ES2206520T3 - Dispositivo al vacio para la separacion de liquidos biologicos. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE RELACIONA CON UN ANALISIS DE FLUIDOS CORPORALES PARA SEPARAR CELULAS U OTROS COMPONENTES DE FLUIDOS CORPORALES PARA SU ANALISIS APROPIADO. HASTA AHORA, ESTE ANALISIS DE SANGRE, HA REQUERIDO UNA HABILIDAD Y UN CUIDADO CONSIDERABLES EN LA PREPARACION DE LA MUESTRA DE SANGRE, Y EN OTRAS AREAS, COMO EL ANALISIS DE LA ANORMALIDAD FETAL, HA LLEVADO CONSIGO TECNICAS INVASORAS, QUE INCOMODAN FRECUENTEMENTE A LA MADRE. EL OBJETIVO DE ESTA INVENCION ES SUPERAR ESTOS INCONVENIENTES Y SE LOGRA POR UN MEDIO QUE COMPRENDE AL MENOS UNA CAMARA PRIMERA, UN FILTRO DE COOPERACION QUE SE EXTIENDE POR LA O CADA CAMARA PRIMERA, AL MENOS UNA CAMARA SEGUNDA QUE COOPERA RESPECTIVAMENTE CON LA AL MENOS UNA CAMARA PRIMERA, Y UNA O LAS DOS DE LAS CAMARAS PRIMERAS Y SEGUNDA QUE TIENEN UNA CONEXION CON VACIO.

Description

Dispositivo al vacío para la separación de líquidos biológicos.

La presente invención está relacionada con el análisis de fluidos corporales, ocupándose en particular de la separación de la sangre en varios de sus componentes para permitir la realización de una variedad de tests, y con la separación de otros fluidos corporales como médula ósea, esperma / plasma seminal, orina y saliva.

Hasta la fecha, en el campo de la hematología y otras áreas relacionadas como la terapia génica y la patología forense, así como en otros campos tales como la determinación del potencial de fertilización del esperma y la separación de células de la médula ósea, se han requerido aparatos y procedimientos complejos y caros, así como una considerable habilidad del operador para separar correctamente los componentes de un determinado fluido corporal. Esto ha ocurrido particularmente con la sangre, con la consiguiente necesidad de una minuciosa preparación de la muestra de la misma.

Otras áreas como el análisis y revisión de fetos por una o más posibles anomalías se han llevado a cabo hasta el momento predominantemente mediante técnicas invasivas, con frecuentes molestias para la madre.

EP 298 513 A1 presenta una unidad de filtración para muestras biológicas en la que el líquido filtrado se obtiene en un recipiente herméticamente cerrado que no puede ser abierto por ninguno de sus extremos.

WO 92/17110 presenta una unidad de filtración para el análisis de orina y otras muestras biológicas que consta de una cámara de recepción de la muestra, un filtro adaptado para la retención de partículas, un filtro adaptado para la retención de bacterias y una cámara de recepción de residuos.

El objetivo de la invención es proporcionar un equipo de notable simplicidad y un coste relativamente bajo, cuyos procedimientos se adapten a las aptitudes de los miembros más inexpertos del laboratorio para permitir la separación de un fluido corporal en varios de sus componentes.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, un medio de separación de fluidos corporales consta de al menos una cámara inicial, un filtro auxiliar extendido sobre cada una de las cámaras iniciales, al menos una segunda cámara como complemento de al menos una cámara inicial y una conexión para aspirar un sistema de cierre desmontable situado a cada extremo de una o ambas de las nombradas cámaras inicial y secundaria, en la que cierre constituye un intercambiable y conexión supone conectar la cámara a una fuente de vacío situada a uno o ambos lados del filtro.

El sistema de cierre desmontable puede ser simplemente una tapa encajada y sellada en un extremo de la cámara, aunque una segunda tapa puede ir encajada en el otro extremo de la cámara.

En lo que concierne a la utilización de la invención en cada uno de sus aspectos, el filtro extendido de un extremo a otro de la cámara, cubriendo una cámara o encajado entre los platos inicial y secundario sirve para depositar el fluido corporal que se va a examinar, y si se desea, puede ser pretratado para utilizarse con el fluido corporal que se va a analizar. Por lo tanto, existe una forma de construcción en la que es preferible proporcionar un filtro con membrana de retención de leucocitos. En el caso de la separación celular, se proporciona un filtro reemplazable que permite, por ejemplo, el paso de células de la sangre materna y la retención de, por ejemplo, las células de la sangre fetal. En el caso del análisis de esperma, el filtro permitirá el paso del fluido seminal mientras que retendrá el esperma. De manera similar, con la médula ósea, el filtro está preparado para retener las células de la médula ósea mientras que permite el paso del plasma.

El material de la cámara y de cada una de las tapas, así como el material de cada plato debe permitir que tanto la cámara, la(s) tapa(s) y los platos puedan ser esterilizados mediante, por ejemplo, radiación gamma. Es preferible que el filtro sea un componente desechable, compuesto por un material plástico relativamente económico, con el fin de proporcionar un medio de separación de fluidos corporales de un único uso que pueda ser desechado posteriormente.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, un método de separación de fluidos corporales en determinados componentes consiste en la aplicación de una muestra de fluido corporal sobre un lado del filtro, la aplicación de vacío desde el otro lado del filtro para que el fluido corporal pase a través del filtro y el componente específico quede retenido en el mismo, y la liberación de este componente del filtro a otro sistema de cierre desmontable tras la inversión del aparato formado por el filtro, pero sin el sistema de cierre desmontable o la recolocación del otro sistema de cierre desmontable, en el que el otro sistema de cierre desmontable se traslada para reemplazar el sistema de cierre desmontable, ya sea in situ o tras quitar el filtro.

Por lo tanto, si nos referimos en particular a la separación del contenido de ADN de la sangre, para lo que la invención está particularmente preparada en su segundo aspecto, se aplica una muestra entera de sangre sobre un lado del filtro, luego se aplica una fuente de vacío desde el otro lado del filtro para que pase toda la muestra de sangre a su través y separar el plasma y el contenido de células rojas del contenido de leucocitos de la sangre, dejando el contenido de leucocitos retenido en el filtro, seguido de la aplicación de agua o, preferiblemente, de una solución salina isotónica en el mismo lado del filtro para que pase a través de él mediante la aplicación de la fuente de vacío desde el otro lado del filtro con el fin de disolver los leucocitos retenidos en el mismo. Como alternativa a la aplicación de agua o solución salina isotónica, se puede utilizar un agente de disolución química o un detergente compatible con las células con el fin de separar el contenido de plasma y células rojas de la sangre del contenido de leucocitos, y dejar el contenido de leucocitos retenido en el filtro. Tras la disolución, la tapa desmontable del extremo de la cámara que ahora contiene los residuos se puede quitar y desechar. Se invierte la cámara y se aplica la solución salina isotónica desde el otro lado del filtro para separar el contenido celular de los leucocitos del filtro a un recipiente adecuado de donde se separa el contenido de ADN. Este recipiente adecuado puede ser la tapa desmontable del otro extremo de la cámara. Otra posibilidad es que tras quitar la tapa que contiene los residuos, ésta sea reemplazada por la tapa del otro extremo de la cámara y se aplique una solución salina isotónica desde el mismo lado del filtro para separar en la tapa limpia el contenido celular de los leucocitos, de donde se puede separar el contenido de ADN. Como otra alternativa fuera del alcance de la invención tal y como se define en la reivindicación 6, es posible que para ciertos análisis se deje el contenido de leucocitos retenido en el filtro para que sirva como base de análisis de una variedad de tests médicos.

En el caso de la separación de leucocitos, es preferible utilizar el filtro disponible en el mercado conocido por Pall^{TM} LK4. También es preferible que la tapa de recepción del contenido celular cuente con una membrana para aislar el contenido de ADN de las células de otros restos celulares arrastrados desde el filtro, con el fin de proporcionar una muestra de ADN limpia que pueda ser liberada de la membrana mediante la utilización de técnicas de transferencia convencionales. La invención, en su aplicación para la recogida de ADN y el análisis de leucocitos, mediante su equipo y método evita por completo la necesidad de cualquier preparación de una muestra de sangre, y permite la separación, recogida y acumulación del contenido de ADN de una manera muy simple y eficiente.

Se puede colocar la sangre directamente sobre el filtro por la abertura de la cámara sin un tratamiento previo y aplicar vacío por el otro extremo mediante un simple aspirador de laboratorio o mediante, por ejemplo, una jeringuilla médica estándar. Esto hace que las células rojas y el plasma pasen a través del filtro y se acumulen en una de las tapas desmontables, dejando a los leucocitos retenidos en el filtro. Mediante una aplicación continua de vacío, se aplica agua, una solución salina isotónica, un agente de disolución química o un detergente compatible con las células que traspasa el filtro y produce la disolución química o la disolución de los leucocitos mediante un choque osmótico.

Una vez que se ha recogido el contenido celular, se puede recoger el componente de ADN mediante técnicas convencionales.

En otros ámbitos de análisis como, por ejemplo, el análisis fetal, el recuento de esperma, el análisis de médula ósea, orina y saliva, es preferible que se proporcionen varias muestras.

Por lo tanto, en el análisis e identificación de trofoblastos fetales (células sanguíneas inmaduras) de la sangre materna, se emplea un filtro que permite el paso de las células sanguíneas maternas y que retiene las células sanguíneas fetales. Se emplea, por ejemplo, Pall^{TM} J100 o una membrana similar con el lado cubierto de gel colocado para recibir la muestra de sangre. El filtro se cubre posteriormente para que no resulte pegajoso, así como la cámara receptora de la muestra. Se puede aplicar una muestra de sangre tomada de la madre sin ninguna preparación previa en cada uno de los filtros. Mediante la aplicación de vacío por la cámara de vacío hacia la cámara receptora de residuos, las células sanguíneas maternas traspasan el filtro y son recogidas en la cámara receptora de residuos, mientras que las células sanguíneas fetales quedan retenidas en el filtro. En este caso también es preferible que las células fetales sean liberadas del filtro a las cámaras receptoras de donde se pueden separar para ser analizadas. Sin embargo, es posible que, al margen del alcance metodológico de la invención tal y como se define en la reivindicación 6, los filtros con la sangre fetal puedan ser liberados de residuos para que las células queden retenidas y se puedan analizar sobre ellos.

De forma preferente, el procedimiento de identificación y análisis de trofoblastos fetales consiste en el aislamiento de células sanguíneas fetales de la muestra de sangre materna mediante la utilización de una membrana especialmente preparada que permita el paso de las células sanguíneas maternas, dejando las células sanguíneas fetales retenidas en el filtro. Luego se disuelven las células sanguíneas fetales y se añade un marcador químico específico de anticuerpos compatible con los cromosomas específicos, con la capacidad de producir fluorescencia bajo la luz ultravioleta de onda corta, con el fin de señalar cualquier anormalidad de las células fetales. Por lo tanto, lo que ocurre en el caso del Síndrome de Down es que el cromosoma 21 se muestra presente por triplicado, en lugar de estar por duplicado. El cromosoma 21 aparecerá en la pantalla bajo luz ultravioleta como tres puntos fluorescentes.

Está previsto que esta identificación no invasiva se lleve a cabo desde la décima semana de gestación. La técnica puede ser empleada para detectar cualquier otro síndrome genético como la enfermedad de Huntington, la fibrosis cística y la espina bífida.

A continuación, se describirá la invención con mayor profundidad y, únicamente a modo de ejemplo, se tomarán como referencia los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 es una vista en perspectiva de una primera plasmación de la invención, destinada particularmente a la recogida de ADN. La figura 2 es una vista en perspectiva seccionada de una segunda plasmación fuera del alcance de la invención, destinada particularmente al análisis de varias muestras de fluido corporal. Finalmente, la figura 3 es una sección en la línea III-III de la figura 2 montada.

En la figura 1, un medio de separación de fluidos corporales adaptado particularmente a la recogida de ADN está formado por una cámara 1 con los sectores superior e inferior 2 y 3, y por un filtro central 4. Cada uno de los sectores superior e inferior 2 y 3 están provistos de las tapas desmontables 5 y 6 respectivamente. Cada tapa está sellada con su respectivo extremo del sector de la cámara. Cada sector tiene una conexión 7 y 8 respectivamente cerrada por su respectivo tapón 9 y 10 que permite que los sectores 2 y 3 de la cámara se puedan conectar a una fuente de vacío.

Para iniciar el proceso, se quita la tapa 5 y se introduce una muestra de sangre en la cámara sobre el filtro 4 mediante una jeringa convencional. Se vuelve a colocar la tapa 5, se quita el tapón 10 de la conexión 8 localizada en el sector inferior 3 de la cámara, y se conecta la conexión 8 a una fuente de vacío, que puede ser de nuevo una jeringa convencional. La presencia de una fuente de vacío debajo del filtro hace que la sangre pase a través del mismo. El filtro es específicamente elegido para permitir que el contenido de leucocitos de la sangre queda retenido en él, y que el plasma y el contenido de células rojas de la sangre pase a través del mismo quedando depositado en la tapa 6. A continuación, se quita la tapa 5 y se aplica sobre el filtro agua, una solución salina isotónica, un agente de disolución química apropiado o un detergente compatible con la células que traspasa el mismo gracias a la fuente de vacío que se encuentra debajo. Luego se vuelve a colocar la tapa 5. Se quita la tapa 6 para deshacernos de los residuos contenidos en ella. A continuación, se puede invertir el recipiente, se vuelve a poner el tapón 10 en la conexión 8 y se quita el tapón 9 para conectar la conexión 7 a una fuente de vacío. Mediante la aplicación de agua o de una solución salina isotónica sobre el otro lado del filtro, se arrastra el contenido celular de los leucocitos para que quede depositado en la tapa 5. A continuación, se puede quitar la tapa 5 para recoger el contenido de ADN. Otra alternativa es que, tras quitar la tapa 6, se puede colocar la tapa 5 en el lugar de la tapa 6 y aplicar agua, una solución salina isotónica, un agente de disolución química o un detergente compatible con las células desde el mismo lado del filtro para separar el contenido celular de los leucocitos y depositarlo en la tapa 5 mediante una aplicación continua de vacío por la conexión 8.

Independientemente de la tapa 5 ó 6 que se emplee para recoger el contenido celular de los leucocitos, lo preferible es que se proporcione un filtro de membrana11 para aislar el contenido de ADN celular de los restos celulares lavados del filtro, siendo esta membrana fácilmente desmontable de la tapa para la consiguiente extracción del contenido de ADN aislado.

En las figuras 2 y 3 se muestra un medio de separación de fluidos corporales para el tratamiento simultáneo de varias muestras. Aunque el medio de separación representado muestra el tratamiento de seis muestras simultáneamente, se apreciará que permite el manejo de cualquier número de muestras. En esta ilustración, se proporciona un plato inicial 12 constituido por seis cámaras receptoras 13 y un segundo plato 14 constituido por seis cámaras auxiliares 15 de recepción de residuos. Cada una de las cámaras 15 receptoras de residuos tienen un puerto de conexión 16 para conectarse a una cámara de vacío 17 formada por un tercer plato 18. Este tercer plato 18 cuenta con una conexión 19 a una fuente de vacío (no se muestra en la figura). Dentro de la cámara de vacío 17 hay una membrana 20. Por lo tanto, con el segundo plato 14 colocado sobre el tercer plato 18, y con una serie de filtros individuales 21 dispuestos sobre cada una de las cámaras receptoras de residuos, se aplica una muestra de fluido corporal sobre cada filtro y se coloca el plato inicial 12 sobre el segundo plato para montar el instrumento tal y como se muestra en la figura 3. Aplicando vacío por la conexión 19 a la cámara 17, se aplica vacío por cada uno de los puertos 16 a cada cámara receptora de residuos para hacer que el contenido de plasma o de fluido de las muestras colocadas sobre los filtros pase a través de ellos hacia las cámaras receptoras de residuos 15, desde donde pasan por los puertos 16 a ser recogidos en la membrana 20. Posteriormente, se desmonta el tercer plato 18 y se desechan los residuos de la membrana 20. Se invierten el primer y segundo plato, desmontando el segundo para permitir el acceso a los filtros y que la células u otros componentes de fluido corporal que están retenidas en los filtros pasen a las cámaras receptoras de muestras 13.

Un instrumento como el representado en las figuras 2 y 3 está principalmente adaptado para procesos como, por ejemplo, el análisis e identificación de trofoblastos fetales de la sangre materna. En ese caso, se emplea una membrana o un filtro cubierto de gel, la muestra de sangre se aplica en el lado cubierto de gel y la membrana o el filtro junto con cada una de las cámaras receptoras reciben un tratamiento posterior para que no resulten pegajosas, pues se sabe que los trofoblastos fetales tiene facilidad para adherirse a otras sustancias. Una vez que se han aislado los trofoblastos fetales, se puede realizar a las células una prueba genética específica de un determinado cromosoma, como por ejemplo el cromosoma 21, que si aparece por triplicado en lugar de por duplicado confirma el diagnóstico del Síndrome de Down. La técnica de la hibridación in situ fluorescente, ya sea en interfase o metafase, se puede emplear para identificar todos los desórdenes genéticos que se conocen. La fluorescencia in situ se puede visualizar con un simple microscopio o un lector ultravioleta, donde el cromosoma sometido a la prueba específica se verá como puntos fluorescentes (por ejemplo, dos puntos implican un Síndrome de Down negativo y tres puntos, positivo).

Claims (10)

1. Un medio de separación de fluidos corporales que consta de al menos una cámara inicial (2), filtro(s) auxiliar(es) (4) extendido(s) sobre cada una de las cámaras iniciales, y al menos una segunda cámara (3) como complemento de al menos una cámara inicial, caracterizado por una o ambas cámaras inicial y secundaria (2, 3) que cuentan con una conexión (7, 8) al vacío, dispuestas a uno o ambos lados del filtro (4) y con un sistema de cierre desmontable constituido por unas tapas (5, 6) dispuestas en un extremo de cada cámara, en el que las tapas (5, 6) son intercambiables.

2. Un medio de separación de fluidos corporales como el descrito en la reivindicación 1, caracterizado por un filtro (4) que es pretratado para utilizarse con el fluido corporal que se coloca encima.

3. Un medio de separación de fluidos corporales como el descrito en la reivindicación 2, caracterizado por un filtro de membrana de retención de leucocitos.

4. Un medio de separación de fluidos corporales como el descrito en la reivindicación 2, caracterizado por un filtro sustituible (4) para la separación celular cuyas características permiten el paso de la sangre o el plasma y la retención de la células requeridas para su análisis.

5. Un medio de separación de fluidos corporales como el descrito desde la reivindicación 1 a la 4, caracterizado por un material de la(s) cámara(s) (2, 3) y de la(s) tapa(s) (5, 6) que puede ser fácilmente esterilizado.

6. Un método de separación de fluidos corporales en varios componentes selectivos que emplea el medio de separación de fluidos corporales descrito en la reivindicación 1, comprendido por los pasos de aplicación de una muestra de sangre sobre un lado del filtro (4) de la cámara inicial (2), aplicación de una fuente de vacío desde el otro lado del filtro para que pase la sangre a través del mismo y quede en un medio de cierre desmontable (6), quedando el componente específico retenido en el filtro, y liberación del componente específico del filtro en el otro medio de cierre desmontable (5) tras la inversión del aparato comprendido por el filtro (4) pero sin el medio de cierre desmontable (6) o recolocación del otro medio de cierre desmontable (5) en sustitución del medio de cierre desmontable (6).

7. Un método como el descrito en la reivindicación 6, caracterizado por un filtro (4) que es pretratado para prevenir la adherencia al mismo del componente retenido.

8. Un medio de separación de fluidos corporales como el descrito en la reivindicación 4, caracterizado por un filtro (4) que permite el paso de las células de la sangre materna y la retención de las células de la sangre fetal.

9. Un método de identificación de trofoblastos fetales en el que se emplea un medio de separación de fluidos corporales como el descrito en la reivindicación 8.

10. Un método de separación de fluidos corporales en varios componentes selectivos como el descrito en la reivindicación 6, en el que el componente específico está constituido por trofoblastos fetales.