ES2211883T3

ES2211883T3 - Medio de cultivo y procedimiento para la preparacion de acido hialuronico de peso molecular alto.

Info

Publication number: ES2211883T3
Application number: ES94925419T
Authority: ES
Inventors: Flavia Cazzola; Michael O'regan; Vincenza Corsa
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2014-07-29
Also published as: DE69433177D1; ITPD930164A0; EP0716688A1; ATE250663T1; ITPD930164A1; AU7534294A; DE69433177T2; IT1263393B; WO1995004132A1; EP0716688B1

Abstract

SE PRESENTAN UN MEDIO DE CULTIVO ECONOMICO UTIL PARA LA PRODUCCION DE ALTOS NIVELES DE ACIDO HIALURONICO CON UN PESO MOLECULAR DE 2 A 3,1 X 10{SUP,6} DALTONS MEDIANTE FERMENTACION BACTERIANA, UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE ACIDO HIALURONICO DE ALTO PESO MOLECULAR MEDIANTE FERMENTACION BACTERIANA UTILIZANDO ESTE MEDIO, Y UN METODO PARA LA PURIFICACION DEL ACIDO HIALURONICO PRODUCIDO MEDIANTE FERMENTACION BACTERIANA. TAMBIEN SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN EL ACIDO HIALURONICO PRODUCIDO A TRAVES DEL PRESENTE PROCESO, Y UN METODO PARA EL TRATAMIENTO DE HERIDAS Y DE INCISIONES QUIRURGICAS PARA EVITAR LA FORMACION DE CICATRICES Y QUELOIDES HIPERTROFICOS.

Description

Medio de cultivo y procedimiento para la preparación de ácido hialurónico de peso molecular alto.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácido hialurónico de alto peso molecular mediante técnicas de fermentación, utilizando estreptococos y otras bacterias capaces de producir ácido hialurónico, y un medio de cultivo semidefinido y rentable.

Descripción de la técnica relacionada

El ácido hialurónico (HA) es un glicosaminoglicano muy viscoso que comprende unidades alternantes, repetitivas, de ácido glucurónico y una N-acetil-glucosamina unidos mediante enlaces glicosídicos \beta_{1}-3 y \beta_{1}-4. El ácido hialurónico se encuentra en varios tejidos conjuntivos animales, tales como en la piel y en el cartílago, en el cordón umbilical, el líquido sinovial, humor acuoso y en las crestas de gallo.

La función del ácido hialurónico en la piel y en el cartílago es retener agua y procurar elasticidad y tono a los tejidos, mientras que en los líquidos de las articulaciones, actúa como un lubricante y protege las células de los choques físicos del exterior, y de las infecciones bacterianas. Debido a su naturaleza altamente hidrofílica, el ácido hialurónico constituye un constituyente ideal para la preparación de lociones cosméticas. Soluciones muy purificadas de HA se utilizan también como medio de soporte en cirugía ocular (Patente USA No. 4.141.973) o como un líquido de sustitución en las articulaciones en el caso de situaciones patológicas particulares.

La producción del ácido hialurónico de alto peso molecular, que posee propiedades viscoelásticas superiores a las de las fracciones de bajo peso molecular, es por tanto de considerable interés, en vista especialmente de la necesidad de absorber variaciones mayores en la presión, tal como las que tienen lugar in vivo en las articulaciones.

La extracción de ácido hialurónico a partir de fuentes animales presenta varias desventajas debido a la disponibilidad limitada del material en bruto, la dificultad de extraer grandes cantidades de ácido hialurónico de alto peso molecular de los tejidos animales, donde sólo se encuentran trazas de él, a menudo en forma de complejos con proteínas u otros mucopolisacáridos, y el peligro de contaminación vírica. Por estas razones, muchos investigadores se han vuelto hacia la producción de HA a partir de un origen microbiológico.

La producción de HA mediante estreptococos se demostró primero por Forrest y col., J.Biol.Chem. 118:61 (1937), y posteriormente por otros investigadores, por ejemplo, Roseman y col., J. Biol. Chem. 203:213 (1953); Pierce y col., Proc. Soc. Exp. Biol Med. 87: 50 (1954); Patente USA No 2.975.104; y Sunghara y col., J. Biol. Chem. 254:6252 (1979). Estos investigadores demostraron que el ácido hialurónico que se encontraba en las cápsulas de muchas cepas de los estreptococos del grupo A y del grupo C es el mismo que el del origen animal. Estos microorganismos pueden asimilar glucosa u otras fuentes de carbono y, bajo condiciones medioambientales particulares, producen ácido hialurónico como un metabolito secundario. La síntesis del ácido hialurónico por los estreptococos está, sin embargo, influenciada por muchos factores genéticos y nutricionales.

Los estreptococos se encuentran entre las bacterias más exigentes desde un punto de vista nutricional. La literatura describe muchos tipos de medios de cultivo que favorecen la producción de ácido hialurónico por estos microorganismos, que normalmente incluyen hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, y algunos factores de crecimiento. Generalmente, la glucosa se utiliza como una fuente de carbono, mientras que la fuente de nitrógeno puede ser orgánica o inorgánica, incluyendo peptona, extracto de levadura, productos de caseína hidrolizada, productos de soja hidrolizada, aminoácidos, sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, urea, glutamina, etc. Ciertas sales inorgánicas pueden también añadirse al medio, tales como sulfatos, clorhidratos, carbonatos, nitratos, fosfatos, y acetatos de calcio, potasio, sodio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, y zinc. Finalmente, la adición de vitaminas y aminoácidos puede también mostrarse ventajosa para el crecimiento bacteriano.

Algunos medios nutritivos específicos para los estreptococos ya se venden comercialmente, tales como la Infusión Corazón Cerebro y el Caldo Todd-Hewitt. Otros se han descrito en patentes relacionadas con la producción del ácido hialurónico mediante fermentación, tales como la Patente USA No. 4.517.295, Patente USA No. 2.975.104, Patente USA No. 4.784.990, Patente USA No. 4.897.349, y la Patente Europea No. 0 244 757. Muchos de estos medios, sin embargo, no son ventajosos porque requieren componentes caros, y no son por tanto apropiados para objetivos industriales. Por lo tanto, el producto HA obtenido mediante la fermentación utilizando estos costosos medios complejos, no es ventajosamente económico comparado con el obtenido a partir de fuentes animales.

Otro problema asociado con la producción de ácido hialurónico a partir de las fuentes bacterianas es la utilización, en algunos casos, de cepas de estreptococos que son patogénicos en el hombre, tales como S. pyogenes (Patente USA No. 4.517.295).

Sin embargo, la producción de ácido hialurónico mediante fermentación, aparte de facilitar la obtención de grandes cantidades de polímeros con un peso molecular más alto que el obtenido a partir de los tejidos animales, permite también la purificación del HA mediante procedimientos menos complicados que los requeridos para otros materiales de partida. Los procedimientos de purificación conocidos, que se han descrito en numerosas patentes, permiten el aislamiento del ácido hialurónico de alto peso molecular, a menudo con un alto grado de pureza. Estos procedimientos necesitan habitualmente grandes cantidades de solventes o de otros productos tóxicos, tales como el cloruro de cetilpiridina, requiriendo también por tanto numerosos pasos antes de producir el ácido hialurónico altamente purificado para utilización en el campo farmacéutico. Todos estos factores crean problemas relacionados con el medio ambiente y el coste.

Utilización terapéutica del ácido hialurónico

Las notables características biocompatibles y biodegradables del HA han sido factores determinantes en su utilización en el campo de la viscocirugía. Verdaderamente, el ácido hialurónico, en su forma más altamente polimérica, que alcanza un peso molecular de 4-6 millones, se encuentra a varias concentraciones en la matriz del tejido conjuntivo de todos los primates, y su utilización en viscocirugía causa por tanto sólo un aumento temporal en la concentración, comparado con la del ácido hialurónico original.

En ciertas operaciones quirúrgicas, HA puede proteger a los tejidos absorbiendo choques y lubricando las capas celulares abiertas al daño mecánico por instrumentos quirúrgicos o implantes. Representa el medio en el cual se lleva a cabo la cirugía, evita la formación de adherencias tisulares, y permite que fragmentos de tejido y coágulos sanguíneos puedan ser eliminados. Además de este efecto protector durante la cirugía, el ácido hialurónico, en su función como barrera molecular, puede utilizarse como un implante entre dos superficies tisulares que deben mantenerse separadas con objeto de funcionar apropiadamente.

Otra aplicación del ácido hialurónico está relacionada con sus propiedades viscoelásticas. En algunas condiciones patológicas, por ejemplo, la artritis y la artrosis crónica o aguda, algunos tejidos pierden viscoelasticidad, y esta pérdida se caracteriza tanto por una disminución en el peso molecular como en la concentración del ácido hialurónico endógeno. La "viscosuplementación" es un proceso terapéutico para restaurar o aumentar las propiedades reológicas normales, introduciendo un medio viscoso tal como el ácido hialurónico en el compartimiento tisular.

La función biológica del ácido hialurónico en la reparación de los tejidos también se ha descrito ampliamente en la literatura. La adición de HA exógeno puede jugar un papel importante en la aceleración o en la modificación de la reparación tisular, facilitando el movimiento de células inflamatorias, mesenquimáticas, y epiteliales en el sitio de reparación tisular. La reparación tisular consiste en una compleja serie de sucesos que implican a varios tipos celulares, con el objetivo final de formar una cicatriz. Este último estadio del proceso de reparación, aunque necesario, representa a menudo un problema estético. Es muy importante, por tanto, ser capaz de reducir la formación de las cicatrices.

Características de la invención

Constituye, por tanto, un objetivo de la presente invención proporcionar un medio de cultivo que comprende una mezcla de dos distintas fuentes de nitrógeno, es decir, un digesto de harina de soja así como una mezcla de peptona, y una fuente de carbono. Dicho digesto de harina de soja es HY-SOY, dicha mezcla de peptona es SPECIAL PEPTONE, y dicha fuente de carbono es glucosa. Dicho digesto de harina de soja o HY-SOY se encuentra a una concentración de entre 10 g/l y 30 g/l aproximadamente, preferentemente de 20 g/l aproximadamente, encontrándose dicha mezcla de peptona o SPECIAL PEPTONE a una concentración de entre 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, preferentemente a 10 g/l aproximadamente, y la fuente de carbono o glucosa se encuentra a una concentración de entre 10 g/l y 60 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 30 g/l. El pH del medio puede ser del orden de entre 6,5 y 7,5 aproximadamente. El medio de cultivo puede comprender además un barredor de radicales libres, a una concentración de entre 0,01 g/l y 1 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 0,1 g/l.

Constituye otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para la producción de ácido hialurónico, que comprende el cultivo de una cepa bacteriana capaz de producirlo en un medio de cultivo que comprende un digesto de harina de soja, una mezcla de peptona y una fuente de carbono, tal como se describió anteriormente, bajo condiciones que promuevan la formación de ácido hialurónico mediante dicha cepa bacteriana, y recuperando dicho ácido hialurónico. La cepa bacteriana puede ser una cepa de Streptococcus del grupo A o del grupo C. Más particularmente, la cepa estreptocócica puede ser una cepa de S. equi, S. equisimilis, S. dysgalactiae, S. pyogenes, o S. zooepidemicus. S. equi 68222 se ha utilizado en los Ejemplos infra. Más preferentemente, la glucosa se encuentra a una concentración de 30 g/l, y el barredor de radicales libres se encuentra a una concentración de entre 0,01 g/l y 1 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 0,1 g/l. El desarrollo bacteriano puede llevarse a cabo mediante cultivo bajo condiciones aeróbicas introduciendo aire estéril a una velocidad de entre 0,1 y 4 vvm aproximadamente, preferentemente 2 vvm, y agitando vigorosamente a una velocidad de entre 200 rpm y 900 aproximadamente, preferentemente alrededor de 600 rpm.

Otros aspectos

Además, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para producir ácido hialurónico que comprende el cultivo de una cepa de estreptococos capaz de producir ácido hialurónico en un medio de cultivo que comprende un digesto de harina de soja o HY-SOY a una concentración de entre 10 g/l y 30 g/l aproximadamente, preferentemente de 20 g/l aproximadamente, una mezcla de peptona o SPECIAL PEPTONE a una concentración de entre 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, preferentemente a 10 g/l aproximadamente, o un extracto de levadura a una concentración de entre 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, preferentemente a alrededor de 10 g/l, glucosa a una concentración de entre 10 g/l y 60 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 30 g/l y un barredor de radicales libres a una concentración de entre 0,01 g/l a 1g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 0,1 g/l, bajo condiciones que promueven la formación de ácido hialurónico mediante dicha cepa estreptocócica, y recuperando dicho ácido hialurónico.

Además todavía, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para la purificación del ácido hialurónico producido por células bacterianas cultivadas en un medio de cultivo que comprende la muerte de las células bacterianas que se encuentran en dicho medio de cultivo; la liberación de cualquier ácido hialurónico que esté adherido a dichas células bacterianas mediante su tratamiento con un surfactante; la eliminación de las células bacterianas prefiltrando dicho medio de cultivo a través de un filtro que posee una porosidad de entre 0,1 \mum y 10 \mum aproximadamente; la eliminación de cualquier célula bacteriana remanente mediante microfiltración de dicho medio de cultivo a través de un filtro con una porosidad de 0,45 \mum aproximadamente; la dialización de dicho medio de cultivo contra agua destilada; y la concentración de este medio de cultivo dializado.

Además todavía, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para producir ácido hialurónico que comprende el cultivo de una cepa de estreptococos capaz de producir ácido hialurónico en un medio de cultivo que comprende un digesto de harina de soja o HY-SOY a una concentración de entre 10 g/l y 30 g/l aproximadamente, preferentemente de 20 g/l aproximadamente, una mezcla de peptona o SPECIAL PEPTONE a una concentración de entre 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, preferentemente a 10 g/l aproximadamente, o un extracto de levadura a una concentración de entre 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, preferentemente a alrededor de 10 g/l, glucosa a una concentración de entre 10 g/l y 60 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 30 g/l y un barredor de radicales libres a una concentración de entre 0,01 g/l y 1 g/l aproximadamente, preferentemente alrededor de 0,1 g/l, bajo condiciones que promueven la formación de ácido hialurónico mediante dicha cepa estreptocócica; la muerte de las células bacterianas que se encuentran en dicho medio de cultivo tratando a dichas células con un bactericida seleccionado entre formaldehído, un alcohol, cloroformo, y acetona; la liberación de cualquier ácido hialurónico que esté adherido a dichas células bacterianas mediante su tratamiento con un surfactante; la eliminación de las células bacterianas prefiltrando dicho medio de cultivo a través de un filtro que posee una porosidad de entre 0,1 \mum y 10 \mum aproximadamente; la eliminación de cualquier célula bacteriana remanente mediante microfiltración de dicho medio de cultivo a través de un filtro con una porosidad de 0,45 \mum aproximadamente; la dialización de dicho medio de cultivo contra agua destilada; y la concentración de este medio de cultivo dializado.

Además todavía, en la presente memoria se da a conocer una fracción de ácido hialurónico con un peso molecular del orden de entre 2x10^{6} Daltons y 3x10^{6} Daltons, preferentemente de 2x10^{6} Daltons. El ácido hialurónico puede utilizarse con un peso molecular del orden de entre 2x10^{6} Daltons y 3x10^{6} Daltons, preferentemente de 2x10^{6} Daltons, en la fabricación de un medicamento para tratar heridas o incisiones quirúrgicas con el fin de evitar la formación de cicatrices hipertróficas o queloides cicatriciales.

Además, en la presente memoria se da a conocer una composición farmacéutica que comprende ácido hialurónico con un peso molecular del orden de entre 2x10^{6} Daltons y 3x10^{6} Daltons, preferentemente de 2x10^{6} Daltons y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además todavía, en la presente memoria se da a conocer un procedimiento para el tratamiento de una herida o incisión quirúrgica para evitar las cicatrices hipertróficas o la formación de queloides, que comprende la administración a dicha herida o incisión quirúrgica de una cantidad efectiva de ácido hialurónico con un peso molecular del orden de 2x10^{6} Daltons a 3x10^{6} Daltons, preferentemente de 2x10^{6} Daltons.

Mediante la utilización del medio y procedimiento de la presente invención, el ácido hialurónico, con un peso molecular del orden de 2 a 3,1 x 10^{6} Daltons, puede obtenerse con un rendimiento de alrededor de 2 g/l.

Los presentes inventores han proporcionado de este modo un procedimiento para la producción de ácido hialurónico de alto peso molecular a partir de fuentes bacterianas, utilizando un nuevo y rentable medio de cultivo que mejora la relación HA/célula, facilitando de este modo la separación de las bacterias del caldo de cultivo, y por tanto, el procedimiento entero de purificación.

El procedimiento para el aislamiento y purificación del ácido hialurónico liberado en el medio de cultivo que se proporciona en la presente memoria, da lugar a un buen rendimiento, es fácilmente reproducible, produce un producto terapéuticamente aceptable, es económico y reduce los problemas medioambientales.

El ácido hialurónico de alto peso molecular producido mediante este procedimiento, puede utilizarse para la modulación de la curación de las heridas.

A partir de la descripción detallada que se da a conocer a continuación, se evidenciará otro alcance respecto a la aplicabilidad de la presente invención. Sin embargo, deberá entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indiquen formas de realización preferentes de la invención, se proporcionan sólo como ilustrativos, ya que a partir de esta descripción detallada, varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la materia.

Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción detallada de la invención se proporciona para ayudar a los expertos en la materia para poner en práctica la presente invención. Aún así, la siguiente descripción detallada no se interpretará para limitar indebidamente la presente invención, pues las modificaciones y variaciones en las formas de realización que se consideran en la presente memoria, pueden realizarse por los expertos en la materia sin apartarse del espíritu o alcance del presente descubrimiento de invención.

El contenido de cada una de las referencias citadas en la presente memoria se incorpora a ésta como referencia en su totalidad.

Los estreptococos de los grupos A y C, según la clasificación de Lancefield, producen una cápsula de ácido hialurónico, cuya composición es idéntica a la del polímero presente en los tejidos conjuntivos del mamífero (R.M. Krause (1972). "The Streptococcal Cell: Relationship of Structure to Function and Pathogenesis", en L.W.Wannamaker y J.M. Matsen, editores., Streptococci and Streptococcal Diseases, Academic Press Inc., New York, páginas 3-18). Una gran variedad de estreptococos en los grupos A y C son capaces de producir altas concentraciones de HA. Los microorganismos que pueden utilizarse en el procedimiento de la presente invención incluyen S. dysgalactiae, S. equi, S. equisimilis, S. pyogenes, y S. zooepidemicus, que pertenecen al grupo C, y que no son por tanto patogénicos para el hombre. La especie preferente es S. equi y en particular la cepa S. equi 68222 del Instituto Belfanti en Milán. A esta cepa no se le han aplicado procedimientos de ingeniería genética, y no está sometida, por tanto, a la desventaja de la inestabilidad, que es característica de las cepas manipuladas genéticamente. S. equi 68222 produce ácido hialurónico bajo condiciones de aerobiosis; la fuente de carbono puede ser la glucosa.

Es bien sabido que los estreptococos constituyen, desde un punto de vista nutricional, algunas de las bacterias más exigentes (Terleckyl y col., Infection and Immunity, págs 649-655, 1975; Milligan y col., J. of Clinical Microbiol. págs 28-33, 1978). En la literatura, se han descrito varios medios de cultivo que promueven el desarrollo de estos microorganismos y su producción de ácido hialurónico. Tales medios incluyen normalmente hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas y sales orgánicas, así como varios factores de crecimiento. La influencia de la fuente de carbono, nitrógeno y compuestos inorgánicos sobre el desarrollo bacteriano y el metabolismo es muy importante para estos microorganismos que producen exopolisacáridos (Robinson y col. Biotech. and Bioeng. XXVI: páginas 1409-1417, 1984; MacFarlane y col. J. of Appl. Bacteriol. 68:páginas 179-187, 1990).

Respecto a la fuente más apropiada de carbono para la producción de HA, la más ampliamente utilizada es la glucosa, que se utiliza también según la invención, aunque otros azúcares pueden utilizarse con éxito. Éstos incluyen, por ejemplo, sacarosa, lactosa, molasas finales, e hidrolisados del almidón. Verdaderamente, aparte de constituir una fuente de energía para el desarrollo celular, éstos pueden también utilizarse para la síntesis de los monómeros sencillos que componen el polímero HA.

Pueden utilizarse varias fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico, incluyendo extracto de levadura, peptonas, hidrolisados de caseína, proteínas de la soja, sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, etc. Según la invención, se utiliza una mezcla de peptonas.

Aparte de estos dos componentes principales, pueden añadirse al medio de cultivo sales inorgánicas, tales como varios sulfatos, carbonatos, fosfatos, cloruro cálcico, potasio, magnesio, sodio, manganeso, zinc, hierro, etc, que aumentan el desarrollo y que pueden a veces intervenir como cofactores enzimáticos implicados en la síntesis del ácido hialurónico.

Los presentes inventores han concebido un medio de cultivo que facilita la producción de ácido hialurónico de alto peso molecular con un buen rendimiento, y que es económico de utilizar, con vistas hacia la producción a escala industrial. Este medio da lugar a una mejor relación ácido hialurónico/células cuando se compara a la obtenida mediante cultivo bacteriano sobre medios comerciales tal como la Infusión de Cerebro Corazón o sobre varios tipos de medios descritos en la literatura de patentes. Una alta relación HA/células facilita el estado inicial de purificación, que consiste en la separación de las células bacterianas del líquido de cultivo que contiene el biopolímero.

Ejemplo 1 Comparación del desarrollo bacteriano y de la producción de ácido hialurónico sobre varios medios

El siguiente medio semidefinido, denominado HYP, se preparó en agua destilada:

Medio HYP

HY-SOY	10 g/L
SPECIAL PEPTONE	10 g/l
Glucosa	30 g/l

HY-SOY es un producto comercial de Sheffield Products-QUEST International. Es una fuente de nitrógeno vegetal soluble en agua obtenida de un digesto papaico de harina de soja. Debido a su alto nivel en hidratos de carbono, esta fuente de nitrógeno estimula el rápido e intenso desarrollo de los microorganismos.

La SPECIAL PEPTONE (POLIPEPTONA) es un producto comercial de UNIPATH. Es una mezcla de peptonas compuesta de harina, vegetales y extracto de levadura, y contiene una gran variedad de péptidos disponibles, minerales, vitaminas, nucleótidos y otros compuestos orgánicos.

Equivalentes de SPECIAL PEPTONE que pueden utilizarse en la presente invención incluyen PEPTONE BACTERIOLOGICAL TECHNICAL de Difco, PEPTONE FROM MEAT ("PEPTONA DE CARNE") de Serva, y PRIMATONE de Productos Sheffield.

El YEAST EXTRACT ("EXTRACTO DE LEVADURA") de Difco y otros equivalentes suyos comercialmente disponibles, pueden utilizarse en el medio HYP en lugar de SPECIAL PEPTONE. El YEAST EXTRACT ("EXTRACTO DE LEVADURA") es la parte soluble en agua de la levadura autolisada, estandarizada para utilización microbiológica.

Se preparó una solución de almacenamiento de glucosa mediante filtración a través de un filtro de 0,22 micras. Se trataron en el autoclave HY-SOY y SPECIAL PEPTONE a 121ºC durante 20 minutos. Se mezclaron cantidades apropiadas de ambas soluciones esterilizadas, y se ajustó el pH del medio a un valor de 7 aproximadamente.

El desarrollo y la producción de HA por S. equi 68222 en este medio de cultivo se comparó con el que utilizaba el mismo microorganismo cultivado en un medio comercialmente disponible (Infusión de Cerebro Corazón, BHI) o los medios descritos en varias patentes (Solicitud de Patente Europea Nº 0 244 757; Patente USA No. 4.784.990; y Solicitud de Patente Europea 0 266 578), de la manera siguiente:

Infusión de Cerebro Corazón (BHI)

Infusión de cerebro de ternera	200 g/l
Infusión de corazón de oveja	250 g/l
Peptona proteosa	10 g/l
Bacto dextrosa	2 g/l
NaCl	5 g/l
Fosfato disódico	2,5 g/l

Medio en la patente USA 4.784.990

Hidrolisado de caseína	20 g/l
Extracto de levadura	10 g/l
NaCl	2 g/l
MgSO_{4}.7H_{2}O	1,5 g/l
K_{2}HPO_{4}	2,5 g/l
Glucosa	5 g/l

Medio en patente EP 0 266 578

Peptona	15 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
KH_{2}PO_{4}	10 g/l
CH_{3}COONa.3H_{2}O	5 g/l
NaHCO_{3}	3 g/l
MgSO_{4}.7H_{2}O	0,2 g/l
FeSO_{4}.7H_{2}O	0,01 g/l
MnCl_{2}.4H_{2}O	0,01 g/l
CaCl_{2}	0,05 g/l
Glucosa	30 g/l

Medio en patente EP 0 244 757 (medio KBS)

Polipeptona	15 g/l
Extracto de levadura	5 g/l
KH_{2}PO_{4}	2 g/l
MgSO_{4}. 7H_{2}O	1 g/l
CaCl_{2}	0,1 g/l
Glucosa	60 g/l

Se inoculó un asa de platino de S. equi 68222 en 100 ml de cada uno de estos distintos medios, previamente esterilizados, en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Los cultivos se incubaron por duplicado durante la noche a 37ºC, mientras se agitaban a 200 rpm. Después de medir la densidad óptica de cada cultivo a 600 nm, el contenido de cada matraz se diluyó con medio recién preparado, hasta que se obtuvo una densidad óptica de 0,1 aproximadamente, de forma que se obtuvo un volumen final de 200 ml en un matraz de 1 litro. La temperatura del desarrollo se mantuvo a 37ºC durante la agitación vigorosa (200 rpm) a un pH de 7. Cuando el pH del medio rebasó el intérvalo apropiado, se volvió a su valor apropiado añadiendo una cantidad apropiada de ácido o de base, por ejemplo, HCl 1N acuoso o NaOH 1N acuoso.

Durante el cultivo celular, el desarrollo se controló haciendo lecturas de la densidad óptica a 600 nm, mientras el pH se controlaba utilizando rojo fenol, y se mantenía a un valor de 7 aproximadamente. Al final de la fermentación, es decir, cuando las bacterias detuvieron su crecimiento, se midieron el crecimiento celular y la producción de ácido hialurónico. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La cantidad de ácido hialurónico producido por el S.equi 68222 fermentativo en el medio HYP es mayor que la obtenida en la Infusion de Cerebro Corazón y en los otros medios ensayados. Además, la concentración celular es considerablemente más baja, explicando la mejor relación HA/células y la separación más fácil de las bacterias del caldo de cultivo.

La extrema sencillez del presente medio y el coste más económico de la fuente de nitrógeno utilizada, comparados con los de las fuentes de nitrógeno utilizadas en los medios comparativos hicieron al HYP más rentable y competitivo, especialmente para las aplicaciones industriales.

Ejemplo 2 Efecto de la concentración de glucosa, aireación y barredores de radicales libres sobre el desarrollo bacteriano y la producción de ácido hialurónico

Modificando los parámetros del cultivo, es posible aumentar la producción de polisacáridos microbianos. La utilización de un cultivo en discontinuo o continuo, hace posible aplicar distintas presiones fisiológicas sobre el crecimiento de los microrganismos y sobre la síntesis de los polisacáricos.

Se determinó el efecto de distintas concentraciones de glucosa sobre el crecimiento celular y la producción de ácido hialurónico. El crecimiento celular, el consumo de glucosa, la producción de HA, la eficiencia en la conversión de glucosa en HA, y la relación HA/célula, se analizaron utilizando concentraciones de glucosa de 0, 5, 15, 30 y 60 g/l en el medio de cultivo.

Se volvió a suspender en 200 ml de un medio de cultivo HYP un asa de platino de S.equi 68222 en ausencia de glucosa en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. El cultivo se agitó a 200 rpm a 37ºC durante la noche. Al día siguiente, se utilizó el cultivo para inocular diez matraces de 500 ml. Una cantidad del inóculo se diluyó con medio recién preparado para obtener una densidad óptica de 0,1 en un volumen total de 100 ml. Se añadió glucosa a los matraces en cantidades finales de 0 g/l, 5g/l, 15g/l, 30g/l y 60 g/l. Cada experimento se realizó por duplicado. Los matraces se incubaron a 37ºC con agitación a 200 rpm. Se controlaron la densidad óptica, el consumo de glucosa y la producción de HA durante la fase de crecimiento; al final de la fermentación, la concentración celular se midió en términos de gramos de peso seco.

Como puede apreciarse a partir de los resultados dados a conocer en la Tabla 2, los valores más altos para la producción de HA se obtienen utilizando 30 g/l y 60 g/l de glucosa, pareciendo incluso que el crecimiento a 60 g/l es ligeramente más lento, mientras la concentración celular en el estado de equilibrio es similar en los dos casos. Por otra parte, disminuyendo la concentración de glucosa en el medio, existe una disminución simultánea en la producción de HA. Una concentración de glucosa de 30 g/l aproximadamente parece ser, por tanto, óptima para la producción de HA mediante el S.equi 68222.

2

El efecto de oxigenación sobre el crecimiento bacteriano y la producción de HA también se evaluó. Se prepararon ocho matraces Erlenmeyer de 1 litro que contenían, por duplicado, 100 ml, 200 ml, 500 ml y 1 litro de medio de cultivo HYP. Los matraces se inocularon entonces con una suspensión de S. equi 68222 y se incubaron durante la noche a 37ºC mientras se agitaban a 200 rpm. Las condiciones del cultivo se mantuvieron constantes para todos los matraces; 37ºC, pH 7, 200 rpm. Una vez se alcanzó el estado de equilibrio, se determinaron la densidad óptica a 600 nm y la producción de ácido hialurónico.

Como puede apreciarse a partir de los datos en la Tabla 3, la aireación no parece afectar al crecimiento bacteriano muy intensamente, mientras que la buena oxigenación es muy importante para la producción abundante del ácido hialurónico. Es posible que cuando la aireación se reduce el oxígeno disponible se utiliza más para la reproducción celular que para la síntesis del biopolímero.

TABLA 3

3

En cultivos expuestos a una intensa oxigenación, sin embargo, puede existir una acumulación de radicales libres, esto es, aniones superóxidos, peróxidos de hidrógeno, radicales hidroxílicos, oxígeno simple, etc. Recientemente, se ha sugerido que estos radicales libres pueden estar implicados en la degradación del ácido hialurónico (Robert y col. "Treatment of Cartilage Proteoglycan Aggregate With H_{2}O_{2}," Biochem. J. 247: págs 349-357 (1987)). Se ha demostrado posteriormente que in vivo, las cadenas poliméricas del ácido hialurónico se degradan fácilmente tanto por el efecto de factores físicos como por el de químicos, tales como la radiación y los agentes oxidantes y enzimáticos (Merry y col, Annals of the Rheumatic Diseases 48: páginas 864-870 (1989): R.A. Greenwald, Seminars of Arthritis and Rheumatism, 20: páginas 210-240 (1991)). Otros estudios han demostrado que el ácido hialurónico es despolimerizado por la acción de radicales libres debido a una escisión oxidativa del enlace glicosídico.

Se evaluó, por tanto, el efecto de una categoría de moléculas con características antioxidantes, sobre la acción de los radicales libres y consecuentemente, sobre la despolimerización del ácido hialurónico.

De las moléculas capaces de capturar las especies radicales reactivas, existen dos tipos de compuestos que tienen por lo menos un anillo aromático al que se unen uno o más grupos hidroxílicos. Estos compuestos incluyen, por ejemplo, el ácido 2,3-dihidroxibenzoico, el ácido salicílico, vanilina, ácido tánnico, etc.

Diez matraces de 1 litro se rellenaron con 200 ml de medio de cultivo KBS, y a dos de éstos, se añadieron 0,11 g/l de ácido 2,3-hidroxibenzoico, mientras que el ácido salicílico, vanilina, y el ácido tánnico se añadieron a los otros matraces, respectivamente, a la misma concentración. Se utilizaron dos matraces como controles, y contenían sólo medio de cultivo sin ninguna molécula antioxidante.

Los matraces se inocularon con una suspensión de S.equi 68222 de forma que se obtuviera una densidad óptica inicial de 0,1, incubándose por la noche a 37ºC mientras se agitaba a 200 rpm. Las condiciones del cultivo se mantuvieron constantes en todos los matraces; 37ºC, pH 7, 200 rpm. Una vez se alcanzó el estado de equilibrio, se detuvo la fermentación, se purificó el ácido hialurónico y su peso molecular se midió mediante la técnica GPC-LALLS (P. Kratochvil, "Classical Light Scattering From Polymer Solutins", Polymer Science Library, Vol 5, Elsevier).

Los resultados obtenidos, que se muestran en la Tabla 4, demuestran que las moléculas que actúan como barredores de radicales libres pueden utilizarse ventajosamente para proteger al HA bacteriano de la degradación de tipo radical, manteniento su peso molecular, haciendo así al HA útil en diversas aplicaciones farmacéuticas y otras.

TABLA 4

4

Para la utilización como barredores de radicales libres en el medio y procedimientos de la presente invención, se considera una amplia variedad de tipos de compuestos. Éstos incluyen:

Fenoles monohídricos

Fenol, cresol, xilenol, catecol, 4-metil-pirocatecol, urushiol, cresolcinol, y orcinol;

Fenoles dihídricos Fenoles polihídricos

Pirogalol, 1,2,4-bencenotriol, bencenotetraol, y bencenohexaol;

Ácidos hidroxicarboxílicos aromáticos

Ácido gentisínico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, ácido gálico, ácido salicílico, ácido protocatechuico, ácido pirogalo-4-carboxílico, ácido 3-o-galoilgálico, y sus ésteres;

Aldehidos aromáticos

Vanilina, o-vanilina, y protocatechualdehído:

Compuestos heterocíclicos

Catequina, luteolina, miricetina, y antocianidina;

Compuestos policíclicos no condensados con grupos hidroxil fenólicos

Bifenildiol y ácido elágico;

Compuestos de naftaleno con grupos hidroxílicos

Naftol y naftalendiol;

Compuestos de antraceno con grupos hidroxílicos fenólicos

Crisarobina y antragalol:

Ácido sulfosalicílico Vitamina P 3,4-dihidroxifenilalanina Taninos, ácido tánico

Estos compuestos se han descrito en EP 0 266 578.

Ejemplo 3

Se cultivó S. equi 68222 en fermentadores que tenían una capacidad de 3 a 10 litros, provistos con un mecanismo de agitación, utilizando medio HYP. Ya que la concentración de oxígeno en el medio de cultivo controla la síntesis del ácido hialurónico, tal como se describe en el Ejemplo 2, la fermentación se llevó a cabo bajo condiciones aeróbicas de forma que se mantuviera la concentración de oxígeno disuelto en el medio a una saturación del 20 aproximadamente. Los fermentadores se inocularon con un inóculo bacteriano igual al 10 (vol/vol) del volumen del medio. Durante la fermentación, la temperatura se mantuvo a 37ºC, y el pH se mantuvo a un valor de 7 añadiendo hidróxido sódico 0,1N. La formación de espuma se controló añadiendo un agente antiespumante no tóxico apropiado, tal como la Silicona 1520 (EU) de Dow Corning. Al final de la fermentación, la densidad de la biomasa era equivalente a un valor de turbidez de 8-12 unidades de densidad óptica medidas a 660 nm.

Bajo estas condiciones, el ácido hialurónico se produjo con un rendimiento de 1,5-2 g/l aproximadamente.

Ejemplo 4 Purificación del ácido hialurónico a partir de los caldos de fermentación

Hasta la fecha, se han utilizado varias técnicas para purificar el ácido hialurónico de alto peso molecular, a partir de los caldos de fermentación. Tales técnicas incluyen el tratamiento con ácido tricloroacético o con una mezcla de alcohol isoamílico y cloroformo, la utilización de enzimas proteolíticos, la precipitación en etanol o acetona, y la precipitación selectiva del ácido hialurónico con cloruro de cetilpiridina. Estos procedimientos convencionales para el aislamiento y purificación del ácido hialurónico no son apropiados para fines industriales a causa de la cantidad de etapas requeridas, a menudo complicadas, a su alto coste, y a la toxicidad de los reactivos implicados.

El procedimiento de purificación descrito a continuación, utilizando un sistema único que no necesita la utilización de reactivos tóxicos y que es particularmente rentable, facilita la preparación del ácido hialurónico con un peso molecular de más de 2x10^{6} Daltons y de un alto grado de pureza.

Al final de la fermentación, las células se matan tratándolas con un bactericida. Pueden utilizarse agentes alquilantes tales como el formaldehído que, si se usa en una solución acuosa al 37%, se denomina formalina. Otros bactericidas útiles incluyen alcoholes tales como el alcohol etílico y el alcohol isopropílico, y solventes orgánicos tales como cloroformo y acetona. Estos compuestos se utilizan normalmente a una concentración de 1%, vol/vol.

Para facilitar la liberación de cualquier ácido hialurónico que pudiera todavía estar unido a la cápsula bacteriana, puede añadirse una solución apropiada de un surfactante aniónico, tal como sulfato dodecil sódico, a una concentración de 0,02 aproximadamente y 0,04, peso/vol. Otros surfactantes útiles incluyen, por ejemplo, TWEEN 20 (polioxietileno sorbitan monolaurato), TWEEN 40 (polioxietileno sorbitan monopalmitato), TWEEN 60 (polioxietileno sorbitan monoestearato), TWEEN 80 (polioxietileno sorbitan monooleato), y DIGITONINA.

La masa bacteriana se deja en contacto con estos reactivos durante la noche a temperatura ambiente, después de lo cual la células bacterianas se separan del caldo de cultivo que contiene el biopolímero. Las células se eliminan del caldo de cultivo mediante prefiltración con filtros que tienen una porosidad de 0,1 a 10 micras aproximadamente. Los filtros Millipore CP15-CP20 son particularmente apropiados para este propósito. La solución del ácido hialurónico, parcialmente libre de células bacterianas, se purifica con éxito mediante microfiltración. Para eliminar del caldo de cultivo las células bacterianas que quedan, puede utilizarse la filtración tangencial de flujo. En este procedimiento, el caldo de fermentación se bombea a través de membranas que tienen una porosidad de 0,45 \mum aproximadamente. Por ejemplo, pueden utilizarse placas de filtración Minitan de 0,45 \mum a la vez que el sistema MINITAN-S de filtración tangencial de flujo Millipore.

La solución así obtenida se limpia de impurezas que provienen de los componentes del medio de cultivo, de los productos de degradación de las células bacterianas, de los residuos de los bactericidas utilizados, y del agente surfactante, mediante diálisis contra agua destilada. Para esta etapa, puede utilizarse una membrana de ultrafiltración con una extinción del peso molecular de 200.000 Daltons. En este momento, la solución filtrada se dializa contra 10 y 50 volúmenes de agua destilada, desechándose el filtrado. Al final de la diálisis, la solución concentrada se liofiliza. El ácido hialurónico así obtenido posee un peso molecular de 2 a 3x10^{6} Daltons aproximadamente, medido mediante la técnica GPC LALLS. El producto purificado se analiza entonces para determinar su contenido proiteco y el contenido de ácidos nucleicos y pirógenos. El contenido máximo de cada una de estas impurezas deberá ser: proteínas, < 1,5; ácidos nucleicos, < 1%; y pirógenos, < 10 mg/kg.

Ejemplo 5 Efecto del ácido hialurónico sobre la proliferación fibroblástica y la expresión de la \alpha-actina

La formación de cicatrices constituye una parte esencial e integral de la reparación tisular. El tejido cicatricial confiere cierto grado de elasticidad al sitio de la herida, permitiendo que el tejido nuevamente formado se defienda del estrés causado por los movimientos normales del cuerpo. El depósito de tejido cicatricial se debe esencialmente a la proliferación y producción de colágeno por algunas células (fibroblastos en particular) que migran al sitio de la herida.

Sin embargo, como sucede en muchos procesos biológicos, la reparación tisular puede a veces descontrolarse y convertirse en perjudicial, llevando a consecuencias graves. En algunos casos, por ejemplo en el caso de las heridas hipertróficas o queloides, los fibroblastos pueden ser sobre-estimulados, con la consiguiente superproducción de tejido de granulación. La composición de este tejido de granulación puede también poseer una relación anormal el colágeno de tipo 3 y de tipo 1. Además, los fibroblastos pueden producir una cantidad excesiva de \alpha-actina, produciendo de este modo una contracción severa del tejido de granulación. Esto da lugar a la formación de una cicatriz aumentada en el caso de cicatrices hipertróficas, y la formación de una cicatriz crónica curada imperfectamente en el caso de los queloides.

Una aproximación a la modificación de tales anormalidades podría ser la aplicación al sitio de la herida de agentes capaces de suprimir la proliferación de los fibroblastos y la formación de \alpha-actina.

El ácido hialurónico de alto peso molecular, producido según el procedimiento descrito en la presente memoria, se ha ensayado para evaluar su capacidad para modular la proliferación de células musculares lisas de rata cultivadas in vitro, y la expresión de la \alpha-actina por dichas células.

Las células musculares lisas de la aorta de la rata se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM). Las células se dispusieron entonces en placas de Petri de 100 mm a una concentración de 5x10^{3} células/cm^{2}. Los productos que iban a ser ensayados se añadieron a las placas después de 24 horas de cultivo, y las células se mantuvieron en cultivo durante otros siete días. El número de células se determinó utilizando un hemocitómetro. El contenido de la \alpha-actina de las fibras musculares lisas se determinó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia.

Las células se volvieron a suspender en 0,4 M Tris-HCl, pH 6,8, que contenía SDS al 1%, ditiotreitol al 1, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM del éster metílico de la Na-p-tosil-L-arginina, hirviéndose durante tres minutos. La concentración proteica se determinó mediante el procedimiento de Bradford (Anal.Biochem. 72: pág. 248 (1976)), y 1 y 5 \mug de cada muestra se cargaron en geles de electroforesis del 5-20. Se llevó a cabo la transferencia Western tal como fue descrita por Skalli y col., J.Cell. Biol. 103:página 2787 (1991). Se evaluaron las modificaciones en la expresión de la actina mediante rastreo densitométrico de las manchas (de transferencia).

Los resultados se muestran en las Tablas 5-7.

TABLA 5

5

TABLA 6

6

TABLA 7

7

El contaje celular y los niveles de actina se expresan como procentajes medios comparados con los controles. El ácido hialurónico con un peso molecular de 2x10^{6} Daltons inhibe la proliferación celular y la expresión de la \alpha-actina de los músculos lisos de una forma dependiente de la dosis.

Estos resultados sugieren que HA puede modular la proliferación de los fibroblastos y la actividad contráctil en las heridas hipertróficas y queloides.

Ejemplo 6 Utilización del ácido hialurónico de alto peso molecular en la modulación de la cicatrización de las heridas y, por tanto, sus composiciones farmacéuticas

Composiciones farmacéuticas conteniendo una cantidad efectiva de ácido hialurónico con un peso molecular de 2X10^{6} a 3X10^{6} Daltons aproximadamente, preparadas según los procedimientos de la presente invención, solas o en asociación con uno o más principios activos, portadores farmacológicamente aceptables, diluyentes o excipientes, pueden utilizarse con ventajas para la reducción de la cicatrices en los casos de formación de cicatrices hipertróficas o de queloides.

Las composiciones farmacéuticas conteniendo ácido hialurónico adaptadas para la administración tópica, intra-articular, oftálmica, sistémica y peritoneal, se han descrito en la Patente Europea 0 138 572 B1. Estas composiciones contienen típicamente ácido hialurónico en una cantidad de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml aproximadamente. Para la administración tópica e intra-articular, pueden estar en forma de cremas, geles, pomadas, vendas y gasas. Para utilización oftálmica, pueden estar en forma de gotas oculares, lentes, e hilos de sutura. Para administración sistémica, son apropiadas preparaciones farmacéuticas para administración intravenosa o intramuscular, tales como ampollas o viales.

Estas composiciones farmacéuticas, que contienen ácido hialurónico con un peso molecular de 2X10^{6} a 3X10^{6}Dal-
tons aproximadamente, y especialmente 2X10^{6} Daltons, pueden administrarse a individuos humanos o animales para inhibir la formación de cicatrices hipertróficas y queloides que aparecen en los sitios de las heridas que se originan por lesiones o provienen de intervenciones quirúrgicas. Estas composiciones farmacéuticas pueden aplicarse tópicamente en el sitio herido en forma de un líquido, crema, gel, rociado, o un biomaterial hidrófilo, o en forma de una inyección intradérmica al formarse la herida o la sutura. Las dosis del ácido hialurónico de alto peso molecular dependen de la necesidad individual del paciente, del efecto deseado, y de la vía de administración, y puede típicamente ser del orden de aproximadamente 0,1 mg a 100 mg por pulgada o pulgada cuadrada de la incisión o de la herida, respectivamente. La administración de estas composiciones farmacéuticas en el sitio herido pueden continuarse diariamente tanto como se necesite hasta un momento en el que el proceso de curación se haya terminado, con objeto de evitar la formación de la cicatriz o del queloide.

Estando la invención descrita de este modo, es obvio que la misma puede variarse de muchas manera. Tales variaciones no debe considerarse que se apartan del espíritu y alcance de la invención, y la totalidad de tales variaciones, tal como es obvio para los expertos en la materia, tienen la intención de ser incluídas dentro del campo de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Medio de cultivo, que comprende un digesto de harina de soja, una mezcla de peptona y una fuente de carbono,

en el que dicho digesto de harina de soja es HY-SOY, dicha mezcla de peptonas es SPECIAL PEPTONE, y dicha fuente de carbono es glucosa,

encontrándose dicho HY-SOY a una concentración de 10 g/l y 30 g/l aproximadamente, encontrándose dicha SPECIAL PEPTONE a una concentración de 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, y encontrándose dicha glucosa a una concentración de 10 g/l y 60 g/l aproximadamente.

2. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, que comprende además un barredor de radicales libres.

3. Medio de cultivo según la reivindicación 2, en el que dicho barredor de radicales libres es por lo menos un miembro seleccionado del grupo formado por un fenol monohídrico, un fenol dihídrico, un fenol polihídrico, un ácido hidroxi-carboxílico aromático, un aldehído aromático, un compuesto heterocíclico, un compuesto policíclico no condensado con, por lo menos, un grupo hidroxil fenólico, un compuesto de naftaleno con, por lo menos, un grupo hidroxilo, un compuesto de antraceno con, por lo menos, un grupo hidroxil fenólico, ácido sulfosalicílico, vitamina P, 3,4-dihidroxifenilalanina, y un tanino.

4. Medio de cultivo, según la reivindicación 3, en el que dicho fenol monohídrico se selecciona del grupo formado por fenol, cresol, xilenol, catecol, 4-metil-pirocatecol, urushiol, cresolcinol, y orcinol; dicho fenol polihídrico es un miembro seleccionado del grupo formado por pirogalol, 1,2,4-bencenotriol, bencenotetraol, y bencenohexaol; dicho ácido hidroxicarboxílico aromático es un miembro seleccionado del grupo formado por ácido gentisínico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, ácido gálico, ácido salicílico, ácido protocatechuico, ácido pirogalo-4-carboxílico y ácido 3-o-galoilgálico; dicho éster de un ácido hidroxicarboxílico aromático es seleccionado del grupo formado por un éster del ácido gentisínico, un éster del ácido 2,3-dihidroxibenzoico, un éster del ácido gálico, un éster del ácido salicílico, un éster del ácido protocatechuico, un éster del ácido pirogalo-4-carboxílico, un éster del ácido 3-o-galloilgálico; dicho aldehído aromático es seleccionado del grupo formado por vanilina, o-vanilina y protocatechualdehído; dicho compuesto heterocíclico se selecciona del grupo formado por catequina, luteolina, miricetina, y antocianidina; dicho compuesto policíclico no condensado que tiene por lo menos un grupo hidroxil fenólico, es seleccionado del grupo formado por bifenildiol y ácido elágico; dicho compuesto de nafaleno con, por lo menos, un grupo hidroxilo, es seleccionado del grupo formado por naftol y naftalendiol; y dicho compuesto de antraceno con, por lo menos, un grupo hidroxil fenólico, se selecciona del grupo formado por crisarobina y antragalol.

5. Medio de cultivo según la reivindicación 2, en el que dicho barredor de radicales libres se encuentra a una concentración de 0,01 g/l a 1 g/l aproximadamente.

6. Medio de cultivo según la reivindicación 5, en el que dicha HY-SOY se encuentra a una concentración de 20 g/l, dicha SPECIAL PEPTONE se encuentra a una concentración de 10 g/l, dicha glucosa se encuentra a una concentración de 30 g/l, y dicho barredor de radicales libres se encuentra a una concentración de 0,1 g/l, con un pH de 6,5 y 7,5 aproximadamente.

7. Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, que comprende:

el cultivo de una cepa bacteriana capaz de producir ácido hialurónico en un medio de cultivo que comprende un digesto de harina de soja, una mezcla de peptona y una fuente de carbono bajo condiciones que promuevan la formación de ácido hialurónico mediante dicha cepa bacteriana, y recuperando dicho ácido hialurónico,

en el que dicho digesto de harina de soja es HY-SOY, dicha mezcla de peptona es SPECIAL PEPTONE, y dicha fuente de carbono es glucosa,

encontrándose dicha HY-SOY a una concentración de 10 g/l y 30 g/l aproximadamente, encontrándose dicha SPECIAL PEPTONE a una concentración de 5 g/l y 15 g/l aproximadamente, y encontrándose dicha glucosa a una concentración de 10 g/l y 60 g/l aproximadamente.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que dicha cepa bacteriana es una cepa de Streptococcus.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicha cepa de Streptococcus es un Streptococcus del grupo A o del grupo C.

10. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicha cepa de Streptococcus es un miembro seleccionado del grupo formado por S. equi, S. equisimilis, S. dysgalactiae, S. pyogenes, y S. zooepidemicus.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que dicha S.equi es S.equi 68222.

12. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que dicha glucosa se encuentra a una concentración de 30 g/l.

13. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que dicho medio comprende además, por lo menos, un barredor de radicales libres.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicho barredor de radicales libres es un miembro seleccionado del grupo formado por un fenol monohídrico, un fenol dihídrico, un fenol polihídrico, un ácido hidroxi-carboxílico aromático, un aldehído aromático, un compuesto heterocíclico, un compuesto policíclico no condensado con, por lo menos, un grupo hidroxil fenólico, un compuesto de naftaleno con, por lo menos, un grupo hidroxilo, un compuesto de antraceno con, por lo menos, un grupo hidroxil fenólico, ácido sulfosalicílico, vitamina P, 3,4-dihidroxifenilalanina, y un tanino.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el que dicho fenol monohídrico se selecciona del grupo formado por fenol, cresol, xilenol, catecol, 4-metil-pirocatecol, urushiol, cresolcinol, y orcinol; dicho fenol polihídrico es un miembro seleccionado del grupo formado por pirogalol, 1,2,4-bencenotriol, bencenotetraol, y bencenohexaol; dicho ácido hidroxicarboxílico aromático es un miembro seleccionado del grupo formado por ácido gentisínico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, ácido gálico, ácido salicílico, ácido protocatechuico, ácido pirogalo-4-carboxílico y ácido 3-o-galoilgálico; dicho éster de un ácido hidroxicarboxílico aromático es seleccionado del grupo formado por un éster del ácido gentisínico, un éster del ácido 2,3-dihidroxibenzoico, un éster del ácido gálico, un éster del ácido salicílico, un éster del ácido protocatechuico, un éster del ácido pirogalo-4-carboxílico y un éster del ácido 3-o-galoilgálico; dicho aldehído aromático es seleccionado del grupo formado por vanilina, o-vanilina y protocatechualdehído; dicho compuesto heterocíclico se selecciona del grupo formado por catequina, luteolina, miricetina, y antocianidina; dicho compuesto policíclico no condensado que tiene por lo menos un grupo hidroxil fenólico, es seleccionado del grupo formado por bifenildiol y ácido elágico; dicho compuesto de naftaleno con por lo menos un grupo hidroxilo, es seleccionado del grupo formado por naftol y naftalendiol; y dicho compuesto de antraceno que tiene por lo menos un grupo hidroxil fenólico, se selecciona del grupo formado por crisarobina y antragalol.

16. Proceso según la reivindicación 13, en el que dicho barredor de radicales libres se encuentra a una concentración de 0,01 g/l y 1 g/l aproximadamente.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 7 y 16, que comprende además:

la muerte de las células bacterianas que se encuentran en dicho medio de cultivo, tratando a dichas células con un bactericida seleccionado del grupo formado por formaldehído, un alcohol, cloroformo y acetona;

la liberación de cualquier ácido hialurónico que esté adherido a dichas células bacterianas mediante su tratamiento con un surfactante;

la eliminación de las células bacterianas prefiltrando dicho medio de cultivo a través de un filtro que posee una porosidad de 0,1 \mum y 10 \mum aproximadamente;

la eliminación de cualquier célula bacteriana remanente mediante microfiltración de dicho medio de cultivo a través de un filtro con una porosidad de 0,45 \mum aproximadamente;

la dialización de dicho medio de cultivo contra agua destilada; y

la concentración del medio dializado.