ES2200345T3 - Dispositivo y procedimiento de aislamiento de material celular en una envuelta de tejido y/o un liquido. - Google Patents
Dispositivo y procedimiento de aislamiento de material celular en una envuelta de tejido y/o un liquido.Info
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Abstract
La invención se refiere a un tanque (1) con extremo superior abierto, en el cual puede colocarse material celular en un medio de tejidos y / o en un líquido. El dispositivo incluye un separador en forma de tampón, que comprende un disco separador de forma plana (2), cuyo borde anular está sellado a prueba de humedad con las paredes interiores del tanque, y presenta al menos un pasaje cubierto por una membrana (5). El disco separador puede insertarse desde arriba en el tanque (1), a fin de que pueda someterse a presión dicho material celular, junto con el medio de tejidos y / o el líquido, y activarse el material celular por rotación, ejerciendo fuerzas de cizalla. Las células y / o los envoltorios celulares atraviesan los poros del filtro de membrana (5), mientras que se retienen los residuos de tejidos.
Description
Dispositivo y procedimiento de aislamiento de
material celular en una envuelta de tejido y/o líquido.
La invención se refiere a un dispositivo y a un
procedimiento para el aislamiento de material celular de un
conjunto de tejido y/o de un líquido, mediante un recipiente
abierto por arriba dentro del cual se puede introducir el material
celular que se trata de aislar en el conjunto de tejido y/o en el
líquido.
Para el diagnóstico médico de cuadros clínicos
así como para fines de investigación científica, en particular en el
campo de la biomedicina, se analizan células individuales o
conjuntos de células. La condición necesaria para los
procedimientos de análisis que han de efectuarse en las células es
el aislamiento de células individuales de conjuntos de tejidos o de
líquidos en los que las células individuales estén presentes en su
forma natural. En muchos casos, las células para la investigación
celular se extraen de tejidos biológicos blandos, como por ejemplo
el bazo, el hígado o también de tejidos más duros, la piel o los
cabellos. Con frecuencia se aíslan también células de líquidos en
los análisis de sangre o de orina, que a continuación se investigan,
por ejemplo, para determinar la presencia de gérmenes patógenos.
Estas investigaciones se hacen extensivas también a células
contenidas en secreciones corporales, frotis u otros líquidos
propios del cuerpo, pero que sin embargo, e igual que en todos los
casos antes citados, se han de aislar de los distintos conjuntos de
tejidos o líquidos.
Ahora bien, en la actualidad no se conocen
procedimientos normalizados para el aislamiento de las células.
Hasta ahora se procede principalmente a la separación manual de
células individuales o conglomerados de células de conjuntos de
tejidos y/o líquidos, de manera que para la extracción de células de
tejidos, por ejemplo del bazo, se emplean diversos métodos
manuales, desarrollados individualmente y adaptados a la habilidad
de la persona que los esté realizando. De esta manera se han ido
formando a lo largo del tiempo diversas técnicas de aislamiento de
células, que han evolucionado de manera diferente de un laboratorio
a otro. Tampoco se pueden deducir de la bibliografía
correspondiente indicaciones útiles de las que se puedan deducir
procedimientos utilizados de manera general o incluso normalizados
para el aislamiento universal de células.
Para preparar una suspensión de células
individuales para la investigación de un determinado tipo de célula
son necesarias una serie de operaciones a realizar de forma
consecutiva y que hasta hoy se realizan exclusivamente de manera
manual.
Para analizar las células que aparecen en los
conjuntos de tejidos es preciso separar, en primer lugar, un trozo
de tejido, por ejemplo del bazo o del hígado, que tenga el tamaño
deseado. La muestra de tejido extraída se introduce generalmente en
un medio que junto con la muestra se coloca en una cápsula de Petri.
A continuación, la muestra de tejido que se encuentra en el medio
se aplasta y desmenuza mecánicamente sirviéndose de herramientas
adecuadas, con lo cual se pueden desprender mejor del tejido las
células que se trata de analizar. Las células o conglomerados de
células desprendidos de las distintas partículas de tejido
desmenuzado y que se enriquecen en el medio, se deberán extraer
ahora como suspensión del medio que se encuentra en la cápsula de
Petri. Este proceso de separación se realiza generalmente empleando
una pipeta, cuyo orificio sin embargo puede quedar fácilmente
obstruido por pequeños trocitos de tejido separados. La separación
de la suspensión de células mediante la pipeta exige por lo tanto
una habilidad manual especial de la persona en cuestión ya que las
células aisladas están presentes en el medio junto con los trocitos
de tejido desmenuzados por el procedimiento mecánico de
desprendimiento.
La suspensión de células obtenida mediante la
extracción con la pipeta se vuelve a colocar en un recipiente en el
cual los trocitos pequeños de tejido extraídos junto con las
células se pueden sedimentar, en el fondo del recipiente, debido a
su mayor masa por procesos de sedimentación. De nuevo se repite el
proceso de pipeteado antes descrito, para obtener de esta manera
una suspensión enriquecida en células. Según la clase, tamaño y
proporción de pequeños trocitos de tejido separados, presentes en la
suspensión, es necesario repetir varias veces el proceso de
separación basado en la sedimentación. Este proceso se puede
favorecer también mediante el empleo de centrifugadora.
Para disolver y separar en células individuales
el conjunto de células que está presente en la suspensión se retira
y coloca varias veces con la pipeta la suspensión enriquecida con
material celular, de manera que en la suspensión haya el mayor
número posible de células en estado aislado. La suspensión de
células aisladas independientes, procedentes de un conjunto de
tejidos, obtenida de esta manera, se suele colocar generalmente en
otro recipiente, al que se añade, por ejemplo, cloruro de amonio
para eliminar los hematíes que también están presentes en la
suspensión.
La forma de proceder antes descrita para aislar
las células, por ejemplo, células procedentes de un trocito de
tejido, por ejemplo del hígado, ha demostrado que es preciso llevar
a cabo un gran número de fases de separación que han de realizarse
manualmente de forma sucesiva, hasta que se pueden obtener células
individuales aisladas. Ahora bien, con cada una de las fases de
separación se produce basura residual difícil de eliminar, por
ejemplo, los líquidos de suspensión, las herramientas necesarias
para el proceso de separación, tales como las juntas de pipeta o los
dispositivos de separación así como los recipientes utilizados.
Para reducir el gasto que entraña el proceso de
separación se renuncia en numerosos laboratorios, por ejemplo, en
laboratorios de diagnóstico PCR, a la preparación específica de
suspensiones de células individuales y en su lugar se disgrega el
conjunto total del tejido. Quizá esto suponga un ahorro de tiempo,
pero en cambio entraña el inconveniente de que para la analítica
subsiguiente se forman unos homogeneizados no unitarios con multitud
de tipos de células, fragmentos de tejido y con frecuencia,
sustancias inhibidoras.
Por la patente EP 0 590 504 A1 se conoce un
dispositivo de separación conforme a la especie, que se compone de
un recipiente de vidrio 41 dentro del cual se puede introducir un
elemento 10 en forma de cilindro hueco, que en su extremo inferior
dispone de un dispositivo de separación 20 que lleva unos orificios
de paso 28, 38, a través de los cuales pasa la suspensión celular,
mientras se sumerge el elemento 10 en forma de cilindro hueco en el
recipiente 41 lleno de la suspensión celular 45.
La invención tiene por tanto como objetivo
presentar un dispositivo y un procedimiento para el aislamiento de
material celular de un conjunto de tejido o de un líquido, de tal
manera que se reduzca el número de operaciones manuales a realizar
y se normalice en gran medida el proceso de aislamiento de las
células, de manera que se pueda conseguir una reproducibilidad
fiable de los resultados de los análisis relacionados con el
aislamiento de las células. Se trata además de reducir los desechos
relacionados con cada uno de los procesos individuales de
separación, como por ejemplo, las cápsulas de Petri y los
recipientes y herramientas en general. En particular, se trata de
evitar en gran medida la contaminación del puesto de trabajo
relacionada con el procedimiento convencional.
La solución del objetivo que constituye la base
de la invención se indica en la reivindicación 1, donde se describe
un dispositivo conforme a la invención. En la reivindicación 15 se
indica un procedimiento conforme a la invención para el aislamiento
de material celular de un conjunto de tejido y/o de un líquido. Las
características que materializan ventajosamente la idea de la
invención constituyen el objeto de las subrreivindicaciones.
La invención se basa en la idea de crear un
sistema portador de muestras que integre todas las funciones para
el aislamiento de las células de un tejido, así como para el
enriquecimiento de las células de un líquido.
De acuerdo con la invención, el dispositivo para
el aislamiento del material celular de un conjunto de tejido y/o de
un líquido presenta un dispositivo de separación realizado en forma
de émbolo, con un recipiente abierto por arriba dentro del cual se
puede introducir el material celular que se trata de aislar en el
conjunto del tejido y/o en el líquido, que prevé un vástago de
accionamiento en el cual va fijado un disco separador de forma
plana, cuyo borde periférico ajusta estanco con las paredes
interiores del recipiente. El disco separador presenta, además, por
lo menos un orificio de paso, cubierto por una membrana filtrante y
que se puede introducir desde arriba en el recipiente. Por último,
en el disco separador están previstos unos elementos de fricción
mediante los cuales se pueden aplicar al material unas fuerzas de
cortadura mediante la rotación del disco separador.
Sirviéndose del dispositivo conforme a la
invención se tiene la posibilidad de introducir, después de la
extracción de la muestra, por ejemplo, por el propio médico, la
muestra extraída y eventualmente reactivos que favorezcan el
proceso, en el recipiente objeto de la invención para su
transporte.
Mediante la correspondiente elección del tamaño
del recipiente se puede predeterminar al mismo tiempo el tamaño de
la muestra de tejido que se ha de extraer, de manera que de este
modo se le indique al médico, por medio de unas marcas debidamente
colocadas en el recipiente, el volumen de tejido que se precisa para
la investigación en cuestión. Esta medida tiene también en cuenta
el deseo de normalización al realizar tales estudios con los
tejidos.
Una vez recibida la muestra de tejido en el
laboratorio de análisis dentro del recipiente cerrado, se pueden
introducir, en el laboratorio, en el recipiente los reactivos
correspondientes para el subsiguiente proceso de separación. Para el
aislamiento de las células sirve el dispositivo de separación en
forma de émbolo, que se introduce desde arriba en el interior del
recipiente. De acuerdo con la invención, el dispositivo de
separación está realizado con un disco separador que ajusta a haces
con la pared interior del recipiente y que se puede descender hacia
abajo dentro del recipiente verticalmente por medio de un vástago
de accionamiento. Para esto el disco separador está realizado de
tal manera que presenta unos orificios de paso, que están en cada
caso recubiertos adicionalmente con una membrana filtrante. La
membrana filtrante presenta unos orificios que corresponden al
tamaño de las células o conjuntos de células que se trata de aislar
en cada caso. Descendiendo el dispositivo de separación por el
interior del recipiente, en dirección hacia la muestra de tejido que
está presente en una solución, tanto la solución como las células o
conjuntos de células desprendidas de la muestra de tejido pueden
pasar a través de la membrana filtrante a la parte superior del
recipiente. De esta manera se crean en el recipiente dos espacios
separados entre sí por el disco separador. Debajo del disco
separador se encuentra el trozo de tejido que está presente en la
solución, mientras que por encima del disco separador están las
células o conjuntos de células aislados presentes en
suspensión.
Los elementos de fricción aplicados
preferentemente en la cara inferior del disco separador están
realizados en forma de salientes agudos o con aristas vivas, que al
descender y girar el disco separador desgarran auténticamente
desgarran la muestra de tejido, de manera que las células o
conjuntos de células que se encuentran en la muestra de tejido
están casi íntegros en la suspensión y de esta manera pueden pasar a
través de la membrana filtrante a la parte superior del
recipiente.
Por medio del vástago de accionamiento, que puede
estar colocado como mango central sobre el disco separador o
realizado como cilindro hueco que ajusta al borde periférico del
disco separador, se puede descender el disco separador de forma
controlada dentro del recipiente, impartiéndole un movimiento de
rotación, de manera que se puedan ejercer sobre la muestra de
tejido que se encuentra en la solución unas fuerzas de presión y
cortadura controladas. Con ayuda de los elementos de fricción que
se encuentran en el disco separador se puede realizar una separación
sumamente eficaz de las células o conjuntos de células que se
tratan de aislar de la muestra de tejido.
Gracias a la separación física de las células o
conjuntos de células que se encuentran en la suspensión, respecto a
los trozos de tejido desmenuzados que se encuentran debajo del disco
separador, se puede extraer del recipiente la suspensión de células
situada encima del disco separador, sirviéndose de pipetas
convencionales, sin correr el riesgo de que pequeños trozos de
tejido obstruyan el orificio de la pipeta. Después de extraer
correspondientemente la suspensión celular mediante pipeteado o
decantación, se pueden eliminar los trozos de tejido y reactivos que
se encuentran debajo del disco separador, junto con el
recipiente.
El dispositivo objeto de la invención posibilita
de esta manera un sistema portamuestras y para aislamiento de
células que, a pesar de los rigurosos requisitos de esterilidad,
resulta adecuado tanto para alojar las muestras de tejido, para su
transporte a un laboratorio de investigación, para todo el proceso
de aislamiento, como para su eliminación final. Mediante la
especificación de tamaños adecuados de los recipientes se pueden
normalizar mejor los análisis de tejidos, de manera que los
resultados del análisis se pueden conseguir con una reproducibilidad
más fiable.
Mediante el dispositivo de separación realizado
de acuerdo con la invención se tiene por una parte la posibilidad
de aumentar considerablemente la velocidad del proceso mediante el
cual se realiza el aislamiento de las células y por otra parte, se
reduce el trabajo manual para llevar a cabo el aislamiento de las
células. Dado que todo el proceso de aislamiento tiene lugar en un
mismo recipiente, se pueden reducir al mínimo las contaminaciones
cruzadas con otras muestras o personas u objetos.
El vástago de accionamiento previsto para la
manipulación del dispositivo de separación se puede manejar
convenientemente tanto de forma manual como automatizada. Además de
la posibilidad de colocar el vástago de accionamiento firmemente
pero desmontable en una caperuza de cierre, para cerrar el
recipiente y realizar de esta manera un manejo manual simplificado
del dispositivo de separación, el vástago de accionamiento puede
tener además una brida para el accionamiento automático mediante un
dispositivo de manipulación adecuado, por ejemplo, un brazo de
robot. Con la ayuda, si se utilizan, de autómatas de movimiento se
tiene la posibilidad de efectuar el aislamiento de las células de
forma totalmente automática, utilizando el sistema portamuestras
objeto de la invención. Esto a su vez hace más viable el objetivo
de un método normalizado de aislamiento de células y unido a ello
un elevado grado de reproducibilidad.
También, a la vista de la creciente toma de
conciencia de respeto del medio ambiente, el sistema portamuestras
objeto de la invención contribuye a reducir al mínimo los productos
residuales que se han de eliminar, al utilizarse un único
recipiente.
La invención se describe a título de ejemplo
mediante un ejemplo de realización haciendo referencia al dibujo.
En éste pueden verse:
Fig. 1 Representación del sistema portamuestras,
y
Fig. 2 Representaciones secuenciales sobre la
utilización del sistema portamuestras.
El sistema portamuestras objeto de la invención
se compone de un recipiente 1, preferentemente de forma cilíndrica,
que presenta un orificio superior igual al de un vaso. A través del
orificio superior del recipiente 1, que en el ejemplo de
realización representado queda cerrado mediante una tapa roscada 4,
se puede introducir un dispositivo de separación que se compone de
un disco separador 2 y de un vástago de accionamiento 3. El vástago
de accionamiento 3 va colocado centrado sobre el disco separador 2
y está firmemente unido a éste. Por el otro extremo del vástago de
accionamiento 2, éste se puede unir fijándolo de manera desmontable
a la tapa roscada 4, que cierra el recipiente 1 de forma estanca a
los fluidos. La tapa roscada 4 presenta preferentemente en su
superficie superior un tabique adecuado para pinchar a través del
mismo las agujas de pipeteado para la extracción de la suspensión
celular.
Mediante el vástago de accionamiento 3 se pueden
transmitir sobre el disco separador 2 unos pares de fuerza
controlados, accionando para ello el vástago de accionamiento 3 con
un movimiento de rotación alrededor de su eje y/o verticalmente. En
particular, en la zona superior del vástago de accionamiento 3 hay
colocado un adaptador o brida para aparatos de maniobra
automáticos, como por ejemplo, el brazo de un robot (no
representado en la Fig. 1).
El disco separador 2 lleva en su superficie
anular unos orificios de paso cubiertos con una membrana filtrante
5. El tamaño de los poros de la membrana filtrante depende del
tejido de partida y del tamaño de las células, y para la
investigación de células hepáticas generalmente es de aprox. 100
\mum.
Por la cara inferior del disco separador 2 están
colocados unos elementos de fricción 6, que en la figura
representada están realizados como aristas puntiagudas. Al
descender correspondientemente el dispositivo de separación, los
elementos de fricción 6 se clavan en el trozo de tejido situado
debajo del disco separador 2 (que no está representado en la Fig.
1) y desmenuzan el material del tejido de tal manera que las
células y los conglomerados de células contenidos en el tejido se
pueden desprender de éste de forma preferente.
El recipiente representado en la Fig. 1 está
fabricado en un material plástico fácilmente esterilizable, que
para visualizar mejor los procesos de separación que tienen lugar
en el interior del recipiente está realizado transparente a la
luz.
Como alternativa a la geometría del vástago de
accionamiento 3 representado en la Fig. 1, éste puede estar
realizado como un cilindro hueco que ajuste a haces con el contorno
exterior periférico del disco separador 2. Mediante esta
configuración del vástago de accionamiento se puede aprovechar toda
la superficie del disco separador 2 para el proceso de separación,
es decir, que también actúa como filtro la zona que en el ejemplo
de realización representado está cubierta por el vástago de
accionamiento colocado centrado sobre el disco separador.
En las representaciones de la secuencia según la
Figura 2 se representa una forma de utilización ventajosa del
sistema portamuestras objeto de la invención. En la primera
representación de la secuencia se introducen en el interior del
recipiente 1 los trozos de tejido C que se trata de analizar. Al
mismo tiempo, se introduce un líquido para disolver las células o
conjuntos de células que se encuentran en el material del tejido,
como por ejemplo, una solución salina y/o una solución de cloruro de
amonio para eliminar los hematíes.
En la segunda fase, la muestra de tejido y la
solución introducidos en el recipiente, se cierran estancos mediante
una tapa de cierre, quedando dispuestos para su transporte a un
laboratorio de análisis.
Para mejorar las reacciones de separación
eventualmente se pueden introducir en el recipiente otros
reactivos. Para esto es necesario o bien quitar la tapa de cierre
del recipiente, o como en el ejemplo mostrado, según la
representación de la secuencia 3 se introducen los demás reactivos
mediante un dispositivo de pipeteado 7 en el interior del
recipiente. Alternativamente la tapa de cierre está dotada de un
tabique que se puede atravesar mediante cánulas adecuadas que
terminan en punta, para introducir de esta manera un líquido en el
interior del recipiente evitando la contaminación por gérmenes.
En la representación de la secuencia 4 el
dispositivo de separación objeto de la invención se desciende hacia
abajo dentro del recipiente, bien de forma manual o automatizada
sirviéndose de un brazo de robot, impartiéndole al mismo tiempo un
movimiento de rotación, de manera que los trozos de tejido que se
encuentran en el fondo del recipiente quedan sometidos a presión y
se desmenuzan por la acción de las fuerzas de cortadura. Dado que
el perímetro exterior del disco separador ajusta estanco con la
pared interior del recipiente, el líquido que se encuentra en el
recipiente y las células o conglomerados de células desprendidos del
material del tejido pasan a la parte superior del recipiente
exclusivamente a través de la membrana filtrante colocada sobre el
disco separador.
En la secuencia 5 se extrae con la pipeta la
suspensión celular que se encuentra encima del disco separador. No
existe sin embargo el riesgo de que se obstruya el orificio de la
pipeta con trocitos de tejido, ya que a través de la membrana
filtrante no pueden pasar trocitos de tejido macroscópicos.
Por último, al final del análisis y según la
secuencia 6, queda únicamente como basura residual el recipiente
con el dispositivo de separación y el material del tejido contenido
en su interior.
- 1
- Recipiente
- 2
- Disco separador
- 3
- Vástago de accionamiento
- 4
- Tapa roscada
- 5
- Membrana filtrante
- 6
- Elementos de fricción
- 7
- Dispositivo de pipeteado
- G
- Trozos de tejido
Claims (16)
1. Dispositivo para el aislamiento de material
celular de un conjunto de tejido y/o de un líquido, mediante un
recipiente (1) abierto por arriba dentro del cual se puede
introducir el material celular que se trata de aislar en el conjunto
de tejido y/o en el líquido, caracterizado porque está
previsto un dispositivo de separación realizado en forma de émbolo,
que prevé un vástago de accionamiento (3) que lleva colocado un
disco separador (2) de forma plana, cuyo borde periférico ajusta
estanco con las paredes interiores del recipiente y que presenta
por lo menos un orificio de paso, cubierto por una membrana
filtrante (5) y que se puede introducir desde arriba en el
recipiente y porque en el disco separador están previstos unos
elementos de fricción (6) mediante los cuales se pueden aplicar al
material unas fuerzas de cortadura mediante la rotación del
disco
separador.
separador.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque está prevista una tapa de cierre, que
cierra el recipiente de forma estanca a los fluidos.
3. Dispositivo según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque el disco separador aplica presión sobre
el material celular junto con el conjunto de tejido y/o
líquido.
4. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado porque el vástago de accionamiento va
colocado centrado sobre el disco separador.
5. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizado porque el dispositivo de separación
lleva un vástago de accionamiento en forma de cilindro hueco, a
haces con el borde periférico.
6. Dispositivo según la reivindicación 5,
caracterizado porque el dispositivo de separación se puede
accionar con movimiento rotativo y/o vertical a través del vástago
de accionamiento.
7. Dispositivo según las reivindicaciones 5 ó 6,
caracterizado porque el extremo superior del vástago de
accionamiento se puede aplicar fijo o fijo desmontable en la tapa
de cierre.
8. Dispositivo según una de las reivindicaciones
5 a 7, caracterizado porque el vástago de accionamiento
lleva una brida para el accionamiento automático o manual mediante
un dispositivo de manipulación.
9. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado porque los elementos de fricción están
dispuestos en la cara del disco separador próxima al fondo del
recipiente.
10. Dispositivo según una de las reivindicaciones
2 a 9, caracterizado porque la tapa de cierre está realizada
como tapa roscada (4).
11. Dispositivo según una de las reivindicaciones
2 a 10, caracterizado porque la tapa del cierre lleva un
tabique para pinchar cánulas.
12. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 11, caracterizado porque el recipiente está fabricado de
material plástico.
13. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 12, caracterizado porque la membrana filtrante está
realizada de tal manera que presenta unos poros que aseguran el
paso a través de la membrana de células individuales y/o conjuntos
de células y retienen el tejido restante.
14. Dispositivo según la reivindicación 13,
caracterizado porque los poros presentan un tamaño de
aproximadamente 100 \mum.
15. Procedimiento para el aislamiento del
material celular de un conjunto de tejido y/o de un líquido
mediante el empleo del dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por las siguientes
fases del proceso:
- -
- el material de las células que se trata de aislar y que está integrado en un conjunto de tejido y/o en un líquido, se introduce en el recipiente abierto,
- -
- el dispositivo de separación se introduce desde arriba en el recipiente sobre el material celular junto con el conjunto de tejido y/o un líquido, de tal manera que el disco separador aplique presión sobre el material celular que está integrado en un conjunto de tejido y/o en un líquido y mediante unos movimientos de rotación somete al material celular a fuerzas de cortadura de tal manera que se desmenuce el material celular,
- -
- descendiendo el disco separador dentro del recipiente, se impulsa material celular a través de los orificios de paso a la cara superior del disco separador, mientras que las partes de tejido restantes y/o de líquido quedan retenidas por la membrana filtrante en la parte inferior del recipiente,
- -
- el material celular aislado por encima del disco separador se extrae del recipiente mediante procedimientos de pipeteado y/o decantación.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque antes o después de introducir el
dispositivo de separación en el recipiente se añaden reactivos.
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