FR2852393A1

FR2852393A1 - Methode de detection et d'analyse d'organelle immobilises sur biopuce et leurs applications

Info

Publication number: FR2852393A1
Application number: FR0303195A
Authority: FR
Inventors: Christian Leveque; Raymond Miquelis; Michael Seagar; Geraldine Ferracci
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de la Mediterranee; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de la Mediterranee
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2004-09-17
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: WO2004083370A2; WO2004083370A3; EP1604206A2; FR2852393B1

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et d'analyse d'organelles, notamment de vésicules synaptiques, immobilisés sur des biopuces. L'invention vise également une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle. Les applications de la présente invention concernent en particulier la détection de neurotoxines, comme les toxines botuliques ou la toxine tétanique, la caractérisation fonctionnelle d'organelles, la détection de marqueurs tumoraux, ou le criblage de nouvelles molécules interagissant avec des constituants membranaires spécifiques d'organelles.

Description

METHODE DE DETECTION ET D'ANALYSE D'ORGANELLES
IMMOBILISES SUR BIOPUCE ET LEURS APPLICATIONS La présente invention se rapporte à une méthode de détection et d'analyse d'organelles, notamment de vésicules synaptiques, immobilisés sur des biopuces. L'invention vise également une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle. Les applications de la présente invention concernent en particulier la détection de neurotoxines, comme les toxines botuliques ou la toxine tétanique, la caractérisation fonctionnelle d'organelles, la détection de marqueurs tumoraux ou le criblage de nouvelles molécules interagissant avec des constituants membranaires spécifiques d'organelles.

La présente invention concerne en particulier les domaines du diagnostic médical, de la pharmacologie et de la toxicologie.

La cellule .eucaryote contient différentes structures délimitées par une membrane formant des compartiments intracellulaires, appelées organelles.

Ces organelles peuvent soit rester localisés dans les cellules, soit, pour des raisons physiologiques ou physiopathologiques, être sécrétés ou libérés dans les milieux extracellulaires. A titre d'exemples d'organelles, on peut citer les mitochondries, les chloroplastes, les vésicules ou les granules de sécrétion, les lysosomes, les peroxisomes, les exosomes, les dexosomes, ou encore les vésicules synaptiques.

Les caractéristiques structurales et la composition des organelles dépendent fortement, de leur fonction dans la cellule, mais aussi des types cellulaires dans lesquels ils se trouvent et de l'état physiologique de la cellule. Le dosage ou l'analyse des caractéristiques structurales et fonctionnelles d'organelles déterminés issus de cellules en culture ou de cellules prélevées d'un organisme biologique est un moyen d'obtenir des informations sur ces

cellules et dans certains cas d'identifier des états physiologiques ou pathologiques de ces cellules.

Un exemple d'organelle dont les caractéristiques structurales sont dépendantes du type cellulaire analysé et de l'état physiologique de la cellule est la vésicule synaptique. Les vésicules synaptiques sont des organelles présents en grande quantité dans les terminaisons nerveuses des neurones.

Des vésicules apparentées, connues sous le terme SLMV (synaptic like microvesicle), se trouvent en moindre quantité dans des tissus endocrines et neuroendocrines et dans certains types de tumeurs. Dans le système nerveux, ces vésicules synaptiques véhiculent les neuromédiateurs et peuvent être considérées comme de véritables unités fonctionnelles de la communication. Elles sont d'une taille d'environ 50 nm et présentent à leur surface entre 20 et 40 protéines, dont certaines sont spécifiques de ces organelles (Fernandez-Chacon and Sudhôf, 1999). Ces protéines spécifiques, comme par exemple la synaptophysine ou la VAMP, constituent des marqueurs de choix pour identifier des neurones différenciés au sein d'un tissu, et sont étudiées dans des domaines aussi variés que la dégénérescence/régénération neuronale, la plasticité synaptique ou la cancérologie. Certaines de ces protéines sont par ailleurs les cibles des neurotoxines, et notamment des toxines botuliques et tétanique.

Le dosage et l'analyse des vésicules synaptiques est réalisé actuellement par des méthodes conventionnelles en immunopathologie (immunohistochimie, hybridation in situ, ...) ou en biochimie (Western Blot après séparation sur gel d'électrophorèse des protéines de l'extrait cellulaire, ou bien après purification des organelles par immunocapture). Un exemple de méthode d'analyse de vésicules synaptiques par Western Blot après purification est par exemple décrit par Lévêque et al., 2000 ou encore Quetglas et al. 2000. Le résultat de telles analyses n'est en général obtenu qu'au-delà de 24 heures et nécessite l'utilisation de plusieurs types d'appareillages non adaptés pour des applications de dosage en routine.

La présente invention fournit une méthode permettant de purifier, détecter et analyser sur une biopuce, en une seule étape, des organelles tels que des vésicules synaptiques extraites de cellules neuronales.

Les biopuces sont des outils qui permettent une analyse chimique ou biochimique de molécules préalablement immobilisées. Lorsqu'elles sont couplées à un capteur détectant des variations de masse ou de conformation moléculaire à leur surface, elles permettent l'analyse d'interactions entre les molécules immobilisées et des ligands pharmacologiques, naturels ou synthétiques. Diverses méthodes susceptibles de détecter la masse ou la conformation moléculaire d'un analyte s'immobilisant sur une biopuce sont connues et incluent des méthodes piezoélectriques, optiques, thermooptiques, d'ondes acoustiques de surface (surface acoustic wave SAW), ainsi que des méthodes électrochimiques (voltamétriques, conductométriques, potentiométriques, ampérométriques, ...). Parmi les méthodes de détection optique, on peut retenir, sans être exhaustif, celles qui détectent des variations de masse ou de conformation moléculaire à la surface de biopuces telles les méthodes de réflexion optique comme l'ellipsométrie ou la spectroscopie des ondes évanescentes. Cette dernière méthode inclut les méthodes fondées sur la résonance plasmonique de surface, encore appelées méthodes SPR. Les méthodes de spectroscopie des ondes évanescentes ont donné lieu à plusieurs types de biocapteurs commercialisés, dont ceux fondés sur l'utilisation de la résonance plasmonique de surface et produits par différentes sociétés dont BIACORE AB (comme les biocapteurs Biacore X, Biacore 3000), Texas Instruments (comme le biocapteur Spreeta), Windsor Scientific IBIS,ou Quantec DP, et ceux fondés sur la réflexion d'angle frusté (frustrated angle reffection, FTR) et produit par la société IASYS. Ces techniques sont décrites en détail dans l'état de la technique (Biotechniques, 1991, 11 : 620-627 ; Methods, 2000, 22 : 77-91 ; Nature Biotechnology, 2002, 20 : 225-229).

Dans le texte qui suit, sauf précisions spécifiques, par le terme biopuces pour biocapteurs par réflexion optique , on entend une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.

A ce jour, le développement des biopuces pour biocapteurs par réflexion optique concernait essentiellement l'analyse de molécules simples comme l'ADN, les protéines, voire des lipides ou des structures lipidiques comme des liposomes.

En particulier, à la connaissance de la demanderesse, le développement de biopuces pour biocapteurs par réflexion optique, contenant des organelles immobilisés à leur surface, n'a jamais été décrit.

L'invention résulte en particulier de la constatation qu'il est possible d'immobiliser de manière stable et spécifique des organelles sur des biopuces pour biocapteurs par réflexion optique et d'obtenir une quantification extrêmement sensible de ces organelles immobilisés, à l'aide d'une méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.

Au sens de l'invention, le terme organelle signifie dans le texte qui suit, sauf précision spécifique, une structure intracellulaire d'une cellule eucaryote, délimitée par une membrane.

De préférence, il s'agit d'organelles d'une taille inférieure à 360 nm.

Les organelles peuvent être sous la forme native ou le cas échéant reconstitués. On entend par organelle reconstitué toute structure protéolipidique contenant l'un quelconque ou plusieurs des constituants de ces organelles et préparés par des méthodes physico-chimiques ou à partir de cellules les exprimant, provenant de la sonication d'une cellule exprimant à sa surface une protéine recombinante d'un organelle natif.

Par dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique , sauf précision spécifique, on entend au sens de l'invention tout dispositif permettant de détecter des variations de masse ou de conformation moléculaire à la surface d'une biopuce appropriée, fondé sur les méthodes de réflexion optique, interne ou externe, et notamment l'ellipsométrie ou la spectroscopie des ondes évanescentes.

Un premier aspect de l'invention concerne donc une méthode d'identification ou de dosage d'organelles dans un échantillon liquide, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire des organelles à identifier ou à doser, b) l'injection de l'échantillon liquide dans un dispositif permettant la mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, c) la détection d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce par réflexion optique, ladite détection permettant l'identification et/ou le dosage des organelles liés à la surface de la biopuce.

Au sens de l'invention, le terme identification signifie que la méthode permet au moins de déterminer si l'échantillon contient les organelles recherchés ou non. Le terme dosage signifie que la méthode permet au moins de déterminer si l'échantillon contient plus ou moins d'organelles qu'un échantillon contrôle, ci-après indiqué par le terme quantité relative d'organelles ou taux relatif d'organelles , et le cas échéant, de déterminer la masse d'organelles immobilisés sur la biopuce.

La première étape de la méthode consiste à préparer une biopuce permettant la fixation des organelles à détecter ou à doser.

La biopuce choisie sera naturellement adaptée au dispositif choisi pour détecter une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique. Dans un mode de réalisation particulier, la détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.

Dans ce cas, la biopuce comprend de préférence un support métallique solide, par exemple d'or ou d'argent. Des exemples de biopuces pour biocapteurs optiques par résonance plasmonique de surface sont décrits dans les brevets EP044922, US 5,242,828 et US 5,436,161. De telles biopuces sont commercialisées par la société BIACORE AB.

L'homme du métier sélectionnera un ligand approprié en fonction de l'organelle à identifier, le ligand devant présenter une affinité suffisante avec un constituant membranaire spécifique de l'organelle afin d'immobiliser l'organelle à la surface de la biopuce lorsque le ligand est couplé à la biopuce. Le ligand peut être tout type de molécules, et notamment un polypeptide, un polysaccharide, un polynucléotide ou un lipide, ou un ligand physiologique ou pharmacologique naturel ou synthétique.

Dans un premier mode de réalisation, le ligand est un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un antigène exprimé à la surface de l'organelle à identifier.

L'étape (a) de la méthode comprend le couplage du ligand choisi sur la biopuce. Le terme couplage signifie au sens de l'invention toute méthode visant à permettre une association physique entre le ligand et le support solide constitué par la biopuce. Il est préférable cependant que l'interaction soit suffisamment stable pour que le ligand ne se dissocie pas lors de la mise

en #uvre de la méthode. De manière préférée, l'interaction est suffisamment stable pour permettre une utilisation répétée de la biopuce sans perte de sensibilité de la détection.

Le couplage peut être direct ou indirect. Par couplage direct , on entend une liaison covalente entre le ligand et le support de la biopuce. Par couplage indirect , un premier ligand est lié de manière covalente à la puce, un deuxième ligand de manière réversible à ce premier ligand. Selon une procédure alternative, le second ligand peut être préincubé avec la préparation contenant les organelles avant leur mise en contact avec le premier ligand.

A titre d'exemple de couplage indirect, le premier ligand, fixé à la biopuce de manière covalente est un anticorps anti-Fc ou anti-IgG souris se liant spécifiquement à un deuxième anticorps capable de reconnaître l'organelle à identifier dans l'échantillon. Le premier ligand est avantageusement peu sensible au choc de pH, de manière à régénérer la biopuce après utilisation par choc acide tout en permettant des immobilisations successives et reproductibles du deuxième ligand. Un exemple d'anticorps anti-Fc peu sensible au choc de pH est commercialisé notamment par la société BIACORE AB sous le nom d'anti-mouse Fcy Ref. BR-1000-50.

De préférence, le couplage indirect sera suffisamment stable de façon à réaliser des mesures de liaison d'organelles sur une période de 24 heures.

Dans un mode de réalisation particulier visant à détecter des vésicules synaptiques ou vésicules apparentées exprimant des marqueurs neuroendocrines, on citera à titre d'exemples de ligands susceptibles d'être couplés à la biopuce, les anticorps ou fragments d'anticorps reconnaissant spécifiquement les antigènes exprimés à la surface de ces organelles. Une liste non exhaustive d'anticorps reconnaissant des antigènes de vésicules synaptiques inclut par exemple les anti : -VAMP, -synaptophysine, synaptotagmine, -SV2, le transporteur vésiculaire du glutamate.

De façon avantageuse, dans l'objectif de détecter des vésicules synaptiques ou tout organelle exprimant la VAMP ou la synaptophysine, on utilisera des anticorps anti-synaptophysine ou anti-VAMP ou l'un de leurs fragments fonctionnels. Ces anticorps ont déjà été décrits dans l'état de la technique Lorsque l'un de ces anticorps est utilisé comme ligand, il a été avantageusement constaté par les inventeurs que la biopuce pouvait aussi être régénérée, après utilisation, au moyen d'une solution de détergent concentré, par exemple l'octylglucoside. De préférence, l'octylglucoside est utilisé en solution à 100 mM. Cela permet notamment de régénérer totalement l'interaction synaptophysine/anti-synaptophysine tout en solubilisant la membrane des organelles. De 10 à 100 cycles de régénération/immobilisation sont alors possibles sur le même anticorps couplé à la biopuce. L'utilisation alternative des procédures de régénération par variation de pH et par l'octylglucoside permettent une capacité théorique de plusieurs centaines d'analyses.

Différentes méthodes de couplages de molécules, et notamment de couplage de polypeptides à des supports solides de type biopuces, comme les silanes, les films de polymères, les alcanethiols et les hydrogels, sont bien connues de l'homme du métier. De façon avantageuse, la biopuce contient une matrice poreuse biocompatible, par exemple un hydrogel (formé de polysaccharide tel que le dextran). Un tel hydrogel peut contenir de manière appropriée des groupes hydroxyl, carboxyl, amino, aldéhyde, carbonyl, époxy, ou vinyl pour la fixation covalente du ligand.

Selon les principes des méthodes de réflexion optiques, le changement de composition à la surface d'une biopuce, par adsorption, désorption, fixation d'un analyte ou relargage d'un analyte, est associé à un changement de l'angle de réflexion d'une lumière atteignant la surface de la biopuce. L'étape (b) consiste donc à injecter l'échantillon liquide à analyser dans un dispositif

permettant la mise en contact de cet échantillon avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé.

Le dispositif choisi sera naturellement adapté à la méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique choisie. Pour la mise en oeuvre de l'étape b), un exemple préféré de dispositif est un dispositif permettant le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques. De tels dispositifs sont décrits notamment dans le brevet US5,313,264.

Des dispositifs appropriés permettant une détection de variation de masse par résonance plasmonique de surface et utilisant un circuit microfluidique pour la mise en contact de l'échantillon sur la biopuce sous forme de flux sont des dispositifs commercialement disponibles.

Les organelles susceptibles d'être présents dans l'échantillon se lient spécifiquement aux ligands couplés à la biopuce. La quantité d'organelles immobilisés est ainsi déterminée selon la méthode de l'invention par détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, en utilisant naturellement les contrôles appropriés pour déduire de l'interaction détectée, les interactions non spécifiques (bruit de fond).

L'échantillon liquide peut être tout type d'échantillon préparé soit à partir de cellules susceptibles de comporter des organelles, soit à partir d'un milieu biologique dans lequel elles ont été libérées, soit par tout procédé consistant à générer des structures protéolipidiques contenant des protéines des vésicules synaptiques. Dans le premier cas, La préparation consiste en général en une lyse des cellules de manière à obtenir une libération des organelles. Plus particulièrement, comme dans le second ou le troisième cas, il peut s'agir d'un échantillon préparé à partir de cellules d'un organisme biologique, et notamment d'un prélèvement de tissus ou de fluides biologiques tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive.

Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire.

L'échantillon liquide peut être également préparé à partir d'une culture de cellules.

Dans un mode de mise en #uvre particulier, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules d'exocytose. On entend par vésicules d'exocytose , tout organelle contenant des constituants destinés à être sécrétés à l'extérieur de la cellule, ou comprenant des constituants membranaires destinés à être incorporés à la membrane plasmique. Ces organelles incluent notamment les vésicules synaptiques, les granules de sécrétion (ou vésicules à c#ur dense) ou encore les SLMV.

Dans un mode de mise en #uvre préféré, l'échantillon liquide est préparé à partir de tissus neuronaux en vue de l'identification et/ou du dosage de vésicules synaptiques.

Les protéines de la membrane des vésicules synaptiques constituent des marqueurs synaptiques très étudiés. Dans certaines maladies neurodégénératives de type Alzheimer (Terry et al., 1991 ; Sze et al., 2000), la sclérose latérale amyotrophique (Ikemoto, Acta neuro, 2002), la dégénérescence commence par le compartiment présynaptique où sont localisées la très grande majorité des vésicules synaptiques. Dans la maladie d'Alzheimer, une bonne corrélation à été observée entre la perte de fonctions cognitives et la diminution de synaptophysine (Mucke et al., 2000, US2002040032). Sur des modèles de rats épileptiques, il a été montré une diminution sélective du nombre de vésicules synaptiques associées à une population neuronale (Hirsh et al., 1999). A l'inverse, des études de

synaptogénèse montrent que les éléments présynaptiques se mettent en place avant les complexes post-synaptiques.

La présente méthode peut donc être utilisée pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un patient atteint de maladies neuro-dégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer. Elle vise en particulier le dosage de synaptophysine ou d'autres protéines de vésicules synaptiques contenues dans le prélèvement de tissus ou de fluides biologiques de patients atteints de maladies neurodégénératives (voir en particulier US2002040032).

D'autre part, il est bien connu que des molécules comme les neurotrophines jouent un rôle prépondérant dans la survie et la différenciation neuronale dans de nombreux systèmes. Il a été montré par exemple, sur des neurones d'hippocampe en culture, que ces molécules augmentent significativement le nombre de vésicules synaptiques (Yamada et al., 2002, Collin et al., 2001).

La recherche de nouvelles molécules ayant un effet comparable à la neurotrophine est une voie majeure pour la découverte de nouveaux traitements contre les maladies neuro-dégénératives (voir par exemple US20020210837). La sensibilité et la rapidité de mise en #uvre de la méthode selon l'invention peuvent être utilisées pour mettre en évidence une perte (maladie neurodégénérative, infection par des virus neurotropes,...) ou un gain synaptique (étude sur la régénération neuronale, la synaptogénèse, criblage d'agents anti-neurodégénératifs...) dans des systèmes de culture cellulaire, des tranches de neurones maintenus en survie ou chez l'animal.

La méthode de l'invention est aussi utile dans toutes les recherches visant à démontrer des modifications synaptiques dans des régions particulières du système nerveux (Davidson et al., 1999).

La méthode peut plus particulièrement être utilisée pour le criblage de molécules susceptibles de moduler la croissance de cellules contenant des vésicules synaptiques, notamment de molécules neuro-trophiques ou antineurodégénératives.

Dans un autre mode de mise en #uvre de la méthode selon l'invention, l'échantillon liquide est extrait de cellules isolées d'un individu en vue de l'identification ou du dosage de vésicules contenant des marqueurs neuroendocrines.

La détection de marqueurs neuro-endocrines, parmi lesquels figure la synaptophysine, par des méthodes conventionnelles d'histologie et d'immuno-histochimie occupe une place essentielle dans le diagnostic positif et différentiel de tumeurs. La présente méthode permet avantageusement de détecter et quantifier dans un échantillon contenant des cellules issues de tumeurs, les marqueurs neuroendocrines présents dans les vésicules synaptiques, comme par exemple la synaptophysine ou la VAMP. Aussi, la présente invention vise plus préférentiellement toute utilisation de la méthode selon l'invention, pour le diagnostic positif et différentiel de tumeurs.

De manière plus générale, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour détecter toute variation de la quantité relative d'organelles dans un échantillon biologique corrélée à un traitement par un agent physiologique ou pharmacologique ou une manipulation génétique de l'organisme biologique dont est issu l'échantillon analysé.

En outre, la méthode selon l'invention peut être appliquée pour le criblage de molécules capables de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel.

En particulier, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir. Au sens de l'invention, on entend par toxine, toute molécule susceptible d'affecter les fonctions et/ou la viabilité cellulaire et dirigée contre une cible membranaire d'un organelle, entraînant une modification de la quantité du constituant membranaire ciblé ou de son interaction avec son ligand naturel. De préférence, la méthode de l'invention s'applique à la détection de

neurotoxines dont les cibles sont les constituants membranaires des vésicules synaptiques. Les toxines botuliques et tétanique sont l'objet d'enjeux majeurs dans le secteur médical (traitement de troubles neurotoxiques sévères qu'elles entraînent, utilisation croissante dans les traitements locaux de dystonies), le secteur agroalimentaire (détection/recherche de la présence de toxines botuliques), les secteurs des biotechnologies (le vaccin anti-tétanique est l'une des principales productions de ce secteur) et militaires, dans la mesure où ces neurotoxines sont susceptibles d'être utilisées dans une arme biologique. Ces neurotoxines ont pour cibles les protéines de la famille SNAREs (syntaxines, VAMPs, et par exemple SNAP23 ou SNAP25), en particulier la syntaxine 1, la VAMP2 et la SNAP25 présentes dans la membrane des vésicules synaptiques. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est appliquée à la détection d'une toxine botulique ou de la toxine tétanique dans un échantillon susceptible d'en contenir.

De préférence, pour la détection de neurotoxines, des anticorps anti-VAMP, anti-SNAP25 ou anti-syntaxine sont couplés à la biopuce. Un échantillon susceptible de contenir une neurotoxine est mis au contact d'une préparation contenant des organelles comprenant des cibles des toxines botuliques et tétanique à leur surface, en particulier des vésicules synaptiques, et la variation, ou la disparition, de protéines SNARE, est analysé en mettant au contact cet échantillon traité sur ces anticorps couplés à la biopuce.

Les biopuces contenant une quantité déterminée d'organelles immobilisés à leur surface peuvent, en raison de leur stabilité remarquable, être ellesmêmes utilisées comme matériaux de départ pour la mise en #uvre d'une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle par des méthodes de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique.

Un deuxième objet de l'invention concerne par conséquent une méthode de préparation d'une biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, ladite méthode comprenant : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, b) l'injection d'un échantillon liquide contenant des organelles dans un dispositif permettant la mise en contact des organelles avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, permettant ainsi l'obtention d'une biopuce contenant des organelles immobilisés à sa surface, c) le cas échéant, la congélation de la biopuce obtenue à l'étape b) et sa conservation au froid, suivi d'une décongélation, ou sa lyophilisation suivie d'une réhydratation, en vue de son utilisation.

Les étapes (a) et (b) sont mises en oeuvre de manière similaire aux étapes (a) et (b) de la méthode d'identification et de dosage d'organelles décrite précédemment.

De préférence, la biopuce et le dispositif choisis pour la mise en #uvre des étapes (a) et (b) sont adaptés pour une utilisation des biopuces dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.

De façon avantageuse, le dispositif utilisé à l'étape b) permet le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques. Des exemples de tels dispositifs ont été décrits précédemment.

Dans un mode de mise en #uvre particulier, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules de sécrétion.

Dans un mode de mise en oeuvre préféré, les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules synaptiques. Comme décrit précédemment, le ligand couplé à la surface de la biopuce est alors choisi par exemple dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.

L'invention vise naturellement une biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la méthode de préparation définie ci-dessus.

Une biopuce selon l'invention, utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, est caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un support approprié pour détecter une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, b) des ligands couplés audit support, lesdits ligands étant susceptibles de se lier spécifiquement au constituant membranaire d'un organelle, c) des organelles immobilisés à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec lesdits ligands.

Dans un mode de réalisation, le support approprié pour mesurer une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique à la surface de la biopuce est choisi parmi un support d'or ou d'argent. La biopuce peut comprendre en outre une couche de dextran permettant le couplage des ligands à sa surface. Des exemples préférés de biopuces pour biocapteurs par résonance plasmonique de surface ont été décrits précédemment.

Dans un mode de réalisation préféré, les organelles immobilisés à la surface des biopuces selon l'invention sont des vésicules synaptiques.

Dans un mode de réalisation particulier, les vésicules synaptiques sont immobilisées à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec des ligands choisis dans le groupe constitué par les anticorps antisynaptophysine et les anticorps anti-VAMP.

Un troisième objet de l'invention porte sur une méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, comprenant a) l'obtention d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, b) l'injection d'un échantillon liquide contenant l'analyte dans un dispositif permettant la mise en contact de l'analyte avec la surface de la biopuce contenant des organelles immobilisés, c) la mesure d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce par réflexion optique, ladite mesure permettant la détection de la quantité d'analytes liés aux organelles immobilisés à la surface de la biopuce.

Avantageusement, la biopuce obtenue à l'étape (a) est une biopuce selon l'invention telle que définie plus haut. La biopuce est réalisée par l'immobilisation d'une quantité suffisante d'organelles nécessaires à l'analyse subséquente recherchée. Etant donné que la quantité d'organelles peut être quantifiée par la mise en #uvre de la première méthode selon l'invention décrite plus haut, le niveau d'immobilisation d'organelles peut être contrôlé précisément selon le type d'application souhaité.

Selon un mode de mise en #uvre préféré, la mesure d'une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la

spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface. De préférence, le dispositif utilisé à l'étape b) permet le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques. Des exemples de tels dispositifs ont été donnés plus haut.

La méthode permet notamment de mesurer l'affinité de toute molécule sur un constituant membranaire de l'organelle immobilisé. Elle permet de quantifier toute molécule présente dans un échantillon se liant spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle. Elle permet en outre de déterminer la présence ou non de constituant membranaire spécifique d'un organelle par détection d'une liaison entre ledit constituant membranaire et un ligand connu de celui-ci.

Tout type d'analyte peut être étudié. Il peut s'agir notamment d'une molécule ou d'un complexe supramoléculaire. A titre d'exemples, l'analyte peut être une protéine, un ADN, un lipide, un sucre, et en particulier un anticorps ou fragment d'anticorps, une enzyme, une hormone, un neuromédiateur, un récepteur, un substrat d'enzyme, une lectine, une toxine ou un agent pharmacologique. L'analyte peut également être compris dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, il peut s'agir d'un échantillon issu d'un prélèvement de tissus ou de fluide biologique tel que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive. Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou d'un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire.

L'analyte peut être également compris dans une culture de cellules eucaryotes ou procaryotes, de bactéries, de champignons ou de levures.

L'analyte peut aussi être compris dans un produit agro-alimentaire, et notamment des graines, des fruits, des céréales ou des aliments cuisinés.

De préférence, l'analyte peut être complexé à des complexes de haut poids moléculaires de façon à accroître la masse de la molécule injectée et ainsi augmenter la sensibilité de la mesure. Par exemple, l'analyte peut être intégré dans des liposomes artificiels.

En particulier, il est possible de répéter les étapes (b) et (c) avec différentes concentrations d'un même analyte permettant d'obtenir les affinités de liaison de différents analytes sur un même organelle.

La méthode de l'invention telle que définie ci-dessus peut par conséquent être appliquée au criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, notamment d'agonistes ou d'antagonistes de ligands de récepteurs membranaires.

A titre d'exemples, on injectera un échantillon contenant différentes molécules candidates susceptibles de se lier spécifiquement à un constituant membranaire suivi d'un ligand connu pour se lier spécifiquement audit constituant membranaire. Une inhibition partielle de la liaison du ligand sera significative de la présence d'un nouveau ligand parmi les molécules candidates injectées.

En outre, la présente méthode permet également la purification de nouveaux ligands spécifiquement immobilisés sur un organelle et leur analyse subséquente, par exemple par spectrométrie de masse.

La méthode vise en particulier le criblage de nouveaux ligands de marqueurs neuro-endocrines pour le diagnostic moléculaire de ces marqueurs. Dans un mode de mise en #uvre préféré, les analytes testés sont des anticorps ou fragment d'anticorps dirigés contre un constituant membranaire d'un

organelle, de préférence d'une vésicule de sécrétion et notamment de vésicules synaptiques. En particulier, il s'agit d'anticorps monoclonaux.

Une autre utilisation de la méthode décrite ci-dessus concerne le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel. Les molécules recherchées peuvent par exemple être des composés capables de modifier la structure post-traductionnelle des constituants membranaires, tels que des kinases ou des phosphatases. A titre d'exemple, la méthode permet de comparer l'affinité de liaison d'un ligand naturel avec un constituant membranaire de l'organelle immobilisé sur la biopuce et l'affinité du même ligand injecté avec ou après l'injection d'une molécule susceptible de modifier l'interaction dudit ligand avec le constituant membranaire de l'organelle. Ainsi dans un mode de mise en oeuvre particulier, la méthode comprend, préalablement à l'injection d'un ligand d'un constituant membranaire (l'analyte), l'injection d'un composé susceptible de modifier l'interaction dudit ligand avec le constituant membranaire de l'organelle.

La répétition des mesures de liaison de différents analytes peut être appliquée à la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, lesdits analytes étant choisis parmi des ligands connus de constituants membranaires d'organelles. Par caractérisation , on entend la détermination de la présence sur un même organelle de différents constituants membranaires connus et le cas échéant l'évaluation de la proportion relative de chaque constituant analysé.

Cette caractérisation peut permettre d'identifier le cas échéant des affections pathologiques, des modifications génétiques induites ou naturelles ou des traitements pharmacologiques. Des exemples de modifications du contenu en constituant membranaire de vésicules synaptiques sont décrits par exemple par Veinbergs et al., 1999.

A titre d'exemple d'analytes utilisables pour la caractérisation d'organelles, en particulier de vésicules synaptiques, on pourra utiliser : - des anticorps spécifiques dirigés contre chaque constituant membranaire de l'organelle, voire des anticorps dirigés contre différents épitopes d'un même constituant membranaire afin d'identifier des changements de conformation dudit constituant résultant par exemple d'altérations liées à une pathologie, - des ligands spécifiques des lipides (par exemple, l'annexine V), - tout type de ligands naturels, recombinants ou synthétiques, et notamment la calmoduline, la complexine ou l'alpha-SNAP pour la caractérisation de vésicules synaptiques.

Une application préférée de la présente méthode concerne la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir. De préférence, la méthode de l'invention s'applique à la détection de neurotoxines dont les cibles sont les constituants membranaires des vésicules synaptiques. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est appliquée à la détection d'une toxine botulique ou d'une toxine tétanique. Ces neurotoxines ont pour cibles les protéines SNARE (syntaxine 1, VAMP2 et SNAP25) présentes dans la membrane des vésicules synaptiques. L'effet de ces neurotoxines sur des vésicules synaptiques peut être analysé par la détection selon la méthode de l'invention de la liaison d'un anticorps antisyntaxine 1, anti-VAMP2 ou anti-SNAP25 sur des vésicules synaptiques immobilisées mises en contact ou non avec un échantillon susceptible de contenir lesdites neurotoxines.

Sont également visées dans la présente invention les utilisations des biopuces contenant les organelles immobilisées à leur surface, telles que décrites plus haut,

- pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel, - pour le criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, - pour la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, ou encore - pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir, de préférence de toxine botulique ou tétanique.

Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples présentés ci-après.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : La figure 1 illustre la capture spécifique d'environ 2 ng d'équivalent protéique de vésicules synaptiques sur une biopuce par le moyen d'anticorps anti-synaptophysine 171 B5.

S2 : fraction subcellulaire S2 diluée au 1/20 non pré-incubée avec l'anticorps 171 B5 et injectée sur une biopuce à laquelle est couplé l'anticorps 171 B5 S2 en présence d'un excès d'anticorps anti-synaptophysine : fraction subcellulaire S2 diluée au 1/20 et pré-incubée avec l'anticorps 171B5 injectée sur une biopuce à laquelle est couplé l'anticorps 171 B5 Figure 2 : La Figure 2 illustre la capacité d'une solution d'octylglucoside 100 mM à régénérer les vésicules synaptiques immobilisées sur un anticorps anti-synaptophysine 171 B5. Chaque cycle est constitué par une injection de fraction S2 diluée, suivi par une injection d'octylglucoside 100 mM (40 l à 5 l/mn).

Figure 3 : La Figure 3 illustre la capture de vésicules synaptiques à partir de lysats de neurones d'hippocampe en culture, ensemencées à différentes densités.

Lysat de 28800 cellules Lysat de 9000 cellules Lysat de 4500 cellules.

Figure 4 : 23 échantillons issus de prélèvements de tumeurs pulmonaires ont été analysés pour la présence de marqueurs neuro-endocrines.

La ligne horizontale représente le niveau de signal au-delà duquel la détection est considérée comme positive (4 unités de résonance valeur au dessous de laquelle le signal n'est plus considéré comme fiable).

Tumeurs à petites cellules représentées par des losanges.

Tumeurs non petites cellules représentées par des carrés.

Prélèvements sains (contrôle) représentés par un triangle.

Figure 5: La figure 5 illustre la mise en évidence d'une variation de la quantité de vésicules synaptiques dans des neurones en culture traités par un facteur neurotrophique Cellules traitées : neurones d'hippocampe (20000 cellules/cm2) traités après 7 jours de mise en culture avec 37.5 ng/ml de BDNF (Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) durant 7 jours.

Cellules non traitées : neurones d'hippocampe cultivés dans les mêmes conditions non traités.

Figure 6 : La figure 6 illustre l'effet de la toxine botulique B (Bont/B) sur l'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuce.

La biopuce comprend deux à quatre pistes d'analyse placées en série : un anticorps non spécifique est capturé sur la piste contrôle (700 pg) et un anticorps anti-VAMP sur la piste test (700 pg). Il est possible de détecter la présence de toxine (1-10 pM), après des temps d'incubation de 0,5 - 1,5 heures (80% de clivage à 10 pM 30min à 37 C). La limite de détection est de l'ordre de 0,1 pM de toxine botulique B (environ 0,3 pg de toxine) soit 15 pg/ml.

Figure 7 : Exemple de caractérisation de vésicules synaptiques issues de neurones en culture traités ou non à la toxine tétanique.

La culture est traitée (cellules traitées) ou non traitée (cellules non traitées) avec la toxine tétanique (100 ng/ml) pendant 39 heures. Les anticorps spécifiques des vésicules synaptiques sont ensuite injectés successivement : 1 : anti-CSP (Cysteine String Protein) 2 : anti-pompe à proton 3 : anti-transporteur vésiculaire du glutamate 4 : anti-SNAP25 5 : anti-synapsine 6 : anti-SV2A 7 : anti-synaptotagmine 8 : anti-synaptogyrine 9 : anti-synaptophysine 10 : anti-VAMP Nt polyclonal 11 :anti-VAMP 1 H7 12 : anti-VAMP 60-88 13 : anti-VAMP 3D10

EXEMPLES
1. Matériels et méthodes
1.1Anticorps L'anticorps anti-synaptophysine utilisé pour la capture des vésicules synaptiques est l'anticorps 171 B5 (Lévêque et al. 2000).

Les anticorps monoclonaux anti-synaptotagmine 1 CI 41. 1, anti-synaptogyrine CI 80. 1, anti-synapsine 1 Ci 46. 1 and anti-Rab5 CI 621. 3 et anti-VAMP2 : CI 69. 1 sont commercialisés par la société Synaptic Systems.

Les anticorps polyclonaux anti-bassoon et l'anticorps monoclonal antisyntaxin13 sont commercialisés par la société Stressgen.

L'anticorps polyclonal anti VAMP2 Nter (dirigé contre la partie Nter de la VAMP, Léveque et al. 2000) et anti-VAMP 60-88 (anticorps polyclonal dirigé contre le peptide 60-88 de la VAMP2 de rat) ont été fournis par le laboratoire du Dr Takahashi (Mitsubishi Kasei Institute of Life Science, Tokyo, Japan). Les anticorps 1 H7 et 3D10 (monoclonaux anti VAMP2 dont les épitopes sont localisés dans la région 19-59 de la VAMP2 de rat), ainsi que l'anticorps anti SNAP 25( BR05, Lévêque et al, 2000) ont été fournis par le Dr Kosaki ( Départment of Veterinary Science, College of Agriculture, Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka, Japan).

Les anticorps monoclonaux anti-syntaxine : 6D2, 9H1, 4D4, 10F5, 6H1 ont aussi été fournis par le laboratoire du Dr Takahashi ainsi que les anticorps anti-synaptotagmine (1D12 et anti région Nterminales de la synaptotagmine 1), anti-CSP (Lévêque et al. 2000), anti-Rab3A, Munc 18, NSF, sortilline, complexine, GluR2, Neurexine,alpha-beta SNAP et synaptophysine (6H2 dirigé contre une région luminale) L'anticorps monoclonal anti-synapsine lia est commercialisé par la société Translaboratories. L'anticorps anti-SV2A de la Developmental Studies

Hybridoma Bank a été développé par le NICHD et conserve par l'université de l'Iowa, Department of biological Sciences, lowa City, IA 52242.

Les IgG non immun de souris IgGNIS (IgG non spécifiques) ont été obtenus auprès d'Interchim.

1.2 Préparation des vésicules synaptiques issues de cerveau de rat La procédure de fractionnement est décrite dans Lévêque et al. 2000.

Un cerveau de rat frais est homogénéisé avec un homogénéisateur Teflon dans 10ml d'un tampon de sucrose froid (10 mM HEPES, NaOH, 0. 32 M sucrose,1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride, pH 7. 4). L'échantillon homogénéisé est centrifugé à 800 x g pendant 10 minutes. Le surnageant (S1) est centrifugé à 10000-30000 x g pendant 25 min. Le surnageant (S2) est filtré et utilisé immédiatement ou conservé à -20 C pour une utilisation ultérieure.

1.3 Méthode de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique Toutes les expériences décrites ci-après ont été réalisées sur un biocapteur de type Biacore (Biacore X ou Biacore 3000). La température du biocapteur est contrôlée à 25 C. Toutes les expériences ont été effectuées avec une piste contrôle placée en série et une piste test ou expérimentale. Tous les résultats présentés correspondent à des mesures spécifiques (signal de la piste contrôle soustrait du signal de la piste test) exprimées en unités de résonance : une unité de résonance correspond à une masse de 1 pg d'équivalent protéique avec la technologie Biacore.

Les expériences de caractérisation ont été réalisées sur une biopuce (sensor chip) F1. Le protocole d'immobilisation est le même que celui utilisé pour la biopuce CM5. Après immobilisation des vésicules synaptiques, la surface de la biopuce est saturée avec 50 l d'un anticorps IgGNIS (50g/ml) à 15 I/min avant la mise au contact des anticorps spécifiques.

Exemple 1 : Contrôle de la spécificité de l'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuces Cet exemple illustre la détection spécifique de vésicules synaptiques, immobilisées sur biopuces.

Une fraction S2 contenant des vésicules synaptiques est diluée dans un tampon TBS à une concentration en protéines de 0.15 mg/ml, et préincubée ou non avec un excès d'anticorps anti-synaptophysine (100 g/ml). Les échantillons sont ensuite injectés (50 l à 5 l/min) sur une biopuce sur laquelle ont été préalablement immobilisés 0,5 ng d'anticorps antisynaptophysine dans la piste test et 0,5 ng d'anticorps non immun dans la piste contrôle.

La figure 1 illustre la capture spécifique d'environ 2 ng d'équivalent protéique de vésicules synaptiques sur une biopuce par le moyen d'anticorps antisynaptophysine 171 B5. L'anayse du taux d'immobilisation de chaque préparation permet de mesurer une inhibition de 88% de l'immobilisation de vésicules synaptiques lorsque la fraction S2 a été pré-incubée avec l'anticorps 171B5. Le signal généré par l'immobilisation des vésicules synaptiques est spécifique au regard des critères suivants : # le passage de l'échantillon biologique sur une piste contrôle sur laquelle est couplée un anticorps non spécifique génère un signal qui ne représente que 5 à 10% du signal recueilli sur la piste expérimentale .

Les analyses immunologiques et morphologiques démontrent que ce signal non-spécifique mesuré sur la piste contrôle ne correspond pas à des protéines des vésicules synpatiques, # la préincubation de la fraction S2 avec un excès de l'anticorps spécifique inhibe largement la liaison des vésicules sur la piste expérimentale, # l'utilisation d'anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiques d'autres organelles ne génère aucun signal spécifique alors qu'une majorité d'anticorps spécifique des vésicules synaptiques génère un signal positif comme le montre le tableau 1 ci-après.

Tableau 1: Caractérisation immunologique du matériel immobilisé avec mAb anti-synaptophysine (171 B5) sur biopuce couplée avec un anticorps antiFcy.

ANTIGENE EPITOPE ** Nom SIGNAL Nt du 1er M CI 41.1* ++ domaine C2 Synaptotagmine 1 aa 301-314 P AntiC2b ++ Domaine M 1 D12 +++ cytoplasmique aa 21-55 P Anti 21-55 Synaptotagmine 1 aa 1-20 M 4E2a domaine Région Nt P Syt Nt intravésiculaire Région Nt P IgG-Stg 1 N(14) aa 1-18 P AntiNt +++ Région Nt M CI 69.1* VAMP-2 aa 60-88 P Anti 60-88 +++ >M 1H7 +++ CI) M 3D10 +++ CI) Synaptophysine M 171 B5 +++ Synaptophysine CI 7.2* ++ Synaptophysine Domaine aa 160-174 M 6H2 .!! intravésiculaire ,n M 6D2 ++ CI) M 9H1 - ," Syntaxine-1 Région Ct M 4D4 + /M 10F5 + M 6H1 + SNAP-25 M BR05 +/++ .E Synaptogyrine M CI 80.1* +++ 0 SV2A Acides aminés P * ++ CL 1-19 CSP P + /++ Transporteur Acides aminés vésiculaire CI es ammes VGI t1 vésiculaire du 456-561 u glutamate 456'561 Pompe à protons P +

ANTIGENE EPITOPE ** Nom SIGNAL Synapsine M CI 46.1 -/+ EN II Rab3a Acides aminés p Rab3a-Ct Rab3a 204-217 aDja-t -ST1 >(0 U) Rab5 621.3 ,0.2 Rab5 621.3* M'5 si 0) > a;o Acides aminés .. * .

-o Synapsmella 451-586 M 01 CL ~ ~~~~~~~ x Syntaxine 13 Domaine M 15G2* cytoplasmique ~~~~~~~~~~~~~ a/[3-SNAP Acides aminés P - 144-156 Bip ? N Récepteur M 'g Transferrine ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ S "-5 Munc-18-1 Acides aminés P E CL 2-15 E 3T NSF M 2E5 ?#≈Bassoon Acides aminés P SAP7F407* 738-1035 a d ########### ########## ### ########## ###### #Neurexine Acides aminés P g 1489-1507 GIuR2 P Sortilline P SP13 CL 0 Complexine #########M LP27 signal:5 0 RU + signal 0-10 RU ** M : monoclonal ++ signal 10-50 RU P : polyclonal +++ signal # 50 RU * Produits commercialisés

En outre, l'analyse en microscopie électronique permet d'observer des vésicules sphériques de diamètre voisin de 50 nm immunomarquées par un anticorps anti-VAMP (résultats non présentés).

Les inventeurs ont en outre constaté les observations suivantes : # Le signal généré par l'immobilisation des vésicules synaptiques est fiable et reproductible dès 5 à 10 pg d'équivalent protéique de vésicules synaptiques immobilisées, # Le signal obtenu est proportionnel à la quantité de vésicules synaptiques présentes dans l'échantillon contenant les vésicules synaptiques, # Le signal peut être quantifié précisément par l'utilisation d'une gamme étalon de vésicules synaptiques purifiées et dosées par d'autres techniques (dosage de l'ensemble des protéines vésiculaires ou dosage d'une protéine synaptique par Western Blot et radioimmunoblotting (Walch-Solimena et al., 1995) ou par dosage de la VAMP ou de la synaptophysine à partir de l'extrait cellulaire par
Western Blot.

Exemple 2 : Régénération de la biopuce Plusieurs immobilisations consécutives de faible quantité peuvent être réalisées sur la même biopuce. Néanmoins, les inventeurs ont développé des procédés de régénération des biopuces permettant de mettre en #uvre les méthodes selon l'invention sur une même biopuce plusieurs centaines de fois.

Les inventeurs ont sélectionné un anticorps monoclonal anti-synaptophysine présentant une cinétique de dissociation rapide, atypique par rapport à la plupart des anticorps anti-vésicules synaptiques. Une injection prolongée d'une solution de détergent concentrée (comme par exemple l'octylglucoside

à 100 mM) permet de régénérer totalement l'interaction synaptophysine/antisynaptophysine tout en solubilisant la membrane des vésicules.

Après immobilisation d'un anticorps de souris non spécifique (1,4 ng) sur la piste contrôle, et d'un anticorps anti-synaptophysine sur la piste expérimentale (1,4 ng), 6 l de la fraction S2 (0,5 mg/ml ) sont injectés.

Chaque cycle est constitué par une injection de l'échantillon S2, suivi par une injection d'octylglucoside 100 mM (40 l à 5 l/mn). Comme le montre la figure 2, la décroissance de capture est limitée (23% de perte sur 40 cycles) et linéaire dans le temps ce qui permet de la prendre en compte dans un programme d'injections/ régénérations.

Une quarantaine de cycles régénération/immobilisation est donc possible avec l'octylglucoside sur le même anticorps couplé à la biopuce.

Les inventeurs ont également immobilisé un anticorps monoclonal anti- (vésicules synaptiques) par un anticorps anti-Fc. Tout en conservant les propriétés d'immobilisation décrites ci-dessus, cette procédure présente en outre l'avantage d'orienter de façon fonctionnelle l'anticorps anti-vésicules synaptiques. En sélectionnant un anticorps anti-Fc peu sensible au choc de pH, la biopuce contenant les organelles immobilisés peut être régénérée plusieurs dizaines de fois à un pH acide.

L'utilisation alternée de ces deux protocoles permet de réaliser plusieurs centaines de dosage sur une seule biopuce.

Exemple 3: Détection de vésicules synaptiques issues de quantités différentes de neurones en culture et analyse de la sensibilité de la méthode selon l'invention Des cultures primaires de neurones d'hippocampe sont préparées à partir d'embryons de rat de 18 jours selon la méthode décrite dans Garrido et al., 2001. Quatre lamelles par boîte de culture sont ensemencées avec

différentes densités de cellules dissociées. Au jour J14, les cellules sont lavées trois fois avec du tampon PBS. Les cellules sont ensuite lysées 3 minutes avec 500 l ( par boîte de culture) de tampon de lyse (5 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,4 ) et remises en suspension par grattage. Les cellules lysées sont passées 9 fois au travers d'une aiguille 27G et centrifugées 15 minutes à 12000 x g à 4 C. Les surnageants cellulaires sont injectés (100 l à 1 pl/min) sur la biopuce fonctionnalisée avec un anticorps anti-synaptophysine (171B5).

La sensibilité de la méthode de détection d'organelles selon l'invention est ainsi illustrée à la figure 3. En effectuant des dilutions d'un lysat de culture de neurones à 20000 cellules /cm2 et par extrapolation, il a en effet été déterminé qu'il était possible de détecter la présence de vésicules issues d'une centaine de neurones. La méthode selon l'invention, rapide et sensible, est ainsi particulièrement bien adaptée à la détection d'organelles dans des biopsies ou des prélèvements de fluides biologiques, notamment des prélèvements sanguins.

Exemple 4: Utilisation de la méthode de détection d'organelles au diagnostic de tumeurs de poumon à petites cellules 21 prélèvements de tumeurs de poumon (xénogreffes) et 2 de poumons sains ont été fournis par le laboratoire de M.F. Poupon (Insitut Curie). Chaque prélèvement est homogénéisé dans un tampon 5mM HEPES-NaOH, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH7,4 (1 mg de tumeur par ml de tampon). Les échantillons sont ensuite centrifugés 30 min à 10000 x g. Le surnageant est dilué 40 fois dans un tampon 10 mM HEPES-NaOH, 0. 4 M NaCI, pH 7.4, contenant de la spermine 1 mM avant d'être injecté (40 l à 5 l/min). La biopuce est couplée avec un anticorps anti-synaptophysine (171B5). Les 23 prélèvements ont été analysés. Les résultats sont présentés à la figure 4. Les 9 échantillons provenant de tumeurs à petites cellules (dont la caractéristique est de contenir des marqueurs neuroendocrines) sont positifs

ainsi que 3 échantillons de tumeurs non petites cellules . Il est cependant attendu que 10 à 30% d'échantillons non petites cellules contiennent néanmoins aussi des marqueurs neuro-endocrines (Carnaghi C. et al., 2001). La ligne horizontale représente le niveau de signal au-delà duquel la détection est considérée comme positive (4 unités de résonance valeur au dessous de laquelle le signal n'est plus considéré comme fiable). Les résultats démontrent que la méthode de l'invention est adaptée à la détection et la quantification des marqueurs neuro-endocrines, notamment pour le diagnostic positif et différentiel des tumeurs.

Exemple 5: Détection d'une modification du nombre de vésicules synaptiques issues de neurones traités par un facteur neurotrophique Les neurones d'hippocampe (20000 cellules/cm2) sont traités après 7 jours de mise en culture avec 37.5 ng/ml de BDNF ( Brain-derived neurotrophic factor, R&D Systems) durant 7 jours. Après lyse hypotonique des neurones, les surnageants de lyse sont injectés (100 l à 1 l /min) sur 0. 7 ng d'anticorps anti-synaptophysine ou d'anticorps non spécifiques. Comme le montre la figure 5, le traitement par le BDNF induit une modification du signal de détection des vésicules synaptiques, dès le départ de l'injection, confirmée par l'obtention d'un plateau plus élevé (% d'augmentation : 29% +/- 4.8, n = 3 ).

Exemple 6 : Détection de la toxine botulique B par perte d'immobilisation de vésicules synaptiques sur biopuces L'expérience consiste à mesurer une perte de liaison de vésicules synaptiques de cerveau de rat, sur un anticorps anti-VAMP, consécutivement à l'incubation avec la toxine botulique B. L'anticorps monoclonal anti-VAMP utilisé pour capturer les vésicules est dirigé contre la partie Nterminale de la VAMP (CI 69.1). Les toxines Botuliques B et E purifiées ont été fournies par

le laboratoire du Dr Kosaki (Départment of Veterinary Science, College of Agriculture, Osaka Préfecture University, Sakai, Osaka, Japan).

La biopuce comprend deux à quatre pistes d'analyse placées en série : un anticorps non spécifique est capturé sur la piste contrôle (700 pg) et un anticorps anti-VAMP sur la piste test (700 pg). Dans certaines expériences, des anticorps anti-synaptophysine (171 B5) ou anti-synaptotagmine (1D12) ont également été placés en série sur les deux pistes suivantes afin de vérifier l'intégrité de la préparation vésiculaire pour des temps d'incubation prolongés.

Il a été constaté qu'il est possible de détecter la présence de toxine (1-10 pM), après des temps d'incubation de 0,5 - 1,5 heures (80% de clivage à 10 pM 30min à 37 C) (résultats non montrés). Cependant une meilleure sensibilité a été obtenue pour des temps d'incubation plus longs par exemple de 12 heures comme dans l'exemple de la figure 6. Seul l'épitope de VAMP disparaît. Il n'y a pas de diminution de capture de ces mêmes vésicules sur un anticorps anti-synaptophysine ou anti-synaptotagmine. La fraction S2 (3 mg/ml) a été préparée en présence de DTT 5 mM sans autres inhibiteurs de protéases.

Les toxines 0,6 M en solution dans un tampon HEPES-NaOH 10 mM, DTT 10 mM, NaCI 0. 15M, pH 7,4 et incubée de 30 min à 1 heure à 37 C, constituent les solutions mères.

La fraction S2 est diluée 3000 fois dans le tampon de clivage : 50 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 20 M ZnCI2, 0,02% BSA, 0,16 mM DTT, pH 7,4 puis incubée en présence ou non de concentrations variables de toxine. A la fin de l'incubation, la concentration en NaCI est ajustée à 0,4 M et une partie de l'échantillon est injectée sur la biopuce.

Sur un appareil de type Biacore, l'échantillon (15 l) est injecté à un débit de
2 l/min. Le tampon de course est constitué par 10 mM HEPES-NaOH, 0. 15
M NaCl, pH 7.4.

Il a été observé que la toxine botulique B (600 pM) chauffée à 100 C ou bien non réduite ainsi que la toxine botulique E, utilisée comme un contrôle négatif, sont inactives dans ce test (expériences effectuées sur des temps courts).

La limite de détection est de l'ordre de 0,1 pM de toxine botulique B (environ 0,3 pg de toxine) soit 15 pg/ml. La présence de DTT et la dilution importante de la fraction S2 sont deux paramètres importants permettant de mesurer une immobilisation de vésicules synaptiques incubées à 37 C durant plusieurs heures.

Exemple 7: Caractérisation de vésicules synaptiques provenant de neurones en culture traitées ou non à la toxine tétanique Pour cette expérience, la toxine tétanique a été fournie par le Dr Boquet (INSERM U452, Nice).

Les neurones d'hippocampe sont cultivés comme décrit dans la figure 3. La culture est traitée ou non avec la toxine tétanique (100 ng/ml) pendant 39 heures. Après lyse hypotonique, les vésicules synaptiques (environ 2 ng d'équivalent protéique) sont immobilisées sur un anticorps antisynaptophysine. La biopuce est alors saturée avec un anticorps non spécifique de souris.

Les anticorps spécifiques des VSs sont ensuite injectés successivement (20 l à 30 g/ml, 15 pl/min). Chaque injection est précédée par une injection d'anticorps non spécifique à la même concentration. Les pourcentages d'inhibition de liaison des anticorps anti-VAMP par l'action de la toxine tétanique sont respectivement de 94%, 87%, 87% et 89% comme illustré par la figure 7.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Carnaghi et al., 2001, Ann. Oncol. 12 (Suppl.) 119-123 Collin et al., Eur. J. Neurosci., 2001, 13, 1273-82 Davidson et al., Schizophrenia Research, 1999, 40, 23-29 Fernandez-Chacon et Sudhöf Annu. Rev. Physiol. 1999, 61, 753-776 Garrido et al., 2001, EMBO J., 20,5950-5961 Hirsh et al., Nat. Neurosci., 1999, 2, 499-500 Ikemoto Acta Neuro 2002, 103, 179-187 Jahn et Sudhôf, J. Neurochem., 1993, 61, 12-21 Lévêque et al., J. Neurochem., 2000,74, 367-74 Mucke, J. Neurosci., 2000,20, 4050-4058 Quetglas et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 15, 9695-700 Sze et al., J. of Neurological Sciences, 2000, 175, 81-90 Terry et al., Ann. Neurol., 1991,30, 572-580 Veinbergs et al., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 1999,23, 519-31 Walch-Solimena et al., J. of Cell Biology, 1995, 128, 637-645 Yamada et al., J. Neurosci., 2002,22, 7580-85

Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode d'identification ou de dosage d'organelles dans un échantillon liquide caractérisée en ce qu'elle comprend : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire des organelles à identifier ou à doser, b) l'injection de l'échantillon liquide dans un dispositif permettant la mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, c) la détection d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce par une méthode de réflexion optique, ladite détection permettant l'identification et/ou le dosage de la quantité d'organelles liés à la surface de la biopuce.

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.

3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le dispositif utilisé à l'étape b) permet la mise au contact de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.

4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon liquide est extrait de cellules neuronales en vue de l'identification et/ou du dosage de vésicules synaptiques.

5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps dirigés contre un constituant de la membrane des vésicules synaptiques.

6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.

7. Méthode selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que la biopuce est régénérée au moyen d'une solution de détergent concentré, par exemple l'octylglucoside.

8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon liquide est extrait de cellules isolées ou d'un fluide biologique prélevé d'un individu en vue de l'identification ou du dosage de vésicules contenant des marqueurs neuro-endocrines.

9. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la détection d'une variation de la quantité relative d'organelles dans un échantillon biologique corrélée à un traitement par un agent physiologique ou pharmacologique ou une manipulation génétique de l'organisme biologique dont est issu l'échantillon biologique analysé.

10. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour le criblage de molécules capables de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec un ligand naturel.

11. Utilisation de la méthode selon la revendication 4, pour le criblage de molécules susceptibles de moduler la croissance de cellules

contenant des vésicules synaptiques, notamment de molécules neuro- trophiques ou anti-neurodégénératives.

12. Utilisation de la méthode selon la revendication 7 ou 8, pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un patient atteint de maladies neuro- dégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.

13. Utilisation de la méthode selon la revendication 7, pour le diagnostic positif et différentiel de tumeurs.

14. Méthode de préparation d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, ladite méthode comprenant : a) le couplage, à la surface d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique, d'un ligand susceptible de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, b) l'injection d'un échantillon liquide contenant des organelles dans un dispositif permettant la mise en contact de la quantité d'organelles avec la surface de la biopuce contenant le ligand couplé, permettant ainsi l'obtention d'une biopuce contenant des organelles immobilisés à sa surface, c) le cas échéant, la congélation de la biopuce obtenue à l'étape b) et sa conservation au froid, suivi d'une décongélation, ou sa lyophilisation suivie d'une réhydratation, en vue de son utilisation.

15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que la détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.

16. Méthode selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le dispositif utilisé à l'étape b) permet le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.

17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules d'exocytose ou de sécrétion.

18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que les organelles contenus dans l'échantillon sont des vésicules synaptiques.

19. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le ligand couplé à la surface de la biopuce est choisi dans le groupe constitué par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-VAMP.

20. Biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par une méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 19.

21. Biopuce utilisable pour la détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un support approprié pour détecter une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, b) des ligands couplés audit support, lesdits ligands étant susceptibles de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, c) des organelles immobilisés à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec lesdits ligands.

22. Biopuce selon la revendication 21, caractérisée en ce que les organelles immobilisés à sa surface sont des vésicules synaptiques.

23. Biopuce selon la revendication 21, caractérisée en ce que les vésicules synaptiques sont immobilisées à la surface de la biopuce par liaison spécifique avec des ligands choisis dans le groupe constitués par les anticorps anti-synaptophysine et les anticorps anti-

VAMP.

24. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce que le support approprié pour mesurer une variation de masse ou de conformation moléculaire à sa surface par réflexion optique, est choisi parmi un support d'or ou d'argent.

25. Méthode de détection d'une liaison entre un analyte et un constituant membranaire d'un organelle comprenant : a) l'obtention d'une biopuce utilisable dans un dispositif de détection de variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique et comprenant des organelles immobilisés à sa surface, b) l'injection d'un échantillon liquide contenant l'analyte dans un dispositif permettant la mise en contact de l'analyte avec la surface de la biopuce contenant des organelles immobilisés, c) la mesure d'une variation de masse ou de conformation moléculaire à la surface de la biopuce par réflexion optique, ladite mesure permettant la détection de la quantité d'analytes liés aux organelles immobilisés à la surface de la biopuce.

26. Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que la biopuce obtenue à l'étape (a) est une biopuce selon l'une quelconque des revendications 20 à 24.

27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, caractérisée en ce que la mesure d'une variation de masse ou de conformation moléculaire par réflexion optique est fondée sur la spectroscopie des ondes évanescentes, notamment sur la résonance plasmonique de surface.

28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisée en ce que le dispositif utilisé à l'étape b) permet le passage d'un flux de l'échantillon liquide à la surface de la biopuce, par exemple au moyen de circuits microfluidiques.

29. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications

25 à 28 pour le criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, notamment d'agonistes ou d'antagonistes de ligands de récepteurs membranaires.

30. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications

25 à 28 pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaire à se lier avec son ligand naturel.

31. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications

25 à 28 pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir.

32. Utilisation selon la revendication 31, dans laquelle la toxine à détecter est une toxine botulique ou la toxine tétanique.

33. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications

25 à 28 à la caractérisation des organelles contenus dans un

échantillon, lesdits analytes étant choisis parmi des ligands connus de constituants membranaires d'organelles.

34. Utilisation d'une biopuce selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, - pour le criblage de molécules susceptibles de modifier la quantité d'un constituant membranaire d'un organelle ou de modifier la capacité d'un constituant membranaires à se lier avec son ligand naturel, - pour le criblage de molécules capables de se lier spécifiquement à un constituant membranaire d'un organelle, - pour la caractérisation des organelles contenus dans un échantillon, ou, - pour la détection de toxines dans un échantillon susceptible d'en contenir, notamment de toxine botulique ou tétanique.