas celulares marcadas se cosecharon separadamente y se almacenaron a -70ºC. La síntesis de proteína se midió por precipitación con ácido tricloroacético (TCA). Conteos iguales (10^{6} cpm) de medios o lisatos celulares marcados se sometieron a inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación se llevó a cabo usando anticuerpos contra el colágeno tipo I (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), tipo III (Gift by Prof. Dr. D. Schuffan, Freie Univ. Berlín, Alemania) o \alpha-actina del músculo liso (clone 1A4, Sigma). Después de la inmunoprecipitación, las proteínas se separaron por SDS-PAGE, los geles se sumergieron en Amplify (Amersham, Little Charfort, UK) y se secaron, se expusieron a película de autoradiografía destellada anteriormente (Hyperfilm-MP, Amersham) o se analizaron cuantitativamente mediante Imagen de Fósforo (Molecular Imager, GS-525, BioRad, USA).
^{35}S-metionina > 1.000 Ci/mmol, ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) en presencia de vitamina C (50 \mug/ml) (Merck) y \beta-aminopropionitrilo (64 \mug/ml) (Sigma), mientras se continuaba la exposición a tricostatina A y/o TGF-\beta_{1}. Los medios o las capas celulares marcadas se cosecharon separadamente y se almacenaron a -70ºC. La síntesis de proteína se midió por precipitación con ácido tricloroacético (TCA). Conteos iguales (10^{6} cpm) de medios o lisatos celulares marcados se sometieron a inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación se llevó a cabo usando anticuerpos contra el colágeno tipo I (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), tipo III (Gift by Prof. Dr. D. Schuffan, Freie Univ. Berlín, Alemania) o \alpha-actina del músculo liso (clone 1A4, Sigma). Después de la inmunoprecipitación, las proteínas se separaron por SDS-PAGE, los geles se sumergieron en Amplify (Amersham, Little Charfort, UK) y se secaron, se expusieron a película de autoradiografía destellada anteriormente (Hyperfilm-MP, Amersham) o se analizaron cuantitativamente mediante Imagen de Fósforo (Molecular Imager, GS-525, BioRad, USA).
Los cultivos confluentes de fibroblastos se
expusieron a 100 nmoles/l de tricostatina A y/o 5 ng/ml de
TGF-\beta_{1} durante 24 h. Se extrajo el ARN
total mediante el método de Chomczynski y Sacchi. Se llevó a cabo la
hibridación Northern como se describe, usando sondas de cADN
marcadas con ^{32}P para procolágeno \alpha_{1} (I) de rata
(fragmento de 1,6 kb Pst I), procolágeno \alpha_{1} (III) de
rata (fragmento de 0,5 kb Hind III/EcoRI), y GAPDH
(gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa)
(fragmento 0,5 kb XbaI/Hindi). Para la
\alpha-actina del músculo liso, se usó mARN como
se describe anteriormente. Los resultados se cuantificaron mediante
Imagen de Fósforo y se corrigieron por GAPDH.
Las relaciones de proteína o de niveles de mARN
de las muestras tratadas frente a los controles se calcularon para
cada proceso experimental y se expresaron como medias +/- la
desviación patrón. Para el estudio de proteínas, la corrección se
hizo para la diferencia, si hubiera, en las cuentas precipitables
de ácido tricloroacético. El número de experimentos usados para
calcular un valor medio fue al menos 3. El efecto se consideró
estadísticamente significativo, cuando 1,0 no pertenecía al 95% del
intervalo de confianza de la relación muestra tratada/control.
Después se marcó metabólicamente la proteína
producida de forma endógena con ^{35}S-metionina,
y se inmunoprecipitó el colágeno tipo I y III usando anticuerpos
específicos. Las proteínas inmunoprecipitadas se separaron en
SDS-PAGE y se cuantificaron por Imagen de Fósforo.
Se encontró que a 100 nmoles/l, 10 nmoles/l, y 1 nmol/l, la
tricostatina A inhibió la síntesis del colágeno tipo I en 30%, 44%,
y 17%, respectivamente (tabla 6, fila 2). La síntesis de colágeno
tipo III se inhibió en 41%, 49% y 10% a las mismas concentraciones
de tricostatina A (tabla 6, fila 3). Así, tanto el colágeno tipo I
como III se inhibieron mediante tricostatina A (p < 0,05 para 100
nmoles/l y p < 0,01 para 10 nmoles/l), con el máximo efecto
obtenido a 10 nmoles/l. La síntesis de
\alpha-actina del músculo liso, un marcador para
la diferenciación de miofibroblastos, se inhibió también en 37
\pm 18%, 36 \pm 8%, respectivamente, siguiendo a la exposición
a 100 nmoles/l y 10 nmoles/l de tricostatina A (tabla 6, fila 4).
Estos efectos inhibitorios de la tricostatina A eran selectivos, ya
que no se afectó toda la síntesis de proteína según se midió por
conteos precipitables de TCA.
Después se exploró si la tricostatina A afectó
las acciones fibrogénicas del TGF-\beta_{1} en
los fibroblastos dérmicos. Para este propósito, se expusieron las
células a TGF-\beta_{1} (5 ng/ml) solo,
tricostatina A (100 ng/ml) sola, o la combinación de
TGF-\beta_{1} (5 ng/ml) y tricostatina A (100
nmoles/l). El colágeno tipo I y III y la
\alpha-actina del músculo liso se
inmunoprecipitaron de nuevo, se separaron por
SDS-PAGE y se cuantificaron por Imagen de Fósforo.
Como se muestra en la tabla 7, la exposición a
TGF-\beta_{1} estimuló la síntesis de colágeno
tipo I y III en 3,4 y 4,7 veces respectivamente. Aunque la
estimulación se dio en todos los preparados de fibroblastos
dérmicos, la magnitud de la estimulación varió de cultivo a
cultivo, oscilando de 1,8 a 5,9 veces para el colágeno tipo I y de
2,5 a 8,0 veces para el colágeno tipo III. El
TGF-\beta_{1} tuvo un modesto efecto
estimulante (aumento de 1,8 veces) en la síntesis de la
\alpha-actina del músculo liso. De forma
llamativa, el efecto estimulante del
TGF-\beta_{1} se eliminó ampliamente cuando el
TGF-\beta_{1} y la tricostatina A se añadieron
simultáneamente.
Finalmente, se exploró a que nivel la
tricostatina A ejerció su efecto inhibitorio en la síntesis de
colágeno por los fibroblastos dérmicos. Para este propósito se
expusieron de nuevo los fibroblastos dérmicos a tricostatina A y/o
TGF-\beta_{1}.
Después de 24 h de exposición, se extrajo el ARN total y se sometió al análisis de hibridación Northern. Se midió la radioactividad, se corrigió por GAPDH y se expresó como una relación al valor del cultivo de control. Como se muestra en la tabla 8, el TGF-\beta_{1} (5 ng/ml) aumentó la expresión génica de los colágenos tipo I y III y la \alpha-actina del músculo liso 2,3 veces, 2,5 veces y 1,7 veces respectivamente. La tricostatina A sola (100 nmoles/l) tuvo un modesto efecto supresivo en los niveles de mARN de los colágenos tipo I y III y la \alpha-actina del músculo liso. Estos datos sugieren que el efecto supresivo de la tricostatina A se da tanto a nivel de transcripción como post-traslacional.
Después de 24 h de exposición, se extrajo el ARN total y se sometió al análisis de hibridación Northern. Se midió la radioactividad, se corrigió por GAPDH y se expresó como una relación al valor del cultivo de control. Como se muestra en la tabla 8, el TGF-\beta_{1} (5 ng/ml) aumentó la expresión génica de los colágenos tipo I y III y la \alpha-actina del músculo liso 2,3 veces, 2,5 veces y 1,7 veces respectivamente. La tricostatina A sola (100 nmoles/l) tuvo un modesto efecto supresivo en los niveles de mARN de los colágenos tipo I y III y la \alpha-actina del músculo liso. Estos datos sugieren que el efecto supresivo de la tricostatina A se da tanto a nivel de transcripción como post-traslacional.
Los resultados de los ejemplos mencionados
anteriormente se resumen en las tablas 6, 7 y 8.
| 100 nM | 10 nM | 1 nM | |
| Colágeno I | 70 +/- 13% | 56 +/- 11% | 83 +/- 11% |
| Colágeno III | 59 +/- 18% | 51 +/- 11% | 90 +/- 14% |
| \alpha-SMA | 63 +/- 8% | 64 +/- 8% | 86 +/- 23% |
| TGF-\beta | TGF-\beta + TSA | TSA | |
| Colágeno I | 347 \pm 185% | 121 \pm 39% | 70 \pm 13% |
| Colágeno III | 476 \pm 273% | 86 \pm 35% | 59 \pm 18% |
| SMA | 175 \pm 196% | 67 \pm 6% | 63 \pm 8% |
| TGF-\beta | TGF-\beta + TSA | TSA | |
| Colágeno I | 231 \pm 89% | 132 \pm 49% | 84 \pm 14% |
| Colágeno III | 253 \pm 94% | 180 \pm 51% | 74 \pm 10% |
| SMA | 171 \pm 61% | 114 \pm 24% | 85 \pm 16% |
Los resultados en esta Solicitud indican que los
inhibidores de histona-desacetilasa proporcionan un
nuevo potencial terapéutico en el tratamiento de las enfermedades
fibro-proliferativas.
En conclusión, se ha demostrado que dos
inhibidores de histona-desacetilasa no relacionados
son compuestos antifibróticos activos según dos modelos
experimentales de fibrosis bien conocidos, es decir, fibrosis
hepática y fibrosis dérmica.
Claims (7)
1. El uso de un inhibidor de
histona-desacetilasa para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el
inhibidor de histona-desacetilasa es tricostatina A
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que el
inhibidor de histona-desacetilasa es butirato
sódico.
4. El uso según las reivindicaciones 1 a 3, en el
que la cantidad de ingrediente activo varía de 0,1 a 50% en
peso.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que la
dosis diaria del ingrediente activo para un adulto es de 0,05 a 100
mg.
6. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la sal farmacéutica es una sal de
metal alcalino, tal como sal sódica o sal de potasio, una sal de
metal alcalinotérreo tal como sal de calcio o una sal de magnesio,
una sal con una base orgánica tal como una sal de amonio, o una sal
con una base orgánica tal como una sal de trietilamina o una sal de
etanolamina.
7. El uso según las reivindicaciones 1 a 6, en el
que la composición farmacéutica se va a administrar de forma no
oral, en particular en la forma de una crema, un ungüento,
disolución en inyección, infusión en gotas o supositorios.
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