ES2208938T3

ES2208938T3 - Dispositivos biocompatibles provistos de andamios alveolares.

Info

Publication number: ES2208938T3
Application number: ES97935251T
Authority: ES
Inventors: Rebecca Li; Tyrone F. Hazlett
Original assignee: Neurotech SA France
Current assignee: Neurotech Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: WO1998005304A1; CA2258483A1; US6231879B1; JP4212116B2; CA2258483C; EP0918509A4; US6054142A; EP0918509A1; DE69725149T2; AU3823697A; JP2000515551A; ATE250435T1; EP0918509B1; DK0918509T3; DE69725149D1; AU723826B2

Abstract

SE PROPORCIONA UN DISPOSITIVO CELULAR BIOCOMPATIBLE QUE TIENE UN ARMAZON INTERNO DE ESPUMA A FIN DE PROPORCIONAR UNA SUPERFICIE PARA EL CRECIMIENTO DE CELULAS ENCAPSULADAS, QUE PRODUCEN UNA MOLECULA BIOLOGICAMENTE ACTIVA (DA) O PROPORCIONAN UNA FUNCION BIOLOGICA.

Description

Dispositivos biocompatibles provistos de andamios alveolares.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a dispositivos biocompatibles con estructuras de espuma y a los procedimientos para la elaboración y el uso de dichos dispositivos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a dispositivos de encapsulación implantables para el tratamiento de enfermedades y desórdenes con células encapsuladas o sustancias tales como los neurotransmisores, neuromoduladores, hormonas, factores tróficos, factores de crecimiento, analgésicos, enzimas, anticuerpos y otras moléculas biológicamente activas. En concreto, la invención se refiere a dispositivos de encapsulación celular biocompatibles, e internamente sostenidos.

Un enfoque de encapsulación ha sido la macroencapsulación, que típicamente implica cargar células vivas en dispositivos de fibras huecas (o de otras formas adecuadas) y a continuación sellar las extremidades. La encapsulación de tales células mediante una membrana selectivamente permeable, o "permeoselectiva" permite la difusión de los factores biológicos producidos y segregados por las células, todavía contenidas, las células, dentro de una locación específica. La encapsulación también puede reducir o evitar el rechazo al huésped en el caso de transplantes xenogénicos (especies cruzadas) o alogénicos.

Se conocen diversos tipos de dispositivos celulares. La Patente de Estados Unidos 4.892.538 de Aebischer y colaboradores describe una membrana de fibra hueca selectivamente permeable para la encapsulación celular. La Patente de Estados Unidos 5.158.881, también de Aebischer y colaboradores, describe un procedimiento para encapsular células viables mediante la formación de un extrudado tubular alrededor de una suspensión celular y el sellado del extrudado tubular en intervalos para definir compartimentos de células separados unidos mediante uniones poliméricas. Véase también Mandel y colaboradores (documento WO91/00119), que se refiere a un tubo de membrana celular sellable y selectivamente permeable para su implantación en un sujeto que posee una superficie externa hidrófoba de poro grande, para encarar la vascularización.

Muchos de los tipos celulares usados en los dispositivos encapsulados son de tipo adherente, y (dividiéndose o no) se agregarán o adherirán entre sí. Estos clústeres o agregaciones celulares pueden forman un núcleo necrótico en el centro del dispositivo. Dicho núcleo puede desarrollarse con el tiempo debido a una escasez de determinados metabolitos que alcancen el centro del clúster celular o a una acumulación de productos tóxicos, lo que provoca la muerte de las células. Conforme se acumulan las células que mueren y empiezan a degradarse, el tejido necrótico puede también liberar factores que perjudican a las células supervivientes (por ejemplo, factores de los que se deriva un macrófago y otra respuesta inmunitaria).

Un enfoque para reducir la formación de un núcleo necrótico implica la inmovilización de las células en un material matriz, por ejemplo, una matriz de hidrogel, dentro del dispositivo. Véase, por ejemplo, Dionne y colaboradores (documento WO92/19195) que se refiere a vehículos inmunoaislantes biocompatibles con un núcleo de hidrogel o de matriz extracelular.

Otro procedimiento conocido para controlar el crecimiento de células en el dispositivo y para reducir los efectos necróticos en el núcleo consiste en proporcionar poli(hidroxietil metacrilato) o poli(hidroxietil metacrilato-co-metil metacrilato) o estructura de poliéster no tejido para que las células crezcan dentro del dispositivo. Véase, por ejemplo, Schimstine y colaboradores (documento WO96/02646). Tales estructuras forman una red fibrosa, y no una estructura celular abierta.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un nuevo dispositivo celular biocompatible con una estructura de espuma interna. La estructura de espuma posee una estructura celular abierta, es decir, una estructura que presenta macroporos interconectados. Las células pueden fijarse a las paredes de los macroporos. El material de la estructura usado en los dispositivos de esta invención es un material de espuma sintético, macroporoso, polimérico y de celdilla abierta. Se evita que las células contenidas en este material de la estructura escapen de la estructura mediante encapsulación dentro de una membrana porosa impermeable a las células.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es un gráfico de fluorescencia Alamar a partir de células PC12 a lo largo del tiempo, en comparación con dispositivos con una estructura de espuma de PVA (círculos cerrados) y dispositivos con una matriz de quitosán (cuadrados abiertos).

Fig. 2 es un gráfico de liberación de L-dopa basal (pm/ml/30 min) a partir de células P12 a lo largo del tiempo, en comparación con dispositivos con una estructura de espuma de PVA (círculos cerrados) y dispositivos con una matriz de quitosán (cuadrados abiertos).

Fig. 3 en un gráfico de liberación de L-dopa basal a partir de células PC12 antes del implante y en el explante después de 1 mes de implante en roedores. El gráfico muestra una comparación de dispositivos con una estructura de espuma de PVA (etiquetada como PVA) y dispositivos con una matriz de quitosán (marcada como control). Las barras con entramado representan datos pre-implante; las barras sin entramado representan datos de explante. Los dispositivos se cargaron inicialmente con una densidad baja (LD) de células, o con una densidad alta (HD) de células.

Fig. 4 es un gráfico de liberación de L-dopa K-evocada a partir de células PC12 antes del implante y en el explante después de 1 mes de implante en roedores. El gráfico muestra una comparación de dispositivos con una estructura de espuma de PVA (etiquetada como PVA) y dispositivos con una matriz de quitosán (marcada como control). Las barras con entramado representan datos pre-implante; las barras sin entramado representan datos de explante. Los dispositivos se cargaron inicialmente con una densidad baja (LD) de células, o con una densidad alta (HD) de células.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a dispositivos biocompatibles con una estructura interna de espuma. Los dispositivos de la presente invención poseen al menos una superficie selectivamente permeable (permeoselectiva) a través de la que pueden suministrarse moléculas biológicamente activas. El suministro de tales moléculas puede tener lugar desde el dispositivo hacia el huésped o desde el huésped hacia el dispositivo. El dispositivo puede incluir medios para introducir células en éste después de la implantación. Véase, por ejemplo, Aebischer y colaboradores. (documento WO93/00128).

Los dispositivos de la presente invención comprenden (a) una estructura de espuma que comprende una estructura reticulada de poros interconectados, siendo estos poros de un tamaño que permita a las células fijarse a las paredes del poro, (b) células vivas dispersadas dentro o sobre dicha estructura de espuma, y (c) una región circundante o periférica que comprende una envoltura de membrana selectivamente permeable que es biocompatible. Si así se desea, el dispositivo puede construirse para minimizar los efectos deletéreos que el sistema inmunitario del huésped ejerce sobre las células en su núcleo.

Las matrices de la técnica anterior usadas en dispositivos de membranas de fibra hueca para inmovilizar células eran hidrogeles entrecruzados. La estructura de espuma de esta invención muestra diversas ventajas sobre estas matrices de hidrogel convencionales:

(1): En general, los hidrogeles no inhiben el crecimiento y la migración celular debido a una carencia de superficies físicas que retengan a las células, mientras que la espuma posee poros interconectados con superficies (o paredes) sobre las que pueden fijarse las células. Esto puede inhibir el crecimiento de las células inhibidas por contacto. Así, para la proliferación de líneas celulares inhibidas por contacto, las espumas pueden proporcionar un número de células estables una vez que el área superficial se haya llenado de células, mientras que en los hidrogeles, la proliferación celular permanece incontrolada.

(2): Las espumas pueden proporcionar a las membranas de fibra hueca una resistencia mecánica, elasticidad y resistencia a la deformación añadida considerables, mientras que la mayoría de los hidrogeles son débiles mecánicamente y no pueden proporcionar resistencia a la deformación.

(3): Las espumas pueden formarse directamente en las membranas de fibra hueca y esterilizarse como parte del dispositivo antes de montarlo, eliminando la necesidad de inyectar las células en la matriz en una etapa aséptica separada.

(4): Las espumas pueden mantener a las células distribuidas más uniformemente en el dispositivo de encapsulación que con los sustratos de núcleo líquido empleados como soportes celulares previamente, y así pueden evitar la acumulación de células, que lleva a unas características de transporte pobres y a unos posibles núcleos necróticos subsiguientes en el lumen del dispositivo.

(5): Los materiales de espuma sintética son considerablemente más estables biológicamente que los hidrogeles que pueden degradarse por la acción de células o enzimas.

(6): Las espumas sintéticas no degradables no se incrustan a la membrana, mientras que los hidrogeles pueden obstruir los poros de la piel permeoselectiva de la membrana cuando se cargan en el dispositivo y cuando se degradan.

(7): Debido a que las espumas separan físicamente pequeños clústeres celulares unos de otros, éstas pueden soportar una densidad celular más alta que los materiales de matriz de hidrogel si se necesita.

Las estructuras de espuma de esta invención también muestran ventajas sobre las estructuras que no son de espuma. Las estructuras de espuma pueden producirse fácilmente con unas características y tamaños de poro definidos. Además, las estructuras de la técnica anterior poseen típicamente una estructura fibrosa en forma de red, más que una estructura de celdillas abiertas con poros interconectados, y por lo tanto posee menos superficie disponible para que se fijen las células. Por otra parte, las estructuras de red fibrosa son generalmente más difíciles de elaborar con características físicas reproducibles, y generalmente no pueden pre-fabricarse fuera de la envoltura de membrana. Además, la estructura macroporosa reticulada de la estructura de espuma permite la fabricación de áreas de permisividad celular y de no permisividad celular en el dispositivo, al llenar los poros con un material no permisivo (por ejemplo, un hidrogel no permisivo).

Un "dispositivo biocompatible" significa que el dispositivo, al implantarse en un mamífero huésped, no causa una respuesta perjudicial en el huésped que provocaría el rechazo del dispositivo o que lo haría inoperante. Dicha inoperatividad puede tener lugar, por ejemplo, mediante la formación de una estructura fibrosa alrededor del dispositivo, que limitaría la difusión de los nutrientes a las células que se encuentran en éste.

La "actividad biológica" se refiere a los efectos biológicos de una molécula sobre una célula específica. Según la presente invención, una "molécula biológicamente activa" es una molécula que ejerce su actividad biológica en la célula que la genera (por ejemplo, bcl-2 para evitar la apoptosis) o puede expresarse sobre la superficie celular y afectar a las interacciones de las células con otras células o moléculas biológicamente activas (por ejemplo, un receptor de neurotransmisores o una molécula de adhesión celular). Además, una molécula biológicamente activa puede liberarse o segregarse de la célula que la genera, y ejercer su efecto sobre una célula diana separada (por ejemplo, un neurotransmisor, hormona, factor de crecimiento o trófico, o citoquina).

Pueden usarse diversos polímeros y mezclas de polímeros para elaborar la envoltura del dispositivo de encapsulación. Las membrana poliméricas que forman el dispositivo pueden incluir poliacrilatos (incluyendo a copolímeros acrílicos), polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (incluyendo a las polietersulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilos, y PAN/PVC, así como sus derivados, copolímeros y mezclas de éstos.

Alternativamente, la envoltura del dispositivo puede formarse a partir de cualquier material biocompatible, incluyendo, por ejemplo, hidrogeles. Véase, por ejemplo, Dionne y colaboradores (documento WO92/19195).

La envoltura del dispositivo puede incluir también una matriz hidrófoba, por ejemplo un copolímero de etileno-acetato de vinilo, o una matriz hidrófila, por ejemplo un hidrogel. La envoltura puede revestirse con posterioridad a su producción o tratarse con un revestimiento externo impermeable, por ejemplo poliuretano, etileno-acetato de vinilo, silicio, o alginato, cubriendo parte del recinto celular. El material usado para formar la envoltura genera una región circundante o periférica que es selectivamente permeable y biocompatible.

Los disolventes usados en conjunción con los polímeros anteriormente identificados para la formación de la envoltura dependerán del polímero concreto que se haya elegido como material de membrana. Los disolventes adecuados incluyen una amplia variedad de disolventes orgánicos, tales como alcoholes y cetonas generalmente, así como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMA), y dimetilformamida (DMF) y también mezclas de estos disolventes. En general, se prefiere a los disolventes orgánicos miscibles con el agua.

La disolución polimérica (o "lubricante") también puede incluir diversos aditivos tales como los tensioactivos, para potenciar la formación de canales porosos, y antioxidantes para secuestrar a los óxidos que se forman durante el proceso de coagulación. Los tensioactivos ejemplares incluyen Triton-X 100, disponible en Sigma Chemical Corp., y Pluronics P65, P32 y P18. Los antioxidantes ejemplares incluyen vitamina C (ácido ascórbico) y vitamina E.

La envoltura permite el paso de sustancias de hasta un tamaño predeterminado, pero evita el paso de sustancias más grandes. Más específicamente, la envoltura se produce de tal manera que muestra poros o huecos de un intervalo de tamaño predeterminado. El límite de peso molecular (MWCO) escogido para un dispositivo en concreto se determinará en parte según la aplicación para la que se contemple. Las membranas más útiles en la presente invención son las membranas de ultrafiltración y microfiltración.

En una forma de realización, se contemplan las membranas de ultrafiltración. Éstas también se conocen como membranas selectivamente permeables o permeoselectivas. En esta forma de realización, se contempla un MWCO de 1000 kD o inferior, preferiblemente entre 50-700 kD o inferior, y preferentemente entre 70-300 kD. En otra forma de realización, se contemplan las membranas de microfiltración, o membranas microporosas, para formar la envoltura.

Puede usarse cualquier membrana adecuada para construir los dispositivos con una estructura interna de espuma de esta invención. Por ejemplo, pueden usarse las membranas permeoselectivas de fibra hueca que se describen en la Patente de Estados Unidos 4.892.538 (por ejemplo, los tubos XM-50 de AMICON Corp., Lexington, Massachussets). Alternativamente, pueden formarse membranas de fibra hueca selectivamente permeables, según se describe en las Patentes de Estados Unidos 5.284.761 ó 5.283.187, y en Baetge y colaboradores (documento WO95/05452). En una forma de realización, la envoltura se forma a partir de una membrana de polietersulfona de los tipos descritos en las Patentes de Estados Unidos 4.976.859 y 4.968.733 (en lo referente a membranas permeoselectivas y microporosas).

En la técnica se conocen diversos procedimientos para formar membranas permeables. En un procedimiento, las membranas de fibra hueca se forman por coextrusión de una disolución de colada polimérica y un coagulante (que puede incluir fragmentos de tejido biológico, orgánulos o suspensiones de células y/u otros agentes terapéuticos). Se hace referencia a tal procedimiento en las Patentes de Estados Unidos 5.284.761 y 5.283.187.

Preferiblemente, los dispositivos de esta invención son inmunoaislantes. Un "dispositivo inmunoaislante" significa que el dispositivo, al implantarlo en un huésped mamífero, minimiza el efecto deletéreo del sistema inmunitario del huésped sobre las células, en su núcleo, de modo que el dispositivo funciona durante extensos periodos de tiempo in vivo. Para que sea inmunoaislante, la región circundante o periférica del dispositivo debería conferir protección de las células del sistema inmunitario del huésped al que se implanta el dispositivo, evitando que las sustancias dañinas del cuerpo del huésped entren en el núcleo del vehículo, y proporcionando una barrera física suficiente para evitar el contacto inmunológico perjudicial entre las células encapsuladas (aisladas) y el sistema inmunitario del huésped. El grosor de esta barrera física puede variar, pero siempre será lo suficientemente gruesa como para evitar el contacto directo entre las células y/o sustancias en cada lado de la barrera. El grosor de esta región oscila generalmente entre 5 y 200 micrómetros; se prefieren grosores de 10 a 100 micrómetros, y especialmente se prefieren grosores de 20 a 75 micrómetros. Los tipos de ataque inmunológico que pueden evitarse o minimizarse mediante el uso del presente vehículo incluyen el ataque llevado a cabo por macrófagos, neutrófilos, respuestas celulares inmunitarias (por ejemplo, células naturales asesinas y citólisis mediada por células T dependientes de anticuerpos (ADCC) y respuesta humoral (por ejemplo, citólisis mediada por complemento, dependiente de anticuerpos)).

El uso de dispositivos inmunoaislantes permite la implantación de células o tejidos xenogénicos, sin una necesidad concomitante de suprimir inmunológicamente al receptor. La exclusión de lgG del núcleo del vehículo no es el punto de referencia del inmunoaislamiento, ya que en la mayoría de los casos lgG por sí sola es insuficiente para producir la citólisis de las células o tejidos diana. Usando dispositivos inmunoaislantes, es posible suministrar productos necesarios de peso molecular alto, o proporcionar funciones metabólicas que pertenecen a sustancias de alto peso molecular, siempre que se excluya del dispositivo inminoaislante a las sustancias críticas necesarias para la mediación del ataque inmunológico. Estas sustancias pueden comprender el componente complejo complementario de ataque Clq, o pueden comprender células fagocíticas o citotóxicas; el presente dispositivo inmunoaislante proporciona una barrera protectora entre estas sustancias perjudiciales y las células aisladas.

La estructura de espuma puede formarse a partir de cualquier material adecuado que forme una espuma biocompatible con una estructura de célula abierta o macroporosa con una red de poros. Una espuma de célula abierta es una estructura reticulada de poros interconectados. La estructura de espuma proporciona un material de estructura no biodegradable y estable, que permite el fijado de las células adherentes. Entre los polímeros que son útiles en la formación de estructuras de espuma para los dispositivos de esta invención se encuentran los termoplásticos y los elastómeros termoplásticos.

En la Tabla 1 aparecen algunos ejemplos de materiales útiles en la formación de estructuras de espuma adecuadas.

TABLA 1

Termoplásticos	Elastómeros Termoplásticos
Acrílico	Poliamida
Metacrílico	Poliéster
Poliamida	Polietileno
Policarbonato	Polipropileno
Poliéster	Poliestireno
Polietileno	Poliuretano
Polipropileno	Alcohol polivinílico
Poliestireno	Silicona
Polisulfona
Polietersulfona
Fluoruro de polivinilideno

Se prefiere a las estructuras de espuma termoplásticas elaboradas a partir de polisulfona y polietersulfona, y a las estructuras de espuma elastomérica termoplástica elaboradas a partir de poliuretano y alcohol polivinílico.

La espuma debe poseer algunos (pero no necesariamente todos) poros de un tamaño que permita a las células fijarse a las paredes o superficies dentro de los poros. El tamaño de poro, densidad de poro y volumen de huecos de la estructura de espuma puede variar. La forma del poro puede ser circular, elíptica o irregular. Debido a que la forma del poro puede variar considerablemente, sus dimensiones pueden variar de acuerdo con el eje que se mida. Para los propósitos de esta invención, al menos algunos poros en la espuma deberían poseer un diámetro de poro de entre 20-500 \mum, preferiblemente entre 50-150 \mum. Preferiblemente, las anteriores dimensiones representan el tamaño de poro medio de la espuma. Si se trata de poros no circulares, el poro puede poseer dimensiones variables, siempre que su tamaño sea suficiente para permitir a las células adherentes que se fijen a las paredes o superficies dentro del poro. En una forma de realización, se contemplan espumas que poseen algunos poros elípticos de 20-500 \mum de diámetro a lo largo del eje menor y un diámetro de hasta 1500 \mum a lo largo del eje mayor.

Además de los tamaños de poro permisivos a las células anteriores, preferiblemente al menos una fracción de los poros en la espuma debería ser inferior a 10 \mum para que no sea permisivo a la célula pero que aún proporcione canales para el transporte de nutrientes y moléculas biológicamente activas a través de la espuma.

La densidad de poro de la espuma (es decir, el número de poros por volumen que puede acomodar a las células, según se ha descrito anteriormente) puede variar entre 20-90%, preferiblemente entre 50-70%.

De manera similar, el volumen de huecos de la espuma puede variar entre 20-90%, preferiblemente entre 30-70%.

Las paredes o superficies de los poros se revisten típicamente con una molécula o moléculas de matriz extracelular, u otra molécula adecuada. Este revestimiento puede usarse para facilitar la adherencia de las células a las paredes de los poros, para sostener a las células en un fenotipo concreto y/o para inducir la diferenciación celular.

Los ejemplos preferidos de moléculas de matriz extracelular (ECM) que pueden adherirse a las superficies de los poros de las espumas incluyen: colágeno, laminina, vitronectina, poliomitina y fibronectina. Otras moléculas ECM adecuadas incluyen glicosaminoglicanos y proteoglicanos, tales como el sulfato de condroitina, sulfato de heparina, hialurón, sulfato de dermatina, sulfato de queratina, proteoglicano de sulfato de heparina (HSPG) y elastina.

Las ECM pueden obtenerse cultivando células de las que se sabe que depositan ECM, incluyendo células de origen mesenquimal o astrocítico. Las células Scwann pueden ser inducidas para que sinteticen ECM cuando se tratan con ascorbato y cAMP. Véase, por ejemplo, Baron-Van Evercooran y colaboradores, "Schwann Cell Differentiation in vitro: Extracellular Matriz Deposition and Interaction", Dev. Neurosci; 8, pp. 182-96 (1986).

Además, se ha encontrado que los fragmentos de péptidos de adhesión, por ejemplo, secuencias que contienen RGD (ArgGlyAsp), secuencias que contienen YIGSR (TyrIleGlySerArg), así como las secuencias que contienen

\hbox{IKVAV}

(IleLysValAlaVal) resultan útiles para promover la fijación celular. Algunas moléculas que contienen RGD se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo PepTite-2000™ (Telios).

Las estructuras de espuma de esta invención también pueden tratarse con otros materiales que potencien la distribución celular en el dispositivo. Por ejemplo, los poros de la espuma pueden rellenarse con un hidrogel no permisivo que inhiba la proliferación o migración celular. Dicha modificación puede mejorar la fijación de las células adherentes a la estructura de espuma. Los hidrogeles adecuados incluyen hidrogeles aniónicos (por ejemplo, alginato o carragenano) que pueden repeler a las células debido a su carga. Alternativamente, los hidrogeles "sólidos" (por ejemplo, agarosa u óxido de polietileno) pueden también usarse para inhibir la proliferación celular al desfavorecer la unión de moléculas de matriz extracelular segregadas por las células.

El tratamiento de la estructura de espuma con regiones de un material no permisivo permite la encapsulación de dos o más poblaciones celulares distintas en el dispositivo sin que una población predomine sobre la otra. Así, pueden usarse materiales no permisivos en la estructura de espuma para segregar poblaciones separadas de células encapsuladas. Las poblaciones distintas de células pueden comprender tipos de células iguales o diferentes, y pueden producir moléculas biológicamente activas iguales o diferentes. En una forma de realización, una población de células produce una sustancia que aumenta el crecimiento de otra población de células. En otra forma de realización, se encapsulan múltiples tipos de células que producen múltiples moléculas biológicamente activas. Esto proporciona al recipiente una mezcla o "cóctel" de sustancias terapéuticas.

Cabe destacar que los dispositivos de la presente invención pueden poseer una variedad de formas. El dispositivo puede mostrar cualquier configuración apropiada para mantener la actividad biológica y para proporcionar acceso para el suministro del producto o función, incluyendo, por ejemplo, formas cilíndricas, rectangulares, de disco, de parche, ovoides, de estrella o esféricas. Además, el dispositivo puede enrollarse o envolverse en una estructura de malla o de nido. Si el dispositivo debe recuperase después de su implante, las configuraciones que tiendan a llevar a una migración de los dispositivos desde el sitio de implante, tales como los dispositivos esféricos suficientemente pequeños para migrar en el paciente, no se prefieren. Determinadas formas, tales como los rectángulos, parches, discos, cilindros y láminas planas ofrecen una integridad estructural mayor, y resultan preferibles cuando se desean recuperar.

La estructura de espuma se adapta para que se ajuste al dispositivo, de la manera apropiada. Para las formas de realización tubulares (o de "fibra hueca"), la estructura de espuma puede formar un tubo o barra cilíndrica, un tubo o barra rectangular, o cualquier otra forma oblicua, con tal de que pueda encajar en el lumen de la fibra hueca. Cabe destacar que en algunas formas de realización, la estructura de espuma puede mostrar rebarbas u otras protuberancias que pueden estar en contacto con la pared interna de la fibra hueca.

En una forma de realización de la invención, el dispositivo celular se forma a partir de una membrana de fibra hueca con una estructura de espuma interna cilíndrica.

El dispositivo también puede encontrarse en forma de dispositivo laminar plano. Los dispositivos laminares planos se describen en detalle en Dionne y colaboradores (documento WO92/19195). Generalmente, un dispositivo laminar plano de esta invención se caracteriza por una primera membrana laminar plana con una primera superficie interior, y una segunda membrana laminar plana con una segunda superficie interior, ambas selladas en su periferia para proporcionar un recinto, con la estructura de espuma posicionada entre las membranas, dentro del recinto. Entonces, las células pueden introducirse a través de una puerta de acceso, y completarse el sello con un tapóninsertado en la puerta.

Los dispositivos de esta invención pueden formarse de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado. En una forma de realización, la estructura de espuma puede pre-formarse e insertarse en una envoltura pre-fabricada, por ejemplo, una membrana de fibra hueca, como un componente discreto.

Cualquier material de estructura de espuma termoplástico o elastómero termoplástico adecuado puede pre-formarse para su inserción en una envoltura pre-fabricada. En una forma de realización, se prefiere a las esponjas de alcohol polivinílico (PVA) para su uso como estructura de espuma. Diversas esponjas de PVA se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, las esponjas de espuma de PVA #D-3, de 60 \mum de tamaño de poro, son adecuadas (Rippey Corp., Kanebo). De manera similar, las esponjas de PVA se encuentran disponibles comercialmente en Unipoint Industries, Inc. (Thomasville, Carolina del Norte) e Ivalon Inc. (San Diego, California). Las esponjas de PVA son espumas insolubles que se forman por la reacción de disoluciones aireadas de poli(alcohol vinílico) con vapor de formaldehído como agente de entrecruzamiento. Los grupos hidroxilo del PVA se entrecruzan covalentemente con los grupos aldehído para formar la red polimérica. Las espumas son flexibles y elásticas cuando se humedecen y semi-rígidas cuando se secan.

En una forma de realización alternativa, la estructura de espuma puede formarse in situ dentro de una envoltura pre-fabricada. Puede usarse cualquier precursor de espuma termoplástica o elastomérica termoplástica para formar una estructura de espuma in situ. Para la formación de la estructura in situ, se prefiere al alcohol polivinílico, poliuretano, polisulfona y poliéter sulfona.

En una forma de realización preferida, la estructura de espuma puede formarse in situ usando poliuretanos. Los poliuretanos son polímeros que se forman por la reacción de los poliisocianatos con compuestos polihidroxilo. Los materiales de la matriz de espuma de poliuretano pueden formarse dentro de la membrana de fibra hueca usando prepolímeros (formados mediante la reacción de un polímero lineal que termina en OH con un exceso de diisocianato, que resulta en un polímero terminado en isocianato) que polimerizan al entrar en contacto con disoluciones acuosas y generan CO_{2} como un producto de la polimerización. El gas CO_{2} producido forma las estructuras de espuma de celdilla abierta de los materiales de la matriz. Véase, por ejemplo, Hasirci, "Polyurethanes" en High Performance Biomaterials: A Comprehensive Guide to Medical and Pharmaceutical Applications (Szycher, ed.) (Technomic Publishing, Lancaster, Pensilvania, PA 1991), pp. 71-89.

Puede añadirse un tensioactivo a la disolución acuosa para facilitar la formación de poros en la espuma. Los tensioactivos ejemplares incluyen Triton-X 100, disponible en Sigma Chemical Corp., y Pluronics P65, P32 y P18. Los materiales precursores de espuma de poliuretano, y un tensioactivo adecuado para formar espumas adecuadas en esta invención se encuentran disponibles comercialmente en Hampshire Chemical Corp. (Lexington, Massachussets).

En una forma de realización adicional, la estructura de espuma puede haberse pre-formado y revestido a continuación con una envoltura impermeable a las células. Nuevamente, cualquier precursor de espuma termoplástico o elastomérico termoplástico puede usarse para formar la estructura de espuma in situ. La formación de la envoltura alrededor de la estructura puede lograrse de acuerdo con los procedimientos como los que se detallan en Dionne y colaboradores (documento WO 92/19195).

En una forma de realización preferida, las barras de espuma de polietileno formadas mediante lechos de sinterización de polietileno de alta densidad (HDPE) (Porex®) que posee unos tamaños de poro medio que oscilan entre 30-60 \mum, pueden estar compuestas de una membrana permeoselectiva de PAN/PVC mediante un procedimiento de revestimiento por inmersión. Otros materiales termoplásticos sinterizados se encuentran disponibles comercialmente en, por ejemplo, Interflo Technologies (Brooklyn, Nueva York). Las barras de espuma se revisten por inmersión con PAN/PVC disuelto en DMSO como disolvente, y se invierte su fase para formar la membrana por inmersión en un baño de agua no-disolvente. Las barras de espuma también pueden revestirse con poli-ornitina, para mejorar la adhesión celular al material de espuma antes de infundir de células a los dispositivos.

Preferiblemente, el dispositivo es una brida que ayuda a la recuperación. Dichas bridas son bien conocidas en la técnica.

Los dispositivos de esta invención poseen un núcleo de un volumen mínimo preferible de aproximadamente 1 a

\hbox{10  \mu m,}

y en función de su uso se fabrican fácilmente para que posean un volumen que supere a 100 \mul (el volumen se mide en ausencia de la estructura de espuma).

En una configuración de fibra hueca, la fibra posee preferiblemente un diámetro interior de menos de 1500 micrómetros, preferentemente de aproximadamente 300-600 micrómetros. Si se usa una membrana semi-permeable, la permeabilidad hidráulica se encuentra preferiblemente en el intervalo de 1-100 ml/min/m^{2}/mmHg, preferentemente en el intervalo de 25 a 70 ml/min/m^{2}/mmHg. Preferiblemente, el coeficiente de transferencia de masa de glucosa del dispositivo, definido, medido y calculado según describe Dionne y colaboradores, ASAIO Abstracts, p. 99 (1993), y Colton y colaboradores, The Kidney (Brenner and Rector, eds.) (1981), pp. 2425-89 es superior a 10^{-6} cm/s, preferentemente superior a 10^{-4} cm/s.

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para sellar los dispositivos, incluyendo el empleo de adhesivos poliméricos y/o engastado, atado, y sellado por calor. Estas técnicas de sellado son conocidas en la técnica. Además, puede usarse cualquier procedimiento de sellado en "seco". En tales procedimientos, se proporciona un miembro de ajuste sustancialmente no poroso que se fija al dispositivo de encapsulación de membrana con un sello seco seguro, y la disolución que contiene a las células se introduce a través de dicho miembro de ajuste. Después del llenado, el dispositivo se sella cerrando la abertura en el miembro de ajuste no poroso. Dicho procedimiento se describe en Mills y colaboradores (documento WO94/01203).

En esta invención puede usarse una amplia variedad de células. Éstas incluyen a las líneas celulares inmortalizadas, conocidas, y públicamente disponibles (incluyendo a las células condicionalmente inmortalizadas) así como cultivos celulares primarios divisores. Los ejemplos de líneas celulares públicamente disponibles, adecuadas para la práctica de esta invención, incluyen a las células de riñón de cría de hámster (BHK), de ovario de hámster chino (CHO), fibroblasto de ratón (L-M), embrión de ratón Suizo NIH (NIH/3T3), líneas celulares de mono verde Africano (incluyendo COS-a, COS-7, BSC-1, BSC-40, BMT-10 y Vero), feocromocitoma adrenal de rata (PC12 y PC12A), tumor glial de rata (C6), células RIN, células 3-TC, células Hep-G2 y líneas celulares de mioblastos (incluyendo a las células C_{2}C_{12}).

Las células primarias que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen células madre de progenitor neural derivadas de CNS de mamíferos (véase Richards y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8591- 95 (1992); Ray y colaboradores, PNAS, 90: 3602-06 (1993)), fibroblastos primarios, células Schwan, astrositos, oligodendrocitos y sus precursores, mioblastos, células de cromafina adrenal y similares.

La elección de la célula depende de la aplicación a la que se la destina. Las células pueden producir naturalmente la molécula biológicamente activa deseada o pueden modificarse mediante ingeniería genética para que así sea.

Un gen de interés (es decir, un gen que codifique una molécula biológicamente activa adecuada) puede insertarse en un sitio de clonación de un vector de expresión adecuado usando técnicas de ADN recombinante. Cabe destacar que puede insertarse más de un gen en un vector de expresión adecuado. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica.

El vector de expresión que contiene el gen de interés puede entonces usarse para transfectar la línea celular deseada. Pueden usarse técnicas de transfección convencionales, tales como la co-precipitación con fosfato cálcico, transfección DEAE-dextrano o electroporación. Pueden comprarse equipos de transfección de mamíferos comercialmente disponibles en, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California).

Puede usarse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar el gen que codifica a la molécula biológicamente activa. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores iniciales y finales de SV40 o adenovirus y otros promotores no retrovirales conocidos capaces de controlar la expresión génica. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden estar formados por segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, tales como los diversos derivados conocidos de SV40 y los plásmidos bacteriales conocidos, por ejemplo, pUC, pBlueScript™, pBR322, pCR1, pMB9, pUC, pBlueScript™ y sus derivados. También son útiles los vectores de expresión que contienen los genes de selección de fármacos de geneticina (G418) o higromicina (véase, por ejemplo, Southern, P. J., In Vitro, 18: 315 (1981) y Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)). También se contemplan vectores de expresión que contienen el gen de selección del fármaco zeocina. Son ejemplos de vectores de expresión comercialmente disponibles que pueden emplearse pRC/CMV, pRC/RSV, y pCDNAINEO (en Vitrogen). Las regiones promotoras virales de tales vectores que dirigen la transcripción de los genes biológicos y de selección de fármacos de interés se reemplazan ventajosamente con una de las secuencias promotoras anteriores que no se someten a la regulación descendente experimentada por los promotores virales en el CNS. Por ejemplo, el promotor de GFAP se emplearía para la transfección de astrositos y líneas celulares de astrositos, el promotor de TH se usaría en las células PC12, o el promotor de MBP se usaría en los oligodendrocitos.

En una forma de realización, se usa el vector de expresión pNUT. Véase Baetge y colaboradores, PNAS, 83: 5454-58 (1986). Además, el vector de expresión pNUT puede modificarse de modo que la secuencia codificante DHFR se sustituya por la secuencia codificante para G418 o resistencia al fármaco higromicina. El promotor SV40 en el vector de expresión pNUT puede sustituirse también por cualquier promotor de mamífero adecuado expresado constitutivamente, como los que se han descrito anteriormente. El vector pNUT contiene el ADNc de DHFR mutantes y la secuencia pUC18 completa, incluyendo el policonector (Baetge y colaboradores, supra). La unidad de transcripción DHFR es dirigida por el promotor SV40 y fusionada en su extremo 3' con la señal de poliadenilación del gel del virus de la hepatitis B (aproximadamente 200 bp de la región no traducida de 3') para asegurar una poliadenilación eficiente y unas señales de maduración.

Cualquier molécula biológicamente activa adecuada puede producirse mediante las células encapsuladas. Las moléculas biológicamente activas contempladas incluyen a los neurotransmisores. Típicamente, éstos son pequeñas moléculas (inferiores a 1.000 Dalton de peso molecular) que actúan como medios químicos de comunicación entre neuronas. Dichos neurotransmisores incluyen dopamina, ácido gamma aminobutírico (GABA), serotonina, acetilcolina, noradrenalina, epinefrina, ácido glutámico y otros neurotransmisores de péptidos. Del mismo modo, se contempla la producción de agonistas, análogos derivados o fragmentos de neurotransmisores que sean activos, incluyendo, por ejemplo, bromocriptano (un agonista de dopamina) y L-dopa (un precursor de dopamina).

Otras moléculas biológicamente activas contempladas incluyen hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, factores tróficos, factores de angiogenesis, anticuerpos, factores de coagulación sanguínea, linfoquinas, enzimas, analgésicos y otros agentes terapéuticos o agonistas, precursores, análogos activos, o fragmentos activos de éstos. Éstos incluyen a encefalinas, catecolaminas (por ejemplo, norepinefrina y epinefrina), endorfinas, dimorfina, insulina, factor VIII, eritropoietina, Sustancia P, factor de crecimiento nervioso (NGF), Factor Neurotrófico derivado de células Gliales (GDNF), Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4/5 (NT-4/5), una serie de factores de crecimiento de fibroblastos, y el factor neurotrófico ciliar (CNTF).

Alternativamente, las células encapsuladas pueden producir una molécula biológicamente activa que actúe sobre sustancias que se suministren al dispositivo. Por ejemplo, el dispositivo puede contener una o más células o sustancias que "limpien" el colesterol y otras moléculas no deseable del huésped. En tales casos, el dispositivo proporciona una función biológica al paciente.

En algunos aspectos de la invención, la célula es alogénica (es decir, de otra de las mismas especies que el sujeto en el que se va a implantar), autóloga o singénica (es decir, del mismo individuo), o xenogénica (es decir, de una especie diferente).

Los dispositivos se diseñan para su implante en un recipiente. El recipiente puede ser cualquier animal adecuado, preferiblemente un mamífero, y preferentemente un paciente humano. Puede usarse cualquier técnica de implante quirúrgico adecuada. Un sistema preferido para implantar dispositivos capsulares se describe en la Patente de Estados Unidos 5.487.739.

Puede usarse cualquier sitio de implante adecuado. En una forma de realización, se contempla el tratamiento de la diabetes mediante el suministro de insulina. En esta forma de realización, se prefiere el implante en la cavidad peritoneal.

En otra forma de realización, se contempla el implante en el sistema nervioso central (CNS). Los dispositivos de esta invención pueden usarse en el tratamiento o profilaxis de una amplia variedad de enfermedades, desórdenes o condiciones neurológicas. Éstas incluyen Huntington, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, y dolor, así como cánceres o tumores. Los sitios adecuados en el CNS incluyen los ventrículos cerebrales, parenquimales, fluido cerebroespinal (CSF), el estrato, la corteza cerebral, el núcleo subtalámico, y los núcleos Basales de Maynert. Un CNS preferido es el CSF, preferiblemente el espacio subaracnoide.

La dosis de molécula biológicamente activa puede variarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Esto incluye el cambio de la producción celular de la molécula biológicamente activa, lo que se logra mediante cualquier procedimiento convencional, tal como variar el número de copia del gen que codifica la molécula biológicamente activa en la célula transducida, o dirigir la expresión de la molécula biológicamente activa usando un promotor de mayor o menor eficiencia, según se desee. Además, el volumen del dispositivo y la densidad de carga celular puede variarse fácilmente, en al menos tres órdenes de magnitud. Las cargas preferidas oscilan entre 10^{3}-10^{7} células por dispositivo. Además, la dosis puede controlarse implantando un número mayor o menor de dispositivos. Preferiblemente, se implantarán de uno a diez dispositivos por paciente.

Con objeto de que esta invención se comprenda mejor, se establecen los siguientes ejemplos. El propósito de estos ejemplos es únicamente el de ilustración, y no deben considerarse como limitantes del alcance de esta invención en ninguna manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Células PC12 encapsuladas en membranas de fibra hueca con una estructura de espuma de alcohol polivinílico (PVA) Procedimiento de preparación de fibra hueca

Se prepararon fibras huecas permeoselectivas usando la técnica alternantehúmedo-seco de Cabasso, Encyclopedia of Chemical Technology, 12: 492-5 17(1980). Las fibras huecas asimétricas se colaron a partir de copolímero de cloruro de polivinilo-poliacrilonitrilo al 12,5% (PAN/VC) en dimetilsulfóxido (peso/peso) como disolvente. Se produjeron fibras de dartos único usando este procedimiento. Las fibras huecas se introdujeron en un baño de agua no disolvente, se sumergieron en glicerina al 25% durante la noche y a continuación se secaron. En este conjunto de experimentos, las membranas de fibra hueca usadas fueron copolímeros de PAN/PVC de dartos único con un diámetro interno de 680 \mum y un grosor de pared de 85 \mum.

Se usaron diversas esponjas de PVA comercialmente disponibles para formar la estructura de espuma en los dispositivos de esta invención. Éstas incluyeron a esponjas de espuma de PVA de los siguientes fabricantes:

(1): #D-3 PVA de Rippey Corp. (Kanabo). Esta espuma posee un tamaño medio de poro de 60 mm, una gravedad específica de 0,094 g/cm^{3}, resistencia a la fractura de 5,9 kg/cm^{2}, que se ablanda con el contenido de agua, hinchándose ligeramente. Véase, por ejemplo, "PVA Sponge Material Technical Manual", Rippey Corp.

(2): Espuma de PVA de Unipoint Industries, Inc. (Thomasville, Carolina del Norte) que posee unas características sustancialmente similares a las de la espuma Rippey. Esta espuma se describe en la Patente de Estados Unidos 2.609.347.

(3): Espuma de PVA de Ivalon, Inc. (San Diego, California) que posee unas características sustancialmente similares a las de la espuma Rippey.

Para la encapsulación en membranas de fibra hueca (MFH), se cortan las espumas con un microtomo en "palillos" rectangulares o alternativamente se taladran con microtaladros de acero en forma de cilindros. Estos cilindros de espuma se taladran para que muestren unos diámetros (una vez secos) de aproximadamente 50-100 micrómetros menos que los de las membranas de fibra hueca usadas. La longitud era de aproximadamente 1 cm.

A continuación, se revisten los cilindros de espuma de PVA con colágeno de Tipo IV derivado de placenta humana (Sigma Chemical, #C5533) sumergiéndolos durante la noche en una disolución de colágeno de 1 mg/ml preparada en disolución salina de tampón fosfato (PBS). Entonces, se retiraron las espumas de la disolución de colágeno y se dejaron secar completamente bajo una lámpara UV en una cámara de flujo laminar.

Los cilindros de espuma se insertaron entonces en membranas de fibra hueca antes de la esterilización y de la carga de células. Se fijó un ensamblaje de nodo septal con un acceso para la carga de células al compuesto de espuma/MFH. Un ensamblaje de nodo tal se describe, por ejemplo, en Mills y colaboradores (documento WO94/01203). El dispositivo compuesto de espuma/MFH se esterilizó sumergiéndolo en etanol o alternativamente mediante esterilización de gases de óxido de etileno (OET).

Las espumas de PVA se expanden en aproximadamente 20% en volumen al humedecerse. Así, el medio celular se inyectó en primer lugar en el lumen de la fibra para humedecer suficientemente la espuma de modo que llenase el lumen y se eliminase el desfase entre la espuma y la membrana, antes de la carga de células.

En este experimento se usaron células PC12. Las células adherentes PC12 se rasparon para eliminarlas del matraz de cultivo. Las células se re-suspendieron en el medio y se pelletizaron por centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos. Las células se re-suspendieron entonces en el medio hasta una concentración final de 50.000 células/\mul.

Se compararon los dispositivos que poseían estructuras de espuma interna de esta invención con los dispositivos de la técnica anterior que poseían un núcleo de matriz de hidrogel. Se cargaron las células en dispositivos de fibra hueca de 1 cm de longitud usando una jeringuilla de vidrio Hamilton. Para los dispositivos de estructura de espuma, se cargaron 2 \mul de células suspendidas en el medio. Para los dispositivos de núcleo de matriz de hidrogel, se cargaron 2 \mul de una pasta de células/quitosán (disolución de quitosán al 2% antes de la dilución 1:2 con la suspensión celular).

Después de la carga de células, el septum del nodo de carga se rompió y la puerta de acceso se selló con un acrilato ligeramente endurecido (Luxtrak LCM 24, ICI Resisns US, Wilmington, Massachussets).

Los siguientes dispositivos de encapsulado de fibra hueca se prepararon de la siguiente manera:

(1): matriz de quitosán con una densidad celular de 50.000 células/\mul

(2): matriz de espuma de PVA con una densidad celular de 100.000 células/\mul

Los dispositivos se mantuvieron in vitro durante 6 semanas. Los dispositivos de carga celular encapsulados se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37ºC, y el medio celular se rellenó 3 veces/semana.

La velocidad de crecimiento celular se controló semanalmente con un ensayo de Alamar Blue®. El ensayo de Alamar Blue es una medida cuantitativa de la proliferación de líneas celulares humanas y animales que incorpora un indicador de crecimiento fluorométrico/colorimétrico basado en la detección de la actividad metabólica. Los datos Alamar indican (Fig. 1) que la proliferación celular en dispositivos con matriz de espuma de PVA se ralentizó dramáticamente con el curso del experimento en comparación con el aumento aproximadamente lineal con el tiempo observado en los dispositivos de matriz de quitosán. En el punto final del experimento, basado en los datos de Alamar, el número de células en los dispositivos de la técnica anterior era casi de dos veces el de los dispositivos de estructura de espuma de esta invención.

Se analizó semanalmente la liberación de catecolamina basal y evocada por potasio de las células encapsuladas. Tal y como muestra la Fig. 2, la liberación de L-dopa basal indica que las células en los dispositivos de estructura de espuma produjeron más catecolaminas que las células encapsuladas en los dispositivos de matriz de quitosán, especialmente en el punto final del experimento.

Se fijaron, se seccionaron y se tiñeron los dispositivos representativos con Hematoxilina y eosina a las dos semanas; todos los dispositivos remanentes se fijaron y tiñeron a las 6 semanas. Las secciones histológicas mostraron que las células PC12 encapsuladas con una matriz de espuma de PVA poseen una morfología diferenciada predominantemente aplanada. Por el contrario, las células PC12 en los dispositivos de matriz de quitosán poseen una morfología más redondeada.

Se observaron grandes clústeres de células en los dispositivos de matriz de quitosán después de dos semanas in vitro. Por el contrario, las células en los dispositivos de matriz de PVA se encontraban principalmente aplanadas en monocapas dentro de los poros de la espuma, y mostraron una excelente distribución a lo largo de la membrana de fibra hueca.

Después de 6 semanas in vitro, los dispositivos de matriz de quitosán mostraron grandes núcleos necróticos. Por el contrario, los dispositivos de espuma de PVA mostraron algunas pequeñas áreas necróticas después de 5 semanas; no obstante, estas áreas de necrosis en los dispositivos de espuma no se concentraban en el centro del dispositivo sino que aparecían aleatoriamente dispersas en el dispositivo.

Ejemplo 2 Células PC12 encapsuladas en membranas de fibra hueca con una matriz de espuma de PVA implantadas en un huésped roedor

Además de los ejemplos in vitro anteriores, también se implantaron dispositivos en huéspedes roedores (ratas Sprague-Dawley) para evaluar la actuación in vivo de los dispositivos de estructura de espuma comparados con los dispositivos de núcleo de matriz de la técnica anterior.

Los dispositivos se implantaron en el estriado en el cerebro. Los dispositivos se implantaron bilateralmente, con cada huésped recibiendo un dispositivo de espuma de PVA y un dispositivo de matriz de quitosán, ambos cargados con células PC12. Los dispositivos se elaboraron como en el Ejemplo 1, excepto con las siguientes densidades de carga de células:

(1): matriz de quitosán precipitado con una densidad celular de 50.000 células/\mul

(2): matriz de espuma de PVA con una densidad celular de 50.000 células/\mul

(3): matriz de quitosán precipitado con una densidad celular de 100.000 células/\mul

(4): matriz de espuma de PVA con una densidad celular de 100.000 células/\mul

Se analizó la liberación de catecolamina basal y evocada por potasio de las células encapsuladas una semana después de la encapsulación (pre-implante) e inmediatamente después del explante. Los resultados se muestran en las figuras 3 y 4.

El número de células (según indica la liberación de dopamina K+ evocada) parecía permanecer relativamente constante en los dispositivos de espuma de PVA tanto para las cargas iniciales de células de alta densidad (100.000 células/\mul) como para las de baja densidad (50.000 células/\mul). En contraste, la secreción de K+ dopamina en los dispositivos de matriz de quitosán de la técnica anterior descendió dramáticamente para los dispositivos de alta densidad. Véase la Figura 4. Una explicación para ello puede ser que estos dispositivos habían crecido hasta el límite superior del número de células que pueden soportar durante el periodo de sostenimiento de 1 semana antes del implante. Los datos de secreción de K+ dopamina también sugieren que los dispositivos sembrados con quitosán de baja densidad todavía aumentaban en cuanto al número de células cuando se explantaban.

Estos resultados in vivo concuerdan con los descubrimientos in vitro descritos en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Células BHK-hCNTF encapsuladas en membranas de fibra hueca con matriz de espuma de PVA e hidrogel no permisivo a las células

En este experimento, se encapsularon células de riñón de hámster (BHK) transfectadas para segregar el factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF). Se incorporó una línea pNUT-hCNTF-TK en las células BHK usando un procedimiento de transfección convencional mediado por fosfato cálcico, según se describe en Baetge y colaboradores (documento WO95/05452). Las células se cultivaron en DMEM con suero fetal bovino al 10% y L-glutamina 2 mM, recolectadas con tripsina y resuspendidas en una suspensión de célula única en medio PCl para la encapsulación. Las células se encapsularon en dispositivos que contenían una matriz de espuma de PVA tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Después de cargar a los dispositivos de espuma de PVA (construidos según se ha descrito en el Ejemplo 1) con

\hbox{2  \mu l}

de suspensión celular en el medio, se rellenaron los poros de las espumas con alginato sódico al 2% preparado en disolución HBSS exenta de calcio y magnesio, y entonces se entrecruzó con cloruro de calcio al 1% durante 5 minutos. El gel de alginato proporciona una región no permeable a las células mientras las células permanecen aplanadas frente a las paredes de la espuma en el dispositivo, evitando así que las células se aglomeren. Ejemplo 4 Células de mioblastos C_{2}C_{12} de ratón encapsuladas con membranas de fibra hueca con matriz de espuma de PVA

En este ejemplo, se encapsularon células de mioblastos C_{2}C_{12} en dispositivos que poseían estructuras de espuma preparados según se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células de mioblastos C_{2}C_{12}se hicieron crecer en medio DMEM con 10% de suero fetal bovino. Se cargaron las células en dispositivos de membrana de fibra hueca como en el Ejemplo 1, en medio PCI. La diferenciación de los mioblastos en el estado post-mitótico después del encapsulado tuvo lugar mediante la eliminación del suero del medio de soporte.

Ejemplo 5 Células madre neurales encapsuladas en membranas de fibra hueca con matriz de espuma de Polietileno

Se compusieron barras de espuma de polietileno formadas por sinterización de lechos de polietileno de alta densidad (HDPE) (Porex®) que poseían tamaños de poro medio en el intervalo de 30-60 \mum, con una membrana de PAN/PVC permeoselectiva mediante un procedimiento de revestimiento por inmersión. Las barras de espuma se revistieron por inmersión con PAN/PVC disuelto en el disolvente DMSO (12,5% p/p de polímero en DMSO), y se invirtió la fase para formar las membranas por inmersión en un baño de agua no disolvente. Los dispositivos de barra de espuma con revestimientos de membrana externos de PAN/PVC se esterilizaron sumergiéndolos en etanol. A continuación se revistieron las barras de espuma con poli-ornitina para mejorar la adhesión celular al material de espuma antes de infundir células a los dispositivos.

En este experimento, se encapsularon células madre neurales derivadas de ratones (véase, por ejemplo, Richards y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:8591-95 (1992)). Las células se cargaron en los dispositivos compuestos de barra/membrana de espuma y se mantuvieron in vitro. Se examinó la distribución y la viabilidad celular después de una semana y tres semanas tiñendo con diacetato de fluoresceína/yoduro de propidinio (FDA/PI) y se encontró que eran de buenas a excelentes (70-90%). Por el contrario, la viabilidad de las células madre murinas en dispositivos de matriz de hidrogel Vitrogen™ era significativamente menor (aproximadamente 50%).

Ejemplo 6 Células de mioblastos C_{2}C_{12} encapsuladas en membranas de fibra hueca con matriz de espuma de poliuretano

En este experimento, se fabricó una estructura de espuma de poliuretano en el lumen de una membrana de fibra hueca de polietersulfona de 0,2 \mum pre-formada (AG Tech, Massachussets). Se formó una estructura de espuma de poliuretano en la membrana de fibra hueca usando un prepolímero de poliuretano (Hypol™, Hampshire Chemical Corp., Lexington, Massachussets). La espuma se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la espuma se formó mediante la reacción de un polímero lineal terminado en OH con un exceso de diisocianato, dando lugar a un polímero terminado en isocianato rico en polioxietileno. Cuando se hizo reaccionar con un aditivo acuoso, éste formó entonces un elastómero biocompatible insoluble. La primera etapa en la reacción entre el poliisocianato y el compuesto polihidroxilo dio lugar a la formación inestable de ácido carbámico. Este ácido se degrada entonces en amina y CO_{2}. Conforme continúa la reacción, las cadenas de isocianato y la amina forman grupos urea. El gas CO_{2} producido forma las estructuras de espuma de celdilla abierta deseadas de los materiales de matriz. Puede añadirse un tensioactivo a la disolución acuosa para facilitar la formación de poros. En este ejemplo, se usó el tensioactivo suministrado por el fabricante.

Una vez polimerizado el material de espuma en las membranas de fibra hueca, se cortan las membranas y se forman los dispositivos de encapsulación mediante la adición de un nodo de carga septal (según se ha descrito en el

\hbox{Ejemplo
1).}

Se cargaron las células de mioblastos C_{2}C_{12} (20 \mul de una suspensión de 20.000 células/\mul) con una jeringuilla Hamilton en los dispositivos de membrana de fibra hueca con estructura de espuma de poliuretano en el lumen. Los dispositivos se abrieron inmediatamente, y se tiñeron con tinte de viabilidad celular MTT para visualizar la viabilidad y la distribución celular. Se encontró que la distribución celular era excelente a lo largo de una longitud e 1,5 cm. Esto indicó que la estructura de poro formada estaba suficientemente interconectada para permitir la inyección de células a lo largo de la longitud del dispositivo de membrana de fibra hueca.

Ejemplo 7 Células adicionales encapsuladas en una matriz de espuma

Se fabricaron dispositivos de encapsulación celular adicionales de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 1, con tipos de células adicionales, segregando diversas moléculas biológicamente activas.

Se transformaron las células de mioblastos C_{2}C_{12} para producir factor neurotrófico ciliar (CNTF), neurotrofina 4/5 (NT-4/5), tanto CNTF como NT-4/5, y factor neurotrófico derivado de glial (GDNF), usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 3, sustancialmente. Se fabricaron dispositivos de fibra hueca con un núcleo de matriz de espuma de PVA, que contenían dichas células en la manera descrita en el Ejemplo 1. Los dispositivos se implantaron en cerdos y ovejas. Globalmente, los dispositivos mostraron una buena viabilidad celular y una producción de moléculas biológicamente activas, y cuando se compararon con los dispositivos de encapsulación celular equivalentes (la comparación no se llevó a cabo para todos los experimentos), los dispositivos de estructura de espuma resultaron ser mejores (según este criterio) que los dispositivos equivalentes con un núcleo líquido o un núcleo de colágeno.

También se encapsularon células de ovario de hámster chino CHO) que habían sido modificadas para segregar NT-4/5 en los dispositivos de fibra hueca con un núcleo de matriz de espuma de PVA. Después de un mes in vitro, estos dispositivos mostraron una viabilidad excelente en el medio definido. El núcleo de espuma de PVA controló la proliferación celular de 2 a 3 veces mejor que la agarosa o vitrogen. Se repitió este estudio in vitro usando fibroblastos NIH 3T3 y se encontró una buena viabilidad celular en medios que contenían suero. También se repitió este estudio in vitro usando fibroblastos de prepucio humano Hs27. Los datos preliminares indicaron una viabilidad celular 2 veces mayor que los dispositivos equivalentes con un núcleo de matriz de vitrogen.

Los expertos en esta materia sugerirán otras formas de realización adicionales a partir de la descripción anterior.

Claims

1. Un dispositivo biocompatible para implantarlo en un recipiente que comprende:

(a): un núcleo que comprende una estructura de espuma reticulada que posee poros interconectados, que además comprende una población de células vivas dispersadas en los poros, que son capaces de segregar una molécula biológicamente activa o de proporcionar una función biológica al recipiente.

(b): una envoltura que rodea al núcleo, que comprende al menos una superficie de membrana permeable que permite el paso de sustancias entre el recipiente y las células a través de la envoltura, para proporcionar la molécula biológicamente activa o la función al recipiente.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la estructura de espuma es un termoplástico o un elastómero termoplástico.

3. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la estructura de espuma se forma a partir de un material del grupo formado por polisulfona, polietersulfona, poliuretano y alcohol polivinílico.

4. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el volumen hueco de la estructura de espuma se encuentra entre 20 y 90%.

5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la estructura de espuma se ha revestido con una molécula de adhesión de matriz extracelular o un fragmento peptídico de adhesión de ésta.

6. El dispositivo de la reivindicación 5, en el que la estructura de espuma se reviste con una o más moléculas de matriz extracelular del grupo formado por colágeno, laminina, vitronectina, poliomitina, fibronectina, elastina, glicosaminoglicanos y proteoglicanos.

7. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que al menos una porción de la estructura de espuma se ha expuesto a un material no permisivo que inhibe la proliferación o migración celular.

8. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el núcleo del dispositivo comprende además una segunda población de células vivas.

9. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el dispositivo comprende una envoltura de fibra hueca.

10. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la envoltura se forma a partir de un termoplástico o un hidrogel.

11. Un procedimiento de elaboración de un dispositivo de encapsulación celular implantable y biocompatible, que comprende:

(a): la formación de un núcleo que comprende una estructura de espuma reticulada que posee poros interconectados, que además comprende una población de células vivas dispersadas en los poros, que son capaces de segregar una molécula biológicamente activa o de proporcionar una función biológica al paciente;

(b): formación de una envoltura alrededor del núcleo, que comprende al menos una superficie de membrana permeable que permite el paso a través de la envoltura de sustancias entre las células y un huésped, al que se implanta el dispositivo para proporcionar la molécula biológicamente activa o la función;

(c): sellado de la envoltura

12. Un procedimiento de elaboración de un dispositivo de encapsulación celular implantable y biocompatible, que comprende:

(a): formación de una envoltura que comprende un material biocompatible permeable;

(b): carga de la envoltura con un núcleo que comprende una estructura de espuma reticulada que posee poros interconectados, comprendiendo dicho núcleo además una población de células vivas dispersadas en los poros, células que son capaces de segregar una molécula biológicamente activa o de proporcionar una función biológica al paciente;

(c): sellado de la envoltura;

en el que la envoltura proporciona al menos una superficie de membrana permeable que permite el paso a través de la envoltura de sustancias entre las células y un huésped, al que se implanta el dispositivo para proporcionar la molécula biológicamente activa o la función al recipiente.

13. Un procedimiento de elaboración de un dispositivo de encapsulación celular implantable y biocompatible, que comprende:

(b): formación de un núcleo en la envoltura, que comprende una estructura de espuma reticulada que posee poros interconectados;

(c): carga del núcleo con una población de células vivas, siendo capaces las células de segregar una molécula biológicamente activa o de proporcionar una función biológica a un recipiente;

(d): sellado de la envoltura;

proporcionando la envoltura al menos una superficie de membrana permeable que permite el paso de sustancias entre el recipiente y las células, a través de la envoltura, para proporcionar la molécula biológicamente activa o la función al recipiente.

14. Uso del dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la elaboración de un dispositivo para suministrar una molécula biológicamente activa o para proporcionar una función biológica a un recipiente.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la estructura de espuma es un termoplástico o un elastómero termoplástico.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la estructura de espuma se forma a partir de un material seleccionado del grupo formado por polisulfona, polietersulfona, poliuretano y alcohol polivinílico.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que el volumen hueco de la estructura de espuma se encuentra entre 20 y 90%.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la estructura de espuma se ha revestido con una molécula de adhesión de matriz extracelular o un fragmento peptídico de adhesión de ésta.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la estructura de espuma se reviste con una o más moléculas de matriz extracelular del grupo formado por colágeno, laminina, vitronectina, poliomitina, fibronectina, elastina, glicosaminoglicanos y proteoglicanos.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que al menos una proporción de la estructura de espuma se ha expuesto a un material no permisivo que inhibe la proliferación o migrción celular.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que el dispositivo comprende una envoltura de fibra hueca.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la envoltura se forma a partir de un termoplástico o un hidrogel.