EP3810216A1 - Bioaktiver träger - Google Patents

Bioaktiver träger

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EP3810216A1
EP3810216A1 EP19729515.7A EP19729515A EP3810216A1 EP 3810216 A1 EP3810216 A1 EP 3810216A1 EP 19729515 A EP19729515 A EP 19729515A EP 3810216 A1 EP3810216 A1 EP 3810216A1
Authority
EP
European Patent Office
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glass
mass
maximum
bioactive carrier
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19729515.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Armin Lenhart
Lukas Forchheimer
Gundula Schulze-Tanzil
Clemens Gögele
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Klinikum Nuernberg Medical School GmbH
Georg Simon Ohm Hochschule fuer Angewandte Wissenschaften Fachhochschule Nurnberg
Original Assignee
Klinikum Nuernberg Medical School GmbH
Georg Simon Ohm Hochschule fuer Angewandte Wissenschaften Fachhochschule Nurnberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Klinikum Nuernberg Medical School GmbH, Georg Simon Ohm Hochschule fuer Angewandte Wissenschaften Fachhochschule Nurnberg filed Critical Klinikum Nuernberg Medical School GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the invention relates to a bioactive carrier for the settlement of living cells.
  • Osteoarthritis is a common joint disease that is economically very important due to the treatment costs and incapacity to work, the importance of which is increasing against the background of the current demographic change. It is currently incurable, marked by a
  • tissue engineering This process of obtaining tissue by culturing cultivated cells in a suitable biomaterial is called "tissue engineering”.
  • tissue engineering This means that cell proliferation of adherent cells and subsequent tissue formation on a three-dimensional bioactive carrier, usually called “scaffold", is achieved in vitro.
  • chondrocytes so-called chondrocytes, cells taken from the body have to be stimulated in a suitable environment.
  • a suitable geometrical arrangement of the cells can form the new one Support tissue.
  • Tissue formation is of major importance:
  • a suitable scaffold for the growth of the cells i.e. a bioactive carrier that not only meets the mechanical requirements placed on such a carrier in future tissue, but is also sufficiently cyto- and biocompatible to do this To ensure cell survival and not trigger inflammation.
  • Cell adhesion to the scaffold must be possible.
  • the cell surface receptors must therefore recognize structures in the scaffold as binding motifs and the necessary cofactors (including ions) must be sufficiently available.
  • Signal transduction of the living cells may be possible, which can be achieved, for example, by growth stimulators (such as growth factors, ions, but also a suitable scaffold topology).
  • growth stimulators such as growth factors, ions, but also a suitable scaffold topology.
  • ECM extracellular matrix
  • glass is regarded as an excellent material for the production of such a bioactive carrier.
  • Bioactive carriers also called bio glasses, are known in various applications, for example from WO 2011/161 422 A1 or WO 2016/089 731 A1, furthermore from WO 2014/168 631 A1, which are also explicitly concerned with the production of a scaffold.
  • bioactive carriers or bio glasses described there are based on alkaline earth and phosphate
  • the hydroxyapatite layer acts as a diffusion barrier, which at least hinders, if not prevents, the subsequent dissolution of the framework-like glass support in the body.
  • a bioactive carrier for the settlement of living cells is provided according to the invention, with a porous three-dimensional glass framework which has an alkaline earth metal oxide content of at most 2.0% by mass and which is at least superficially reduced in its alkali metal oxide content by leaching ,
  • the bioactive glass carrier according to the invention is characterized by a porous three-dimensional web structure which has a specific glass composition with regard to the content of alkaline earth metal oxides and alkali metal oxides.
  • an extremely low content of alkaline earth metal oxides is contained, the content is a maximum of 2.0% based on the dry carrier, ie the pure dry substance without embedded OH groups and
  • the glass composition is characterized in that there is no addition of any alkaline earth metal oxide.
  • the basic composition of the glass from which the bioactive carrier is made is generally available to a sufficient extent, since these alkali oxides, usually Na2Ü and K2O, serve as network converters and are required to adjust the melting and sintering temperature.
  • these alkali metal oxides are deliberately removed from the glass matrix. This means that the Na + and K + ions from the Glass matrix detached by the acid attack, i.e. released from its bond in the network. There is therefore an ion exchange between Na + and K + in the network and H + in the glass. This leads to a drained gel layer with a minimal amount of alkali.
  • a first advantage of this leaching or ion exchange is that when this glass is stored in aqueous solutions (cell culture medium) there are no dissolving reactions of the glass, in which the pH value changes significantly into the toxic range. This applies in particular to the local area on the surface of the glass, this is the contact area between the adherent cells and the glass.
  • a second advantage of this leaching i.e. The ion exchange is that OH groups or water can be stored in this “open” network.
  • This inclusion and the ion composition on the scaffold surface have proven to be advantageous for the adhesion of the cells and the stimulation of the cell receptors that interact with the surface of the scaffold.
  • the bioactive carrier according to the invention therefore allows very good adhesion and thus colonization with the living cells to be multiplied, in particular cartilage cells. Furthermore, the bioactive carrier according to the invention shows no discernible tendency that the cell differentiation is not chondrogenic i.e. in a differentiation direction than z. B. to influence cartilage cells, as is the case for known carriers with the hydroxyapatite layer. This means that the bioactive carrier behaves neutrally with regard to cell differentiation.
  • Glass carrier also dissolves due to the hydrolytic acid-alkali attack of the surrounding medium given an in vivo use.
  • one of the central features of the bioactive carrier or bioglass according to the invention is that a superficial strong one
  • Alkali metal oxide reduction can only be superficial. This means that the thin webs are only reduced in the area of a relatively narrow surface layer. As an alternative to this, the alkali metal oxide content can also be reduced far in depth, even to the extent that the bridge framework is reduced in alkali over the entire bridge cross section.
  • Hydrochloric acid for example at 37 ° C instead.
  • the ion exchange between Na + / K + and H + takes place here, as does the incorporation of H2O or OH- into the glass, so that a glass matrix with a high water or OH group content is formed. So water is stored, similar to a gel layer.
  • a superficially reduced alkali metal oxide content can be achieved after only about 1 to 1.5 days for leaching.
  • a complete ion exchange of a scaffold bar can be achieved after approx. 12 days, whereby a bar thickness between 30 - 120 pm is required.
  • the alkali metal oxide content should be reduced as far as possible.
  • the content of alkali metal oxides in the leached-out area of the finished bioactive carrier should be a maximum of 6.5% by mass (based on the dry substance), be it superficial or over the entire cross-section, preferably it should be less than 4% by mass.
  • the degree of leaching is naturally greater the longer the leaching takes place.
  • the tissue formation process through the cells to be multiplied also influences the concrete geometry of the bar framework.
  • the pore size of the bridge scaffold should be between 20 and 300 pm, in particular between 50 and 200 pm. This means that the pores are sufficiently small so that they can contain cells and ECM formed by them can be fully populated or closed within a few days or weeks.
  • the web thickness should be between 30 and 120 mm, in particular between 50 and 100 ⁇ m. This is expedient in that, as described, the bioactive carrier, that is to say the glass bar structure, is dissolved during later in vivo use. The thinner the webs, the faster the resolution.
  • the glass composition is essential for the bioactive carrier according to the invention.
  • the following mass percentages relate to the dried carrier, i.e. to the pure dry substance.
  • the bioactive carrier in mass%) contains:
  • the bioactive carrier according to the invention is distinguished by the fact that it has only a minimal content of alkaline earth metal oxides, in particular CaO, which, as described, is disadvantageous
  • the content of alkaline earth metal oxides, in particular CaO is a maximum of 2.0% by mass (based on the dry substance), preferably significantly less.
  • the measurement of the respective amounts or proportions takes place, for. B. with X-ray fluorescence or
  • the bioactive carrier can contain (in mass% based on the dry substance):
  • the bioactive carrier can additionally contain (in mass% based on the dry substance): - Ti0 2 0.1 - 0.5 and / or
  • bioactive carrier can additionally contain (in mass% based on the dry substance):
  • the invention further relates to a specific glass composition according to the invention which is suitable for the
  • Glass composition contains (in mass%):
  • Glass composition is less than 2% by mass, especially less than 1.5% by mass, preferably less than 1% by mass and in particular less than 0.5% by mass.
  • the glass composition according to the invention and thus also the bioglass that can be produced essentially contains the network formers S1O 2, P 2 0s and B 2 O3 and the network converters Na 2 Ü and K 2 O. Because of the proportion of P 2 O 5 and B 2 O3 it is possible to set the Si0 2 content between 60.0-65.5 mass%, it preferably being in the range between 62-63 mass%. Due to the addition of P 2 O 5 , the glass contains the phosphate ions which are necessary for cell proliferation and are usually present in the cell culture medium anyway and essentially buffer the pH. B 2 O 3 serves to stabilize the glass structure, the boron ions also proving to be beneficial in terms of cell proliferation.
  • the network formers Na2Ü and K2O are to the specified proportions
  • the proportion of Na2Ü and K2O was chosen as high as possible for the glass composition according to the invention, since the leachability increases with the alkali fraction and the remaining residual glass is only slightly polymerized. This is advantageous for in vivo resolution.
  • the selected composition is also advantageous in that there is a high diffusion coefficient on the part of the alkali, that is to say the Na + and the K + , which has a very beneficial effect on the high and rapid leachability. As described, it is possible to leach out the surface of the glass web superficially or completely, so that the alkali metal oxide content is ⁇ 6.5% by mass, preferably ⁇ 4% by mass, based on the dry matter.
  • the glass composition can contain (in mass%):
  • alkaline earth metal oxides 0 0.5 - 1, 5, whereby here too the proportion of alkaline earth metal oxides is as low as possible, that is ⁇ 2 mass% or significantly less.
  • the glass composition according to the invention can additionally contain (in mass%): T1O2 0.1-0.5 and / or
  • T1O2 and / or Zr0 2 can be added to promote or increase the stability within the leached layer. As a result of the leaching, there are slight tensions within the matrix due to the solid Si bonds. After the finished bioactive carrier is stored in a liquid medium, usually a TRIS buffer, these do not have a negative effect.
  • the gel layer can be stabilized by adding T1O2 respectively
  • Zr0 2 can be achieved because the Ti and Zr ions form permanent bonds.
  • the glass composition additionally contains according to the invention (in mass%):
  • Add glass composition Copper ions have an antibacterial effect, zinc ions have an anti-inflammatory effect. This means that the addition of minimal amounts of CuO and / or ZnO can also have a positive effect on cell growth. It is also possible to additionally add to the glass composition according to the invention (in mass%): - NaCl max. 0.5 and / or
  • These compounds can be used to introduce fluoride and / or chloride ions into the glass matrix. These have a favorable influence on the proliferation of the cells, which is why their addition is advantageous even with a small proportion.
  • the glass composition according to the invention additionally contains (in mass%): - Na 2 S0 4 max. 0.6 and / or
  • These two compounds are preferably added to the batch in order to homogenize and refine the melt.
  • the stated mass% values refer to the glass composition of the respective components of the raw material mixture before melting.
  • the mass% values on the molten glass can be recorded in a corresponding manner with the corresponding values. All that is varied is the proportion of Na2Ü and K2O that are leached out as alkali metal oxides from the finished bioglass carrier, as described in the introduction. In the event that the melted glass is to be used as bioglass in a non-leached form, the corresponding Na2Ü and K 2 0 proportions are also found on the melted glass.
  • a concrete glass composition contains (in mass%):
  • the invention further relates to a method for producing a bioactive
  • Vitreous is poured.
  • the melting preferably takes place at approx. 1,300 ° C, the holding time is selected depending on the corresponding glass composition, it is approx. 5-7 hours.
  • the melt which has a viscosity of approx. 10 2 dPas, is then poured into a preheated steel mold, removed from the mold and transferred in solid form to another furnace in order to relieve tension during the further cooling. Any casting geometry can be created here.
  • vitreous is crushed and ground. This can be done in a suitable mill, for example a ball mill. The grinding is carried out until a correspondingly fine glass powder is obtained, an appropriate grain size fraction being separated off if necessary.
  • the glass powder is then mixed with an aqueous or organic solvent to form a suspension, which is then further processed to form the carrier.
  • a porous sponge carrier made of a polymer is used according to the invention.
  • This sponge carrier which has the desired geometry of the bioactive carrier to be produced, serves as a carrier for the ground glass powder.
  • a suspension is applied, which the glass powder is applied to the porous sponge carrier, so that its surface is covered with the glass powder. That means that the powder particles on the
  • Sponge carrier This serves two purposes, firstly the thermal decomposition of the sponge carrier, which means that it is thermally destroyed; on the other hand, the simultaneous sintering of the glass powder to form a porous three-dimensional framework as the basis for the bioactive carrier.
  • Sponge carrier formed a stable, porous, three-dimensional web structure. It should be noted here that the glass particles are sintered, which means that the glass particles adhere to one another by viscous flow without crystallizing. The web structure formed shows the sponge structure reduced in proportion.
  • the three-dimensional bar framework produced in this way is then leached out in order to reduce the alkali metal oxide content.
  • the finished bioactive carrier or the scaffold is then stored in a fluid, preferably a TRIS buffer, until it is used for cell growth.
  • the glass powder itself can be sieved as described, a glass powder fraction with a grain size ⁇ 100 mm, in particular ⁇ 40 ⁇ m, is preferably formed, with which the suspension is subsequently produced.
  • the suspension can preferably be prepared with isopropanol as the solvent, although other solvents can also be used.
  • a dispersant and / or a binder can be added to the suspension.
  • the dispersant serves to avoid the formation of agglomerates, while the binder, preferably polyvinyl alcohol, has an emulsifying effect.
  • a sponge made of polyurethane is preferably used as the sponge carrier, for example one from Eurofoam Kunststoff GmbH under the
  • the heat treatment for the degeneration of the polymer sponge carrier and for the sintering of the glass particles takes place at a temperature of 550-800 ° C, in particular 600-740 ° C. This temperature is sufficient to decompose the organic sponge and at the same time to sinter the glass particles together.
  • the sintering time can range from a few minutes to 2 hours.
  • the finished sintered glass bridge framework is leached out with hydrochloric acid, preferably 0.1 molar hydrochloric acid, preferably at a slightly higher level
  • Fig. 2 shows the bioactive carrier from Fig. 1 after the leaching of
  • Fig. 3 is a diagram for explaining the essential steps of the
  • Fig. 5 is a diagram of a line scan over the fracture surface of the
  • FIG. 6 shows a microscopic image of living porcine articular chondrocytes on a bioactive carrier according to the invention after 24 hours
  • FIG. 7 shows a microscopic image of living porcine articular chondrocytes on a bioactive carrier according to the invention after 21 days of colonization
  • 8 shows a microscopic picture of living human mesenchymal stromal cells on a bioactive carrier according to the invention after 24 hours of colonization
  • FIG. 9 shows a microscopic picture of living human mesenchymal painters
  • FIG. 11 shows a microscopic image of living human fluff fibroblasts on a bioactive carrier according to the invention after 7 days of colonization.
  • 1 shows a microscopically enlarged image of a bioactive carrier, that is to say a bioglass scaffold, before the alkali metal oxides are leached out according to the invention.
  • this bioactive carrier a raw material mixture of highly pure, powdery and mainly oxidic raw materials corresponding to the selected composition, for example the above composition, is first weighed out in one, as shown in FIG. 3
  • melt contamination melted in a platinum-gold crucible (see steps a and b in Fig. 3). After melting at the melting temperature of approx. 1300 ° C. and a holding time of approx. 6 hours, the relevant parameters depending on the glass composition selected, the melt is preferably poured into a preheated steel mold in order to
  • vitreous After casting and demoulding, the vitreous is transferred to another furnace to relieve any intrinsic stress.
  • a glass powder is produced from the glass body, for which purpose the glass body is broken and comminuted in a mill, preferably a zirconium oxide ball mill. After grinding, it will
  • Glass powder sieved and fractionated accordingly preferably only very fine glass powder with a grain size up to approx. 40 pm being used for the further production of the bioactive carrier or the scaffold.
  • step d a slip, ie a suspension of the or
  • fractionated glass powder containing the fractionated glass powder. This is done with the addition of one or more dispersants and at least one binder, such as polyvinyl alcohol in an aqueous or organic solvent, such as polyvinyl alcohol in an aqueous or organic solvent, such as polyvinyl alcohol in an aqueous or organic solvent, such as polyvinyl alcohol in an aqueous or organic solvent, such as polyvinyl alcohol in an aqueous or organic solvent
  • Solvents such as isopropanol.
  • the slip is homogenized with a stirring device such as a magnetic stirrer fish.
  • the slip produced in this way is then applied (see step e in FIG. 3) to a porous sponge carrier made of a polymer such that the slip or the suspension covers the surface of the sponge carrier, hence the glass powder dispersed in the slip
  • the covered sponge carrier is heated.
  • the temperature is increased until a sintering temperature for the glass powder is reached, which is in the range between 600 - 740 ° C.
  • the polymer sponge carrier preferably consisting of polyurethane, degrades, on the one hand, that is, the organic components are oxidized and converted into the gaseous phase.
  • the powder particles sinter together without crystallizing. This is done by viscous flow in the interface area.
  • the glass particles sintered to one another depict the sponge structure in a proportionally reduced manner, that is to say that the resulting sintered glass body is consequently an exact, albeit proportionally reduced, image of the porous sponge carrier originally used, and is therefore also correspondingly porous.
  • the three-dimensional vitreous body or bioactive carrier has a corresponding three-dimensional bar structure with large pores located between the bars.
  • the bioactive carrier shown in Fig. 1 is not leached, that is, it is the result of the process after the end of the heat treatment.
  • the bioactive carrier 1 shown in FIG. 1 has a three-dimensional web framework 2 with a large number of individual webs 3, which form a porous but stable framework which has a corresponding number of pores or passages 4 defined via the webs.
  • the webs and the pores or passages have, depending on the sponge carrier used, which, as described, forms the basis for the vitreous body depicting it,
  • FIG. 1 shows the bioactive carrier 1 before leaching.
  • the bioactive carrier 1 is then leached out in a next step g (see FIG. 3) in order to remove alkaline earth metal oxides, i.e. the sodium contained in the glass, at least in the area of the bars 3, preferably over the entire bar cross section - and leach potassium ions.
  • the bioactive carrier 1 according to FIG. 1 is placed, for example, in 1 normal salt column at, for example, 37 ° C.
  • H2O is embedded in the glass structure, so that depending on how long the acid treatment lasts and how deep it takes
  • a bioactive carrier 1 is rinsed and then in a buffer solution, for example a TRIS buffer,
  • FIG. 2 shows a microscopically enlarged image of a leached bioactive carrier 1 or the bar framework 2.
  • the leaching out of the alkali ions and the incorporation of the water into the bar framework change its glass structure or composition, which also changes optically in the form of the slightly milky bars 3 shows.
  • the web structure as such is retained, as is the pore structure, as the comparison between FIGS. 1 and 2 clearly shows.
  • the bioactive carrier 1 according to the invention is reduced by leaching at least at the edge in its content of alkali ions or alkali oxides.
  • 4 and 5 show an element scan in one
  • the upper, solid line shows the Si concentration
  • the lower, dashed line the Na concentration
  • Degree of leaching as shown by way of example in FIGS. 4 and 5, can be achieved after a leaching time of approximately 12 hours.
  • the potassium ion content even if not shown in FIG. 5, would be similar, here too there would be a significant drop in the range in which the acid is diffused, although the potassium content is generally significantly lower than the sodium content.
  • a bioactive carrier according to the invention with a leached out surface layer or a deeply leached out bridge structure serves to colonize and multiply cells living on it.
  • colonization experiments were carried out with three different cell types, namely with porcine
  • Gel cchondrocytes with human mesenchymal stromal cells that can be prospectively differentiated into corpus cells, and with human skin fibroblasts. 6 - 11 show two microscopic images for each cell type at different times, which clearly show the colonization and growth process with the different cell types.
  • FIG. 6 and 7 show two images of a bioactive carrier populated with porcine articular chondrocytes.
  • FIG. 6 shows the state of colonization 24 hours after the application of the porcine articular chondrocytes
  • FIG. 7 shows the state of colonization after 21 days.
  • bioactive carrier according to the invention with human mesenchymal
  • FIG. 8 showing the condition 24 hours after the application of the stromal cells
  • FIG. 9 the condition after 7 days of colonization.
  • FIGS. 10 and 11 show the colonization of a bioactive carrier according to the invention with human skin fibroblasts, once after 24 hours of colonization (FIG. 10), once after 7 days of colonization (FIG. 11).
  • Articular chondrocytes and human fibroblasts addition of 5 ml of culture medium containing Fletal's F-12 / Dulbecco's Modified Eagle's (DME) medium containing 50% fetal calf serum (FCS) [DMEM] medium 1: 1), 50 IU / ml streptomycin, 50 IU / ml penicillin, 2.5 pg / ml amphotericin B, non-essential amino acids and 25 pg / ml ascorbic acid
  • DME Dulbecco's Modified Eagle's
  • FCS fetal calf serum
  • Mesenchymal stromal cells addition of 5 ml stem cell-specific medium (FG0445 / Dulbecco’s Modified Eagle’s [DMEM] / FIG) with 5%
  • 6-11 are the living cells of the respective cell types
  • FIG. 6 and 7 show laser scanning microscope images of a bioactive carrier with porcine articular chondrocytes.
  • the carrier was already populated with living cells over a large area within 24 hours after the cell solution had been pipetted on.
  • a continuous cell growth or a continuous cell multiplication began, as FIG. 7 clearly shows.
  • the bioactive carrier is significantly more extensive or more densely populated, the uninhabited areas, or the pores or zones between the webs, are significantly smaller, sometimes completely filled.
  • bioactive carrier according to the invention demonstrably enables active cell growth or active cell multiplication of this cell type.
  • Fluorescent dye DAPI (stock solution: 20 mg / ml) in the dilution 1: 100 after incubation for 60 minutes at room temperature in the dark, rinsing the support 3 times for 5 minutes with TBS (1x)
  • the PFA solution paraformaldehyde
  • the blocking solution serves to prevent non-specific binding of the antibodies to be detected and to achieve permeabilization of the cell membrane.
  • TBS TBS-buffered saline
  • the antibody solution (AK) is used to detect the desired protein, here collagen type II and type I.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • Type II collagen is only contained in gels of kchondrocytes. Consequently, if the cells show collagen type II after the prolonged colonization, i.e. if they have the corresponding positive immune labeling, this proves that they are articular chondrocytes that were originally pipetted on and have therefore multiplied.
  • leached bioactive carrier according to the invention has no influence on the cell type, unlike previously known bio glasses, in which the
  • the bioactive carrier according to the invention is consequently completely inert with regard to the cell types to be grown.
  • FIG. 8 and 9 show two microscope images of bioactive carriers after 24 hours and 7 days of colonization with mesenchymal stromal cells.
  • FIG. 8 shows on the basis of FIG. 8 that basic settlement has already taken place at the beginning of the incubation period, but the settled areas are not yet too large.
  • FIG. 9 shows that the cells have proliferated rapidly. It can be seen that the bioactive carrier is largely populated after only 7 days of incubation. Accordingly, this cell type also grows actively and at a high rate of increase on the leached bioactive carrier according to the invention.
  • FIGS. 10 and 11 show a bioactive carrier with flaut fibroblasts after 24 hours and 7 days of colonization. Already after 24 hours, a relatively large-scale settlement appears, the increase is steadily increasing. As shown in FIG. 11, the carrier is almost completely populated after 7 days.
  • the experiments show that the bioactive carrier according to the invention enables the growth of different cell types. This means that it is not selectively only suitable for a certain cell type.

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Abstract

Bioaktiver Träger für die Ansiedlung lebender Zellen, mit einem porösen dreidimensionalen Steggerüst aus Glas, das einen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden von maximal 2,0 Masse% aufweist und das zumindest oberflächlich durch Auslaugung in seinem Gehalt an Alkalimetalloxiden reduziert ist.

Description

Bioaktiver Träger
Die Erfindung betrifft einen bioaktiven Träger für die Ansiedlung lebender Zellen.
Die Arthrose ist eine häufige und durch entstehende Behandlungskosten und Arbeitsunfähigkeit volkswirtschaftlich sehr wichtige Gelenkerkrankung, deren Bedeutung vor dem Hintergrund des derzeitigen demografischen Wandels zunimmt. Sie ist derzeit noch unheilbar, gekennzeichnet durch einen
fortschreitenden Verlauf, wobei in den Gelenken unter anderem der Knorpel angegriffen wird, seine Festigkeit verliert und teilweise aufgelöst wird. Die Arthrose entsteht oft als Folge von Gelenkknorpelverletzungen, denn der Gelenkknorpel und Knorpelgewebe im Allgemeinen verfügen über keine Selbstheilungsfähigkeit. Als Behandlungsoption zur Rekonstruktion der Gelenkflächen nach
Knorpelverletzungen und fortgeschrittener Arthrose bleibt häufig nur ein
entsprechender chirurgischer Eingriff, der oft mit einem teilweisen oder kompletten Ersatz des Gelenks durch ein Implantat einhergeht. Alternativ hierzu wird die Möglichkeit der Züchtung von entsprechendem körpereigenem Knorpelgewebe in vitro als biologischer Ersatz angestrebt. Dieses Ersatzgewebe wird nach seiner Züchtung in den Knorpeldefekt des Patienten übertragen, um den defekten Gelenkknorpel zu ersetzen.
Um eine dreidimensionale Anordnung der Knorpelzellen zu gewährleisten, werden natürliche und synthetische Biomaterialien eingesetzt, die sich sobald die
Gewebeneubildung im Defekt vorangeschritten ist, auflösen sollen.
Dieses Verfahren der Gewebegewinnung durch Züchtung kultivierter Zellen in einem geeigneten Biomaterial wird„Tissue Engineering“ genannt. Hierbei wird also zunächst in vitro, in einer Zellkultur eine Zellproliferation von adhärenten Zellen und eine anschließende Gewebebildung auf einem dreidimensionalen bioaktiven Träger, üblicherweise„Scaffold“ genannt, erreicht. Um dieses in vitro Wachstum von Knorpelzellen, sog. Chondrozyten zu erreichen, müssen aus dem Körper entnommene Zellen in einer geeigneten Umgebung stimuliert werden. Eine passende geometrische Anordnung der Zellen kann die Bildung des neuen Gewebes unterstützen. Für das in vitro Wachstum der Zellen und eine
Gewebebildung sind mehrere grundlegende Faktoren von hoher Bedeutung:
Es muss ein geeignetes Gerüst für das Wachstum der Zellen vorhanden sein, also ein bioaktiver Träger, der nicht nur die mechanischen Anforderungen, die an einen solchen Träger im zukünftigen Gewebe gestellt werden, erfüllt, sondern der auch hinreichend zyto- und biokompatibel ist, um das Zellüberleben zu gewährleisten und keine Entzündung auszulösen.
Auf dem bioaktiven Träger, dem sogenannten Scaffold müssen lebende und vermehrbare Zellen ansiedelbar sein. Das heißt, dass eine hinreichende
Zelladhäsion am Scaffold möglich sein muss. Die Zelloberflächenrezeptoren müssen daher Strukturen im Scaffold als Bindungsmotive erkennen und die dafür erforderlichen Kofaktoren (u.a. Ionen) müssen ausreichend verfügbar sein.
Weiterhin muss eine Anregung und Kontrolle einer Zelltyp-spezifischen
Signaltransduktion der lebenden Zellen möglich sein, was beispielsweise durch Wachstumsstimulatoren (wie Wachstumsfaktoren, Ionen, aber auch eine geeignete Scaffoldtopologie) erreicht werden kann.
Schließlich muss für eine initiale Zellproliferation, also eine Zellvermehrung und ein Zellwachstum, sowie eine spätere Differenzierung der Zellen ein förderliches extrazelluläres Milieu in dem Scaffold und um die Zellen herum vorhanden sein.
Von besonderem Interesse ist die durch u.a. die geometrische Scaffoldstruktur (Topologie) und Wachstumsfaktoren gesteuerte Synthese einer neuen
extrazellulären Knorpelmatrix durch die Zellen im Scaffold, da der Gelenkknorpel zu über 90 % aus extrazellulärer Matrix (ECM = extracellular matrix) besteht. Bei den Stimulationsfaktoren für das Zellwachstum und für die Matrixsynthese kann man im Wesentlichen zwischen elektro-/biochemischen, Struktur-assoziierten und mechanischen, Faktoren unterscheiden. Wenn sich die angesiedelten Zellen gut vermehren sollen, sind diese Faktoren entsprechend für die zu züchtende Zellart zu wählen. Im Rahmen des Tissue Engineering stellt dabei der bioaktive Träger, also das Scaffold ein zentrales Element dar, denn es muss einerseits mechanisch hinreichend stabil sein, andererseits muss es die Zelladhäsion, das Zellwachstum und die Synthese extrazellulärer Matrix (ECM-Synthese) ermöglichen. Auch muss es auflösbar („degradierbar“) sein, wobei durch das Auflösen des bioaktiven Scaffolds entstehende Konzentrationsgradienten von Ionen mit entsprechenden chemischen und elektrochemischen Potentialen die Zell proliferation, die
Zelldifferenzierung und die ECM-Synthese unterstützen können. Glas wird in diesem Zusammenhang als exzellenter Werkstoff für die Herstellung eines solchen bioaktiven Trägers angesehen.
Bioaktive Träger, auch Biogläser genannt, sind in unterschiedlichen Anwendungen bekannt, beispielsweise aus WO 2011/161 422 A1 oder WO 2016/089 731 A1 , ferner aus WO 2014/168 631 A1 , die sich auch explizit mit der Herstellung eines Scaffolds beschäftigen. Die dort beschriebenen bioaktiven Träger, respektive Biogläser, basieren jedoch auf erdalkalihaltigen und phosphathaltigen
Glassystemen, die in wässrigen Lösungen eine Hydroxylapatit-Schicht an der Glasoberfläche bilden. Diese Hydroxylapatit-Schicht bildet eine Grenzfläche, als sogennante Grenzschicht, an der die lebenden, zu vermehrenden Zellen anhaften müssen und die wachstumsförderlich sein soll. Das bekannteste dieser
erdalkalihaltigen Biogläser ist unter der Bezeichnung 45 S5 bekannt.
Problematisch bei diesen Biogläsern ist jedoch, dass die Hydroxylapatit-Schicht quasi als Diffusionssperre wirkt, die die spätere Auflösung des gerüstartigen Glasträgers im Körper zumindest behindert, wenn nicht sogar verhindert.
Weiterhin besteht die Gefahr, dass die Hydroxylapatit-Schicht Einfluss auf die Zelldifferenzierung nimmt. Denn Hydroxylapatit bildet die Grundlage der
Hartsubstanz der Knochen und Zähne von Tier und Mensch. Dies kann dazu führen, dass sich beim Zellwachstum der Zelltyp der aufgebrachten lebenden Zellen ändert, das heißt, dass eine Knorpelzelle resultierend aus der Anwesenheit des Hydroxylapatits zu einer Knochenzelle differenziert. Daher ist nicht
sichergestellt ist, dass die Hydroxylapatit-Schicht Wachstums- bzw.
differenzierungsneutral ist. Der Erfindung liegt damit das Problem zu Grunde, einen demgegenüber verbesserten bioaktiven Träger anzugeben. Zur Lösung dieses Problems ist erfindungsgemäß ein bioaktiver Träger für die Ansiedlung lebender Zellen vorgesehen, mit einem porösen dreidimensionalen Steggerüst aus Glas, das einen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden von maximal 2,0 Masse% aufweist und das zumindest oberflächlich durch Auslaugung in seinem Gehalt an Alkalimetalloxiden reduziert ist.
Der erfindungsgemäße bioaktive Träger aus Glas zeichnet sich durch ein poröses dreidimensionales Steggerüst aus, das eine spezifische Glaszusammensetzung, was den Gehalt an Erdalkalimetalloxiden und Alkalimetalloxiden angeht, aufweist. So ist erfindungsgemäß ein extrem niedriger Gehalt an Erdalkalimetalloxiden enthalten, der Gehalt beträgt maximal 2,0 % bezogen auf den trockenen Träger, also die reine Trockensubstanz ohne eingelagerte OH-Gruppen und
Wassermoleküle, vorzugsweise beträgt er weniger als 1 ,5 Masse%, insbesondere weniger als 0,5 Masse%. Die Glaszusammensetzung zeichnet sich also dadurch aus, dass keinerlei Zugabe irgendeines Erdalkalimetalloxids erfolgt.
Dies hat den besonderen Vorteil, dass eine Hydroxylapatit-Schichtbildung in jedem Fall vermieden wird. Das heißt, dass das dreidimensionale Glassteggerüst oberflächlich keinerlei Hydroxylapatit aufweist. Darüber hinaus wird bei dem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger auch der Gehalt an Alkalimetalloxiden durch eine gezielte Auslaugung über eine saure Oberflächenbehandlung reduziert. Alkalimetalloxide sind in der
Basiszusammensetzung des Glases, aus dem der bioaktive Träger hergestellt wird, grundsätzlich in hinreichendem Umfang vorhanden, da diese Alkalioxide, üblicherweise Na2Ü und K2O, als Netzwerkwandler dienen und zur Einstellung der Schmelz und Sintertemperatur benötigt werden. Nach Herstellung des
dreidimensionalen Steggerüsts werden diese Alkalimetalloxide gezielt aus der Glasmatrix herausgelöst. Das heißt, dass gezielt die Na+ und K+-lonen aus der Glasmatrix durch den sauren Angriff herausgelöst, also aus ihrer Bindung im Netzwerk gelöst werden. Es findet folglich ein lonenaustausch zwischen Na+ respektive K+ im Netzwerk und H+ im Glas statt. Dies führt zu einer ausgelaugten Gelschicht mit minimalem Alkalianteil.
Ein erster Vorteil dieser Auslaugung respektive des lonenaustausches ist, dass bei einer Lagerung dieses Glases in wässrigen Lösungen (Zellkulturmedium) keine Auflösereaktionen des Glases stattfinden, bei denen der pH-Wert stark in den toxischen Bereich verändert wird. Dies gilt insbesondere für den lokalen Bereich an der Oberfläche des Glases, dies ist der Kontaktbereich zwischen adhärierenden Zellen und dem Glas.
Ein zweiter Vorteil dieser Auslaugung d.h. des lonenaustausches ist, dass in dieses„offene“ Netzwerk OH-Gruppen, respektive Wasser, eingelagert werden können. Diese Einlagerung sowie die lonenkomposition an der Gerüstoberfläche haben sich als vorteilhaft für die Adhäsion der Zellen sowie die Stimulation der Zellrezeptoren, die mit der Oberfläche des Gerüsts interagieren, herausgestellt.
Der erfindungsgemäße bioaktive Träger lässt daher eine sehr gute Adhäsion und damit Besiedelung mit den lebenden, zu vermehrenden Zellen, insbesondere Knorpelzellen, zu. Darüber hinaus zeigt der erfindungsgemäße bioaktive Träger keine erkennbare Tendenz, die Zelldifferenzierung nicht chondrogen d.h. in eine andere Differenzierungsrichtung als z. B. zu Knorpelzellen zu beeinflussen, wie dies für bekannte Träger mit der Hydroxylapatit-Schicht der Fall ist. Das heißt, dass sich der bioaktive Träger neutral hinsichtlich der Zelldifferenzierung verhält.
Aufgrund des hohen Anteils der Alkalioxide in dem Grundglas, der Auslaugung und der nicht brückenbildenden Sauerstoffe, respektive OH-Bindungen, sind die entsprechenden Baugruppen innerhalb der Glasmatrix wie beschrieben nur gering verknüpft. Dies führt zu einer reduzierten chemischen Beständigkeit und fördert die Auflösung des Trägers beim in vivo Einsatz, das heißt, dass sich der
Glasträger aufgrund des bei einem in vivo Einsatz gegebenen hydrolytischen Säure-Lauge-Angriffs des umgebenden Mediums auch auflöst. Wie beschrieben ist eines der zentralen Merkmale des erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers, respektive Bioglases, dass eine oberflächliche starke
Reduzierung an Alkalimetalloxiden durch Auslaugung gegeben ist. Diese
Alkalimetalloxidreduzierung kann nur oberflächlich sein. Das heißt, dass die dünnen Stege nur im Bereich einer relativ schmalen oberflächlichen Schicht reduziert sind. Alternativ dazu kann die Reduzierung des Alkalimetalloxidgehalts auch weit in die Tiefe erfolgen, sogar soweit, dass das Steggerüst über den gesamten Stegquerschnitt alkalireduziert ist.
Die Reduzierung, also das Auslaugen findet beispielsweise in 1 normaler
Salzsäure, beispielsweise bei 37 °C statt. Hierbei findet wie beschrieben der lonenaustausch zwischen Na+/K+ und H+ statt, wie auch die Einlagerung von H2O respektive OH- in das Glas, so dass sich eine Glasmatrix mit hohem Wasser- respektive OH-Gruppenanteil ausbildet. Es wird also Wasser eingelagert, ähnlich wie bei einer Gel-Schicht. Ein oberflächlich reduzierter Alkalimetalloxidgehalt lässt sich bereits nach ca. 1 - 1 ,5 Tagen Dauer für das Auslaugen erreichen. Ein kompletter lonenaustausch eines Scaffold-Steges lässt sich nach ca. 12 Tagen erreichen, wobei hierbei eine Stegdicke zwischen 30 - 120 pm vorausgesetzt ist.
Die Reduzierung des Gehalts an Alkalimetalloxiden sollte möglichst weitgehend erfolgen. Am fertigen bioaktiven Träger sollte der Gehalt an Alkalimetalloxiden im ausgelaugten Bereich, sei er oberflächlich oder über den gesamten Querschnitt, maximal 6,5 Masse% (bezogen auf die Trockensubstanz) betragen, vorzugsweise sollte er kleiner 4 Masse% liegen. Der Auslaugungsgrad ist naturgemäß umso größer, je länger das Auslaugen erfolgt.
Auf den Wachstumsprozess respektive die Matrixsynthese und den
Gewebebildungsprozess durch die zu vermehrenden Zellen nimmt neben der dreidimensionalen Geometrie des Trägers auch die konkrete Geometrie des Steggerüsts Einfluss. So sollte die Porengröße des Steggerüsts zwischen 20 - 300 pm, insbesondere zwischen 50 - 200 pm betragen. Das heißt, dass die Poren hinreichend klein sind, so dass sie mit Zellen und von diesen gebildeter ECM innerhalb weniger Tage respektive Wochen vollständig besiedelt, respektive geschlossen werden können.
Die Stegdicke sollte zwischen 30 - 120 miti, insbesondere zwischen 50 - 100 pm betragen. Dies ist dahingehend zweckmäßig, als wie beschrieben beim späteren in vivo Einsatz der bioaktive Träger, also das gläserne Steggerüst aufgelöst wird. Die Auflösung geht umso schneller, je dünner die Stege sind.
Wesentlich für den erfindungsgemäßen bioaktiven Träger ist, wie beschrieben, die Glaszusammensetzung. Die folgenden Masse%-Angaben beziehen sich auf den getrockneten Träger, also auf die reine Trockensubstanz. Erfindungsgemäß enthält der bioaktive Träger (in Masse%):
- Si02 77,5 - 85,0
- P2O5 8,5 - 12,0
- B2O3 0,5 - 3,4
- Na20 + K2O < 6,5
Der erfindungsgemäße bioaktive Träger zeichnet sich, wie bereits ausgeführt, dadurch aus, dass er nur einen minimalen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden, insbesondere CaO aufweist, was, wie beschrieben, zu der nachteiligen
Hydroxylapatit-Schichtbildung führt. Der Gehalt an Erdalkalimetalloxiden, insbesondere CaO, beträgt wie ausgeführt maximal 2,0 Masse% (bezogen auf die Trockensubstanz), bevorzugt deutlich weniger. Die Messung der jeweiligen Mengen bzw. Anteile erfolgt z. B. mit Röntgenfluoreszenz oder
Flammenspektroskopie ICP.
In weiterer Konkretisierung kann der bioaktive Träger enthalten (in Masse% bezogen auf die Trockensubstanz):
- Si02 79,5 - 83,0
- P2O5 9,0 - 11 ,7
- B2O3 0,65 - 3,25
- Na2 + K2O < 6,5 Ferner kann der bioaktive Träger zusätzlich enthalten (in Masse% bezogen auf die Trockensubstanz): - Ti02 0,1 - 0,5 und/oder
- Zr02 0,1 - 0,4
Weiterhin kann der bioaktive Träger zusätzlich enthalten (in Masse% bezogen auf die Trockensubstanz):
- CuO max. 0,1 und/oder
- ZnO max. 0,1 und/oder
- NaCI max. 0,5 und/oder
- NaF max. 0,4 und/oder
- Na2S04 max. 0,6 und/oder
- KNOs max. 0,6
Neben dem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger betrifft die Erfindung ferner eine spezifische, erfindungsgemäße Glaszusammensetzung, die für die
Herstellung eines Bioglases, insbesondere eben eines solchen bioaktiven Trägers, wie vorstehend beschrieben, formuliert wurde. Diese erfindungsgemäße
Glaszusammensetzung enthält (in Masse%):
- Si02 60 - 65,5
- P205 6,7 - 9,3
- B2030,4— 2,6
- Na20 25,5 - 28,5
- K20 0,45 - 1 ,55
sowie einen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden < 2 Masse%.
Der Gehalt an Erdalkalimetalloxiden in der erfindungsgemäßen
Glaszusammensetzung beträgt weniger als 2 Masse%, insbesondere weniger als 1 ,5 Masse%, vorzugsweise weniger als 1 Masse% und insbesondere weniger als 0,5 Masse%.
Die erfindungsgemäße Glaszusammensetzung und damit auch das herstellbare Bioglas enthält also im Wesentlichen die Netzwerkbildner S1O2, P20s und B2O3 sowie die Netzwerkwandler Na2Ü und K2O. Aufgrund des in den angegebenen Grenzen vorgesehenen Anteils an P2O5 und B2O3 ist es möglich, den Si02-Anteil zwischen 60,0 - 65,5 Masse% einzustellen, wobei er bevorzugt im Bereich zwischen 62 - 63 Masse% liegt. Aufgrund der Zugabe von P2O5 enthält das Glas die für eine Zell proliferation förderlichen Phosphationen, die üblicherweise in dem Zellkulturmedium ohnehin vorhanden sind und wesentlich den pH-Wert puffern. B2O3 dient der Stabilisierung der Glasstruktur, wobei auch die Borionen sich bezüglich der Zellproliferation als förderlich erweisen.
Die Netzwerkbildner Na2Ü und K2O sind zu den angegebenen Anteilen
schmelztechnisch erforderlich. Je höher ihr Anteil ist, umso dünnflüssiger wird das Glas und die chemische Beständigkeit nimmt ab. Für die erfindungsgemäße Glaszusammensetzung wurde der Anteil an Na2Ü und K2O so hoch wie möglich gewählt, da die Auslaugbarkeit mit dem Alkalianteil zunimmt und das verbleibende Restglas nur gering polymerisiert ist. Dies ist für die Auflösung in vivo vorteilhaft. Die gewählte Zusammensetzung ist auch dahingehend vorteilhaft, als ein hoher Diffusionskoeffizient seitens der Alkali, also des Na+ und des K+ gegeben ist, was sich sehr förderlich auf die hohe und schnelle Auslaugbarkeit auswirkt. Wie beschrieben ist es möglich, das Glassteggerüst oberflächlich oder vollständig extrem weit auszulaugen, so dass der Alkalimetalloxidanteil < 6,5 Masse%, vorzugsweise < 4 Masse% bezogen auf die Trockensubstanz beträgt.
In weiterer Konkretisierung der Glaszusammensetzung kann diese enthalten (in Masse%):
- Si02 61 ,5 - 64,0
- P2O5 7,0 - 9,0
- B2O3 0,5 - 2,5 - Na20 26,0 - 28,0
- K20 0,5 - 1 ,5, wobei natürlich auch hier der Anteil an Erdalkalimetalloxiden geringstmöglich ist, also < 2 Masse% oder deutlich weniger beträgt.
In weiterer Ausgestaltung kann die erfindungsgemäße Glaszusammensetzung zusätzlich enthalten (in Masse%): - T1O2 0,1 - 0,5 und/oder
- Zr02 0,1 - 0,4
T1O2 und/oder Zr02 können zugesetzt werden, um die Stabilität innerhalb der ausgelaugten Schicht zu fördern, respektive zu erhöhen. In Folge der Auslaugung kommt es innerhalb der Matrix aufgrund der festen Si-Bindungen zu leichten Spannungen. Diese wirken sich - nachdem der fertige bioaktive Träger in flüssigem Medium, üblicherweise einem TRIS Puffer aufbewahrt wird - nicht negativ aus. Eine Stabilisierung der Gelschicht kann durch die Zugabe von T1O2 respektive
Zr02 erreicht werden, da die Ti- und Zr- Ionen beständige Verbindungen eingehen.
In weiterer Ausgestaltung kann vorgesehen sein, dass die Glaszusammensetzung erfindungsgemäß zusätzlich enthält (in Masse%):
- CuO max. 0,04 und/oder
- ZnO max. 0,1
Es besteht also des Weiteren die Möglichkeit, CuO und/oder ZnO der
Glaszusammensetzung hinzuzugeben. Kupferionen wirken dabei antibakteriell, Zinkionen anti-inflammatorisch. Das heißt, dass sich die Zugabe der minimalen Anteile von CuO und/oder ZnO ebenfalls positiv auf das Zellwachstum auswirken kann. Ferner ist es möglich, der erfindungsgemäßen Glaszusammensetzung zusätzlich zuzugeben (in Masse%): - NaCI max. 0,5 und/oder
- NaF max. 0,4
Über diese Verbindungen können Fluorid- und/oder Chloridionen in die Glasmatrix eingebracht werden. Diese haben einen günstigen Einfluss auf die Proliferation der Zellen, weshalb ihre Zugabe auch mit geringem Anteil vorteilhaft ist.
Ferner ist es in weiterer Ausgestaltung vorgesehen, dass die erfindungsgemäße Glaszusammensetzung zusätzlich enthält (in Masse%): - Na2S04 max. 0,6 und/oder
- KNO3 max. 0,6
Diese beiden Verbindungen werden dem Gemenge bevorzugt zugegeben, um die Schmelze zu homogenisieren und zu läutern.
An dieser Stelle der Flinweis, dass die angegebenen Masse% Werte sich auf die Glaszusammensetzung der jeweiligen Bestandteile des Rohstoffgemenges vor dem Schmelzen beziehen. An dem geschmolzenen Glas können die Masse%- Werte in entsprechender Weise mit den entsprechenden Werten erfasst werden. Variiert wird lediglich der Anteil an Na2Ü und K2O, die als Alkalimetalloxide aus dem fertigen Bioglasträger, wie einleitend beschrieben, ausgelaugt werden. Für den Fall, dass das aufgeschmolzene Glas als Bioglas in nicht ausgelaugter Form verwendet werden soll, finden sich auch am aufgeschmolzenen Glas die entsprechenden Na2Ü und K20-Anteile.
Eine konkrete Glaszusammensetzung enthält (in Masse%):
- Si02 62,7 - P2O5 7,0
- B2O3 2,0
- Na20 25,6
- K20 1 ,0
- Ti02 0,12
- Zr02 0,1
- CuO 0,02
- ZnO 0,06
- NaCI 0,3
- NaF 0,2
- Na2S04 0,4
- KN03 0,5
An dieser Stelle erfolgt der Hinweis, dass, wenngleich vorstehend eine konkrete Zusammensetzung beschrieben wurde, jedwede Zusammensetzung, die sich in Kombination der chemischen Bestandteile innerhalb der angegebenen Intervalle ergibt, erfindungswesentlich ist. Das heißt, dass jedweder Zahlenwert in 0,01 - Schritten innerhalb des jeweiligen, zu einem chemischen Bestandteil
angegebenen Intervall als erfindungswesentlich offenbart anzusehen ist und daher auch jedweder dieser Zahlenwerte, obgleich nicht explizit beschrieben, zur
Präzisierung eines Intervalls oder eines Anteils eines chemischen Bestandteils herangezogen werden kann.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven
Trägers der vorstehend beschriebenen Art, mit folgenden Schritten:
Verwendung einer Glaszusammensetzung der vorstehend beschriebenen Art und Herstellung einer Glasschmelze hieraus
Herstellung eines Glaskörpers aus der Glasschmelze
Mahlen des Glaskörpers zur Bildung eines Glaspulvers
- Bildung einer Suspension aus dem Glaspulver und einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel Aufbringen der Suspension auf einen porösen Schwammträger aus einem Polymer unter Belegung der Oberfläche des Schwammträgers mit dem Glaspulver
Wärmebehandlung des belegten Schwammträgers zur thermischen
Zersetzung des Schwammträgers und gleichzeitiger Sinterung des
Glaspulvers zur Bildung eines porösen dreidimensionalen Steggerüsts Auslaugung des Steggerüsts zur Reduzierung des Gehalts an
Alkalimetalloxiden im Steggerüst
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers wird eine
erfindungsgemäße Glaszusammensetzung, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Das heißt, dass die entsprechenden chemischen Bestandteile in der entsprechenden erfindungsgemäßen Menge, wie sie sich aus den
entsprechenden Intervallangaben respektive Mengenangaben ergeben, vermischt werden. Diese Glaszusammensetzung wird im nächsten Schritt aufgeschmolzen, das heißt, dass eine Glasschmelze hergestellt wird, aus der sodann ein
Glaskörper gegossen wird. Hierzu wird die hochreine, pulverförmige
Glaszusammensetzung nach entsprechender Einwaage und gegebenenfalls erfolgter Homogenisierung, bevorzugt in einem Keramikmörser, in einem Platin- Gold-Tiegel aufgeschmolzen, wobei ein solcher Tiegel zur Vermeidung von Schmelzkontaminationen verwendet wird. Das Aufschmelzen erfolgt bevorzugt bei ca. 1.300 °C, die Haltezeit wird je nach entsprechender Glaszusammensetzung gewählt, sie beträgt ca. 5 - 7 Stunden.
Anschließend wird die Schmelze, die eine Viskosität von ca. 102 dPas aufweist, in eine vorgewärmte Stahlform gegossen, entformt und in fester Form in einen weiteren Ofen überführt, um Spannungen bei der weiteren Abkühlung abzubauen. Hierüber kann eine beliebige Gussgeometrie erzeugt werden.
Anschließend wird der Glaskörper zerkleinert und zermahlen. Dies kann in einer geeigneten Mühle, beispielsweise einer Kugelmühle erfolgen. Das Mahlen erfolgt solange, bis ein entsprechend feines Glaspulver gegeben ist, wobei bei Bedarf eine entsprechende Korngrößenfraktion abgetrennt wird. Das Glaspulver wird sodann mit einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel zu einer Suspension vermischt, die anschließend zur Bildung des Trägers weiterverarbeitet wird.
Hierzu bedient man sich erfindungsgemäß eines porösen Schwammträgers aus einem Polymer. Dieser Schwammträger, der die gewünschte Geometrie des herzustellenden bioaktiven Trägers aufweist, dient als Träger für das gemahlene Glaspulver. Zu diesem Zweck wird eine Suspension, welche das Glaspulver auf den porösen Schwammträger aufgebracht, so dass dessen Oberfläche mit dem Glaspulver belegt wird. Das heißt, dass die Pulverpartikel an der
Schwammoberfläche anhaften, mithin also die Schwammgeometrie über das Glaspulver nachgebildet wird. Die Beschichtung mit dem Glaspulver erfolgt derart, dass sich eine möglichst gleichmäßige partikuläre Beschichtung auf der
Oberfläche bildet.
Im nächsten Schritt erfolgt eine Wärmebehandlung des belegten
Schwammträgers. Diese dient zweierlei Zwecken, zum einen der thermischen Zersetzung des Schwammträgers, das heißt, dass dieser thermisch zerstört wird; zum anderen der gleichzeitigen Sinterung des Glaspulvers zur Bildung eines porösen dreidimensionalen Steggerüsts als Basis für den bioaktiven Träger. Durch das Überführen des Polymer-Schwammträgers, der durch die Wärmebehandlung hinsichtlich seiner organischen Bestandteile degradiert wird, und das gleichzeitige Sintern der Pulverpartikel aneinander wird somit trotz Auflösens des
Schwammträgers ein in sich stabiles, poröses, dreidimensionales Steggerüst ausgebildet. Festzuhalten hierbei ist, dass die Glaspartikel gesintert werden, das heißt, dass die Glaspartikel durch viskoses Fließen ohne zu kristallisieren aneinander anhaften. Das gebildete Steggerüst bildet die Schwammstruktur proportional verkleinert ab.
Im letzten Schritt erfolgt sodann die Auslaugung des auf diese Weise hergestellten dreidimensionalen Steggerüsts, um den Alkalimetalloxidgehalt zu reduzieren. Der fertig hergestellte bioaktive Träger, respektive das Scaffold wird sodann in einem Fluid, bevorzugt einem TRIS-Puffer, aufbewahrt, bis es zur Zellzüchtung verwendet wird.
Das Glaspulver selbst kann wie beschrieben gesiebt werden, bevorzugt wird hierbei eine Glaspulverfraktion mit einer Korngröße < 100 miti, insbesondere < 40 pm gebildet, mit der anschließend die Suspension hergestellt wird.
Die Suspension kann bevorzugt mit Isopropanol als Lösungsmittel hergestellt werden, wobei aber auch andere Lösungsmittel verwendet werden können.
Ferner kann der Suspension ein Dispergator und/oder ein Bindemittel zugegeben werden. Der Dispergator dient der Vermeidung der Bildung von Agglomeraten, während das Bindemittel, bevorzugt Polyvinylalkohol, emulgierend wirkt.
Als Schwammträger wird bevorzugt ein Schwamm aus Polyurethan verwendet, beispielsweise ein von der Firma Eurofoam Deutschland GmbH unter dem
Markennamen„Bluebrain S“ vertriebener retikulierter Polyurethanschaumstoff auf Polyesterbasis.
Die Wärmebehandlung zur Degenerierung des Polymer-Schwammträgers sowie zur Sinterung der Glaspartikel erfolgt bei einer Temperatur von 550 - 800 °C, insbesondere von 600 - 740 °C. Diese Temperatur ist ausreichend, um den organischen Schwamm zu zersetzen und gleichzeitig die Glaspartikel aneinander zu sintern. Die Sinterzeit kann einige Minuten bis zu 2 Stunden betragen.
Das Auslaugen des fertig gesinterten Glassteggerüsts erfolgt mit Salzsäure, vorzugsweise 0,1 molarer Salzsäure, bevorzugt bei etwas erhöhter
Raumtemperatur, vorzugsweise ca. 37 °C. Das Auslaugen erfolgt je nach Größe des Scaffolds respektive der Stegdurchmesser sowie je nach gewünschtem Auslaugungsgrad respektive der gewünschten Auslaugungstiefe. Ein
oberflächlicher lonenaustausch von Na+/K+ aus der Glasmatrix und H+ aus dem Auslaugmedium ist innerhalb von ca. 1 - 2 Tagen möglich, ein kompletter lonenaustausch über den Stegdurchmesser, bei einer Stegbreite von ca. 80 - 100 miti, lässt sich in ca. 12 Tagen Auslaugungsdauer erreichen.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den im Folgenden beschriebenen Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnungen: Dabei zeigen:
Fig. 1 einen bioaktiven Träger mit einem porösen dreidimensionalen Steggerüst aus Glas vor der Auslaugung der Alkalimetalloxide,
Fig. 2 den bioaktiven Träger aus Fig. 1 nach der Auslaugung der
Alkalimetalloxide,
Fig. 3 ein Diagramm zur Erläuterung der wesentlichen Schritte des
erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fierstellung eines erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers,
Fig. 4 eine Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme der Bruchfläche eines Steges eines ausgelaugten bioaktiven Trägers,
Fig. 5 ein Diagramm eines Linescans über die Bruchoberfläche des
ausgelaugten Steges aus Fig. 9 entlang der in Fig. 9 eingezeichneten Scanlinie unter Darstellung der Verläufe der Elementkonzentrationen für Silizium-Ionen und Natrium-Ionen,
Fig. 6 eine mikroskopische Abbildung lebender porciner Gelenkchondrozyten auf einem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger nach 24 Stunden
Besiedlung, Fig. 7 eine mikroskopische Abbildung lebender porciner Gelenkchondrozyten auf einem erfindungsgemäß bioaktiven Träger nach 21 Tagen Besiedlung, Fig. 8 eine mikroskopische Abbildung lebender humaner mesenchymaler Stromazellen auf einem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger nach 24 Stunden Besiedlung, Fig. 9 eine mikroskopische Abbildung lebender humaner mesenchymaler
Stromazellen auf einem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger nach 7 Tagen Besiedlung,
Fig. 10 eine mikroskopische Abbildung lebender humaner Flaut-Fibroblasten auf einem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger nach 24 Stunden
Besiedlung, und
Fig. 11 eine mikroskopische Abbildung lebender humaner Flaut-Fibroblasten auf einem erfindungsgemäßen bioaktiven Träger nach 7 Tagen Besiedlung. Fig. 1 zeigt eine mikroskopisch vergrößerte Aufnahme eines bioaktiven Trägers, also eines Bioglas-Scaffolds vor der erfindungsgemäßen Auslaugung der Alkalimetalloxide. Die Glaszusammensetzung dieses bioaktiven Trägers, sowie der bioaktiven Träger, die für die nachfolgend noch beschriebenen
Besiedlungsversuche verwendet wurden, respektive die chemischen Bestandteile dieses Glases sind (in Masse%):
- Si02 62,7
- P2O5 7,0
B2O3 2,0
- Na20 25,6
- K20 1 ,0
- Ti02 0,12
- Zr02 0,1
- CuO 0,02
- ZnO 0,06
- NaCI 0,3
- NaF 0,2
Na2S04 0,4 - KNOs 0,5
Zur Herstellung dieses bioaktiven Trägers wird zunächst, wie in Fig. 3 dargestellt, eine Rohstoffmischung aus hochreinem, pulverförmigen und hauptsächlich oxydischen Rohstoffen entsprechend der gewählten Zusammensetzung, beispielsweise der obigen Zusammensetzung, eingewogen, in einem
Keramikmörser homogenisiert und sodann zur Vermeidung von
Schmelzkontamination in einem Platin-Gold-Tiegel geschmolzen (siehe die Schritte a und b in Fig. 3). Nach dem Aufschmelzen bei der Schmelztemperatur von ca. 1300 °C und einer Haltezeit von ca. 6 Stunden, wobei die entsprechenden Parameter abhängig von der gewählten Glaszusammensetzung sind, wird die Schmelze bevorzugt in eine vorgewärmte Stahlform gegossen, um einen
Glaskörper zu bilden. Nach dem Gießen und Entformen wird der Glaskörper in einen weiteren Ofen überführt, um etwaige intrinsische Spannungen abzubauen.
Anschließend wird (siehe Schritt c in Fig. 3) aus dem Glaskörper ein Glaspulver hergestellt, wozu der Glaskörper gebrochen und in einer Mühle, vorzugsweise eine Zirkonoxidkugelmühle zerkleinert wird. Nach dem Mahlen wird das
Glaspulver gesiebt und entsprechend fraktioniert, wobei vorzugsweise nur sehr feines Glaspulver mit einer Korngröße bis ca. 40 pm für die weitere Herstellung des bioaktiven Trägers respektive des Scaffolds verwendet wird.
Im Schritt d wird sodann ein Schlicker, also eine Suspension aus dem bzw.
enthaltend das fraktionierte Glaspulver hergestellt. Dies geschieht unter Zugabe eines oder mehrerer Dispergatoren und wenigstens eines Bindemittels, wie beispielsweise Polyvinylalkohol in einem wässrigen oder organischen
Lösungsmittel, wie beispielsweise Isopropanol. Mit einer Rühreinrichtung wie beispielsweise einem Magnetrührfisch wird der Schlicker homogenisiert. Der derart hergestellte Schlicker wird sodann (siehe Schritt e in Fig. 3) auf einem porösen Schwammträger aus einem Polymer aufgebracht, derart, dass der Schlicker respektive die Suspension die Oberfläche des Schwammträgers belegt, mithin also auch das im Schlicker dispergierte Glaspulver die
Schwammträgeroberfläche belegt.
In einem folgenden Wärmebehandlungsschritt (siehe Schritt f gemäß Fig. 3) wird der belegte Schwammträger erwärmt. Die Temperatur wird soweit gesteigert bis eine Sintertemperatur für das Glaspulver erreicht ist, die im Bereich zwischen 600 - 740 °C liegt. Bei dieser Temperatur degradiert einerseits der Polymer- Schwammträger, vorzugsweise bestehend aus Polyurethan, das heißt, die organischen Bestandteile werden oxidiert und in die gasförmige Phase überführt. Gleichzeitig sintern die Pulverpartikel zusammen, ohne zu kristallisieren. Dies geschieht durch ein viskoses Fließen im Grenzflächenbereich. Durch diesen Sintervorgang unter gleichzeitiger Degradation des Schwammträgers bilden die aneinander gesinterten Glaspartikel die Schwammstruktur proportional verkleinert ab, das heißt, dass der sich ergebende gesinterte Glaskörper demzufolge ein exaktes, wenngleich proportional verkleinertes Abbild des originär verwendeten porösen Schwammträgers ist, mithin also ebenfalls entsprechend porös ist. Dies führt dazu, dass der dreidimensionale Glaskörper respektive bioaktive Träger ein entsprechendes dreidimensionales Steggerüst mit großen, zwischen den Stegen befindlichen Poren aufweist.
Der in Fig. 1 gezeigte bioaktive Träger ist nicht ausgelaugt, das heißt, dass er das Ergebnis des Verfahrens nach dem Ende der Wärmebehandlung darstellt.
Ersichtlich weist der in Fig. 1 gezeigte bioaktive Träger 1 ein dreidimensionales Steggerüst 2 mit einer Vielzahl einzelner Stege 3 auf, die ein poröses, jedoch stabiles Gerüst bilden, das eine entsprechende Vielzahl von über die Stege definierten Poren respektive Durchgängen 4 aufweist. Die Stege und die Poren bzw. Durchgänge haben je nach verwendetem Schwammträger, der wie beschrieben die Basis für den ihn abbildenden Glaskörper darstellt,
entsprechende Dicken bzw. Durchmesser. Ein typischer Stegdurchmesser liegt im Bereich von 20 - 80 miti, eine Pore weist eine Größe im Bereich zwischen 100 - 500 pm auf. Ein solcher bioaktiver Träger 1 respektive dieses Steggerüst 2 dient, worauf nachfolgend noch eingegangen wird, als Basis für die Besiedlung mit lebenden Zellen. Wie beschrieben zeigt Fig. 1 den bioaktiven Träger 1 vor der Auslaugung.
Erfindungsgemäß wird nun nach Herstellung dieses gläsernen Steggerüstes 2 der bioaktive Träger 1 in einem nächsten Schritt g (siehe Fig. 3) ausgelaugt, um zumindest im Bereich der Oberfläche der Stege 3, bevorzugt über den gesamten Stegquerschnitt, Erdalkalimetalloxide, also die im Glas enthaltenen Natrium- und Kalium-Ionen auszulaugen. Hierzu wird der bioaktive Träger 1 gemäß Fig. 1 beispielsweise in 1 normale Salzsäule bei beispielsweise 37 °C gelegt. Es findet ein lonenaustausch zwischen den Alkali-Ionen Na+ und K+ und dem in der Säure enthaltenen H+ statt. Darüber hinaus wird H2O in die Glasstruktur eingelagert, so dass sich, je nachdem, wie lange Säurebehandlung dauert und wie tief die
Auslaugung erfolgt, eine entsprechend wasserreiche ausgelaugte Struktur ergibt, die jedoch stabil und fest ist. Bei Stegdicken im Bereich weniger 10 pm kann ein kompletter lonenaustausch der Alkali-Ionen eines Steges in ca. 8 - 12 Tagen erreicht werden.
Nach Beendigung der Auslaugung wird ein bioaktiver Träger 1 gespült und anschließend in einer Pufferlösung, beispielsweise einem TRIS-Puffer,
aufbewahrt, bis er besiedelt wird.
Fig. 2 zeigt ein mikroskopisch vergrößertes Bild eines ausgelaugten bioaktiven Trägers 1 respektive des Steggerüsts 2. Durch das Auslaugen der Alkali-Ionen sowie das Einlagern des Wassers in das Steggerüst verändert sich dessen Glasstruktur respektive Zusammensetzung, was sich auch optisch in Form der leicht milchigen Stege 3 zeigt. Erhalten jedoch bleibt die Stegstruktur als solche wie auch die Porenstruktur, wie der Vergleich zwischen den Fig. 1 und 2 deutlich zeigt.
Wie beschrieben wird der erfindungsgemäße bioaktive Träger 1 durch Auslaugung zumindest randseitig in seinem Gehalt an Alkali-Ionen respektive Alkali-Oxiden reduziert. Die Fig. 4 und 5 zeigen einen Elementscan in einem
Rasterelektronenmikroskop mittels EDAX über einen Randbereich eines gebrochenen Steges eines erfindungsgemäß ausgelaugten bioaktiven Trägers. Fig. 4 zeigt eine mikroskopisch vergrößerte Ansicht eines Teilbereichs eines Steges 3, eingezeichnet ist eine Scanlinie S, entlang welcher der Elementscan von einem mittleren Bereich des Steges 3 bis zu seinem Rand 5 vorgenommen wurde. Das Ergebnis des Elementscans ist in Fig. 5 gezeigt, wobei hier nur die ermittelten Werte für die Silizium- und Natrium-Ionen aufgetragen sind.
Im oberen Diagrammbereich in Fig. 5 ist längs der Abszisse der Weg des
Linienscans in Mikrometern aufgetragen, längs der Ordinate der Anteil an Si- und Na-Ionen in Form der Zählrate der EDAX-Messung. Unterhalb des Diagramms ist ein Ausschnitt aus dem Bild gemäß Fig. 4, in dem der Scan verläuft, zur
Positionsreferenz dargestellt.
Die obere, durchgezogene Linie zeigt die Si-Konzentration, die untere, gestrichelte Linie die Na-Konzentration. Im Stegvolumen, beginnend ab einem Scanweg von 0 pm bis zu einem Scanweg von ca. 22 pm bleiben die Konzentrationen im
Wesentlichen konstant, abgesehen von üblichen lokalen Schwankungen. Ab einem Scanweg von ca. 22 pm jedoch ist ersichtlich ein starker Abfall der Na- Konzentration zu erkennen, der Wert von ca. 25 sinkt rapide auf einen Wert von deutlich unter 10. Die Na-Konzentration nimmt im Verlauf des weiteren
Elementscans zwischen den Punkten 1 und 2, die in dem unter dem
Liniendiagramm dargestellten Ausschnitt des Mikroskopbildes aus Fig. 4 entlang der Scanlinie eingezeichnet sind, noch weiter ab. Der Punkt 2 markiert dabei den Stegrand. Es zeigt sich also, dass im randnahen Bereich zwischen den Positionen 1 und 2 eine extreme Reduzierung der Na-Ionen-Konzentration zu verzeichnen ist.
Die Auslaugfront würde, wenn die Auslaugung über längere Zeit angedauert hätte, noch weiter in das Stegvolumen wandern, wie beschrieben ist eine nahezu vollständige Auslaugung über den gesamten Stegquerschnitt möglich. Ein
Auslauggrad, wie er exemplarisch in den Fig. 4 und 5 gezeigt ist, kann bereits nach einer Auslaugdauer von ca. 12 Stunden erreicht werden.
Der Kalium-Ionengehalt würde, auch wenn in Fig. 5 nicht gezeigt, ähnlich verlaufen, auch hier wäre ein deutlicher Abfall im Bereich, in den die Säure eindiffundiert ist, zu verzeichnen, wenngleich der Kaliumgehalt allgemein deutlich niedriger ist als der Natriumgehalt.
Wie beschrieben dient ein erfindungsgemäßer bioaktiver Träger mit ausgelaugter Randschicht oder tief ausgelaugtem Steggerüst dazu, auf ihm lebende Zellen zu anzusiedeln und zu vermehren. Zur Darstellung der besonderen Geeignetheit des erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers wurden Besiedelungsversuche mit drei unterschiedlichen Zelltypen durchgeführt, nämlich mit porcinen
Gelen kchondrozyten, mit humanen mesenchymalen Stromazellen, die prospektiv zu Korpelzellen differenzierbar sind sowie mit humanen Haut-Fibroblasten. Die Fig. 6 - 11 zeigen zu jedem Zelltyp zwei mikroskopische Aufnahmen zu unterschiedlichen Zeitpunkten, die den Besiedlungs- und Wachstumsvorgang mit den unterschiedlichen Zelltypen anschaulich zeigen.
In den Fig. 6 und 7 sind zwei Abbildungen eines mit porcinen Gelenkchondrozyten besiedelten bioaktiven Trägers gezeigt. Fig. 6 zeigt den Besiedlungszustand 24 Stunden nach dem Aufbringen der porcinen Gelenkchondrozyten, Fig. 7 den Besiedlungszustand nach 21 Tagen.
Die Fig. 8 und 9 zeigen zwei Abbildungen der Besiedlung eines
erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers mit humanen mesenchymalen
Stromazellen, wobei Fig. 8 den Zustand 24 Stunden nach dem Aufbringen der Stromazellen und Fig. 9 den Zustand nach 7 Tagen Besiedlung zeigt.
Entsprechend zeigen die Fig. 10 und 11 die Besiedlung eines erfindungsgemäßen bioaktiven Trägers mit humanen Haut-Fibroblasten, einmal nach 24 Stunden Besiedlung (Fig. 10), einmal nach 7 Tagen Besiedlung (Fig. 11 ).
Zur Durchführung der Versuche wurden entsprechend präparierte
Zellsuspensionen auf entsprechend präparierte, erfindungsgemäß ausgelaugte bioaktive Träger der eingangs genannten Glaszusammensetzung aufpipettiert und anschließend in einem Inkubator inkubiert. Die Durchführung der Versuche gestaltete sich wie folgt: Sterilisation der in TRIS-gepufferter Salzlösung (TBS) gelagerten bioaktiven Träger im Autoklaven bei 121 °C für 20 Minuten in einem abgedeckten
Glasbehälter, nachdem zuvor die TBS-Lösung entfernt wurde
- nach Abkühlen Spülen der bioaktiven Träger mit Phosphat-gepufferter
Salzlösung (PBS, ohne Kalzium- und Magnesium-Ionen), anschließend Absaugen der Flüssigkeit aus den bioaktiven Trägern durch einen sterilen Fliesstoff, so dass die Träger für die Besiedlung möglichst trocken sind
Einlegen der bioaktiven Träger in einer Sterilbank in ein steriles 50 ml
Bioreaktorröhrchen mit Filtercap
Behandlung der für die Scaffoldbesiedlung vorgesehenen Zellen
(Gelenkchondrozyten, mesenchymale Stromazellen und Fluman-Fibroblasten) nach einem Spülschritt mit PBS für 5 Minuten in einem Inkubator mit
Trypsin/EDTA-Lösung (0,05/0,02 %) zum Ablösen der Zellen vom Kulturboden der Zellkulturflaschen
Gelenkchondrozyten und humane Fibroblasten: Zugabe von 5 ml 10 % fetales Kälberserum (fetal calf serum: FCS) enthaltendes Kulturmedium (Flam’s F- 12/Dulbecco’s Modified Eagle’s) [DMEM] Medium 1 :1 ), 50 IU/ml Streptomycin, 50 IU/ml Penicillin, 2,5 pg/ml Amphotericin B, nicht essentielle Aminosäuren und 25 pg/ml Ascorbinsäure
Mesenchymale Stromazellen: Zugabe von 5 ml Stammzell-spezifischem Medium (FG0445/Dulbecco’s Modified Eagle’s [DMEM]/FIG) mit 5 %
Plättchenlysat (PL), 50 IU/ml Streptomycin, 50 IU/ml Penicilin, 2,5 pg/ml Amphotericin B, 100 mM Natriumpyruvat und 5000 U/ml Heparin
- Stoppen des Ablösevorgangs durch die Zugabe von 5 ml 10 % FCS-haltigem
Medium, wobei das FCS die enzymatische Aktivität des Trypsins beendet Zentrifugation der Zellsuspension bei 300 U/min oder 484 g für 5 Minuten Resuspension des sich aus der Zentrifugation ergebende Zellpellets in 1 ml Kulturmedium
- Mischen von 10 pl Trypanblau-Lösung (1 %) mit 10 pl Zellsuspension, so dass sich tote Zellen anfärben
Pipettieren von 10 pl aus dieser Mischung in eine Neubauer-Zellkammer und optisches Zählen der lebenden Zellen Pipettieren der Zellen in einer Konzentration von 50.000 bis 1.000.000 Zellen in einem kleinen Volumen (0,5 - 1 ml) auf jeweils einen bioaktiven Träger, der im konisch verjüngten Bereich des Bioreaktorröhrchens positioniert ist
Zweistündige statische Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 im stehenden Bioreaktorröhrchen im Inkubator zur Ermöglichung einer ersten Adhäsion der jeweiligen Zellen
Auffüllen des Kulturmediums auf 5 ml Volumen zur Sicherstellung einer Versorgung in der nachfolgenden dynamischen Kultur
Kultivierung der besiedelten bioaktiven Träger im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 auf einem Orbitalschüttler (dynamisch)
bei längerer Inkubationsdauer Wechsel des Kulturmediums alle drei Tage
Wie zu den Fig. 6 - 11 angegeben, wurden je nach Zelltyp unterschiedlich lange Inkubationszeiten durchgeführt. Jeweils ein bioaktiver Träger mit jeweils einem Zelltyp wurde 24 Stunden besiedelt, ein mit Gelen kchondrozyten besiedelter Träger wurde 21 Tage lang besiedelt, während die beiden mit den Haupt- Fibroblasten respektive den Stromazellen besiedelten bioaktiven Träger 7 Tage lang besiedelt wurden. Letzteres liegt daran, dass diese Zellen deutlich schneller wachsen als Gelen kchondrozyten.
Um die lebenden Zellen, deren Besiedlung in den Fig. 6 - 11 gezeigt ist, in einem Laser-Scanning-Mikroskop sichtbar zu machen ist es erforderlich, eine Vitalitäts- Färbung durchzuführen. Diese erfolgte wie folgt:
Herstellung einer Vitalitätsfärbe-Lösung aus 5 pl Fluoreszeindiazetat- (FDA) Lösung, 1 pl Propidiumiodid- (PI) Lösung und 1000 mI PBS
Entnahme des jeweiligen bioaktiven Trägers aus der dynamischen
Kultivierung im Inkubator
Pipettieren von 50 mI Vitalitäts-Lösung auf den besiedelten bioaktiven Träger Begutachtung der Zellen: lebende Zellen sind aufgrund der Einfärbung mit der Vitalitäts-Lösung grün und tote Zellen rot auf dem bioaktiven Träger mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops differenzierbar Das PBS dient als Puffer, als Farbstoff wird FDA verwendet. Dieser Farbstoff dringt in die lebenden Zellen ein und wird enzymatisch in eine fluoreszierende Verbindung umgesetzt, die mit einer Wellenlänge von 525 nm angeregt wird. PI interkaliert in die DNA von toten Zellen, da deren Zell- und Kernmembran dafür permeabel wird. PI wird mit einer Wellenlänge von 600 nm angeregt.
In den Fig. 6 - 11 sind die lebenden Zellen der jeweiligen Zelltypen
(Gelenkchondrozyten, Flaut-Fibroblasten, Stromazellen) gezeigt. Das heißt, dass die hellen Bereiche die Bereiche des bioaktiven Trägers sind, die mit den lebenden, sich vermehrenden Zellen besiedelt sind. Die dunklen Bereiche sind primär nicht besiedelte Bereiche des Trägers.
Die Fig. 6 und 7 zeigen Laser-Scanning-Mikroskopaufnahmen eines bioaktiven Trägers mit porcinen Gelenkchondrozyten. Wie Fig. 6 zeigt, wurde der Träger nach dem Aufpipettieren der Zelllösung innerhalb von 24 Stunden bereits größerflächig mit lebenden Zellen besiedelt. In den folgenden 20 Tagen setzte ein kontinuierliches Zellwachstum respektive eine kontinuierliche Zellvermehrung ein, wie Fig. 7 deutlich zeigt. Der bioaktive Träger ist deutlich großflächiger respektive dichter besiedelt, die unbesiedelten Bereiche, respektive die Poren oder Zonen zwischen den Stegen sind deutlich kleiner, zum Teil auch vollständig ausgefüllt.
Das heißt, dass der erfindungsgemäße bioaktive Träger nachweislich ein aktives Zellwachstum respektive eine aktive Zellvermehrung dieses Zelltyps ermöglicht.
Wie einleitend beschrieben, besteht bei bisher bekannten und verwendeten bioaktiven Trägern aufgrund der Flydroxylapatitbildung das Problem, dass es insbesondere bei Gelenkchondrozyten dazu kommen kann, dass diese aufgrund des Vorhandenseins des Flydroxylapatits den Zelltyp ändern, d.h. sich Richtung einer Knochenzelle differenzieren. Dies ist bei dem erfindungsgemäßen ausgelaugten bioaktiven Träger, der keine derartige Hydroxylapatitschicht aufweist, nicht gegeben, das heißt, dass die Gelenkchondrozyten ihren Zelltyp während des Wachstums nicht ändern. Um dies zu überprüfen wurde bei den Gelenkchondrozyten eine
Immunmarkierung von Kollagen Typ II, einem Knorpelzellen- Identifizierungsmarker durchgeführt. Außerdem wurde zum Vergleich ein unspezifischer Kollagentyp markiert (Kollagen Typ I). Dies geschah wie folgt:
Entnahme eines mit Gelenkchondrozyten besiedelten bioaktiven Trägers aus der Kultur im Inkubator
Fixation in 4 % kaltem Paraformaldehyd (PFA)
Spülung des Trägers mit 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS)
- 20 minütige Inkubation in einer Blockierlösung (TBS 0,1 % TritonX-100, 5 %
Eselserum)
Verdünnen von Primärantikörpern (AK) mit Blockierlösung
Aufpipettieren von 50 pl der Primär-AK-Lösung auf den Gelenkchondrozyten- Träger und Inkubation bei 4 °C für 12 Stunden
- Spülen des Trägers nach der Inkubation mit TBS (1 s)
Inkubation des Trägers bei Dunkelheit mit Sekundär-AK (Esel anti-Kaninchen IgG), gekoppelt mit dem Fluoreszenzmarker Alexa Fluor 555 für Kollagen Typ II und Alexa Fluor 488 gekoppelten Esel-anti-Ziege IgG für Kollagen Typ I für eine Stunde
- Färbung der Zellkerne über einen in der Blockierlösung enthaltenen
Fluoreszenzfarbstoff DAPI (Stammlösung: 20 mg/ml) in der Verdünnung 1 :100 nach 60 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bei Dunkelheit Spülen des Trägers 3 mal für 5 Minuten mit TBS (1x)
Begutachtung der immunhistochemischen Färbung mit konfokalem Laser- Scanning-Mikroskop DMi8
Mittels des konfokalem Laser-Scanning-Mikroskops DMi8 ist es möglich, fluoreszenzmarkierte Marker sichtbar zu machen. Die PFA-Lösung (Paraformaldehyd) dient der Fixierung der Zellen auf dem Träger. Die Blockierlösung dient dazu, eine unspezifische Bindung der nachzuweisenden Antikörper zu verhindern sowie eine Permeabilisierung der Zellmembran zu erreichen.
TBS (TRIS-gepufferte Salzlösung) dient dem Abspülen nicht gebundener
Antikörper bzw. Reagenzien.
Die Antikörperlösung (AK) dient der Detektion des gewünschten Proteins, hier des Kollagen Typ II und des Typ I.
DAPI (4‘, 6-Diamidino-2-phenylindol) dient der Kernfärbung.
Kollagen Typ II ist nur in Gelen kchondrozyten enthalten. Zeigen folglich die Zellen nach der länger andauernden Besiedlung Kollagen Typ II, weisen sie also die entsprechende positive Immunmarkierung auf, so wird hierüber nachgewiesen, dass es sich um Gelenkchondrozyten handelt, die originär aufpipettiert wurden und sich also solche vermehrt haben.
Entsprechende Untersuchungen der Immunmarkierung mit dem Laser-Scanning- Mikroskop haben gezeigt, dass die Zellen Kollagen Typ II aufweisen und folglich die Gelenkchondrozyten ihren Zelltyp nicht ändern. Das heißt, dass der
erfindungsgemäße ausgelaugte bioaktive Träger keinen Einfluss auf den Zelltyp hat, anders als bei bisher bekannten Biogläsern, bei denen sich die
Hydroxilapatitschicht ausbildet. Der erfindungsgemäße bioaktive Träger ist demzufolge bezüglich der aufzuwachsenden Zelltypen vollkommen inert.
Die Fig. 8 und 9 zeigen zwei Mikroskopaufnahmen von bioaktiven Trägern nach 24 Stunden und 7 Tagen Besiedlung mit mesenchymalen Stromazellen. Auch hier zeigt sie anhand von Fig. 8, dass zu Beginn des Inkubationszeitraums bereits eine Grundbesiedlung stattgefunden hat, jedoch sind die besiedelten Bereiche noch nicht allzu groß. Demgegenüber zeigt Fig. 9, dass sich die Zellen rasch vermehrt haben, ersichtlich ist der bioaktive Träger weitestgehend bereits nach 7 Tagen Inkubationszeit besiedelt. Auch dieser Zelltyp wächst demzufolge aktiv und mit hoher Vermehrungsrate auf dem erfindungsgemäßen ausgelaugten bioaktiven Träger.
Dies zeigen auch die Fig. 10 und 11 , die einen bioaktiven Träger mit Flaut- Fibroblasten nach 24 Stunden und 7 Tagen Besiedlung zeigen. Bereits nach 24 Stunden zeigt sich eine relativ großflächige Besiedlung, die Vermehrung nimmt stetig zu. Wie Fig. 11 zeigt, ist nach 7 Tagen der Träger nahezu vollständig besiedelt.
Auch dieser Versuch zeigt, dass der erfindungsgemäße ausgelaugte bioaktive Träger ein aktives und rasches Wachstum von Flaut-Fibroblasten ermöglicht.
Darüber hinaus zeigen die Versuche, dass der erfindungsgemäße bioaktive Träger das Wachstum unterschiedlicher Zelltypen ermöglicht. Das heißt, dass er nicht selektiv nur für einen bestimmten Zelltyp geeignet ist.
Nachfolgend ist eine Aufstellung der im Rahmen der durchgeführten
Besiedlungsversuche sowie der Immunmarkierung verwendeten Materialien und Gerätschaften dargestellt:

Claims

Patentansprüche
1. Bioaktiver Träger für die Ansiedlung lebender Zellen, mit einem porösen dreidimensionalen Steggerüst aus Glas, das einen Gehalt an
Erdalkalimetalloxiden von maximal 2,0 Masse% aufweist und das zumindest oberflächlich durch Auslaugung in seinem Gehalt an
Alkalimetalloxiden reduziert ist.
2. Bioaktiver Träger nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Steggerüst über den Stegquerschnitt alkalioxidreduziert ist.
3. Bioaktiver Träger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Alkalimetalloxiden oberflächlich oder über den
Stegquerschnitt maximal 5 Masse% beträgt.
4. Bioaktiver Träger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Porengröße des Steggerüsts zwischen 20 - 300 miti, insbesondere zwischen 50 - 200 pm beträgt.
5. Bioaktiver Träger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Stege zwischen 30 - 120 pm, insbesondere 50 - 100 pm beträgt.
6. Bioaktiver Träger nach einem der vorangehende Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er enthält (in Masse%):
- Si02 77,5 - 85,0
- P2O5 8,5 - 12,0
B2O3 0,5— 3,4
Na20 + K2O <6,5
7. Bioaktiver Träger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass er enthält (in Masse%):
- Si02 79,5 - 83,0 P2O5 9,0 - 11 ,7
B2O3 0,65 - 3,25
Na2Ü + K2O <6,5 8. Bioaktiver Träger nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich enthält (in Masse%):
- T1O2 0,1 - 0,5 und/oder
Zr02 0,1 - 0,4
Bioaktiver Träger nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, dass er zusätzlich enthält (in Masse%):
- CuO maximal 0,04 und/oder
- ZnO maximal 0,1 und/oder
- NaCI maximal 0,5 und/oder
- NaF maximal 0,4 und/oder
- Na2S04 maximal 0,6 und/oder
- KNO3 maximal 0,6
10. Glaszusammensetzung für die Herstellung eines Bioglases, insbesondere eines bioaktiven Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 9, enthaltend (in
Masse%):
- S1O2 60,0 - 65,5
- P2O5 6,7 - 9,3
B2O3 0,4— 2,6
- Na20 25,5 - 28,5
- K20 0,45 - 1 ,55
sowie einen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden < 2,0 Masse%.
11. Glaszusammensetzung nach Anspruch 10, enthaltend (in Masse%):
- Si02 61 ,5 - 64,0
- P2O5 7,0 - 9,0
- B2O3 0,5 - 2,5
- Na20 26,0 - 28,0 K20 0,5 - 1 , 5
sowie einen Gehalt an Erdalkalimetalloxiden < 2,0 Masse%.
Glaszusammensetzung nach Anspruch 11 , enthaltend zusätzlich (in Masse%):
- T1O2 0,1 - 0,5 und/oder
- Zr02 0,1 - 0,4
Glaszusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, enthaltend zusätzlich (in Masse%):
- CuO maximal 0,04 und/oder
- ZnO maximal 0,1
Glaszusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, enthaltend zusätzlich (in Masse%):
- NaCI maximal 0,5 und/oder
- NaF maximal 0,4
Glaszusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, enthaltend zusätzlich (in Masse%):
- Na2S04 maximal 0,6 und/oder
- KNO3 maximal 0,6
Glaszusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, enthaltend (in Masse%):
- Si02 62,7
- P2O5 7,0
B2O3 2,0
- Na20 25,6
- K20 1 ,0
- Ti02 0,12
- Zr02 0,1
- CuO 0,02 - ZnO 0,06
- NaCI 0,3
- NaF 0,2
Na2S04 0,4
- KNOs 0,5
Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 9, mit folgenden Schritten:
- Verwendung einer Glaszusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 16 und Herstellung einer Glasschmelze hieraus
- Herstellung eines Glaskörpers aus der Glasschmelze
- Mahlen des Glaskörpers zur Bildung eines Glaspulvers
- Bildung einer Suspension aus dem Glaspulver und einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel
- Aufbringen der Suspension auf einen porösen Schwammträger aus einem Polymer unter Belegung der Oberfläche des Schwammträgers mit dem Glaspulver
- Wärmebehandlung des belegten Schwammträgers zur thermischen Zersetzung des Schwammträgers und gleichzeitiger Sinterung des Glaspulvers zur Bildung eines porösen dreidimensionalen Steggerüsts
- Auslaugung des Steggerüsts zur Reduzierung des Gehalts an
Alkalimetalloxiden im Steggerüst.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Glaspulver eine Glaspulverfraktion mit einer Korngröße < 100 miti, insbesondere < 40 pm gebildet wird, mit der die Suspension hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel Isopropanol verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension unter Verwendung wenigstens eines Dispergators und/oder wenigstens eines Bindemittels hergestellt wird. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als
Bindemittel Polyvinylalkohol verwendet wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass als Schwammträger ein Schwamm aus Polyurethan verwendet wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 550 - 800 °C, ins von 600 - 740 °C erfolgt. 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslaugung mit Salzsäure, insbesondere 0,1 molarer Salzsäure erfolgt.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslaugung bei einer Temperatur zwischen 30 - 40°, insbesondere bei 37°, für die Dauer von mehreren Tagen erfolgt.
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