ES2200055T3 - Nanoparticulas micelares. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA RELACIONADA CON NANOPARTICULAS MICELARES Y CON LOS METODOS DE PRODUCCION. LAS NANOPARTICULAS MICELARES SE PREPARAN HIDRATANDO UNA MEZCLA DE UN ACEITE, UN ESTABILIZADOR/SURFACTANTE Y UN INICIADOR ALCOHOLICO CON UNA DISOLUCION ACUOSA. ESTAS NANOPARTICULAS MICELARES TIENEN NORMALMENTE UN DIAMETRO INFERIOR A 100 NANOMETROS. LAS NANOPARTICULAS MICELARES TIENEN VENTAJAS ESPECIALMENTE PARA SUMINISTRAR TOPICAMENTE A TRAVES DE LA PIEL COMPUESTOS COMO EL ESTRADIOL DEBIDO A QUE SU PEQUEÑO TAMAÑO LES PERMITE UNA FACIL PENETRACION.

Description

Nanopartículas micelares.

Antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con materiales y procedimientos para la construcción de "nanopartículas micelares". Por partículas de tipo micelo se entenderá partículas de diámetros inferiores a 1000 nanometros (una micra). Estas nanopartículas micelares son partículas de tamaño submicra, de base aceitosa, siendo las más pequeñas filtrables a través de un filtro de 0,2 micras, tal como los utilizados de manera habitual para purificación microbiológica. Las nanopartículas micelares de la invención pueden constituirse en forma de dispersiones estables en soluciones acuosas y en tampones.

Las nanopartículas micelares presentan una diversidad de usos, debido a su pequeño tamaño. Otras partículas sintéticas, tales como los liposomas, las vesículas lipídicas no fosfolípidas y las microcápsulas tienen habitualmente el tamaño de una micra o superior. Como contrapartida, resulta posible obtener las nanopartículas micelares de la invención en tamaños situados por debajo de los 100 nanometros de diámetro. A diferencia de las vesículas lipídicas, algunas de las cuales pueden ser diseñadas mediante ingeniería genética para transportar un aceite, ver por ejemplo la patente de Estados Unidos Nº. 4.911.928, concedida a Wallach, las presentes partículas requieren al menos un aceite, un estabilizador/tensioactivo, un iniciador y agua u otro diluyente, en su fabricación. No obstante, no se utiliza ni colesterol ni fosfolípidos. De hecho, estas nanopartículas pueden ser preparadas utilizado materiales adecuados para aplicaciones de uso humano, de tipo alimenticio, USP o NF. Esto resulta particularmente importante en el caso de que estas nanopartículas micelares tengan que ser utilizadas para el suministro tópico de un material en el torrente sanguíneo. Un uso específico de este tipo de sistemas es el suministro de hormonas de origen natural o sintético, tales como el estradiol. Estos materiales presentan a menudo problemas de solubilidad; por ejemplo, los mismos son tan solo solubles en materiales tales como etanol, el cual resulta difícil de incorporar en sistemas de partículas estables.

Las nanopartículas micelares son únicas en el sentido de que las mismas permiten que materiales que resultan solubles en cualquiera de agua, aceite o en el iniciador (a saber, etanol o metanol), sean incorporados en partículas estables con diámetros promedio comprendidos entre aproximadamente 30 y 1000 nanometros. La mayoría de las preparaciones presentan diámetros de partícula comprendidos entre 30 y 500 nanometros, son miscibles en agua y filtrables a través de filtros de o bien 0,2 ó 0,45 micras. Pueden ser almacenados a una temperatura comprendida entre -20ºC y 25ºC.

Por medio de la utilización de los materiales y procedimientos descritos, se pueden generar nanopartículas micelares que permitan efectuar lo siguiente:

-1.

Incorporar fármacos solubles en etanol o metanol en el interior de las partículas.

-2.

Incorporar pesticidas solubles en etanol o metanol en el interior de las partículas.

-3.

Incorporar adyuvantes en el interior de las partículas.

-4.

Incorporar proteínas en el interior de las partículas.

-5.

Incorporar virus completos que contienen ácidos nucleicos intactos en el interior de partículas. No obstante, debe tenerse en cuenta que las partículas más pequeñas de la invención presentan aproximadamente el mismo tamaño que muchos virus.

-6.

Incorporar aromas extraídos con etanol en el interior de las partículas.

-7.

Incorporar aceites volátiles (aromas y fragancias) en el interior de las partículas.

-8.

Incorporar una carga en el interior de las partículas.

-9.

Crear partículas coloreadas.

Resulta de particular importancia la capacidad de transmitir fármacos por vía tópica. Se sabe, desde hace muchos años, que las partículas pequeñas, tales como las que tienen un diámetro inferior a una micra, pueden atravesar más fácilmente la barrera de la piel que las partículas más grandes. No obstante, la pequeña cantidad de fármaco transmitida en las partículas pequeñas ha limitado a menudo su utilidad. Además, la mayoría de las partículas han presentado tan solo un limitado tipo de materiales susceptible de ser suministrado.

Por consiguiente, constituye un objetivo de la presente invención el de producir partículas de tamaño submicrométrico, las cuales puedan suministrar una diversidad de tipos de materiales.

Otro objetivo de la invención es el de producir partículas submicrométricas que puedan suministrar materiales que resulten solubles en etanol o metanol, pero que tengan una solubilidad reducida o nula en sistemas acuosos y aceitosos.

Constituye un objetivo adicional de la invención el de producir partículas por debajo de los 100 nanometros de diámetro, las cuales puedan ser utilizadas para el suministro de fármacos.

Constituye todavía un nuevo objetivo de la invención el de producir una partícula para suministro tópico de hormonas, tales como el estradiol.

Estos y otros objetivos y características de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.

Resumen de la invención

La presente invención caracteriza nanopartículas micelares y procedimientos para su fabricación. Estas nanopartículas micelares presentan una particular utilidad como vehículos para fármacos, con aplicaciones específicas para suministro tópico de materiales que son solubles en etanol y metanol. No obstante, estas nanopartículas micelares puede ser también utilizadas para suministrar muchos tipos diferentes de fármacos y otros materiales. El pequeño tamaño de las nanopartículas micelares y su compatibilidad con el tejido las convierten en aplicables para numerosos usos.

Las nanopartículas micelares de la invención presentan diámetros de entre aproximadamente 10 y 1000 nanometros, teniendo la mayor parte de las partículas diámetros por debajo de los 100 nanometros. Este pequeño tamaño de partícula permite el paso a través de un filtro de 0,2 micras. Las nanopartículas se preparan a partir de una fase lipófila que incluye un aceite, un estabilizador (o tensioactivo) y un iniciador tal como etanol o metanol. Esta fase lipófila es hidratada por medio de una solución acuosa tal como agua o un tampón. Entre los estabilizadores preferidos se encuentran tensioactivos no fosfolípidos, particularmente la familia de tensioactivos de los Tween (derivados polioxietilénicos de ésteres de ácido graso de sorbitán) y los éteres de nonilfenol y polietilenglicol. Los tensioactivos más preferidos son el Tween 60 (monoestearato de sorbitan y de polioxietineo 20) y el Tween 80 (monooleato sorbitan y polioxietileno 20) y el Tergitol NP-40 (Poli(oxi-1,2-etanodiilo), \alpha-(4-nonilfenol)-\omega-hidroxi, ramificado [peso molecular promedio 1980]) y el Tergitol NP-70 (un tensioactivo mezcla -AQ=70%). El elevado peso molecular de estos tensioactivos parece aportar ventajosas propiedades a la fabricación y a la estabilidad de las nanopartículas micelares resultantes.

Los iniciadores preferidos de la presente invención son etanol y metanol, pero en determinadas circunstancias pueden utilizarse otros alcoholes y amidas de cadena corta. Si bien resultan preferidos el etanol o el metanol, pueden utilizarse mezclas de los dos y de materiales, mezclados o no mezclados, que contengan al menos el 50% de alcohol. Entre este grupo de iniciadores puede incluirse iniciadores aromatizados, tales como extractos alcohólicos de aromas de tipo menta, limón, naranja o similares.

Además del iniciador y de los tensioactivos del estabilizador, las partículas micelares pueden ser modificadas o fabricadas habitualmente mediante la selección del propio aceite. Si bien la mayoría de los aceites parecen funcionar, los aceites preferidos son seleccionados de entre el grupo de comprende aceites vegetales, aceites de nuez, aceites de pescado, aceites minerales, escualano, tricaprilina y mezclas de los mismos.

Para habituar a las partículas, pueden añadírsele un determinado número de otros materiales a las nanopartículas micelares. En vez de algunos de los aceites pueden utilizarse aceites volátiles, tales como aceites de aroma volátil o pueden ser añadidos a los otros aceites formando las partículas. Puede ser también utilizado un agente colorante, tal como un agente colorante alimentario, preferiblemente por medio de la adición del mismo al iniciador. El iniciador o el aceite pueden también transportar ingredientes activos los cuales son incorporados en la suspensión de partículas final. Estos ingredientes activos pueden estar disueltos o suspendidos en el líquido. Un aditivo preferido es un esteroide u hormona, tal como estradiol, el cual puede estar disuelto en un iniciador etanol e incorporado en el interior de la partícula. Dado que el estradiol precipita en soluciones acuosas, la adición de la fase acuosa precipitará al estradiol, el cual puede ser liberado con posterioridad en una preparación tópica. Un hecho interesante que se refleja es que el tipo de cristales formados utilizando los procedimientos de la presente invención es diferente en forma al de los precipitados de estradiol en solución acuosa estándar.

La solución acuosa utilizada para hidratar la fase lipófila es, preferiblemente, una solución compatible fisiológicamente, tal como agua o un tampón, por ejemplo, salina tamponada con fosfato. La solución acuosa puede contener un material activo disuelto o suspendido en la misma, para su incorporación. El procedimiento básico para la fabricación de las nanopartículas micelares consiste en el mezclado del aceite, el estabiliador/tensioactivo y el iniciador, para formar una fase lipófila y el mezclado, en exceso, preferiblemente a una relación de aproximadamente 4:1, de la fase lipófila con la solución acuosa de diluyente. El mezclado o la hidratación de la fase lipófila con la fase acuosa se consigue, preferiblemente, utilizando un dispositivo que genera una velocidad relativa de aproximadamente 50 m/s a través de un diámetro de orificio de 1/18.000 pulgadas. Esta cortadura proporciona partículas dentro de la banda de tamaño preferido, mientras que valores de cortadura inferiores, por ejemplo, utilizando orificios mas grandes o velocidades más bajas, puede dar lugar a tamaños de partículas más grandes.

La totalidad de los diferentes materiales y de procedimientos descritos en el presente documento pueden ser modificados o seleccionados para controlar las propiedades de las nanopartículas micelares resultantes. Los ingredientes activos pueden ser transportados en el aceite, el iniciador o en la fase acuosa, para su incorporación en el interior de las partículas. Si bien parece que las partículas son micelos, las mismas pueden presentarse en forma de micelos inversos, sin modificar la amplitud de la invención. La invención es ilustrada adicionalmente, a través de la siguiente descripción detallada y de los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1a y 1b son electromicrografías de las nanopartículas de la invención en dos aumentos diferentes; y la Figura 2 es una gráfica de los niveles de estradiol en monos Rhesus ovarioectomizados, después de la administración de 1 mg de estradiol por vía tópica, utilizando tres diferentes tipos de vehículos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está relacionada con nanopartículas micelares y con procedimientos para su producción. A diferencia de los sistemas de microcápsulas y de los liposomiales, las presentes nanopartículas micelares presentan una población de tamaño significativo por debajo de los 100 nanometros de diámetro, mientras todavía transportan cantidades significativas de ingredientes activos. Estas nanopartículas micelares resultan particularmente útiles como vehículos de suministro de fármaco por vía tópica, debido a su pequeño tamaño y a otras características que permiten la penetración dérmica rápida. Las partículas micelares son también excepcionalmente versátiles, en el sentido de que entre los materiales activos que pueden ser transportados se incluyen aquellos que pueden ser suspendidos o disueltos en cualquiera de entre aceite, diluyente acuoso o, preferiblemente, el iniciador. Estas propiedades permiten que el sistema sea utilizado con ingredientes activos que resultan difíciles de utilizar en otros sistemas de suministro.

Las nanopartículas micelares se forman combinando primeramente al menos un aceite, preferiblemente un aceite seleccionado de entre los que figuran en la Tabla 1, un estabilizador (tensioactivo), preferiblemente un tensioactivo de entre los que figuran en la Tabla 2, y un iniciador, preferiblemente etanol o metanol. Los estabilizadores más preferidos son Tween 60, Tween 80, Tergitol NP-40 y Tergitol NP-70. En la Tabla 3 (alcoholes y compuestos relacionados) y en la Tabla 4 (extractos aromatizados con alcohol) se muestran posibles iniciadores adicionales. Si alguno de los extractos aromatizados con alcohol de la Tabla 4 tiene un contenido en etanol por debajo del 50%, para tener la seguridad de que el citado contenido en etanol es del 50%, se utiliza una mezcla 1:1 de etanol-extracto. A estos componentes químicos se les pueden adicionar también aceites volátiles (Tabla 5), al igual que coloreantes a la mezcla de aceite- estabilizador-iniciador (Tabla 6). Mediante la adición de ácido oleico a la mezcla de aceite- estabilizador-iniciador, puede introducirse una carga negativa. Una vez pre-mezclados estos materiales, se les inyecta agua o un tampón adecuado, tal como cualquiera de los indicados en la Tabla 7, a elevada velocidad y hacia el interior de la mezcla. La relación preferida de aceite-estabilizador-iniciador es 25:3:5, respectivamente, en base a volumen-volumen. La relación preferida de la fase que contiene aceite premezclado a agua es 4:1, respectivamente. Las nanopartículas pueden ser producidas con instrumentación de jeringa alternativa, instrumentación de flujo continuo o equipo de mezclado a velocidad elevada. Las partículas creadas dentro de esta banda de relación 4:1, tienen diámetros que oscilan entre los 30 y los 500 nanometros. Estas partículas miscibles en agua pueden ser después filtradas a través de, o bien un microfiltro de 0,2 ó de 0,45 micras. Mediante el simple incremento del contenido de agua pueden obtenerse partículas micelares más grandes, así como reduciendo el contenido aceite-estabilizador-iniciador o modificando la cortadura en el momento de la formación de las partículas. Hemos acuñado el término "nanopartículas micelares" para definir aquellas partículas que tienen diámetros promedio por debajo de los 1000 nanometros (una micra).

TABLA 1 Aceites utilizados en la preparación de nanopartículas micelares

Aceite de almendra, dulce

Aceite de hueso de albaricoque

Aceite de borraja

Aceite de canola

Aceite de coco

Aceite de maíz

Aceite se semilla de algodón

Aceite de pescado

Aceite de haba de jojoba

Aceite de manteca de cerdo

Aceite de linaza, hervido

Aceite de nueces de Macadamia

Aceite mineral

Aceite de oliva

Aceite de cacahuete

Aceite de alazor

Aceite de sésamo

Aceite de haba de soja

(continuación)

Escualano

Aceite de semilla de girasol

Tricaprilina (1,2,3-trioctanoilglicerol)

Aceite de germen de trigo

TABLA 2 Estabilizadores/tensioactivos utilizados en la preparación de nanopartículas micelares

Tween 60

Tween 80

Éteres de nonilfenol y polietilenglicol (alquilfenol-hidroxipolioxietileno)

Poli(oxi-1,2-etanodiilo), alfa-(4-nonilfenol)-omega-hidroxi-, ramificado (a saber, Tensioactivo

Tergitol NP-40) Fórmula:C_{95}H_{185}O_{40} MW(promedio)=1980

Mezclas de éter nonilfenol y polietilenglicol (a saber, Tergitol NP-70 (70% AQ) Tensioactivo).

Fórmula y MV: No aplicable (mezcla).

TABLA 3 Iniciadores utilizados en la preparación de las nanopartículas micelares

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Etanol\cr 
Metanol\cr}

TABLA 4

Iniciadores aromatizados (Extractos* aromatizados) utilizados en la preparación de nanopartículas micelares
Extracto de anís puro	(73% de etanol)
Extracto de banana de imitación	(40% de etanol)
Extracto de cereza de imitación	(24% de etanol)
Extracto de chocolate	(23% de etanol)
Extracto de limón puro	(84% de etanol)
Extracto de naranja puro	(80% de etanol)
Extracto de menta puro	(89% de etanol)
Extracto de piña de imitación	(42% de etanol)
Extracto de ron	(35% de etanol)
Extracto de fresa de imitación	(30% de etanol)
Extracto de vainilla pura	(35% de etanol)
*Los extractos utilizados son materiales de tipo alimenticio (McCormick). Los materiales procedentes de otras
fuentes podrían ser sustituidos.

TABLA 5

Aceite de bálsamo

Aceite de laurel

Aceite de bergamota

Aceite de madera de cedro

Aceite de cereza

Aceite de canela

Aceite de clavo

Aceite de orégano

Aceite de menta

\newpage

TABLA 6 Coloreantes* alimenticios utilizados en la preparación de las nanopartículas micelares

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Verde\cr  Amarillo\cr  Rojo\cr 
Azul\cr}

* Los colores para alimentos utilizados son materias de tipo alimenticio (McCormick). Los materiales procedentes de otras fuentes podrían ser sustituidos.

TABLA 7 Lista de diluyentes utilizados en la preparación de las nanopartículas micelares.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Agua para inyección\cr  Salina tamponada con
fosfato\cr}

Los siguientes ejemplos ilustrarán más claramente la invención y su utilidad.

Ejemplo 1 Producción de nanopartículas micelares no cargadas.

La Tabla 8 contiene los materiales utilizados para producir nanopartículas micelares en las cuales el diluyente es agua. En la Tabla 9 se muestran los parámetros de tamaño, obtenidos utilizando un aparato de medición de tamaño Coulter L130 Laser.

TABLA 8

Preparación de nanopartículas micelares utilizando agua como diluyente
Componente químico	Cantidad
Aceite de haba de soja (Aceite)	25 mL
Polisorbato 80 (Tween 80) (Estabilizador)	3 mL
Etanol (Iniciador)	5 mL

Los componentes aceite-estabilizador-iniciador mencionados anteriormente son objeto de mezclado durante un período de 60 segundos. Utilizando instrumentación de jeringa inversa se inyecta un mL de agua en cuatro mL de la mezcla. Esta instrumentación tiene dos jeringas de 5 mL conectadas conjuntamente a través de un conector Leuriok de acero inoxidable, con un orificio de 1/18.000 pulgadas. Las soluciones son conducidas entre las dos jeringas, a través del conector, durante un período de tiempo aproximado de 100 segundos. Las partículas resultantes se secaron sobre rejillas EM, teñidas con acetato de uranilo, y se efectuaron estudios con micrografías electrónicas. La Figura 1a muestra una electromicrografía de esta preparación, con un aumento de 60.000X, mientras que la Figura 1b muestra la misma preparación con un aumento de 150.000X. Después de cada Tabla sigue una breve descripción del procedimiento de producción de las nanopartículas micelares.

TABLA 9

Dimensionamiento de las nanopartículas micelares con agua como diluyente
Preparación	Diámetro promedio LS-130 (nanometros)	Banda LS-130 (nanometros)
Nanopartículas micelares	312	193-455
(SBO/Tw80/E/WFI)

Uno de los problemas derivados de la utilización del dispositivo de establecimiento de tamaño LS-130 reside en el hecho de que este aparato no puede medir tamaños, de manera adecuada, cuando las partículas tienen un diámetro inferior a los 200 nanometros. Utilizando las Figuras 1a y 1b se determina que la mayoría de las partículas tienen diámetros situados en la banda comprendida entre los 70 y los 90 nanometros, teniendo tan solo un 5% de ellas un diámetro superior a los 90 nanometros. Las partículas comprendidas en la banda de entre los 20 y los 30 nanometros resultan visibles en la ampliación mas destacada mostrada en la Figura 1b.

Ejemplo 2 Incorporación de estradiol en el interior de las nanopartículas micelares

Las Tablas 10 y 12 contienen los materiales utilizados para producir los lotes de nanopartículas micelares no cargadas en cuyo interior se ha incorporado estradiol, a dos concentraciones diferentes. Ambas preparaciones han sido preparadas utilizando agua como diluyente. Los materiales con concentraciones más elevadas de estradiol fueron utilizados en los estudios con monos Rhesus descritos en el Ejemplo 3 que sigue. O bien 50 ó 100 mg de estradiol son solubilizados en el iniciador (componente etanol) de la preparación, con anterioridad a la formación de las partículas micelares. Ello resulta necesario, dado que el estradiol precipita en presencia de agua. De hecho, la pequeña cantidad de agua en el etanol de grado reactivo parece resultar suficiente para precipitar el estradiol, dado que las partículas micelares formadas utilizando los materiales y procedimientos descritos en la presente parecen tener cristales de estradiol contenidas en las mismas. No obstante, estos cristales parecen tener más una forma de tipo lámina que la forma de tipo aguja, habitualmente encontrada en la precipitación con agua.

TABLA 10

Preparación de nanopartículas micelares que contienen estradiol
Componentes químicos	Cantidad
Aceite de haba de soja (aceite)	25 mL
Polisorbato 80 (Tween 80) (estabilizador)	3 mL
Etanol (iniciador)	5 mL
Estradiol	50 mL

Las nanopartículas micelares fueron preparadas utilizando procedimientos sustancialmente idénticos a los descritos en el Ejemplo 1, con la excepción de que el estradiol fue disuelto (o suspendido) en el iniciador etanol con anterioridad al mezclado del iniciador con los restantes componentes. Los componentes aceite-estabilizador-iniciador/estradiol son mezclados a mano o pueden ser mezclados durante un período de 60 segundos utilizando un mezclador vortex. Un mL de agua es inyectado en 4 mL de la mezcla resultante utilizando instrumentación de jeringa inversa, tal como se describe en el Ejemplo 1.

TABLA 11

Datos de dimensionamiento de nanopartículas micelares que contienen estradiol (50 mg)
Preparación	Diámetro promedio LS-130 (nanometros)	Banda LS-130 (nanometros)
Nanopartículas micelares	289	174-459
(SBO/Tw80/EtOH-estradiol/WFI)

Los datos de tamaño de estas preparaciones, medidos utilizando un aparato de medición de tamaño Coulter LS130 Laser, se muestran en las Tablas 11 y 13, respectivamente, para las dos preparaciones. El dispositivo de medición de tamaño LS130 no puede medir, de manera adecuada, tamaños de partícula por debajo de los 200 nanometros de diámetro. Estos materiales fueron también secados sobre rejillas EM, teñidas con acetato de uranilo y se llevaron a cabo estudios con micrografría electrónica. Las micrografías electrónicas revelaron que la mayor parte de las partículas están por debajo de los 200 nanometros. Las partículas en la banda de entre 20 y 30 nanometros son visibles. El estradiol cristalizado es rápidamente visible en los micelos más grandes. No se detecta la presencia de cristales de fármaco en ningún campo, lo que sugiere la total incorporación del fármaco en el interior de los micelos.

TABLA 12

Preparación de nanopartículas micelares que contienen estradiol
Componente químico	Cantidad
Aceite de haba de soja (aceite)	25 mL
Polisorbato 80 (Tween 80) (estabilizador)	3 mL
Etanol (iniciador)	5 mL
Estradiol	100 mg

TABLA 13

Datos de dimensionamiento de nanopartículas micelares que contienen estradiol (100 mg)
Preparación	Diámetro promedio LS-130 (nanometros)	Banda LS-130 (nanometros)
Nanopartículas micelares	217	151-291
(SBO/Tw 80/EtOHestradiol/WFI)

Ejemplo 3 Ensayo en mono rhesus de las preparaciones que contienen estradiol

La preparación de estradiol de 100 mg del Ejemplo dos fue objeto de ensayo frente a una preparación estándar de etanol de estradiol, a los efectos de demostrar eficacia. Un miligramo de estradiol, ya sea en etanol (Tabla 15) o nanopartículas micelares (Tabla 14), fue aplicado a la piel de grupos de cuatro monos rhesus ovarioectomizados. Se extrajeron muestras de sangre en serie y se determinaron los niveles de estradiol en suero durante los siguientes 32 días. Los datos de estradiol en suero están representados de manera gráfica en la Figura 2. No se aplicó ningún otro fármaco a la piel de los animales. Los animales fueron sometidos a observación durante un período de 60 días para determinar si el tiempo de ocurrencia, la duración y la gravedad del sangrado vaginal (Tabla 16).

TABLA 14

Niveles de estradiol en suero en monos hembra ovarioectomizados después de
una única aplicación tópica de nanopartículas micelares equivalente a 1 mg de estradiol
Tiempo de	Número de mono	Promedio
muestra	Estradiol en suero	grupo\pmS.E.
	#19567(pg/ml)	#21792(pg/ml)	#22366(pg/ml)	#22405(pg/ml)
0 horas	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
0,5 horas	22,2	49,8	36,9	77,5	46,6\pm11,7
1 hora	37,4	60,9	65,6	108,6	68,1\pm14,8
2 horas	61,5	80,5	87,3	191,3	105,2\pm29,2
4 horas	77,2	132,1	120,6	120,4	112,6\pm12,1
6 horas	89,0	166,3	119,0	158,3	133,2\pm18,0
8 horas	87,5	157,3	116,1	148,1	127,3\pm15,9
12 horas	83,0	160,5	100,6	140,3	121,1\pm17,8
Día 1	90,7	178,0	105,7	132,6	126,8\pm19,2
Día 2	95,5	152,8	90,6	83,5	105,6\pm15,9
Día 3	81,9	122,6	51,1	47,2	75,7\pm17,5
Día 4	91,5	83,9	58,7	50,3	71.1\pm9,9
Día 5	41,6	74,7	35,1	40,0	47,9\pm9,1
Día 6	45,2	63,7	25,6	40,9	43,9\pm7,8
Día 7	18,3	25,9	21,9	27,0	23,3\pm2,0
Día 12	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
Día 17	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
Día 22	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
Día 27	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
Día 32	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
^{a}CDB 3988 = 2,4 mg de estradiol /ml sw Tween/aceite. El volumen de dosificación era de 0,42 ml.
^{b}0 = No detectable. El límite de detección (ED_{90}) para el ensayo era 13,3\pm2,4 pg/ml (promedio \pmS.E., n=4)

TABLA 15

Niveles de estradiol en suero en monos hembra ovarioectomizados después de una
única aplicación tópica de 1 mg de estradiol^{a} conteniendo etanol
Tiempo de	Número de mono	Promedio de
muestra	Estradiol en suero	grupo\pmS.E.
	#G-558(pg/ml)	#G-603(pg/ml)	#E-920(pg/ml)	#E-924(pg/ml)
0 horas	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
0,5 horas	17,7	97,1	44,8	19,5	44,8\pm18,5
1 hora	53,2	44,1	88,3	99,9	71,4\pm13,5
2 horas	144,3	89,4	138,5	155,1	131,8\pm14,6
4 horas	143,7	202,3	165,1	193,6	176,2\pm13,4
6 horas	155,8	257,8	173,1	203,7	197,6\pm22,4
8 horas	114,2	266,1	130,7	130,0	160,3\pm35,5
12 horas	80,8	219,5	86,4	115,9	125,7\pm32,2
Día 1	92,4	145,2	56.9	109,4	101,0\pm18,4
Día 2	74,1	124,2	55,3	107,2	90,2\pm15,6
Día 3	65,0	67,4	51,9	89,2	68,4\pm7,7
Día 4	70,5	79,6	57,8	90,0	74,5\pm6,8
Día 5	53,6	53,2	51,6	47,3	51,4\pm1,4
Día 6	60,1	59,0	59,4	53,0	57,9\pm1,6
Día 7	48,7	40,6	50,3	36,6	44,1\pm3,3
Día 12	28,5	24.2	53,3	0,0^{b}	26,4\pm10,9^{b}
Día 17	0,0^{b}	0,0^{b}	28,9	0,0^{b}	7,2\pm7,2^{b}
Día 22	0,0^{b}	0,0^{b}	13,8	0,0^{b}	3,5\pm3,5
Día 27	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
Día 32	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0^{b}	0,0\pm0,0^{b}
^{a}CDB 100= 2,4 mg de estradiol/ml de etanol absoluto. El volumen de dosificación era de 4,2 ml.
^{b}0= No detectable. El límite de detección (ED_{90}) para el ensayo era 13,2\pm2,4 pg/ml (promedio\pmS.E., n=4)

Los datos en las Tablas 14 y 15 y en la Figura 2 muestran que en el torrente sanguíneo de ambos grupos de animales ovarioectomizados se encuentran presentes niveles terapéuticos de estrógeno en suero, transcurrida una hora desde la única aplicación. Con la preparación de etanol se mantienen niveles promedio de estradiol por encima de los 40 picogramos/ml por espacio de 7 días y por espacio de 6 días con la preparación de nanopartículas. Cuando los niveles de estrógenos permanecen bajos (ver la Figura 2 y la Tabla 16), en ambos grupos se produce sangrado vaginal. También de particular interés es la forma de las curvas en la Figura 2. La preparación de etanol-estradiol genera una curva en forma de "diente de tiburón" que muestra una alta acción inicial y una pronunciada caída, mientras que la preparación de nanopartículas micelares genera más un efecto "mesa", con un nivel prácticamente plano durante varias horas. Este efecto "mesa" resulta a menudo preferido, dado que permite minimizar algunos de los problemas asociados con los períodos punta.

TABLA 16

Sangrado por retirada de estrógeno en monos rhesus ovarioectomizados después de una
única aplicación tópica de estradiol en alcohol o de nanopartículas micelares
CDB Nº	Éster de estradiol	Sangrado por retirada
		Días	Intensidad^{a}
		Latencia	Duración
100	Estradiol en	19,5\pm0,3	4,3\pm0,9	1,6\pm0,2
	solución alcohólica
3988	Formulación^{b} de	16,5\pm0,5^{c}	7,3\pm1,5	1,6\pm0,1
	estradiol
^{a} Intensidad promedio de sangrado (1=escasa, moderada, 3=fuerte), durante el período de sangrado
^{b}Suspensión Novavax MN 11294-2
^{c}Significativamente diferente (p<0,01) a la de estradiol en solución alcohólica basado en un análisis
unilateral de la variancia seguido de un ensayo Student Neuman-Keuls de banda múltiple

Por consiguiente, este ejemplo demuestra en un primate no humano que las nanopartículas micelares de la invención pueden ser utilizadas para suministrar estradiol a través de la piel intacta con mantenimiento de los niveles terapéuticos de estradiol en suero, durante un período de 6 días subsiguientes a la única aplicación. Esta tecnología puede tener numerosas aplicaciones terapéuticas en medicina.

La preparación de estradiol es también estable a una diversidad de temperaturas. La Tabla 17 muestra datos de estabilidad térmica para la preparación de nanopartículas micelares del Ejemplo 2 a -20ºC, 25ºC y 65ºC. Tal como queda claro, si bien las nanopartículas micelares son inestables a temperaturas elevadas, las mismas son estables a temperatura ambiente y a bajas temperaturas.

TABLA 17

Estabilidad térmica de las nanopartículas micelares
Preparación	Diámetro		Banda LS-130
	promedio LS-130		(nanometros)
	(nanometros)
Nanopartículas micelares
(SBO)/Tw80/Etohestradiol/WFI	361		168-599
Almacenamiento a 25ºC
Nanopartículas micelares
(SBO)/Tw80/Etohestradiol/WFI	312		179-510
Almacenamiento a -20ºC
Nanopartículas micelares
(SBO)/Tw80/Etohestradiol/WFI		Inestable
Almacenamiento a 65ºC

Además, las nanopartículas micelares de la invención pueden ser diluidas con soluciones acuosas sin pérdida de estabilidad. Esto permite la posibilidad de utilizar productos de elevada concentración, los cuales pueden ser diluidos durante su utilización, según resulte necesario.

Claims (12)

1. Nanopartícula micelar que tiene un diámetro comprendido entre 25 y 1000 nm, comprendiendo dicha nanopartícula micelar una fase lipófila que incluye un aceite, un estabilizador y un iniciador de base alcohólica, hidratada con una solución adecuada de base acuosa, en donde dicho estabilizador se selecciona de entre monoestearato sorbitan polioxitileno 20 (Tween 60), monooleato de sorbitan de polioxietileno 20 (Tween 80), éteres de nonilfenol y polietilenglicol y mezclas de los mismos.

2. Nanopartícula micelar de la reivindicación 1, en donde dicho iniciador es seleccionado a partir de materiales de base alcohólica que contienen metanol, etanol o una mezcla de los mismos, preferiblemente al menos el 50% de etanol, metanol o mezclas de los mismos.

3. Nanopartícula micelar de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho aceite se selecciona de entre aceites vegetales, aceites de nuez, aceites de pescado, aceites de manteca de cerdo, aceites minerales, escualano, tricaprilina y mezclas de los mismos.

4. Nanopartícula micelar de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha solución acuosa comprende una solución fisiológicamente compatible, siendo seleccionada dicha solución acuosa preferiblemente de entre agua y solución salina tamponada con fosfato.

5. Nanopartícula micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha fase acuosa y/o el aceite y/o el iniciador tiene un material activo disuelto o suspendido en el mismo.

6. Nanopartícula micelar de la reivindicación 5, en donde dicho iniciador tiene estradiol disuelto o suspendido en el mismo.

7. Nanopartícula micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha nanopartícula micelar es dispersable en solución acuosa.

8. Nanopartícula micelar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el diámetro de dicha nanopartícula micelar permite el paso a través de un filtro de 0,2 mm.

9. Procedimiento para la preparación de nanopartículas micelares, que comprende las etapas de:

Mezclar un exceso de un aceite, conjuntamente con un estabilizador y un iniciador, para formar una fase lipófila, siendo seleccionado dicho estabilizador de entre Tween 60, Tween 80, éteres de nonilfenol polietilenglicol y mezclas de los mismos;

Preparar una solución de diluyente que tiene una base de solución acuosa; y

Mezclar un exceso de dicha fase lipófila con dicho diluyente para formar dichas nanopartículas micelares.

10. Procedimiento de la reivindicación 9, en donde dichas nanopartículas micelares presentan las características de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

11. Procedimiento de la reivindicación 9 ó 10, en donde dicho mezclado de la citada fase lipófila y del citado diluyente se logra utilizando una velocidad relativa de 50 m/s a través de un orificio de 1,41 \mum (1/18.000 pulgadas).

12. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la relación de dicha fase lipófila a la citada fase acuosa es 4:1.