JP2003509021A

JP2003509021A - 細胞増殖基質

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Publication number: JP2003509021A
Application number: JP2001522386A
Authority: JP
Inventors: トーマスギルクリスト、; デイビッド、マイケルヒーリー、
Original assignee: ギルテック・リミテッド
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2003-03-11
Also published as: WO2001018174A2; CA2380767C; EP1210409A2; DE60032153D1; AU7022700A; EP1210409B1; ATE346911T1; WO2001018174A3; CA2380767A1

Abstract

(57)【要約】生きた細胞の増殖を支えるのに適合した水溶性ガラスのマトリクスを含む細胞培養の増殖基質。好ましくは、前記基質は生きた細胞を含み、あるいは覆われている。前記水溶性ガラスはリン酸ベースであるのが有利であり、ガラスのファイバー又は細かく砕いた粒子を含む。また、本発明は、患者の損傷した組織と置きかわり又は修復を促進する移植組織としての増殖基質の使用、ならびに、生きた組織の増殖を促進する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細胞培養のための増殖基質を提供する。特に、本発明は、組織工学
のための細胞培養増殖基質を提供する。

【０００２】組織工学は、整形外科治療、ガン治療及び慢性変性疾患の治療を変えることを
期待されている。組織工学は、生きた細胞又は患者に組み込むそのような細胞の
増殖を維持する適当な基質を含む移植片の提供に関するもので、傷の治癒と修復
の促進、又はドラッグデリバリーか遺伝子治療デリバリーかのいずれかのシステ
ムを提供する。組織工学の移植片は、自家移植片、同種移植片又は異種移植片で
あり得る。自家移植片は、適当な増殖培地又は基質で培養された患者自身の細胞
で作られている。同種移植片は、（死体又は胎児由来のものを含む）代わりにな
り得る同種由来のものから提供された細胞を頼みにし、一方異種移植片は、他種
から提供された細胞を頼みにしている。同種移植片と異種移植片のどちらもが、
移植後に移植片の自己免疫拒絶反応を抑える処置をされ得る。

【０００３】組織工学の移植片には、再建外科や整形外科や歯科の治療、やけどの治療、又
は（静脈性潰瘍及び糖尿病性の足の潰瘍を含む）潰瘍の治療を含む多数の潜在的
な用途がある。多くの組織工学の移植片が、文献（Ｄｕｔｔｏｎ、“Ｔｉｓｓｕ
ｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮ
ｅｗｓ、Ｖｏｌ１８、Ｎｏ８、Ａｐｒｉｌ１５、１９９８参照）に記載さ
れている。

【０００４】そのような組織工学の移植片の例として、分化ケラチノサイトとコラーゲンマ
トリクス中の繊維芽細胞の層との両方を含む二層構造の移植片であるアプリグラ
フ（ＡＰＬＩＧＲＡＦ）（商標）がある。アプリグラフは、特にやけど、糖尿病
性の足の潰瘍、切除外科及び静脈性潰瘍のための植皮片として使われている（Ｂ
ｅｎｄｅｒ、“ＨｅａｌｉｎｇｏｆＤｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏＨｅａｌ
ＷｏｕｎｄｓＵｓｉｎｇａＢｉｌａｙｅｒｅｄＳｋｉｎＣｏｎｓｔｒ
ｕｃｔ”、１１ｔｈＡｎｎｕａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＣｒｉｔｉ
ｃａｌＩｓｓｕｅｓｉｎＳｕｒｇｅｒｙ−ＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ、
ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３−５Ｄｅｃｅｍｂｅｒ
１９９８、ＳｔＴｈｏｍａｓ、ＵＳＶｉｒｇｉｎＩｓｌａｎｄｓ）。他の
生物工学の皮膚同等物には、牛のコラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）
とシラスチックのシートからなる異種移植片であるインテグラ（ＩＮＴＥＧＲＡ
）（商標）、加工された死体の皮膚からなる同種移植片であるアロダーム（ＡＬ
ＬＯＤＥＲＭ）（商標）、及びポリグラクチンの骨格上の新生児の繊維芽細胞か
らなる同種移植片であるダーモグラフト（ＤＥＲＭＯＧＲＡＦＴ）（商標）があ
る。骨のための組織工学の移植片には、骨状の層を金属性の人工器官を覆うよう
に成長させ、骨の成長のための足場に使えるバイオミメティックコーティングで
あるイソティスビーブイ（ＩｓｏＴｉｓＢＶ）のレインボウ（ＲＡＩＮＢＯＷ
）（商標）、及び吸収性の骨修復材料であるエンバーク（ＥＭＢＡＲＣ）（商標
）がある。

【０００５】現在開発されている組織工学の移植片が多数あるにもかかわらず、さらに改良
された製品の要望が未だにある。本発明者達は今回、水溶性のガラスが細胞増殖
のための支持材又はマトリクスとして働き、それ故にそのガラスが細胞工学にお
いて役に立つことを見出した。

【０００６】本発明はそのように、生きた細胞の増殖を支えるのに適応した水溶性ガラスの
マトリクスを含む細胞培養増殖基質を提供する。好ましくは、その基質は、生き
た細胞で覆われている少なくとも一部表面を含み、あるいは有する。

【０００７】ある態様では、細胞培養の増殖基質は生きた細胞を予め植え付けられ、それ故
にマトリクスは生きた細胞で覆われている少なくとも一部表面を含み、あるいは
有する。

【０００８】ある態様では、例えば損傷した組織に取ってかわるのに、又は修復を促進する
のに患者への移植を予定されている移植組織又は組織の移植片として、細胞培養
の増殖基質は有用である。

【０００９】水溶性ガラスのマトリクスは勿論生体適合性である。一般的に、患者への移植
片の移植後の水溶性ガラスの生体分解は、関係する組織の再生に必要とされるタ
イムスケールに合うように予め決められる。

【００１０】移植片に存在するガラスは細胞支持マトリクスとして働き、生体内でもそのよ
うに機能するだろう。そのように、その移植片は、周辺組織の侵入成長を促す一
時的な生体分解性の骨格を提供するのに直接生体内で使われることができる。他
の態様では、移植の前に、予め選択された細胞タイプの移植片を予め植え付けて
おくこと、及び随意的にその細胞タイプの増殖することが望ましい。

【００１１】別の態様においては、細胞培養増殖基質は、例えば、薬やその他の生物由来の
化学品の製造のためのバイオリアクター及び発酵技術において、非臨床目的のた
めに意図されている。有機体は、通常は表面で集密を増して増殖し、ならびに、
酵素反応（及び多くの他の生化学反応）は、酵素が反応表面に結合する時に、一
般的に最も効果的である。ビーズ、シンター及びファイバーが、大きな（生産）
表面積と、制御された無機微量栄養素の供給、混入制御、ｐＨ調節、及び細胞、
酵素あるいは反応ステージの完了時にその表面に結合するその他の成分の連続し
た移動又はろ過を許す生体適合性キャリアー、といったような付加的な特徴とを
有して、要求される機械的支持を付与するのに使用することができる。

【００１２】利便性から、水溶性ガラスのマトリクスは水溶性ガラスのファイバーの形状に
なってよく、適当なガラスファイバーの製品を記載しているＷＯ−Ａ−９８／５
４１０４で参照される。ガラスファイバーは個々のストランドの形状で使われる
ことができる一方で、織られた（例えば、１×１バスケットウィーブ）又は不織
りのマットもファイバーから作られ、マトリクスとして使われてよい。不織りマ
ットの個々のファイバーは、ストランドの一体性を得るのに互いにゆるやかに焼
結されて良い。また、ファイバーはガラスウールとして使われてよく、この形状
のマトリクスは、移植片が３Ｄ形状である必要がある場合に特に適している。

【００１３】また、水溶性ガラスのマトリクスは細かく砕かれたガラス粒子から作られてよ
い。例えば、その粒子は１５μｍから６ｍｍの平均直径を有して良く、好ましく
は５０μｍから６ｍｍである。付随的に、ガラス粒子は、細胞が中に又は表面に
植え付けられる多孔質構造を形成するべく互いに焼結されてよく、この態様では
、ガラス粒子は５３μｍから２ｍｍの好ましい直径を有し、より好ましくは４０
０μｍから２ｍｍである。また、３次元的に形作られた移植片は、（もし患者の
傷口に合うように個々に作られる必要があるなら）シンターから作られて良い。
また、フラー曲線の充填分布に従った、０．３ｍｍから５．６ｍｍの直径範囲で
ある粒子が使われて良い。

【００１４】さらなる態様において、ガラスは、実質的に平面か又は必要な形に形成されて
いる単なるガラスシートの形になって良い。エッチングされ、磨かれ、又はパタ
ーンを形成したガラスシートが表面が平坦化されたガラスに加え、使われて良い
。この水溶性ガラスは、ガラス形成材料として五酸化リン（Ｐ_２Ｏ_５）を含むの
が好ましい。

【００１５】一般的にはガラス成分中の五酸化リンのモルパーセントは８５％未満であり、
好ましくは６０％未満であり、特に３０〜６０％である。

【００１６】アルカリ、アルカリ土類又は遷移金属の酸化物や炭酸塩が一つ以上、ガラス改
質材料として使われるのが好ましい。

【００１７】一般的に、アルカリ、アルカリ土類又は遷移金属のこれらの酸化物又は炭酸塩
のモルパーセントは６０％未満であり、好ましくは４０〜６０％の間である。

【００１８】ホウ素含有化合物（例えば、Ｂ_２Ｏ_３）が、ガラス添加物として使われるのが
好ましい。

【００１９】一般的に、ホウ素含有化合物のモルパーセントは１５％以下であり、好ましく
は５％未満である。

【００２０】他の化合物、例えばＳｉＯ_２、Ａｌ₂Ｏ_３、ＳＯ_３、硫酸イオン（ＳＯ_４ ^２−
）又は遷移金属の化合物（例えば、最前列の遷移金属の化合物）が、ガラスの性
質を変えるのにガラスに加えられてもよい。

【００２１】典型的には、本発明で使用される溶解性ガラスは、主なガラス形成材料として
五酸化リン（Ｐ_２Ｏ_５）を含み、一緒に、酸化ナトリウム(Ｎａ_２Ｏ)、酸化カリ
ウム(Ｋ_２Ｏ)、酸化マグネシウム(ＭｇＯ)、酸化亜鉛(ＺｎＯ)及び酸化カルシウ
ム(ＣａＯ)といった、ガラスを改質する無毒な材料を一つ以上含む。ガラスが液
体に溶ける速度は、ガラスの組成により決まり、一般的にはガラス形成材料に対
するガラス改質材料の割合によって、及びガラス中のガラス改質材料の相対的な
比率により決まる。ガラス組成の適当な調節により、３８℃の水への溶解速度が
実質的にゼロ（つまり、ちょうどゼロよりは上）から２５ｍｇ/ｃｍ^２/時間以上
の範囲となるように設定されることができる。しかし、ガラスの最も望ましい溶
解速度Ｒは、０．００１と２．０ｍｇ／ｃｍ^２／時間との間である。

【００２２】水溶性ガラスは、リン酸ガラスであることが好ましく、ならびに、抗菌保護か
細胞増殖の促進かのどちらか又は両方を与えるものであり、また有用な微量元素
である金属イオン又はホウ素の放出源を含むのが好ましい。例として、銀、銅、
マグネシウム、亜鉛、鉄、コバルト、モリブデン、クロム、マンガン、セリウム
、セレンがあげられ、これらの金属イオンは、単独で、又は相互に任意で組み合
わせて含有させられる。銀イオンに関しては、これらはオルトリン酸銀（Ａｇ_３ＰＯ_４）として製造中に取り入れられるのが好都合である。ガラスは、ガラス中
の金属イオン又はホウ素、及び他の成分の放出制御が可能であるのが好ましく、
ならびにこれらの添加物の含有量は、使用条件及び望まれる放出速度に従い変え
ることができるが、銀の含有量は一般的には５モル％までである。本発明者らは
、ガラスの組成を、酸化物、ハロゲン化物及び硫酸イオンのモル％の形で記載す
る慣習に従っているが、これは、そのような化学種がガラス中にあること、なら
びにそれらがガラスの調整のためのバッチに使用されることを意味するつもりは
ない。

【００２３】水性の環境への金属イオンの最適な放出速度は、状況により、とりわけ放出さ
れる金属イオンの特定の作用により選択される。本発明は、金属イオン又はホウ
素を水性媒質へデリバリーする手段を、前記水性媒質中の金属イオン又はホウ素
濃度を０．０１ｐｐｍ以上で１０ｐｐｍ以下に維持する速度で提供する。ある場
合には、要求される放出速度は、システムに加えられたすべての金属が数時間又
は数日の短い期間で放出されるようなものになって良く、ならびに他の用途では
、全部の金属が数ヶ月又はさらに数年に達する期間中実質的に均等な速度でゆっ
くりと放出されて良い。特定の場合には、付加的な要望があって良く、例えば金
属イオンの放出源が尽きた後に何も残らないことが望まれること、あるいは、他
の場合においては、金属が利用される場合に、同時に放出されるいずれかの金属
、つまり前記金属イオン自体以外の金属が、生理的に無害であることが望まれる
。さらに他の場合には、結果として生じた溶液のｐＨが、規定した範囲外となら
ないことを確実にすることが必要である。

【００２４】一般的に、ガラス中のこれらの添加物のモルパーセントは２５％未満であり、
好ましくは１０％未満である。

【００２５】細胞は移植片として要求されるいずれかの適当な細胞であって良い。特に好ま
しい細胞タイプとしてケラチノサイト、繊維芽細胞、軟骨細胞等から作られたも
のが挙げられる。また、（間充織、造血、及び胚）幹細胞、シュワン細胞、ケラ
チノサイト（上皮細胞）、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞と他の繊維芽細胞、心
臓の細胞（と他の筋原細胞）、膵臓のβ細胞、及び、例えば象牙質といった歯周
組織から作られたものが挙げられるが、本発明はこれらの細胞タイプのみに限定
されない。

【００２６】本発明の態様が、以下の非限定的な実施例及び図を参照しながら記述される。

【００２７】実施例１序論放出制御ガラス（ＣＲＧ）は、予め設定可能な速度で分解するリン酸ベースの
材料である。軟骨設計製作のマトリックスとしてＣＲＧを使用するための潜在的
可能性が、分離した馬の軟骨細胞を使用しインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）の手
法で評価された。ガラスは、三つの異なる組成のファイバー形状で準備された。
準備された三つのＣＲＧ組成は、組織工学の基質としての潜在的可能性を示した
。

【００２８】材料及び方法馬の関節の軟骨から分離された合計で２０００００の軟骨細胞は、２４ウエル
プレートの各々の２ｃｍウエルに加えられた。それぞれのウエルは、０．０２グ
ラムのガラスファイバーサンプルを含んだ。Ｆ１からＦ４の４つの異なるファイ
バー（直径２０〜３０μｍ）が分析された。Ｆ１はＦｅ_２Ｏ_３及びＮａＦを含み
、Ｆ２はＣｅ_２Ｏ_３及びＳｅを含む。Ｆ１からＦ４を作るのに使われるガラスの
組成は以下の表１に示されている。（１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含む）培
地は毎日取り替えられた。３日、１週及び２週のタイムピリオドで、サンプルは
、アクチン及びチューブリンを、走査型共焦点レーザー顕微鏡を使用して観察す
るためにローダミンファロイジン及びオレゴングリーンを使用し染色させた。同
じタイムピリオドで、細胞の上澄みが取られ、細胞の生存可能性及びタイプIIコ
ラーゲン生成の解析がなされるまで、−８０℃で貯蔵された。タイプIIコラーゲ
ンの生成は、ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析を使用することにより、ガラスファイ
バーに接触している軟骨細胞集団から解析された。そのＲＮＡは全部、１ｍｌの
ＴＲＩｚｏｌ（ＳＩＧＭＡ社）を５分間細胞集団に加えることにより、その細胞
集団から準備された。この時間の後、ＴＲＩｚｏｌが回収され、ＲＴ−ＰＣＲ解
析が行われるまで−８０℃で貯蔵された。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、コラーゲンタイ
プIIのためにはプライマーで、ならびに細胞生存率のためにはｇａｐＤＨでタギ
ングすることにより行われた。

【００２９】またザイモグラフィーが、軟骨細胞で作られるマトリクスメタロプロテナーゼ
（ＭＭＰ’ｓ）を検出するために４日、１週、及び２週のタイムピリオドで行わ
れた。

【００３０】

【表１】

【００３１】結果及び結論軟骨細胞は、３タイプのファイバーサンプル全てに接着した。３日のタイムピ
リオドで、細胞が丸くなるのが見えた。１週目及び２週目での共焦点顕微鏡検査
は、全てのタイムピリオドの間での細胞増殖を示めした。１週目及び２週目にお
いて、細胞は伸長し、図１で見られるようにファイバーの長さ方向にそって単層
を形成した。

【００３２】ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ファイバーＦ２及びＦ３が２週のタイムピリオド以内で
コラーゲンタイプIIを作っていることを示しており、細胞が軟骨細胞の表現型を
残していることを示している。

【００３３】Ｆ２及びＦ３で行われたザイモグラフィーは、これらのファイバーと接触して
いる細胞が３つのタイムピリオド全てでＭＭＰ２を作ったことを示しているが、
１週目よりは２週目のほうが、４日目よりは１週目のほうがより量が多かった。
共焦点顕微鏡解析から、細胞はこれらのタイムピリオドで数を増やしているのが
観察されたので、ＭＭＰ２生成のこの増加は予期される。

【００３４】結論において、３つのファイバータイプ全てが細胞接着性を示し、Ｆ２及びＦ
３に接着した軟骨細胞はタイプIIコラーゲンを生成する能力を残しているようで
ある。

【００３５】実施例２不織りマットのファイバーの生物学的評価１．目的ａ．一連の５つの不織りマットのＣＲＧファイバーの細胞毒性。ｂ．細胞の基質マトリクスとしてのファイバーの潜在的可能性。をインビトロの手法を使用し決定する。

【００３６】２．範囲このテスト手順はファイバーサンプル全てに適用する。

【００３７】３．装置及び材料３．１装置３．１．１層流空気流フード３．１．２３７℃／５％二酸化炭素で維持されたインキュベーター３．１．３４℃の冷蔵庫３．１．４ −１８℃の冷凍庫３．１．５真空源３．１．６位相差顕微鏡

【００３８】３．２材料３．２．１滅菌プラスチック製ピペット３．２．２滅菌ガラスピペット３．２．３２４ウエル滅菌皿３．２．４外科用ピンセット３．２．５外科用ハサミ３．２．６滅菌ユニバーサルコンテナー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｃｏｎｔ
ａｉｎｅｒ）３．２．７Ｌ９２９細胞培養系（ＡＴＣＣＮＣＴＣクローン９２９
）３．２．８人のへその緒の内皮細胞（最初の細胞源、リバプールウーマン
ズホスピタル）３．２．９ＴＣＰＳ（組織培養ポリスチレン）のネガティブコントロール３．２．１０ＣＲＧファイバー：Ｄ０２１２９８Ｆ１（ＭＡＴＴ０１）Ｄ３０１１９８Ｆ１（ＭＡＴＴ０２）Ｄ１００２９９Ｆ１（ＭＡＴＴ０３）Ｄ１６１２９８Ｆ２（ＭＡＴＴ０４）Ｄ１７１２９８Ｆ２（ＭＡＴＴ０５）全てのＣＲＧファイバーは、８〜３８ｇの量を滅菌せずに提供された。使用さ
れるＣＲＧファイバーの組成（ＭＡＴＴ０１から０５）は、以下の表２に示され
ている。

【００３９】

【表２】

【００４０】４．手順４．１テストサンプルの準備４．１．１テストサンプルは適当なサイズにカットされた（セクション４．
２．１参照）。４．１．２組織培養ポリスチレンがネガティブコントロールとして用いられ
た。該コントロールはテスト材料と同じ物理的形状ではなかった。

【００４１】４．２ファイバーは、いずれかのクリーニング処置前に、Ｌ９２９細胞系と
接触させ試験された。ファイバーは、アセトンでのクリーニング、ＰＢＳでの洗
浄、ならびにドライオーブンでの１９０℃で２時間の滅菌後に、両方の細胞系と
接触させ試験された。

【００４２】４．３細胞の準備４．３．１細胞の継代培養が、ファイバーに導入される前２４時間に準備さ
れた。

【００４３】４．４テスト手順４．４．１ファイバーの小さい「ベッド」が各々のウエルの底に置かれた. ４．４．２細胞／培地のプレパレーションがファイバーのベッドの上に静か
にピペットでのせられた。４．４．３２４ウエルプレートが、インキュベートされ、２４時間目と４８
時間目に試験された。

【００４４】４．５結果の解釈４．５．１インキュベートする期間の終了後、プレートはインキュベーター
から取り出され、位相差顕微鏡で×１０と×２０の対物レンズを使用し試験され
た。４．５．２各々のテスト及びコントロール材料が、以下に詳細に記載された
スコアリングシステムを使用し最初に評価された。この評価は、ＴＣＰＳ表面に
付着されている細胞の外観に基づいている。ファイバーに接着している細胞のそ
のような評価を行うことは可能ではなかった。

【００４５】

【表３】

【００４６】４．６細胞毒性の結果以下の表は、以下の２つの別個のテストで得られた結果をハイライトしている
。２回又は４回のリーディングが各々のテストで行われた。全ての場合において
、ネガティブコントロール（ＴＣＰＳ）は、等級０を提供した。

【００４７】

【表４】

【００４８】コメント記載されているような結果は、材料の細胞毒性の非常に主観的評価を提供する
。等級０が見られる場合には、毒性の証拠はなく、細胞の健康的な集密単層が存
在した。汚染の証拠がある場合又は細胞単層が評価するのに困難である場合には
、スコアーは与えられなかった。

【００４９】４．７細胞の基質の結果以下の表（表５）は、位相差顕微鏡で観察された細胞−ファイバー相互作用及
び全体的な細胞培養状態を詳しく記載している。前に記載されているように、フ
ァイバー上の細胞の位相差像はよくない。染色処理がＨＵＥ細胞で行われた。こ
の処理は、細胞の生存率を同定するのに蛍光染色の手法（臭化エチジウム及びア
クリジンオレンジ）を使用する。観察は全て、細胞とファイバー間の接触の４８
時間後だった。

【００５０】

【表５】

【００５１】図３及び図４に示されている像が生体染色処理の後に得られ、蛍光顕微鏡検査
により試験された。

【００５２】図２において、明るい領域は生存細胞（ｈｕｅ）を表している。この像は様々
な方向に放射状にのびているファイバーの束のある場所を示す。ほとんどの場合
において、細胞は丸くなり、ファイバーの上で伸長しない。

【００５３】図３において、明るい場所は生存細胞（ｈｕｅ）を表している。細胞は、ファ
イバー上で伸長しているのが見られた。この像においてほとんどのファイバーは
、同じ方向に方向付けられている。すぐれた細胞の覆いがある。この像は、ＭＡ
ＴＴ０５で得られた結果を代表するものでもある。

【００５４】テストされた５つのファイバー組成のもののうち、ＭＡＴＴ０４及びＭＡＴＴ
０５は細胞接着のための優れた基質を提供している。ＭＡＴＴ０１は、細胞の形
態はコントロールの表面において見られるものよりも丸くなってはいるが、接着
している多くの細胞を有する。ＭＡＴＴ０２及びＭＡＴＴ０３は、かなり数は減
るが、接着している細胞を見せている。試験したファイバーのいずれでも、細胞
毒性の証拠はない。

【００５５】細胞の生存率を実証するのと同様に、その処理は、ファイバーに接着している
細胞のより良い評価を可能にした。細胞−ファイバー相互作用は、位相差顕微鏡
検査で示されるものよりもさらに良かった。ＭＡＴＴ０４とＭＡＴＴ０５は、優
れた細胞接着を有することが認められた。ＭＡＴＴ０１は、良好な細胞接着を許
した。ＭＡＴＴ０２とＭＡＴＴ０３で細胞接着はあったが、これは０１、０４及
び０５と比較して粗末だった。

【００５６】実施例３約５×１０^５細胞／ｍｌの濃度の（５％ウシ胎仔血清を補われた完全細胞培地
中の）細胞懸濁液が、確立したマウス繊維芽細胞系（Ｌ９２９）に導入された。

【００５７】材料／細胞相互作用は、２４時間目、４８時間目及び７２時間目に位相差顕微
鏡検査を使用し試験された。特に、以下の材料がテストされた（バッチ番号で参
照されるガラスの組成における表６を参照）。

【００５８】ａ）ガラスシート（平面）；コード１０５１０９８−１細胞は、材料に接着しているのがみられ、皿同士の間の一連の移動後も材料と
接触したままである。細胞の形態は丸くなり、増殖速度はコントロールの皿の細
胞で観察されるよりもかなりゆっくりである。それにもかかわらず、その表面で
おこっている細胞分裂の証拠がある。

【００５９】ｂ）焼結ガラスビーズ（滑らかな表面）；コードＢＸ−Ｄ２２１０９８−
１、焼結ガラスビーズ（粗い表面）；コードＢＸ−Ｄ２２１０９８−１位相差を使用しこれらのサンプルを観察するのはより困難である。しかし、細
胞は、粗いもの及び滑らかなものの両方の試料の表面に明らかに存在している。
細胞集団は、７２時間のピリオドまでの時間で明らかに増加している。また、こ
れは、２４時間目の一連の移動後である。

【００６０】

【表６】

【００６１】細胞が７２時間ガラスと接触し、２．５％グルタルアルデヒドで固定され、そ
してアルコールで脱水された後、サンプルのＳＥＭ像が得られた（図４から７参
照）。サンプルは観察前に金のコートをされた。倍率は、図４から７で示されて
いる。

【００６２】実施例４細胞培養の増殖基質として金属イオンあるいはホウ素のうち２つの異なる種類
のものを放出するＣＲＧガラスを使用することの潜在的可能性が、Ｌ９２９マウ
ス繊維芽細胞系において評価された。そうするのに、金属イオン又はホウ素のう
ち異なるタイプのものを放出する２種類のＣＲＧの混合物の抽出物を混ぜ合わせ
た抽出溶媒が準備され、それから、それは、Ｌ９２９マウス繊維芽細胞系の代謝
活性でポジティブな効果が得られた濃度にされた。このデータは、本発明による
細胞増殖基質用のマトリクスとしてのこれらの混合ＣＲＧの潜在的可能性の良い
示唆を与えるだろう。

【００６３】材料この調査で使用される材料は、銀（Ａｇ）イオン、銅（Ｃｕ）イオン、マグネ
シウム（Ｍｇ）イオン、亜鉛（Ｚｎ）イオン、ニッケル（Ｎｉ）イオン、及びホ
ウソ（Ｂ）を含む放出制御ガラス（ＣＲＧ’ｓ）である。ガラスは粒子サイズ＜
５３μｍまで予め細かくした。ＣＲＧの組成は、溶解速度の情報とともに以下の
表７で見られる。使用された抽出溶媒はＰＢＳ（リン酸バッファー溶液―体で見
られる液体に似ている）及びＭＥＭ（１９９改変イーグル培地―血清タンパクを
含んでいる）である。

【００６４】

【表７】

【００６５】Ｌ９２９マウス繊維芽細胞系を確立その細胞系は、リバプール大学で維持されている既存の細胞系を継代培養する
ことにより確立された。細胞は１９９改変イーグル培地（ＭＥＭ）で維持されて
おり、３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気の雰囲気中でインキュベートし保存され
ている。細胞は、平底のフラスコで集密するまで増殖させられ、その後、その単
層がトリプシン処理を使用し採取された。継代培養は、層流フードを使用し滅菌
状態で行われ、以下のプロトコルに従った。

【００６６】繊維芽細胞の継代培養プロトコル・１０ｍｌのＭＥＭを含むオリジナルのフラスコを取り、顕微鏡で細胞をチ
ェックする。・層流フードの下にフラスコを置き、滅菌ガラスパスツールと吸引を使用し
ＭＥＭを取り除く。・細胞の集密層を遊離するのに、フラスコに１％のトリプシンを２．５ｍｌ
加える。細胞の前記遊離を顕微鏡で観察する（約３〜４分かかる）。・細胞が遊離して（それらが丸い状態になる）すぐに、フラスコを前記フー
ドに戻し、トリプシンをパスツールと吸引を使い除去し、１０ｍｌの新しいＭＥ
Ｍと交換する。・それからフラスコは、底から細胞を取り除くのに静かに揺り動かされ、約
１０^６細胞／ｍｌの濃度の懸濁液を作る。・それから１ｍｌのこの懸濁液が、新しいフラスコ中の９ｍｌの新しいＭＥ
Ｍに加えられる。２つのフラスコがこの方法で準備される。・最終的にフラスコは、名前、日付及び細胞系をラベルされる。それから細
胞はインキュベーターに戻され、細胞の集密層を確立するまで１週間置かれる。

【００６７】その後、継代培養が週１回行われ、２つの継代培養のフラスコが１０分の１濃
度で作成され（それから、集密層に発展するのに１週間置かれ）、９６ウエルマ
イクロタイタープレートが４０分の１の濃度で作成される。層が集密であるとき
に、推定される細胞濃度は１×１０^６細胞／ｍｌである。

【００６８】抽出溶媒を準備組合せを構成する各々のＣＲＧ０．１ｇが、微量天秤を使用し計り取られた。
ＣＲＧは滅菌したユニバーサルコンテナーに入れられ、これに、２０ｍｌの抽出
溶媒、すなわちＰＢＳ又はＭＥＭが加えられた。抽出溶媒はその後、３７℃で５
％ＣＯ_２／９５％空気の雰囲気中で４時間の間インキュベートされた。４時間は
、ＣＲＧがこの時間内にＰＢＳ中に完全に溶解し、もしより長く放置されたら沈
殿を始めるような時間として選択された。ＣＲＧは、７２時間の間ＭＥＭ中に置
いてもまだ完全には溶解しなかったので、両方の抽出溶媒のために４時間を使う
ことが決められた。この時間の後、それらはインキュベーターから取り出され、
滅菌条件下で濾過された。濾過は、汚染及び沈殿を取り除くために行われた。

【００６９】次のステップは、一連の濃度のものを準備することであった。ろ過された抽出
液（２０ｍｌ）は、１倍濃度の培地で５０％の開始濃度を提供すべく最初に２倍
濃度の培地２０ｍｌに加えられた、。この濃度はテスト中に使われなかった。次
に、１０ｍｌのＭＥＭが新しいユニバーサルコンテナーに計り取られ、２５％の
濃度を与えるのに１０ｍｌの５０％溶液が加えられ、これは、０．０５％の濃度
が確立されるまでＭＥＭでさらに希釈された。

【００７０】１．１０ｍｌの５０．０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝２５．０％濃度 ^★ 。２．１０ｍｌの２５．０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝１２．５％濃度 ^★ 。３．１０ｍｌの１２．５％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝６．２５％濃度 ^★ 。４．１０ｍｌの６．２５％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝３．１２％濃度
。５．１０ｍｌの３．１２％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝１．６０％濃度 ^★ 。６．１０ｍｌの１．６０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝０．８０％濃度
。７．１０ｍｌの０．８０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝０．４０％濃度 ^★ 。８．１０ｍｌの０．４０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝０．２０％濃度
。９．１０ｍｌの０．２０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝０．１０％濃度 ^★ 。１０．１０ｍｌの０．１０％溶液＋１０ｍｌの新しいＭＥＭ＝０．０５％濃度 ^★ 。 ^★ テスト中に使われる濃度。

【００７１】ウエルプレートのセッティングウエルプレートは、４０分の１の濃度の繊維芽細胞を植え付けられた。培地は
ピペッター及び滅菌トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）を使用しウエルの中に入れられた。
細胞の増殖の効果が調査されるのであって、従って集密層は必要とされないので
、４０分の１の濃度が選ばれた。

【００７２】その後プレートは、３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気の雰囲気中に４８時間又
は９６時間のピリオドの間、再びインキュベートされた。この時間の後、培地が
滅菌条件下でプレートから取り出され、準備した抽出液と以下の方法で取替えた
。１２個ウエルが各々の濃度のために使用され、再び、ピペッター及び滅菌トラ
フがウエルに抽出溶媒を入れるのに使われた。

【００７３】

【表８】

【００７４】その後プレートは、（３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気の雰囲気中に）さらに
４８時間又は７２時間のピリオドの間インキュベートされ、その後抽出溶媒が取
り出され、ＭＴＴ分析が行われた。

【００７５】ＭＴＴ分析を行うＭＴＴ分析は、テトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４，５ジメチルチアゾール−
２−イル）―２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）に基づく迅速
な比色分析である。細胞は、増殖するときにある酵素をつくり、ＭＴＴ塩溶液が
、あるそのような酵素、報告によれば、ミトコンドリアの酵素のコハク酸デヒド
ロゲナーゼにより、青色のホルマザン結晶に分解される。その結晶はイソプロパ
ノールに溶解し、着色した水溶液をつくる。つくられるホルマザンの量は生存細
胞の存在数に比例すると言われており、つまり作られる青の濃さが濃ければ濃い
ほど、細胞活性のレベルがより高いことを示している。

【００７６】２００μｌのＭＴＴ塩溶液が、１ｍｇ／ｍｌの濃度でプレートのそれぞれのウ
エルに加えられ、その後プレートは４時間の期間３７℃でインキュベートされた
。その後ＭＴＴ溶液は取り除かれ、約１００μｌのイソプロパノールと取りかえ
られた。その後、プレートはさらに２０分間（３７℃で）インキュベートされた
。青色のホルマザン結晶の完全な溶解を確実にするために、プレートは静かに揺
り動かされた。

【００７７】最後のステージは、プレートの光学濃度値を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬ
ＩＳＡ）のプレートリーダーを使用し５７０ｎｍのテスト波長で計測することで
あった。

【００７８】結果を得るための反復は、９６ウエルプレート中１２ウエルを、それぞれの濃
度及びコントロールのために使用することによってなされた。反復は、結果に含
まれる誤差量を減じるために必要とされる。

【００７９】結果が比較できるように、様々な異なるステップが取られた。これらは、以下
のものを含む。・それぞれの抽出溶媒のために４時間の溶解時間。・前記インキュベート時間は、ＭＥＭで２日に続けて抽出で２日（２ｄ−２ｄ
）又はＭＥＭで４日に続けて抽出で３日（４ｄ−３ｄ）のいずれの抽出でも同じ
とした。・細胞は調査中定常状態、３７℃／５％ＣＯ_２に保たれた。

【００８０】得られた結果は棒グラフとして表示され、図８から２０に示されている。グラ
フで考える重要な特徴は、セット番号と細胞活性レベルである。それぞれのセッ
ト番号は以下のような異なる濃度に対応している。セット１：コントロールセット２：２５％セット３：１２．５％セット４：６．２５％セット５：１．６％セット６：０．４％セット７：０．１％セット８：０．０５％

【００８１】この研究中に使われたコントロールは、ウシ胎仔血清と抗生物質とを加えられ
た５％ＭＥＭ中で増殖している４０分の１の濃度の細胞であった。このコントロ
ールはＭＴＴ解析の正確さの良い目安を与え、ならびに、その組み合わせが細胞
増殖を拮抗しているのか又は相乗しているのかを決めるのに容易に用いることが
できるという理由で、このコントロールが使われた。

【００８２】光学濃度値から細胞活性レベルを得るのに、コントロールがあるレベルに固定
され、それから、得られた光学濃度値の残りのものが、このレベルに合わせて調
節された。これは、グラフを見ることによって、その組み合わせが細胞増殖にと
って正又は負の効果のどちらになるかを決めることが容易になることを意味する
。

【００８３】光学濃度値のいくつかは、細胞がより長時間の間置かれると、ＥＬＩＳＡプレ
ートで測定できなくなった。細胞活性の量が、プレートリーダーの範囲よりも大
きくなった。しかし、これらの結果は少なくとも３つあることが知られており、
だから、これは最小値として結果に加えられた。これが起こった結果は、グラフ
で^★の印をつけられている。

【００８４】結果ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｍｇ（図８）図８のグラフは、刺激反応が、６．２５％から０．０５％の範囲の２ｄ−ｄ２
サンプルにおいて明らかにあることを示しており、ピーク刺激は０．０５％の濃
度で起こり、コントロールレベルに対して２８％の増加を示している。

【００８５】ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｎｉ（図９）図１１で示されているグラフは、２ｄ−２ｄのピリオドの間に起こっている刺
激効果を示している。０．０５％で起こっている刺激があり、コントロールより
１５％上である。２ｄ−２ｄでの１２．５％では、一連の濃度の中に最初に選択
されなかったので結果を得られなかった。

【００８６】ＭＥＭ抽出溶媒中のＡｇ／Ｚｎ（図１０）この組み合わせは、両方の長さのタイムにおいて、高濃度（２５％、１２．５
％及び６．２５％）では細胞に有毒に働く証拠がある。しかし、０．１％及び０
．０５％の最も低い濃度では、細胞増殖が引き起こされる。より短いタイムの刺
激が、４ｄ―３ｄにおけるよりも大きくなり、０．０５％においてはコントロー
ルレベルより１７％大きくなる。

【００８７】ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｂ（図１１）図１１中に表示されているグラフの解析は、２ｄ−２ｄのピリオドでは、細胞
代謝の刺激が１２．５％で始まり、ピークが０．０５％で起こり、コントロール
より４０％上になることを示している。４ｄ−３ｄ期間では、コントロールより
５％上の刺激効果が０．０５％濃度で起こる。

【００８８】ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｃｕ（図１２ａ）図１２ａのグラフは、刺激反応が２ｄ−２ｄのタイムピリオドでは、６．２５
％と０．４％の間の濃度で起こることを示しており、ピークは６．２５％で現れ
、コントロールよりも２８％の増加を示すことを現している。

【００８９】イオンそれぞれを考えると、マグネシウムは高濃度でさえ完全に無毒なイオン
であることが知られているが、銅イオンは高濃度ではかなり有毒である。これは
、マグネシウムと銅が組み合わさることにより、ＰＢＳに対する特定の濃度範囲
において、マグネシウムが銅の効力を抑制することを示唆している。

【００９０】ＭＥＭ抽出溶媒中のＭｇ／Ｃｕ（図１２ｂ）図１２ｂのグラフは細胞増殖が、４ｄ−３ｄサンプルでは、低濃度（０．４％
、０．１％及び０．０５％）で起こることを示している。ピークは０．０５％で
起こり、細胞のコントロールレベルより３３％の増加を示している。４ｄ−３ｄ
のタイムピリオドはまた、毒性から刺激性への緩やかな増加を示す。

【００９１】ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｎｉ（図１３）２ｄ−２ｄのタイムピリオドは非常に興味深い挙動を示しており、刺激のピー
クは１．６％の濃度で現れ、細胞の代謝ではコントロールよりも２４％の増加を
示している。刺激反応は６．２５％及び０．０５％でも起こる。

【００９２】ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｂ（図１４ａ）このＣＲＧの組み合わせは、２ｄ−２ｄのピリオドでは有意な刺激効果を実現
し、刺激は０．０５％から１．６％までは（０．１％はコントロール直下である
が）明らかにある。この正の効果でのピークは１．６％の濃度で起こり、コント
ロールレベルより３２％上である。

【００９３】ＭＥＭ抽出溶媒中のＭｇ／Ｂ（図１４ｂ）図１４ｂのグラフは、選択されたタイムピリオドの両方で、細胞の代謝に対し
非常に小さい毒作用があることを示している。実際には、２５％と１．６％の間
の濃度においては細胞活性レベルはほとんど等しくなる。４ｄ―３ｄのタイムで
は、刺激効果は０．４％から先で現れる。最大刺激は０．０５％で起こり、コン
トロールより１４％上になる。

【００９４】ＰＢＳ抽出溶媒中のＮｉ／Ｃｕ（図１５ａ）図１５ａのグラフは、両方の長さのタイムにおいて２５％と１２．５％の高濃
度で起こる高いレベルの毒性を示している。２ｄ−２ｄのタイムでは、６．２５
％のＣＲＧ濃度の時にちょうどコントロールの７％下までくる細胞活性の突然の
増加がある。細胞代謝の刺激は、２ｄ−２ｄでは１．６％から先で、４ｄ−３ｄ
では０．４％から見られる。両方のタイムピリオドは０．０５％でピークをむか
え、おおよそ同じレベルの１２／１３％である。

【００９５】ＭＥＭ抽出溶媒中のＮｉ／Ｃｕ（図１５ｂ）毒作用が、他の組み合わせの多くのものと同様に、両方のタイムピリオドにお
いて高濃度で見られる。その後、毒性レベルは、１．６％で有意に下がる。４ｄ
−３ｄのタイムでは、０．４％から０．０５％までに刺激の証拠があり、０．１
％と０．０５％の両方はコントロールより１５％上まで刺激している。２ｄ−２
ｄのタイムでは０．１％で刺激の兆しがあるが、コントロールのレベルより１．
５％上になるのみである。

【００９６】ＭＥＭ抽出溶媒中のＮｉ／Ｚｎ（図１６）図１６のグラフの主な特徴は、２ｄ−２ｄのタイムでの、０．１％の濃度でコ
ントロールより１２％上になる刺激ピークである。刺激は、４ｄ−３ｄでは０．
０５％濃度で、コントロールより８％上になるピークとなり、毒作用は高濃度で
存在する。６．２５％と１．６％の間で、細胞活性の急激な増加がある。

【００９７】ＰＢＳ抽出溶媒中のＮｉ／Ｂ（図１７ａ）この組み合わせは、２ｄ−２ｄでは濃度範囲１．６％から０．０５％にわたり
細胞代謝の刺激反応を引き起こし、最大のものは０．１％の濃度で起こり、コン
トロールより２５％上になる。４ｄ−３ｄのピリオドでは、細胞の活性の緩やか
な増加があり、非毒性は０．１％で達成され、ピークは０．０５％で起こり、コ
ントロールより１７％上になる。

【００９８】ＭＥＭ抽出溶媒中のＮｉ／Ｂ（図１７ｂ）２ｄ−２ｄのピリオドにおいて図１７ｂのグラフで示された結果は、高濃度で
の高い毒性であり、その範囲にわたり細胞活性は緩やかに増加する。この組み合
わせのために起こる正の効果がある。１２．５％から先で刺激があり、０．０５
％でピークがあり、コントロールより３３％上になる。

【００９９】ＭＥＭ抽出溶媒中のＣｕ／Ｚｎ（図１８）図１８のグラフは、この組み合わせは高濃度（２５％から６．２５％まで）で
中毒反応を引き起こすことを示している。細胞増殖は、２ｄ−２ｄのタイムでは
０．０５％で影響を受けなくなる。０．４％から先の結果の４ｄ−３ｄのセット
で起こる細胞増殖がある。最大の刺激は０．０５％で起こり、コントロールレベ
ルに対し４２％のかなりの増加がある。

【０１００】ＭＥＭ抽出溶媒中のＣｕ／Ｂ（図１９）図１９のグラフを考えると、２ｄ−２ｄと４ｄ−３ｄの両方で、細胞活性の緩
やかな増加があることが注目される。２５％において、その組み合わせは、細胞
への毒作用を引き起こし、０．０５％では細胞増殖を実現する。それは、２ｄ−
２ｄではコントロールより２０％上になり、４ｄ−３ｄではコントロールより２
８％上になる。

【０１０１】ＰＢＳ抽出溶媒中のＺｎ／Ｂ（図２０）図２０のグラフを考えると、両方のタイムピリオドで、高濃度（２５％、１２
．５％及び６．２５％）での毒性の証拠がある。２ｄ−２ｄのタイムピリオドで
の、この組み合わせに対する細胞による刺激効果は、１．６％の濃度で始まり、
０．１％の濃度でコントロールレベルより２７％大きくなりピークを向える。

【０１０２】結論集められた結果は、様々な組合せの金属イオン又はホウ素を放出するＣＲＧが
、本発明による細胞培養の基質マトリクスとしての潜在的可能性を有しているこ
とを示している。これは特に、いくつかの組合せで刺激がコントロールより２５
％大きくなるホウ素を含む組合せの場合である。

【図面の簡単な説明】

【図１】走査型共焦点レーザー顕微鏡で見られるようなガラスファイバー（実施例１）
上で単層を形成している軟骨細胞。

【図２】ＭＡＴＴ０１ガラスファイバー上のＨＵＥ細胞の蛍光顕微鏡検査（実施例２参
照）。

【図３】ＭＡＴＴ０４ガラスファイバー上のＨＵＥ細胞の蛍光顕微鏡検査（実施例２参
照）。

【図４】ガラス表面上のＬ９２９細胞の×３０倍でのＳＥＭ写真（実施例３参照）。

【図５】ガラス表面上のＬ９２９細胞の×１７０倍でのＳＥＭ写真（実施例３参照）。

【図６】ガラス表面上のＬ９２９細胞の×２１５倍でのＳＥＭ写真（実施例３参照）。

【図７】ガラス表面上のＬ９２９細胞の×６１０倍でのＳＥＭ写真（実施例３参照）。

【図８】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｍｇ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照
）。

【図９】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｎｉ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照
）。

【図１０】細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＡｇ／Ｚｎ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照
）。

【図１１】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＡｇ／Ｂ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照）
。

【図１２】（ａ）細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｃｕ濃度を示す棒グラフ（実施
例４参照）。（ｂ）細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＭｇ／Ｃｕ濃度を示す棒グラフ（実施
例４参照）。

【図１３】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｎｉ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照
）。

【図１４】（ａ）細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＭｇ／Ｂ濃度を示す棒グラフ（実施例
４参照）。（ｂ）細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＭｇ／Ｂ濃度を示す棒グラフ（実施例
４参照）。

【図１５】（ａ）細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＮｉ／Ｃｕ濃度を示す棒グラフ（実施
例４参照）。（ｂ）細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＮｉ／Ｃｕ濃度を示す棒グラフ（実施例
４参照）。

【図１６】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＮｉ／Ｚｎ濃度を示す棒グラフ（実施例４参照
）。

【図１７】（ａ）細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＮｉ／Ｂ濃度を示す棒グラフ（実施例
４参照）。（ｂ）細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＮｉ／Ｂ濃度を示す棒グラフ。

【図１８】細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＣｕ／Ｚｎ濃度を示す棒グラフ。

【図１９】細胞活性対ＭＥＭ抽出溶媒中のＣｕ／Ｂ濃度を示す棒グラフ。

【図２０】細胞活性対ＰＢＳ抽出溶媒中のＺｎ／Ｂ濃度を示す棒グラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生きた細胞の増殖を支えるのに適合した水溶性ガラスマトリク
スを含む細胞培養の増殖基質。
【請求項２】少なくとも、前記基質表面の一部が生きた細胞で覆われている
ことを特徴とする請求項１記載の基質。
【請求項３】前記マトリクスが、少なくとも、生きた細胞で覆われた前記表
面の一部を有することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の基質。
【請求項４】前記水溶性ガラスが、リン酸ガラスであることを特徴とする請
求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の基質。
【請求項５】前記水溶性ガラスが、ガラス形成材料として５酸化リンを含む
ことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の基質。
【請求項６】前記ガラスが、ガラス改質材料としてアルカリ金属、アルカリ
土類金属又は遷移金属の酸化物又は炭酸塩を含むことを特徴とする請求項１ない
し請求項５のいずれか一項に記載の基質。
【請求項７】前記ガラス改質材料が、酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化
マグネシウム、酸化亜鉛、又は酸化カルシウムであることを特徴とする請求項６
記載の基質。
【請求項８】前記水溶性ガラスが、ホウ素含有化合物を含むことを特徴とす
る請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の基質。
【請求項９】前記ガラスが、３８℃で実質的に０から２．０ｍｇ／ｃｍ^２／
時間の範囲にわたる溶解速度を有することを特徴とする請求項１ないし請求項８
のいずれか一項に記載の基質。
【請求項１０】前記ガラスが、水性媒質中で、添加物の制御された放出を可
能にすることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の基質
。
【請求項１１】前記添加物が、少なくとも一つの金属イオン又はホウ素を含
むことを特徴とする請求項１０に記載の基質。
【請求項１２】前記水溶性ガラスのマトリクスが、水溶性ガラスファイバー
を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１１のいずれか一項に記載の基質
。
【請求項１３】前記ガラスファイバーが、不織りマットを作るのに互いに焼
結されていることを特徴とする請求項１２に記載の基質。
【請求項１４】前記水溶性ガラスのマトリクスが、細かく砕かれたガラス粒
子を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の基
質。
【請求項１５】前記細かく砕いたガラス粒子が、多孔質の構造を形成するの
に互いに焼結されていることを特徴とする請求項１４に記載の基質。
【請求項１６】前記ガラス粒子が、１５ミクロンから６ｍｍの平均直径を有
することを特徴とする請求項１４又は請求項１５に記載の基質。
【請求項１７】患者の損傷組織に取ってかわる又は修復を促進する移植組織
としての、請求項１ないし請求項１６のいずれか一項に記載の基質の使用。
【請求項１８】請求項１ないし請求項１６に記載の基質を提供することによ
り、生きた組織の増殖を促進する方法。
【請求項１９】前記方法が、水性媒質中の金属イオン又はホウ素の濃度を０
．０１ｐｐｍ以上で１０ｐｐｍ以下に維持する速度で、金属イオン又はホウ素を
水性媒質にデリバリーするステップを含むことを特徴とする請求項１８に記載の
方法。