KR20150016367A - 동결보존된 이식형 세포 배양 장치 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20150016367A
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cells
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존 디. 주니어 더간
크리스탈 코르텔레사
Original Assignee
뉴로테크 유에스에이, 인코포레이티드.
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Abstract

본 발명은 생물학적 활성 분자를 전달할 수 있는 동결보존된 캡슐화 세포 요법 장치 및 이들 장치를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

동결보존된 이식형 세포 배양 장치 및 그의 용도 {CRYOPRESERVED IMPLANTABLE CELL CULTURE DEVICES AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2012년 5월 30일 출원된 U.S.S.N. 61/653,191을 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 캡슐화된 세포 요법 분야에 관한 것이다.
지난 20여 년간에 걸쳐 이루어진 분자생물학의 발전을 통해 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 및 항혈관신생 항체 및 분자를 비롯한, 유망한 치료학적 잠재능을 지닌 수많은 단백질 분자가 발견되었다. 그러나, 대개는 효과적인 전달 시스템의 부족으로 인해 이러한 신규한 분자들의 가치가 임상적 사용에 완전하게 현실화되지 못하고 있다. 혈액-망막 장벽 (BRB)으로 인해 혈류내 거대 분자는 망막으로 진입하지 못한다. 상기 장벽을 우회하는 것이 장기간에 걸쳐 지속적으로 단백질을 망막으로 전달하기 위한 주된 도전 과제 중 하나가 된다.
단백질을 망막으로 전달하기 위한 전통적인 접근법은 매우 제한적이다. 단백질을 망막으로 전달하는 데에는 정제된 재조합 단백질의 볼루스 주사 및 유전자 요법이라는 2가지 옵션이 있다. 마큐젠(Macugen), 루센티스(Lucentis) 또는 에일리아(Eylea)의 볼루스 주사가 습성 형태의 연령-관련 치료를 위한 것으로 승인을 받았다. 그러나, 상기 작용제는 반감기가 짧고, 장기간에 걸쳐 반복적으로 투여되어야 한다. 한편, 유전자 요법은 주어진 단백질을 지속적으로 발현할 수 있다. 그러나, 트랜스진의 발현 수준을 조절하는 데 이용가능한 신뢰가능한 수단이 없다는 사실에 기인하여 치료 단백질의 용량을 제어하기는 어렵다. 추가로, 일단 유전자가 전달되고 나면, 치료를 역전시킬 수 없다.
캡슐화된 세포 공학 또는 ECT는 치료제를 분비하기 위해 살아있는 세포를 사용하는 전달 시스템이다. 이는 보통 특정 작용제를 과다발현하는 특정 유형의 세포를 유전자 조작함으로써 달성된다. 이어서, 조작된 세포를 반투과성 중합체 캡슐에 캡슐화시킨다. 이어서, 캡슐을 표적 수술 부위 내로 이식한다. 반투과성 막을 통해 영양소 및 치료 분자는 자유롭게 확산될 수 있지만, 숙주 면역계의 세포는 장치 내의 세포와 직접적으로는 접촉하지 못한다.
발명의 개요
본 발명은 ECT 장치의 동결보존 방법을 기술한다. 동결보존 방법을 통해 동결보존된 ECT 장치를 무기한 저장할 수 있고, 이로써 현재 수주/수개월 범위인 보관 수명을 잠재적으로는 무기한으로 연장시킬 수 있다. 본 발명은 세포 배양 장치의 제조, 저장, 배포, 및 제품 원가에 있어 중요한 이점을 나타낸다.
세포주 (예컨대, ARPE-19 세포)는 치료량의 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 생산할 수 있도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)는 WO 2012/075184 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 바와 같이, 항혈관신생 항체 및 분자, 항혈관신생 항체-스캐폴드 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 PDGF 수용체일 수 있다. 다른 생물학적 활성 분자(들)로는 뉴로트로핀, 인터류킨, 시토카인, 성장 인자, 항아폽토시스 인자, 혈관신생 인자, 항혈관신생 인자, 항체 및 항체 단편, 항원, 신경전달물질, 호르몬, 효소, 림포카인, 항염증 인자, 치료 단백질, 유전자 전달 벡터, 및/또는 이들의 임의의 조합(들)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 실시양태에서, 상기 분자는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), NT-4, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 악소킨(Axokine), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF II), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGF α), 형질전환 성장 인자 β (TGF β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 미드카인(Midkine), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 트리오포틴, 액티빈, 티로트로핀 방출 호르몬, 인터류킨, 골 형태발생 단백질, 대식세포 염증성 단백질, 헤파린 술페이트, 암피레귤린, 레티노산, 종양 괴사 인자 α, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), PEDF, LEDGF, NTN, 뉴블라스틴(Neublastin), VEGF 억제제 및/또는 잠재적인 표적 조직에 대해 치료상 유용한 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 작용제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포주를 당업계에 공지된 임의의 방법(들)을 사용하여 캡슐화 세포 요법 (ECT) 장치내에 캡슐화시킬 수 있다.
본원에서는 세포 및/또는 세포주 중 하나 이상을 함유하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸는 반투과성 막을 포함하는 이식형 세포 배양 장치로서, 여기서 상기 막은 그를 통해 분자(들)가 확산될 수 있도록 허용하고, 여기서 상기 장치는 동결보존된 것인 (즉, 장치 제조 후 및 이식 이전에 동결보존된 것인) 이식형 세포 배양 장치를 기술한다. 예를 들어, 코어내 세포주는, 1, 2, 또는 3회의 형질감염을 포함하는 반복적 형질감염 과정에 의해 ARPE-19 세포 내로 도입되는 치료 유효량의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포주를 포함할 수 있거나; 또는 코어내 세포주는 적어도 10,000 ng/일/106개의 세포인 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 동결보존된 장치 중 임의의 것은 또한 치료 유효량의 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 분비하도록 유전자 조작된 ARPE-19 세포를 포함할 수 있다.
"캡슐," "장치" 및 "이식물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 유전자 조작된 세포 및 세포주 (예컨대, ARPE-19 세포 또는 세포주)를 함유하는 임의의 생체 인공 기관 또는 캡슐화된 세포 요법 장치를 의미한다. 상기 동결보존된 장치의 코어는 또한 코어 내에 함유되어 있는 세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 동결보호제를 함유할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 동결보존 방법이 사용될 수 있다. 비제한적인 일례로, 캡슐화된 세포 요법 장치를 극저온 저장 바비알 내에 배치시키고, 동결 속도 제어하에 (예컨대, -80℃ 온도로) 동결시키고, 최종적으로 기상 액체 질소 (예컨대, -190℃) 조건에서 저장할 수 있다.
동결보존된 장치를 기상 액체 질소 (예컨대, -190℃) 조건하에서, 및/또는 드라이아이스 (예컨대, -70℃) 조건하에서 수송할 수 있다.
임의의 적합한 동결보존 기법(들)이 사용될 수 있다. 비제한적인 일례로, 본 발명의 ECT 장치는 드라이아이스 중에서 (예컨대, -70℃에서), 동결기에서 (예컨대, -80℃에서), 및/또는 기상 액체 질소 중에서 (예컨대, -190℃) 저장될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 동결보존된 ECT 장치는 약 -70℃, 약 -71℃, 약 -72℃, 약 -73℃, 약 -74℃, 약 -75℃, 약 -76℃, 약 -77℃, 약 -78℃, 약 -79℃, 약 -80℃, 약 -81℃, 약 -82℃, 약 -83℃, 약 -84℃, 약 -85℃, 약 -86℃, 약 -87℃, 약 -88℃, 약 -89℃, 약 -90℃, 약 -91℃, 약 -92℃, 약 -93℃, 약 -94℃, 약 -95℃, 약 -96℃, 약 -97℃, 약 -98℃, 약 -99℃, 약 -100℃, 약 -101℃, 약 -102℃, 약 -103℃, 약 -104℃, 약 -105℃, 약 -106℃, 약 -107℃, 약 -108℃, 약 -109℃, 약 -110℃, 약 -111℃, 약 -112℃, 약 -113℃, 약 -114℃, 약 -115℃, 약 -116℃, 약 -117℃, 약 -118℃, 약 -119℃, 약 -120℃, 약 -121℃, 약 -122℃, 약 -123℃, 약 -124℃, 약 -125℃, 약 -126℃, 약 -127℃, 약 -128℃, 약 -129℃, 약 -130℃, 약 -131℃, 약 -132℃, 약 -133℃, 약 -134℃, 약 -135℃, 약 -136℃, 약 -137℃, 약 -138℃, 약 -139℃, 약 -140℃, 약 -141℃, 약 -142℃, 약 -143℃, 약 -144℃, 약 -145℃, 약 -146℃, 약 -147℃, 약 -148℃, 약 -149℃, 약 -150℃, 약 -151℃, 약 -152℃, 약 -153℃, 약 -154℃, 약 -155℃, 약 -156℃, 약 -157℃, 약 -158℃, 약 -159℃, 약 -160℃, 약 -161℃, 약 -162℃, 약 -163℃, 약 -164℃, 약 -165℃, 약 -166℃, 약 -167℃, 약 -168℃, 약 -169℃, 약 -170℃, 약 -171℃, 약 -172℃, 약 -173℃, 약 -174℃, 약 -175℃, 약 -176℃, 약 -177℃, 약 -178℃, 약 -179℃, 약 -180℃, 약 -181℃, 약 -182℃, 약 -183℃, 약 -184℃, 약 -185℃, 약 -186℃, 약 -187℃, 약 -188℃, 약 -189℃, 및/또는 약 -190℃ 또는 그 초과 (또는 이들의 임의의 조합(들))에서 저장될 수 있다.
동결보존된 장치는 사용 전 당업계에 공지된 임의의 방법(들)을 사용하여 해동될 수 있다.
일부 비제한적인 일례로, 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들) (예컨대, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 다른 생물학적 활성 분자(들))를 WO 2012/075184에 기술된 바와 같이, 반복적 형질감염 과정을 사용하여 ARPE-19 세포 내로 도입할 수 있다. 구체적으로, 반복적 형질감염은 1회 형질감염, 2회 형질감염, 3회 형질감염 또는 그 초과의 형질감염 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 형질감염)일 수 있다. 반복적 형질감염 과정이 1회 형질감염일 때, 세포주는 1종의 생물학적 활성 분자(들)를 함유할 것이다. 반복적 형질감염 과정이 2회 형질감염일 때, 세포주는 2종의 생물학적 활성 분자(들)를 함유할 것이다. 이는 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성 분자(들)일 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 반복적 형질감염 과정이 3회 형질감염일 때, 세포주는 3종의 생물학적 활성 분자(들)를 함유할 것이다. 이 또한, 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성 분자(들)일 수 있다. 반복적 형질감염 과정에서 형질감염의 횟수가 생성된 세포주 중의 (동일하거나 또는 상이한) 생물학적 활성 분자(들)의 개수를 결정할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
다중 카피수의 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성 분자(들)를 ARPE-19 세포 내로 도입하는 데 반복적 형질감염 과정이 사용될 수 있다.
ARPE-19 세포는 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하도록 유전자 조작될 수 있으며, 여기서 치료 유효량은 적어도 10,000 ng/일/106개의 세포 (예컨대, 적어도 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65, 000, 70,000, 75,000 ng/일/106개의 세포 또는 그 초과)이다. 상기 세포주는 적어도 3개월 이상 (예컨대, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 또는 24개월 이상) 동안 상기 치료 유효량을 생산할 수 있다.
상기 세포주는 반복적 형질감염 과정을 사용하여 생산될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 상기 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하는 데 당업계에 공지된 다른 방법 또한 사용될 수 있다.
반복적 형질감염 과정이 1회 형질감염일 때, 장치 내에 함유되어 있는 세포주는 10,000 내지 30,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 예를 들어, 세포주는 약 15,000 ng/일/106개의 세포를 생산할 수 있다. 반복적 형질감염 과정이 2회 형질감염일 때, 장치 내에 함유되어 있는 세포주는 30,000 내지 50,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 예를 들어, 세포주는 약 35,000 ng/일/106개의 세포를 생산할 수 있다. 반복적 형질감염 과정이 3회 형질감염일 때, 장치 내에 함유되어 있는 세포주는 50,000 내지 75,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 예를 들어, 세포주는 약 70,000 ng/일/106개의 세포를 생산할 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 장치 구성은 본원에 기술된 방법 및 장치에 따라 동결보존될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 특정 장치 디자인 또는 구성 선택이 장치의 동결보존과 관련된 이점에 영향을 미치지는 않는다.
또한 장치를 동결보존시킴으로써 (즉, 제조 후, 및 사용 이전에 장치를 동결보존시킴으로써) 캡슐화된 세포 요법 장치의 보관 수명을 증가시키는 방법도 제공한다. 이는 하나 이상의 동결보존제를 장치의 코어 내로 혼입시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 비제한적인 일례로, 코어는 동결보존제로서 10% 글리세롤을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 코어는 0.25-1.0 x 106개의 세포를 함유한다.
코어는 반투과성 막 내에 배치된 매트릭스를 추가로 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 매트릭스는 다수의 모노필라멘트를 포함하고, 상기 모노필라멘트는 실로 꼬여 있거나 메쉬로 엮여 있거나, 또는 비-직조 가닥인 실로 꼬여 있고, 여기서 상기 세포 또는 조직이 그 위에 분포되어 있다. 모노필라멘트는 아크릴, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 폴리아세니트릴, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 나일론, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리부테스터, 실크, 코튼, 키틴, 탄소, 및/또는 생체적합성 금속으로부터 선택된 생체적합성 물질로부터 제조될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 모노필라멘트는 상기 장치의 내부 부피의 40-85%를 차지하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 섬유이다.
본원에 기술된 세포 캡슐화 장치는 또한 테더 앵커를 가질 수 있다. 예를 들어, 테더 앵커는 장치를 눈의 구조에 고정시킬 수 있도록 적합화된 앵커 루프일 수 있다.
일단 해동되고 나면, 본원에 기술된 임의의 장치는 눈, 또는 신체의 또 다른 표적 영역, 예를 들어 비장, 귀, 심장, 결장, 간, 신장, 유방, 관절, 골수, 피하, 및/또는 복막 공간 내로 이식될 수 있다 (또는 상기 부위에의 이식을 위한 것이다). 비제한적인 예로, 장치는 눈의 유리체, 방수, 테논낭하(Subtenon) 공간, 안구주위 공간, 후안방, 및/또는 전안방으로 이식될 수 있다 (또는 상기 부위에의 이식을 위한 것이다).
일부 예시적인 실시양태에서, 본원에 기술된 장치의 재킷은 선택투과성, 면역격리성 막으로부터 제조된다. 예를 들어, 재킷은 한외여과 막 또는 마이크로여과 막으로부터 제조된다. 한외여과 막의 기공 크기는 전형적으로 1-100 nm인 반면, 마이크로여과 막의 기공 크기는 전형적으로 0.1-10 ㎛라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 다른 실시양태에서, 재킷은 비-다공성 막 물질 (예컨대, 히드로겔 또는 폴리우레탄)로부터 제조될 수 있다. "재킷" 및 "반투과성 막"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본원에 기술된 장치의 반투과성 막은 선택투과성, 면역보호성 막으로부터 제조된다. 다른 실시양태에서, 반투과성 막은 한외여과 막 또는 마이크로여과 막으로부터 제조된다. 반투과성 막의 기공 크기 중간값은 약 100 nm라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
추가의 다른 실시양태에서, 반투과성 막은 비-다공성 막 물질 (예컨대, 히드로겔 또는 폴리우레탄)로부터 제조될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 장치에서, 반투과성 막의 공칭 분자량 컷오프 (MWCO)는 50 내지 500 kD (예컨대, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500)이다. 반투과성 막의 두께는 약 90-120 ㎛ (예컨대, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120)일 수 있다. 장치의 길이는 약 1 mm-20 mm (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 내부 직경은 약 0.1 mm-2.0 mm (예컨대, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0)일 수 있다.
한 실시양태에서, 장치의 말단은 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉된다.
본원에 기술된 임의의 장치에서, 캡슐은 중공 섬유 또는 편평 시트로 구성될 수 있다. 그러나, 생물학적 활성을 유지하고, 생물학적 활성 분자(들)에 접근하는 데 적절한 임의의 다른 장치 구성(들) 또한 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
또한, 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자가 상기 장치로부터 공동으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자는 비-세포 공급원 또는 세포 공급원으로부터 생산될 수 있거나, 그로부터 방출된 것일 수 있다 (즉, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자는 코어내 하나 이상의 유전자 조작된 ARPE-19 세포 또는 세포주에 의해 생산된 것이다).
비제한적인 일례로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 장치는 하기 추가의 특징들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모두를 포함할 수 있다:
a. 코어가 0.5-1.0 x 106개의 ARPE-19 세포를 함유함;
b. 장치의 길이가 1 mm-20 mm임;
c. 장치의 내부 직경이 0.1-2.0 mm임;
d. 장치의 말단이 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉됨;
e. 반투과성 막의 기공 크기 중간값이 약 100 nm임;
f. 반투과성 막의 공칭 MWCO가 50-500 kD임;
g. 반투과성 막의 두께가 90-120 ㎛임;
h. 코어가 내부 스캐폴드를 포함하고, 상기 스캐폴드가 장치의 내부 부피의 40-85%를 차지하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 섬유를 포함함; 및
i. 이들의 임의의 조합(들).
본원에 기술된 방법 및 용도 중 임의의 것에서, 본 발명에 따른 동결보존된 장치는 사용 이전에 해동되는 것인 바람직하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 상기 장치를 해동시키는 데 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법(들)이 사용될 수 있다.
본 발명은 해동 이후 대상체의 눈에 적절한 치료 용량의 임의의 생물학적 활성 분자(들) (예컨대, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 다른 생물학적 활성 분자(들))을 전달하기 위한 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치의 용도를 제공한다. 예를 들어, 치료 용량은 적어도 100 ng/일/눈이다 (예컨대, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000 ng/일/눈 또는 그 초과).
본원에서는 또한 동결보존된 장치를 해동시키고, 환자의 눈 내로 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 상기 장치로부터 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 확산되어 눈에서 VEGF 및/또는 PDGF에 결합할 수 있게 함으로써 안과 장애를 치료하는, 안과 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 안과 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 세포주 (즉, 본원에 기술된 임의의 세포주)로서, 여기서 세포주는 이식형 세포 배양 장치에 도입되어 있고, 여기서 동결보존된 장치 해동 이후에 장치를 환자의 눈 내로 십입하고, 여기서 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자는 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF 및/또는 PDGF에 결합함으로써 안과 장애를 치료하는 것인 세포주를 제공한다.
동결보존된 장치를 해동시키고, 환자의 눈 내로 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 눈에서 상기 장치로부터 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 확산되게 함으로써 안과 장애를 치료하는, 안과 장애를 치료하는 방법 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 안과 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 세포주 (즉, 본원에 기술된 임의의 세포주)로서, 여기서 세포주는 이식형 세포 배양 장치에 도입되어 있고, 여기서 장치를 환자의 눈 내로 십입하고, 여기서 동결보존된 장치 해동 이후에 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)는 눈에서 장치로부터 확산되어 안과 장애를 치료하는 것인 세포주를 제공한다.
예를 들어, 치료하고자 하는 안과 장애는 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성 (예컨대, 습성 형태의 연령-관련 황반 변성 또는 위축성 AMD (이는 또한 건성 형태의 AMD로도 명명된다)), 녹내장, 색소성 망막염, 백내장 형성, 망막모세포종 및 망막 허혈로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 연령-관련 황반 변성은 습성 형태의 연령-관련 황반 변성이다. 또 다른 실시양태에서, 안과 장애는 당뇨병성 망막병증이다.
놀랍게도, 본원에 기술된 방법 및 용도 중 임의의 것에서, 동결보존이 장치의 생산량에는 악영향을 미치지 않는다. 실제로, 동결보존은 장치의 생산량을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 이상 또는 그 초과만큼 증진시킬 수 있다.
본원에 기술된 임의의 장치는 또한 다양한 비-안구 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 비-안구 장애의 경우, 장치 디자인은 변형되어야 할 것이다. 장치 디자인의 변형은 당업자의 통상적인 수준 내에 존재한다.
본 발명은 동결보존된 장치를 해동시키고, 세포 증식 장애를 앓는 환자 내로 본 발명의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 상기 장치로부터 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 확산되어 VEGF 및/또는 PDGF에 결합하게 함으로써 이러한 결합이 환자에서 내피 세포 증식 또는 혈관 형성을 억제시키는 것인, 내피 세포 증식 또는 혈관 형성을 억제시키는 방법을 추가로 제공한다. 유사하게, 동결보존된 장치를 해동시키고, 세포 증식 장애를 앓는 환자 내로 본 발명의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 상기 장치로부터 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 확산되어 환자에서 내피 세포 증식 또는 혈관 형성을 억제시키게 함으로써 이루지는 것인, 내피 세포 증식 또는 혈관 형성을 억제시키는 방법 또한 제공한다.
예를 들어, 세포 증식 장애는 혈액 장애, 아테롬성동맥경화증, 염증, 증가된 혈관 투과성 및/또는 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방법에서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 및 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 장치로부터 확산된다.
동결보존된 장치를 해동시키고, 본원에 기술된 임의의 이식형 세포 배양 장치를 수용 숙주의 표적 영역 내로 이식시킴으로써 이루어지며, 여기서 하나 이상의 캡슐화된 ARPE-19 세포 또는 세포주는 표적 영역에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비하는 것인, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 수용 숙주에게 전달하는 방법 또한 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 동결보존된 장치를 해동시키고, 본원에 기술된 임의의 이식형 세포 배양 장치를 수용 숙주의 표적 영역 내로 이식시킴으로써 이루어지고, 여기서 하나 이상의 캡슐화된 ARPE-19 세포 또는 세포주가 표적 영역에서 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 분비하는 것인, 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 수용 숙주에게 전달하는 방법을 제공한다. 바람직한 표적 영역으로는 뇌, 뇌실, 척수를 비롯한, 중추 신경계, 눈의 방수 및 유리체액, 비장, 귀, 심장, 결장, 간, 신장, 유방, 관절, 골수, 피하, 및/또는 복막 공간을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 영역으로는 전신 전달을 위한 전신 및/또는 예컨대, 신체 기관, 예컨대 유방, 결장, 비장, 난소, 고환 및/또는 골수 내, 또는 그에 인접한 위치의 국부화된 표적 영역을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 및 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 표적 영역으로 확산된다.
안구 이식 및/또는 장애와 관련하여 본원에 기술된 방법 및 용도 중 임의의 것에서 1일 환자 1명당 0.1 pg 내지 10,000 ㎍의 생물학적 활성 분자(들) (예컨대, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 다른 생물학적 활성 분자(들))가 이식형 세포 배양 장치로부터 확산될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 신체 다른 표적 영역 내로 전신 이식하는 경우, 치료 유효량은 1일 환자 1명당 1,000 mg 이상일 수 있다. 상기 전신 적응증인 경우, 훨씬 더 큰 대형 ECT 장치가 사용되어야 한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
안구 이식인 경우, 치료량은 1 pg 내지 10,000 ㎍/일/6 mm - 8.5 mm 장치 (1 pg 및 10,000 ㎍ 포함) 사이의 임의의 양이다. 일부 실시양태에서, 치료량은 1,000 ng/일 (1.0 pcd) 이상이다. 또한, 본 발명의 세포주 및 장치는 3주 이상의 기간 동안에 걸쳐 상기 치료량을 발현할 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료량은 100-10,000 ng/일 이상이다. 한 제한적인 실시양태에서, 양은 4 ㎍/일 이상이다. 가용성 수용체, 및 항혈관신생 항체 및 분자를 전달할 때, 5-10 ㎍/일을 전달하는 것이 최적이다. 상기 투여량을 달성하기 위해서는 눈마다 1개 초과의 장치 이식이 요구될 수 있다. 다른 생물학적 활성 분자(들)를 전달할 때, 보다 저용량의 생물학적 활성 분자(들)를 전달하는 보다 짧은 장치가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들어, 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비하도록 1종 이상의 ARPE-19 세포를 유전자 조작함으로써 본 발명의 이식형 세포 배양 장치를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 예를 들어, (동결보존된 장치 해동 이후에) 환자의 눈 내로, 또는 국부화된 다른 이환 부위로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들) 분자를 전달함으로써 눈 장애를 비롯한 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치의 제조에서 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포주의 용도를 기술한다.
또한, 본원에 기술된 임의의 이식형 세포 배양 장치는 (동결보존된 장치 해동 이후에) 환자의 눈 내로 상기 장치를 이식시키고, 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 상기 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF 및/또는 PDGF에 결합함으로써 안과 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 임의의 이식형 세포 배양 장치는 (동결보존된 장치 해동 이후에) 환자의 눈 내로 상기 장치를 이식시키고, 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 눈에서 상기 장치로부터 확산되게 함으로써 안과 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
(동결보존된 장치 해동 이후에) 환자의 눈 내로 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 하나 이상의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 상기 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF 또는 PDGF에 결합함으로써 안과 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 (동결보존된 장치 해동 이후에) 환자의 눈 내로 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 눈에서 상기 장치로부터 확산되게 함으로써 안과 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포 또한 제공한다.
본 발명은 또한 예를 들어, (동결보존된 장치 해동 이후에) 세포 증식 장애를 앓는 환자의 눈 내로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 상기 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF 및/또는 PDGF에 결합함으로써 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제시키도록 하는 내피 세포 증식 억제용의 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치의 제조에서 폴리펩티드 (예컨대, 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자)를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포의 용도를 기술한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 예를 들어, (동결보존된 장치 해동 이후에) 세포 증식 장애를 앓는 환자의 눈 내로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 눈에서 상기 장치로부터 확산되어 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제시키도록 하는 내피 세포 증식 억제용의 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치의 제조에서 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포주의 용도를 기술한다.
유사하게, 본 발명은 또한 (동결보존된 장치 해동 이후에) 세포 증식 장애를 앓는 환자의 눈 내로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 상기 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF 및/또는 PDGF에 결합함으로써 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제시키도록 하는 내피 세포 증식 억제용의 본 발명의 이식형 세포 배양 장치를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 (동결보존된 장치 해동 이후에) 세포 증식 장애를 앓는 환자의 눈 내로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시키고, 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)가 눈에서 상기 장치로부터 확산되어 상기 환자에서 내피 세포 증식을 억제시키도록 하는 내피 세포 증식 억제용의 본 발명의 이식형 세포 배양 장치를 제공한다.
본원에서는 또한 (동결보존된 장치 해동 이후에) 수용 숙주의 표적 영역으로 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치를 이식시킴으로써 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 수용 숙주로 전달하기 위한 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치의 제조에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 수용 숙주로 전달하기 위한 본 발명에 따른 이식형 세포 배양 장치의 제조에서 폴리펩티드를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포주의 용도로서, 여기서 캡슐화된 하나 이상의 ARPE-19 세포는 표적 영역에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비하는 것인 용도를 제공한다. 유사하게, 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치는 (동결보존된 장치 해동 이후에) 수용 숙주의 표적 영역으로 상기 장치를 이식시킴으로써 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 수용 숙주로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 캡슐화된 하나 이상의 ARPE-19 세포는 표적 영역에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비한다.
또한, 임의의 폴리펩티드를 생산하도록 유전자 조작된 하나 이상의 ARPE-19 세포는 (동결보존된 장치 해동 이후에) 수용 숙주의 표적 영역으로 본 발명의 임의의 이식형 세포 배양 장치를 이식시킴으로써 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 수용 숙주로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 캡슐화된 하나 이상의 ARPE-19 세포는 표적 영역에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 분비한다.
본원에 기술된 이식형 세포 배양 장치를 해동시키는 단계를 포함하는 단계로서, 여기서 해동된 장치는 환자의 눈 내로 이식하여 하나 이상의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 상기 장치로부터 확산되어 눈에서 VEGF, PDGF, 또는 VEGF 및 PDGF 둘 다에 결합할 수 있도록 하는 것이고, 여기서 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)는 내피 세포 증식 또는 혈관 형성을 억제시키는 방법에서 안과 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 대상체의 눈으로 전달하는 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 임의의 이식형 세포 배양 장치도 또한 제공한다.
표적 영역은 뇌, 뇌실, 척수를 비롯한, 중추 신경계, 및 눈의 방수 및 유리체액으로부터 선택된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 다른 표적 영역도 신체 어디에나 위치할 수 있으며, ECT 장치는 상기 부위에 인접하게 배치될 수 있다. 부위로는 비장, 귀, 심장, 결장, 간, 신장, 유방, 관절, 골수, 피하, 및 복막 공간을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나, 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충할 경우, 정의를 비롯한, 본 명세서를 통해 조정될 것이다. 추가로, 물질, 방법, 일례는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특성 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 pCpG프리-비트로 익스프레션 벡터(pCpGfree-vitro Expression Vector) (인비보젠(InvivoGen)) 맵(Map)을 보여주는 개략도이다.
도 2는 p834를 발현하는 세포주의 안정성을 보여주는 것이다.
도 3은 용기에 4주간 유치된 이후의 p834 ECT 장치의 조직 절편을 보여주는 것이다.
도 4는 뉴질랜드 흰 토끼의 눈에 이식된 후 3개월 경과하였을 때, 체외이식된 p834 ECT 장치의 조직을 보여주는 것이다.
도 5는 질량 대 효능 플롯에서 834 단백질을 생산하는 세포주의 PCD를 보여주는 것이다. 1차, 2차, 및 3차 형질감염/반복 세포주가 플롯팅된 것이다.
도 6은 p834 및 애플리버셉트(Aflibercept)의 서열 정렬이다.
도 7a는 캡슐화 이후, 동결보존 없이 1주 경과시 정상 조건하의 대조군 세포의 조직을 보여주는 사진이다. 도 7b는 캡슐화에 이어서, 기상 LN2 내에서, 그러나 장치내 세포 현탁액과 함께 제제화되는 동결보호제는 함유하지 않은 상태로 동결된 이후, 1주 경과시의 세포의 조직을 보여주는 사진이다. 도 7c는 캡슐화에 이어서, 동결보호제가 장치내 세포 현탁액과 함께 제제화된 상태하의 1주간의 동결보존 이후 세포의 조직을 보여주는 사진이다. 도 7d는 캡슐화에 이어서, 동결보호제가 장치내 세포 현탁액과 함께 제제화된 상태하의 1개월간의 동결보존 이후 세포의 조직을 보여주는 사진이다. 도 7e는 캡슐화에 이어서, 동결보호제가 장치내 세포 현탁액과 함께 제제화된 상태하의 1년간의 동결보존 이후 세포의 조직을 보여주는 사진이다.
도 8a는 1주간 동결보존된 장치 및 대조군 장치로부터의 VEGFR 생산을 보여주는 그래프이다. 도 8b는 1개월간의 동결보존된 장치로부터의 VEGFR 생산을 보여주는 그래프이다. 도 8c는 1년간의 동결보존된 장치로부터의 VEGFR 생산을 보여주는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
ECT는 몇가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 잠재적으로 임의의 치료 단백질을 코딩하는 유전자가 세포로 조작될 수 있게 할 수 있으며, 이로써 광범위하게 저용될 수 있다. 장기간 지속되는 생산량을 통해 표적 영역에서의 단백질의 이용가능성은 연속적일 뿐만 아니라, 장기적이라는 것을 확인할 수 있다. 추가로, ECT 이식물의 생산량은 최적의 치료 용량을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 마지막으로, ECT에 의한 치료는 필요할 경우, 간단하게 이식물을 회수함으로써 종결될 수 있다. 따라서, ECT는 생물학적으로 활성인 단백질 및 폴리펩티드를 망막으로 장기간에 걸쳐 전달하는 데 매우 효과적인 수단이다. 실제로, ECT는 특히 실제로 요구되는, 제한된 치료학적 분포 부피, 눈에의 용이한 접근, 및 질환의 만성적 성질을 고려해 볼 때, 그 자체가 망막 질환에 대하여 탁월한 선택안이 되는 것으로 나타났다.
그러나, 대부분의 세포 기반 요법 제품과 같이, ECT 장치는 수주 내지 수개월 범위의, 상대적으로 짧은 보관 수명을 가진다. 그 결과, 사용되지 않은 다량의 제품이 폐기되어야 할 것이다. 전형적으로, 최선의 시나리오에서 재조합 단배질은 12-24개월 범위의 보관 수명을 가진다.
본 발명에 따라, 임의의 캡슐화된 세포 요법 (ECT) 장치는 제조 후, 및 투여 및/또는 실행 이전에 동결보존될 수 있다. 성공할 경우, 동결보존은 ECT 장치의 보관 수명을 개선시키는 데 도움을 주며, 결국 장치 저장은 개선되고/거나, 장치 제조는 간소화될 것이다.
의학 요법 가치망의 주된 구성 요소는 제품 생산의 용이함, 장기간의 제품 유통 기간, 및 유통시 제품의 안정성이다. 세포 기반 요법에 대한 현 방법론은 최적의 성장 조건을 모사하는 조건하에서 살아있는 세포를 수송하는 것에 주력하고 있다. 이러한 조건은 예를 들어, 습도, CO2, 온도 조절을 포함할 수 있고, 이는 세포 확장, 저장, 및 분포 동안 실행될 수 있다. 이러한 환경 파라미터는 포장 요건을 복잡하게 만들고, 제조 후 각 공정 단계시 일정한 환경 모니터링을 유도한다. 하기 제시된 바와 같이, 세포 요법 제품의 보관 수명은 전형적으로 수일 내지 수주이다. 따라서, 복잡한 포장 요건 및 짧은 보관 수명은 세포 기반 제품의 제조, 저장 및 유통과 관련된 주된 도전 과제를 제시한다.
Figure pct00001
이러한 현 세포 기반 제품의 제한된 보관 수명은 제품 유통 및 전달에 영향을 미친다. 따라서, 제조 물류 관리를 간소화시키는, 보관 수명이 증가된 세포 기반 제품이 요구되고 있다.
동결보존을 통해 그러한 제약은 해소될 것이다. 이와 관련하여, 동결보존은 제품 보관 수명을 유의적으로 연장시키며, 제품 유통 및 최종 사용자에게로의 공급을 간소화시키며, 결국 이를 통해서 ECT 장치의 제조 및 유통과 관련된 비용은 절감될 것이다. 놀랍게도, 하기 실시예 5에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 장치의 동결보존은 장치 결에 어떤 부작용도 또는 다른 역효과도 미치지 않는다.
본원에 기술된 ECT 장치 중 임의의 것을 동결보존시키는 데 당업계에 공지된 임의의 적합한 동결보존이 사용될 수 있다.
예를 들어, 기상 액체 질소에서의 동결보존은 살아있는 세포를 장기간 저장할 수 있는 확립된 방법으로서, 이는 적절한 동결보호제, 및 극저온 조건하에서 생존할 수 있는 세포의 능력에 따라 달라진다. 일단 동결보존을 위한 최적의 조건이 충족되고 나면, 세포는 기상 액체 질소는 거의 무기한으로 저장이능하다.
ECT의 한가지 장점은 세포 이식물이 장치 캡슐 내의 자체 완비형(self-contained)이고, ECT 장치가 세포로 충전된 후에는 세포의 외부 배양이 요구되지 않는다는 점이다. 따라서, 세포를 포함하는 전체 ECT 장치를 동결보존시키고, 저장할 수 있는 능력은 환경적으로 제어된 조건하에서의 저장에 대한 관심의 대상이 되는 대안이 된다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 동결보존 방법은 ECT 제품에 맞게 적합화될 수 있고, 상기 방법은 ECT 장치의 제조, 저장, 및 유통 과정을 간소화시킬 것이다. 비제한적인 일례로, 동결보존 시스템을 사용하여, 본 발명의 ECT 장치 중 임의의 것을 동결보호제 (예컨대, 10% 글리세롤)로 제제화된 세포로 충전시키고, 이를 극저온 저장 바이알 중에 배치하고, 속도 조절 방식의 동결하에 (예컨대, -80℃까지) 동결시키고, 최종적으로 기상 액체 질소 (예컨대, -190℃) 조건하에서 저장할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 임의의 다른 동결보존 방법(들) 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적절한 동결보존 방법(들)을 결정하는 것은 당업계의 통상적인 기술 수준 범위 내에 포함되어 있다.
추가로, 전체적인 공급망이 간소화되었기 때문에 본 발명의 ECT 장치 중 임의의 것은 기상 액체 질소 (-190℃) 조건 및/또는 드라이아이스 (-70℃) 조건 (또는 이들의 임의의 조합(들))하에서 수송될 수 있다.
동결보존된 장치는 사용 이전에 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법 또는 프로토콜을 사용하여 해동될 수 있다. 놀랍게도, 동결보존된 조건하에 1주, 1개월 및 1년의 간격을 두고 해동된 ECT 장치는 강건한 성장 및 재조합 단백질 생산량을 보이는 세포를 함유하였다. 실제로, 일부 경우에서, 동결보존된 장치에 대한 장치의 생산량은 동시점에 비-동결보존된 장치와 비교하였을 때 개선되어 있었다 (즉, 더 우수하거나, 상승되어 있었다). 세포 내용물과 함께, 캡슐 구성에 사용된 물질을 포함하는 ECT 장치가 기상 액체 질소의 극저온 조건을 견뎌낼 수 있을 것이라고는 에상하지 못했다. 그러나, ECT 장치의 구성 요소의 무손상, 동결보존 이후 ECT 장차 내 존재하는 세포의 건강한 증식, 및 ECT 장치로부터의 강건한 재조합 단백질 분비가 본 연구 범위 내에서 사용되는 ECT 디자인의 내구성을 입증한다 (하기 실시예 5 참조).
따라서, (당업계게 공지된 임의의 수단에 의한) ECT 동결보존을 통해 상업적으로 실행 가능한 최종 제품의 저장 및 유통을 유의적으로 간소화시키면서, ECT 제품을 대량으로 제조할 수 있을 것이다.
단백질은 눈 질환의 치료에 사용되는 치료제들 중 지배적인 부류이다. 그러나, 대형의 항체 기반 단백질 약물은 혈관-망막-장벽을 우회할 수 없는 바, 치료를 위해서는 안구내 투여가 반복적으로 이루어져야 한다. 캡슐화된 세포 공학 (ECT) 안구내 장치는 앞서 인간 임상 시험에서 2년 동안에 걸쳐 생물학적 치료제 (예컨대, 생물학적 활성 분자)를 일관되게 눈으로 직접 전달할 수 있다는 것이 입증된 바 있으며, 이는 상기 기술이 또한 안과 생물학적 작용, 예를 들어 습성 AMD와 관련된 것으로까지 확장될 수 있다는 것을 제안하는 것이다.
청구되는 본 발명에서 사용될 수 있는 항혈관신생 항체-스캐폴드 및 항혈관신생 분자는 WO2012/075184 (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 본 발명과 연계하여 사용될 수 있는 다른 생물학적으로 활성인 작용제로는 뉴로트로핀, 인터류킨, 시토카인, 성장 인자, 항아폽토시스 인자, 혈관신생 인자, 항혈관신생 인자, 항체 및 항체 단편, 항원, 신경전달물질, 호르몬, 효소, 림포카인, 항염증 인자, 치료 단백질, 유전자 전달 벡터, 및/또는 이들의 임의의 조합(들)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 분자의 비제한적인 예로는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), NT-4, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 악소킨, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF II), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGF α), 형질전환 성장 인자 β (TGF β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 미드카인, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 트리오포틴, 액티빈, 티로트로핀 방출 호르몬, 인터류킨, 골 형태발생 단백질, 대식세포 염증성 단백질, 헤파린 술페이트, 암피레귤린, 레티노산, 종양 괴사 인자 α, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), PEDF, LEDGF, NTN, 뉴블라스틴, VEGF 억제제 및/또는 잠재적인 표적 조직에 대해 치료상 유용한 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 작용제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
세포를 유전자 조작하는 데 1, 2, 3회 또는 그 초과의 형질감염 (예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과)으로 이루어진 반복적 형질감염 과정이 사용될 수 있다. 놀랍게도, 반복된 DNA 형질감염 및 선택을 통해 50,000 내지 70,000 ng/106개의 세포/일 (70 pcd) 초과의 재조합 단백질 분비물을 생산할 수 있는 세포주의 능력은 유의적으로 증가하였다. 다중 카피수의 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성 분자(들)를 세포 (예컨대, ARPE-19 세포) 내로 도입하는 데 반복적 형질감염 과정이 사용될 수 있다. 1회의 형질감염을 포함하는 반복적 형질감염 과정을 제조된 분자는 "제1 세대" 분자로 지칭될 수 있다. 2회의 형질감염을 포함하는 반복적 형질감염 과정을 제조된 분자는 "제2 세대" 분자로 지칭될 수 있다. 3회의 형질감염을 포함하는 반복적 형질감염 과정을 제조된 분자는 "제3 세대" 분자로 지칭될 수 있다.
상기와 같은 반복적 형질감염 과정은 임의의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 항혈관신생 항체-스캐폴드, 항혈관신생 분자, 및/또는 다른 생물학적 활성 분자(들)와 함께 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
ECT 장치는 안과 적응증 뿐만 아니라, 국부 및/또는 전신 적응증용의, 항체, 항체 스캐폴드, 다른 생물학적 활성 분자(들) 및/또는 수용체 융합 단백질을 비롯한 대형 생물학적 분자에 대해 효과적인 약물 전달 플랫폼일 수 있다.
당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 관심 유전자 (즉, 주어진 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들)를 코딩하는 유전자)를 적합한 발현 벡터의 클로닝 부위 내로 삽입할 수 있다.
공지된 항-VEGF 화합물 및 그의 생체반응성 단편으로부터 유래된 (및/또는 그와 생물학적으로 유사한) 혈관신생 항체-스캐폴드 및 수용체 융합 단백질은 앞서 기술된 바 있다 (예컨대, WO 2012/075184 (본원에 참조로 포함됨) 참조). 예를 들어, 공지된 항-VEGF 화합물로는 항-VEGF 수용체 단편 (즉, 애플리버셉트) 및/또는 항-VEGF 항체 (또는 그의 항원 결합 단편) (즉, 베바시주맙(Bevacizumab), 드럭뱅크(DrugBank) DB00112; 또는 라니비주맙(Ranibizumab) 드럭뱅크 DB01270))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공지된 항-VEGF 화합물의 서열은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 개시된 장치 및 방법에서 사용될 수 있는 구체적인 VEGF 수용체 구축물에 대한 한 비제한적인 일례는 p834 (VEGFR-Fc#1, [RS-VEGF 수용체 1, 도메인 2 및 VEGF 수용체 2, 도메인 3 (R1D2-R2D3)]-EFEPKSC-hIgG1 Fc)이다. 그러나, 임의의 다른 적합한 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 및/또는 생물학적 활성 분자(들) 또한 사용될 수 있다.
834에 기초하여 생성된 세포주의 생산량은 하기에 요약되어 있다.
Figure pct00002
p834 (또한 p910, p969) 형질감염 결과, 매회 고 발현 클론이 생성된다.
p834 구축물의 구체적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다.
명확성을 위해, 본 발명의 항혈관신생 항체-스캐폴드 및/또는 항혈관신생 분자 및/또는 임의의 다른 생물학적 활성 분자(들)는 본 출원에서 하기와 같이 식별된다: "pXXX"는 플라스미드 (예를 들어, 플라스미드 p834)를 지칭하고, "XXX-X-XX"는 세포주 (예를 들어, 세포주 834-10-5)를 지칭하고, "XXX"는 분자 (예를 들어, 분자 834)를 지칭한다. 그러나, 본 발명에 기초한 스캐폴드 및/또는 구축물 및/또는 분자 및/또는 세포주 중 임의의 것은 본원에서 상호교환적으로 지칭되고/거나, 식별되고/거나, 구별될 수 있다.
동일 분자는 상이한 발현 벡터 내로 도입될 수 있고, 이로써 상이한 플라스미드가 제조될 수 있다. 예를 들어, 분자 834 cDNA는 pCpG 비트로 프리 블라스티시딘 저항성 벡터 (도 1 참조) 내로 도입됨으로써 플라스미드 p834 cDNA를 제조할 수 있다. 대안적으로, 분자 834는 또한 pCpG 비트로 프리네오마이신 저항성 벡터 내로 도입됨으로써 플라스미드 p910을 제조할 수 있거나; 또는 pCpG 히그로마이신 저항성 벡터 내로 도입됨으로써 플라스미드 p969를 제조할 수 있다 (WO 2012/075184 참조).
본원에 기술된 반복적 형질감염 과정을 사용하여, 다중 카피수의 동일한 (또는 상이한) 항혈관신생 항체-스캐폴드 및/또는 항혈관신생 분자 및/또는 임의의 다른 생물학적 활성 분자(들)를 세포 (예컨대, ARPE-19 세포) 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 반복적 형질감염 과정이 2회의 형질감염을 도입하였을 때, 2 카피수의 834 cDNA를 함유하는 제2 세대 구축물 (910)이 생성된다. 유사하게, 반복적 형질감염 과정이 3회의 형질감염을 도입하였을 때, 3 카피수의 834 cDNA를 함유하는 제3 세대 구축물 (969)이 생성된다.
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관심 생물학적 활성 분자(들)를 코딩하는 유전자를 발현시키는 데 광범위한 숙주/발현 벡터 조합이 사용될 수 있다. 장기간 동안 안정한 생체내 발현은, 포유동물 숙주에서 생체내 이식으로 하향 조절되지 않는 관심 유전자가 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 것인 발현 벡터 (즉, 재조합 DNA 분자)를 이용하여 달성된다. 적합한 프로모터로는 예를 들어, 강력한 구성적 포유동물 프로모터, 예컨대 베타-액틴, eIF4A1, GAPDH 등을 포함한다. 스트레스 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 1 (MT-1) 또는 VEGF 프로모터 또한 적합할 수 있다. 추가로, 코어 프로모터 및 맞춤형(custom) 5' UTR 또는 인핸서 요소를 함유하는 하이브리드 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 공지된 비-레트로바이러스 프로모터, 예컨대 CMV 또는 SV40 또는 아데노바이러스의 조기 및 후기 프로모터가 적합하다. 인핸서 요소 또한 스트레스 환경, 예컨대 낮은 O2 하에서의 추가의 유전자 발현을 부여하기 위해 배치될 수 있다. 일례로는 저산소 유도시에 관련된 유전자 요소의 상향 조절을 부여하는 에리트로포이에틴 인핸서가 있다.
이어서, 관심 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 원하는 세포주를 형질감염시킬 수 있다. 표준 형질감염 기법, 예컨대 리포솜, 인산칼슘 공침전, DEAE-덱스트란 형질감염 또는 전기천공이 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 포유동물 형질감염용 키트, 예컨대 퓨진6(Fugene6) (로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences))을 구입할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터를 사용하여 원하는 세포주를 형질도입할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터의 예로는 상업적으로 이용가능한 p렌티(pLenti) 계열의 바이러스 벡터 (인비트로젠(Invitrogen))가 있다. 인간 포유동물 세포가 사용될 수 있다. 모든 경우에서, 장치에 포함되어 있는 세포 또는 조직은 오염되지 않거나, 불순물과 섞이지 않도록 하는 것이 중요하다. 중쇄 및 경쇄 구성 요소를 필요로 하는 항체 스캐폴드 단백질의 경우, 각각 관련 항체 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 것인 이중 구축물은 동시에 공동으로 형질감염될 수 있고, 이로써 기능성 2가 Fab 및 4가 전장의 항체 분자를 발현하는 세포주가 생산된다.
예시적인 프로모터는 도 1에 제시되어 있는 바와 같이, SV40 프로모터 및 CMV/EF1알파 프로모터를 포함한다.
예를 들어, 다른 유용한 발현 벡터는 다른 유용한 발현 벡터는 예컨대, SV40의 각종 공지된 유도체 및 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pBR322, PCR1, pMB9 및 그의 유도체를 비롯한, 이. 콜라이(E. coli)로부터의 pUC, pBlueScript™ 플라스미드와 같은 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열 절편으로 구성될 수 있다. 게네티신 (G418), 히그로마이신 또는 블라스티시딘 약물 선택 유전자를 함유하는 발현 벡터도 유용하다 (문헌 [Southern, P. J., In Vitro , 18, p. 315 (1981)], [Southern, P. J. and Berg, P., J. Mol. Appl. Genet, 1, p. 327 (1982)]). 상기 벡터는 관심 생물학적 유전자 및/또는 독성, 예컨대 G418, 히그로마이신 B 또는 블라스티시딘을 이용한 선택에 대한 저항성을 부여하는 유전자 둘 다의 발현을 구동시키는 각종의 상이한 인핸서/프로모터 영역을 사용할 수 있다. 각종의 상이한 포유동물 프로모터는 G418 및 히그로마이신 B에 대한 유전자 및/또는 관심 생물학적 유전자의 발현을 지시하기 위하여 사용될 수 있다. G418 저항성 유전자는 배양 배지에 첨가된 G418 (100-1,,000 ㎍/㎕)을 효소적으로 불활성화시키는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩한다. 오직 APH 유전자를 발현하는 세포만이 약물 선택에서 생존하게 될 것이며, 보통은 이로써 제2 생물학적 유전자의 발현이 일어나게 될 것이다. 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (HPH) 유전자는 히그로마이신 독소를 특이적으로 변형시키고, 이를 불활성화시키는 효소를 코딩한다. 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자와 함께 공동으로 형질감염되거나, 또는 그와 동일한 플라스미드 상에 함유되어 있는 유전자는 50-200 ㎍/ml 농도로 히그로마이신 B의 존재하에서 우선적으로 발현될 것이다.
사용될 수 있는 발현 벡터의 예로는 상업적으로 이용가능한 pRC/CMV (인비트로젠), pRC/RSV (인비트로젠), pCDNA1NEO (인비트로젠), pCI-Neo (프로메가(Promega)), pcDNA3.3 (인비트로젠) 및 GS 벡터 시스템 (론자 그룹(Lonza Group: 스위스))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 상업적으로 이용가능한 벡터로는 pBlast, pMono, 또는 pVitro를 포함한다. 한 실시양태에서, 발현 벡터 시스템은 네오마이신 (G418), 히그로마이신, 및 블라스티시딘 저항성 유전자와 함께 이용가능한 pCpG프리-비트로 발현 벡터 (인비보젠: 미국 캘리포니아주 샌디에고)이다 (도 1 참조).
한 실시양태에서, 폴리링커를 포함하는 전체 pUC18 서열 및 돌연변이체 DHFR의 cDNA를 포함하는 pNUT 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Aebischer, P., et al., Transplantation, 58, pp. 1275-1277 (1994)]; [Baetge et al., PNAS, 83, pp. 5454-58 (1986)]을 참조할 수 있다. pNUT 발현 벡터는 DHFR 코딩 서열이 G418 또는 히그로마이신 약물 저항성에 대한 코딩 서열에 의해 대체되도록 변형될 수 있다. pNUT 발현 벡터 내의 SV40 프로모터는 또한 예컨대, 상기 논의된 것과 같은, 임의의 적합한 구성적으로 발현된 포유동물 프로모터로 대체될 수 있다.
임의의 다른 적합한, 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 (예컨대, pcDNA 계열 (인비트로젠), pBlast, pMono, pVitro, 또는 pCpG-비트로 (인비보젠)) 또한 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 발현을 조절하는 주요 요소는 전형적으로 발현 카세트에서 발견된다. 이러한 요소로는 프로모터, 5' 비번역 영역 (5' UTR) 및 3' 비번역 영역 (3' UTR)을 포함한다. 적합한 발현 벡터의 다른 요소가 플라스미드 통합 또는 발현에 중요할 수 있지만, 쉽게 나타나지 않을 수도 있다. 당업자는 청구되는 발명에서 사용하는 데 적합한 발현 벡터를 디자인하고 구축할 수 있을 것이다. 적합한 벡터의 선택, 디자인, 및/또는 구축은 당업계의 통상적인 기술 수준 범위 내에 충분히 포함되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 적합한 생물학적 활성 분자(들)의 서열은 또한 공개되어 있고/거나, 당업계에 공지되어 있다. 공개적으로 이용가능하지 않은, 본 발명에서 유용한 생물학적 활성 분자를 코딩하는 다른 유전자는 표준 재조합 DNA 방법, 예컨대 PCR 증폭, 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하는 게놈 및 cDNA 라이브러리 스크리닝을 사용하여 수득될 수 있다.
벡터 DNA는 종래 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 외래 핵산 (예컨대, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 의미하는 것으로, 이는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션, 또는 전기천공을 포함한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook et al" MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harber, NY 1989], 및 다른 실험실용 매뉴얼에서에서 살펴볼 수 있다.
최상의 세포는 자발적으로 발생하는 무한 증식 인간 망막 색소 상피 세포주인 ARPE-19 세포주이다. 그러나, CHO 세포, BHK 세포, RPE (1차 세포 또는 무한증식 세포)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 적합한 세포 또한 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 세포 선택은 의도되는 적용에 따라 달라진다. 캡슐화된 세포는 생물학적 활성 분자의 분비를 위해 선택될 수 있다. 활성인, 구축물의 효능제, 유사체, 유도체 또는 단편을 합성 및 분비하는 세포 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 세포 유형은 또한 생물학적 활성 분자(들)를 분비하도록 유전자 조작될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
캡슐화된 세포 기반 전달을 위한 플랫폼 세포주가 되도록 하기 위해서는 세포주는 하기 특징들 중 가능한 많은 특징을 가져야 한다: (1) 세포는 엄격한 조건하에서도 강한 내구력을 가져야 한다 (캡슐화된 세포는 무혈관 조직 공간에서, 예컨대 중추 신경계, 또는 눈에서, 특히 안구내 환경에서 기능적이어야 한다); (2) 세포는 유전적으로 변형될 수 있어야 한다 (세포 내로 조작될 필요가 있는 원하는 치료학적 인자); (3) 세포는 비교적 긴 수명을 가져야 한다 (세포는 저장되고, 특징이 규명되고, 조작되고, 안전성 시험되고, 임상 로트를 제조하는 데 충분한 자손을 생산하여야 한다); (4) 세포는 인간 기원의 것이어야 한다 (이는 캡슐화된 세포와 숙주 사이의 적합성을 증가시킨다); (5) 세포는 생체내 장치 중에서 1개월 초과의 기간 동안 80% 초과의 생존능을 보여야 한다 (이를 통해서 장기간 전달이 보장된다); (6) 캡슐화된 세포는 유용한 생물학적 산물을 유효한 양으로 전달해야 한다 (이를 통해서 치료 유효성은 보장된다); (7) 세포는 낮은 수준의 숙주 면역 반응을 가져야 한다 (이를 통해 이식 수명은 보장된다); 및 (8) 세포는 (장치가 누설되는 경우, 숙주에 대한 안전성을 제공하기 위해) 종양을 형성하지 않아야 한다.
ARPE-19 세포주 (문헌 [Dunn et al., 62 Exp. Eye Res. 155-69 (1996)], [Dunn et al., 39 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2744-9 (1998)], [Finnemann et al., 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12932-7 (1997)], [Handa et al., 66 Exp. Eye. 411-9 (1998)], [Holtkamp et al., 112 Clin. Exp. Immunol. 34-43 (1998)], [Maidji et al., 70 J. Virol. 8402-10 (1996)]; 미국 특허 번호 6,361,771 참조)는 캡슐화된 세포 기반 전달 시스템용으로 성공적인 플랫폼 세포의 특징들 모두를 입증한다. ARPE-19 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC 번호 CRL-2302)으로부터 이용가능하다. ARPE-19 세포는 정상적인 망막 색소 상피 (RPE) 세포이며, 망막 색소 상피 세포 특이 마커인 CRALBP 와 RPE-65를 발현한다. ARPE-19 세포는 형태학적 및 기능적 극성을 나타내는 안정된 단일층을 형성한다.
유전자 조작된 ARPE-19 세포는 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 발현하여 치료량의 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 ARPE-19 세포는 적어도 10,000 ng/일/106개의 세포를 생산할 수 있다. 이들 세포는 3개월 이상의 기간 동안 상기 양으로 생산할 수 있다.
반복적 형질감염 과정을 사용하여 상기 분자를 ARPE-19 세포 내로 도입할 수 있다. 반복적 형질감염은 1회 형질감염, 2회 형질감염, 3회 형질감염 또는 그 초과의 형질감염 (예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 형질감염)일 수 있다. 반복적 형질감염이 1회 형질감염일 때, 본 발명의 세포주는 10,000 내지 30,000 ng/일/106개의 세포, 예를 들어 약 15,000 ng/일/106개의 세포 또는 적어도 15,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 대안적으로, 반복적 형질감염이 2회 형질감염일 때, 세포주는 30,000 내지 50,000 ng/일/106개의 세포, 예를 들어 약 35,000 ng/일/106개의 세포 또는 적어도 35,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 다른 실시양태에서, 반복적 형질감염이 3회 형질감염일 때, 세포주는 50,000 내지 75,000 ng/일/106개의 세포, 예를 들어 약 70,000 ng/일/106개의 세포 또는 적어도 70,000 ng/일/106개의 세포의 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 생산한다. 일부 실시양태에서, 상기와 같은 반복적 형질감염을 사용하여 동일한 생물학적 활성 분자(들)를 세포 내로 도입할 수 있다. 대안적으로, 상이한 생물학적 활성 분자(들)를 반복적 형질감염의 각 형질감염에서 세포 내로 도입한다.
본 발명의 장치가 사용될 때, 102 내지 108개의 유전자 조작된 ARPE-19 세포, 예를 들어 0.5-1.0 x 106개 또는 5 x 102 내지 6 x 105개의 유전자 조작된 ARPE-19 세포가 각 장치에 캡슐화되어 있다. 투여량은 더 적거나, 더 많은 캡슐, 예컨대 환자 1명당 1 내지 50개의 캡슐을 이식함으로써 제어될 수 있다. 본 원에 기술된 안과 장치는 하루에 환자 1명당 눈마다 약 0.1 pg 내지 10,000 ㎍을 전달할 수 있다. 한 비제한적인 일례로, 치료량은 눈마다 500-50,000 ng 항정 상태이다. 또 다른 일례에서, 치료량은 눈마다 10 ㎍/ml 이상의 항정 상태이다. 또한, 일단 해동되고 나면, 본 발명의 동결보존된 장치는 3개월 이상의 기간 동안 치료량을 발현할 수 있다.
선택된 산물을 생산하는 세포 또는 조직을 단리시키는 기법 및 절차는 당업자에 공지되어 있거나, 또는 통상적인 실험 수준을 넘지 않는 공지된 절차로부터 적합화될 수 있다.
단리시키고자 하는 세포가 시험관내에서의 성장에 적합화된 복제 세포 또는 세포주일 경우, 이는 특히 이들 세포의 세포 은행을 생성하는 데 유리하다. 세포 은행의 특정의 이점은 세포의 동일한 배양물 또는 배치로부터 제조되는 세포의 공급원이라는 점이다. 즉, 모든 세포는 동일한 세포 공급원으로 기원되고, 동일 조건 및 스트레스에 노출되었다. 그러므로, 바이알은 동종 배양물로서 처리될 수 있다. 이식 맥락에서, 이는 동일한 산물 생산 또는 장치의 교체를 매우 용이하게 한다. 또한 이는 실험 프로토콜을 단순화하는 바, 이를 통해서 확실하게 이식된 세포에는 레트로바이러스 등이 존재하지 않게 된다. 또한 이를 통해서 생체내 및 시험관내에서 비히클을 동시에 모니터링할 수 있으며, 이로써 생체내 거주하는 독특한 효과 및 인자를 조사할 수 있다.
본원에 사용된 "개체" 또는 "수용자" 또는 "숙주"라는 용어는 상호교환적으로 사용되는, 이는 인간 또는 동물 대상체를 의미한다.
본원에 사용된 "생물학적 활성 분자" ("BAM")는 본 발명의 장치가 이식되는 개체의 체내에 대하여 생물학상 유용한 효과를 발휘할 수 있는 임의의 물질이다. 항혈관신생 항체-스캐폴드 및 항혈관신생 항체 및 분자는 BAM의 예이다. BAM으로는 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 및/또는 항혈관신생 항체 및 분자를 포함할 수 있다. BAM의 다른 적합한 예로는 예를 들어, 뉴로트로핀, 인터류킨, 시토카인, 성장 인자, 항아폽토시스 인자, 혈관신생 인자, 항혈관신생 인자, 항체 및 항체 단편, 항원, 신경전달물질, 호르몬, 효소, 림포카인, 항염증 인자, 치료 단백질, 유전자 전달 벡터, 및/또는 이들의 임의의 조합(들)을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 상기 분자로는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), NT-4, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 악소킨, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF II), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGF α), 형질전환 성장 인자 β (TGF β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 미드카인, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 트리오포틴, 액티빈, 티로트로핀 방출 호르몬, 인터류킨, 골 형태발생 단백질, 대식세포 염증성 단백질, 헤파린 술페이트, 암피레귤린, 레티노산, 종양 괴사 인자 α, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), PEDF, LEDGF, NTN, 뉴블라스틴, VEGF 억제제 및/또는 잠재적인 표적 조직에 대해 치료상 유용한 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 작용제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"캡슐" 및 "장치" 및 "비히클"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 본 발명의 ECT 장치를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, "세포"라는 용어는 조직, 세포 클러스터 및 개별적으로 단리된 세포에 유지된 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의 형태의 세포를 의미한다.
본원에 사용된 "생체적합성 캡슐" 또는 "생체적합성 장치" 또는 "생체적합성 비히클"은 캡슐 또는 장치 또는 비히클이 개체에서의 이식시, 캡슐을 거부하거나, 또는 예를 들어, 성능 저하를 통해 작동 불능의 결과를 초래하는 데 충분한 유해 숙주 반응을 유발하지 않는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "면역격리성 캡슐" 또는 "면역보호성 캡슐" 또는 "면역격리성 장치" 또는 "면역보호성 장치" 또는 "면역격리성 비히클" 또는 "면역보호성 비히클"은 개체 내로의 이식시, 캡슐이 바람직하게는, 장치 세포 내용물을 구획화하고, 그의 코어 내의 세포에 대한 숙주의 면역계에 유해 효과를 최소화시킨다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "생물학적 활성 분자의 장기간, 안정적인 발현"은 1개월 초과, 예를 들어 3개월 초과 또는 6개월 초과의 기간 동안 그의 유용한 생물학적 활성 활성을 유지하는 데 충분한 수준으로 생물학적 활성 분자를 지속적으로 생산하는 것을 의미한다. 장치의 이식물 및 그의 내용물은 생체 내에서 3개월 초과 동안, 및 많은 경우에서는 1년 초과의 기간 동안, 및 일부 경우에서, 2년 이상보다 더 긴 기간 동안 기능성을 유지할 수 있다.
"재킷" 및 "반투과성 막"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"내부 스캐폴드"라는 용어는 본원에 기술된 장치에서 사용될 수 있는 "매트릭스"의 일례이다.
코어를 둘러싸는 재킷 막의 "반투과성" 성질을 통해 세포에 의해 생산되는 분자 (예컨대, 예컨대 대사산물, 영양소 및/또는 치료학적 물질)은 장치로부터 주변의 숙주의 눈 조직 내로 확산될 수 있도록 허용되지만, 숙주의 유해한 면역학적 공격으로부터 코어내 세포를 보호하는 데 충분히 비-투과성이다.
"캡슐화된 세포 요법" 또는 "ECT"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 숙주내 이식 이전에 반투과성 생체적합성 물질을 이용하여 주변 세포에 의한 수용 숙주의 면역계로부터 세포를 단리시킬 수 있는 임의의 장치를 의미한다. 본 발명의 장치, 방법, 및/또는 용도 중 임의의 것에 당업계에 공지된 임의의 ECT 장치가 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
대개의 경우, 단일 IgG가 표적 세포 또는 조직의 세포의 용해를 일으키기에는 불충분하기 때문에, 비히클의 코어로부터 IgG를 배제시키는 것이 면역격리의 기준이 되지는 못한다. 따라서, 면역격리성 캡슐의 경우, 최대 1,000 kD 이하의 재킷의 공칭 MWCO 값이 고려된다. 예를 들어, MWCO는 50-700 kD 또는 50-500 kD 또는 70-300 kD이다. 예컨대, WO 92/19195를 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, MWCO는 500 kD이다.
본 발명은 또한 생물학적 활성 분자(들)를 눈으로 전달하기 위한 생체적합성, 임의로 면역격리성 및/또는 면역보호성의 동결보존된 장치에 관한 것이다. 상기 장치는, 동결보호제, 및 생물학적 활성 분자(들)를 생산 또는 분비하는 살아있는 세포를 함유하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸는 생체적합성 재킷을 함유하며, 여기서 재킷은 생물학적 활성 분자(들)가 눈으로, 및 뇌, 뇌실, 척수를 비롯한, 중추 신경계로 확산될 수 있도록 하는 MWCO를 가진다.
본 발명은 또한, 동결보호제, 및 하나 이상의 생물학적 활성 분자(들)를 생산 또는 분비하는 세포를 포함하는 코어, 및 상기 세포를 둘러싸는 반투과성 막으로서, 그를 통해 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 확산될 수 있도록 허용하는 것인 반투과성 막을 함유하는, 생체적합성 및 이식형 및 임의로 면역격리성 및/또는 면역보호성의 동결보존된 장치를 제공한다.
임의의 장치 구성(들)는 본 발명에 따라 동결보존될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 장치는 생물학적 활성을 유지하고, 생물학적 활성 분자에 접근하는 데 적절한 임의의 구성일 수 있다. 사용되는 특정 장치 구성(들)은 동결보존과 관련된 이점에 영향을 미치지 않을 것이다.
비제한적인 일례로, 적합한 장치는 하기 추가의 특징들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모두를 포함할 수 있다:
a. 코어가 0.5-1.0 x 106개의 ARPE-19 세포를 함유함;
b. 장치의 길이가 약 1 mm-20 mm임;
c. 장치의 내부 직경이 0.1-2.0 mm임;
d. 장치의 말단이 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉됨;
e. 반투과성 막의 기공 크기 중간값이 약 100 nm임;
f. 반투과성 막의 공칭 MWCO가 50-500 kD임;
g. 반투과성 막의 두께가 90-120 ㎛임;
h. 코어가 내부 스캐폴드를 포함하고, 상기 스캐폴드가 장치의 내부 부피의 40-85%를 차지하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 섬유를 포함함; 및
i. 이들의 임의의 조합(들).
다양한 생체적합성 캡슐이 본 발명에 따른 분자를 전달하는 데 적합하다. 유용한 생체적합성 중합체 캡슐은 (a) 액체 배지 중에 현탁되어 있거나, 생체적합성 매트릭스 내에 고정화되어 있는 세포 또는 세포들을 함유하는 코어, 및 (b) 생체적합하고, 세포가 생산한 생물학적 활성 분자가 눈으로 확산될 수 있도록 허용하는, 단리된 세포를 함유하지 않는 막을 포함하는 주변 재킷을 포함한다. 관련 분야의 당업자는 과도한 실험 없이도 주어진 적응증 또는 용도에 적절한 장치 구성을 선택하게 될 것이다.
다수의 형질전환된 세포 또는 세포주는 유리하게는 예컨대, 영양 배지를 포함하고, 임의로는 세포 생존능 및 기능을 유지시키는 추가 인자의 공급원을 함유하는 액체 코어를 가지는 캡슐 내에 단리되어 있다. 본 발명의 장치의 코어는 성장 인자 (예컨대, 프로락틴 또는 인슐린-같은 성장 인자 2), 성장 조절 물질, 예컨대 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 또는 망막모세포종 유전자 단백질 또는 영양소 수송 인핸서 (예컨대, 코어내 용존 산소의 농도를 증진시킬 수 있는 과불화탄소)에 대한 저장소로서의 기능을 할 수 있다. 이러한 물질의 특정의 것은 또한 액체 배지에 포함되는 데 적합하다.
대안적으로, 코어는 세포의 위치를 안정화시키는 히드로겔 또는 다른 생체적합성 물질 (예컨대, 세포외 매트릭스 성분)의 생체적합성 매트릭스를 포함할 수 있다. 침전된 키토산, 합성 중합체 및 중합체 블렌드, 마이크로캐리어 등을 비롯한, 임의의 적합한 매트릭스 또는 스페이서가 캡슐화되는 세포의 성장 특징에 따라 코어 내에서 사용될 수 있다.
대안적으로, 장치는 내부 스캐폴드를 가질 수 있다. 스캐폴드는 장치 내에서 세포 응집을 방지하고, 세포 분포를 개선시킬 수 있다 (PCT 공개 번호 WO 96/02646 (본원에 참조로 포함됨) 참조). 스캐폴드는 캡슐화된 세포에 대한 미세 환경을 정의하고, 세포가 코어 내에 잘 분포되도록 유지시켜 준다. 특정 장치에 대한 최적의 내부 스캐폴드는 사용되는 세포 유형에 크게 의존한다. 그러한 스캐폴드가 부재하면, 부착성 세포는 응집되어 클러스터를 형성한다.
예를 들어, 내부 스캐폴드는 실 또는 메쉬일 수 있다. 실 또는 메쉬 내부 스캐폴드를 형성하는 데 사용되는 필라멘트는 임의의 적합한 생체적합성, 실질적으로 비-분해성인 물질로 형성된 것이다 (미국 특허 번호 6,303,136 및 6,627,422 (본원에 참조로 포함됨) 참조)). 실 또는 직물 메쉬를 형성하는 데 유용한 물질로는 섬유, 예컨대 아크릴, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 나일론, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리부테스터, 또는 천연 섬유, 예컨대 코튼, 실크, 키틴 또는 탄소로 형성될 수 있는 임의의 생체적합성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-랜덤 단방향으로 편성될 수 있는 필라멘트는 두께 및 보이드 부피(void volume)를 변화시키는 실을 형성하기 위해 묶음(bundles)으로 꼬여진다. 보이드 부피는 필라멘트 사이에 존재하는 공간으로 정의된다. 실 내의 보이드 부피는 20-95%, 예를 들어 50-95% 사이에서 변할 것이다. 한 실시양태에서, 내부 스캐폴드는 장치의 내부 부피의 40-85%를 충전하는 PET 섬유로부터 제조된다. 대안적으로, 필라멘트 또는 실은 메쉬로 엮일 수 있다. 다른 실시양태에서, 관형 노끈이 구축된다.
면역학적으로 특권을 가지지 않은 이식물 부위, 예컨대 안구주위 부위와 전안방 (수성) 및 후안방 (유리체) 밖의 다른 영역에 대해, 캡슐은 면역격리성일 수 있다. 생체적합성 물질의 성분은 주위 반투과성 막 및 내부 세포-지지 스캐폴딩을 포함할 수 있다. 형질전환된 세포는 상기 기재된 선택투과성막에 의해 캡슐화된 스캐폴딩 상에 시딩될 수 있다. 또한, 접착된 섬유 구조는 세포 이식에 사용될 수 있다. (참조로 포함된 미국 특허 번호 5,512,600 참조). 생분해성 중합체는, 예를 들어 폴리(락트산) PLA, 폴리(락트산-코글리콜산) PLGA 및 폴리(글리콜산) PGA로 구성된 것 및 그의 등가물을 포함한다. 폼 스캐폴드는 이식된 세포가 부착될 수 있는 표면을 제공하는데 사용되었다 (참조로 포함된 PCT 국제 특허 출원 일련 번호 98/05304). 엮인 메쉬 튜브는 혈관 이식편으로서 사용되었다 (참조로 포함된 PCT 국제 특허 출원 WO 99/52573). 추가로, 코어는 세포의 위치를 안정화시키는 히드로겔로부터 형성된 고정 매트릭스로 구성될 수 있다. 히드로겔은 실질적으로 물로 구성된 겔 형태의 가교 친수성 중합체의 3차원 네트워크이다.
폴리아크릴레이트 (아크릴 공중합체 포함), 폴리비닐리덴, 폴리비닐 클로라이드 공중합체, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아미드, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리술폰 (폴리에테르 술폰 포함), 폴리포스파젠, 폴리아크릴로니트릴, 폴리(아크릴로니트릴/코비닐 클로라이드) 뿐만 아니라 이들의 유도체, 공중합체 및 혼합물을 포함하는 다양한 중합체 및 중합체 블렌드가 주위 반투과성 막을 제조하는데 사용될 수 있다. 일부 예시적 실시양태에서, 주위 반투과성 막은 생체적합성 반투과성 중공 섬유 막이다. 이러한 막 및 이들의 제조 방법은, 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,284,761 및 5,158,881에 개시되어 있다. 주위 반투과성 막은 폴리에테르 술폰 중공 섬유, 예컨대 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,976,859 또는 미국 특허 번호 4,968,733에 기재된 것으로부터 형성된다. 대안적인 주위 반투과성 막 물질은 폴리술폰이다.
캡슐은, 생물학적 활성을 유지하고 생성물 또는 기능의 전달에 대한 접근을 제공하는 데 적절하고/거나 예를 들어 원통형, 직사각형, 디스크형, 패치형, 타원형, 별형 또는 구형을 포함하는 임의의 구성일 수 있다. 더욱이, 캡슐은 메쉬-유사 또는 중첩 구조로 감기거나 싸여질 수 있다. 캡슐이 이식된 후 회수되는 것이라면, 이식의 부위로부터 캡슐의 이동으로 이어지는 경향이 있는 구성, 예컨대 수용 숙주의 혈관에서 이동하기에 충분한 작은 구형 캡슐은 바람직하지 않다. 특정 형상, 예컨대 직사각형, 패치형, 디스크형, 원통형 및 편평 시트는 더 큰 구조적 완전성을 제공하고, 회수가 바람직한 곳에서 사용될 수 있다.
장치는 이식 동안 장치 배치의 유지를 보조하고 회수를 보조하는 테더를 가지고 있을 수 있다. 이러한 테더는 캡슐을 제자리에 고정시키도록 적합화된 임의의 적합한 형상을 가지고 있을 수 있다. 예를 들어, 테더는 루프, 디스크 또는 봉합사일 수 있다. 일부 실시양태에서, 테더는 아일렛(eyelet)과 같이 형성되어, 봉합사가 공막 또는 다른 적합한 안구 구조에 테더 (및 따라서 장치)를 고정시키는데 사용될 수 있도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 테더는 한쪽 단부에서 캡슐과 연속되어 있고, 다른 단부에서 미리-꿰어진 봉합사 바늘을 형성한다. 한 실시양태에서, 테더는 캡슐을 안구 구조에 고정시키도록 적합화된 앵커 루프이다. 테더는 당업계에 공지된 형상 메모리 금속 및/또는 임의의 다른 적합한 의료 등급 재료로 구축될 수 있다.
중공 섬유 구성에서, 섬유는 2000 마이크로미터 미만, 예를 들어 1200 마이크로미터 미만의 내부 직경을 가지고 있을 것이다. 300-600 마이크로미터 미만의 외부 직경을 갖는 장치가 또한 고려된다. 한 실시양태에서, 내부 직경은 0.1 mm 내지 2.0 mm이다. 눈에의 이식을 위해, 중공 섬유 구성에서 캡슐은 0.4 cm 내지 1.5 cm 길이 또는 0.4 내지 1.0 cm 길이일 수 있다. 한 실시양태에서, 장치의 길이는 1 mm 내지 20 mm이다. 그러나, 보다 긴 장치가 눈에 수용될 수 있고, 커브형 또는 아치형이 안전하고 적절한 배치에 요구될 수 있다. 중공 섬유 구성은 안구내 배치에 사용될 수 있다.
안구주위 배치를 위해, 또한 중공 섬유 구성 (실질적으로 상기와 같은 치수를 갖는 것) 또는 편평 시트 구성이 고려된다. 편평 시트에 대해 고려된 상한치는 사각형을 가정하는 경우 대략 5 mm x 5 mm이다. 대략 동일한 표면적을 갖는 기타 형상이 또한 고려된다.
항혈관신생 항체-스캐폴드, 가용성 VEGFR 또는 가용성 PDGFR 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 전달을 위해 제조된 마이크로장치는 1 내지 2.5 mm의 길이, 300 내지 500 마이크로미터의 내부 직경 및 450 내지 700 마이크로미터의 외부 직경을 가질 수 있다. 마이크로화 장치의 내부 부피는 0.5 ㎕ 미만 (즉 0.5 ㎕)일 것이다. 마이크로화 장치의 완전한 논의를 위해서는, 본원에 참조로 포함된 WO2007/078922를 참조한다.
사용을 위해 고려된 개방 막은 1000 kD 이하의 공칭 분자량 컷오프 (MWCO) 값을 가질 것이다. 예를 들어, MWCO는 50-700 kD 또는 50-500 kD이고, 이상적으로는 대략 300 kD이다. 한 실시양태에서, MWCO는 500 kD이다. 고려된 막의 공칭 기공 크기는 대략 100 nm의 공칭 기공 크기를 가질 것이고, 기공의 가우스 분포를 기준으로 가장 큰 절대 기공은 150 nm 미만일 것이다. 대안적으로, 매우 개방된 막이 이용되지 않는 경우, 보다 "면역격리성" 및/또는 "면역보호성"인 막이 사용될 것이다.
한 실시양태에서, 기공 크기 중간값은 약 100 nm이다. 본 발명 장치의 코어를 둘러싸는 주변 또는 말초 영역 (재킷)은 선택투과성, 생체적합성 및/또는 면역격리성일 수 있다. 이는 단리된 세포가 없는 방식으로 제조되고, 코어를 완전히 둘러싸며 (즉, 단리시키며), 이로 인해 코어 내 임의의 세포와 수용자 신체 사이의 접촉을 방지한다. 생체적합성 반투과성 중공 섬유 막 및 이들의 제조 방법은 미국 특허 번호 5,284,761 및 5,158,881에 개시되어 있으며 (또한 WO 95/05452 참조), 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 캡슐 재킷은 폴리에테르 술폰 중공 섬유, 예컨대 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,976,859 및 4,968,733 및 5,762,798에 기재된 것으로부터 형성될 수 있다.
선택투과성이 되기 위해서, 재킷은 장치가 이식된 후 마주칠 것으로 예상되는 면역학적 반응의 유형 및 정도와, 눈 내 장치의 내외부로의 통과가 바람직한 가장 큰 물질의 분자 크기 모두에 적절한 MWCO 범위를 갖도록 형성된다. 장치의 이식 후 수용자에 의해 탑재될 수 있는 면역학적 공격의 유형 및 정도는, 부분적으로는 그 내부에 단리된 모이어티의 유형(들)에 좌우되고, 부분적으로는 수용자의 동일성 (즉, 수용자가 BAM의 공급원과 유전자적으로 얼마나 밀접하게 관련되어 있는지)에 좌우된다. 이식된 조직 또는 세포가 수용자에 대해 동종일 때, 면역학적 거부는 이식된 세포에 대하여 수용자의 면역 세포에 의한 세포-매개 공격을 통해 주로 진행될 수 있다. 조직 또는 세포가 수용자에 대해 이종일 때, 수용자의 세포용해 보체 공격 복합체의 조립을 통한 분자 공격 뿐만 아니라 보체와의 항체 상호작용이 우세할 수 있다.
재킷은 예정된 크기 이하의 물질의 통과는 허용하지만, 더 큰 물질의 통과는 방지한다. 보다 구체적으로, 주위 또는 말초 영역은 예정된 크기 범위의 기공 또는 공극을 갖는 방식으로 제조되고 그 결과 장치는 선택투과성이다. 주위 재킷의 MWCO는 코어에 대한 면역학적 공격을 수행하는데 필요한 물질의 접근을 방지하기에 충분히 낮아야 하며, 수용자에게 생물학적 활성 분자(들)를 전달하기에 충분히 높아야 한다. 말단절단된 생물학적 활성 분자(들)가 사용될 때, 본 발명의 장치의 생체적합성 재킷의 MWCO는 약 1 kD 내지 약 150 kD이다. 그러나, 비-말단절단된 생물학적 활성 분자(들)의 전달이 바람직한 경우, 200 kD보다 더 큰 MWCO를 갖는 개방 막이 사용되어야 한다.
장치의 재킷에 관하여 본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 장치 및 그의 내용물 둘 다에 대한 것을 총괄적으로 의미한다. 특히, 신체의 다양한 보호 시스템의 유해한 영향을 피하고 유의한 시간 주기 동안 기능성을 유지하기 위한, 이식된 무손상 장치 및 그의 내용물의 능력을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "보호 시스템"은 본 발명 비히클이 이식되는 개체의 면역계에 의해 탑재될 수 있는 면역학적 공격의 유형, 및 다른 거부 메카니즘, 예컨대 섬유증 반응, 이물 반응, 및 개체 신체에의 이물질의 존재로 인해서 유도될 수 있는 다른 유형의 염증 반응을 의미한다. 면역계로부터의 보호 반응 또는 이물 섬유증 반응의 방지 이외에, 본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 또한, 비히클 및 그의 내용물에 의해 어떤 특정한 바람직하지 않은 세포독성 또는 전신 효과, 예컨대 비히클 또는 그의 내용물의 바람직한 기능을 방해하는 효과가 야기되지 않음을 의미한다.
장치의 외부 표면은 선택된 부위에의 이식에 특히 적합한 방식으로 선택되거나 설계될 수 있다. 예를 들어, 외부 표면은 주위 조직의 세포에 의한 부착이 바람직한지의 여부에 따라 매끄럽거나 스티플형이거나(stippled) 거칠 수 있다. 형상 또는 구성은 또한 선택된 이식 부위에 특히 적절하도록 선택되거나 설계될 수 있다.
장치를 구축하는데 사용된 물질의 선택은, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Dionne WO 92/19195]에서 상세하게 기재된 바와 같이 수많은 인자에 의해 결정된다. 간략하게, 다양한 중합체 및 중합체 블렌드가 캡슐 재킷을 제조하는데 사용될 수 있다. 장치 및 그 안의 성장 표면을 형성하는 중합 막은 폴리아크릴레이트 (아크릴 공중합체 포함), 폴리비닐리덴, 폴리비닐 클로라이드 공중합체, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐디플루오라이드, 폴리올레핀, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리술폰, 폴리포스파젠, 폴리아크릴로니트릴, 폴리(아크릴로니트릴/코비닐 클로라이드), 뿐만 아니라 이들의 유도체, 공중합체 및 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명 장치의 재킷은 면역격리성 및/또는 면역보호성이다. 즉, 그것은 장치 코어 내의 세포를 장치가 이식되는 개체의 면역계로부터 보호한다. 이는 (1) 개체 신체의 해로운 물질이 코어로 진입하는 것을 방지하고, (2) 코어 내에 존재할 수 있는 염증성, 항원성 또는 그외 유해성 물질과 개체 사이의 접촉을 최소화하고, (3) 개체 면역계의 유해 부분과 단리된 모이어티 사이의 면역학적 접촉을 방지하기에 충분한 공간적 및 물리적 장벽을 제공함으로써 수행된다.
일부 실시양태에서, 외부 재킷은 또한 한외여과 막 또는 미세다공성 막일 수 있다. 당업자는 한외여과 막이 약 1 내지 약 100 나노미터의 기공 크기 범위를 갖는 것인 반면 미세다공성 막은 약 1 내지 약 10 마이크로미터의 범위를 가짐을 인식할 것이다.
상기 물리적 장벽의 두께는 변할 수 있지만, 항상 장벽 양측 상의 세포 및/또는 물질 사이의 직접 접촉을 방지하기에 충분히 두꺼울 것이다. 이러한 영역의 두께는 일반적으로 5 내지 200 마이크로미터의 범위이다. 예를 들어, 10 내지 100 마이크로미터 또는 20 내지 50 또는 20 내지 75 마이크로미터의 두께가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 반투과성 막은 90 내지 120 ㎛ 두께이다. 본 발명 장치의 사용에 의해 방지 또는 최소화될 수 있는 면역학적 공격의 유형은 대식세포, 호중구, 세포 면역 반응 (예를 들어 자연 킬러 세포 및 항체-의존성 T 세포-매개 세포용해 (ADCC)) 및 체액 반응 (예를 들어 항체-의존성 보체 개재된 세포용해)에 의한 공격을 포함한다.
캡슐 재킷은 폴리아크릴레이트 (아크릴 공중합체 포함), 폴리비닐리덴, 폴리비닐 클로라이드 공중합체, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아미드, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리술폰 (폴리에테르 술폰 포함), 폴리포스파젠, 폴리아크릴로니트릴, 폴리(아크릴로니트릴/코비닐 클로라이드), 뿐만 아니라 이들의 유도체, 공중합체 및 혼합물을 포함하는 다양한 중합체 및 중합체 블렌드로부터 제조될 수 있다. 이러한 물질로부터 제조된 캡슐은, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,284,761 및 5,158,881에 기재되어 있다. 폴리에테르 술폰 (PES) 섬유로부터 형성된 캡슐, 예컨대 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,976,859 및 4,968,733에 기재된 바와 같은 것이 또한 사용될 수 있다.
당업자는 선택투과성, 면역격리성 막을 갖는 캡슐 재킷이 면역학적으로 특권을 가지지 않은 부위에 바람직하다는 것을 인식할 것이다. 대조적으로, 미세다공성 막 또는 선택투과성 막은 면역학적으로 특권을 갖는 부위에 적합할 수도 있다. 면역학적으로 특권을 갖는 부위 내로의 이식을 위해, PES 또는 PS 막으로부터 제조된 캡슐이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 장치는 영장류, 예를 들어 인간 숙주, 수용자, 환자, 대상체 또는 개체에 사용하기 위해 의도된다. 수많은 다른 안구 이식 부위가 본 발명의 장치 및 방법을 위해 고려된다. 적합한 이식 부위는 눈의 방수 및 유리체액, 안구주위 공간, 전안방 및/또는 테논낭하를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 체내에서, 이식 부위는 피하, 복강내 또는 CNS 내부를 포함할 수 있다. 또한, 이식은 바람직한 생물 요법을 요구하는 병변에 또는 그 근처에의 국부 전달을 위한 것일 수 있다. 이러한 질환 부위의 예는 염증발생 관절, 뇌 및 CNS 병변, 양성 또는 악성 종양의 부위일 수 있다. 순환계로의 장치 접근은 신체 내의 잠재적 질환 부위에서부터 원위 이환된 기관 및 조직의 범위로 추가로 연장될 수 있다.
이식된 장치에 대한 수용자의 면역학적 반응의 유형 및 범위는 코어 내의 단리된 세포에 대한 수용자의 관계에 의해 영향을 받을 것이다. 예를 들어, 코어가 동계 세포를 함유하는 경우, 수용자가 장치 내의 특정 세포 또는 조직 유형에 대한 자가면역을 겪지 않는다면, 상기 동계 세포는 강력한 면역학적 반응을 야기하지 않을 것이다. 동계 세포 또는 조직은 좀처럼 이용가능하지 않다. 많은 경우에, 동종 또는 이종 세포 또는 조직 (즉, 예상 수용자와 동일한 종의 공여자로부터의 것 또는 예상 수용자와 상이한 종으로부터의 것)이 이용가능할 수 있다. 면역격리성 장치의 사용으로, 동시에 수용자를 면역억제시킬 필요 없이 동종 또는 이종 세포 또는 조직을 이식할 수 있다. 또한, 면역격리성 캡슐의 사용으로, 비매칭 세포 (알로그라프(allograph))를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명 장치는 종래 이식 기술로 치료될 수 있는 것보다 더 많은 개체를 치료하는 것을 가능하게 한다.
더 낮은 MWCO를 갖는 캡슐은 캡슐화된 세포를 갖는 환자 면역계의 분자의 상호작용을 추가로 방지하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 사용된 임의의 장치는 적어도 1치원적으로, 단리된 세포의 생존율 및 기능을 유지하기 위해 수용자의 주위 조직 (즉, 눈 조직)에 대해 코어 내의 임의의 단리된 세포의 충분히 밀접한 근접도를 제공하여야 한다.
본 발명의 장치는 이식 후 완전한 회수를 위해 충분한 크기 및 내구성을 갖는다. 한 예에서, 장치는 대략 2-20 μL (예를 들어, 1-3 μL)의 부피의 코어를 갖는다. 마이크로화 장치의 내부 기하구조는 대략 0.05-0.1 μL의 부피를 갖는다. 다른 장치 구성 및/또는 기하구조가 또한 이용될 수 있다
본 발명의 방법에 따르면, 다른 분자 (예를 들어, 추가적인 생물학적 활성 분자 ("BAM"))가 공동-전달될 수 있다. 예를 들어, 영양 인자(들)는 항혈관신생 인자(들)와 함께 전달될 수 있다.
공동-전달은 수많은 방식으로 수행될 수 있다. 첫째로, 세포가 상기 기재된 분자를 코딩하는 유전자를 함유하는 별개의 구축물로 형질감염될 수 있다. 둘째로, 세포가 둘 이상의 유전자 및 필요한 제어 요소를 함유하는 단일 구축물로 형질감염될 수 있다. 셋째로, 둘 이상의 별개로 조작된 세포주가 공동-캡슐화될 수 있거나 1개 초과의 장치가 관심 부위에 이식될 수 있다.
일부 적응증의 경우, BAM은 (예를 들어, 눈에서) 2개의 상이한 부위에 공동으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 신경 망막 (RPE에 신경절 세포)을 공급하기 위해 신경영양 인자를 유리체로 전달하고, 맥락막 혈관계를 공급하기 위해 테논낭하 공간을 통해 항혈관신생 인자 (예컨대 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자 중 하나 이상)를 전달하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 치료 요법의 과정 동안 여러 세포 유형의 사용을 고려한다. 예를 들어, 환자는 제1 세포 유형 (예를 들어, BHK 세포)을 함유하는 캡슐 장치가 이식될 수 있다. 환자가 상기 세포 유형에 대한 면역 반응을 발달시킨 후라면, 캡슐은 회수되거나 체외이식될 수 있고, 제2 세포 유형 (예를 들어, CHO 세포)을 함유하는 제2 캡슐이 이식될 수 있다. 이러한 방식으로, 환자가 캡슐화된 세포 유형 중 하나에 대한 면역 반응을 발달시키더라도, 치료 분자의 연속 제공이 가능하다.
본원에 기재된 생물학적 활성 분자와 함께, 하나 이상의 추가적인 BAM이 또한 장치로부터 눈에 전달될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 BAM이 세포 또는 비세포 공급원으로부터 제공될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 BAM이 비세포 공급원으로부터 제공되는 경우, 추가적인 BAM(들)은 (a) 실란트; (b) 스캐폴드; (c) 재킷 막; (d) 테더 앵커; 및/또는 (e) 코어 매질을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 세포 시스템 중 하나 이상의 성분에 캡슐화되거나, 그 내에 분산되거나 또는 그에 부착될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 비세포 공급원으로부터의 추가적인 BAM(들)의 공동-전달은 세포 공급원으로부터의 BAM과 동일한 장치에서 발생할 수 있다.
대안적으로, 둘 이상의 캡슐화된 세포 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 분자는 핵산, 핵산 단편, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 무기 분자, 치료제 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특히, 치료제는 상업적 용도를 위해 승인된 항혈관신생 약물, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증 약물, 항유사분열 약물, 항종양 약물, 항기생충 약물, IOP 리듀서, 펩티드 약물 및/또는 임의의 다른 생물학적 활성 분자 약물일 수 있다.
적합한 부형제는 제제에 대해 승인된 임의의 비-분해성 또는 생분해성 중합체, 히드로겔, 용해도 증진제, 소수성 분자, 단백질, 염 또는 다른 착화제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
비-세포 투여량은, 치료제의 농도 및/또는 눈 당 장치의 수를 변경하고/거나 캡슐화 부형제의 조성을 변형시키는 것과 같이 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 변경될 수 있다. 세포성 투여량은, (1) 장치 당 세포의 수, (2) 눈 당 장치의 수, 및/또는 (3) 세포 당 BAM 생산의 수준 (예를 들어, 반복적 형질감염에 의함)을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 세포 생산은, 예를 들어 형질도입된 세포에서 추가적인 BAM(들)에 대한 유전자의 카피수 또는 추가적 BAM(들)의 발현을 조종하는 프로모터의 효율을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 세포 공급원으로부터의 적합한 투여량은 1일 당 약 1 pg 내지 약 10000 mg의 범위일 수 있다.
장치는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 형성될 수 있다. (예를 들어, 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,361,771; 5,639,275; 5,653,975; 4,892,538; 5,156,844; 5,283,138 및 5,550,050 참조).
중합체 접착제의 이용 및/또는 크림핑(crimping), 매듭처리(knotting) 및 열 밀봉을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 적합한 캡슐 밀봉 방법이 사용될 수 있다. 또한, 임의의 적합한 "건조" 실링 방법도 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 세포-함유 용액이 도입되는 실질적으로 비-다공성인 피팅(fitting)이 제공된다. 충전 이후에, 캡슐이 밀봉된다. 이러한 방법은, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,653,688; 5,713,887; 5,738,673; 6,653,687; 5,932,460; 및 6,123,700에 기재되어 있다. 한 방법에서, 장치의 말단은 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉된다.
사용된 막은 또한 생물학적 활성 분자의 분자량을 기준으로 하여 상기 분자의 확산을 제저하도록 맞춤화될 수 있다. (문헌 [Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)) 참조). 캡슐화 기술 사용시, 세포는 면역억제 약물과 함께 또는 그 없이, 면역 거부가 없는 숙주에 이식될 수 있다. 캡슐은, 숙주에의 이식 후에, 캡슐의 거부를 초래하거나 캡슐이 예를 들어 분해를 통해 작동불가능해지는데 충분한 유해 숙주 반응을 도출하지 않는 생체적합성 물질로부터 제조될 수 있다.
장치 수 및 장치 크기는 이식시 치료 효과를 나타내기에 충분해야 하고, 특정 적용에 요구되는 생물학적 활성의 양에 의해 결정된다. 치료 물질을 방출하는 분비 세포의 경우에, 당업계에 공지된 표준 투여량 고려사항 및 기준은 요구되는 분비 물질의 양을 결정하는데 사용될 것이다. 고려되는 인자는 수용자의 크기 및 중량; 세포의 생산성 또는 기능 수준; 및 적절한 경우, 기능이 대체되거나 증가되는 기관 또는 조직의 표준 생산성 또는 대사 활성을 포함한다. 한 분획의 세포는 면역격리 및 이식 절차를 유지시키지 못할 수 있음을 고려하는 것이 또한 중요하다. 더욱이, 수용자가 이식물의 효능을 방해할 수 있는 이미 존재하는 조건을 가지고 있는지 여부가 또한 고려되어야 한다. 수천개의 세포를 함유하는 본 발명의 장치가 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 현재 안구 임상 장치는 200,000 내지 750,000개의 세포를 함유하는 반면, 마이크로화 장치는 10,000 내지 100,000개의 세포를 함유할 것이다. 다른 대규모 장치는 1,000,000 내지 100,000,000개의 세포를 함유할 수 있다.
캡슐화된 세포 요법은 숙주 내 이식 이전에 반투과성 생체적합성 물질로 세포를 둘러쌈으로써 세포를 수용 숙주의 면역계로부터 단리시키는 개념에 기초한다. 예를 들어, 본 발명은 유전자 조작된 ARPE-19 세포가, 수용 숙주 내로의 이식시 장치의 코어내 ARPE-19 세포에 대한 숙주의 면역계의 유해한 효과를 최소화시키는 면역격리성 캡슐에 캡슐화되어 있는 것인 장치 (예컨대, 동결보존된 장치)를 포함한다. ARPE-19 세포는 미세다공성 막에 의해 형성된 이식형 중합체성 캡슐 내에서 그를 내장화시킴으로써 숙주로부터 면역격리된다. 이러한 접근법은 숙주와 이식된 조직 사이의 세포 대 세포 접촉을 막고, 이로써 직접 제시를 통한 항원 인식을 제거한다.
본원에 기술된 장치에 의해 분비된 생물학적 활성 분자(들) 중 임의의 것은 (단독 또는 임의의 조합으로) 안구내로 (예컨대, 전안방 및 유리체강), 안구주위로 (예컨대, 테논낭내 또는 그 아래), 또는 그 둘 다에 전달될 수 있다. 본 발명의 장치는 또한 각종 안과 장애, 안과 질환 및/또는 안구 효과를 가지는 다른 질환을 치료하기 위해 생물학적 활성 분자를 조절식으로 지속적으로 방출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 용도에 따른 많은 병태 치료를 위해서는 적절한 치료 투여량을 공급하는 데 눈마다 단 하나, 또는 최대로 50개 미만의 이식형 장치가 필요할 것이다.
안구내 (예컨대, 유리체내) 또는 안구주위 (예컨대, 테논낭하 공간 또는 영역)는 생물학적 활성 분자(들)의 전달을 허용한다. 1일 환자 1명당 눈마다 치료 투여량은 0.1 pg 내지 10,000 ㎍ (예컨대, 0.1 pg 내지 5,000 ㎍; 0.1 pg 내지 2,,500 ㎍; 0.1 pg 내지 1,,000 ㎍; 0.1 pg 내지 ,500 ㎍; 0.1 pg 내지 250 ㎍; 0.1 pg 내지 100 ㎍; 0.1 pg 내지 50 ㎍; 0.1 pg 내지 25 ㎍; 0.1 pg 내지 10 ㎍; 0.1 pg 내지 5 ㎍; 0.1 pg 내지 100 ng; 0.1 pg 내지 50 ng; 0.1 pg 내지 25 ng; 0.1 pg 내지 10 ng; 또는 0.1 pg 내지 5 ng)인 것이 고려된다. 한 비-제한적인 일례로, 치료량은 눈에서 적어도 0.5-50 ㎍/ml 항정 상태이다. 적합한 치료량은 예를 들어, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ug, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 10 ㎍, 11 ㎍, 12 ㎍, 13 ㎍, 14 ㎍, 15 ㎍, 16 ㎍, 17 ㎍, 18 ㎍, 19 ㎍, 20 ㎍, 21 ㎍, 22 ㎍, 23 ㎍, 24 ㎍, 25 ㎍, 26 ㎍, 27 ㎍, 28 ㎍, 29 ㎍, 30 ㎍, 31 ㎍, 32 ㎍, 33 ㎍, 34 ㎍, 35 ㎍, 36 ㎍, 37 ㎍, 38 ㎍, 39 ㎍, 40 ㎍, 41 ㎍, 42 ㎍, 43 ㎍, 44 ㎍, 45 ㎍, 46 ㎍, 47 ㎍, 48 ㎍, 49 ㎍, 50 ㎍, 51 ㎍, 52 ㎍, 53 ㎍, 54 ㎍, 55 ㎍, 56 ㎍, 57 ㎍, 58 ㎍, 59 ㎍, 60 ㎍, 61 ㎍, 62 ㎍, 63 ㎍, 64 ㎍, 65 ㎍, 66 ㎍, 67 ㎍, 68 ㎍, 69 ㎍, 70 ㎍, 71 ㎍, 72 ㎍, 73 ㎍, 74 ㎍, 75 ㎍, 76 ㎍, 77 ㎍, 78 ㎍, 79 ㎍, 80 ㎍, 81 ㎍, 82 ㎍, 83 ㎍, 84 ㎍, 85 ㎍, 86 ㎍, 87 ㎍, 88 ㎍, 89 ㎍, 90 ㎍, 91 ㎍, 92 ㎍, 93 ㎍, 94 ㎍, 95 ㎍, 96 ㎍, 97 ㎍, 98 ㎍, 99 ㎍, 100 ㎍, 150 ㎍, 200 ㎍, 250 ㎍, 300 ㎍, 350 ㎍, 400 ㎍, 450 ㎍, ,500 ㎍, 550 ㎍, 600 ㎍, 650 ㎍, 700 ㎍, 750 ㎍, 800 ㎍, 850 ㎍, 900 ㎍, 950 ㎍, 1,000 ㎍, 1,500 ㎍, 2,000 ㎍, 2,500 ㎍, 3,000 ㎍, 3,500 ㎍, 4,000 ㎍, 4,500 ㎍, 5,000 ㎍, 5,500 ㎍, 6,000 ㎍, 6,500 ㎍, 7,000 ㎍, 7,500 ㎍, 8,000 ㎍, 8,500 ㎍, 9,000 ㎍, 9,500 ㎍, 10,000 ㎍을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포주 및 장치는 3개월 이상의 기간 동안 상기 치료량을 발현할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태에 의해 치료될 수 있는 안과 장애로는 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 증식성 망막병증, 망막 혈관 질환, 혈관 이상, 연령-관련 황반 변성 및 다른 후천적 장애, 안내염, 감염성 질환, 염증성이지만 비-감염성인 질환, AIDS-관련 장애, 안구 허혈 증후군, 임신-관련 장애, 말초 망막 변성, 망막 변성, 독성 망막병증, 망막 종양, 맥락막 종양, 맥락막 장애, 유리체 장애, 망막 박리 및 증식성 유리체 망막병증, 비-관통 외상, 관통 외상, 백내장후 합병증 및 염증성 시신경병증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
연령-관련 황반 변성은 습성 및 건성 연령-관련 황반 변성, 삼출성 연령-관련 황반 변성, 및 근시성 변성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다는 것을 당업자는 이해할 것이다
일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 장애는 습성 형태의 연령-관련 황반 변성 또는 당뇨병성 망막병증이다. 본 발명은 다수의 안구 질환 및 장애와 관련된 병태인 안구 신생혈관 형성 치료에도 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 망막 허혈-관련 안구 신생혈관 형성은 당뇨병 및 다수의 다른 질환에서 실명의 주요 원인이 된다.
본 발명의 세포주 및 동결보존된 장치는 또한 안구 증상 및 비-안구 증상 둘 다를 갖는 질환 또는 병태로부터 유래하는 안구 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 예는 AIDS 및 다른 병태 및 유리체 장애에서의 시토메갈로바이러스 망막염; 임신 결과 망막에서의 고혈압 변화; 및 다양한 감염성 질환, 예컨대 결핵, 매독, 라임병, 기생충성 질환, 톡소카라 카니스, 눈구더기증, 낭미충증 및 진균 감염의 안구 효과를 포함한다.
장치 및 세포주는 또한 다른 안구내 신생혈관화-기반 질환과 관련된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 신생혈관화는 질환, 예컨대 당뇨병성 망막병증, 중심 망막 정맥 폐쇄 및 가능하게는 연령-관련 황반 변성에서 발생할 수 있다. 각막 신생혈관화는 시각을 방해하고 환자가 각막 이식 실패에 취약하도록 하기 때문에 주요 문제점이다. 심한 시각 상실의 대부분은 안구 신생혈관화를 초래하는 장애와 연관된다.
본 발명은 또한 세포 증식성 장애, 예를 들어 혈액 장애, 아테롬성동맥경화증, 염증, 증가된 혈관 투과성, 및 안구 환경 내부 또는 신체 내의 목적하는 표적화 위치의 외부에 있는 악성종양을 치료하기 위해 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자(들)의 전달 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 장치 및 기술의 사용은 다른 전달 경로를 능가하는 여러 이점을 제공한다: 생물학적 활성 분자(들)는 직접적으로 눈에 전달될 수 있어서 원치않는 말초 부작용을 감소시키거나 최소화하고, 국소 적용과 비교해서 매우 적은 용량 (즉, 밀리그램 보다는 나노그램 또는 적은 마이크로그램의 양)의 생물학적 활성 분자(들)이 전달됨으로써 잠재적으로 부작용도 줄여준다. 더욱이, 생존 세포가 새롭게 합성된 생물학적 활성 분자(들)를 계속해서 생산하기 때문에, 상기 기술은 생물학적 활성 분자(들)의 주사 전달 (여기서 용량은 주사들 간에 크게 변동하고, 생물학적 활성 분자(들)는 계속적으로 분해되지만 계속적으로 보충되지 않음) 보다 우수할 것이다.
생물학적 활성 분자(들)를 분비하도록 유전자 조작된 생존 세포 및 세포주가 본 발명의 장치에서 캡슐화되고, 눈의 임의의 적절한 해부학 구조 내로 (구후 마취 하에) 외과적으로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 장치는 눈의 유리체 내에 외과적으로 삽입될 수 있으며, 여기서 장치는 제거에 도움을 주기 위해 공막에 테더링될 수 있다. 장치는 바람직한 예방 또는 요법을 달성하는 것이 필요한 한 유리체에 남아 있을 수 있다. 예를 들어, 바람직한 요법은 뉴런 또는 광수용체 생존 또는 복구의 촉진, 또는 망막 또는 맥락막 신생혈관화의 억제 및/또는 역전, 뿐만 아니라 포도막, 망막 및 시신경 염증의 억제를 포함할 수 있다. 유리체 배치에 의해, 생물학적 활성 분자(들)는 망막 또는 망막 색소 상피 (RPE)에 전달될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포-로딩된 장치는 테논낭으로서 공지된 공간 내에 또는 하에 안구주위로 이식되며, 이는 유리체로의 이식보다 덜 침습적이다. 따라서, 유리체 출혈 및/또는 망막 박리와 같은 합병증이 잠재적으로 제거된다. 이러한 투여 경로는 또한 본원에 기재된 생물학적 활성 분자(들)를 RPE 또는 망막에 전달할 수 있다. 안구주위 이식은 맥락막 신생혈관화 및 시신경과 포도막의 염증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 안구주위 이식 부위로부터의 전달은 생물학적 활성 분자(들)를 맥락막 혈관계, 망막 혈관계 및 시신경으로 순환시킬 것이다.
본원에 기재된 장치 및 방법을 사용하여, 생물학적 활성 분자(들), 예컨대 항혈관신생 항체-스캐폴드 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 PDGF 수용체를 맥락막 혈관계 (안구주위) 또는 유리체 (안구내)로 직접 전달하는 것은, 선행 기술 치료 방법 및 장치와 연관된 문제를 감소시키거나 완화할 수 있고, 덜 정의되어 있거나 불가사의한 맥락막 신생혈관화의 치료를 가능케 할 수 있을 뿐만 아니라, 보조 또는 유지 요법을 통해 재발성 맥락막 신생혈관화를 감소시키거나 예방하는 방식을 제공할 수 있다.
해동 후, 본 발명의 동결보존된 생체적합성 장치의 이식은 멸균 조건 하에서 수행된다. 장치는 시린지 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 이식될 수 있다. 일반적으로, 장치는 수용자에게 분비 생성물 또는 기능을 적절하게 전달해 주고 이식된 세포 또는 조직에 영양소를 적절하게 전달해 주며 또한 회수 및/또는 대체를 위해 장치에의 접근을 허용해 줄 수용자 신체 부위에 이식된다. 수많은 다른 이식 부위가 고려된다. 이들에는 예를 들어 방수, 유리체액, 테논낭하, 안구주위 공간 및 전안방이 포함된다. 면역학적으로 특권을 가지지 않은 이식 부위, 예컨대 안구주위 부위 및 전안방 (방수) 및 후안방 (유리체) 밖의 다른 구역의 경우, 캡슐은 면역격리성이다.
세포는 이식 전후 둘 다에 적당히 장치 기능 내에 고정되어 있음을 검증하는 것이 바람직하다. 당업계에 널리 공지된 임의의 검정 또는 진단 시험이 이러한 목적에 사용될 수 있다. 예를 들어, ELISA (효소-연계 면역흡착 검정), 크로마토그래피 또는 효소적 검정, 또는 분비된 생물학적 활성 분자(들)에 특이적인 생물검정이 사용될 수 있다. 원하는 경우에, 이식물의 분비 기능은 수용자로부터 적절한 샘플 (예를 들어, 혈청)을 수집하고 그들을 검정함으로써 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이며, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 장치 특성화 및 이식 결과
세포주 안정성 연구
재조합 세포주의 제조성에 대한 한가지 기준은 클론 증식에 의한 생산성의 한계이다. 클론 세포의 40회 생성의 성장 및 생산성 분석은 생산량 안정성을 확인시켜주고 마스터 세포 뱅크 (계대 ~17) 및 작업 세포 뱅크 (계대 ~23)의 생성에 대한 충분한 정보를 공급한다는 것이 계산되었다. 한 작업 세포 뱅크는 적어도 100,000,000개의 장치의 제조에 대해 충분하다고 계산된다. p834-10-5 세포주의 연속 계대는 조직 배양에서 40회 생성에 대한 안정성을 나타내었고, 이때 검정된 시점의 세트에 대해 평균 생산량이 10.4 pcd (피코그램/세포/일)이었다. (도 2 참조).
장치 생산량 시간경과 연구
p834-10-5 세포주를 연구 세포 뱅크 분취액으로부터 증식시켰고, 장치 충전 전에 증식시켰다. 폴리술폰 반투과성 막으로 구축되고 세포 부착을 위한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 실로 충전된 벽을 갖는 6 mm ECT 장치 내로의 주사에 의해 세포를 캡슐화하였다. 개별적으로 영양 배지를 갖는 밀봉 용기의 주요 패키징에 장치를 배치시키고, 10주 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 유지의 시간 과정 동안, ECT 장치에서 패키징으로부터의 제거 및 ELISA에 의한 p834-10-5 단백질 분비 검정에 의해 재조합 단백질 생산량을 주기적으로 조사하였다. 결과는 p834-10-5 단백질의 480 ng/장치/일의 초기 장치 생산량을 나타내었고, 이는 6주 후에 ~60 ng/장치/일의 기준선 생산량으로 점차 감소하였다. 도 3에서, 2개 장치의 조직 절편은 내부적으로 강력한 834-10-5 세포 성장을 나타내며, 이는 1개월 장치 배양을 통한 높은 생존능을 입증한다.
p834 VEGFR 구축물을 분비하도록 유전자 조작된 ARPE-19 세포를 함유하는 장치는 이식 1 및 3개월 후에 탁월한 안전성 프로파일을 보였다. 더욱이, 이러한 장치 ("NT-503 장치")는 이식 1 및 3개월 후에 생체내에서 안정하였다.
표 1은 이러한 NT-503 장치에 대한 PK 데이터를 보여준다:
Figure pct00004
표 2는 NT-503 장치 보관 안정성의 결과를 보여준다:
Figure pct00005
NT-503 장치에 대해 시험관내 장치 생산량 및 생체내 성능 (유리체 수준에 대해 측정됨) 둘 다는 안정하게 유지되었다. 더욱이, 시험관내 유지 기간의 평가 및 이식된 NT-503 장치의 상응하는 생체내 성능은 최대 4주 지속기간의 보관 수명 안정성을 입증하였다.
최종적으로, 가능한 경우, NT-503 장치의 보관 수명을 4주 초과로 연장하기 위한 지속적인 노력이 이루어질 것이다 (즉, 본 발명에 따라 장치를 동결보존하는 것에 의함).
실시예 2: 동물 연구
패키징 4 주 후에, 장치를 비-면역억제 뉴질랜드 백색 토끼 눈에 이식하였다. 이식 후 1 개월 및 3개월 후에 p834-10-5 생산량을 결정하기 위해, 동물을 핵제거하였고, p834-10-5의 농도를 추출된 유리체로부터 정량하여 체외이식된 장치 생산성과 비교하였다. 이식 1개월 후에, 체외이식된 장치는 100 ng/ml/일 초과의 p834-10-5 단백질을 생산하였고, 이때 정상-상태의 유리체 농도는 250 ng/ml 초과이었다. 이식 3개월 후에, 체외이식된 장치는 계속해서 200 ng/ml 초과로 생산한 반면, 유리체 농도는 700 ng/ml 초과로 검출되었다. (표 3 참조). 1년 후에, 토기 유리체 샘플은 350 ng/ml p834-10-5 단백질을 함유하였고, 이는 12개월의 과정에 걸쳐 재조합 수용체의 계속적인 생산을 입증하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 이식 3개월 후의 체외이식된 장치의 조직학은 도 3에 도시된 용기-유지 장치로부터의 샘플에서 관찰된 세포 형태학과 유사한 강력한 세포 성장을 나타내었다. 수의학 안과의사에 의해 주기적으로 검사된 바와 같이, 처리된 토끼의 눈에서 어떤 임상적으로 유의한 유해 사례도 는 관찰되지 않았다.
Figure pct00006
실시예 3: 반복적 유전자 투여는 재조합 단백질 생산을 증가시킨다
특히 p834 cDNA의 유전자 투여량을 증가시키는데 반복적 형질감염을 사용하였다. 동일한 834 cDNA를 갖는 3개의 발현 플라스미드를 생산하였다: p834 pCpG 비트로 프리 (블라스티시딘 내성), p910 pCpG 비트로 프리 (네오마이신 내성) 및 p969 pCpG 비트로 프리 (히그로마이신 내성). p910을 블라스티시딘 내성 p834-10-5 세포주 내로 형질감염시키고, 생성된 이중 구성요소 클론을 네오마이신 선택의 적용에 의해 회수하고, p834-10-5의 PCD 생산량 수준을 초과하는 서브클론을 단리하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 초기 1회 ("1x") 형질감염은 상기 언급된 p834-10-5 세포주를 산출하였고, 이때 네이키드 세포 생산량 수준 (Fc ELISA)은 15-20 PCD 이었다. 모 834-10-5 클론으로부터의 p910 클론의 형질감염 및 선택은 910 (834-10-5)-4-47 클론을 산출하였고, 이때 생산량 수준은 35-40 PCD이었다. 910 (834-10-5)-4-47 서브클론으로의 p969의 반복적 형질감염 및 선택은 수많은 히그로마이신 내성 p969 유래 클론을 산출하였고, 이때 재조합 단백질의 초기 단리물 분비 수준은 50 PCD 내지 > 100 PCD의 범위이었다. 3개의 유전자 통합 사례 모두로부터의 발현의 유지를, 블라스티시딘, 히그로마이신 및 네오마이신 배양 배지 각각에서 969개의 클론 세포주의 배양에 의해 확인하였다. 재조합 단백질을 플레이트 결합된 VEGF에 직접 결합시킨 후 항-인간 Fc를 사용하여 검출하는 것을 토대로 하는 ELISA 검정에 의해 결정된 바와 같이 효능의 최소 손실을 입증한 삼중 형질감염 클론이 존재하였다. 놀랍게도, 3 x 형질감염을 기준으로 유전자 투여량의 단순 산술 가산보다 최대 8배 더 높은 값의 재조합 단백질이 검출되었으며, 이는 예상치 못한 상승작용적 생물 선택이 일련의 형질감염 (예를 들어, 반복적 형질감염 과정을 사용)에 의해 증가하는 유전자 투여량과 관련됨을 시사한다.
실시예 4: 반복적으로 감염된 세포주에 의한 용량 증량의 전임상 연구
실시예 2에서의 방법 후, 이중 형질감염체 세포주 910(834-10-5)-4-47 및 삼중 형질감염체 세포주 969(910(834-10-5)-4-47)-33을 사용하여 ECT 장치를 생성시킨 후, 토끼 내에 이식하였다. 이식 1달 후에, 토끼를 제핵하고, 유리체를 추출하여 834 단백질의 수준을 정량하였다. 동시에, 장치를 외과적으로 제거하고, 체외이식된 장치를 세포 성장 배지 중에서 추가로 배양하여 재조합 단백질의 장치 생산성을 확인하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 910 및 969-장치로부터의 생산량은 834 단일 형질감염 단백질에서 관찰된 것 보다 각각 거의 5배 및 10배 더 큰 수준의 834 단백질의 정상-상태 유리체 수준을 초래하였다 (표 4). 세포주 PCD 생산량 데이터와 일관되게, 일련의 형질감염된 유전자 용량의 단순 부가 효과에 의해 예상되는 것보다 더 높은 정상 상태 농도의 834 단백질이 생체내에서 관찰되었으며 (표 5 대 표 3), 이는 다시 반복적 형질감염 방법론으로 인한 상승작용적 분비 증진의 예상치 못한 상승작용적 생물 선택을 시사한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 5: 캡슐화된 세포의 동결보존
910(834-10-5)-4-47 세포를 T-175 플라스크 당 3 x 106개의 세포로 시딩하여 DMEM + 10% FCS에서 증식시켰다. 5% CO2 및 37℃ 습도 제어 인큐베이터 내에서 3일 성장시킨 후, 세포를 트립신처리하고, 동결보호제로서 10 mM 글루타맥스 및 10% 글리세롤이 보충된 하이클론 SFM4 MegaVir 배지 내 100,000개 세포/μl로 재현탁시켰다.
세포는, 8 mm ECT 장치에 1 x 106개의 세포를 로딩한 후 완전히 캡슐 폐쇄하여 캡슐화하였다. 총 18개의 ECT 장치를 제조하였다. 이어서, ECT 장치를 1 ml 동결 배지와 또한 동결보호제를 함유하는 2 ml 극저온 바이알에 넣었다. 이어서, ECT 장치를 함유하는 극저온 저장 바이알을, 1℃/분의 속도로 제어되는 속도 동결 용기 (미스터 프로스티(Mr. Frosty) 또는 쿨 쎌(Cool Cell))를 이용하여 -80℃의 온도로 동결시켰다. 2 일 후에, 극저온 바이알을 -80℃로부터 제거하고, 기상 하액체 질소 저장으로 즉시 넣었다.
극저온 보존된 이식물을 동결보존 1주 및 1개월 및 1년 후에 평가하였다. 각 시점에, 극저온 바이알을 증기 액체 질소 저장으로부터 제거하고, ECT 장치를 37 ml의 하이클론 SFM4 MegaVir 배지에 넣고, 표준 조직 배양 조건 하에 유지시켰다. 6 일 후에, ECT 장치를 CCK-8 비색 검정을 사용하여 세포 전면생장률에 대해 검정하고, VEGFR 생산량을 Fc ELISA에 의해 측정하였다. 이후, ECT 장치를 고정시키고, 세포 성장 품질의 검사를 위해 조직 절편을 염색하였다. 동결보호제 부재 하의 세포의 동결은 세포 사멸 (도 7b) 및 장치로부터의 VEGFR 분비의 부재 (도 8a)를 유도하였다. 동결보존된 세포는 정상 배양 ECT 장치 (도 7a)와 동일한 강력한 성장 (도 7c, 7d, 7e) 및 보존 시점 1주, 1개월 및 1년 후 각각에서 VEGFR의 높은 발현 (도 8a, 8b, 8c)을 나타내었다. 종래의 환경 제어 조건 하에 저장된 이식물과 비교하여 극저온 보존된 이식물의 세포 생존능, 분포 및 VEGFR 분비는 예상된 수준이었다.
등가물
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세한 내용은 상기 첨부된 상세한 설명에 기술되어 있다. 비록 본 발명의 실시 또는 시험에서 본원에 기술된 것과 유사하거나, 등가인 임의의 방법 및 물질이 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 단수 형태는 복수의 지시 대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 공개문헌은 참조로 포함된다.
상기 상세한 설명은 단지 예시목적으로 제공된 것이며, 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이러한 제한은 첨부된 특허청구범위에 의해서 이루어지는 것이다.

Claims (60)

  1. a) (i) 1회 형질감염, 2회 형질감염 또는 3회 형질감염을 포함하는 반복적 형질감염 과정에 의해 ARPE-19 세포 내로 도입되는 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하도록 유전자 조작된 ARPE-19 세포를 포함하는 세포주,
    (ii) 적어도 10,000 ng/일/106개 세포인 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하도록 유전자 조작된 ARPE-19 세포를 포함하는 세포주, 또는
    (iii) 치료 유효량의 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 분비하도록 유전자 조작된 ARPE-19 세포
    를 포함하는 코어, 및
    b) (i)에서의 세포주, (ii)에서의 세포주, 또는 (iii)에서의 ARPE-19 세포를 둘러싸며, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자의 확산을 허용하는 반투과성 막
    을 포함하며, 동결보존되는 이식형 세포 배양 장치.
  2. 제1항에 있어서, 코어가 동결보호제를 포함하는 것인 장치.
  3. 제2항에 있어서, 극저온 저장 바이알 내에 배치되고, 동결 속도 제어하에 동결되고, 최종적으로 기상 액체 질소 (-190℃) 조건에서 저장되는 장치.
  4. 제3항에 있어서, 기상 액체 질소 (-190℃) 조건하에서, 드라이아이스 (-70℃) 조건하에서, 또는 이들의 조합 조건하에서 수송되는 장치.
  5. 제1항에 있어서, 반복적 형질감염이 1회 형질감염일 때, (i)에서의 세포주가 10,000 내지 30,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  6. 제5항에 있어서, (i)에서의 세포주가 약 15,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  7. 제1항에 있어서, 반복적 형질감염이 2회 형질감염일 때, (i)에서의 세포주가 30,000 내지 50,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  8. 제7항에 있어서, (i)에서의 세포주가 약 35,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  9. 제1항에 있어서, 반복적 형질감염이 3회 형질감염일 때, (i)에서의 세포주가 50,000 내지 75,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  10. 제9항에 있어서, (i)에서의 세포주가 약 70,000 ng/일/106개 세포의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 생산하는 것인 장치.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 뉴로트로핀, 인터류킨, 시토카인, 성장 인자, 항아폽토시스 인자, 혈관신생 인자, 항혈관신생 인자, 항체 및 항체 단편, 항원, 신경전달물질, 호르몬, 효소, 림포카인, 항염증 인자, 치료 단백질, 유전자 전달 벡터 및 이들의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), NT-4, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 악소킨(Axokine), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF II), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGF α), 형질전환 성장 인자 β (TGF β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 미드카인(Midkine), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 트리오포틴, 액티빈, 티로트로핀 방출 호르몬, 인터류킨, 골 형태발생 단백질, 대식세포 염증성 단백질, 헤파린 술페이트, 암피레귤린, 레티노산, 종양 괴사 인자 α, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), PEDF, LEDGF, NTN, 뉴블라스틴(Neublastin), VEGF 억제제, 및 잠재적인 표적 조직에 대해 치료상 유용한 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  13. 제1항에 있어서, 코어가 0.5-1.0 x 106개의 ARPE-19 세포를 함유하는 것인 장치.
  14. 제1항에 있어서, 코어가 반투과성 막 내에 배치된 매트릭스를 추가로 포함하는 것인 장치.
  15. 제14항에 있어서, 매트릭스가 다수의 모노필라멘트를 포함하고, 상기 모노필라멘트가
    a. 실로 꼬여 있거나 메쉬로 엮여 있거나, 또는
    b. 비-직조 가닥인 실로 꼬여 있고,
    세포가 그 위에 분포되어 있는 것인 장치.
  16. 제15항에 있어서, 모노필라멘트가 아크릴, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아세토니트릴, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 나일론, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리부테스터, 실크, 코튼, 키틴, 탄소 및 생체적합성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 물질을 포함하는 것인 장치.
  17. 제15항에 있어서, 모노필라멘트가 장치의 내부 부피의 40-85%를 차지하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 섬유를 포함하는 것인 장치.
  18. 제1항에 있어서, 테더 앵커를 추가로 포함하는 장치.
  19. 제18항에 있어서, 테더 앵커가 앵커 루프를 포함하는 것인 장치.
  20. 제19항에 있어서, 앵커 루프가 장치를 안구 구조에 고정시키도록 적합화되는 것인 장치.
  21. 제1항에 있어서, 눈이나 또는 비장, 귀, 심장, 결장, 간, 신장, 유방, 관절, 골수, 피하 및 복막 공간으로 이루어진 군으로부터 선택된 또 다른 표적 영역 내로 이식되는 장치.
  22. 제21항에 있어서, 눈의 유리체, 방수, 테논낭하(Subtenon) 공간, 안구주위 공간, 후안방 또는 전안방에 이식되는 장치.
  23. 제1항에 있어서, 반투과성 막이 선택투과성, 면역보호성 막을 포함하는 것인 장치.
  24. 제1항에 있어서, 반투과성 막이 한외여과 막 또는 마이크로여과 막을 포함하는 것인 장치.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 반투과성 막의 기공 크기 중간값이 100 nm인 장치.
  26. 제1항에 있어서, 반투과성 막이 비-다공성 막 물질을 포함하는 것인 장치.
  27. 제26항에 있어서, 비-다공성 막 물질이 히드로겔 또는 폴리우레탄인 장치.
  28. 제1항에 있어서, 반투과성 막의 공칭 분자량 컷오프 (MWCO)가 50 내지 500 kD인 장치.
  29. 제1항에 있어서, 반투과성 막의 두께가 90 내지 120 ㎛인 장치.
  30. 제1항에 있어서, 중공 섬유 또는 편평 시트로 구성되는 장치.
  31. 제1항에 있어서, 길이가 1 mm 내지 20 mm인 장치.
  32. 제1항에 있어서, 내부 직경이 0.1 mm 내지 2.0 mm인 장치.
  33. 제1항에 있어서, 말단이 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉되는 것인 장치.
  34. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자를 공동-전달시키는 장치.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자가 비-세포 공급원으로부터의 것인 장치.
  36. 제34항에 있어서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자가 세포 공급원으로부터의 것인 장치.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 분자가 코어에서 하나 이상의 유전자 조작된 ARPE-19 세포에 의해 생산되는 것인 장치.
  38. 제1항에 있어서,
    a. 코어가 0.5-1.0 x 106개의 ARPE-19 세포를 포함함;
    b. 장치의 길이가 1 mm 내지 20 mm임;
    c. 장치의 내부 직경이 0.1 내지 2.0 mm임;
    d. 장치의 말단이 메틸 메타크릴레이트를 사용하여 밀봉됨;
    e. 반투과성 막의 기공 크기 중간값이 약 100 nm임;
    f. 반투과성 막의 공칭 분자량 컷오프 (MWCO)가 50 내지 500 kD임;
    g. 반투과성 막의 두께가 90 내지 120 ㎛임;
    h. 코어가 내부 스캐폴드를 포함하고, 상기 스캐폴드가 장치의 내부 부피의 40-85%를 차지하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 섬유를 포함함; 및
    i. 이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가의 특징을 추가로 포함하는 장치.
  39. 제38항에 있어서, 상기 추가의 특징들 중 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모두를 포함하는 장치.
  40. 해동 이후 대상체의 눈에 적어도 100 ng/일/눈인 적절한 치료 용량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 전달하기 위한, 제1항의 장치의 용도.
  41. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 환자의 눈 내로 장치를 이식시키고, c) 장치로부터 하나 이상의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 확산되어 눈에서 VEGF, PDGF, 또는 VEGF 및 PDGF 둘 다에 결합할 수 있게 함으로써 안과 장애를 치료하는 것을 포함하는, 안과 장애를 치료하는 방법.
  42. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 환자의 눈 내로 장치를 이식시키고, c) 장치로부터 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자가 확산되게 함으로써 안과 장애를 치료하는 것을 포함하는, 안과 장애를 치료하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 안과 장애가 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 녹내장, 색소성 망막염, 백내장 형성, 망막모세포종 및 망막 허혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 연령-관련 황반 변성이 습성 형태의 연령-관련 황반 변성 (AMD) 또는 위축성 AMD인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 안과 장애가 당뇨병성 망막병증인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 1일 환자 1명당 눈마다 0.1 pg 내지 10,000 ㎍의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 눈 내로 확산되고, 상기 가용성 수용체는 가용성 VEGF 수용체 또는 가용성 PDGF 수용체인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 1일 환자 1명당 눈마다 0.1 pg 내지 10,000 ㎍의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 및 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자가 눈 내로 확산되는 것인 방법.
  48. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 세포 증식 장애를 앓는 환자 내로 장치를 이식시키고, c) 장치로부터 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 확산되어 VEGF, PDGF, 또는 VEGF 및 PDGF 둘 다에 결합할 수 있게 함으로써 이러한 결합이 환자에서의 내피 세포 증식 또는 혈관화를 억제시키는 것을 포함하는, 내피 세포 증식 또는 혈관화를 억제시키는 방법.
  49. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 세포 증식 장애를 앓는 환자 내로 장치를 이식시키고, c) 장치로부터 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자가 확산되게 하여 환자에서의 내피 세포 증식 또는 혈관화를 억제시키는 것을 포함하는, 내피 세포 증식 또는 혈관화를 억제시키는 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 장애가 혈액 장애, 아테롬성동맥경화증, 염증, 증가된 혈관 투과성 및 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 가용성 수용체 또는 항혈관신생 항체 및 분자가 장치로부터 확산되는 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자가 장치로부터 확산되는 것인 방법.
  53. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 수용 숙주의 표적 영역 내로 장치를 이식시키며, 이때 하나 이상의 캡슐화된 ARPE-19 세포가 표적 영역에서 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 분비하는 것을 포함하는, 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 수용 숙주에게 전달하는 방법.
  54. a) 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 해동시키고, b) 수용 숙주의 표적 영역 내로 장치를 이식시키며, 이때 하나 이상의 캡슐화된 ARPE-19 세포가 표적 영역에서 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 분비하는 것을 포함하는, 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 수용 숙주에게 전달하는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 표적 영역이 뇌, 뇌실, 척수를 포함한 중추 신경계, 눈의 방수 및 유리체액, 비장, 귀, 심장, 결장, 간, 신장, 유방, 관절, 골수, 피하 및 복막 공간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자가 표적 영역 내로 확산되는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 1일 환자 1명당 치료 유효량의 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 표적 영역 내로 확산되는 것인 방법.
  58. a. 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자를 분비하도록 하나 이상의 ARPE-19 세포를 유전자 조작하고;
    b. 상기 유전자 변형된 ARPE-19 세포를 하나 이상의 시토카인, 신경영양 인자, 가용성 수용체, 항혈관신생 항체 및 분자, 또는 생물학적 활성 분자의 확산을허용하는 반투과성 막 내에 캡슐화하고;
    c. 장치를 동결보존하는 것
    을 포함하는, 제1항의 이식형 세포 배양 장치를 제조하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 뉴로트로핀, 인터류킨, 성장 인자, 항아폽토시스 인자, 혈관신생 인자, 항혈관신생 인자, 항체 및 항체 단편, 항원, 신경전달물질, 호르몬, 효소, 림포카인, 항염증 인자, 치료 단백질, 유전자 전달 벡터 및 이들의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), NT-4, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 악소킨, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF I), 인슐린-유사 성장 인자 II (IGF II), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGF α), 형질전환 성장 인자 β (TGF β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 미드카인, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 트리오포틴, 액티빈, 티로트로핀 방출 호르몬, 인터류킨, 골 형태발생 단백질, 대식세포 염증성 단백질, 헤파린 술페이트, 암피레귤린, 레티노산, 종양 괴사 인자 α, 섬유모세포 성장 인자 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), PEDF, LEDGF, NTN, 뉴블라스틴, VEGF 억제제, 및 잠재적인 표적 조직에 대해 치료상 유용한 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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