CN113881577A - 木霉菌的发酵培养方法、木霉菌剂 - Google Patents

木霉菌的发酵培养方法、木霉菌剂 Download PDF

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CN113881577A CN202111303610.5A CN202111303610A CN113881577A CN 113881577 A CN113881577 A CN 113881577A CN 202111303610 A CN202111303610 A CN 202111303610A CN 113881577 A CN113881577 A CN 113881577A
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冯琦胜
吴淑娟
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Abstract

本发明提供了一种木霉菌的发酵培养方法、木霉菌剂，涉及微生物发酵培养技术领域，木霉菌的发酵培养方法包括：将木霉孢子悬浮液先进行液体发酵培养，得到木霉液态发酵液，再进行固体发酵扩繁培养，得到木霉菌剂；液体发酵培养采用马铃薯淀粉加工废料培养液；固体发酵扩繁培养采用叶片固体培养基，所述叶片固体培养基包括10‑20重量份的草坪禾草草叶、10‑20重量份的三叶草草叶、10‑20重量份的泡桐树叶、10‑20重量份的洋槐树叶、10‑20重量份的杨树树叶、10‑20重量份的柏树树叶和10‑20重量份的葡萄糖。本发明选用特定的培养基依次进行液体发酵培养和固体发酵培养，提高木霉的繁殖效率，产孢子量多，且成本低。

Description

木霉菌的发酵培养方法、木霉菌剂
技术领域
本发明涉及微生物发酵培养技术领域，尤其是涉及一种木霉菌的发酵培养方法、木霉菌剂。
背景技术
木霉属(Trichoderma Pers.Fr.)真菌属于半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)的粘孢菌类(Gloiosporae),其有性阶段为子囊菌亚门(Ascomycotina)、肉座目(Hypocreales)、肉座科(Hypocreaceae)的肉座菌属(Hypocrea)。木霉能够产生多种酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶和蛋白酶等，这些酶类被广泛应用在食品、卫生、饲料、制浆、纺织、造纸、环保和生物基因工程等领域，因此是重要工业酶制剂的生产菌，例如里氏木霉(T.reesei＝H.jecorina)是纤维素酶的生产菌；有的木霉产生各种各样的抗生素，有的木霉可以通过与植物建立共生关系，从而促进植物生长，诱导并激发植物自身的免疫功能，因此可以作为植物病害的生物防治菌使用，例如哈茨木霉(T.harzianum＝H.lixii)、桔绿木霉(T.atroviride＝H.atroviridis)、绿色木霉(T.viride)以及棘孢木霉(T.asperellum)。利用木霉菌防治植物真菌病害已取得了较好的成绩，应用前景一片乐观。
但目前扩繁木霉的使用的材料成本较高，因此想寻求一种低廉的扩繁方式，为更好的利用木霉提供技术手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种木霉菌的发酵培养方法，选用特定的培养基依次进行液体发酵培养和固体发酵培养，提高木霉的繁殖效率，产孢子量多，且成本低。
本发明的目的之二在于提供一种上述木霉菌的发酵培养方法培养的木霉菌剂。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
将木霉孢子悬浮液先进行液体发酵培养，得到木霉液态发酵液，再进行固体发酵扩繁培养，得到木霉菌剂；
其中，所述液体发酵培养所采用的发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料(工厂生产马铃薯淀粉的下脚料，即生产马铃薯淀粉以后的剩余物质，一般用来做猪饲料或者丢弃)培养液；所述固体发酵扩繁培养所采用的发酵培养基质为叶片固体培养基，所述叶片固体培养基包括10-20重量份的草坪禾草草叶、10-20重量份的三叶草草叶、10-20重量份的泡桐树叶、10-20重量份的洋槐树叶、10-20重量份的杨树树叶、10-20重量份的柏树树叶和10-20重量份的葡萄糖。
进一步的，所述马铃薯淀粉加工废料培养液的制备方法包括：每1g马铃薯淀粉加工废料中添加50-70ml水，121℃灭菌25min。
进一步的，所述叶片固体培养基包括重量比为1:1:1:1:1:1:1的草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶和葡萄糖。
进一步的，所述木霉孢子悬浮液中木霉孢子的浓度为1×108cfu/ml-1×109cfu/ml，所述木霉孢子悬浮液的pH为4-7。
进一步的，所述液体发酵培养的接种量为：按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液＝1:50-1:70；接种的木霉孢子悬浮液的浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml。
所述液体发酵培养的培养条件为：培养温度25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天。
进一步的，所述固体发酵扩繁培养的接种量为：按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液＝8:1-5:1；
所述固体发酵扩繁培养的培养条件为：培养温度25-30℃，静态培养8-10天。
进一步的，所述木霉孢子悬浮液的制备包括：
将木霉孢子接种于培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为3-7天；将获得的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，培养基包括PDA培养基、SDA培养基、CMA培养基或CZA培养基。
第二方面，本发明提供了一种木霉菌剂，所述木霉菌剂由上述木霉菌的发酵培养方法培养得到。
进一步的，所述木霉菌剂的产孢量为每克培养底物产出大于等于3.2×109cfu单位木霉孢子。
本发明至少具有如下有益效果：
本发明选用特定的培养基对木霉孢子悬浮液依次进行液体发酵培养和固体发酵培养。种子培养结束后用特定液体发酵培养能够迅速扩繁，并在接种固体培养基时能够均匀广泛的接种，提高木霉的繁殖效率，马铃薯淀粉加工废料培养液成本低廉，且产孢量很高。进而，采用固体发酵形式进行木霉菌的扩繁并选用特定叶片培养基，不仅扩繁效果好，还能够保护环境，降低生产成本。采用本发明方法产孢子量多，且成本低。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
将木霉孢子悬浮液先进行液体发酵培养，得到木霉液态发酵液，再进行固体发酵扩繁培养，得到木霉菌剂；
其中，所述液体发酵培养所采用的发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液；所述固体发酵扩繁培养所采用的发酵培养基质为叶片固体培养基，所述叶片固体培养基包括10-20重量份的草坪禾草草叶、10-20重量份的三叶草草叶、10-20重量份的泡桐树叶、10-20重量份的洋槐树叶、10-20重量份的杨树树叶、10-20重量份的柏树树叶和10-20重量份的葡萄糖。
木霉菌包括但不限于哈茨木霉、长枝木霉、绿色木霉等，优选为绿色木霉。
哈茨木霉菌株、长枝木霉、绿色木霉可以市售获得(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，菌株编号分为13056、40144、13039。
木霉孢子悬浮液是指木霉菌种经种子培养后获得木霉菌孢子经稀释后得到的。在一种优选的实施方式中，木霉孢子悬浮液的制备包括：将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为3-7(例如4)天；将获得的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液。培养基还可以用沙堡弱培养基(SDA)、玉米琼脂培养基(CMA)、察氏培养基(CZA)。
优选地，木霉孢子悬浮液中木霉孢子的浓度为1×108cfu/ml-1×109cfu/ml，木霉孢子悬浮液的pH为4-7。
液体发酵培养
液体发酵培养基质选用马铃薯淀粉加工废料培养液，马铃薯淀粉加工废料培养液是指马铃薯淀粉加工废料所做的培养液。在一种优选的实施方式中，马铃薯淀粉加工废料培养液包括每1g马铃薯淀粉加工废料中添加50-70ml水，121℃灭菌25min。
该马铃薯淀粉加工废料培养液中的马铃薯淀粉加工废料(去淀粉马铃薯渣)是在工厂利用马铃薯块茎生产完粉条、粉丝、粉皮、淀粉等食品后剩余的下脚料，马铃薯块茎除了含有大量的淀粉，还富含蛋白质、氨基酸及多种维生素、矿物质，因此能够满足木霉菌的生长所需，且产孢量很高，并且马铃薯渣简单易得，成本低廉。
在一种优选的实施方式中，液体发酵培养的接种量为：按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液＝1:50-1:70，例如1:56、1:58、1:60、1:62、1:64、1:65、1:68、1:70。
在一种优选的实施方式中，液体发酵培养的培养条件为：培养温度25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天。
种子培养结束后用液体发酵培养能够迅速扩繁，并在接种固体培养基时能够均匀广泛的接种，提高木霉的繁殖效率。
固体发酵扩繁培养
固体发酵培养基选用叶片固体培养基，包括10-20重量份的草坪禾草草叶、10-20重量份的三叶草草叶、10-20重量份的泡桐树叶、10-20重量份的洋槐树叶、10-20重量份的杨树树叶、10-20重量份的柏树树叶和10-20重量份的葡萄糖。
本发明采用特定草叶、树叶以及利用其它树叶制作固体培养基。
草坪禾草草叶：主要为黑麦草、高羊茅和早熟禾等。黑麦草茎叶干物质中含粗蛋白质50.8％，粗脂肪15.2％，粗纤维1.1％，粗灰分7.6％，钙1.57％，磷0.53％；高羊茅：粗蛋白质64.0％，粗脂肪15.5％，粗纤维0.9％，粗灰分10.7％，钙3.07％，磷0.88％；早熟禾：粗蛋白质56.7％，粗脂肪16.1％，粗纤维1.0％，粗灰分13.2％，钙1.29％，磷0.38％。
白三叶草叶营养价值很高，每百克鲜品含蛋白质5.9g、碳水化合物9.7g、胡萝卜素3.28mg、维生素C92mg、维生素B20.36mg、钙332mg、磷115mg、铁8mg。
泡桐树叶的养分含量很高，粗脂肪为10.36％，与麦麸相仿；粗蛋白含量为16.30％；而粗纤维含量较低，仅占16.95％；同时含有大量铁、锰、锌等矿质元素。
洋槐树叶的养分含量很高，蛋白质为2.19％；还原糖含量为1.85％；抗坏血酸含量39.44％，氨基态氮0.35％；同时含有大量钠、钾、钙、铁、锌锰等矿质元素。
杨树树叶含粗蛋白6.1％，粗脂肪6.8％，粗纤维23.9％，灰分16.2％。
柏树树叶中含挥发油0.26％，油中主要成分为α-侧柏酮、侧柏烯、小茴香酮等，叶中还含钾、钠、氮、磷、钙、镁、锰和锌等微量元素。
草坪禾草草叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。
白三叶草叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。
泡桐树叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份重量份。
洋槐树叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。
杨树树叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。
柏树树叶典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。
葡萄糖典型但非限制性的含量例如为10重量份、12重量份、15重量份、16重量份、18重量份或20重量份。葡萄糖起到碳源的作用。
所述的“包括”，意指其除所述组份外，还可以包括其他组份，这些其他组份赋予所述培养基不同的特性。除此之外，本发明所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。
采用固体发酵形式进行木霉菌的扩繁。固体发酵是一种成本低，易于操作，低碳环保的节约型发酵工艺。木霉本身具有一定的分解纤维素的能力，因此利用修剪草坪剪掉的草坪禾草草叶、三叶草草叶，以及一些乔木的落叶制成培养基进行木霉的扩繁培养，不仅能够保护环境，还能降低生产成本。采用特定比例草叶、树叶制作的固体培养基扩繁效果好，产孢量多。
作为一种优选的实施方式，叶片固体培养基包括重量比为1:1:1:1:1:1:1的草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶和葡萄糖。
采用上述比例的草叶、树叶以及利用其它树叶制作的固体培养基扩繁效果优异。
在一种优选的实施方式中，固体发酵扩繁培养的接种量为：按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液＝8:1-5:1；
在一种优选的实施方式中，固体发酵扩繁培养的培养条件为：培养温度25-30℃，静态培养8-10天。
在一种优选的实施方式中，一种典型的培养生防木霉菌的培养基配方，木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为哈茨木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为4天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4-7；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:50-1:70，培养条件为25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min,连续培养5-7天，得到108-109cfu/ml木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106-109cfu/ml的木霉液态发酵液，所述叶片固体培养基，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为8:1-5:1，搅拌均匀，培养条件为25-30℃，静态培养8-10天，得到木霉菌剂，其中，产孢量为每克培养底物产出3.2×109cfu单位木霉孢子。
根据本发明的第二个方面，提供了一种木霉菌剂，由上述木霉菌的发酵培养方法培养得到。
进一步的，木霉菌剂的产孢量为每克培养底物产出大于等于3.2×109cfu单位木霉孢子。这种培养是无杂菌的。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例中马铃薯淀粉加工废料是从淀粉生产厂家免费获得。
实施例1
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为哈茨木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25℃，光照条件为光照8小时、黑暗16小时交替，培养时间为4天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:70，培养条件为25℃，摇床培养140r/min,连续培养5天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为8:1，搅拌均匀，培养条件为25℃，静态培养8天，得到木霉菌剂。
实施例2
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25℃，光照条件为光照8小时、黑暗16小时交替，培养时间为4天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:70，培养条件为25℃，摇床培养140r/min,连续培养5天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为8:1，搅拌均匀，培养条件为25℃，静态培养8天，得到木霉菌剂。
实施例3
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为绿色木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25℃，光照条件为光照8小时、黑暗16小时交替，培养时间为4天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:70，培养条件为25℃，摇床培养140r/min,连续培养5天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为8:1，搅拌均匀，培养条件为25℃，静态培养8天，得到木霉菌剂。
实施例4
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为哈茨木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为30℃，光照条件为光照16小时、黑暗8小时交替，培养时间为7天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为7；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:50，培养条件为28℃，摇床培养160r/min,连续培养7天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为5:1，搅拌均匀，培养条件为30℃，静态培养10天，得到木霉菌剂。
实施例5
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为30℃，光照条件为光照16小时、黑暗8小时交替，培养时间为7天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为7；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:50，培养条件为28℃，摇床培养160r/min,连续培养7天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为5:1，搅拌均匀，培养条件为30℃，静态培养10天，得到木霉菌剂。
实施例6
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为绿色木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为30℃，光照条件为光照16小时、黑暗8小时交替，培养时间为7天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为7；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:50，培养条件为28℃，摇床培养160r/min,连续培养7天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为5:1，搅拌均匀，培养条件为30℃，静态培养10天，得到木霉菌剂。
实施例7
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为哈茨木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为26℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替，培养时间为6天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×105cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为5.5；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:60，培养条件为27℃，摇床培养150r/min,连续培养6天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按2:2:2:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为6:1，搅拌均匀，培养条件为27℃，静态培养9天，得到木霉菌剂。
实施例8
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为长枝木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为26℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替，培养时间为6天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×105cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为5.5；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:60，培养条件为27℃，摇床培养150r/min,连续培养6天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按2:2:2:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为6:1，搅拌均匀，培养条件为27℃，静态培养9天，得到木霉菌剂。
实施例9
一种木霉菌的发酵培养方法，包括以下步骤：
1)木霉菌种的种子培养：木霉菌种为绿色木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为26℃，光照条件为光照12小时、黑暗12小时交替，培养时间为6天；
2)将步骤1)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×105cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为5.5；
3)将步骤2)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，液体发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液为1:60，培养条件为27℃，摇床培养150r/min,连续培养6天，得到木霉液态发酵液；
4)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按2:2:2:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤3)得到的木霉液态发酵液置于叶片固体培养基上，接入量为106cfu/ml的木霉液态发酵液，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液为6:1，搅拌均匀，培养条件为27℃，静态培养9天，得到木霉菌剂。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于，将液体发酵培养基质替换为液体沙氏培养基，配方为：蛋白胨(10g/L)，葡萄糖(40g/L)。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，将叶片固体培养基替换为锯末培养基。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于，泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基。
对比例4
本对比例与实施例2的区别在于，草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:3:3:3:3:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基。
效果例产孢量和孢子萌发率
用琼脂玻片法测定木霉孢子萌发率。
水琼脂玻片的制备：将琼脂粉按照2％的比例在水中融化，121℃高温灭菌20min。用无菌的10号油画笔刷蘸取水琼脂涂于无菌的载玻片上，从一端刷向另一端，一次刷好，不要产生气泡，冷却备用。
孢子悬浮液的制备：用无菌水洗脱木霉孢子，并稀释至浓度为1.25×106CFU/ml-7.5×106CFU/ml。用6号油画笔刷蘸取孢子悬浮液轻刷于载玻片上的水琼脂上，然后置于无菌培养皿内，盖上皿盖，置于25-28℃下培养24小时后进行孢子萌发检测，并计算孢子萌发率。
结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003339316220000151
Figure BDA0003339316220000161
注意：产孢量为每克培养底物产出多少cfu单位木霉孢子。
通过表1可以看出，采用本申请的木霉菌的发酵培养方法培养的木霉菌剂产孢量最多。哈茨木霉、长枝木霉和绿色木霉的最高产孢量分别是4.2×109cfu/g、8.3×109cfu/g和9.0×109cfu/g；孢子萌发率也分别达到了86％、88％和89％。该方法可以用于大量生产木霉孢子制剂。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将木霉孢子悬浮液先进行液体发酵培养，得到木霉液态发酵液，再进行固体发酵扩繁培养，得到木霉菌剂；
其中，所述液体发酵培养所采用的发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液；所述固体发酵扩繁培养所采用的发酵培养基质为叶片固体培养基，所述叶片固体培养基包括10-20重量份的草坪禾草草叶、10-20重量份的三叶草草叶、10-20重量份的泡桐树叶、10-20重量份的洋槐树叶、10-20重量份的杨树树叶、10-20重量份的柏树树叶和10-20重量份的葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述马铃薯淀粉加工废料培养液的制备方法包括：每1g马铃薯淀粉加工废料中添加50-70ml水，121℃灭菌25min。
3.根据权利要求1所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述叶片固体培养基包括重量比为1:1:1:1:1:1:1的草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶和葡萄糖。
4.根据权利要求1-3任一项所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述木霉孢子悬浮液中木霉孢子的浓度为1×108cfu/ml-1×109cfu/ml，所述木霉孢子悬浮液的pH为4-7。
5.根据权利要求1-3任一项所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述液体发酵培养的接种量为：按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液＝1:50-1:70；接种的木霉孢子悬浮液的浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml；
所述液体发酵培养的培养条件为：培养温度25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天。
6.根据权利要求1-3任一项所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述固体发酵扩繁培养的接种量为：按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液＝8:1-5:1；
所述固体发酵扩繁培养的培养条件为：培养温度25-30℃，静态培养8-10天。
7.根据权利要求1-3任一项所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，所述木霉孢子悬浮液的制备包括：
将木霉孢子接种于培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为3-7天；将获得的木霉孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，培养基包括PDA培养基、SDA培养基、CMA培养基或CZA培养基。
8.根据权利要求1-3任一项所述的木霉菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)木霉菌种的种子培养：所述木霉菌种为哈茨木霉；将木霉孢子接种于PDA培养基中，培养温度为25-30℃，光照条件为光照8-16小时、黑暗8-16小时交替，培养时间为3-7天；
b)将步骤a)得到的木霉菌孢子用无菌水稀释为木霉孢子悬浮液，稀释浓度为1×103cfu/ml-1×108cfu/ml，稀释方法为血球计数板计数，并调节pH为4-7；
c)将步骤b)得到的木霉孢子悬浮液进行液态发酵，发酵培养基质为马铃薯淀粉加工废料培养液，接种量为按体积比木霉孢子悬浮液：马铃薯淀粉加工废料培养液＝1:50-1:70；培养条件为培养温度25℃-28℃，摇床培养140r/min-160r/min，连续培养5-7天，得到108-109cfu/ml木霉液态发酵液；
d)草坪禾草草叶、三叶草草叶、泡桐树叶、洋槐树叶、杨树树叶、柏树树叶、葡萄糖按1:1:1:1:1:1:1的重量比混合并粉碎，灭菌处理，得到叶片固体培养基；将步骤c)得到的木霉液态发酵液置于所述叶片固体培养基上，按质量比叶片固体培养基:木霉液态发酵液＝8:1-5:1，搅拌均匀，培养条件为培养温度25-30℃，静态培养8-10天，得到木霉菌剂。
9.一种木霉菌剂，其特征在于，所述木霉菌剂由权利要求1-8任一项所述的木霉菌的发酵培养方法培养得到。
10.根据权利要求9所述的木霉菌剂，其特征在于，所述木霉菌剂的产孢量为每克培养底物产出大于等于3.2×109cfu木霉孢子。
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Title
景芳等: "利用马铃薯残渣等废弃物生产长枝木霉颗粒剂的研究", 《甘肃农业大学学报》 *

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