ES2214667T3 - Complejo enzimatico. - Google Patents

Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE UN COMPLEJO ENZIMATICO RICO EN XILANASA MEDIANTE EL CULTIVO DE UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE XILANASA DEL GENERO TRICHODERMA EN UN MEDIO DE CULTIVO QUE TIENE DENTRO COMO INDUCTOR DE XILANASA Y AL MISMO TIEMPO COMO FUENTE DE CARBONO UN BAGAZO DE AGUARDIENTE DE GRANO PRETRATADO, COMPRENDIENDO EL PRETRATAMIENTO UNA SEPARACION DE LOS COMPONENTES SOLIDOS DEL BAGAZO, UNA CONCENTRACION DE LOS COMPONENTES NO EVAPORABLES MEDIANTE EVAPORACION DEL AGUA Y DE OTRAS SUSTANCIAS EVAPORABLES, ASI COMO UN TRATAMIENTO EN AUTOCLAVE DEL CONCENTRADO DE BAGAZO QUE RESULTA. DE ACUERDO CON OTRO ASPECTO DEL PROCEDIMIENTO DE LA INVENCION SE UTILIZA ADEMAS COMO INDUCTOR DE XILANASA Y COMO FUENTE DE NITROGENO HARINA DE SOJA SIN ACEITE O HERVIDO DE HARINA DE SOJA; MEDIANTE LA ADICION DE LA HARINA DE SOJA SIN ACEITE O DE HERVIDO DE HARINA DE SOJA SE CONSIGUE AL AÑADIRLO AL BAGAZO PRETRATADO UNA ELEVACION DE LA PRODUCCION DE XILANASA. LOS COMPLEJOS ENZIMATICOS OBTENIDOS MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO DE LA INVENCION SE PUEDEN UTILIZAR DE MANERA DIRECTA PARA LA PREPARACION DE COMIDA PARA ANIMALES, EN PARTICULAR COMIDA PARA AVES; SU UTILIZACION EN ALIMENTOS QUE CONTIENEN CENTENO, PAJA O TRITICALES UNA EXCELENTE INFLUENCIA EN LA REDUCCION DEL EFECTO ANTINUTRITIVO DE LOS POLISACARIDOS NO AMILACEOS Y UNA MEJOR DIGESTION Y ABSORCION DE LOS ALIMENTOS EN EL INTESTINO DE LOS ANIMALES.

Description

Complejo enzimático.

La presente invención se refiere a un procedimiento de fermentación para la obtención de complejos enzimáticos ricos en xilanasa, empleando como inductor de la formación de xilanasa las vinazas pretratadas de destilerías de cereales.

Como es sabido, la xilanasa es la denominación que se da a una enzima perteneciente a las hemicelulasas, que hidroliza los xilanos (o "goma de la madera") convirtiéndolos en xilosa y otros azúcares. La enzima es conocida además como endo-1,4-\beta-D-xilanasa o 1,4-\beta-D-xilano-xilanohidrolasa y pertenece al grupo enzimático EC 3.2.1.8. Los xilanos propiamente dichos, que son polisacáridos de D-xilopiranosas unidas mediante enlaces 1,4-\beta-glicósido y poseen cadenas laterales cortas de distintas composiciones y contienen además en su molécula arabinosa, glucosa, galactosa y/o ácido glucurónico e incluso grupos acetilo y metilo, son componentes de muchos árboles frondosos y de coníferas así como de cereales, de salvado, de pectina, de tragacanto, de gomas vegetales, etc. Por su existencia natural en la madera, los xilanos son los materiales naturales más abundantes. Por su gran variedad estructural, la descomposición completa de los xilanos ramificados, parcialmente acetilados, requiere la intervención de diversas xilanasas, que provocan la hidrólisis de los xilanos en xilosa y otros azúcares. Esta intervención de las xilanasas es compleja y se realiza siempre en combinación con otras enzimas (que en algunos casos tienen una acción sinergética).

Las xilanasas son generadas por hongos, p.ej. Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces y Sporotrichum y por bacterias, p.ej. Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermononspora y Ruminococcus. Se utilizan en la industria de la celulosa sobre todo como agentes blanqueantes y de acabado y, en fechas más recientes, en la fabricación de piensos para animales. En lo tocante al último campo de aplicación, los estudios realizados sobre el uso de enzimas exógenas, p.ej. xilanasas, en piensos que contienen centeno, cebada o trigo, apuntan a una influencia positiva de los preparados en cuestión en la reducción del efecto antinutritivo de los polisacáridos no derivados del almidón y en la mejor digestión y absorción de los materiales nutritivos en el intestino de los animales. El principal grupo de enzimas, que se utilizan actualmente sobre todo para el engorde de pollos, está constituido precisamente por aquellas enzimas que permiten hidrolizar los polisacáridos no derivados del almidón que existen en los cereales, por ejemplo la cebada, el trigo y el centeno. Ya se están comercializando diversos preparados que contienen estas enzimas, por ejemplo la Roxazyme® G (Roche) que, como enzimas principales, contiene celulosa, \beta-glucanasa y xilanasa. Estos preparados se agregan al pienso animal por las ventajas ya mencionadas que conllevan; los complejos enzimáticos ricos en xilanasa, obtenidos según la invención, son materiales muy útiles para la fabricación de estos preparados. El uso de las xilanasas como aditivos para el pienso en la dieta avícola constituye un importante campo de aplicación, habida cuenta de que se extrae por ejemplo un valor nutritivo mucho mayor del pienso de los pollos con respecto al que aportan los especies de cereales de bajo valor energético, como son la cebada, la avena, el centeno y el trigo, a las que no se añada tal aditivo [ver Mh. Vet.-Med. 48, 213-217 (1993) y las referencias que en él se
citan].

La presente invención se refiere, como ya se ha mencionado antes, a un procedimiento para la obtención de los complejos enzimáticos en cuestión y que consiste en concreto en el cultivo de un microorganismo del género Trichoderma que genere la xilanasa en un medio de cultivo que contiene fundamentalmente fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y determinadas sales y en el aislamiento del complejo enzimático resultante, rico en xilanasa (y al mismo tiempo con menor contenido de celulasa y de \beta-glucanasa), del medio de cultivo. Los microorganismos en especial del género Trichoderma se consideran generadores de actividad polisacarolítica con una acusada prioridad de la celulolítica (es decir, la actividad se dirige con preferencia a la descomposición de la celulosa). Se han realizado muchos ensayos para modificar este espectro de actividad, entre otros con el objetivo de incrementar selectivamente la actividad xilanolítica. Para ello se han añadido al medio de cultivo (medio de fermentación) materiales que contienen xilano para lograr la inducción de la formación de xilanasa. Son ejemplos de ello los xilanos purificados, el salvado de trigo, las mondas de cebada, las mazorcas molidas (harina de husillo de maíz), la paja y las vinazas de destilerías de cereales. De este modo se ha logrado desplazar el espectro de actividad en el sentido de una mayor actividad de la xilanasa [ver los fundamentos tecnológicos en las patentes alemanas DD 278 359 y DD 291 673; la publicación de patente europea EP 0 455 928 A1; Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 224-229 (1993); y Enzyme & Microb. Technol. 18, 495-501 (1996)]. Este efecto inductor se logra con costes favorables sobre todo con las vinazas de destilerías de cereales; sin embargo, estas vinazas a medida que aumentan su concentración desarrollan un efecto inhibidor sobre el crecimiento y la formación de enzimas del microorganismo en cuestión.

Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que un tratamiento previo especial de las vinazas de destilería, empleadas como inductoras, que consiste en la evaporación del agua y otros componentes volátiles, se traduce en la eliminación de los efectos inhibidores molestos mencionados anteriormente de las vinazas de destilería y en el incremento del efecto inductor, de modo que se dispone con ventaja para la aplicación de una forma concentrada, tratada de esta manera, de las vinazas de destilación de cereales. La formación enzimática inducida a raíz del tratamiento, realizada durante el cultivo del microorganismo (en el fermentador), aporta un cambio importante en el espectro enzimático: la actividad xilanolítica supera la actividad de las demás enzimas, es decir, la actividad celulolítica y glucanolítica, en varios porcentajes: se logra un desplazamiento sorprendente de la relación entre xilanasa y la celulasa en favor de la xilanasa.

La presente invención tiene por objetivo la obtención de un complejo enzimático rico en xilanasa (y al mismo tiempo provisto de menor cantidad de celulosa y de \beta-glucanasa) por cultivo de un microorganismo generador de xilanasa del género Trichoderma en un medio de cultivo específico.

Este objetivo se alcanza según la invención empleando en el cultivo como medio de inducción de la formación de xilanasa (denominado a continuación "inductor de xilanasa") y al mismo tiempo como fuente de carbono las vinazas pretratadas de destilación de cereales, el tratamiento previo consiste en la separación de las porciones sólidas de las vinazas de destilación, en la concentración de los componentes no volátiles por evaporación de agua y de otras sustancias volátiles y en el posterior tratamiento en autoclave del concentrado resultante de las vinazas de destilación.

Como microorganismos del género Trichoderma, que pueden generar xilanasa y que se emplean en el procedimiento de la invención para la obtención de un complejo enzimático rico en xilanasa, se toman en consideración en especial las mutantes de Trichoderma (T.) reesei, que se derivan de la cepa original QM6a, p.ej. la QM 9123, QM 9414, M 18.2, M 18.2-y, Rut M-7 y Rut NG-14 (ver Bland S. Montenecourt, "Trichoderma reesei cellulases", Trends in Biotechnology, vol. 1, nº 5, páginas 156-160, 1983 y las referencias que se citan en dicho trabajo).

Se han depositado (registrado) algunas de las cepas de los microorganismos recién citados, por ejemplo:

QM6a: ATCC 13631, CCM F-560, CMI 45548, DSM 768;

QM9123: ATCC 24449;

QM 9414: ATCC 26921, CCM F-522, DSM 769;

M 18.2: DSM 10683; y

M 18.2-y: DSM 7537.

Las cepas de microorganismos T. reesei QM 6a, QM 9123 y QM 9414 figuran en los catálogos de los organismos internacionales de depósito, p.ej. en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSM) y/o en la American Type Culture Collection (ATCC) y, por consiguiente, pueden adquirirse de estas o de otras fuentes. La cepa de microorganismos M 18.2 se depositó con fecha 14 de mayo de 1996 por parte de Biopract GmbH, Rudower Chaussee 5, D-12489 Berlín, en la DSM para la conservación a largo plazo y recibió el número de depósito DSM 10683; con fecha 12 de junio de 1998, Biopract GmbH solicitó a DSM que convirtiera el anterior depósito en un depósito con arreglo al Tratado de Budapest. Finalmente, con fecha 31 de agosto de 1989 se depositó la cepa de microorganismos M 18.2-y con arreglo al Tratado de Budapest en el Instituto Central de Terapias Microbianas y Experimentales
(ZIMET) de Jena con el número de depósito IMET 43915. Con fecha 4 de marzo de 1993 se transfirió esta cepa al DSM de Braunschweig, donde recibió el nuevo número de depósito DSM 7537. A raíz de las transmisiones de propiedad, la empresa F. Hoffmann-La Roche AG obtuvo finalmente el derecho de propiedad de la cepa de microorganismos T. reesei M 18.2-y.

Las vinazas pretratadas de destilación de cereales que se emplean en el procedimiento de la invención como inductor de xilanasa y al mismo tiempo como fuente de carbono proceden de vinazas que pueden adquirirse en destilerías de cereales, donde normalmente se consideran un producto residual. Las vinazas de destilación (sin tratar) se forman en la producción de aguardientes de centeno del modo siguiente, ya conocido: sobre la base de centeno, agua y enzimas (exo- y endoglucanasas) se realiza la fermentación del almidón del centeno para obtener alcohol mediante levaduras en un proceso a 30ºC que dura tres días. Después de destilar el alcohol queda un residuo o mezcla prácticamente libre de almidón de centeno en forma de vinazas de destilación.

La composición de las vinazas de destilación de distintas partidas está sometida a las oscilaciones habituales de los productos naturales y contiene principalmente hidratos de carbono (celulosa, hemicelulosa, pentosano), pequeñas cantidades de albúminas, sales minerales, grasas y cantidades residuales de etanol y de otros productos de la fermentación con levaduras.

El tratamiento previo de las vinazas de destilación consiste fundamentalmente en la separación de los sólidos, la concentración de los materiales no volátiles y el tratamiento en autoclave del material concentrado resultante. Estas etapas del tratamiento previo tienen las características preferidas siguientes:

- La separación de los sólidos de las vinazas de destilación por decantación y separación mediante un separador de platos (p.ej. del tipo SA 1, de la empresa Westfalia Separator AG, Oelde, Alemania). El volumen de la fracción de sólidos a desechar se sitúa entre el 30 y el 50% del volumen de las vinazas de destilación.

- La concentración de los componentes no volátiles de las vinazas, ya ricas en sólidos, mediante un evaporador de recirculación con vacío (p.ej. del tipo VUV 20-I, de la empresa Schott & Gen, Jena, Alemania) a una temperatura de ebullición que se sitúa entre 40 y 50ºC y con una presión de vapor acorde con la temperatura de las vinazas de destilación libres de sólidos. En estas condiciones se consigue la deseada reducción de volumen de las vinazas de destilación libres de sólidos del orden del 80 al 90% en una hora. La concentración de los componentes no volátiles se sitúa, por tanto, en un valor de 1:5 a 1:10.

- El tratamiento en autoclave de las vinazas concentradas, libres de sólidos, a 121ºC (a ser posible a 121\pm1ºC) por lo menos durante 30 minutos.

Para el procedimiento de la invención se toman en consideración como medio de cultivo no solo las vinazas pretratadas de destilación, sino también otras fuentes de carbono, por ejemplo la lactosa, la celulosa, el xilano, el salvado de trigo, el jarabe de glucosa y el agua de hinchamiento de maíz secada por atomización.

Otras fuentes de carbono especialmente preferidas son la lactosa, la celulosa y el xilano de mondas de avena.

Como fuentes de nitrógeno para el medio de cultivo se toman en consideración entre otros el sulfato amónico [(NH_{4})_{2}SO_{4}], el agua amoniacal [NH_{3}-H_{2}O] y la harina de soja después de haberle extraído el aceite (fuente orgánica de nitrógeno). Con respecto a la fuente de carbono, la fracción nitrogenada se sitúa de modo conveniente por lo menos en el 20%.

Como fuente de fósforo para el medio de cultivo se toma en consideración p.ej. el dihidrogenofosfato potásico (KH_{2}PO_{4}). Con respecto a la fuente de carbono, la fracción de fósforo se sitúa de modo conveniente por lo menos en el 2,5%.

El medio de cultivo contiene de modo conveniente otras sales y como tales se toman en consideración entre otros el sulfato de magnesio, de hierro, de manganeso y de cinc así como el cloruro de calcio y de cobalto.

En calidad de componente adicional del medio de cultivo puede utilizarse por ejemplo un antiespumante, p.ej. el M-30 (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Alemania), el Glanapon DG 102 (Bussetti, Viena, Austria) o el MAZU 8005 (Quest International, Cork, Irlanda).

En el procedimiento de la invención se utiliza de modo conveniente de 35 a 45 g/l, con preferencia 40 g/l de unas vinazas de destilación pretratadas, concentradas diez veces, con respecto al volumen total del medio de cultivo. El volumen del inóculo de Trichoderma reesei se sitúa de modo conveniente en el 10% del volumen total del medio de cultivo.

El pH del cultivo se sitúa de modo conveniente en el intervalo de 5,5 a 6,5, con preferencia en torno a 6,0. El ajuste del pH del medio de cultivo se realiza de modo conveniente con agua amoniacal en una concentración del 12,5 al 25% (referido al NH_{3}).

En lo tocante a la temperatura de cultivo, esta se sitúa de modo conveniente entre 28 y 34ºC, con preferencia en torno a 31ºC.

Como aparato de fermentación se puede utilizar un aparato de cultivo (fermentador) corriente, en el que habrá que prestar mucha atención a excluir las infecciones por gérmenes ajenos. Estos recipientes de cultivo están dotados normalmente entre otros de un dispositivo agitador y de un dispositivo de gasificación para la alimentación de aire, ya que el cultivo practicado según la invención es un cultivo sumergido aeróbico del microorganismo. El número revoluciones del agitador y la insuflación de aire deberán regularse de modo conveniente de manera que la concentración de oxígeno en el medio de cultivo no se sitúe por debajo del 10% del valor de saturación de
oxígeno.

Para la ejecución del procedimiento de la invención es idónea en especial la técnica denominada "fed batch" (partida con carga posterior), en la que la primera etapa (fase "batch") es un fermentación en discontinuo y la segunda etapa consiste en la alimentación del sustrato (fase "fed batch").

La fase "batch" se dedica al cultivo del micelio en el medio de cultivo, la inoculación del fermentador se realiza de modo conveniente en tres etapas (i)-(iii):

(i) Enjuague de los conidios de un cultivo inclinado de agar de la colonia original de microorganismos con agua del grifo esterilizada. De modo conveniente, el agua contiene un emulsionante, p.ej. el Tween® 80 (en este caso en una concentración de aprox. 1 g/l). La suspensión de conidios se ajusta de modo conveniente a una concentración por lo menos de 5 x 10^{8} conidios/l, en especial entre 5 x 10^{8} y 1 x 10^{9} conidios/l.

(ii) Con la suspensión de conidios de la etapa (i) se inoculan matraz de agitación, que contienen de modo conveniente medios de cultivo conocidos para hongos del género Trichoderma reesei basados en glucosa o celulosa como fuente de carbono; y fosfato, nitrato, urea, peptona y oligoelementos [ver por ejemplo R. Haapala, E. Parkkinen, P. Suominen y S. Linko, "Production of extracellular enzymes by immobilized Trichoderma reesei in shake flask cultures", Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 815-821 (1995)]. La proporción volumétrica entre la suspensión de conidios y el medio de cultivo dentro del matraz de agitación se sitúa de modo conveniente entre 1:25 y 1:50. En estos matraces agitables se cultivan los conocidos a 31\pm1ºC (30-32ºC), con preferencia en torno a 31ºC, y con una frecuencia de agitación de 200 a 300 rpm, con preferencia de 250 rpm, hasta que se haya formado un medio de cultivo con micelio bien ramificado. Sin embargo, todavía no debería observarse la formación de esporas.

(iii) Con el medio de cultivo de la etapa (ii) se inocula el fermentador, para ello la proporción volumétrica entre el medio de cultivo y el medio de cultivo en el fermentador deberá situarse de modo conveniente entre 1:5 y 1:10, con preferencia en 1:5.

En la siguiente fase "fed batch" se realiza fundamentalmente la formación de enzimas. La adición de la solución de sustrato (aporte de sustrato), fundamentalmente de las vinazas pretratadas de la destilación de cereales, como inductor; de la harina de soja después de haberle extraído el aceite o del residuo de cocción de la harina de soja como fuente orgánica de nitrógeno; y de lactosa como fuente de carbono; se regula de modo conveniente mediante un dispositivo regulador o de una regulación de procesos asistida por ordenador partiendo del desprendimiento o liberación de dióxido de carbono específico del micelio. La adición de sustrato puede regularse por ejemplo a través de la concentración de dióxido de carbono del gas salido (residual) de la fermentación o bien puede realizarse a lo largo de un programa temporal determinado experimentalmente.

Según otro aspecto de la presente invención se utiliza como fuente (adicional) de nitrógeno la harina de soja después de haberle extraído el aceite o el residuo de cocción de la harina de soja. Hay que tener en cuenta que, con la adición de la harina de soja después de haberle extraído el aceite o del residuo de cocción de la harina de soja a las vinazas pretratadas de destilación se logra un nuevo incremento de la producción de xilanasa. De ello puede deducirse que también la harina de soja después de haberle extraído el aceite o el residuo de cocción de la harina de soja tienen un efecto inductor de xilanasa.

La harina de soja después de haberle extraído el aceite es de modo conveniente un producto comercial de los molinos de soja. La concentración de la harina de soja sin aceite dentro del medio de cultivo se sitúa de modo conveniente en la fase "batch" entre 20 y 30 g/l de medio cultivo y en la fase "fed batch" de modo conveniente entre 15 y 25 g/l de solución de sustrato, con preferencia en 25 g/l y en 20 g/l, respectivamente.

El residuo de la cocción de la harina de soja es una solución acuosa de los ingredientes de la harina de soja después de haberle quitado el aceite. El residuo de cocción de la harina de soja sin aceite se obtiene por suspensión de dicha harina en agua (aprox. 35 g/l). La suspensión de mantiene en ebullición durante 10 minutos y, después de enfriar a temperatura ambiente, se separan por filtración los componentes sólidos. El volumen del líquido filtrado sin sólidos (residuo de cocción de la harina de soja) equivale al 80% del volumen de la suspensión de harina de soja antes de la filtración. El residuo de cocción de la harina de soja se emplea con preferencia en la fase "fed batch" como alternativa de la harina de soja sin aceite, en este caso el volumen del residuo de cocción de la harina de soja equivale a la pesada de la harina de soja a la que se ha quitado el aceite.

La separación del complejo enzimático obtenido según la invención y su purificación y concentración pueden realizarse por métodos de por sí conocidos. Las exigencias básicas para ello son temperaturas bajas del medio (de 5 a 15ºC), pH bajo (de 4 a 4,5) y condiciones asépticas. El procedimiento consiste de modo conveniente en lo siguiente:

- la separación de la biomasa del medio de fermentación mediante centrifugación, filtración o microfiltración;

- la concentración del complejo enzimático por ultrafiltración;

- para obtener un preparado enzima-sólido puede realizarse un secado por atomización después de la concentración del complejo enzimático.

El principal campo de aplicación del complejo enzimático obtenido con arreglo a la invención es su aprovechamiento como aditivo para la fabricación de piensos para animales. El complejo enzimático puede utilizarse en forma de medio de fermentación sin purificar, en forma de líquido filtrado del cultivo, en forma de concentrado enzimático o en forma de preparado sólido.

La presente invención se ilustra con el ejemplo siguiente.

Ejemplo

Se prepara un complejo enzimático rico en xilanasa con el Trichoderma reesei M 18.2-y (DSM 7537) mediante una fermentación del tipo "fed batch".

Para la fabricación del concentrado de vinazas de destilación de cereales se concentran la fracción libre de sólidos de las vinazas de destilación a 50ºC con vacío hasta un volumen 7,5 menor y se somete en autoclave a una temperatura de 121ºC durante 30 minutos.

Para la fabricación del medio de cultivo para la fase "batch" se tratan en un fermentador (autoclave) de 5 l a 121ºC durante 20 minutos 1800 ml del medio de cultivo, compuesto por 20,8 g/l de lactosa, 8,3 g/l de celulosa microcristalina, 25 g/l de harina de soja sin aceite, 33,3 ml/l de concentrado de vinazas de destilación, 3,75 g/l de KH_{2}PO_{4}, 6,0 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 6,25 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,0 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 1,75 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O y 2,5 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O y se ajusta el pH a 6,0 por adición de amoníaco al 12,5% en agua.

Para la fabricación de la solución de sustrato para la fase "fed batch" se tratan en autoclave a 121ºC durante 20 minutos 1000 ml de la solución de sustrato e inductor, compuesta por 300 g/l de lactosa, 10 g/l de celulosa, 500 ml/l de residuo de cocción de harina de soja y 107 ml/l de concentrado de vinazas de destilación de cereales. (Para preparar los 500 ml de residuo de cocción de harina de soja se suspenden 20 g de harina de soja en 600 ml de agua; la suspensión se mantiene en ebullición durante 10 minutos y se filtra la fracción sólida.)

En la fase "batch" se inocula el fermentador con 300 ml de precultivo del matraz de agitación. Para fabricar este inóculo se llenan en primer lugar dos tubitos inclinados de agar de la colonia original en cada caso con 3 ml de agua del grifo esterilizada que lleva 1 g/l de Tween® 80 (polietoxioleato de sorbitano) y se separan por agitación los conidios de ambas superficies de agar. En la etapa siguiente se inoculan tres matraces de agitación, cada uno de los cuales contiene 100 ml de medio de cultivo, con la suspensión de conidios a partes iguales. El medio de cultivo tiene la composición siguiente: 20 g/l de glucosa, 15,0 de KH_{2}PO_{4}, 4,8 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,3 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,3 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5,0 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,6 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 1,4 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O y 2,0 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O. A continuación se cultivan los precultivos de los matraces de agitación a 31ºC y con una frecuencia de agitación de 250 rpm. No se ajusta ni regula el pH del medio. En el momento inicial del cultivo, el pH es de 5, al término del cultivo es de 3,5. Después de un período de cultivo de 28 horas se inocula el fermentador con estos precultivos de los matraces de agitación. Después se añade amónico al 12% en agua para ajustar el pH a 6,0. La concentración de oxígeno se mantiene a 31ºC en el 10% del valor de saturación de oxígeno mediante una regulación en cascada del agitador. Después de 21 horas de cultivo se rebasa un primer máximo de CO_{2} en el gas (residual) que sale del fermentador y con ello se alcanza el final de la fase "batch".

En el marco de la fase "fed batch" se inicia la disminución del contenido de CO_{2} en el gas residual hasta el 80% del primer máximo con la adición discontinua de la solución de sustrato. Cada adición se traduce en un nuevo máximo de CO_{2}. Las adiciones se realizan en porciones de forma automática después de que el contenido de CO_{2} del gas residual se sitúe por debajo del 80% del máximo anterior. Los volúmenes añadidos de solución de sustrato equivalen a una adición de 1,5 g de lactosa por litro de medio de cultivo y de 2,0 g de lactosa por litro de medio de cultivo a partir de 50 horas de fermentación.

Después de 72 horas se da la fermentación por finalizada enfriando a 10ºC y ajustando el pH a 4,5. Se separa el micelio por filtración y se analiza la solución restante de la fermentación. Las actividades enzimáticas del medio de fermentación son las siguientes:

xilanasa:	2625 U/ml
\beta-glucanasa:	555 U/ml
carboximetilcelulasa (CMCasa):	330 U/ml

La concentración de las proteínas disueltas en el medio de fermentación es de 17,0 g/l.

Determinación de enzimas y proteínas

La actividad de la xilanasa (endo-1,4-\beta-xilanasa) se determina por incubación a 50ºC durante 20 minutos con una suspensión de xilano al 0,5% (xilano de mondas de avena, empresa Roth) en tampón acetato sódico 40 mM (pH 6,0). Una unidad (U) de xilanasa libera 1 \mumol de xilosa por minuto.

La actividad de la \beta-glucanasa (endo-1,3-1,4-\beta-glucanasa) se determina por incubación a 50ºC durante 20 minutos con una suspensión de liquenina al 0,5% (liquenina, empresa Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) en tampón acetato sódico 40 mM (pH 6,0).

La actividad de la CMCasa (endo-1,4-\beta-glucanasa) se determina por incubación a 50ºC durante 20 minutos con una solución al 2,0% de la sal sódica de la carboximetilcelulosa (Carl Roth GmbH) en tampón acetato sódico 40 mM (pH 6,0). Una unidad (U) de \beta-glucanasa o de CMCasa libera 1 \mumol de glucosa por minuto.

La determinación de proteínas se realiza después de la precipitación de las proteínas (adición de ácido tricloroacético) mediante un método de Lowry modificado, basado en el ácido bicincónico: procedimiento nº TPRO-562 de Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, EE.UU.).

Claims (11)

1. Procedimiento para la obtención de un complejo enzimático rico en xilanasa por cultivo de un microorganismo generador de xilanasa del género Trichoderma en un medio de cultivo, caracterizado porque en el cultivo se emplean en calidad de inductor de xilanasa y al mismo tiempo en calidad de fuente de carbono vinazas pretratadas de destilación de cereales; el tratamiento previo consiste en la separación de las fracciones sólidas de las vinazas de destilación, en la concentración de los componentes no volátiles por evaporación del agua y de otras sustancias volátiles y en el posterior tratamiento en autoclave del concentrado resultante de las vinazas de destilación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación de las fracciones sólidas de las vinazas de destilación de cereales se realizada por decantación y separación mediante un separador de platos; el volumen de la fracción de sólidos a desechar se sitúa entre el 30 y el 50% del volumen de las vinazas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la concentración de las fracciones no volátiles de las vinazas de destilación libres de sólidos se realiza mediante un evaporador de recirculación con vacío a una temperatura de ebullición que se sitúa entre 40 y 50ºC y a una presión de vapor de las vinazas de destilación libres de sólidos correspondiente a esta temperatura, con lo cual al cabo de aproximadamente una hora se logra la deseada disminución de volumen de las vinazas de destilación libres de sólidos, dicha disminución se sitúa entre el 80 y el 90%.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque el tratamiento del concentrado de vinazas de destilación en el autoclave se realiza a 121ºC durante por lo menos 30 minutos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque el microorganismo generador de xilanasa que se quiere cultivar es una mutante del Trichoderma reesei, derivada de la cepa original QM6a, en especial la QM 9123, QM 9414, M 18.2, M 18.2-y, Rut M-7 o Rut NG-14.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque en calidad de fuente adicionales de carbono se añaden al medio de cultivo lactosa, celulosa, xilano, salvado de trigo, jarabe de glucosa y agua de hinchamiento de maíz secada por atomización, con preferencia lactosa, celulosa y xilano procedentes de mondas de avena.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque en calidad de fuentes de nitrógeno se añaden al medio de cultivo sulfato amónico, agua amoniacal y harina de soja después de haberle quitado el aceite.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque el medio de cultivo contiene además una fuente de fósforo, con preferencia el dihidrogenofosfato potásico y/o sales, con preferencia el sulfato de magnesio, de hierro, de manganeso y de cinc así como el cloruro de calcio y de cobalto.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque el pH y la temperatura del cultivo se sitúan entre 5,5 y 6,5 y entre 28 y 34ºC, respectivamente.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado porque en calidad de inductor adicional de xilanasa y en calidad de fuente de nitrógeno se emplea harina de soja después de quitado el aceite o residuo de cocción de harina de soja.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 10, caracterizado porque para su realización se aplica la técnica llamada "fed batch".