EP3420358A1 - Peptides immunogenes et leur utilisation - Google Patents

Peptides immunogenes et leur utilisation

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Publication number
EP3420358A1
EP3420358A1 EP17712193.6A EP17712193A EP3420358A1 EP 3420358 A1 EP3420358 A1 EP 3420358A1 EP 17712193 A EP17712193 A EP 17712193A EP 3420358 A1 EP3420358 A1 EP 3420358A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
peptides
peptide
individual
sera
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17712193.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre-Alain RUBBO
Edouard TUAILLON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Omunis
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Universite de Montpellier
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
Original Assignee
Omunis
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Universite de Montpellier
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Omunis, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier, Universite de Montpellier, AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS filed Critical Omunis
Publication of EP3420358A1 publication Critical patent/EP3420358A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • the present invention relates to immunogenic peptides and their use, particularly in the context of the diagnosis of pathologies.
  • tuberculosis With one third of the world's population infected and one death every 20 seconds, tuberculosis (TB) remains one of the world's most deadly diseases. No rapid diagnostic test, accurate and validated according to the expectations of health authorities, including the World Health Organization (WHO) is marketed to date, the reference test requiring several weeks before giving a result .
  • WHO World Health Organization
  • the WHO thus opens the door to an opportunity for a new generation of tests meeting strict criteria of quality and clinical validation.
  • One of the aims of the invention is therefore to provide a diagnostic method for active tuberculosis that can be easily implemented in any situation, and in particular in the absence of highly equipped hospital infrastructure.
  • Another object of the invention is to determine the best peptide candidates for implementing this new method of efficient and rapid diagnosis.
  • the invention also relates to a method for in vitro screening of at least one immunogenic peptide of interest capable of recognizing at least one antibody derived from the serum of individuals with active tuberculosis, said at least one immunogenic peptide being a hydrophilic peptide derived from a hydrophobic protein, said hydrophobic protein being a wall protein, or secreted, bacteria of the genus Mycobacterium, said hydrophobic protein having lipolytic activity, said method comprising the following steps:
  • At least one control sample from an individual who does not have tuberculosis from an individual who does not have tuberculosis
  • the ratio R being the normalized measurement value of the immune complex formation, relative to the respective backgrounds of the sera and components used to detect the immune complexes, on or divided by the standardized measurement value obtained from the sample from a healthy individual relative to the respective backgrounds of sera and components used to detect immune complexes.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that certain peptides derived from specific proteins are very good candidates for implementing a diagnostic method of active tuberculosis, while proposing a sensitivity and efficacy of detection of pathology at a high level.
  • the diagnosis proposed by the invention can be carried out in humans but also in animals.
  • tuberculosis tuberculosis
  • TB tuberculosis
  • hydrophobic protein having lipolytic activity are used to designate an enzyme with lipolytic activity and include, phospholipases A, B, C or D, and lipases, especially triglycerides lipases, lipases. or diglycerides, monoglyceride lipases.
  • Mycobacterium tuberculosis During infection, Mycobacterium tuberculosis accumulates intracellular inclusion bodies loaded with lipids whose lipids are probably derived from the degradation of the cell membrane of the host. There is now strong evidence supporting the fact that fatty acids are a source of carbon during dormancy. Mycobacterium tuberculosis stores fatty acids as triacylglycerol (TAG) upon entry into the persistent non-replicating stage (latent state). In addition, granulomas containing foamy macrophages which are cells containing in their cytoplasm a large amount of neutral lipids surrounded by phospholipids have been found.
  • TAG triacylglycerol
  • lipid bodies are induced by the internalisation of the bacterium and therefore provide a source of carbon for the survival and reactivation of the pathogen. More generally, these findings support the fact that the enzymes involved in lipid degradation can assume important physiological functions and can participate in the extraordinary ability to survive and inactivate Mycobacterium tuberculosis from infected cells. The degradation of host lipids by Mycobacterium tuberculosis is probably carried out by lipolytic enzymes, such as lipases and phospholipases, including the family of cutinase enzymes.
  • Lipases are water soluble proteins having lipolytic activity belonging to the esterase group and catalyzing the hydrolysis of water insoluble substrates such as triacylglycerol ester bonds and phospholipids.
  • the catalytic reaction of lipolysis involves different process at the interface and depends closely on the structure of the lipid substrates present in oil-in-water emulsions, membrane bilayers, monolayers, micelles and vesicles.
  • the catalytic process can be described as a reversible lipase adsorption / desorption step at the oil / water interface, followed by formation of an enzyme / substrate complex at the interface and release of the lipolysis products.
  • 24 were classified in the family of enzymes called "Lip family". However, this classification is only based on the presence of the consensus sequence GXSXG which is characteristic of esterases and members of the family of hydrolases possessing ⁇ / ⁇ sheets.
  • the method for detecting immunogenic peptides is therefore based on taking advantage of the properties of proteins with lipolytic activity (which make it possible to detect active tuberculosis) while avoiding the difficulty of working with whole proteins, which can be difficult to handle and / or expensive and complex to produce.
  • hydrophobic protein in the invention a protein which is considered, as a whole, to have little affinity for aqueous solutions and which is unlikely to dissolve in an aqueous liquid.
  • Proteins are composed of amino acids that can be polar (hydrophilic) or hydrophobic. When the protein is synthesized, it adopts a specific three-dimensional conformation related to its activity or function so that amino acids distant from each other in the sequence can be found nearby in space. If during the folding of a protein, all the polar amino acids are found inside a pocket which is surrounded by hydrophobic amino acids, the entire protein will then be considered hydrophobic, even if the proportion of hydrophilic amino acids is greater than that of hydrophobic amino acids.
  • a protein will be considered as hydrophilic, if its three-dimensional conformation is such that the majority of the amino acids present on the surface of the protein are hydrophilic.
  • hydrophilic peptide derived from a hydrophobic protein a fragment of said hydrophobic protein, as defined above, whose properties are to be easily soluble and stable in an aqueous liquid, c i.e., in water or polar solvents.
  • Solubility can also be predicted by counting the number of charged residues and adding the free terminal ends of the peptide. Theoretically, at least one charge every 5 residues is required to obtain minimal solubility. We must also avoid a sequence of more than 3 to 4 hydrophobic residues.
  • the hydrophobicity at pH 6.8 makes it possible to check the solubility of the peptide in an aqueous buffer. This value makes it possible to check the compatibility with the coupling buffers during the step of conjugation with the carrier protein.
  • the peptides to be screened are, for example, i) flexible, that is to say not spatially constrained, that is to say with free epitopes of access for possible antibodies in relation to the overall structure of the peptide, ii) if they are found in conserved protein motifs or secondary structures (helices, ⁇ -sheets) which would reduce their specificity, iii) if they are found in regions exposed to the entire protein from which they derive.
  • the skilled person may also find other appropriate characteristics that could complement its choice of potentially immunogenic peptides.
  • hydrophilic peptides have been identified, their immunogenicity is then tested according to the following method:
  • each peptide is brought into contact with at least two pools of sera, the sera being from patients with clinically confirmed active TB, and 2- in parallel with a control sample from a healthy individual, which is not has tuberculosis, especially active TB, that is, an individual who has never been in contact with TB or a patient who is latent in TB (and therefore has not developed active TB) .
  • the objective is to determine whether the peptides tested are capable of forming immune complexes with at least one antibody contained in said pools of sera of individuals with active TB, which means that the peptides are potentially immunogenic.
  • the potential immune complexes are detected according to conventional methods which consist in labeling and identifying the presence of an immune complex by detecting the constant part of the antibodies which have potentially interacted with the peptides to be screened by means of specific immunoglobulin of the parts constants of antibodies coupled to markers for quantification.
  • a standard laboratory method for detecting these immune complexes is an ELISA (Enzyme-linked ImmunoSorbentAssay) test. This detection method can also be adapted to different solid supports to facilitate the identification of immune complexes outside laboratories.
  • a ratio R is calculated, the ratio R being the normalized measurement value of the immune complex formation, relative to the respective backgrounds of the sera and components used to detect the immune complexes, over, or divided by, the normalized measurement value obtained from the sample from a healthy individual relative to the respective backgrounds of the sera and components used to detect the immune complexes.
  • Vp + e corresponds to the value measured during the detection of an immune complex when the peptide (p) is brought into contact with the serum of a patient suffering from active TB
  • Vs + e corresponds to the value measured during the detection of an immune complex when the solvent of the peptide (s) is brought into contact with the serum of a patient with active TB
  • - Vp + n corresponds to the value measured during the detection of an immune complex when the peptide (p) is brought into contact with the serum of a healthy individual (n)
  • - Vs corresponds to the value measured during the detecting an immune complex the solvent of the peptide (s) is brought into contact with the serum of a healthy individual (n)
  • VBIanc is the value measured when an immune complex is detected in the absence of any serum, peptide or solvent.
  • the ratio as calculated above is greater than or equal to 1.5, the peptide will be considered as particularly interesting and capable of effectively detecting Antibodies markers of active TB. On the other hand, if the ratio R is less than 1, 5 it will not be retained.
  • each peptide is contacted with at least two pools of sera.
  • a pool or mixture of several sera from distinct patients each with a clinically established active TB is used. These pools make it possible to have a mixture of sera and thus to increase the diversity of antibodies that can be detected.
  • Independent pools are used, i.e. mixtures of sera that do not have the same origins. For example, if a first pool comprises 4 sera from 4 different individuals, a second independent pool will include several sera none of which will be in common with at least one of the sera of the first pool.
  • the immune complexes between the peptide and the antibodies contained in the pools are quantified by immunodetection using immunoglobulins coupled to a detection agent.
  • the preferred peptides are those which have a ratio R greater than
  • peptides with a ratio R greater than or equal to 1 will also be interesting. for a pool of at least two serum pools. On the other hand, peptides are not selected for which the ratios R, irrespective of the pool of the at least two serum pools, are less than 1, 5.
  • the invention relates to the aforementioned screening method, further comprising the steps of:
  • the ratio R is measured according to the above-mentioned formula, and the peptides for which the ratio R is greater than or equal to 1.5 are retained as being the most efficient peptides, that is, that is, peptides that have good affinity for specific antibodies to active tuberculosis (active TB).
  • the invention relates to the abovementioned method in which, during the first selection, only peptides are selected for which the value of a ratio R is greater than or equal to 1.5 for at least two of the independent pools of sera from patients with confirmed active TB.
  • the invention relates to the method as defined above, in which the hydrophilic peptides are identified by bioinformatics, on the basis of their apparent hydrophilicity.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein the hydrophilic peptides have a size of 15 to 25 amino acids.
  • the peptides which are to be screened in the invention are medium-sized peptides having a tiller of 15 to 25 amino acids, i.e. having 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 natural amino acids.
  • These peptides can also be modified on one or more amino acid residues, for example by protecting certain residues such as cysteine residues. It is possible to add on these peptides other N-terminal or C-terminal chemical groups. -terminal facilitating their handling and their use in a rapid test (grafting to the support, epitopic presentation, conformation, etc.). These groups may be, for example, Biotin, a BSA-type soluble carrier protein, thiol or NH 2 provided that it is absent from the peptide sequence of interest.
  • the invention relates to the method described above in which the immune complexes are detected by immunodetection using labeled antibodies directed against the constant part of the immunoglobulins.
  • the invention also relates to at least one hydrophilic peptide, intended to detect active tuberculosis in a patient's blood sample, obtainable or screened by the method as defined above.
  • the invention relates to a peptide capable of being screened by the above-mentioned method for its use in the diagnosis of active tuberculosis in an individual.
  • the invention further relates to at least one hydrophilic peptide, comprising from 15 to 25 amino acids, derived from a hydrophobic protein, said hydrophobic protein being a bacterial wall protein of the genus Mycobacterium, said hydrophobic protein having an activity lipolytic.
  • the invention also relates to a peptide a hydrophilic peptide, comprising 15 at 25 amino acids, derived from a hydrophobic protein, said hydrophobic protein being a bacterial wall protein of the genus Mycobacterium, said hydrophobic protein having lipolytic activity, for use in the diagnosis of active tuberculosis in an individual
  • the peptides screened by the aforementioned method are particularly advantageous for implementing a method for diagnosing active tuberculosis in individuals. Indeed, since these peptides are selected for their ability to detect antibodies specifically present in the serum of patients with active tuberculosis, they will be particularly effective in determining the serological status of an individual vis-à-vis tuberculosis.
  • the invention relates to a hydrophilic peptide, as defined above, said peptide being represented by any one of the following sequences: SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 30.
  • Peptides having the sequence SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 30 are understood to mean in the invention the peptides of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30.
  • the most advantageous peptides of the invention are the peptides of sequence: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, which have R ratios well above 1.5 for four independent pools of sera.
  • the invention also advantageously relates to a composition
  • a composition comprising at least one of the peptides chosen from the peptides of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, for its use in the diagnosis of active tuberculosis in an individual.
  • the invention relates to a composition for its aforementioned use, comprising at least one of the peptides chosen from the peptides of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the invention relates to a composition for its aforementioned use, comprising at least one of the peptides chosen from the peptides of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19.
  • the invention further relates to an in vitro diagnostic method in an individual susceptible to active tuberculosis, said method comprising:
  • a step of detecting an immune complex between at least one antibody of said blood sample and said peptides is a step of detecting an immune complex between at least one antibody of said blood sample and said peptides.
  • the invention relates to a method for diagnosing active tuberculosis in an individual comprising a step of contacting a blood sample, in particular serum, of said individual with at least one peptide chosen from the peptides of sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, and
  • a step of detecting at least one immune complex between at least one antibody of said blood sample and said at least one peptide is a step of detecting at least one immune complex between at least one antibody of said blood sample and said at least one peptide.
  • the invention further relates to a diagnostic kit for active tuberculosis, comprising:
  • the said at least one peptide is in particular a peptide selected from the peptides of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30.
  • immunoglobulins specifically recognizing the constant part of the antibodies, in particular human antibodies, said immunoglobulins being able in particular to be coupled with fluorochromes, with enzymes, etc. of the art knows what types of labeled immunoglobulins are suitable for making such a kit and allow the detection of immune complexes.
  • the invention relates to a kit as defined above, comprising means for identifying immune complexes between at least one antibody from a blood sample of an individual are arranged on a chromatographic type support.
  • Other formats such as magnetic beads or "electricsensors" are also usable.
  • kits for detecting active tuberculosis in the form of a portable kit, usable in all situations and in all situations, by depositing a drop of blood.
  • a kit for detecting active tuberculosis in the form of a portable kit, usable in all situations and in all situations, by depositing a drop of blood.
  • a kit is a quick detection kit, in just a few minutes.
  • An example of such a portable kit is shown in Figure 1.
  • the invention relates to the aforementioned kit, further comprising at least one positive control.
  • a positive control that is to say a serum from one or more patients whose active tuberculosis is or has been clinically confirmed.
  • the invention relates to the aforementioned kit, wherein said at least one hydrophilic peptide is coupled to magnetic nanobeads.
  • the invention furthermore relates to a hydrophilic peptide as defined above, in particular a peptide consisting essentially of or consisting of any one of SEQ ID NO: 1 to 30, for use in the diagnosis active tuberculosis in an individual.
  • the specific peptides of the invention are very suitable for detecting antibodies directed against Mycobactrium tuberculosis peptides, and thus for enabling a diagnosis of active tuberculosis in an individual.
  • Figure 1 shows an example of portable kit according to the invention
  • FIG. 2 shows a representative diagram of the embodiment of Fig. 1.
  • Figure 3 is a schematic representation of the visual result obtained during a positive diagnosis of active tuberculosis (++) or during a negative diagnosis (-).
  • T denotes the significant marking of the positivity of the sample
  • T + indicates the positive control of the reaction.
  • the arrow indicates the direction of migration.
  • Figures 4 to 7 show histograms of the reactivity of peptides tested in the form of index (ratio R according to the invention).
  • Figure 8 shows a histogram the reactivity of peptides C2, C12, M3, V5 and G9 (respectively represented by the sequences SEQ ID NO: 1 to 5) as an index (ratio R according to the invention). The bars represent the 4 pools tested for each of the peptides
  • FIG. 9 represents a histogram showing the comparison of the results obtained between the conventional ELISA technique (columns in dark gray) and the nanobeads technology (column in light gray), by using the peptide SEQ ID NO: 3.
  • the samples 1. and 2. correspond to positive controls, samples 3. and 4. correspond to negative samples, samples 5. to 7. correspond to sera of patients and sample 8. corresponds to a sample announced as negative.
  • Figure 10 shows a histogram showing the comparison of the evaluation results of 19 human sera (13 positive with active TB, samples 1 to 27, and 6 negative non-infected, Neg1 to Neg6 samples) between the benchtop version. (Black columns) of the laboratory and the "transportable" version of the prototype developed (gray columns)
  • Figure 11 shows a histogram showing the average of the signals obtained for the analysis of 20 samples tested in single blind (15 positive and 5 negative) on the optimized transportable prototype. Positive samples are # 1, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20. The negative samples are # 2, 6, 9, 13, 18.
  • Figure 12 shows a histogram showing the evaluation of the stability of coupling magnetic nanobeads-candidate diagnostic peptides over time, on negative (Neg6) or positive (Pos1) samples.
  • the histogram here represents the evaluation of two patient serum samples (a negative and a positive) with the same technique on magnetic nanobeads using the same peptide (M3) grafted at different time intervals on the nanobeads. Both will have been analyzed with the grafted peptide and tested on 24/11/2016 (right histogram for each of the two patients) compared with the same peptide grafted on 12/152017 and tested on 30/11/2017 and the 01/12/2016 (first two histograms for each of the two patients). There appears to be a decrease in the signal over time for this peptide which could be explained by instability of the peptides in solution or a lack of reproducibility of the grafting.
  • the diagnostic kit for active tuberculosis consists of a device comprising a cassette 1, comprising three windows 2; 3; 4 respectively for detecting the reactivity of a sample with a positive control, for detecting the reactivity of a sample with at least one peptide according to the invention, and for depositing a serum sample to be tested.
  • the cassette 1 covers a reservoir comprising, positioned under the window 4,
  • a sample support 5 allowing the macromolecular filtration of the deposited sample (blood, serum, human plasma) and allowing the control of the matrix (ionic strength, absorption rate, etc.),
  • a conjugation support 6 comprising detection antibodies directed against the antibodies that may be contained in the sample to be tested, and coupled to a tracer such as colloidal gold, latex or carbon.
  • a tracer such as colloidal gold, latex or carbon.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the reservoir further comprises, juxtaposed to the membrane 7, an absorbent support 8 whose function is to serve as a residual liquid reservoir and stabilization of the migration speed.
  • FIG. 2 shows the device of Figure 1 in use.
  • a biological sample in particular blood or serum
  • a biological sample is deposited on the sample support 5 via the window 4.
  • the content of the sample is progressively and at a constant speed, transferred to the conjugation support 6, where the antibodies of the biological sample are then capable of coupling with the detection antibodies.
  • the contents of the sample migrate from the conjugation support 6 to the membrane 7.
  • the antibodies directed against the peptide of The invention is immobilized by immunological reaction, the remainder of the sample continuing to migrate. The same is true for the control line.
  • the inventors From the recombinant proteins of the family of lipolytic enzymes, the inventors have screened epitopes in order to hierarchize in silico more than 800 peptides according to different characteristics: hydrophobicity, secondary structure, etc. This ranking allowed them to select the 200 candidates who gather the most promising characteristics to make the diagnosis of active tuberculosis. The immunogenicity of each of the 200 peptides was then evaluated in an ELISA assay for screening of these peptides. From the results obtained on pools of patients, the 30 best candidates were kept for the rest of the technical evaluations.
  • the peptides are fixed on a Maxisorp plate (high binding): Incubation overnight at 4 ° C, concentration of the protein in ⁇ g / ml of 20 to 50.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the spectrophotometer at 450 nm reads the amount of TMB converted by peroxidase (indicative of the formation of an immune complex between the peptides and the antibodies contained in the serum).
  • Figures 4 to 7 show histograms showing the ratio R (Index) of the different peptides tested.
  • Figure 8 shows the reactivity of the most promising peptides C2, C12 M3, V5 and G9 (respectively represented by the sequences SEQ ID NO: 1 to 5).
  • the inventors evaluated the immunogenicity of each of the peptides on several different pools of samples. Those with reactivity for all pools tested were selected as the best candidates.
  • the table below represents an example of 3 peptides tested with two different pools of positive samples.
  • Peptides for which a ration of 1, 5 was found were selected at screening and are among the best diagnostic candidates for active TB. Among the peptides tested, some have a ration> 1.5 for both patient pools (example D7), while others are positive for one of the two pools (example C4) or negative for both pools ( example B4). The screening of the peptides was then refined using samples of individual patients infected or not with active TB.
  • the inventors have developed a technology on magnetic nanobeads, making it possible to significantly improve the performance of the ELISA test, without washing and in just a few minutes. This strategy is relevant for the purpose of miniaturizing existing existing elements to provide a rapid laboratory diagnostic solution, as well as a future Point-of-Care test.
  • the nanobeads technology was developed on a benchtop version in the laboratory, which can not be relocated. This is the initial version of the test.
  • the first tests carried out with this version showed that by coupling the magnetic nanobeads with the best diagnostic candidate peptides of the invention, and using a strategy for detecting antibodies in the serum of patients, the inventors obtained results that were at least as good. that the results of ELISA but with a lesser amount of peptides and especially in less than 10 minutes (against about 2 hours for a conventional ELISA).
  • An example of the results for one of the best peptides is shown in Figure 9.

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Abstract

L'invention concerne une méthode de criblage in vitrode peptides immunogènes d'intérêt capables de reconnaître des anticorps issus du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ladite méthode comprenant : • - la mise en contact de peptides du sérum issu de patients atteints de tuberculose active • - la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et • - la sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5, le ratio R étant la valeur de mesure de la formation de complexe immun sur la valeur de mesure obtenu à partir de l'échantillon contrôle.

Description

Peptides immunogènes et leur utilisation
[1] La présente invention concerne des peptides immunogènes et leur utilisation, notamment dans le cadre du diagnostic de pathologies.
[2] Avec un tiers de la population mondiale infectée et un décès toutes les 20 secondes, la tuberculose (TB) reste une des maladies les plus meurtrières au monde. Aucun test de diagnostic rapide, précis et validé selon les attentes des autorités de santé, et notamment de l'Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) n'est commercialisé à ce jour, le test de référence nécessitant plusieurs semaines avant de donner un résultat.
[3] Aujourd'hui, les méthodes internationales de référence pour le diagnostic de la TB sont longues (jusqu'à 8 semaines pour la culture bactériologique), insuffisamment performantes, coûteuses et difficiles à mettre en œuvre car elles utilisent des prélèvements pulmonaires, nécessitent un laboratoire de niveau de sécurité 3 ainsi que l'hospitalisation du malade.
[4] Pour la première fois de son histoire, l'OMS a publié en 2011 une recommandation de politique générale explicitement négative contre l'utilisation de la première génération commercialisée de tests sérologiques pour le diagnostic de la TB (OMS 2011 , commercial sérodiagnostic tests for diagnosis of TB: policystatement).
[5] Plus d'un million de ces tests non validés cliniquement et avec de mauvaises performances étaient vendus chaque année dans le monde notamment dans les pays du Sud (Afrique, Asie) en profitant des faibles contraintes réglementaires locales. La quasi-totalité de ces tests utilisent les mêmes antigènes et ils n'ont jamais fait l'objet d'une validation clinique rigoureuse entraînant des performances très faibles avec un risque pour les patients.
[6] L'OMS ouvre ainsi la porte à une opportunité pour une nouvelle génération de tests satisfaisants à des critères stricts de qualité et de validation clinique.
[7] Au cours de l'infection latente, le bacille de la TB est contenu dans un macrophage qualifié de spumeux en raison de l'aspect microscopique de son cytoplasme saturé de vacuoles lipidiques. Mycobacteriumtuberculosis stocke les acides gras sous forme de triglycérides (TG) permettant l'entrée de la bactérie en phase de dormance (TB latente). Ces vacuoles lipidiques constituent une source de carbone pour la bactérie et sont utilisées par celle-ci pour la sortie de la dormance et sa réactivation (TB active). La réduction des niveaux de TG lors de la réactivation de la TB coïncide avec l'augmentation de l'activité de certaines protéines dégradant les TG. Certaines de ces protéines, jusqu'alors peu étudiées, semblent étroitement associées à la réactivation de la TB à partir des formes latentes et présentent donc un intérêt majeur pour l'identification précoce de la TB active ou pour le suivi des cas de TB latente à haut risque de développer la forme grave de la maladie.
[8] On connaît de l'état de la technique la demande de brevet WO/2012/164088 qui enseigne une méthode de diagnostic de la tuberculose active basé sur des ELISpot B utilisant des protéines lipases à activité lipolytique.
[9] Toutefois, une telle méthode, bien qu'efficace dans la cadre de la détection précoce de la tuberculose active ne peut être mise en œuvre qu'avec un matériel lourd dans un laboratoire équipé, nécessite des compétences techniques spécifiqueset ne peut donc être utilisée simplement sur le terrain auprès des populations à risque.
[10] Aussi, existe-t-il un besoin de fournir une méthode plus simple qui conserve un niveau de sensibilité de détection de la TB active au moins aussi bon que celui obtenu avec la méthode de la demande WO/2012/164088.
[1 1 ] Un des buts de l'invention est donc de fournir une méthode de diagnostic de la tuberculose active qui puisse être mise en œuvre facilement en toute situation, et en particulier en l'absence de d'infrastructures hospitalières fortement équipées.
[12] Un autre but de l'invention est de déterminer les meilleurs candidats peptidiques permettant de mettre en œuvre cette nouvelle méthode de diagnostic efficace et rapide.
[13] Aussi l'invention concerne une méthode de criblage in vitro d'au moins un peptide immunogène d'intérêt capable de reconnaître au moins un anticorps issu du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ledit au moins un peptide immunogène étant un peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi, ou sécrétées, de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
+ la mise en contact d'au moins un peptide hydrophile issu d'au moins une protéine hydrophobe avec
- successivement au moins deux pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, et
- au moins un échantillon contrôle issu d'un individu n'étant pas atteint de tuberculose,
+ ,la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente,
+ une première sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour au moins un des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée,
le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe immun, par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns.
[14] L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs selon laquelle certains peptides issus de protéines déterminées sont de très bons candidats pour mettre en œuvre une méthode de diagnostic de la tuberculose active, tout en proposant une sensibilité et une efficacité de détection de la pathologie à un niveau élevé.
[15] Le diagnostic proposé par l'invention peut être réalisée chez l'homme mais aussi chez les animaux.
[16] Ci-après, la tuberculose sera désignée de manière uniforme "la tuberculose» ou «TB».
[17] Dans l'invention, les termes "protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique" sont utilisés pour désigner une enzyme à activité lipolytique et comprennent, phospholipases A, B, C ou D, et les lipases, notamment de triglycérides lipases, des lipases ou des diglycérides, de monoglycérides lipases.
[18] Durant l'infection, Mycobacteriumtuberculosis accumule des corps d'inclusion intracellulaires chargés de lipides dont les lipides sont probablement issus de la dégradation de la membrane cellulaire de l'hôte. On dispose désormais de fortes évidences supportant le fait que les acides gras représentent une source de carbone durant la dormance. Mycobacteriumtuberculosis stocke des acides gras sous la forme de triacylglycérol (TAG) lors de son entrée dans le stade non réplicatif persistant (état latent). De plus, des granulomes contenant des macrophages spumeux qui sont des cellules contenant dans leur cytoplasme une grande quantité de lipides neutres entourés de phospholipides ont été trouvés. Ces corps lipidiques sont induits par l'internalisation de la bactérie et par conséquent fournissent une source de carbone pour la survie et la réactivation du pathogène. Plus généralement, ces découvertes supportent le fait que les enzymes impliquées dans la dégradation des lipides peuvent assumer des fonctions physiologiques importantes et peuvent participer à l'extraordinaire capacité de survie et à laréactivation de Mycobacteriumtuberculosis à partir des cellules infectées. La dégradation des lipides de l'hôte par Mycobacteriumtuberculosis est probablement réalisée par des enzymes lipolytiques, telles que les lipases et les phospholipases, comprenant la famille des enzymes cutinases.
[19] Les lipases sont des protéines solubles dans l'eau ayant une activité lipolytique appartenant au groupe des estérases et catalysant l'hydrolyse de substrats insolubles dans l'eau comme les liaisons ester du triacylglycérol et des phospholipides.
[20] Dans ce contexte, la réaction catalytique de lipolyse implique différents processus à l'interface et dépend étroitement de la structure des substrats lipidiques présents dans les émulsions huile dans, eau, les bicouches membranaires, les monocouches, les micelles et les vésicules. Le processus catalytique peut être décrit comme une étape réversible d'adsorption/désorption des lipases ayant lieu à l'interface huile/eau, suivie par la formation d'un complexe enzyme/substrat à l'interface et la libération des produits de lipolyse. Parmi les lipases de M. tuberculosis identifiées, 24 ont été classées dans la famille des enzymes appelée "famille Lip". Toutefois, cette classification est seulementbasée sur la présence de la séquence consensus GXSXG qui est caractéristique des estérases et des membres de la famille des hydrolases possédant des feuillets α/β.
[21 ] Dans l'invention, la méthode de détection de peptides immunogènes repose donc sur la mise à profit des propriétés des protéines à activité lipolytique (qui permettent de détecter la tuberculose active) tout en s'affranchissant de la difficulté de travailler avec des protéines entières, qui peuvent être difficiles à manipuler et/ou coûteuses et complexe à produire.
[22] En effet, il est particulièrement pertinent de trouver de petits fragments immunogènes desdites protéines à activité lipolytiques, puisque celles-ci sont des protéines membranaires (insérées dans la bicouche lipidique) et sont par conséquent hydrophobes, ou tout simplement car il s'agit de protéines dégradant les lipides, donc hydrophobes.
[23] Par « protéine hydrophobe », en entend dans l'invention une protéine qui est considérée, dans sa globalité comme présentant peu d'affinité pour les solutions aqueuses et qui sera peu à même de se dissoudre dans un liquide aqueux.
[24] Les protéines sont composés d'acides aminés qui peuvent être polaires (hydrophiles) ou hydrophobes. Lorsque la protéine est synthétisée, elle adopte une conformation tridimensionnelle spécifique liée à son activité ou sa fonction de sorte que les acides aminés éloignés les uns des autres dans la séquence peuvent se retrouver à proximité dans l'espace. Si au cours du repliement d'une protéine, l'ensemble des acides aminés polaires se retrouvent à l'intérieur d'une poche qui est entourée d'acides aminés hydrophobes, la protéine entière sera alors considérée comme hydrophobe, ceci même si la proportion d'acides aminés hydrophiles est plus importante que celle des acides aminés hydrophobes.
[25] De la même manière, une protéine sera considérée comme hydrophile, si sa conformation tridimensionnelle est telle que la majorité des acides aminés présents à la surface de la protéine sont hydrophiles.
[26] La notion d'hydrophilie et d'hydrophobicité d'une protéine sont bien connus de l'homme du métier. Il est d'ailleurs possible pour l'homme du métier, à partir de la séquence primaire d'une protéine de déterminer son profil hydrophilie/hydrophobicité en prédisant sa structure et son indice d'hydrophobicité.
[27] Dans l'invention on appelle « peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe » un fragment de ladite protéine hydrophobe, telle que définie ci-dessus, dont les propriétés sont d'être facilement soluble et stable dans un liquide aqueux, c'est-à-dire dans l'eau ou des solvants polaires.
[28] Pour prédire les peptides hydrophiles à cribler selon l'invention à partir de protéines hydrophobes, il est notamment possible de se baser sur la solubilité desdits peptides. Les séquences possédant de nombreux résidus basiques sans résidus acides intercalant (balance acide/basique) peuvent être difficiles à solubiliser. De ce fait, une balance est déterminée afin d'analyser la solubilité de chacune des séquences peptidiques qui seront susceptibles d'être immunogènes après criblage.
[29] Il est donc important de choisir les peptides dont la balance acide/basique Ba est la plus grande, selon la formule :
Bab = Aaa-Bbb
où
Aaa = (Na/N)x100 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés acides dans la séquence et N = le nombre d'acides aminés, et
Bbb = (N /N)x100 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés basiques dans la séquence et N = le nombre d'acides aminés.
[30] La solubilité peut aussi être prédite en comptabilisant le nombre de résidus chargés et en ajoutant les extrémités terminales libres du peptide. Théoriquement, au moins une charge tous les 5 résidus est requise pour obtenir une solubilité minimale. Il faut par ailleurs éviter un enchaînement de plus de 3 à 4 résidus hydrophobes. L'hydrophobicité à pH 6.8 permet de vérifier la solubilité du peptide dans un tampon aqueux. Cette valeur permet de vérifier la compatibilité avec les tampons de couplage lors de l'étape de conjugaison à la protéine porteuse.
[31 ] On notera que l'hydrophobicité à pH=6,8 correspond à la valeur de l'hydrophobicité de chacun des acides aminés à pH= 6,8 sur le nombre total d'acides aminés du peptide considéré.
[32] Il peut notamment être avantageux de vérifier, avant de tester leur immunogénicité que les peptides à cribler sont par exemple i) flexibles, c'est-à-dire non contraints spatialement, c'est à dire avec des épitopes libres d'accès pour les éventuels anticorps par rapport à la structure globale du peptide, ii) s'ils sont retrouvés dans des motifs protéiques conservés ou des structures secondaires (hélices, feuillets β) ce qui diminuerait leur spécificité, iii) s'ils sont retrouvés dans des régions exposées sur la protéine entière dont ils dérivent. L'homme du métier pourra également trouver d'autres caractéristiques appropriées qui pourraient compléter son choix de peptides potentiellement immunogènes.
[33] Une fois les peptides hydrophiles identifiés, leur immunogénicité est alors testée selon le procédé suivant :
1- chaque peptide est mis en contact avec au moins deux pools de sérums, les sérums étant issus de patients atteints de TB active confirmée cliniquement, et 2- en parallèle avec un échantillon contrôle issus d'un individu sain, qui n'est pas atteint de tuberculose, notamment active, c'est-à-dire un individu qui n'a jamais été en contact avec la tuberculose ou un patient qui est en phase latente de la tuberculose (et n'a donc pas développé de tuberculose active).
[34] L'objectif est de déterminer si les peptides testés sont capables de former des complexes immuns avec au moins un anticorps contenu dans lesdits pools de sérums d'individus atteints de TB active, ce qui signifie que les peptides sont potentiellement immunogènes.
[35] Les potentiels complexes immuns sont détectés selon des méthodes classiques qui consistent à marquer et identifier la présence d'un complexe immun en détectant la partie constante des anticorps qui ont potentiellement interagi avec les peptides à cribler au moyen d'immunoglobuline spécifiques des parties constantes des anticorps couplées à des marqueurs permettant une quantification.
[36] Une méthode de laboratoire classique de détection de ces complexes immuns consiste en un test ELISA (Enzyme-linkedlmmunoSorbentAssay). Cette méthode de détection peut aussi être adaptée sur différents supports solides pour faciliter l'identification des complexes immuns en dehors des laboratoires.
[37] Afin de déterminer lesquels des peptides sont intéressant, un ratio R est calculé, le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe immun, par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns.
[38] Cela signifie que la formule suivante est appliquée :
(Vp + e - V Blanc) - (Vs + e - V Blanc )
(Vp + n — V Blanc)— (Vs + n— V Blanc )
où:
- Vp+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum de patient atteint de TB active (e),
- Vs+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum de patient atteint de TB active (e),
- Vp+n correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain (n), - Vs correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun le solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain (n), et
- VBIanc correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun à en l'absence de sérum quel qu'il soit, de peptide et de solvant.
[39] Les valeurs sont dites normalisées, puisque pour chaque mesure, il est tenu compte du potentiel bruit de fond de chaque matériel biologique : le sérum (on compare les sérums positifs avec le sérum d'un individu sain), le peptide (on compare le peptide avec son solvant)...
[40] Quelle que doit la méthode utilisée pour obtenir le ratio R, si pour un peptide déterminé le ratio tel que calculé ci-dessus est supérieur ou égal à 1 ,5, le peptide sera considéré comme particulièrement intéressant et susceptible de détecter efficacement des anticorps marqueurs de la TB active. A contrario, si le ratio R est inférieur à 1 ,5 il ne sera pas retenu.
[41 ] Dans l'invention, comme cela a été mentionné ci-dessus, chaque peptide est mis en contact avec au moins deux pools de sérums. On utilise dans une première approche un pool ou mélange de plusieurs sérums issus de patients distincts chacun atteints d'une TB active cliniquement établie (résultats de culture microbiologique positive - test clinique de référence). Ces pools permettent de disposer d'un mélange de sérums et ainsi d'augmenter la diversité d'anticorps susceptibles d'être détectés.
[42] On utilise des pools indépendants, c'est-à-dire des mélanges de sérums qui n'ont pas les mêmes origines. Par exemple, si un premier pool comprend 4 sérums venant de 4 individus différents, un second pool indépendant comportera plusieurs sérums dont aucun ne sera en commun avec l'un au moins des sérums du premier pool.
[43] Avantageusement, comme il est mentionné plus haut, les complexes immuns entre le peptide et les anticorps contenus dans les pools sont quantifiés par immunodétection en utilisant des immunoglobulines couplées à un agent de détection.
Il est par exemple possible, selon le marqueur utilisé de mesurer la densité optique DO.
Selon le marqueur utilisé, l'homme du métier saura déterminer la meilleure méthode de quantification des complexes immuns.
[44] Dans l'invention, les peptides préférés sont ceux qui ont un ratio R supérieur à
1 ,5 pour la totalité des pools des au moins deux pools de sérums. Bien évidemment, seront également intéressants les peptides qui ont un ratio R supérieur ou égal à 1 ,5 pour un pool des au moins deux pools de sérum. Par contre, ne seront pas sélectionnés les peptides pour lesquels les ratios R, quel que soit le pool considéré des au moins deux pools de sérum, sont inférieurs à 1 ,5.
[45] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de criblage susmentionnée, comprenant en outre les étapes suivantes :
- la mise en contact des peptides sélectionnés à la première étape de sélection avec chacun des sérum individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler,
- la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et
- une seconde sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur du ratio R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour avec chacun des sérums individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.
[46] Avantageusement, une fois qu'un peptide a été identifié selon le procédé susmentionné, il est également avantageux de procéder à un second test de réactivité avec individuellement chacun des sérums composant les au moins deux pools. Un tel double criblage confirme la sélection, et permet d'éliminer éventuellement des peptides sélectionnés qui ne reconnaîtraient que des anticorps surreprésentés dans l'un des sérums des pools.
[47] Tout comme lors du premier criblage, on mesure le ratio R selon la formule susmentionnée, et les peptides pour lesquels le ratio R est supérieur ou égal à 1 ,5 sont retenus comme étant des peptides les plus performants, c'est-à-dire les peptides qui ont une bonne affinité pour des anticorps spécifiques de la tuberculose active (TB active).
[48] Avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans laquelle lors de la première sélection, seuls sont sélectionnés les peptides pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour au moins deux des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.
[49] Il est bien évidemment particulièrement intéressant et avantageux de sélectionner les peptides pour lesquels, lors du premier criblage en pool, le ratio R est supérieur ou égal à 1 ,5, pour chacun desdits au moins deux pools, et pour lesquels le ratio R pour chacun desdits sérums composant lesdits au moins deux pools supérieur ou égal à 1 ,5.
[50] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les peptides hydrophiles sont identifiés par bioinformatique, sur la base de leur hydrophilie apparente.
[51] Comme il a été discuté ci-dessus, différents critères peuvent être utilisés pour déterminer les peptides hydrophiles potentiels qui doivent être testés pour déterminer leur immunogénicité selon le procédé de l'invention. Cette sélection de peptide peut être réalisée par informatique en estimant différents critères pertinents pour l'homme du métier, tels que l'hydropathie, la stabilité, la solubilité, la structure secondaire, l'accessibilité du peptide dans la protéine entière, la flexibilité... L'homme du métier saura choisir le ou les critères les plus pertinents pour déterminer si le peptide est considéré comme hydrophile au sens de l'invention et s'il doit être criblé selon le procédé susmentionné.
[52] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle les peptides hydrophiles ont une taille de 15 à 25 acides aminés.
[53] Les peptides qui a cribler dans l'invention sont des peptides de taille moyenne présentant une talle de 15 à 25 acides aminés, c'est-à-dire ayant 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, ou 25 acides aminés naturels.
[54] Ces peptides peuvent également être modifiés sur un ou plusieurs résidus d'acides aminés, par exemple en protégeant certains résidus tels que les résidus cystéine II est possible d'ajouter sur ces peptides d'autres groupes chimiques en N- terminal ou C-terminal facilitant leur manipulation et leur utilisation dans un test rapide (greffage au support, présentationépitopique, conformation, etc). Ces groupes peuvent être par exemple la Biotine, protéine « carrier » soluble type BSA, thiol ou NH2 à condition que celle-ci soit absente de la séquence peptidique d'intérêt.
[55] Avantageusement, l'invention concerne la méthode décrite précédemment dans laquelle les complexes immuns sont détectés par immunodétection à l'aide d'anticorps marqués dirigés contre la partie constante des immunoglobulines.
[56] L'invention concerne également au moins un peptide hydrophile, destiné à détecter la tuberculose active dans un échantillon sanguin de patient, susceptible d'être obtenu ou criblé par la méthode telle que définie ci-dessus.
[57] En outre, l'invention concerne un peptide susceptible d'être criblé par la méthode susmentionnée, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.
[58] L'invention concerne en outre au moins un peptide hydrophile, comprenant de 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique.
[59] L'invention concerne aussi un peptide un peptide hydrophile, comprenant de 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu
[60] Comme cela a été évoqué précédemment, les peptides criblés par la méthode susmentionnée sont particulièrement avantageux pour mettre en œuvre une méthode de diagnostic de la tuberculose active chez des individus. En effet, puisque ces peptides sont sélectionnés sur leur capacité de détecter des anticorps présents spécifiquement dans le sérum de patients atteints de la tuberculose active, ils seront particulièrement efficaces pour déterminer le statut sérologique d'un individu vis-à-vis de la tuberculose.
[61] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un peptide hydrophile, tel que défini ci-dessus, ledit peptide étant représenté par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30.
[62] Par peptides de séquence SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30 on entend dans l'invention les peptides de séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19 , SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.
[63] Les peptides les plus avantageux de l'invention sont les peptides de séquence : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5, qui ont des ratios R très supérieurs à 1 ,5 pour quatre pools indépendants de sérums.
[64] Les peptides SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 19 sont également intéressants dans la mesure où les ratios R sont supérieurs à 1 ,5 pour 3 sur 4 sérums testés.
[65] L'invention concerne aussi avantageusement une composition comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19 , SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, pour son utilization dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.
[66] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.
[67] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son utilization susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19.
[68] L'invention concerne par ailleurs une méthode de diagnostic in vitro chez un individu susceptible d'être atteint de la tuberculose active, ladite méthode comprenant :
- une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin dudit individu avec au moins un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et
- une étape de détection d'un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et lesdits peptides.
[69] Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de diagnostic de la tuberculose active chez un individu comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin, notamment du sérum, dudit individu avec au moins un peptide choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, et
une étape de détection d'au moins un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et ledit au moins un peptide.
[70] L'invention concerne en outre un kit de diagnostic de la tuberculose active, comprenant :
- au moins un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et
- des moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu et ledit au moins un peptide. [71] Dans le kit de l'invention, le dit au moins un peptide est notamment un peptide choisi parmi les peptides des séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.
[72] Par moyens de détection de complexes immuns, on peut prévoir des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la partie constante des anticorps, en particulier des anticorps humains, lesdites immunoglobulines pouvant être notamment couplés avec des fluorochromes, avec des enzymes, ... L'homme du métier sait quels types d'immunoglobulines marquées sont appropriés pour réaliser un tel kit et permettre la détection de complexes immuns.
[73] Avantageusement, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus, comprenant moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu sont disposés sur un support de type chromatographique. D'autres formats tels que les billes magnétiques ou les « electricsensors » sont également utilisables.
[74] Dans un aspect avantageux de l'invention, il est prévu un kit de détection de la tuberculose active sous la forme d'un kit portable, utilisable dans toutes les situations et dans toutes les situations, en déposant une goutte de sang. Un tel kit est un kit de détection rapide, en seulement quelques minutes. Un exemple d'un tel kit portable est illustré à la figure 1.
[75] Avantageusement, l'invention concerne le kit susmentionné, comprenant en outre au moins un contrôle positif. Qu'il s'agisse d'un kit à utiliser dans un laboratoire, et surtout d'un kit portable, il est particulièrement pertinent de disposer d'un contrôle positif, c'est-à-dire d'un sérum issu d'un ou plusieurs patients dont la tuberculose active est ou a été confirmée cliniquement.
[76] La possibilité de diagnostiquer la TB active de manière simple, fiable et rapide à partir de sang veineux ou capillaire est un succès médical et économique au moins identique à celui des tests rapides pour la détection d'autres infections (VI H par exemple). Même si la spécificité du test n'est pas optimale, une bonne valeur prédictive négative permet à un test de ce type un très large usage en première ligne pour le dépistage de la maladie et l'orientation vers un test de confirmation. Le développement d'un test rapide pour le dépistage ou le diagnostic de la TB active contribue très significativement à la réalisation des objectifs fixés par l'OMS pour l'éradication de la tuberculose.
[77] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le kit susmentionné, dans lequel ledit au moins un peptide hydrophile est couplé à des nanobilles magnétiques.
[78] Le couplage des peptides de l'invention à des nanobilles magnétiques permet d'obtenir des résultats similaires à un test immunologique ELISA classique, avec une quantité moindre de peptides et surtout en moins de 10 minutes (contre environ 2 h pour un ELISA classique). L'avantage d'un tel couplage est qu'il limite les temps de lavages nécessaires pour éliminer les interactions non spécifiques, car les complexes immuns sont isolés par magnétismes grâces aux billes sur lesquels ils se sont formés.
[79] L'invention concerne en outre un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, notamment un peptide consistant essentiellement en ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1 à 30, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.
[80] Comme mentionné ci-dessus, les peptides spécifiques de l'invention sont très appropriés pour détecter des anticorps dirigés contre des peptides de Mycobactrium tuberculosis, et donc pour permettre de poser un diagnostic de tuberculose active chez un individu.
[81] L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples suivants :
[82] Légende des figures
[83] La figure 1 représente un exemple de kit portable selon l'invention
[84] La figure 2 représente un schéma représentatif du mode de réalisation de la figure 1.
[85] La figure 3 est une représentation schématique du résultat visuel obtenu lors d'un diagnostic positif de la tuberculose active (++) ou lors d'un diagnostic négatif (-). T désigne le marquage significatif de la positivité de l'échantillon, et T+ indique le témoin positif de la réaction. La flèche indique le sens de migration.
[86] Les figures 4 à 7 montrent des histogrammes de la réactivité des peptides testés sous la forme d'index (ratio R selon l'invention).
[87] La figure 8 montre un histogramme la réactivité des peptides C2, C12, M3, V5 et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 5) sous forme d'index (ratio R selon l'invention). Les barres représentent les 4 pools testés pour chacun des peptides
[88] La figure 9 représente un histogramme montrant la comparaison des résultats obtenus entre la technique ELISA classique (colonnes en gris foncé) et la technologie nanobilles (colonne en gris clair), en utilisant le peptide SEQ ID NO : 3. Les échantillons 1 . et 2. correspondent à des contrôles positifs, les échantillons 3. et 4. correspondent à des échantillons négatifs, les échantillons 5. à 7. correspondent à des sera de patients et l'échantillon 8. correspond à un échantillon annoncé comme négatif.
[89] La figure 10 représente un histogramme montrant la comparaison des résultats d'évaluation de 19 sera humains (13 positifs avec une TB active, échantillons 1 à 27, et 6 négatifs non infectés, échantillons Neg1 à Neg6) entre la version « paillasse » (colonnes noires) du laboratoire et la version « transportable » du prototype mis au point (colonnes grises)
[90] La figure 11 représente un histogramme montrant la moyenne des signaux obtenus pour l'analyse de 20 échantillons testés en simple aveugle (15 positifs et 5 négatifs) sur le prototype transportable optimisé. Les échantillons positifs sont les n°1 , 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11 , 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20. Les échantillons négatifs sont les n°2, 6, 9, 13, 18.
[91 ] La figure 12 représente un histogramme montrant l'évaluation de la stabilité du couplage nanobilles magnétiques-peptides candidats diagnostic au cours du temps, sur des échantillons négatifs (Neg6) ou positifs (Pos1 ). L'histogramme représente ici l'évaluation de deux échantillons de sérum de patient (un négatif et un positif) avec la même technique sur nanobilles magnétiques en utilisant le même peptide (M3) greffé à différents intervalles de temps sur les nanobilles. Les deux sera ont été analysés avec le peptide greffé et testé le 24/11/2016 (histogramme de droite pour chacun des deux patients) comparativement avec le même peptide greffé le 12/09/2017 et testé le 30/11/2016 et le 01/12/2016 (deux premiers histogrammes pour chacun des deux patients). Il apparaît une diminution du signal au cours du temps pour ce peptide qui pourrait être expliquée par une instabilité des peptides en solution ou un manque de reproductibilité du greffage.
[92] Si l'on se réfère à la figure 1 , le kit de diagnostic de la tuberculose active selon l'invention est constitué d'un dispositif comprenant une cassette 1 , comprenant trois fenêtres 2 ; 3 ; 4 permettant respectivement de détecter la réactivité d'un échantillon avec un contrôle positif, de détecter la réactivité d'un échantillon avec au moins un peptide selon l'invention, et de déposer un échantillon de sérum à tester. La cassette 1 recouvre un réservoir comprenant, positionné sous la fenêtre 4,
- un support d'échantillon 5 permettant la filtration macromoléculaire de l'échantillon déposé (sang, sérum, plasma humain) et permettant le contrôle de la matrice (force ionique, vitesse d'absorption...),
- un support de conjugaison 6 comprenant des anticorps de détection dirigé contre les anticorps susceptibles d'être contenus dans l'échantillon a tester, et couplé à un traceur tel que de l'or colloïdal, du latex, du carbone. [93] Positionné sous les fenêtres 3 et 2 se trouve positionné une membrane 7 de nitrocellulose, de nylon, ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF) sur la quelle est fixée, sous la forme d'une ligne, au moins un peptide selon l'invention (sous la fenêtre 3) et une ligne d'albumine bovine biotinylée (sous la fenêtre 2).
[94] Le réservoir comprend en outre, juxtaposé à la membrane 7, un support absorbant 8 dont la fonction est de servir de réservoir de liquide résiduel et stabilisation de la vitesse de migration.
[95] La figure 2 représente le dispositif de la figure 1 en utilisation. Dans un premier temps, un échantillon biologique (notamment du sang ou du sérum) est déposé sur le support d'échantillon 5 via la fenêtre 4. Sous l'effet de la capillarité générée par un support absorbant 8 et un tampon de migration spécifique facilitant la capillarité, le contenu de l'échantillon est progressivement et a vitesse constante, transféré vers le support de conjugaison 6, où les anticorps de l'échantillon biologique sont alors capables de se coupler avec les anticorps de détection.
[96] Toujours sous l'effet de la capillarité, le contenu de l'échantillon migre du support de conjugaison 6 vers la membrane 7. Lors de leur passage sur la ligne de peptide selon l'invention, les anticorps dirigés contre le peptide de l'invention sont immobilisés par réaction immunologique, le reste de l'échantillon continuant de migrer. Il en est de même pour la ligne de contrôle.
[97] Comme l'indique la figure 3, lorsque l'échantillon à tester comprend des anticorps dirigés contre les peptides de l'invention qui ont été déposés sur le membrane 7, ceux-ci sont immobilisés et s'accumulent, et grâce au couplage avec des anticorps marqués, il est possible de voir apparaître une ligne indicatrice de la réactivité, au niveau de la zone de test T.
[98] Exemples
[99] Exemple 1 - identification des peptides à cribler
[100] A partir des 25 protéines recombinantes de la famille des enzymes lipolytiques, les inventeurs ont réalisé un criblage d'épitopes afin de hiérarchiser in silico plus de 800 peptides en fonction de différentes caractéristiques : hydrophobicité, structure secondaire, etc. Ce classement leur a permis de sélectionner les 200 candidats qui rassemblent les caractéristiques les plus prometteuses pour faire du diagnostic de la tuberculose active. L'immunogénicité de chacun des 200 peptides a ensuite été évaluée dans un test ELISA pour faire le criblage de ces peptides. A partir des résultats obtenus sur des pools de patients, les 30 meilleurs candidats ont été conservés pour la suite des évaluations techniques.
[101 ] A l'aide d'un algorithme informatique et à partir des séquences génétiques fournies, les principales caractéristiques des protéines candidates diagnostiques ont été identifiées et un classement des meilleurs peptides potentiels a été établi. Au total, les inventeurs ont obtenu une liste de 833 peptides chevauchants de 15 acides aminés classés en 4 groupes (1 , 2, 3 et « bad ») en fonction de leur immunogénicité théorique in silico (avec 1 le meilleur et « bad » le plus mauvais). Les informations concernant les 200 peptides testés sont indiquées dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1 : Liste des 200 peptides testés
[102] Afin de déterminer l'immunogénicité des peptides, ceux-ci sont testés par le test ELISA suivant :
[103] Les peptides sont fixés sur une plaque Maxisorp (high binding): Incubation toute la nuit à 4°C, concentration de la protéine en μg/ml de 20 à 50.
[104] Les puits sont rincés avec 300μΙ_ de tampon phosphate salin (PBS)
[105] Les « puits » sont bloqués pendant 2h à température ambiante (19°C-25°C)avec 200μί d'albumine sérique bovine (BSA) 2% et 0.01 % de Tween 20
[106] Les puits sont rincés avec 300μί de PBS
[107] Ondépose 100μί de sérums de patients atteints de TA active dilués au 1/100ième en solution de blocage et on incube 1 h à 37°C
[108] Faire 3 lavages (300μί) PBS-Tween 20 (0,05%)
[109] On ajoute 100μί d'anticorps conjugué à la peroxydase, dilué au 1/20 000 en solution de blocage et on incube 1 h à 37°C
[1 10] Faire 3 lavages (300μί) PBS-Tween 20 (0.05%)
[1 1 1 ] On ajoute 100μΙ_ de substrat 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) et incube 20min à l'obscurité
[1 12] On déposer 50μΙ_ d'acide sulfurique à 1 N
[1 13] On lit au spectrophotomètre à 450 nm la quantité de TMB convertie par la peroxydase (indicatif de la formation d'un complexe immun entre les peptides et les anticorps contenus dans le sérum).
[1 14] Les figures 4 à 7 représentent des histogrammes montrant le ratio R (Index) des différents peptides testés.
[1 15] La figure 8 montre la réactivité des peptides les plus prometteurs C2, C12 M3, V5 et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 5).
[1 16] Exemple 2 - réactivité des 4 peptides sur des échantillons de patients individuels différents des pools utilisés pour le criblage
[1 17] Afin de confirmer que les peptides sectionnés sont bien capables de diagnostiquer la tuberculose active, les inventeurs ont testé la réactivité de 4 peptides (M3 : SEQ ID NO : 3 ; C12 : SEQ ID NO : 2 ; C2 : SEQ ID NO : 1 et 07 : SEQ ID NO : 6).
[1 18] Le tableau suivant montre les résultats obtenus avec le sérum de 16 patients Patient M3 C12 C2 07
#1 +++ +++ +++ +++
#2 +++ +++ + +/-
#3 +++ +/- +/- +/-
#4 +++ +++ +/- +
#5 +++ + + +/-
#6 +++ + +/- +++
#7 +++ +++ +/- +/-
#8 +++ +/- +++ +++
#9 +++ +++ +/- -
#10 +++ +++ +++ +++
#11 + +/- +/- -
#12 + +/- +/- +/-
#13 + + +/- -
#14 +/- + + +
#15 +/- - +/- -
#16 - +++ - -
[1 19] +++ : très Ortement positif ; + : positif ; +/- : valeur positive limite ; - : négatif.
[120] Les résultats montrent que parmi les 5 meilleurs candidats identifiés, 3 (M3, C2, C12) détectent la grande majorité des individus atteints de TB active testés (soit 94%), confirmant les résultats obtenus avec les pools de patients. En revanche les performances diagnostiques de 07 sont plus faibles avec moins de 70% de sensibilité pour l'identification des cas de TB active sur ces patients testés.
[121 ] Exemple 3 - Comparaison de la réactivité des peptides selon le nombre de pools d'échantillons utilisés
[122] Dans le but d'évaluer la réactivité des peptides et de sélectionner les plus prometteurs pour le test de diagnostic de la Tuberculose active, les inventeurs ont évalué l'immunogénicité de chacun des peptides sur plusieurs pools différents d'échantillons. Ceux avec une réactivité pour tous les pools testés ont été sélectionnés comme les meilleurs candidats. Le tableau ci-dessous représente un exemple de 3 peptides testés avec deux pools différents d'échantillons positifs.
[123] Les peptides pour lesquels un ration de 1 ,5 a été retrouvé ont été sélectionnés à l'issue du screening et font partie des meilleurs candidats diagnostiques pour la TB active. Parmi l'ensemble des peptides testés, certains ont un ration > 1 ,5 pour les deux pools de patients (exemple D7) alors que d'autres sont positifs pour un des deux pools (exemple C4) ou sont négatifs pour les deux pools (exemple B4). Le screening des peptides a été affiné ensuite en utilisant des échantillons de patients individuels infectés ou non par la TB active.
[124] Exemple 3 - méthode alternative de détection de la tuberculose
[125] A la suite de la preuve de concept en ELISA faite par les inventeurs, des tests latéral flow ont été mis au point en intégrant les meilleurs peptides candidats diagnostic pour la Tuberculose, décrits dans l'invention. Ces résultats n'ont pas été suffisamment bons pour répondre aux attentes du cahier des charges et du targeted product profile de l'OMS. Les inventeurs ont donc préféré mettre de côté cette stratégie latéral flow pour chercher une alternative plus performante.
[126] Les inventeurs ont développé une technologie sur nanobilles magnétiques, permettant d'améliorer significativement les performances du test ELISA, sans lavages et en quelques minutes seulement. Cette stratégie est pertinente dans l'optique de miniaturiser les éléments existants actuels pour proposer une solution de diagnostic rapide de laboratoire, ainsi qu'un futur test Point-of-Care. La technologie nanobilles a été développée sur une version de paillasse au laboratoire, non délocalisable. Il s'agit de la version initiale du test. Les premiers tests réalisés avec cette version montraient qu'en couplant les nanobilles magnétiques avec les meilleurs peptides candidats diagnostiques de l'invention, et en utilisant une stratégie de détection des anticorps dans le sérum de patients, les inventeurs obtenaient des résultats au moins aussi bons que les résultats d'ELISA mais avec une quantité moindre de peptides et surtout en moins de 10 minutes (contre environ 2 h pour un ELISA classique). Un exemple des résultats pour un des 5 meilleurs peptides est illustré en figure 9.
[127] Les inventeurs ont donc poussé les expérimentations et après des tests d'optimisation (dilution des sera, test en combinaison de peptides, choix de l'anticorps de détection, contrôle du bruit de fond, etc) les inventeurs ont identifié le meilleur peptide à utiliser parmi les 5 meilleurs candidats. En parallèle, un prototype transportable a été développé et les inventeurs ont testé 19 échantillons (13 patients avec une TB active et 6 négatifs pour la maladie). Les résultats de la figure 10 montrent que ce prototype transportable permet d'obtenir des résultats au moins aussi bons que ceux obtenus avec le système de paillasse précédemment mis au point par les inventeurs, permettant ainsi de discriminer clairement les patients positifs des patients négatifs.
[128] Enfin les derniers tests réalisés sur 20 autres échantillons ont évalué en simple aveugle la capacité du prototype transportable à discriminer les patients avec une TB active de ceux non infectés (figure 11 ) confirmant les performances du test intégrant la combinaison de peptides candidats diagnostiques avec la technologie sur nanobilles dans sa version transportable.
[129] Des tests de reproductibilité ont aussi été réalisés et ne montrent pas de variation. La stabilité du couplage nanobille-peptide peut être améliorée car une diminution progressive dans le temps du signal du test a été observée (figure 12).
[130] Le prototype transportable montre donc des résultats très encourageants. [131 ] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de criblage in vitro d'au moins un peptide immunogène d'intérêt capable de reconnaître au moins un anticorps issu du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ledit au moins un peptide immunogène étant un peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi, ou sécrétées de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique,
ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
- la mise en contact d'au moins un peptidehydrophile issud'au moins une protéine hydrophobe avec
successivement au moins deux pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, et
au moins un échantillon contrôle issu d'un individu n'étant pas atteint de tuberculose,
- ladétection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, - une première sélection des peptides d'intérêtpour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour au moins un des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée,
le ratio R étant la valeur normalisée (de mesure de la formation de complexe immun surla valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain.
2. Méthode de criblage selon la revendication 1 , comprenant en outre les étapes suivantes :
- la mise en contact des peptides sélectionnés à la première étape de sélection avec chacun des sérum individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler,
- la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et
- une seconde sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur du ratio
R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour avec chacun des sérums individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.
Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle lors de la première sélection, seuls sont sélectionnés les peptides pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1 ,5 pour au moins deux des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.
Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle les peptides hydrophiles ont une taille de 15 à 25 acides aminés.
Peptide hydrophile, comprenant, ou consistant en 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi ou sécrétée de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique,
Peptide hydrophile, selon la revendication 6, ledit peptide étant représenté par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ IS NO : 1 à SEQ ID NO 30, notamment par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ IS NO : 1 à SEQ ID NO :5.
Méthode de diagnostic in vitro chez un individu susceptible d'être atteint de la tuberculose active, ladite méthode comprenant :
- une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin dudit individu avec au moins un peptide hydrophile tel que défini dans l'une quelconque des revendications 5 ou 6, et
- une étape de détection d'un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et lesdits peptides.
8. Kit de diagnostic de la tuberculose active, comprenant :
- au moins un peptide hydrophile tel que défini dans l'une quelconque des revendications 5 ou 6, et
- des moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu et ledit au moins un peptide.
9. Kit de diagnostic selon la revendication 8, comprenant moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu sont disposés sur un support de type chromatographique.
10. Kit de diagnostic selon la revendication 8, dans lequel ledit au moins un peptide hydrophile est couplé à des nanobilles magnétiques.
11. Pept.ide hydrophile, tel que défini à la revendication 5 ou 6, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.
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