ES2215570T3 - Compuestos para tratar y prevenir complicaciones diabeticas. - Google Patents
Compuestos para tratar y prevenir complicaciones diabeticas.Info
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Abstract
El uso de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en la que R es N, N-dimetilamino o isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
Description
Compuestos para tratar y prevenir complicaciones
diabéticas.
La presente invención se refiere al uso de
derivados específicos de pirimidina para la preparación de
medicamentos para tratar y prevenir complicaciones diabéticas en un
mamífero. Los mencionados derivados específicos de pirimidina pueden
usarse también en combinación con un inhibidor de
aldosa-reductasa o un inhibidor de intercambio
iónicos sodio hidrógeno para la preparación de los mencionados
medicamentos. Las complicaciones diabéticas mencionadas pueden
incluir neuropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía
diabética, úlceras en el pie y dolencias cardiovasculares.
S. Ao y otros, en Metabolism, 40,
77-87 (1991) han demostrado que se produce una
mejora funcional significativa en los nervios de ratas diabéticas
(basada en la velocidad de conducción nerviosa) cuando se bajan
farmacológicamente los niveles de fructosa y que tal mejora se
correlaciona más íntimamente cuando se rebaja la fructosa en nervios
que el sorbitol en nervios. Dieron cuenta de resultados similares
N.E. Cameron y M. A. Cotter, Diabetic Medicin,
8, suppl. 1, 35A-36A (1991). En ambos casos,
la bajada de fructosa en nervios. se logró usando dosis
relativamente altas de inhibidores de aldosa reductasa, que inhiben
la formación de sorbitol, un precursor de fructosa, a partir de
glucosa mediante la aldosa-reductasa enzimática.
Las patentes U.S. nº. 5.138.058 y nº. 5.215.990,
describen compuestos de la fórmula
en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y
R^{5} son como se describe en las patentes. Se describe que los
mencionados compuestos son útiles para la exploración de inhibidores
de aldosa reductasa debido a la actividad acumuladora de sorbitol de
los mencionados
compuestos.
La patente U.S. nº. 5.728.704 y nº. 5.868.578,
cedida de conformidad con lo habitual, describen un método para
tratar o prevenir complicaciones diabéticas que se pueden tratar o
prevenir inhibiendo la enzima
sorbitol-deshidrogenasa. Esa patente describe
también compuestos de la fórmula A
en la que R^{1} a R^{5} son como se define en
la propia
memoria.
Además, las patentes U.S. n^{os}, transferidas
a Hoechst, describen que tienen utilidad para detectar niveles de
sorbitol-deshidrogenasa.
Los autores de la presente invención han
encontrado que derivados de pirimidina de las fórmulas I, II, III y
IV, que se dan posteriormente, y sus sales farmacéuticamente
aceptables, rebajan los niveles de fructosa en los tejidos de
mamíferos afectados por diabetes (por ejemplo, tejido nervioso, de
riñón y retina) y son útiles en el tratamiento y la prevención de
complicaciones diabéticas a las que se ha hecho mención antes. Estos
compuestos, o sus metabolitos in vivo, son inhibidores de la
enzima sorbitol-deshidrogenasa, que cataliza la
oxidación de sorbitol a fructosa.
Esta invención está dirigida al uso de una
cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable,
fórmula en la
que:
R es N,N-dimetilamino o
isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o
prevención de complicaciones diabéticas en un mamífero.
Esta invención está dirigida también al uso de
una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I, o una de sus
sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de
aldosa-reductasa (ARI), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento
para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un
mamífero.
Esta invención está dirigida también al uso de
una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I, o una de sus
sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de intercambio
iónico sodio hidrógeno (NHE-1), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento
para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un
mamífero.
Un compuesto preferido de fórmula I es el
compuesto de la fórmula
Otro compuesto preferido de fórmula I es el
compuesto de fórmula
El término "reducción" incluye la prevención
parcial o la prevención que, aunque fuera mayor que aquélla que
resultaría de no tomar un compuesto o de tomar un placebo, es
inferior a 100% además de la prevención sustancialmente total.
El término "que se trata", "tratar" o
"tratamiento", tal como se usa aquí incluye el tratamiento
preventivo (esto es, profiláctico) y el paliativo.
Por "farmacéuticamente aceptable" se
entiende que el vehículo, el diluyente, los excipientes y/o la sal
deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y
no perjudiciales para quien los recibe.
La expresión "sal farmacéuticamente
aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen
aniones tales como (aunque no exclusivamente) cloruro, bromuro,
yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato,
oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, metanosulfonato y
4-toluenosulfonato. Cuando existe más de un resto
básico, la expresión incluye sales múltiples (por ejemplo, disal).
La expresión se refiere también a sales catiónicas no tóxicas tales
como (pero no exclusivamente) de sodio, potasio, calcio, magnesio,
amonio o benzatina protonada (N,N'-dibencildiamina),
colina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, meglamina
(N-metil-glucamina), benetamina
(N-bencilfenetilamina), piperazina o trometamina
(2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol).
Tal como se usa aquí, las expresiones
"disolvente inerte a la reacción" y "disolvente inerte" se
refieren a un disolvente o una mezcla de disolventes que no
reaccionan con los materiales de partida, reactivos, intermedios o
productos de manera que se afecte negativamente al rendimiento del
producto deseado.
DMF significa
N,N-dimetilformamida, DMSO significa
dimetilsulfóxido. THF significa tetrahidrofurano.
La presente invención incluye también compuestos
marcados isotópicamente, que son idénticos a las indicados de
fórmula I, pero en los que uno o más átomos están reemplazados por
un átomo que tiene una masa atómica o un numérico másico diferente
de la masa atómica o el número másico usualmente encontrado en la
naturaleza. Entre los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar
a los compuestos de la invención están incluidos isótopos de
hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y
cloro, tales como ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, ^{14}C, ^{15}N,
^{18}O, ^{17}O, ^{31}P, ^{32}P, ^{35}S, ^{18}F y
^{36}Cl, respectivamente. Los compuesto de la presente invención,
sus prefármacos y las sales farmacéuticamente aceptables de los
mencionados compuestos o los mencionados prefármacos que contienen
los antes mencionados isótopos y/u otros isótopos de otros átomos
están incluidos en el ámbito de la presente invención. Ciertos
compuestos isotópicamente marcados de la presente invención, por
ejemplo, los compuestos en los que se han incorporado isótopos
radiactivos tales como ^{3}H y ^{14}C, son útiles en ensayos de
fármacos y/o ensayos de distribución de tejidos sustrato. Son
particularmente preferidos los isótopos tritiados, esto es, ^{3}H,
y carbono-14, esto es, ^{14}C, a causa de la
facilidad de su preparación y su detectabilidad. Además, la
sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, esto es,
^{2}H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas
resultantes de una estabilidad metabólica mayor, por ejemplo,
acrecentada semivida in vivo, o exigencias reducidas de
dosis, y, por tanto, se puede preferir tal sustitución en algunas
circunstancias. Los compuestos de fórmula I de esta invención,
isotópicamente marcados, y sus prefármacos se pueden preparar, por
lo general, llevando a la práctica los procedimientos descritos en
los siguientes Esquemas y/o los Ejemplos y Preparaciones,
sustituyendo un reactivo no marcado isotópicamente con un reactivo
isotópicamente marcado fácilmente asequible.
Otras características y ventajas serán evidentes
al considerar la memoria y las reivindicaciones que describen la
invención.
Generalmente, los compuestos de uso en esta
invención se pueden preparar por procedimientos entre los que están
incluidos procedimientos conocidos en las tecnologías químicas, en
particular a la luz de la descripción que aquí se hace. Ciertos
procedimientos para la producción de los compuestos de la esta
invención se proporcionan como otros rasgos de la invención y se
ilustran mediante los siguientes esquemas de reacción. Otros
procedimientos se describen en la sección experimental.
Los compuestos de uso en la presente invención se
pueden preparar como se ilustra en el siguiente Esquema 1. Los
compuestos de la fórmula 1-10, Esquema I, en la que
R^{1} es hidrógeno, alquilo C_{1-6}, COalquilo
C_{1-6}, CO-fenilo o bencilo,
bencilo o fenilo que opcionalmente están sustituidos en el anillo
fenilo con hasta como máximo 2 sustituyentes seleccionados entre
alquilo C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{4} es
N,N-dimetilamino o isopropilo, se pueden preparar de
acuerdo con el Esquema I
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema
1
Los compuestos de la fórmula 1-3
en la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{2} es
etilo o metilo, se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de
fórmula 1-1 en la que R^{1} es H, alquilo
C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el
anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes
seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro,
bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con
reactivo de Meerwein en condiciones estándar y usualmente se aislan
en forma de sus sales de adición de ácido, por ejemplo, una sal
hidrocloruro o tetrafluoroborato.
Los compuestos de fórmula 1-3 en
la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, y R^{2} es
etilo o metilo, se pueden preparar también haciendo reaccionar
compuestos de fórmula 1-2 en la que R^{1} es H,
alquilo C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido
en el anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes
seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor, cloro,
bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con
cloruro de hidrógeno gaseoso en presencia de disolventes alcohólicos
tales como etanol o metanol. La cantidad de cloruro de hidrógeno gas
puede variar de un equivalente hasta la requerida para saturar el
disolvente empleado. La reacción se efectúa a presión ambiente y a
temperaturas entre -20ºC y 0ºC. El término presión ambiente
significa la presión del recinto en que se está realizando la
reacción.
Los compuestos de fórmula 1-4 en
la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, se pueden
preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula
1-3 en la que R^{1} es H, alquilo
C_{1-4} o bencilo opcionalmente sustituido en el
anillo de fenilo con hasta como máximo dos sustituyentes
seleccionados entre alquilo C_{1-4}, flúor,
cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi
C_{1-4}, con amoniaco en disolventes alcohólicos.
El grupo de disolventes orgánicos típicos incluye metanol, etanol,
propanoles y butanoles. La reacción se lleva a cabo a temperaturas
entre -20ºC y 0ºC.
Los compuestos de fórmula 1-6 en
la que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, se preparan
haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-4 en la
que R^{1} es H, alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con compuestos
de fórmula 1-5 (que se preparan de acuerdo con el
método descrito en la patente U.S. nº. 5.138.058) en la que R^{3}
es alquilo C_{1-4}. La reacción puede efectuarse
en disolventes acuosos o alcohólicos, a temperaturas entre 25 y
100ºC. El grupo de disolventes alcohólicos típicos incluye metanol,
etanol y butanoles.
Los compuestos de fórmula 1-6 de
configuración enantiómera R en la que R^{1} es
CO-alquilo, CO-fenilo en el que
fenilo está opcionalmente sustituido con hasta como máximo dos
sustituyentes seleccionados entre alquilo C_{1-4},
flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o
COCH_{2}-fenilo en el que el mencionado fenilo
opcionalmente está sustituido con alquilo C_{1-4},
flúor, cloro, bromo yodo, trifluorometilo o alcoxi
C_{1-4} se preparan haciendo reaccionar compuestos
de fórmula 1-6 que son racémicos, esto es, una
mezcla de enatiómeros R y S, en la que R^{1} es H, con compuestos
de fórmula CH_{2}=CH-OR^{1} en la que R^{1} es
CO-alquilo C_{1-4},
CO-fenilo en el que fenilo opcionalmente está
sustituido con alquilo C_{1-4}, flúor, cloro,
bromo, yodo, trifluorometilo o alquilo C_{1-4},
flúor, cloro, bromo, yodo, trifluorometilo o alcoxi
C_{1-4}, y una enzima lipasa, opcionalmente en
presencia de un disolvente. Por lo general, la reacción se realiza
en presencia de entre uno y 100 equivalentes de
CH_{2}=CH-OR^{1}con o sin un disolvente. Cuando
se usa un disolvente, se trata de disolventes orgánicos que incluyen
disolventes no polares tales como hidrocarburos alquilo
C_{1-7} o disolventes hidrocarburo aromático tales
como benceno, tolueno y xilenos, disolventes polares tales como
acetonitrilo o dimetilsulfóxido, u otros disolventes tales como
alquil C_{1-6} éteres, tetrahidrofurano o dioxano.
Los disolventes preferidos son disolventes éter. En la reacción se
pueden usar varias lipasas comerciales, incluida Lipasa P30, y la
proporción de lipasa puede estar en el intervalo entre cantidades
catalíticas y hasta 10 equivalentes. La reacción se efectúa a
presión ambiente y a temperaturas de 25ºC a la temperatura de
reflujo del CH_{2}=CH-OR^{1} o el disolvente
utilizado.
Los compuestos de la fórmula 1-6
con configuración enantiómera R, en la que R^{1} es
CO-alquilo, CO-fenilo en el que
fenilo está opcionalmente sustituido con alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o COCH_{2}-fenilo en el que el
mencionado fenilo opcionalmente está sustituido con alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo yodo, trifluorometilo
alcoxi C_{1-4} se pueden preparar también haciendo
reaccionar compuestos de fórmula 1-6 en la que
R^{1} es H, con alquilo
C_{1-6}-CO-O-CO-alquilo
C_{1-6} o alquilo
C_{1-6}-COCl en presencia de una
base adecuada y disolventes compatibles con la reacción. Entre las
bases adecuadas están incluidas bases orgánicas terciarias tales
como trietilamina, piridina y dimetilaminopiridina. El grupo de
disolventes compatibles con la reacción incluye éter,
tetrahidrofurano y disolventes halocarburo tales como cloruro de
metileno y cloroformo.
Los compuestos de la fórmula 1-7,
en la que Y es Cl, OSO_{2}Me y OSO_{2}CF_{3}, respectivamente,
y R^{1} es lo definido antes, se pueden preparar haciendo
reaccionar compuestos de fórmula 1-6,
respectivamente, con oxicloruro de fósforo, cloruro de
metanosulfonilo y cloruro de
trifluoro-metanosulfonilo. La reacción se efectúa en
disolventes inertes frente a la reacción tales como cloruro de
metileno, éter o tetrahidrofurano en presencia de una base amina
terciaria tal como trietilamina y piridina. La temperatura de
reacción es de entre 0ºC y 30ºC.
Los compuestos de fórmula 1-8 se
pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula
1-7, en la que Y es Cl, SOO_{2}Me o
OSO_{2}CF_{3}, con piperazina. La reacción se efectúa en
disolventes de reacción inertes tales como cloruro de metileno, éter
o tetrahidrofurano y en presencia de una base amina terciaria tal
como trietilamina, piridina o una cantidad en exceso de piperazina.
La temperatura de reacción es de entre 0ºC y 30ºC.
Los compuestos de fórmula 1-10 en
la que R^{1} es alquilo C_{1-4} o bencilo
opcionalmente sustituido en el anillo de fenilo con hasta como
máximo dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, flúor, cloro, bromo, yodo,
trifluorometilo o alcoxi C_{1-4},
CO-alquilo C_{1-6}, arilo
C_{1-6}, en el que arilo está opcionalmente
sustituido con hasta dos sustituyentes seleccionados entre alquilo
C_{1-4}, cloro, bromo, yodo o trifluorometilo se
pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de fórmula
1-8 con R^{4}SO_{2}Cl, siendo R^{4}
N,N-dimetilo o isopropilo. La reacción se efectúa en
disolventes inertes a la reacción tales como cloruro de metileno,
éter o tetrahidrofurano y en presencia de una base amina terciaria
tal como trietilamina, dimetilaminopiridina, piridina o una cantidad
en exceso de 1-8. La temperatura de reacción está en
el intervalo entre la ambiente y la temperatura de reflujo del
disolvente empleado.
Los compuestos de fórmula 1-10 en
la que R^{1} es hidrógeno y R^{4} es
N,N-dimetilo o isopropilo se pueden preparar
haciendo reaccionar compuestos de la fórmula 1-10,
en la que R^{1} es CO-alquilo
C_{1-6} o CO-arilo
C_{1-6}, grupo en el que arilo es fenilo
opcionalmente sustituido con hasta como máximo dos sustituyentes
seleccionados entre alquilo C_{1-4}, cloro, bromo,
yodo, trifluorometilo o alcoxi C_{1-4}, con una
base o un ácido en agua o una mezcla de agua y disolventes miscibles
con agua. El grupo de disolventes miscibles con agua incluye
metanol, etanol, propanol, DMSO, dioxano y tetrahidrofurano. El
grupo de bases incluye hidróxidos de metales alcalinos y
alcalinotérreos tales como los hidróxidos de litio, sodio, potasio y
calcio. El grupo de ácidos incluye ácidos minerales tales como los
ácidos clorhídrico y sulfúrico. La reacción se efectúa a
temperaturas entre la temperatura ambiente y 50ºC.
Los compuestos de fórmula 1-10 en
la que R^{1} es hidrógeno y R^{4} es
N,N-dimetilo o isopropilo se pueden preparar
haciendo reaccionar compuestos de fórmula 1-12 en la
que R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo con
bromuro de metilmagnesio en disolventes estándar inertes frente a la
reacción usados en reacciones de Grignard, por ejemplo, éter o
tetrahidrofurano. La reacción se efectúa a temperaturas de 0ºC a la
temperatura de reflujo del disolvente empleado.
Los compuestos de fórmula 1-12 en
la que R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo se
pueden preparar oxidando compuestos de fórmula 1-11
(preparados de acuerdo con la patente U.S. nº. 5.138.058) en la que
R^{4} es N,N-dimetilo o isopropilo. La oxidación
puede llevarse a cabo con dióxido de manganeso activado en
disolventes clorados tales como cloruro de metileno o usando las
condiciones de oxidación de Swern, bien conocidas.
Los materiales de partida y los reactivos para
los compuestos antes descritos son adquiribles fácilmente o los
pueden sintetizar fácilmente los expertos en la técnica usando
métodos convencionales de síntesis orgánica. Por ejemplo, muchos de
los compuestos aquí considerados están relacionados con compuestos
naturales (o derivan de ellos) que suscitan un gran interés
científico y son comercialmente necesarios, por lo que muchos de
tales compuestos son asequibles comercialmente o figuran en la
bibliografía, o se preparan fácilmente a partir de otras sustancias
comúnmente asequibles por métodos considerados en la
bibliografía.
Los compuestos de uso en la presente invención
inhiben la formación de sorbitol-deshidrogenasa y,
por tanto, son útiles para tratar complicaciones diabéticas, entre
las que están incluidas, aunque no exclusivamente, nefropatía
diabética, neuropatía diabética y cardiomiopatía diabética. La
utilidad de los compuestos de uso en la presente invención como
agentes médicos en el tratamiento en mamíferos (por ejemplo, el
hombre) de enfermedades tales como las aquí detalladas, por ejemplo,
complicaciones diabéticas tales como cardiomiopatía diabética,
neuropatía diabética, nefropatía diabética, microangiopatía
diabética y macroangiopatía diabética está demostrada por la
actividad de los compuestos de fórmula I de esta invención en
ensayos convencionales. Tales ensayos proporcionan, también, un
medio con el que se pueden comparar las actividades de los
compuestos de fórmula I de uso en esta invención con las actividades
de otros compuestos conocidos. Los resultados de estas comparaciones
son útiles para determinar los niveles de dosificación en mamíferos,
incluido el hombre, para el tratamiento de tales enfermedades.
Para estos experimentos se usan ratas
Sprague-Dawley macho (350-400 g). En
algunas de las ratas se induce diabetes por inyección en vena de la
cola de 85 mg/kg de estreptozoquina. 24 horas más tarde, se
administra por vía oral, a 4 grupos de ratas diabéticas, una dosis
única de
4-[4-(N,N-dimetilsulfamoil)-piperazino]-2-metilpirimidina
(10, 50, 100 ó 300 mg/kg). Los animales se sacrifican
4-6 horas después de haber administrado la dosis y
se cosechan sangre y nervios ciáticos. Los tejidos y células se
someten a extracción con ácido pelclórico al 6%.
El sorbito en eritrocitos y nervios se mide
mediante una modificación del método de R.S. Clements y otros
(Science, 168: 1007-8, 1969). Se
añaden partes alícuotas de extracto de tejido a un sistema de ensayo
que tiene concentraciones finales de los reactivos glicina 0,033 M,
pH 9,4, dinucleótido de \beta-nicotina adenina 800
mM, y 4 unidades/ml de sorbitol-deshidrogenasa.
Después de incubación durante 30 min a temperatura ambiente, se
determina la fluorescencia de la muestra en un espectrofotómetro de
fluoresecencia con excitación a 366 nm y emisión a 452 nm. Después
de sustraer los blancos apropiados, se determina la cantidad de
sorbitol en cada muestra de una regresión lineal de patrones de
sorbitol tratados de la misma manera que los extractos de
tejido.
La fructosa se determina mediante una
modificación del método descrito por M. Ameyama, Methodos in
Enzymology, 89: 20-25 (1982). Se usa
resazurina en vez de ferricianuro. Se añaden partes alícuotas de
extractos de tejidos a un sistema de ensayo cuyas concentraciones
finales de reactivos son ácido cítrico 1,2 M, pH 4,5, resazurina 13
mM, 3,3 unidades/ml de fructosa-deshidrogenasa y
0,068% de Triton X-100. Después de incubación a
temperatura ambiente durante 60 min, se determina la fluoresecencia
de la muestra en un espectrofotómetro de fluoresecencia con
excitación a 560 nm y emisión a 580 nm. Después de sustraer los
blancos apropiados, se determina la cantidad de fructosa en cada
muestra por regresión lineal de patrones de fructosa tratados de la
misma manera que los extractos de tejidos.
La actividad de SDH se mide por una modificación
del método descrito por U. Gerlach, Methodology of Enzymantic
Analyses, editado por H.U. Bergmeyer, 3,
112-117 (1983). Se añaden partes alícuotas de suero
u orina al sistema de ensayo, que tiene concentraciones finales de
reactivos, tampón de fosfato potásico 0,1 M, pH 7,4, NAD 5 mM,
sorbitol 20 mM y 0,7 unidades/ml de
sorbitol-deshidrogenasa. Después de incubación a
temperatura ambiente durante 10 min, se determina a 340 nm el cambio
medio de absorbancia de la muestra. La actividad de SDH se expresó
como unidades de miliOD_{340}/min (OD_{340}=densidad óptica a
340 nm).
Se puede usar cualquier inhibidor de
aldosa-reductasa como segundo compuesto (agente
activo) de esta invención para terapias de combinación. El término
inhibidor de aldosa-reductasa se refiere a
compuestos que inhiben la bioconversión de glucosa a sorbitol
catalizada por la enzima aldosa-reductasa. Tal
inhibición la determinan fácilmente los expertos en la técnica de
acuerdo con ensayos estándar (J. Malone, Diabetes, 29:
861-864, 1980. Red Cell Sorbitol, an Indicator de
Diabetic Control). En lo que sigue se describen y se dan
referencias de varios inhibidores de
aldosa-reductasa, aunque los expertos en la técnica
conocerán otros inhibidores de aldosa-reductasa. Las
descripciones de las patentes U.S. que se citan más adelante se
incorporan aquí por referencia. También, los nombres químicos
comunes USAN o de otra designación figuran entre paréntesis cuando
son aplicables, junto con la referencia a la bibliografía de
patentes apropiadas que describen el compuesto.
La actividad de un inhibidor de
aldosa-reductasa puede determinarse ensayando la
cantidad de inhibidor de aldosa-reductasa que se
requiere para rebajar el sorbitol de tejido (esto es, por inhibir la
producción ulterior de sorbitol debido al bloqueo de
aldosa-reductasa y, consecuentemente, la producción
de fructosa). Si bien no se quiere condicionamiento alguno por
cualquier teoría o mecanismo, se cree que un inhibidor de
aldosa-reductasa, al inhibir la
aldosa-reductasa, impide o reduce la lesión
isquémica que se describe aquí luego posteriormente.
Consecuentemente, los ejemplos de inhibidores de
aldosa-reductasa útiles en los métodos de esta
invención incluyen:
1. Ácido
3-(4-bromo-2-fluorobencil)-3,4-dihidro-4-oxo-1-ftalazinaacético
(ponalrestat, patente U.S. 4.251.528).
2.
N[{(5-trifluorometil)-6-metoxi-1-naftalenil]tioxo-metil}-N-metilglicina
(tolrestat, patente U.S. 4.600.724).
3. Ácido
5-[(Z,E)-\beta-metilcinamiliden]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinaacético
(epalrestat patentes U.S. 4.464.382, U.S. 4.791.126 y U.S.
4.831.045).
4. Ácido
3-(4-bromo-2-fluorobencil)-7-cloro-3,4-dihidro-2,4-dioxo-1(2H)-quinazolinaacético
(zenarestat, patentes U.S. 4.734.419 y U.S. 4.883.800).
5. Ácido
2R,4R-6,7-dicloro-4-hidroxi-2-metilcroman-4-acético
(patente U.S. 4.883.410).
6. Ácido
2R,4R-6,7-dicloro-6-fluoro-4-hidroxi-2-metil-
croman-4-acético (patente U.S.
4.883.410).
7. Ácido
3,4-dihidro-2,8-diisopropil-3-oxo-2H-1,4-benzoxazina-4-acético
(patente U.S. 4.771.050).
8. Ácido
3,4-dihidro-3-oxo-4-[(4,5,7-trifluoro-2-benzo-tiazolil)metil]-2H-1,4-benzoxazina-2-acético
(SPR-210,
patente U.S. 5.252.572).
patente U.S. 5.252.572).
9.
N-[3,5-dimetil-4-[(nitrometil)sulfonil]fenil-2-metil-bencenoacetamida
(ZD5522, patentes U.S. 5.270.342 y U.S. 5.430.060).
10.
(S)-6-fluoroespiro[croman-4,4'-imidazolina]-2,5-diona
(sorbinil, patente U.S. 4.130.714).
11.
d-2-metil-6-fluoro-espiro(croman-4',4'-imidazolina)-
2',5'-diona (patente U.S. 4.540.704).
12.
2-fluoro-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)2',5'-
diona (patente U.S. 4.438.272).
13.
2,7-di-fluoro-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)-
2',5'-diona (patentes U.S. 4.436.745 y U.S.
4.438.272).
14.
2,7-di-fluoro-5-metoxi-espiro(9H-fluoreno-9,4'-imidazolina)2',5'-diona
(patentes U.S. 4.436.745 y U.S.
4.438.272).
4.438.272).
15.
7-fluoro-espiro(5H-indenol[1,2-b]piridina-5,3'-pirro
lidina)2,5'-diona (patentes U.S. 4.436.745 y
U.S.
4.438.272).
4.438.272).
16.
d-cis-6'-cloro-2,3'-dihidro-2'-metil-espiro(imidazolidina-4,4',4'-H-pirano(2,3-b)piridina)-2,5-diona
(patente U.S. 4.980.357).
17.
Espiro[imidazolidina-4,5'(6H)-quinolina]2,5-diona-3'-cloro-7',8'-dihidro-7'-metil-(5'-cis)
(patente U.S.
5.066.659).
5.066.659).
18.
(2S,4S)-6-fluoro-2',5'-dioxoespiro(croman-4,4'imidazolidina)-2-carboxamida
(patente U.S. 5.447.946) y
19.
2-[(4-bromo-2-fluorofenil)metil]-6-fluoroespiro[isoquinolina-4(1H),3'-pirrolidina]-1,2',3,5'(2H)-tetrona
(ARI-509, patente U.S. 5.037.831).
(ARI-509, patente U.S. 5.037.831).
Entre otros inhibidores de
aldosa-reductasa están incluidos compuestos que
tienen la fórmula AR
o una de sus sales farmacéuticamente
aceptables,
Z siendo en el compuesto de fórmula ARI: O o
S;
R^{1} siendo en el compuesto de fórmula ARI:
hidroxi o un grupo capaz de ser eliminado in vivo para
producir un compuesto de la fórmula ARI en la que R^{1} es OH,
y
X e Y siendo en el compuesto de fórmula ARI: son
los mismos o diferentes y se seleccionan entre hidrógeno,
trifluorometilo, flúor y cloro.
Un subgrupo preferido dentro del grupo anterior
de inhibidores de aldosa-reductasa incluye los
compuestos numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10 y 17, y los siguientes
compuestos de fórmula ARI:
20. Ácido
3,4-dihidro-3-(5-fluorobenzotiazol-2-il-metil-4-oxoftlalazin-1-il-acético
[R^{1}=hidroxi; X=F, Y=H].
21. Ácido
3-(5,7-difluorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Y=H].
22. Ácido
3-(5-clorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Cl; Y=H].
23. Ácido
3-(5,7-diclorobenzotiazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Y=Cl].
24. Ácido
3,4-dihidro-4-oxo-3-(5-trifluorometilbenzoxazol-2-ilmetil)ftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=CF_{3};
Y=H].
Y=H].
25. Ácido
3,4-dihidro-3-(5-fluorobenzoxazol-2-il-metil)-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=F; Y=H].
26. Ácido
3-(5,7-difluorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-dihidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Y=F].
27. Ácido
3-(5-clorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Cl; Y=H].
28. Ácido
3-(3,5-diclorobenzoxazol-2-ilmetil)-3,4-di-hidro-4-oxoftalazin-1-ilacético
[R^{1}=hidroxi; X=Y=Cl] y
29. zopolrestat, ácido
1-ftalazinaacético,
3,4-dihidro-4-oxo-3-[{5-(trifluorometil)-2-benzotiazolil}metil]
[R^{1}=
hidroxi; X=trifluorometilo; Y=H].
hidroxi; X=trifluorometilo; Y=H].
En los compuestos 20-23 y 29, Z
es S. En los compuestos 24-28, Z es O.
Del subgrupo anterior, los más preferidos son los
compuestos 20-29, siendo especialmente preferido el
compuesto 29.
Un inhibidor de aldosa-reductasa
especialmente preferido es ácido 1-ftalazinaacético,
3,4-dihidro-4-oxo-3-[{5-trifluorometil)-2-benzotiazolil}metilo].
Los compuestos inhibidores de
aldosa-reductasa de uso en esta invención son
fácilmente asequibles o pueden sintetizarlos fácilmente los expertos
en la técnica por métodos convencionales en síntesis orgánica, en
particular a la vista de las pertinentes descripciones de la memoria
de la patente.
Se puede usar una cantidad de inhibidor de
aldosa-reductasa que sea efectiva para las
actividades de esta invención. Típicamente, una dosis efectiva para
los inhibidores de aldosa-reductasa de esta
invención está en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a
100 mg/kg/día en unidosis o dosis divididas, preferiblemente de 0,1
mg/kg/día a 20 mg/kg/día en una dosis única o dosis divididas.
Como segundo componente activo (agente activo) se
puede usar en esta invención, para medicamentos de combinación, un
inhibidor de intercambio iónico sodio hidrógeno
(NHE-1). El término inhibidor NEH-1
se refiere a compuestos que inhiben el sistema de transporte de
intercambio sodio/protón (Na^{+}/H^{+}) y que, por tanto, son
útiles como agente terapéutico o profiláctico para enfermedades
causadas o agravadas por aceleración del sistema de transporte por
intercambio de sodio/protón (Na^{+}/H^{+}), por ejemplo,
enfermedades cardiovasculares [como arterioesclerosis, hipertensión,
arritmia (por ejemplo, arritmia isquémica, arritmia debida a infarto
de miocardio, bloqueo de miocardio, disfunción miocárdica, arritmia
después de PTCA o después de trombolisis, etc.), angina de pecho,
hipertrofia cardíaca, infarto de miocardio, fallo cardíaco (por
ejemplo, fallo cardíaco congestivo, fallo cardíaco agudo,
hipertrofia cardíaca, etc.), restenosis después de PTCA, PTCl, shock
(por ejemplo, shock hemorrágico, shock por endotoxinas, etc.)],
enfermedades renales (por ejemplo, diabetes mellitus, nefropatía
diabética, fallo renal isquémico agudo, etc.), trastornos orgánicos
asociados con isquemia o reperfusión isquémica [(por ejemplo,
trastornos asociados a reperfusión isquémica de músculos del
corazón, fallo renal agudo o trastornos inducidos por tratamientos
quirúrgicos tales como cirugía de injerto de bypass en arteria
coronaria (CABG), cirugías vasculares, trasplante de órganos,
cirugías no cardíacas o angioplastia percutánea transluminal
coronaria (PTCA), enfermedades cerebrovasculares (por ejemplo,
apoplejía isquémica, apoplejía hemorrágica, etc.), trastornos
cerebroisquémicos (por ejemplo, trastornos asociados a infarto
cerebral, trastornos causados después de apoplejía cerebral como
secuelas, o edema cerebral. Los inhibidores NEH-1 se
pueden usar también como agentes para protección miocárdica durante
cirugías de injerto de bypass en arteria coronaria (CABG), cirugías
vasculares, angioplastia percutánea transluminal coronaria (CABG),
PTCl, trasplante de órganos o cirugías no cardíacas. La utilidad de
los inhibidores NHE-1 como agentes médicos en el
tratamiento de enfermedades tales como las que se detallan aquí en
mamíferos (por ejemplo, el hombre), por ejemplo, protección del
miocardio durante cirugía o protección del miocardio en pacientes
que presentan episodios en curso cardíacos o isquémico cerebrales, o
cardioprotección crónica en pacientes con enfermedad cardíaca
coronaria diagnosticada, o con riesgo de una enfermedad cardíaca
coronaria, disfunción cardíaca o bloqueo miocárdico, se demuestra
por la actividad de los compuestos de fórmula I de esta invención en
ensayos convencionales preclínicos de cardioprotección [véase el
ensayo in vivo, por Klein W y otros, Circulation,
92:260-268 (1995); el ensayo de corazón aislado, por
Scholz, W. y otros, Cardiovascular Research
29:260-268 (1995); el ensayo antiarrítmico,
por Yasutake M y otros, Am. J. Physiol.,
36:H2430:H2440 (1994); el ensayo NMR, por Kolke y otros,
J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 112:
765-775 (1996) y los ensayos in vivo e in
vitro adicionales que se describen más adelante. Tales ensayos
proporcionan también un medio con el que se pueden comparar las
actividades de los compuestos de fórmula I de uso en esta invención
con las actividades de otros compuestos conocidos. Los resultados de
estas comparaciones son útiles para determinar niveles de
dosificación en mamíferos, incluido el hombre, para el tratamiento
de tales enfermedades.
Se describen inhibidores NEH-1 en
la patente U.S. nº. 5.698.581, la solicitud de patente europea nº.
EP 803.501 A1, la publicación de solicitud de patente internacional
nº WO 94/26709 y el documento PCT/JP97/04650. Los inhibidores
NHE-1 descritos en ellas tienen utilidad en
combinación con esta invención. Los mencionados inhibidores
NHE-1 se pueden preparar como se describe en los
documentos citados.
Entre los inhibidores NHE-1
preferidos están incluidos compuestos de la fórmula NHE.
un prefármaco de ellos o una de las sales
farmacéuticamente aceptable del mencionado compuesto o el mencionado
prefármaco.
Z en el compuesto de la fórmula NHE, está
conectado a carbono y es un anillo diaza, diinsaturado, de 5
miembros, que tiene dos nitrógenos contiguos, anillo que,
opcionalmente, está monosustituido, disustituido o trisustituido con
hasta como máximo tres sustituyentes independientemente
seleccionados entre R^{1}, R^{2} y R^{3}; o
Z en el compuesto de la fórmula NHE, está
conectado a carbono y es un anillo triaza, diinsaturado, de 5
miembros que tiene dos nitrógenos contiguos, anillo que,
opcionalmente, está monosustituido o disustituido con hasta como
máximo dos sustituyentes independientemente seleccionados entre
R^{4} y R^{5};
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son,
cada uno independientemente, hidrógeno, hidroxialquilo
C_{1-4}, alquilo C_{1-4}, alquil
C_{1-4} tio, cicloalquilo
C_{3-4}, cicloalquilo C_{3-7}
alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-4},
alcoxi C_{1-4} alquilo C_{1-4},
mono-N o
di-N,N-alquil
C_{1-4}carbamoílo, M o M alquilo
C_{1-4}, teniendo, opcionalmente, cualquiera de
los anteriores restos alquilo C_{1-4}, de uno a
nueve átomos de flúor; estando los mencionados alquilo
C_{1-4} o cicloalquilo C_{3-4}
opcionalmente mono o di-sustituidos con,
independientemente, hidroxi, alcoxi C_{1-4},
alquil C_{1-4} tio, alquil
C_{1-4} sulfinilo, alquil
C_{1-4} sulfonilo, alquilo
C_{1-4}, mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} carbamoílo o mono-N- o
di-N,N- alquil C_{1-4}
aminosulfonilo; y teniendo el mencionado cicloalquilo
C_{3-4}, opcionalmente, de uno a siete átomos de
flúor.
M es un anillo de cinco a ocho miembros,
parcialmente saturado, totalmente saturado o totalmente insaturado,
que opcionalmente tiene de uno a tres heteroátomos seleccionados
independientemente entre oxígeno, azufre y nitrógeno, o un anillo
bicíclico que consta de dos anillos de tres a seis miembros
condensados parcialmente saturados, totalmente saturados o
totalmente insaturados, que opcionalmente tienen de uno a cuatro
heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno,
azufre y oxígeno;
M está opcionalmente sustituido en un anillo si
el resto es monocíclico, o en uno o ambos anillos si el resto es
bicíclico, sobre carbono o nitrógeno con hasta como máximo tres
sustituyentes seleccionados independientemente entre R^{6},
R^{7} y R^{8}, siendo uno de R^{6}, R^{7} y R^{8} un
anillo de tres a siete miembros parcialmente saturado, totalmente
saturado o totalmente insaturado que opcionalmente tiene uno a tres
heteroátomos seleccionados independientemente entre oxígeno, azufre
y nitrógeno, opcionalmente sustituidos con alquilo
C_{1-4} y, adicionalmente, R^{6}, R^{7} y
R^{8} son, opcionalmente, hidroxi, nitro, halo, alcoxi
C_{1-4}, alcoxi C_{1-4}
carbonilo, alquilo C_{1-4}, formilo, alcanoilo
C_{1-4}, alcanoil C_{1-4} oxi,
alcanoil C_{1-4} amino, alcoxi
C_{1-4} carbonilamino, sulfonamido, alquil
C_{1-4} sulfonamido, amino,
mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} amino, carbamoílo, mono-N-
o di-N,N-alquil
C_{1-4} carbamoílo, ciano, tiol, alquil
C_{1-4} tio, alquil C_{1-4}
sulfinilo, alquil C_{1-4} sulfonilo,
mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} aminosulfonilo, alquenilo
C_{2-4}, alquinilo C_{2-4} o
cicloalquenilo C_{5-7};
los mencionados sustituyentes alcoxi
C_{1-4}, alquilo C_{1-4},
alcanoilo C_{1-4}, alquil
C_{1-4} tio, mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} amino o cicloalquilo
C_{3-7}, R^{6}, R^{7} y R^{8} están
opcionalmente sustituidos, independientemente, con hidroxi, alcoxi
C_{1-4} carbonilo, cicloalquilo
C_{3-7}, alcanoilo C_{1-4},
alcanoil C_{1-4} amino, alcanoil
C_{1-4} oxi, alcoxi C_{1-4}
carbonilamino, sulfonamido, alquil C_{1-4}
sulfonamido, amino, mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} amino, carbamoílo, mono-N-
o di-N,N-alquil
C_{1-4} carbamoílo, ciano, tiol, nitro, alquil
C_{1-4} tio, alquil C_{1-4}
sulfinilo, alquil C_{1-4} sulfonilo o
mono-N- o
di-N,N-alquil
C_{1-4} aminosulfonilo u opcionalmente sustituidos
con uno a nueve átomos de flúor.
Entre los inhibidores NEH-1
especialmente preferidos están incluidos
[1-(8-bromoquinolin-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
[1-(6-cloroquinolin-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
[1-(indazol-7-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
[1-(benzoimidazol-5-il)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]-guanidina;
[1-(isoquinolil)-5-ciclopropil-1H-pirazol-4-carbonil]
guanidina;
[5-ciclopropil-1-(4-quinolil)-1H-pirazol-4-
carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-8-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil] guanidina; [1-(1-metilbenzoimidazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)5-n-propil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)-5-isopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-etil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(2-metilbenzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(1,4-benzodioxan-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzotriazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(3-cloroindazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]-guanidina; [1-(5-quinolinil)-5-butil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-propil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-isopropil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-ciclopropil-1-(quinolin-8-il)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(indazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil] guanidina; [1-(1-metilbenzoimidazol-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)5-n-propil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; 1-(5-quinolinil)-5-isopropil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-etil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(2-metilbenzoimidazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(1,4-benzodioxan-6-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(benzotriazol-5-il)-5-etil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [1-(3-cloroindazol-5-il)-5-etil-
1H-pirazol-4-carbonil]-guanidina; [1-(5-quinolinil)-5-butil-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-propil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina; [5-isopropil-1-(6-quinolinil)-1H-pirazol-4-carbonil]guanidina;
o una de sus sales farmacéuticamente
aceptable.
Los inhibidores NHE-1 preferidos
y especialmente preferidos descritos en los dos párrafos anteriores
se pueden preparar de acuerdo con métodos considerados en la
solicitud de patente internacional nº. PCT /lB99/00206 o como se
indica más adelante, señalándose que las variables de los esquemas y
la descripción siguientes se refieren sólo a compuestos
NHE-1.
Esquema
I
Esquema
II
Esquema
III
Esquema
IV
Esquema
V
\newpage
Esquema
VI
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
VII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
VIII
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el Esquema I, el compuesto de la
fórmula I-a, en la que R^{4} es lo descrito antes
para el compuesto de fórmula NHE, se disuelve o se pone en
suspensión en una solución acuosa de hidróxido de un metal alcalino
(por ejemplo, hidróxido sódico) junto con nitrito sódico y la mezcla
se añade a una solución acuosa de un ácido (por ejemplo, ácido
sulfúrico al 10% v/v) a un pH de aproximadamente 0 a una temperatura
de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 5ºC durante aproximadamente
30 min a aproximadamente 1 hora. La mezcla resultante se filtra y se
obtiene la oxima de fórmula I-b. Alternativamente,
el compuesto de fórmula I-a se disuelve en ácido
acético/ácido propiónico 1:1 y se añade nitrito sódico sólido a
aproximadamente 0ºC. La mezcla de reacción se agita a
aproximadamente 0ºC durante aproximadamente 2 horas y luego se
vierte en agua-hielo, obteniéndose por filtración la
oxima de fórmula I-b.
El compuesto de fórmula I-b se
hace reaccionar con un compuesto de la fórmula I-c,
en la que R^{5} es lo descrito antes para un compuesto de fórmula
NHE, en un disolvente prótico tal como etanol, a una temperatura de
aproximadamente 50ºC a aproximadamente 110ºC durante aproximadamente
1 hora para formar la hidrazona de fórmula I-d.
La hidrazona de fórmula I-d se
cicla e hidroliza, obteniéndose el triazol de fórmula
I-e en un disolvente alcohólico tal como
2-etoxietanol en condiciones básicas (por ejemplo,
hidróxido potásico) a una temperatura de aproximadamente 100ºC a
aproximadamente 175ºC durante aproximadamente ½ hora a
aproximadamente 2 horas; seguidamente se acidifica, obteniéndose el
ácido de triazol de fórmula I-e.
El ácido de fórmula I-e se acopla
con guanidina en presencia de un agente de acoplamiento adecuado. Un
agente de acoplamiento adecuado es un agente que transforma un ácido
carboxílico en una especie reactiva que forma un enlace amida al
reaccionar con una amina.
El agente de acoplamiento puede ser un reactivo
que efectúa esta condensación en un proceso en una etapa cuando se
mezcla con el ácido carboxílico y la guanidina. Son ejemplos de
agentes de acoplamiento, hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol
(EDC/HBT), diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol (HBT),
2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina
(EEDQ) y cianuro de dietilfosforilo. El acoplamiento se realiza en
un disolvente inerte, preferiblemente un disolvente aprótico a una
temperatura de aproximadamente -20ºC a aproximadamente 50ºC durante
aproximadamente 1 a aproximadamente 48 horas, en presencia de
guanidina en exceso como base. Los ejemplos de disolventes incluyen
acetonitrilo, diclorometano, dimetilformamida y cloroformo, o
mezclas de ellos.
El agente de acoplamiento puede ser también aquel
agente que convierte el ácido carboxílico en un intermedio activado
que se aisla y/o forma en una primera etapa y se deja que reaccione
con guanidina en una segunda etapa. Son ejemplos de tales agentes de
acoplamiento e intermedios activados, cloruro de tionilo o cloruro
de oxalilo para formar el cloruro de ácido, fluoruro cianúrico para
formar un fluoruro de ácido o un cloroformiato de alquilo tal como
cloroformiato de isobutilo o isopropenilo, o anhídrido
propanofosfónico (anhídrido del ácido propanofosfónico, PPA) (con
una base amina terciaria) para formar un anhídrido mixto del ácido
carboxílico, o carbonildiimidazol para formar un acilimidazol. Si el
agente de acoplamiento es cloruro de oxalilo, es ventajoso emplear
una pequeña cantidad de dimetilformamida como disolvente con otro
disolvente (tal como diclorometano) para catalizar la formación del
cloruro de ácido. Este derivado de ácido activado puede acoplarse
mezclándolo con guanidina en exceso en un disolvente apropiado junto
con una base apropiada. Son combinaciones apropiadas de
disolvente/base, por ejemplo, diclorometano, dimetilformamida o
acetonitrilo, o mezclas de ellos, en presencia de un exceso de
guanidina como base. Entre otras combinaciones apropiadas de
disolvente/base están incluidos agua o un alcohol
C_{1-5} o una mezcla de ambos junto con un
codisolvente tal como diclorometano, tetrahidrofurano o dioxano y
una base tal como hidróxido sódico, potásico o lítico en cantidad
suficiente para consumir el ácido liberado en la reacción. El uso de
estos agentes de acoplamiento y la selección apropiada de
disolventes y temperaturas son conocidos por los expertos en la
técnica o pueden determinarse fácilmente por estudio de la
bibliografía. Éstas y otras condiciones ejemplares, útiles para
acoplamiento de ácidos carboxílicos, se describen en
Houben-Weyl, vol. XV, parte II, E. Wunsch, Ed., G.
Theime Verlag, 1974, Stuttgart; M. Bodansky, Principles of
Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin, 1984; y The
Peptides, Analysis, Synthesis and Biology (ed. E. Gross y J.
Meienhofer), vols. 1-5 (Academic Press, NY
1979-1983).
De acuerdo con el esquema II, la amina primaria
de la fórmula II-a, en la que R^{5} es lo descrito
antes para el compuesto de fórmula HHE, se hace reaccionar con un
\alpha-diazo-\beta-cetoéster
de fórmula II-b, en la que R^{4} es lo descrito
antes para el compuesto de fórmula NHE y R es alquilo inferior, en
presencia de tetracloruro de titanio de manera análoga al método
descrito por Eguchi y otros, Synthesis 1993, 793, para formar
el éster del ácido triazolcarboxílico de fórmula
II-c. El éster de fórmula II-c se
convierte directamente en la acilguanidina de fórmula
II-d por reacción con guanidina en un disolvente
alcohólico a una temperatura de aproximadamente 60ºC a
aproximadamente 110ºC, preferiblemente en metanol a reflujo, durante
un período de 8 a 20 horas.
De acuerdo con el Esquema III, el compuesto de la
fórmula III-a en la que R^{4} y R^{5} son lo
descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, se trata con
reactivo de Lawesson (esto es,
2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosofoetano-2,4
disulfuro) en un disolvente aprótico tal como dimetoxietano a una
temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 120ºC durante
aproximadamente una a ocho horas. La tioamida resultante se trata
con un agente de alquilación tal como yoduro de metilo en un
disolvente inerte polar tal como acetona, convenientemente a
temperatura ambiente durante aproximadamente ocho a aproximadamente
veinticuatro horas. El compuesto resultante se hace reaccionar con
hidrazina anhidra en un disolvente alcohólico a una temperatura de
aproximadamente 0ºC a 25ºC durante aproximadamente una a ocho horas,
obteniéndose el compuesto de fórmula III-b
(análogamente a lo descrito por Doyle y Kurzer, Synthesis
1974., 583).
El compuesto de fórmula III-b se
trata con un cloruro de monoalquiloxalilo durante aproximadamente
una a ocho horas para obtener el compuesto éster de ácido
carboxílico de la fórmula III-c, en la que R es
alquilo inferior. El éster de fórmula III-c se
acopla directamente en un disolvente alcohólico a una temperatura de
aproximadamente 60ºC a aproximadamente 110ºC, preferiblemente en
metanol a reflujo, durante un período de ocho a veinte horas para
preparar las triazolcarbonil guanidinas de fórmula
III-d.
De acuerdo con el Esquema IV, el compuesto de la
fórmula IV-a en la que R^{5} es lo descrito antes
para el compuesto de fórmula NEH, se trata con yoduro de metilo en
un disolvente inerte, convenientemente a temperatura ambiente
durante aproximadamente cuatro a veinticuatro horas. El compuesto
resultante se hace reaccionar con R^{4}-hidrazina
anhidra (en la que R^{4} es lo descrito antes para el compuesto de
fórmula NHE) en un disolvente alcohólico a una temperatura de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC, durante aproximadamente
una a ocho horas, resultando el compuesto amidrazona de fórmula
IV-b (análogamente a lo descrito por Doyle y Kurzer,
Synthesis 1974, 583).
El compuesto de fórmula IV-b se
trata con un cloruro de monoalquiloxalilo en un disolvente aprótico
a una temperatura de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 50ºC
durante aproximadamente una a ocho horas, obteniéndose el compuesto
éster de ácido carboxílico de la fórmula IV-c en la
que R es alquilo inferior. El éster de fórmula IV-c
se acopla directamente con guanidina en un disolvente orgánico a una
temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 110ºC,
preferiblemente en metanol a reflujo, durante un período de ocho a
veinte horas, resultando las triazolcarbonil guanidinas de fórmula
IV-d.
De acuerdo con el Esquema V, el compuesto de la
fórmula V-a en la que R^{1} es lo descrito antes
para el compuesto de fórmula NEH, se combina con exceso de
(CH_{3}O)_{2}C(R^{3})N(CH_{3})_{2}(N,N-dimetilamidadimetilacetal),
fórmula en la que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de
fórmula NEH, opcionalmente en presencia de un catalizador ácido tal
como ácido p-toluenosulfónico, a una temperatura de
aproximadamente 90ºC a aproximadamente 110ºC durante aproximadamente
una a aproximadamente dos horas, obteniéndose el compuesto de
fórmula V-c.
El compuesto de fórmula V-c se
cicla con un compuesto de fórmula V-d, en la que
R^{2} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH, en un
disolvente inerte tal como etanol a una temperatura de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 30ºC, durante aproximadamente
5 minutos a aproximadamente una hora, y seguidamente se calienta la
mezcla de reacción a una temperatura de aproximadamente 90ºC a
aproximadamente 110ºC durante aproximadamente de dos a cuatro horas,
formándose el pirazol de fórmula V-f.
Alternativamente, de acuerdo con el Esquema V, el
compuesto de la fórmula V-a en la que R^{1} es lo
descrito antes para el compuesto de fórmula NHE,, se combina con un
trietilortoéster (esto es, R^{3}C(OEt)_{3}, en el
que R^{3} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH) y
anhídrido acético a una temperatura de aproximadamente 120ºC a 150ºC
durante aproximadamente dos a aproximadamente cinco horas,
obteniéndose el compuesto de fórmula V-b.
El compuesto de fórmula V-b se
cicla con un compuesto de fórmula V-d, en la que
R^{2} es lo descrito antes para el compuesto de fórmula NEH,
resultando el pirazol de fórmula V-c.
El pirazol de fórmula V-c se
hidroliza con una base tal como hidróxido sódico o hidróxido de
litio en un disolvente tal como agua y/o metanol y/o THF,
convenientemente a temperatura ambiente o a temperatura elevada (por
ejemplo, a reflujo) durante aproximadamente una hora a
aproximadamente cinco horas, resultando el ácido de fórmula
V-f.
El ácido de fórmula V-f se acopla
con guanidina en presencia de un agente de acoplamiento adecuado,
según se ha descrito para el acoplamiento anterior del ácido de
fórmula I-e y guanidina. En una realización, el
ácido de fórmula V-f se activa con cloruro de
tionilo a una temperatura de aproximadamente 60ºC a aproximadamente
90ºC durante aproximadamente quince min a dos horas. El cloruro de
ácido activado resultante se combina con hidrocloruro de guanidina y
una base inorgánica (por ejemplo, hidróxido sódico) en
tetrahidrofurano anhidro y, opcionalmente, metanol y/o agua. La
solución se calienta, es conveniente a reflujo, durante
aproximadamente una hora a ocho horas para obtener el compuesto de
fórmula V-g.
Alternativamente de acuerdo con el Esquema V, el
compuesto de fórmula V-e se puede convertir
directamente en el compuesto de fórmula V-g por
diversos métodos. Por ejemplo, se puede calentar el compuesto de
fórmula V-e en presencia de guanidina en exceso, en
un disolvente prótico polar, por ejemplo metanol o isopropanol, a
una temperatura adecuada, convenientemente a reflujo durante
aproximadamente una hora a aproximadamente setenta y dos horas. Esta
transformación se puede realizar también eliminando repetidamente el
disolvente, por ejemplo, eliminando etanol o tolueno aproximadamente
cuatro veces, de una mezcla del compuesto de fórmula
V-e y guanidina en exceso a una presión de
aproximadamente un mm de Hg a aproximadamente 100 mm de Hg y a una
temperatura de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 95ºC. Esta
reacción se puede realizar también en ausencia de disolvente
calentando la mezcla del compuesto de fórmula V-e y
guanidina en exceso a una temperatura de aproximadamente 100ºC a
aproximadamente 180ºC, opcionalmente a una presión de
aproximadamente 1 mm de Hg a aproximadamente 100 mm de Hg, durante
aproximadamente cinco minutos a aproximadamente ocho horas.
De acuerdo con el Esquema VI, el compuesto de la
fórmula VI-a, en la que R^{3} es lo descrito antes
para el compuesto de fórmula NHE, se hace reaccionar con el
compuesto de la fórmula VI-b, en la que R^{1} y
R^{2} son lo descrito antes para el compuesto de fórmula NHE, en
un disolvente aprótico a una temperatura de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 25ºC durante aproximadamente dos horas a
aproximadamente veinticuatro horas en presencia de una base amina
apropiada, tal como trietilamina, para formar el compuesto de
fórmula VI-c.
El compuesto resultante de fórmula
VI-c se hidroliza y acopla con guanidina usando uno
de los métodos descritos en anteriores Esquemas, como el método en
que se emplea carbonilimidazol, para obtener el compuesto de fórmula
VI-d.
De acuerdo con el Esquema VII, la hidrazina de la
fórmula VII-a, en la que R^{2} es lo descrito
antes para el compuesto de fórmula NHE, se hace reaccionar con el
compuesto apropiado de fórmula VII-b para que se
forme el éster de pirazol de la fórmula VII-c, en la
que R es alquilo inferior, de acuerdo con el método de Bajnati, A y
Hubert-Habart, M., Bull. Soc. Chim. France
1988, 540. El éster de pirazol resultante se convierte en la
acil guanidina de fórmula VII-d usando los métodos
de hidrólisis y acoplamiento descritos antes.
De acuerdo con el Esquema VIII, el compuesto de
la fórmula VIII-a en la que R^{2} y R^{1} son
los descrito antes para el compuesto de fórmula NHE se transforma en
la sal de litio de la fórmula VIII-b en la que R es
alquilo inferior de acuerdo con el método descrito en J. Het.
Chem. 1989, 26, 1389. La sal de litio de fórmula
VIII-b se combina con la hidrazina de la fórmula
VIII-c en la que R^{3} es lo descrito antes para
el compuesto de fórmula NHE, en un disolvente inerte tal como
etanol, en presencia de un ácido mineral, a una temperatura de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 30ºC durante aproximadamente
cinco minutos a aproximadamente una hora, y seguidamente la mezcla
de reacción se calienta a una temperatura de aproximadamente 70ºC a
aproximadamente 110ºC durante dos horas a aproximadamente 4 horas
para formar los pirazoles de fórmulas VIII-d y
VIII-e. Los pirazoles de las fórmulas
VIII-d y VIII-e se convierten en
las acilguanidinas de las fórmulas VIII-f y
VIII-g, respectivamente, usando los métodos de
hidrólisis y acoplamiento descritos antes. Algunos de los métodos
útiles para la preparación de los compuestos descritos en esta
memoria pueden requerir la protección de una funcionalidad remota
(por ejemplo, amina primaria, amina secundaria, carboxilo en los
precursores de fórmula I). La necesidad de tal protección variará
dependiendo de la naturaleza de la funcionalidad remota y las
condiciones de los métodos de preparación. La necesidad de tal
protección la determina con facilidad un experto en la técnica. El
uso de tales métodos de protección/desprotección compete también al
saber de la técnica. Para una descripción general de grupos
protectores y su uso, véase T.W. Greene, Protective Groups in
Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Los compuestos de fórmula I de uso en esta
invención, cuando se usan en combinación con inhibidores
NHE-1, inhiben el sistema de transporte de
intercambio sodio/protón (Na^{+}/H^{+}) y, por tanto, son útiles
como agente terapéutico o profiláctico para enfermedades causadas o
agravadas por la aceleración del sistema de transporte sodio/potasio
(Na^{+}/H^{+}), por ejemplo, enfermedades cardiovasculares [por
ejemplo, arterioesclerosis, hipertensión, arritmia (por ejemplo,
arritmia isquémica, arritmia debida a infarto de miocardio, bloque
miocárdico, disfunción miocárdica, arritmia después de PTCA o
después de trombolisis, etc.), angina de pecho, hipertrofia
cardíaca, infarto de miocardio, fallo cardíaco (por ejemplo, fallo
cardíaco congestivo, fallo cardíaco agudo, hipertrofia cardíaca,
etc.), restenosis después de PTCA, PTCl, shock (por ejemplo, shock
hemorrágico, shock por endotoxinas, etc.)], enfermedades renales
(por ejemplo, diabetes mellitus, nefropatía diabética, fallo renal
isquémico agudo, etc.), trastornos orgánicos asociados con isquemia
o reperfusión isquémica [(por ejemplo, trastornos asociados a
reperfusión isquémica del músculo cardíaco, fallo renal agudo, o
trastornos inducidos por tratamientos quirúrgicos tales como
cirugías de injerto de bypass en arteria coronaria (CABG), cirugías
vasculares, trasplante de órganos, cirugías no cardíacas o
angioplastia percutánea transluminal coronaria (PTCA)], enfermedades
cerebrovasculares (por ejemplo, apoplejía isquémica, apoplejía
hemorrágica, etc.), trastornos cerebrales isquémicos (por ejemplo,
trastornos asociados a infarto cerebral, trastornos causados después
de apoplejía como secuelas, o edema cerebral.
Las metodologías para medir la actividad de
NEH-1 humano y la potencia inhibidora se basan en
las publicadas por Watson y otros, Am. J. Physiol.,
24:G229-G238, 1991), en las que se mide la
recuperación mediada por NHE del pH intracelular que sigue a la
acidificación intracelular. Así, se cultivan fibroblastos que
expresan establemente NHE-1 humano (Counillon, L. y
otros, Mol. Pharmacol., 44:1041-1045
(1993) sobre placas de 96 pocillos revestidas con colágeno
(50.000/pocillo) y se hacen crecer a confluencia en medio de cultivo
(DMEM alto en glucosa, 10% de suero fetal bovino, 50 u/ml de
penicilina y estreptomicina). Las placas confluentes se incuban
durante 30 minutos a 37ºC con la sonda fluorescente sensible a pH
BCECF (5 \muM; Molecular Probes, Eugene, OR). Las células cargadas
con BCECF se incuban a 37ºC durante 37 minutos en medio de carga
ácida (cloruro de colina 70 mM, NHCl_{4} 50 mM, KCl 5 mM,
MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH
7,5) y luego se ponen en un lector de placas Fluorescent Imaging
Plate Reader (Molecular Devices, CA). La fluorescencia de BCECF se
controla usando longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nM
y 525 nM, respectivamente. La acidificación intracelular se inicia
mediante sustitución por vía rápida del medio de carga ácida con
medio de recuperación (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM,
CaCl_{2} 1,8 mM, glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,5) \pm
combinación del ensayo, y la recuperación mediada por NHE del pH
intracelular se controla como posterior aumento dependiente del
tiempo de la fluorescencia de BCECF. La potencia de las
combinaciones de los compuestos de fórmula I de uso en esta
invención con inhibidores NEH-1 se calcula como la
concentración que reduce en 50% la recuperación del pH intracelular
(IC_{50}). En estas condiciones, los inhibidores NHE de referencia
amiloride y HOE-642 tenían valores de IC_{50} para
NEH-1 humano de 50 \muM y 0,5 \muM,
respectivamente.
Como información de base, se señala que breves
períodos de isquemia miocárdica seguida de reperfusión seguida de
reperfusión de la arteria coronaria protegen el corazón de una
severa isquemia miocárdica posterior (Mutty y otros,
Circulation, 74: 1124-1136, 1986).
Los efectos terapéuticos de la combinación de
compuestos de fórmula I con inhibidores NHE-1 en
cuanto a prevenir la lesión del tejido cardíaco resultante de un
ultraje isquémico se pueden demostrar in vitro según las
directrices presentadas por Liu y otros (Cardiovasc. Res.,
28:1057-1061, 1994), como se describe aquí
específicamente. La cardioprotección, puesta de manifiesto como
reducción del miocardio infartado, se puede inducir
farmacológicamente usando agonistas del receptor de adenosina en
corazones aislados, perfundidos retrógradamente como un modelo in
vitro de preacondicionamiento isquémico miocárdico (Liu y otros,
Cardiovasc. Res., 28:1057-1061, 1994).
El ensayo in vitro que se describe más adelante demuestra que
un compuesto que se ensaya o, en este caso, una combinación que se
ensaya (esto es, una combinación de un compuesto de fórmula I con un
antagonista de NHE-1) puede inducir
farmacológicamente también cardioprotección, esto es, un tamaño
reducido del infarto, cuando se administra a un corazón aislado de
conejo. Los efectos de la combinación que se ensaya se comparan con
el preacondicionamiento isquémico y el agonista A1/A3 de adenosina,
APNEA
(N^{6}-[2-(4-aminofenil)etil]adenosina)
que ha revelado que induce farmacológicamente cardioprotección en el
corazón de conejo aislado (Liu y otros, Cardiovasc. Res.,
28:1057-1061, 1994). Seguidamente se describe
la metodología exacta.
El protocolo usado para estos experimentos sigue
el descrito por Liu y otros, Cardiovasc. Res.,
28:1057-1061, 1994. Conejos macho New Zealand
White (3-4 kg) se anestesian con pentobarbital
sódico (30 mg/kg, i.v.). Lograda anestesia profunda (determinada por
la ausencia de reflejo de parpadeo ocular), se intuba el animal y se
ventila con O_{2} al 100% usando un ventilador de presión
positiva. Se realiza toracotomía izquierda, se expone el corazón y
se pone holgadamente un lazo (seda 2-0) en torno a
una rama prominente de la arteria coronaria izquierda,
aproximadamente a una distancia de 2/3 hacia el ápice del corazón.
Se extrae el corazón del pecho y rápidamente (en menos de 30 s) se
monta en un aparato Langendorff. El corazón se perfunde
retrocediendo de manera no recirculante con una solución de Krebs
modificada (NaCl 118,5 mM, KCl 4,7 mM, MgSO_{4} 1,2 mM,
KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, NaHCO_{3} 24,8 mM, CaCl_{2} 2,5 mM y
glucosa 10 mM) a una presión constante de 80 mm de Hg y una
temperatura de 37ºC. El pH del perfundido se mantiene a
7,4-7,5 burbujeando 95% de O_{2}/5% de CO_{2}.
La temperatura del corazón se controla estrechamente usando
depósitos calentados para la solución fisiológica y encamisados en
torno al tubo de perfusión y el corazón aislado. El latido del
corazón y la presión del ventrículo izquierdo se determinan mediante
un balón de látex que está insertado en el ventrículo izquierdo,
conectado a un transductor de presión mediante un tubo de acero
inoxidable. Se infla el balón intraventricular para tener una
presión sistólica de 80-100 mm de Hg y una presión
diastólica \leq 10 mm de Hg. También se controla continuamente el
flujo coronario usando una sonda de corriente en linea normalizada
para el peso del corazón.
Se deja que el corazón se equilibre durante 30
min, tiempo durante el cual el corazón muestra presiones estables en
el ventrículo izquierdo dentro de los parámetros indicados en lo que
antecede. Si las pulsaciones del corazón caen por debajo de 180 bpm
en cualquier momento antes del período de 30 min de isquemia
regional, el corazón se pone a un ritmo de aproximadamente 200 bpm
para el resto del experimento. El preacondicionamiento isquémico se
induce por el cese total de perfusión cardíaca (isquemia global)
durante 5 min, seguido de reperfusión durante 10 min. La isquemia
regional se logra estrechando el lazo en torno a la rama de la
arteria coronaria. Después de 30 min de isquemia regional, se libera
el lazo y se reperfunde el corazón durante 120 min más.
La cardioprotección farmacológica se induce por
infusión de la combinación de ensayo, esto es, una combinación de un
compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1, a
concentraciones predeterminadas, comenzando 30 min antes de la
isquemia regional y continuando hasta el final del período de 120
min de reperfusión. Los corazones que reciben la combinación de
ensayo no se someten al período de preacondicionamiento isquémico.
El compuesto de referencia, APNEA (500 nM), se perfunde a través de
los corazones (que no reciben el compuesto de ensayo) durante un
período de 5 min que termina 10 min antes de los 30 min de isquemia
regional.
Al final de los 120 min del período de
reperfusión, se estrecha el lazo de la arteria coronaria y se
perfunde una suspensión al 0,5% de partículas fluorescentes de
sulfato de zinc-cadmio (1-10 \mum,
Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA) a través del corazón; esto
tiñe la totalidad del miocardio, excepto la zona de riesgo para el
desarrollo de infarto (zona de riesgo). Se extrae el corazón del
aparato de Langendorff, se transfiere en seco, se envuelve en hoja
de aluminio y se almacena durante la noche a -20ºC. Al día
siguiente, el corazón se divide en rebanadas de 2 mm de corte
transversal desde el ápex a la parte de arriba de los ventrículos.
Las rebanadas se tiñen con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al
1%, durante 20 min a 37ºC, en solución salina tamponada con fosfato.
Puesto que el TTC reacciona con tejido vivo (que contiene
deshidrogenasas dependientes de NAD), esta tinción diferencia entre
tejido vivo (teñido en rojo) y tejido muerto (tejido infartado, no
teñido). Se calculan para cada rebanada del ventrículo izquierdo la
zona infartada (no teñida) y la zona de riesgo (sin partículas
fluorescentes) usando un analizador de imágenes precalibrado. Para
normalizar la lesión isquémica por diferencias en la zona de riesgo
entre corazones, los datos se expresan como media \pm d.e. y se
comparan estadísticamente usando un ensayo no paramétrico de
Mann-Whitney con corrección de Bonferroni para
comparaciones múltiples. Se considera significación como p <
0,05.
Los resultados del ensayo in vitro
anterior demuestran que una combinación de un compuesto de esta
invención con un inhibidor NHE-1 induce una
significativa cardioprotección comparativamente con el grupo de
control.
Los efectos terapéuticos de una combinación de un
compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1 en la
prevención de una lesión de tejido cardíaco que resulta de un
ultraje isquémico puede demostrarse también in vivo conforme
a las directrices presentadas por Liu y otros (Circulation,
vol 84:350-356, 1991) según se describe
específicamente en el trabajo). En los ensayos in vivo, se
estudia la cardioprotección de la combinación de ensayo, esto es, un
compuesto de fórmula I junto con un inhibidor NHE-1,
comparativamente con el grupo de control que recibe vehículo salino.
La cardioprotección, indicada por una reducción del miocardio
infartado, se puede inducir farmacológicamente usando agonistas de
receptores de adenosina administrados por vía intravenosa en conejos
intactos anestesiados, estudiados como modelo in situ de
preacondionamiento miocárdico isquémico (Liu y otros,
Circulation 84:350-356, 1991). El
ensayo in vivo determina si la presente combinación de un
compuesto de fórmula I con un inhibidor NHE-1 puede
inducir farmacológicamente protección, esto es un tamaño reducido
del infarto miocárdico, cuando se administra parenteralmente a
conejos anestesiados. Los efectos de la combinación de un compuesto
de fórmula I de esta invención con un inhibidor
NHE-11 pueden compararse a un preacondicionamiento
isquémico usando el agonista de adenosina A1,
N^{6}-1(fenil-2R-isopropil)
adenosina (PIA), que se ha demostrado que induce farmacológicamente
cardioprotección en conejos intactos anestesiados estudiados in
situ (Liu y otros, Circulation
84:350-356. 191). Seguidamente se describe la
metodología.
Conejos macho New Zealand White
(3-4 kg) se anestesian con pentobarbital sódico (30
mg/kg, i.v.). Se realiza una traqueotomía mediante una incisión
cervical ventral en la linea central y los conejos se ventilan con
oxígeno al 100% usando un ventilador de presión positiva. Se ponen
catéteres en la vena yugular izquierda para administración de
fármacos y en la arteria carótida izquierda para medir la presión
sanguínea. Los corazones se exponen luego mediante una toracotomía
izquierda y se pone un lazo (seda 00) en torno a una rama prominente
de la arteria coronaria izquierda. Se induce isquemia estrechando el
lazo y afianzándolo. La liberación del lazo permite reperfundir la
zona afectada. La isquemia miocárdica se evidencia por cianosis
regional; la reperfusión se pone de manifiesto por hiperemia
reactiva.
El ensayo empieza una vez que la presión arterial
y las pulsaciones cardíacas se han estabilizado durante al menos
cinco minutos. El preacondicionamiento isquémico se induce ocluyendo
la arteria coronaria durante 5 minutos, a lo que sigue una
reperfusión durante 10 minutos. El preacondicionamiento
farmacológico se induce por infusión de la combinación de ensayo,
esto es, una combinación de un compuesto de fórmula I de esta
invención con un inhibidor NHE-1, durante, por
ejemplo, 5 minutos y dejando 10 minutos antes de otra intervención o
por infusión del agonista de adenosina, PIA (0,25 mg/kg). Después
del preacondicionamiento isquémico, preacondicionamiento
farmacológico o sin acondicionamiento alguno (no acondicionado,
control con vehículo), se ocluye la arteria durante 30 min y luego
se perfunde durante dos horas para inducir infarto miocárdico. La
combinación de ensayo y el PIA se disuelven en solución salina u
otro vehículo adecuado y se suministran a 1 a 5 mg/kg,
respectivamente.
(Liu y otros, Circulation,
84:350-356, 1991): Al final del período de 2
horas de reperfusión, se extraen rápidamente los corazones, se
cuelgan en un aparato de Langendorff y se purgan durante 1 min con
solución salina normal calentada a la temperatura del cuerpo (38ºC).
La sutura de seda usada como lazo se aprieta estrechamente para
reocluir la arteria y se infunde una suspensión al 0,5% de
partículas fluorescentes de sulfato de zinc-cadmio
(1-10 \mum) con el perfundido para teñir todo el
miocardio excepto la zona de riesgo (ventrículo no fluorescente). Se
congelan luego rápidamente los corazones y se almacenan durante la
noche a -20ºC. Al día siguiente, el corazón se divide en rebanadas
de 2 mm de corte transversal y se tiñen con cloruro de
trifeniltetrazolio (TTC). Puesto que el TTC reacciona con tejido
vivo, esta tinción diferencia entre tejido vivo (teñido en rojo) y
tejido muerto (tejido infartado, no teñido). Se calculan para cada
rebanada del ventrículo izquierdo la zona infartada (sin teñir) y la
zona de riesgo (sin partículas fluorescentes) usando un analizador
de imagen precalibrado. Para normalizar la lesión isquémica por
diferencias en la zona de riesgo entre corazones, los datos se
expresan como relación de zona infartada a zona de riesgo (% de
A/AAR). Todos los datos se expresan como valor medio \pm d.e. y se
comparan estadísticamente usando el factor individual ANOVA o el
ensayo no paramétrico de Mann Whitney. La significación se
considera como p < 0,05.
La combinación de un compuesto de fórmula I con
un inhibidor NHE-1 se puede ensayar en cuanto a su
utilidad para reducir o prevenir la lesión isquémica en tejidos no
cardíacos, por ejemplo, el cerebro o el hígado, utilizando
procedimientos de la bibliografía científica. La combinación de un
compuesto de fórmula I de esta invención con un inhibidor
NHE-1 en tales ensayos se puede administrar por la
vía y con el vehículo de administración preferidos y en el momento
que se desee, antes, durante o después (período de reperfusión) del
episodio isquémico, o durante cualquiera de las etapas
experimentales que se mencionan en lo que sigue.
El beneficio de la combinación de inhibidores
NHE-1 y compuestos de fórmula I para reducir la
lesión isquémica cerebral se puede demostrar, por ejemplo, en
mamíferos usando el método de Park y otros (An. Neurol.,
1988, 24:543-551). De acuerdo con el
procedimiento de Park y otros, se anestesian ratas adultas macho
Sprague Dawley inicialmente con halotano al 2% y luego por
ventilación mecánica con una mezcla de óxido nitroso/oxígeno
(70%/30%) que contiene 0,5-1% de halotano. Se
realiza luego una traqueotomía. El volumen del golpe del ventilador
se ajusta para mantener la tensión arterial de dióxido de carbono a
aproximadamente 35 mm de Hg y una oxigenación arterial adecuada
(PaO_{2} > 90 mm de Hg). La temperatura del cuerpo se puede
controlar con un termómetro rectal y los animales pueden mantenerse
normotérmicos, si es necesario, mediante calentamiento exterior. Los
animales se someten seguidamente a craneotomía subtemporal para
exponer el tronco principal de la arteria media cerebral izquierda
(MCA) bajo un microscopio operativo, y la arteria expuesta se ocluye
con coagulación microbipolar para generar lesiones isquémicas
grandes en el cortex cerebral y ganglios basales. Después de 3 horas
de oclusión de MCA, las ratas se anestesian profundamente con
halotano al 2% y se realiza una toracotomía para infundir solución
salina heparinizada en el ventrículo izquierdo. El efluente se
recoge mediante una incisión del atrio derecho. Al lavado con
solución salina sigue el lavado con aproximadamente 200 ml de
formaldehído al 40%, ácido acético glacial y solución de metanol
absoluto (FAM; 1:1:8, v/v/v), luego se decapitan los animales y la
cabeza se almacena en fijativo durante 24 horas. Se extrae luego el
cerebro, se disecciona, se embebe en cera de parafina y se secciona
(aproximadamente 200 secciones de 0,2 mm por cerebro). Las secciones
se tiñen luego con hematoxilina-eosina o con una
combinación de violeta de cresilo y azul intenso Luxol y se examinan
con microscopio óptico para identificar y cuantificar la lesión
isquémica usando un analizador de imagen precalibrado. Los volúmenes
y superficies isquémicos se expresan en unidades absolutas (mm^{3}
y mm^{2}) y como porcentaje de la región total examinada. El
efecto de las composiciones y métodos de esta invención para reducir
la lesión isquémica cerebral inducida por oclusión de MCA se observa
sobre la base de una reducción de la superficie o volumen de lesión
isquémica relativa o absoluta en las secciones de cerebro de ratas
del grupo de tratamiento en comparación con secciones de cerebro de
ratas del grupo de control tratado con placebo.
Entre otros métodos que se podrían utilizar
alternativamente para demostrar los usos de la invención para
reducir la lesión isquémica cerebral están incluidos los descritos
por Nakayama y otros, Neurology, 1988,
38:1667-1673; Memezawa y otros, en
Stroke, 1992, 23:552-559; Folgergrova
y otros, en Proc. Natl, Acad. Sci., 1995,
92:5057-5059; y Gotti y otros, en Brain
Res., 1990, 522:290-307.
Los usos de esta invención para reducir la lesión
isquémica del hígado se pueden demostrar, por ejemplo, en mamíferos
usando el método de Yokoyama y otros (Am. J. Physiol.
258:G564-G570). De acuerdo con el método de
Yokohama y otros, se anestesian ratas macho adultas Sprague Dawley
en ayunas con pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.) y luego se
traqueotomizan los animales y se ventilan mecánicamente con aire
ambiente. Se extirpa el hígado y se pone en una cámara ambiental
mantenida a temperatura constante (37ºC), luego se perfunde a través
de la vena portal a una presión constante de 15 cm de agua con
tampón de Krebs-Henseleit modificado, exento de
hemoglobina (en mM: NaCl 118, KCl 4,7, NaHCO_{3} 27, CaCl_{2}
2,5, MgSO_{4} 1,2, KH_{2}PO_{4} 1,2, EDTA 0,05 y glucosa 11
mM, más 300 U de heparina). El pH del perfundido se mantiene a 7,4
gaseando el tampón con 95% de O_{2}/5% de CO_{2}. Cada hígado
se perfunde a un caudal de 20 ml/min en una sola pasada durante un
período de lavado y equilibramiento de 30 min, seguidamente un
período de 2 horas de isquemia global y luego un período de 2 horas
de reperfusión en condiciones idénticas a las del período
preisquémico. Durante el período preisquémico, se recogen partes
alícuotas (20 ml) del perfundido, inmediatamente después del período
isquémico oclusivo y cada 30 minutos del período de 2 horas de
reperfusión. Las muestras perfundidas se examinan en cuanto a la
aparición de enzimas hepatocelulares, por ejemplo, aminotransferasa
de aspartato, (AST), aminotransferasa de alanina (ALT) y
lactato-deshidrogenasa (LDH), que se toman para
reflejar cuantitativamente el grado de lesión isquémica de tejido
hepático durante el procedimiento. Las actividades de AST, ALT y LDH
en el perfundido se pueden determinar por varios métodos, por
ejemplo, por el método de reflectometría usando un analizador
automático Kodak Ektachem 500 al que hacen referencia Nakano y otros
(Hepatology 1995, 22:539-545). Se
toma nota del efecto de las composiciones y métodos de esta
invención en cuanto a reducir la lesión hepática isquémica inducida
por oclusión, sobre la base de una reducción de la liberación de
enzimas hepatocelulares inmediatamente después del período oclusivo
y/o durante el período de reperfusión postisquémica en los hígados
perfundidos de ratas del grupo de tratamiento en comparación con
hígados perfundidos de ratas en un grupo de control tratado con
placebo.
Entre otros métodos y parámetros que,
alternativamente, se podrían utilizar para demostrar el efecto
beneficioso de esta invención para reducir la lesión isquémica del
hígado están incluidos los descritos por Nakano y otros
(Hepatology, 1995, 22:539-545).
En lo que sigue, se denominan colectivamente
"composiciones y compuestos activos de uso en esta invención"
los compuestos de fórmula I, las sales farmacéuticamente aceptables
de cualquiera de los anteriores y composiciones farmacéuticas que
comprenden un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente
aceptable del mencionado compuesto y (a) un inhibidor de
aldosa-reductasa o una sal farmacéuticamente
aceptable del mencionado inhibidor de
aldosa-reductasa, o (b) un inhibidor
NHE-1 o una sal farmacéuticamente aceptable del
mencionado inhibidor NHE-1.
Los compuestos activos y las composiciones de uso
en esta invención pueden administrarse a un sujeto que necesita ser
tratado, por varias vías convencionales de administración, incluidas
las vías oral, parenteral y tópica. Por lo general, los compuesto de
fórmula I y sus sales farmacéuticamente aceptables se administrarán
oralmente o parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del sujeto a tratar por
día, preferiblemente de aproximadamente 1 a 15 mg/día, en una dosis
o en dosis divididas. Generalmente, las composiciones que contienen
un compuesto de fórmula I y un inhibidor de
aldosa-reductasa se administrarán oral o
parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg de cada
componente activo (esto es, el compuesto de fórmula I y el inhibidor
de aldosa-reductasa) por kg de peso corporal del
sujeto a tratar por día, preferiblemente de aproximadamente 1 a 25
mg/kg. Las composiciones que contienen un compuesto de fórmula I y
un inhibidor NHE-1 se administrarán, generalmente,
oral o parenteralmente a dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg del
mencionado compuesto de fórmula I por kg de peso corporal del sujeto
a tratar por día y a dosis de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg/día
del mencionado inhibidor NHE-1. Una dosificación
especialmente preferida contiene entre aproximadamente 1 y 50
mg/kg/día del mencionado compuesto de fórmula I y entre
aproximadamente 0.01 y 50 mg/kg/día del mencionado inhibidor
NHE-1.
Los compuestos activos y las composiciones de uso
en esta invención pueden administrarse solos o en combinación con
vehículos farmacéuticamente aceptables, en dosis únicas o múltiples.
Entre los vehículos farmacéuticos adecuados están incluidos
diluyentes sólidos inertes o cargas, soluciones acuosas estériles y
varios disolventes orgánicos. Las composiciones farmacéuticas
formadas combinando los compuestos activos de fórmula I y los
vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden administrar luego
en una variedad de formas de administración tales como comprimidos,
polvos, losanges, jarabes, soluciones inyectables, etc. Si se desea,
estas composiciones farmacéuticas pueden contener ingredientes
adicionales tales como agentes saboreadores, aglutinantes,
excipientes, etc. Así, a fines de administración oral, se pueden
utilizar comprimidos que contienen varios excipientes tales como
citrato sódico, carbonato cálcico y fosfato cálcico junto con
desintegrantes tales como almidón, ácido algínico y ciertos
silicatos complejos, a la vez que agentes aglutinantes tales como
polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Además,
frecuentemente se usan agentes lubricantes tales como estearato
magnésico, laurilsulfato sódico y talco para favorecer la
preparación de comprimidos. Las composiciones sólidas de un tipo
similar se pueden usar también como cargas en cápsulas de gelatina
blanda o dura. Entre los materiales preferidos para esto están
incluidos lactosa o azúcar de la leche en polietilenglicoles de alto
peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas o elixires
para administración oral, el ingrediente activo esencial puede
combinarse con varios agentes edulcorantes o saboreadores, materias
coloreadoras o colorantes y, si se desea, agentes emulsivos o
suspensivos, junto con diluyentes tales como agua, etanol,
propilenglicol, glicerina y combinaciones de ellos.
Para administración parenteral, se pueden emplear
soluciones de los compuestos activos y composiciones de esta
invención en aceite de sésamo o cacahuete, propilenglicol acuoso o
en soluciones acuosas estériles. Tales soluciones acuosas deben
estar adecuadamente tamponadas si es necesario y, primeramente, el
diluyente líquido se hace isotónico con suficiente solución salina o
glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente
adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea
e intraperitoneal. En este aspecto, los medios acuosos estériles
empleados son preparables fácilmente por técnicas estándar conocidas
por los expertos en la técnica.
Los compuestos activos y las composiciones de uso
en esta invención pueden emplearse, más en particular, en la
preparación de soluciones oftálmicas. Tales composiciones oftálmicas
tienen un interés principal para el tratamiento de cataratas
diabéticas por administración tópica. Para el tratamiento de
cataratas diabéticas, los compuestos activos y las composiciones de
uso en esta invención se administran en el ojo en forma de un
preparado oftálmico de acuerdo con la práctica farmacéutica
convencional. El preparado oftálmico contendrá un compuesto de la
fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto de
fórmula I, en una concentración de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 1% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,05
a aproximadamente 0,5%, en una solución, suspensión o ungüento
farmacéuticamente aceptable. En preparados oftálmicos que contienen
una combinación de un compuesto de fórmula I y un inhibidor de
aldosa-reductasa, cada ingrediente activo estará
presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 a aproximadamente
1% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,005 a
aproximadamente 0,25%, en una solución, suspensión o ungüento
farmacéuticamente aceptable.
La administración de los compuestos de fórmula I
puede hacerse por cualquier vía que suministre un compuesto de esta
invención preferentemente al tejido deseado (por ejemplo, los
tejidos pancreático, hepático y/o cardíaco). Entre estas vías están
incluidas las vías oral, parenteral, intraduodenal, etc. Por lo
general, los compuestos de la presente invención se administran en
una dosis única (por ejemplo, una dosis al día) o dosis múltiples, o
por infusión constante.
Generalmente, un compuesto de fórmula I se
administra oralmente o parenteralmente (por ejemplo, por vía
intravenosa, intramuscular, subcutánea o intramedular). También
puede estar indicada la administración tópica, por ejemplo, cuando
el paciente sufre trastornos gastrointestinales o cuando lo mejor es
aplicar la medicación sobre la superficie de un tejido u órgano
conforme a lo que determine el médico que atiende al paciente.
La cantidad y la cronología de aplicación de los
compuestos que se administran dependerá, obviamente, del sujeto que
se está tratando, la severidad de la dolencia, el modo de
administración y el criterio del médico que atiende al paciente.
Así, a causa de la variabilidad de paciente a paciente, las dosis
que se indican más adelante tienen el carácter de directrices y el
médico puede recetar dosis del fármaco que considera que son las
apropiadas para el paciente. Al tener en cuenta el grado de
tratamiento deseado, el médico debe plantear una solución de
compromiso entre una variedad de factores tales como la edad del
paciente, la presencia de una enfermedad preexistente, así como la
presencia de otras enfermedades.
Así por ejemplo, en un modo de administración,
los compuestos de fórmula I se pueden administrar antes de cirugía
(por ejemplo, veinticuatro horas antes de cirugía cardíaca), durante
o después de cirugía (por ejemplo, veinticuatro horas después de
cirugía) cuando hay riesgo de isquemia miocárdica. Los compuestos de
fórmula I también pueden administrarse diariamente de manera
crónica.
Por lo general, los compuestos de la presente
inyección se administran en forma de una composición farmacéutica
que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula I de esta
invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable. Así, los compuestos de fórmula I se pueden administrar
individualmente o combinados en cualquier forma convencional de
dosificación oral, parenteral, rectal o transdérmica.
A los fines de administración transdérmica (por
ejemplo, tópica), se preparan soluciones diluidas estériles, acuosas
o parcialmente acuosas (usualmente de una concentración de
aproximadamente 0,1% a 5%) similares, por lo demás, a las soluciones
parenterales anteriores.
Los métodos para preparar varias composiciones
farmacéuticas con una cierta cantidad de ingrediente activo son
conocidos, o podrán establecerlos los expertos en la técnica a la
luz de esta descripción. Para ver ejemplos de métodos de preparación
de composiciones farmacéuticas, véase Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19ª. edición
(1995).
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la
invención pueden contener, por ejemplo, 0,0001%-95% de
compuesto(s) de esta invención. En cualquier caso, la
composición o formulación a administrar contendrá una cantidad de
un(os) compuesto(s) de acuerdo con la invención en una
cantidad efectiva para tratar la enfermedad/dolencia del sujeto que
se está tratando.
Los dos compuestos diferentes de esta combinación
de esta invención se pueden coadministrar simultáneamente o
secuencialmente, o como una única composición farmacéutica que
comprende un compuesto de fórmula I y un inhibidor de
aldosa-reductasa como se ha descrito antes, o un
inhibidor de glicógeno-fosforilasa como se ha
descrito antes, o un agente cardiovascular.
Generalmente, los compuestos de fórmula I de uso
en esta invención se administrarán en una formulación
conveniente.
En las formulaciones que siguen, "ingrediente
activo" significa un(os) compuesto(s) de uso en
esta invención.
\newpage
Formulación
1
Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los
ingredientes siguientes:
| Ingrediente | Cantidad (mg/cápsula) |
| Ingrediente activo | 0,25-100 |
| Almidón, NF | 0-650 |
| Polvo de almidón deslizable | 0-50 |
| Fluido de silicona de 350 x 10^{-6} m^{2} s^{-1} | 0-15 |
Formulación
2
Se prepara una formulación en comprimidos usando
los ingredientes siguientes:
| Ingrediente | Cantidad (mg/comprimido) |
| Ingrediente activo | 0,25-100 |
| Celulosa microcristalina | 200-650 |
| Dióxido de silicio ahumado | 10-650 |
| Ácido esteárico | 5-15 |
Se mezclan los componentes y se comprimen para
formar comprimidos.
Alternativamente, se preparan como sigue
comprimidos, cada uno con un contenido de 0,25-100
mg de ingrediente activo.
Formulación
3
| Ingrediente | Cantidad (mg/comprimido) | |
| Ingrediente activo | 0,25-100 | |
| Almidón | 45 | |
| Celulosa microcristalina | 35 | |
| Polivinilpirrolidona (solución al 10% en agua) | 4 | |
| Carboximetilcelulosa sódica | 4,5 | |
| Estearato magnésico | 0,5 | |
| Talco | 1 |
Se hacen pasar el ingrediente activo, el almidón
y la celulosa a través de un tamiz de malla U.S. nº. 45 y se mezclan
íntimamente. Se mezcla la solución de polivinilpirrolidona con los
polvos resultantes y luego se hace pasar la mezcla a través de un
tamiz de malla U.S. nº. 14. Los gránulos así producidos se secan a
50ºC-60ºC y se hacen pasar por un tamiz de malla
U.S. nº. 18. Se hacen pasar el carboximetilalmidón sódico, el
estearato magnésico y el talco a través de un tamiz de malla U.S.
nº. 60 y luego se añaden a los gránulos que, después de mezclar, se
comprimen en una máquina para obtener los comprimidos.
Se preparan como sigue suspensiones, cada una con
un contenido de 0,25-100 mg de ingrediente activo
por dosis de 5 ml.
\newpage
Formulación
4
| Ingrediente | Cantidad (mg/5 ml) |
| Ingrediente activo | 0,25-100 mg |
| Carboximetilcelulosa sódica | 50 mg |
| Jarabe | 1,25 mg |
| Solución de ácido benzoico | 0,10 ml |
| Agente saboreador | s. a. |
| Colorante | s. a. |
| Agua purificada hasta | 5 ml |
Se hace pasar el ingrediente activo a través de
un tamiz de malla U.S. nº. 45 y se mezcla con la
carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta
uniforme. Se diluyen con algo de agua la solución de ácido benzoico,
el agente saboreador y el colorante y se añaden a la pasta mientras
que se agita. Se añade luego suficiente agua para producir el
volumen requerido.
Se prepara una solución de aerosol que contiene
los ingredientes siguientes.
Formulación
5
| Ingrediente | Cantidad (% en peso) |
| Ingrediente activo | 0,25 |
| Etanol | 25,75 |
| Propulsor 22 (clorodifluorometano) | 74,00 |
El ingrediente activo se mezcla con etanol y la
mezcla se añade a una porción del propulsor 22, se enfría a 30ºC y
se pasa a un dispositivo de llenado. Se aporta luego la cantidad
requerida a un recipiente de acero inoxidable y se disuelve con el
resto de propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula al
recipiente.
Se preparan supositorios como sigue:
Formulación
6
| Ingrediente | Cantidad (mg/supositorio) |
| Ingrediente activo | 250 |
| Glicéridos de ácido graso saturado | 2.000 |
Se hace pasar el ingrediente activo a través de
un tamiz de malla U.S. nº. 60 y se pone en suspensión en los
glicéridos de ácido graso saturado previamente fundidos usando el
mínimo calor necesario. La mezcla se vierte luego en un molde para
supositorios de una capacidad nominal de 2 g y se deja enfriar.
Se prepara como sigue una formulación
intravenosa:
Formulación
7
| Ingrediente | Cantidad |
| Ingrediente activo | 25 mg-10.000 mg |
| Solución salina isotónica | 1.000 ml |
La solución de los ingredientes indicados se
administra intravenosamente a un paciente.
El ingrediente anterior también puede ser una
combinación de agentes.
Los puntos de fusión se determinaron con un
aparato capilar de puntos de fusión Thomas-Hoover y
son sin corregir. Los espectros de RMN ^{1}H se obtuvieron con los
espectrómetros Bruker AM-250 (Bruker Co., Billerica,
Massachusetts), Bruker AM-300, Varian
XL-300 (Varian Co., Palo Alto, California) o Varian
Unity 400 a aproximadamente 23ºC a 250, 300 ó 400 MHz para protón.
Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón
(\Box) en relación a cloroformo residual (7,26 ppm),
dimetilsulfóxido (2,49 ppm) o metanol (3,30 ppm) como referencia
interna. Las formas de los picos se denotan como sigue: s, singlete;
d, doblete; t, triplete; q, cuartete; m, multiplete; c, complejo;
anc, ancho. Los espectros de masa de baja resolución se obtuvieron
en condiciones de termoproyección (TS^{+}) en un espectrómetro de
masas Fisons (ahora Micromass) Trio 1000 Mas Spectrometer (Micromass
Inc., Beverly, Massachusetts) en condiciones de ionización química
en un espectrómetro Hewlett Packard 5989A Particle Beam Mass
Spectrometer (Hewlett Packard Co, Palo Alto, California), o por
ionización química a presión atmosférica (APCI) en un Fisons (ahora
Micromass) Platform II Spectrometer. Las rotaciones ópticas se
obtuvieron en un polarímetro Perkin-Elmer 241 MC
(Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut) usando una
longitud estándar de paso de 1 dcm a aproximadamente 23ºC a la
concentración indicada en el disolvente indicado.
La cromatografía de líquidos en columna se
realizó usando corriente forzada (cromatografía rápida) del
disolvente indicado en Baker Silica Gel (4 0 \mum, J.T. Baker,
Phillipsburg, New Jersey) o Silica Gel 60 (EM Sciences, Gibbstown,
New Jersey) en columnas de vidrio o usando presión baja de nitrógeno
o aire en cartuchos Flash 40^{MC} o Flash 12^{MC} (Biotage,
Charlottesville, Virginia). La cromatografía radial se realizó
usando un aparato Chromatron (Harrison Research, Palo Alto,
California). Los términos "concentrado" y "evaporado" se
refieren a la eliminación de disolvente usando un evaporador
rotatorio a la presión de aspiración de agua o a presiones similares
generadas por un aparato Büchi B-171 Vacobox
(Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, New York) o Büchi
B-177 Vacobox con una temperatura del baño igual o
menor que 50ºC. Las reacciones que requerían el uso de hidrógeno gas
a presiones superiores a 1 atmósfera se realizaron usando un aparato
de hidrógeno de Parr (Parr Instrument Co., Moline, Ilinois). A no
ser que se especifique lo contrario, los reactivos se adquirieron de
fuentes comerciales. Las abreviaturas "d", "h" y
"min" corresponden a "día(s)", hora(s) y
"minuto(s)", respectivamente.
Etapa
A
Se calienta a 160ºC en un aparato de destilación
una mezcla de 2-metoxi-propionamida
(preparada de acuerdo con Freudenberg y Market, Chem. Ber.,
1927, 60, 2453; 3,0 g, 29,1 mmol), pentóxido de fósforo (4,13
g, 29,1 mmol) y arena seca (3,0 g) y se recoge el destilado (1,01 g,
44%); [\alpha]_{D} + 139,2 (C=1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,5 (d, 3H), 3,45 (s, 3H), 4,15 (q,
1H).
Etapa
B
Se hizo pasar cloruro de hidrógeno gas a una
solución enfriada con hielo de
(R)-2-metoxi-propionitrilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa A, 9,91 g,
116,5 mmol) en etanol anhidro (100 ml) hasta que la solución se
saturó con el gas. La mezcla de reacción se almacenó en una nevera
durante la noche. Se eliminó en vacío el exceso de etanol,
obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 1, Etapa B, como un
sólido delicuescente (19,5 g; rend. de 100%);
[\alpha]_{D} + 46,4 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 3H), 3,4 (s, 1H), 3,7 (q,
2H), 4,8 (q, 1H), 6,2 (b, 1H).
Etapa
C
Una solución del éster etílico del ácido
(R)-2-metoxi-propionimídico
en etanol se enfrió en baño de hielo y se hizo pasar amoniaco gas a
la solución hasta que la mezcla de reacción se saturó con amoniaco.
La mezcla de reacción se agitó durante la noche. Se eliminó el
exceso de etanol para obtener un líquido similar a un jarabe, que se
trituró con dietil éter (100 ml). El sólido resultante se filtró
para recoger el compuesto del Ejemplo 1, Etapa C (12,2 g), p.f.
60-75ºC; [\alpha]_{D} + 45,4 (c= 1,
metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 3), 3,4
(s, 3H), 3,7 (q, 1H), 5,8 (b, 1H), 6,5 (b, 1H).
Etapa
D
Se agitó a temperatura ambiente durante 24 h una
mezcla de
(R)-2-metoxi-propionamidina
(preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa C, 10,0 g,
72,15 mmol),
2-etoxi-carboniletenolato
(preparado de acuerdo con la Preparación Uno, Etapa C, 19,93 g,
144,3 mmol) y agua (50 ml). La mezcla de reacción se neutralizó
añadiendo suficiente HCl conc. para ajustar el pH a aproximadamente
7,0 y se sometió a extracción con cloruro de metileno. El extracto
se secó sobre sulfato sódico anhidro, se evaporó a sequedad y el
residuo se cromatografió sobre gel de sílice. Por elución con una
mezcla 95:5 de cloruro de metileno/metanol y evaporación del
eluyente, se obtuvo un aceite viscoso espeso (1,7 g);
[\alpha]_{D} + 76,4 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 Mhz) \delta 1,51 (d, 3H), 3,44 (s, 3H), 4,29 (q,
1H), 7,91 (d, 1H), 11,00 (b, 1H).
Etapa
E
A una solución enfriada con hielo de
(R)-2-metoximetil-4-hidroxi-pirimidina
(1,69 g, 10,95 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) se añadió
primeramente trietilamina (1,7 ml, 12,05 mmol) y luego cloruro de
mesilo (1,38 g, 12,05 mmol). La mezcla de reacción se agitó a la
temperatura del hielo durante 20 min y luego se calentó a
temperatura ambiente. Después de 1 hora, se apagó la reacción con
solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, se recogió la capa
orgánica y se lavó con agua (10 ml), se secó sobre sulfato sódico,
se filtró y se evaporó el filtrado, obteniéndose un aceite (2,11 g,
83%). [\alpha]_{D} + 69,2 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,52 (d, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,62 (s,
3H), 4,53 (q, 1H), 7,00 (d, 1H), 8,80 (d, 1H).
Etapa
F
A una solución de
(R)-2-(1-metoxietil)-pirimidin-4-il-metanosulfonato
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa E, 2,11 g,
9,1 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) se añadió
dimetilsulfamoílpiperazina (preparada de acuerdo con el método
descrito en la patente U.S. nº. 2.748.129, 1,94 g, 10 mmol) y
seguidamente trietilamina (1,4 ml, 10 mmol). La mezcla de reacción
se mantuvo a reflujo durante 15 h y se evaporó, obteniéndose un
residuo oleoso. Éste se sometió a extracción con acetato de etilo
(20 ml) y luego se lavó el extracto primeramente con una solución
acuosa saturada de bicarbonato sódico y luego con agua (10 ml). El
extracto en acetato de etilo se secó sobre sulfato sódico, se filtró
y se evaporó el filtrado, obteniéndose un producto en bruto que se
cromatografió sobre gel de sílice. Después de eluir con una mezcla
9:1 de acetato de etilo/metanol y evaporar los disolventes, se
obtuvo el compuesto del título del Ejemplo 1, Etapa F (1,75 g, 59%);
p.f. 65-70ºC, [\alpha]_{D} + 54,4º (c =
1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,48 (d,
3H), 2,89 (s, 6H), 3,31 (m, 4H), 3,37 (s, 3H), 3,78 (m, 4H), 4,34
(q, 1H), 6,41 (d, 1H), 8,30 (d, 1H).
Etapa
G
A una solución enfriada a la temperatura del
hielo de dimetilamida del ácido
(R)-4-[2-(1-metoxi-etil)-pirimidin-4-il]piperazin-1-sulfónico
(preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 1, Etapa F, 1,75 g,
5,31 mmol) en cloruro de metileno (53 ml) se añadió tribromuro de
boro (10,6 ml, 10,6 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante
1 h. Se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y
se apagó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. La
capa de cloruro de metileno se lavó con agua (20 ml), se secó sobre
sulfato sódico, se filtró y el filtrado se evaporó para obtener un
residuo sólido que se cristalizó de una mezcla de isopropil éter y
cloruro de metileno, resultando el compuesto del título como un
sólido blanco (642 mg, 38%); p.f. 103-105ºC;
[\alpha]_{D} + 16,1º (c = 1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,48 (d, 6H), 2,83 (s, 3H), 3,31 (m,
4H), 3,74 (m, 4H), 4,70 (q, 1H), 6,40 (d, 1H), 8,21 (d, 1H); MS (Cl)
M^{+1} 316.
Etapa
A
A una solución de dimetilamida del ácido
4-[2-hidroxi-metil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
(preparada de acuerdo con el método descrito en la patente U.S. nº.
5.138.058; 12,12 g, 40,2 mmol) en cloruro de metileno (100 ml) se
añadió una solución de cloruro de oxalilo (3,9 ml, 44,2 mmol) y la
mezcla de reacción se enfrió a -78ºC. A la mezcla de reacción se
añadió a gotas una solución de DMSO (6,27 ml, 88,4 mmol) en cloruro
de metileno (20 ml) para mantener la temperatura de la mezcla de
reacción a -70ºC o más baja. Después de 2 h, se añadió a gotas
trietilamina (28,0 ml, 88,4 mmol) y se dejó que la mezcla de
reacción alcanzara la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se
diluyó con agua (200 ml) y la capa orgánica recogida se lavó con
solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. Se recogió la capa
orgánica lavada, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el
filtrado se evaporó para obtener un sólido. El sólido se trituró con
éter (20 ml) y se filtró la mezcla, obteniéndose el compuesto del
título del Ejemplo 2, Etapa A (10,84 g, 94%); p.f.
124-127ºC.
Etapa
B
A una solución enfriada a -5ºC de dimetilamida
del ácido
4-(2-formil-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
(preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa A, 419 g,
14 mmol) en tetrahidrofurano seco (100 ml) se añadió una solución de
bromuro de metilmagnesio en éter (7,6 ml, 23,1 mmol). Después de 20
min, se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura
ambiente y luego se mantuvo a reflujo durante 30 min. Después de
enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se apagó con
solución saturada de cloruro amónico y luego se sometió a extracción
con acetato de etilo (2 x 50 ml). Se recogió la capa orgánica, se
secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se evaporó el filtrado,
obteniéndose un sólido de color amarillo pálido (4,21 g, 95%); p.f.
115-116ºC.
Etapa
C
A una solución que contiene dimetilamida del
ácido
4-[2-(1RS-hidroxietil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
(preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa B, 0,9 g,
2,86 mmol), dimetoxietano (5,7 ml) y acetato de vinilo (10,5 ml) se
añadió lipasa P30 (90 mg, 10%) y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 14 días. Se filtró y el filtrado se
evaporó, obteniéndose un aceite pardo que se cromatografió sobre gel
de sílice. Eluyendo con mezcla 95:5 de ecetato de etilo/metanol y
evaporando luego el eluyente, se obtuvo el compuesto del título del
Ejemplo 2, Etapa C, como un aceite claro (220 mg, 43%);
[\alpha]_{D} + 41,9 (c = 1, metanol); RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 Mhz) \delta 1,55 (d, 6H), 2,2 (s, 3H), 2,9 (s,
6H), 3,3 (m, 4H), 3,8 (m, 4H), 6,35 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,25 (d,
1H).
Etapa
D
Se agitó a temperatura ambiente durante 1 h una
solución que contenía acetato de
R-1-[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)-
pirimidin-2-il]etilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 2, Etapa C, 200 mg,
0,56 mmol), dioxano (4 ml), metanol (0,5 ml) e hidróxido potásico (4
gotas, solución acuosa al 20%). Se diluyó con agua (10 ml), se
sometió a extracción con acetato de etilo (2 x 10 ml), se recogió
la capa orgánica, se secó sobre sulfato sódico y el filtrado se
evaporó para obtener el compuesto del título del Ejemplo 2 como un
sólido blanco que tiene las mismas características de identificación
indicadas para el compuesto del Ejemplo 1.
Etapa
A
Se añadió
(R,S)-2-hidroxietil-4-hidroxi-pirimidina
(preparada de acuerdo con la Preparación Uno, Etapa D, 21,75 g,
155,2 mmol) a dioxano (650 ml) que contenía butirato de vinilo
(17,72 g, 310 mmol) y la mezcla se calentó a 50ºC. A la solución
resultante se añadió lipasa P30 (4,35 g) y se continuó calentando
durante 24 horas. Se filtró la mezcla de reacción y se evaporó el
filtrado, obteniéndose un residuo líquido espeso siruposo. El
residuo se repartió entre cloruro de metileno (300 ml) y agua (600
ml) y se recogió la capa de cloruro de metileno, se secó sobre
sulfato sódico anhidro y luego se filtró. Se evaporó el filtrado,
obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 3, Etapa A, como un
líquido incoloro (9,35 g, 86%); [\alpha]_{D} +29,5 (c =
1, metanol); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t,
3H), 1,65 (m, 5H), 2,4 (m, 2H), 5,65 (q, 1H), 6,45 (d, 1H), 8,0 (d,
1H).
Etapa
B
Una solución a 0ºC de butirato de
(R)-1-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo
(10,5 g, 50,0 mmol) y trietilamina (6,06 g, 97,8 mmol) en
diclorometano (100 ml) se añadió a gotas cloruro de metanosulfonilo
(6,29 g, 55,0 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h.
La mezcla se lavó sucesivamente con bicarbonato saturado y agua, se
secó sobre sulfato magnésico y se filtró. Se evaporó el filtrado,
obteniéndose acetato de
(R)-1-(4-metano-sulfoniloxi-pirimidin-2-il)-etilo,
12,6 g (91%), como un aceite. Éste se disolvió en tetrahidrofurano
(100 ml), a esta solución se añadió piperazina (7,57 g, 88,0 mmol) y
se agitó a temperatura ambiente durante 12,0 h. Se filtró la mezcla
y el filtrado se concentró y luego se mantuvo a presión reducida
durante 3 h, obteniéndose el compuesto del título como un aceite,
10,2 g (73%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t,
3H), 1,56 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,48 (t, 2H), 2,83 (m, 4H), 3,63
(m, 4H), 5,53 (q, 1H), 6,35 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS (TS)
279(MH^{+}).
Etapa
C
A una solución de butirato de
(R)-1-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 3, Etapa B, 1,49 g,
5,00 mmol), trietilamina (0,61 g, 6,0 mmol) y tetrahidrofurano (20,0
ml) se añadió cloruro de N,N-dimetilsulfamoílo (0,86
g, 6,0 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. La
mezcla se diluyó con agua y se sometió dos veces a extracción con
acetato de etilo. El extracto en acetato de etilo se lavó una vez
con agua (10 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se
concentró el filtrado, obteniéndose el compuesto del título del
Ejemplo 3, Etapa B, como un aceite (0,72 g, 87%). RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,55 (d, 6H), 1,55 (d,
3H), 1,6-1,7-(m, 4H), 2,42 (t, 2H), 3,2 (m, 1H),
3,45 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 5,4 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,1 (d,
1H).
Etapa
D
Se combinó butirato de
R-1[4-(4-dimetilsulfamoil-piperazin-1-il)-pirimidin-2-
il]-etilo (preparado de acuerdo con el método del
Ejemplo 3, Etapa B, 230 mg, 0,60 mmol) con ácido clorhídrico
concentrado (5,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 6 h,
se diluyó con agua, se ajustó el pH de la solución a 9,9 con
hidróxido sódico acuoso 6 N y se sometió dos veces a extracción con
acetato de etilo. El extracto se lavó una vez con agua, se secó
sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado para
obtener un aceite que se purificó por cromatografía rápida (9:1,
cloruro de metileno: metanol). Después de evaporar el eluyente, se
obtuvo un aceite que se cristalizó en isopropil éter, resultando el
compuesto del título del Ejemplo 3, que tenía las mismas
características de identificación dadas para el compuesto del
Ejemplo 1.
Etapa
A
A una solución de butirato de
(R)-1-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 3, Etapa B, 2,1 g,
7,5 mmol), trietilamina (0,91 g, 9,0 mmol) en cloruro de metileno
(37 ml) se añadió cloruro de isopropilsulfonilo (1,3 g, 9,0 mmol) a
temperatura ambiente y se agitó durante 14 h. La mezcla se lavó con
agua (2 x 20 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se
concentró el filtrado, obteniéndose butirato de
(R)-{1-4-[4-propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimi-din-2-il}-etilo
como un aceite claro (2,05 g, 87%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300
MHz) \delta 0,95 (t, 3H), 1,42 (d, 6H), 1,55 (d, 3H),
1,6-1,7 (m, 4H), 2,42 (t, 2H), 3,2 (m, 1H), 3,45 (m,
4H), 3,74 (m, 4H), 5,4 (q, 1H), 6,4 (d, 1H), 8,1 (d, 1H).
MS(Cl) M^{+1} 385.
Etapa
B
A una solución de butirato de
(R)-{1-4-[4-propano-2-sulfonil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2-il}-etilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 4, Etapa A, 1,9 g,
4,92 mmol) en metanol (30 ml) se añadió a temperatura ambiente
hidróxido potásico acuoso 6,0 N (5,0 ml). Después de agitar durante
3,0 h, la solución se diluyó con cloruro de metileno (50 ml) y se
lavó dos veces con agua (10 ml). Se separó la capa orgánica, se secó
sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado,
obteniéndose un aceite viscoso que se purificó por cromatografía
rápida usando una mezcla 9:1 de cloruro de metileno/etanol. La
evaporación de los disolventes dio un sólido que se cristalizó en
ciclohexano, obteniéndose el compuesto del título del Ejemplo 4 como
un sólido blanco (1,2 g, 77%). p.f. 65ºC-66ºC. RMN
^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,4 (d, 6H), 1,54 (d, 3H),
3,23 (m, 1H), 3,4 (m, 4H), 3,6-3,8 (m, 4H), 4,75 (m,
1H), 6,46 (d, 1H), 8,12 (d, 1H). MS(Cl) M^{+1} 315;
[\alpha]_{D} + 14,5 (c = 1,0, MeOH).
Ejemplo comparativo
1
Etapa
A
A una solución de
2-(S-1-hidroxietil)-3H-pirimidin-4-ona
(preparada de acuerdo con el método de Preparación Cuatro, 1,40 g,
10 mmol), trietilamina (2,22 g, 22 mmol) en cloruro de metileno (20
ml) se añadió N,N-dimetilaminopiridina (0,06 g, 0,5
mmol) y seguidamente anhídrido butírico (1,74 g, 11 mmol) a 0ºC.
Después de agitar a temperatura ambiente durante 1,0 h, la mezcla se
lavó con agua y la capa de cloruro de metileno se secó sobre sulfato
magnésico y se filtró. Se concentró el filtrado, resultando el
compuesto del título como un aceite (1,97 g, 94%). RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,94 (t, 3H), 1,49 (d, 3H), 1,68 (m,
2H), 2,38 (t, 2H), 5,64 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS (Cl)
211 (MH^{+}); [\alpha]_{D} -44,3 (c = 1,0, MeOH).
Etapa
B
A una solución enfriada a 0ºC de butirato de
1-(S)-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo
(preparado de acuerdo con el Ejemplo 5, Etapa A, 0,42 g, 2,0 mmol)
y trietilamina (0,20 g, 2,2 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) se
añadió a gotas cloruro de mesilo (0,25 g, 2,1 mmol) y se agitó
durante 1,5 h. La mezcla se lavó sucesivamente con bicarbonato
sódico saturado y agua y la capa orgánica se secó sobre sulfato
magnésico anhidro. Se filtró y evaporó, obteniéndose butirato de
1-(S)-(4-metanosulfoniloxi-pirimidin-2-il)-etilo
como un aceite. El aceite se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml) y
a la solución se añadió piperazina 0,69 g, 8,0 mmol) y se agitó a
temperatura ambiente durante 4 h. Se filtró la mezcla y se concentró
el filtrado obteniéndose un producto en bruto que se purificó por
cromatografía rápida (9:1 cloruro de metileno/metanol), obteniéndose
el compuesto del título del Ejemplo 5, Etapa B, como un aceite (0,50
g, 90%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 0,95 (t, 3H),
1,51 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,83 (m, 4H), 3,63 (m,
4H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251
(MH^{+}).
Etapa
C
A una solución de butirato de
1(S)-(4-piperazin-1-il-pirimidin-2-il)-etilo
(preparado de acuerdo con el método del Ejemplo 5, Etapa B, 0,52 g,
1,8 mmol), trietilamina (0,21 g, 2,0 mmol) y tetrahidrofurano (5,0
ml) se añadió cloruro de N,N-dimetilsulfamoílo (0,29
g, 1,8 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. La
mezcla se diluyó con agua y se sometió dos veces a extracción con
acetato de etilo. El extracto se lavó una vez con agua (10 ml), se
secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró el filtrado,
obteniéndose un aceite. El aceite se disolvió en ácido clorhídrico
concentrado (3,0 ml), se agitó a temperatura ambiente durante 6 h,
se diluyó con agua y el pH de la solución se ajustó a 9,0 con
hidróxido sódico acuoso 6 N. La mezcla de reacción se sometió a
extracción con acetato de etilo (2 x 10 ml) y el extracto se lavó
una vez con agua (10 ml), se secó sobre sulfato magnésico, se filtró
y se concentró el filtrado, obteniéndose un aceite que se purificó
por cromatografía rápida (cloruro de metileno: metanol 95:5),
resultando un aceite. La trituración del aceite con ispropil éter
dio el compuesto del Ejemplo 5 como un sólido blanco (0,16 g,
27,2%); p.f. 99ºC-100ºC. RMN ^{1}H/CDCl_{3}, 300
MHz) \delta 1,48 (d, 6H), 2,83 (s, 3H), 3,32 (m, 4H), 3,74 (m,
4H), 4,69 (q, 1H), 6,41 (d, 1H), 8,21 (d, 1H). MS(Cl)
M^{+1} 316. [\alpha]_{D} - 16,9 (c = 1,0, MeOH).
Preparación
Uno
Etapa
A
Una solución de (RS)-lactonitrilo
(378 g, 5,32 mol) en etil éter (1,46 l) y etanol (0,34 l) se saturó
con cloruro de hidrógeno gas a 0ºC-5ºC durante 0,5 h
y se mantuvo a 5ºC durante 60 h. Se separó por filtración el sólido
y se lavó dos veces con etil éter, obteniéndose hidrocloruro del
éster etílico del ácido 2-hidroxipropionimídico
como un sólido (815 g, 99%); p.f. 165-168ºC. RMN
^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,38 (t,
3H), 4,49 (q, 1H), 6,56-7,11 (s anc, 1H).
Etapa
B
Se saturó con amoniaco gas durante 1 h,
manteniendo la temperatura interna por debajo de 5ºC, una suspensión
de hidrocloruro del éster etílico del ácido
2-hidroxi-propionimídico (preparado
de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa A, 751 g, 4,87
mol) en etanol (75 l) a 0ºC. Se agitó luego a temperatura ambiente
durante 18 h. Se separó por filtración el sólido y se secó en vacío
a 40ºC para obtener un sólido. El filtrado se concentró a la mitad
de volumen y se recogió una segunda cosecha de sólido que se secó en
vacío y se combinó con la primera cosecha, obteniéndose hidrocloruro
de 2-hidroxi-propionamidina como un
sólido amarillo (608 g, 99%); p.f. 134-138ºC. RMN
^{1}H (DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,33 (t,
3H), 4,42 (q, 1H), 6,25-6,88 (s anc, 1H),
8,72-9,25 (s anc, 3H).
Etapa
C
A una suspensión de hidruro sódico (dispersión al
60% en aceite) (269 g, 16,7 mol) el isopropil éter (12 l) se añadió
lentamente acetato de etilo (1280 g, 14,2 mol) a la velocidad
adecuada para mantener una temperatura interna de 45ºC. Se añadió
luego a gotas formiato de etilo (2232 g, 30,13 mol) a 42ºC y se
agitó a temperatura ambiente durante 18 h. Se filtró la mezcla y se
lavó con etil éter (2 x 300 ml) y con hexanos (500 ml) y se secó el
sólido, obteniéndose
2-etoxi-carboniletenolato sódico
como un sólido blanco (1930 g, 99%). RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,03 (t, 3H), 3,86
(q, 2H), 4,08 (d, 1H), 8,03 (d, 1H).
Etapa
D
A una solución de
2-etoxicarboniloetenolato sódico (preparado de
acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa C, 1301 g, 9,42
mol) en agua (1,3 l) se añadió una solución acuosa de hidrocloruro
de 2-hidroxi-propionamida (preparada
de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa B, 610 g, 4,9
mol) en agua (1,3 l) a temperatura ambiente y se agitó durante 48
h. Se ajustó con ácido acético el pH de la solución a 7,0 y luego se
sometió a extracción continua con cloroformo durante 48 h. El
extracto se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El filtrado se
concentró para obtener un sólido que se puso en suspensión en etil
éter, se filtró y se secó el residuo sólido, obteniéndose el
compuesto del título de la Preparación Uno (232 g, 38%). p.f-
121-124ºC. RMN ^{1}H
(DMSO-d_{6}, 300 MHz) \delta 1,45 (d, 1H), 4,42
(q, 1H), 6,25-6,88 (s anc, 1H).
Preparación
Dos
Se añadió (RS
2-hidroxietil)-4-hidroxipirimidina
(preparada de acuerdo con el método de la Preparación Uno, Etapa D,
2,1 g, 15,07 mol) a dioxano (63 ml) que contenía acetato de vinilo
(4,3 g, 50 mol) y la mezcla se calentó a 50ºC. A la solución
resultante se añadió lipasa P30 (0,21 g) y se continuó calentando
durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se
evaporó para obtener un residuo líquido espeso siruposo. El residuo
se cromatografió sobre gel de sílice y se sometió a elusión rápida
con una mezcla 95:5 de cloruro de metileno y metanol. Por
evaporación del eluyente recogido se obtuvo el compuesto del título
como un líquido incoloro (0,97 g, 92%); [\alpha]_{D} +
39,9º (c = 1, metanol). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta
1,61 (d, 3H), 2,2 (s, 3H), 5,65 (q, 1H), 6,35 (d, J = 6 Hz, 1H),
7,97 (d, 1H), 11,94 (s, 1H).
\newpage
Preparación
Tres
A una solución enfriada con hielo de butirato de
1-(S)-(4-hidroxi-pirimidin-2-il)-etilo
(0,42 g, 2,0 mmol) y trietilamina (0,20 g, 2,2 mmol) en cloruro de
metileno (10 ml) se añadió a gotas cloruro de mesilo (0,25 g, 2,1
mmol) y se agitó durante 1,5 h. La mezcla se lavó sucesivamente con
solución saturada de bicarbonato y agua y la fase orgánica se secó
sobre sulfato magnésico anhidro. Se filtró y evaporó, obteniéndose
1-(S)-(4-metanosulfoniloxi-pirimidin-2-il)etilo
como un aceite. El aceite se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml) y
a la solución se añadió piperazina (0,69 g, 8,0 mmol), y se agitó a
temperatura ambiente durante 4 horas. Se filtró la mezcla y el
filtrado se concentró en vacío para obtener un producto en bruto que
se purificó por cromatografía rápida (9:1 de cloruro de
metileno/metanol), obteniéndose el compuesto del título como un
aceite (0,50 g, 90%). RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz) \delta
0,95 (t, 3H), 1,51 (d, 3H), 1,68 (m, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,83 (m,
4H), 3,63 (m, 4H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,24 (d, 1H).
MS(Cl) 251 (MH^{+}).
Preparación
Cuatro
Se separó
2-(1RS-hidroxietil)-3H-pirimidin-4-ona
(30 g) en sus enantiómeros individuales por HPLC preparativa. Se
cargaron en una columna chiralpak AS (5 cm x 50 cm) inyecciones
múltiples de 4 g y se eluyó con hexano/etanol (85:15) a un caudal de
75 ml/min. Se analizaron las fracciones usando una columna analítica
AS de 25 cm eluyendo con heptano: etanol: dietilamina (85:15:0,05).
Se juntaron las fracciones que eluían más rápidamente (7,2 min) y se
evaporó la combinación, obteniéndose
2-(1S-hidroxi-etil-3H-pirimidin-4-ona
como un aceite (9,9 g, recuperación de 66%). RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,51 (d, 3H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d,
1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+});
[\alpha]_{D} - 69,8 (c = 1,0, MeOH).
[\alpha]_{D} - 69,8 (c = 1,0, MeOH).
Se juntaron las fracciones que eluían más
lentamente (9,1 min) y se evaporó la combinación, obteniéndose
2-(1R-hidroxi-etil-3H-pirimidin-4-ona
como un aceite (12,4 g, recuperación de 80%). RMN ^{1}H
(CDCl_{3}, 300 MHz) \delta 1,51 (d, 3H), 5,54 (q, 1H), 6,38 (d,
1H), 8,24 (d, 1H). MS(Cl) 251 (MH^{+}) ;
[\alpha]_{D} + 65,8 (c = 1,0, MeOH).
Principio
Reacción 1
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ SDH\+\cr D-sorbitol + NAD ^{+} \+
<-----------> \+ D-fructosa +
H ^{+} \cr}
Reacción 2
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ diaforasa\+\cr NaDH + INT (incoloro) \+ <-----------> \+
INTH (violeta) +
NAD ^{+} \cr}
Reactivos
Reactivo 1
Solución tampón de fosfato potásico 100 mM, pH
7,0. Se disuelven 6,8 g de KH_{2}PO_{4} (Fischer nº.
P285-500) y 8,7 g de K_{2}HPO_{4} (Fischer nº.
P288-500) en aprox. 990 ml de agua, se ajusta el pH
a 7,0 con KOH 5 N y se añade agua a un volumen de 1000 ml.
Reactivo 2
Dinucleótido de
\beta-nicotinamida adenina (NAD^{+}). Sigma nº.
N-7129.
Reactivo 3
Diaforasa (EC 1.8.1.4 de Clostridium kluyveri)
Sigma nº. D-5540.
Reactivo 4
Colorante violeta de yodotetrazolio (INT). Sigma
nº. I-8377.
Se prepara una solución 10 mM disolviendo 253 mg
de INT en un volumen final de 50 ml de agua destilada. Se requiere
un calentamiento a aproximadamente 50ºC durante 30 min, mientras que
se agita, para disolución completa.
Reactivo 5
Soluciones de SDH recombinante humana o de
rata.
Pan Ver nº. R1820 o R1828, respectivamente,
aproximadamente 0,5 mg/ml.
Los compuestos se disuelven en DMSO al 20% (v/v)
a una concentración 5 mM. Se realizan diluciones seriales con DMSO
al 20% para obtener 10x concentraciones finales deseadas.
Se añaden a 25 ml de tampón de fosfato 22,4 mg de
NAD^{+}, 14,8 mg de diaforasa y 21 \mul de rSDH humana o 146
\mul de rSDH de rata. Después de mezclar en una mezcladora de
rotación, se añaden 2,7 ml de solución de INT.
Se añaden 25 \mul de DMSO o soluciones de
ensayo a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96
pocillos. Se añaden 200 \mul de reactivo de trabajo a cada pocillo
y se deja incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para
iniciar la reacción se añaden 25 \mul de
D-sorbitol 20 mM. Se controla durante 10 minutos a
temperatura ambiente la absorbancia a 495 nm. Se compara la
velocidad de aumento de A_{495} para cada pocillo que contiene
compuesto con la de los pocillos que contienen sólo DMSO. Se calcula
la inhibición porcentual como:
% de inhibición =
\frac{{A_{495} \ no \ inhibido \ - \ A_{495} \ inhibido}}{{A_{495}
\ no \ inhibido}} x
100
| Fosfato potásico | 90 mM, pH 7,0 |
| NAD^{+} | 1 mM |
| INT | 1 mM |
| Sorbitol | 2 mM |
| SDH 2 nM (r SDH humana) o | 14 nM (rSDH de rata) |
| IC_{50}, nM (SDH humana) |
Dimetilamida del ácido
4-[2-(1R-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
Dimetilamida del ácido
4-[2-(1S-hidroxi-etil)-pirimidin-4-il)-piperazin-1-sulfónico
Claims (4)
1. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de fórmula I
o una de sus sales farmacéuticamente
aceptable,
en la que R es N,N-dimetilamino o
isopropilo, para la preparación de un medicamento para tratamiento o
prevención de complicaciones diabéticas en un
mamífero.
2. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de fórmula I según se ha definido en la reivindicación 1,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor de
aldosa-reductasa (ARI), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento
para tratamiento o prevención de complicaciones diabéticas en un
mamífero.
3. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de fórmula I según se ha definido en la reivindicación 1,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y un inhibidor del
intercambio iónico sodio hidrógeno (NHE-1), o una de
sus sales farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un
medicamento para tratamiento o prevención de complicaciones
diabéticas en un mamífero.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada complicación
diabética es neuropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía
diabética, úlceras del pie o un trastorno cardiovascular.
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