WO2013121157A1 - Immunoglobuline chimérique monoclonale anti-hla, procédé et kit mettant en œuvre une telle immunoglobuline chimérique monoclonale - Google Patents

Immunoglobuline chimérique monoclonale anti-hla, procédé et kit mettant en œuvre une telle immunoglobuline chimérique monoclonale Download PDF

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monoclonal
hla
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Antoine BLANCHER
Nicolas CONGY
Jean-Gérard TIRABY
Daniel Drocourt
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Université Paul Sabatier Toulouse Iii
Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse
Cayla
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Definitions

  • the invention relates to a method for determining the amount of anti-HLA antibody of a liquid medium containing antibodies.
  • the invention also relates to a monoclonal anti-HLA class I or class II anti-HLA monoclonal immunoglobulin for carrying out such a method.
  • the invention relates to such a monoclonal chimeric immunoglobulin adapted to be particularly useful as a standardization reagent for the detection and quantification of anti-HLA antibodies in a liquid medium, particularly a biological fluid medium.
  • the invention particularly relates to such a monoclonal chimeric immunoglobulin having on the one hand the function of a monoclonal antibody and on the other hand a chimeric structure.
  • the invention also relates to a standardized method for detecting anti-HLA antibodies in a liquid medium and a method for quantifying anti-HLA antibodies in a liquid medium in which such a monoclonal chimeric immunoglobulin is used.
  • the invention relates to such a method of quantifying the anti-HLA antibodies of the serum of a patient - particularly a patient grafted or waiting for a graft.
  • the invention further relates to a diagnostic kit for implementing such a method.
  • the invention relates to such a method and such a diagnostic kit adapted to allow quantification of the anti-HLA antibodies of a liquid medium-in particular a biological fluid taken from a patient- that is accurate, reliable and fast .
  • HLA Human Leucocyte Antigen
  • HLA antigens are carried by two types of membrane proteins that are highly immunogenic: HLA class I molecules and HLA class II molecules.
  • HLA alloantigens i.e. foreign antigens and distinct from his own, may lead to the development of an immune response against these antigens.
  • This immune response can be cell-mediated (allo-reactive T cells) or humoral (anti-HLA antibody synthesis).
  • HLA antigens are encoded by three HLA-A, HLA-B and HLA-C genes whose polymorphism is responsible for the three sets of HLA-A, HLA-B and HLA-C alleles, respectively.
  • HLA class II antigens are encoded by the HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR genes.
  • the technique known as "complement-dependent micro-lymphocytotoxicity” is known.
  • This technique consists in presenting the serum of a patient - especially a transplant recipient - to a series of cells whose HLA typing is known in the presence of rabbit complement. If antibodies (Ac) specific for the HLA antigens carried by these cells are present in the test serum, and if these antibodies are capable of activating the complement (IgM class and IgG-1 and IgG-3 subclass antibodies) Complement-dependent cell lysis (CDC, Complement Depends Cytotoxycity) reveals the presence of antibodies. Thanks to a panel of cells expressing different HLA antigens, it is possible to detect antibodies and identify their specificity (s).
  • This reference technique makes it possible to detect the anti-HLA cytolytic antibodies which are the most dangerous for the graft.
  • this technique has low sensitivity compared to newer techniques.
  • This technique which requires either to have a large variety of lymphocytes from donors whose HLA phenotype is known, or to cultivate in vitro a large number of cell lines typed HLA is therefore complex and cumbersome in its implementation.
  • More sensitive techniques are also known, such as the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ("ELISA”), and recently the immunofluorometry technique coupled with flow detection designed on the principle of flow cytometer
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the principle of flow immunorluorometry is the binding of purified HLA class I or HLA class II antigens to the surface of polystyrene beads HLA antibodies which recognize HLA antigens class I or HLA class II, bind to antigens bound to the surface of the beads and are revealed by secondary anti-IgG antibodies coupled to a fluorescent group after washing the polystyrene beads Secondary antibodies are detected by fluorimetry in flow Their fluorescence intensity is further quantified.
  • a plurality of types of beads are used in mixture, each type of bead carrying a plurality of HLA antigens, either class I or class II, on the surface.
  • HLA antigens either class I or class II
  • Such an approach makes it possible to detect the presence of anti-HLA antibodies without, however, allowing the identification of their specificity (s).
  • a plurality of types of beads are used in mixture, each type of bead bearing on the surface a single HLA antigen.
  • Kits for the detection and identification of anti-HLA antibodies are known. They include polystyrene beads coated with class I HLA antigens or class II HLA antigens and polystyrene beads coated with human IgG. Also commercially available is a phycoerythrin-coupled anti-human IgG secondary antibody and a serum free of anti-HLA antibodies as a negative control. Such a negative control is adapted to quantify the nonspecific binding of the secondary antibody on the polystyrene beads.
  • kits do not include any positive control, nor any control of the sensitivity, nor any standard allowing to deduce precisely the concentration of anti-HLA antibodies (expressed, for example, in mole / L or in g / L) in the medium analyzed. from the measured fluorescence intensity.
  • kits devoid of calibration and / or sensitivity indicators do not make it possible to determine the sensitivity threshold of the analysis method, ie the minimum value of the signal making it possible to affirm that the signal observed is significantly greater than the background noise of the measurement.
  • the immunology and histocompatibility laboratories use, as a positive control, a mixture of several sera of several immunized individuals. against several HLA antigens.
  • the respective concentration of each antibody of the sera of the immunized individuals is unknown.
  • a serum mixture does not correlate the intensity of the fluorescence measurement with a concentration (mol / L or g / L) of a specific antibody of the mixture of sera. It does not therefore make it possible to quantify the antibodies present in the serum of the patient grafted or waiting for a transplant. It also does not allow to assess the real risks of the occurrence of a hyper-acute humoral response.
  • the reactivity of such a mixture of sera is variable from one antigen to another and their use does not make it possible to set the detection limit for each HLA antigen studied.
  • such a mixture of polyclonal antibodies from patient sera is available in limited quantities and is rapidly depleted. It must therefore be replaced by another mixture also available in variable quantity that does not allow exchanges of said mixture between laboratories for standardization of results.
  • the variability of serum mixtures from one batch to another requires frequent validation of these batches which are neither comparable nor reproducible from one batch to another.
  • the average value of the fluorescence intensity measured on all the polystyrene beads has a dispersion (calculated by its standard deviation) which does not allow to quantify the anti-HLA antibodies of the liquid medium.
  • a dispersion is presented in FIG. 4 (hatched histograms) of the present patent application given by way of illustration of a standard of the prior art.
  • Such a dispersion of the fluorescence intensity measurements does not make it possible, particularly for the low values of fluorescence intensity, to distinguish a low value of fluorescence intensity but reflecting the presence of a low concentration of anti-fluorescent antibody.
  • HLA a low value of fluorescence intensity that can not be distinguished from the background noise of the measurement.
  • the invention aims to overcome these drawbacks by proposing a monoclonal chimeric immunoglobulin as a reagent for standardization and positive control and sensitivity in the serological analysis of anti-HLA class I antibodies or anti-HLA class II antibodies-especially in the context of organ transplantation.
  • the invention aims to overcome the disadvantages mentioned above by proposing a monoclonal chimeric immunoglobulin adapted to allow reliable quantification of anti-HLA antibodies in the serum of a patient.
  • a monoclonal chimeric immunoglobulin is particularly adapted to allow the detection of the occurrence in a patient of antibodies directed against graft antigens, even for a very low concentration of this antibody.
  • the aim of the invention is to provide a monoclonal chimeric immunoglobulin adapted for the standardization of anti-HLA antibody detection methods.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention enables the biologist to validate the antibody detection method.
  • the object of the invention is to propose a monoclonal chimeric immunoglobulin adapted to allow the earliest possible detection of the occurrence of anti-HLA antibodies directed against the HLA antigens of the graft.
  • Such early detection makes it possible in particular to detect as quickly as possible the humoral rejection and thus to rapidly prescribe the curative treatment of rejection of the transplanted organ.
  • the aim of the invention is to propose such a monoclonal chimeric immunoglobulin which makes it possible to standardize and calibrate methods for the detection of anti-HLA antibodies in a biological fluid.
  • the invention also aims at providing such a monoclonal chimeric immunoglobulin capable of enabling the accreditation of a standardized method for screening, quantifying and characterizing anti-HLA antibodies according to the new regulatory standards for laboratory accreditation.
  • medical analysis In France, the analysis laboratories - especially medical immunology - must comply with the standard 15189 of COFRAC (French Accreditation Committee).
  • the invention also aims at providing a composition of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin as a quantitative calibration reagent in the tests for detection of anti-HLA antibodies, in particular by immunofluorimetry.
  • the invention aims in particular to provide such a composition of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin as quantification standard in anti-HLA antibody screening tests by technology "Luminex ®”.
  • the invention also aims at providing such a composition of at least one chimeric immunoglobulin as a quantitative standard in the tests for detection of anti-HLA antibodies by flow cytometry, by the ELISA technique or the complement-dependent micro-lymphocytotoxicity.
  • the object of the invention is therefore to propose such a monoclonal chimeric immunoglobulin and such a composition of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin to be used as a quantitative standard in place of a complex mixture of antibodies derived from the mixture of one or more sera of patients.
  • the invention also aims to provide such a monoclonal chimeric immunoglobulin which is available in large quantities and whose production is perfectly standardized in terms of anti-HLA antibody concentration and in terms of composition.
  • the invention also aims at providing a stable aqueous solution of such a monoclonal chimeric immunoglobulin whose concentration of monoclonal chimeric immunoglobulin is perfectly known for the standardization of a method of screening and / or quantification and / or characterization of anti-HLA antibodies from a liquid medium.
  • the invention relates to a method for determining the amount of anti-HLA antibody of a liquid medium containing antibodies, in which:
  • each solution (S n ) is placed in contact with the same determined quantity of at least one immobilized HLA antigen, and;
  • a calibration curve is constructed in which each value (C n ) of determined concentration is associated with a measured value (V n ) of a parameter, said measured value (V n ) being representative of a quantity (Q n ) monoclonal chimeric immunoglobulin bound to the determined amount of each immobilized HLA antigen;
  • a value, called the threshold value, of the parameter beyond which the concentration of monoclonal chimeric immunoglobulin is significantly greater than 0 is calculated;
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin is formed from:
  • heavy chains of molecular weight between 40 kDa and 60 kDa, and of;
  • L chains two polypeptide chains, called light (L) chains, of molecular weight between 20 kDa and 30 kDa;
  • each heavy chain (H) comprises:
  • V H variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for mono-morphic epitopes of class I HLA antigens and monoclonal antibodies specific for mono-morphic epitopes of HLA class II antigens, and;
  • C H a constant region (C H ) of a heavy chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgG and IgM;
  • each light (L) chain includes:
  • V L light chain variable region of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the class I HLA antigens and monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the antigens HLA class II, and;
  • C L a constant region (C L ) of a light chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of Kappa chains and Lambda chains.
  • HLA class I antigen and “HLA class II antigen” (HLA for "Human Leucocyte Antigen”) refer to antigens that are human in nature.
  • the invention therefore also consists in proposing a method for the in vitro quantification of anti-HLA antibodies in which a calibration curve is produced from a solution of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention, said immunoglobulin monoclonal chimeric having a known concentration in said solution.
  • the parameter is chosen from the group consisting of fluorescence parameters, luminescence parameters and colorimetric parameters.
  • the concentration (C x ) determined in monoclonal chimeric immunoglobulin is at most equal to 10 ⁇ 4 g / mL, in particular between 10 ⁇ 10 g / mL and 10 4 g / mL. Any concentration lower than 10 4 g / ml can be obtained by diluting a solution of high concentration, in particular of the order of 10 4 g / ml.
  • solutions (S n ) of monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention are used for concentrations known to associate each concentration (C n ) of the solutions (S n ) of monoclonal chimeric immunoglobulin with a value (V n ) measured from a parameter selected from the group consisting of a fluorescence parameter-especially a fluorescence parameter measured by immunoassay quantitative fluorimetry (Luminex ® technique with beads coated with HLA antigens) or by the flow cytometry technique (performed with lymphocytes) -, a luminescence parameter - in particular a chemiluminescence parameter - and a colorimetric parameter.
  • a fluorescence parameter-especially a fluorescence parameter measured by immunoassay quantitative fluorimetry Luminex ® technique with beads coated with HLA antigens
  • flow cytometry technique performed with lymphocytes
  • each monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of the HLA class I antigens and each monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of the HLA class II antigens is chosen in the group consisting of monoclonal antibodies of a vertebrate, in particular monoclonal antibodies of a mammal, in particular mice, rats, rabbits, hamsters and humans, and monoclonal antibodies of a non-mammalian vertebrate, in particular a batrachian, a bird, especially a galliform-.
  • the parameter is chosen from the group consisting of fluorescence parameters, luminescence parameters and colorimetric parameters.
  • the fluorescence parameter is a fluorescence intensity.
  • each value (V n ) of the fluorescence parameter is a fluorescence intensity.
  • each measured value (V n ) of the parameter is measured by a technique chosen from the group consisting of multiplexed quantitative immunofluorimetry, flow cytometry, an immunoenzymatic assay method on a support (ELISA), a competitive binding method and a complement-dependent micro-lymphocytotoxicity method.
  • each immobilized HLA antigen being an HLA antigen immobilized on the surface of particles of a solid support in the divided state formed of particles; b) the immobilized HLA antigens are contacted with each monoclonal chimeric immunoglobulin solution directed against the HLA antigens of the solid support under conditions adapted to form a stable bond between the HLA antigens of the solid support and the monoclonal chimeric immunoglobulin of each monoclonal chimeric immunoglobulin solution, then;
  • the monoclonal immunoglobulins bound to the HLA antigens of the solid support are contacted with a solution of a secondary antibody selected from the group consisting of fluorescent secondary antibodies, luminescent secondary antibodies and photoabsorbable secondary antibodies and directed against the immunoglobulin monoclonal chimeric, under conditions adapted to form a stable bond between the monoclonal chimeric immunoglobulin and the secondary antibody, then; e) the secondary antibody not bound to the monoclonal chimeric immunoglobulin is washed out, and then;
  • V n a measured value of said parameter selected from the group consisting of a fluorescence parameter -particularly of a fluorescence parameter measured by immuno-fluorimetry (Luminex technique with beads coated with HLA antigens) or by the flow cytometry technique (performed with lymphocytes) -, a luminescence parameter - in particular a chemiluminescence parameter - and a colorimetric parameter, then;
  • each immobilized HLA antigen is an HLA antigen presented on the surface of at least one cell - in particular a cell in vitro culture.
  • each immobilized HLA antigen being an HLA antigen presented on the surface of at least one cell
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin bound to the HLA antigens of the cell (s) is contacted with a solution of a secondary antibody directed against the monoclonal chimeric immunoglobulin, under conditions adapted to form a stable link between the monoclonal chimeric immunoglobulin and the secondary antibody, then; m) the secondary antibody not bound to the monoclonal chimeric immunoglobulin is washed out and then; n) at least one parameter of the secondary antibody bound to each cell is measured and this measurement is assigned a measured value (V n ) of said parameter selected from the group consisting of a fluorescence parameter-in particular a parameter of fluorescence measured by quantitative immuno-fluorimetry (technical Luminex ® with beads coated with HLA antigens) or by flow cytometry technique (performed with lymphocytes) -, a luminescence-especially setting of a parameter of chemiluminescence - and a colorimetric parameter, then;
  • the solid support in the divided state is in the form of particles of substantially spherical shape and of suitable size to allow their analysis by flow fluorimetry.
  • the calibration curve is determined by nonlinear regression from the fluorescence intensity measurements.
  • the liquid medium is chosen from the group consisting of biological fluids - in particular a serum - taken from an individual.
  • the individual is a patient selected from the group consisting of patients waiting for a transplant and transplant patients.
  • the monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of HLA class I antigens is the W6 / 32 antibody.
  • the monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of HLA class II antigens is the F3.3 antibody.
  • the invention also relates to the use of a monoclonal chimeric immunoglobulin in a screening method - in particular a method of detection or a method for identifying or quantifying anti-HLA antibodies chosen from the group consisting of immunoassay methods. multiplexed quantitative fluorometry, flow cytometric methods, solid-enzyme immunoassay methods (ELISA) and complement-dependent micro-lymphocytotoxicity methods.
  • the invention is directed to the use of a monoclonal chimeric immunoglobulin as a standardization and positive control and sensitivity reagent in an anti-HLA antibody screening or quantification method selected from the group consisting of multiplexed quantitative immunofluorimetry, flow cytometric methods, solid-enzyme immunoassay methods and complement-dependent micro-lymphocytotoxicity methods, characterized in that said monoclonal chimeric immunoglobulin is formed of:
  • heavy chains of molecular weight between 40 kDa and 60 kDa, and of;
  • L chains two polypeptide chains, called light (L) chains, of molecular weight between 20 kDa and 30 kDa;
  • each heavy chain (H) comprises:
  • V H variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of HLA class I antigens and of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the antigens HLA class II, and;
  • C H a constant region (C H ) of a heavy chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgG and IgM;
  • each light (L) chain includes: o a light chain variable (V L ) region of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the class I HLA antigens and monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the antigens HLA class II, and;
  • C L a constant region (C L ) of a light chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of Kappa chains and Lambda chains.
  • a monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention is used in which the constant parts (C H ) of the heavy chains and the constant parts (C L ) of the light chains consist of the constant parts of a human IgA in competition tests.
  • Such IgA monoclonal chimeric immunoglobulins according to the invention are suitable for at least partially inhibiting the binding of anti-HLA class IgG (or IgM) polyclonal antibodies present in the serum of the patients.
  • Inhibition of serum IgG uptake by IgA-class monoclonal chimeric immunoglobulins according to the invention makes it possible to demonstrate the specificity of IgG binding on the immunoadsorbent supports used in anti-HLA antibody screening tests. by quantitative multiplexed immunoassay with fluorimetric reading device on stream "Luminex ®" by flow cytometry, by ELIS A techniques, and the dependent micro lymphocytotoxic complaint complement.
  • IgA-class monoclonal chimeric immunoglobulins make it possible to differentiate a specific signal corresponding to the real presence of anti-HLA IgG in the serum, with respect to a non-specific signal corresponding to the adsorption of IgG on the carrier presenting the HLA antigens.
  • This competition chimeric monoclonal immunoglobulin IgA according to the invention to research anti-HLA IgG was demonstrated by quantitative immunoassay fluorimetry on Luminex ®.
  • the IgG and IgM class monoclonal chimeric immunoglobulins according to the invention can be used as positive controls and sensitivity controls of the direct compatibility test (cross- match) between a recipient and an organ donor performed just prior to the organ transplant by any suitable technique (complement-dependent micro-lymphocytotoxicity or flow cytometry) and in any technique for detecting IgG or IgM class antibodies an immunoabsorbent carrier (ELISA or quantitative immunofluorimetry on a polystyrene ball).
  • the invention also relates to a monoclonal chimeric immunoglobulin specific for HLA class I antigens comprising:
  • heavy chains of molecular weight between 40 kDa and 60 kDa, and of;
  • L chains two polypeptide chains, called light (L) chains, of molecular weight between 20 kDa and 30 kDa;
  • each heavy chain (H) comprises:
  • V H variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of HLA class I antigens, and;
  • C H a constant region (C H ) of a heavy chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgG and IgM;
  • each light (L) chain includes:
  • variable region (V L ) of a light chain of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the class HLA antigens, and;
  • C L a constant region (C L ) of a light chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of Kappa chains and Lambda chains.
  • a monoclonal antibody specific for a mono-morphic epitope of class I HLA antigens is designed to recognize an epitope common to all HLA class I antigens.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin specific for class I HLA antigens is chosen from the group formed:
  • monoclonal chimeric immunoglobulins comprising at least one light chain of sequence SEQ ID_NO 1, and:
  • monoclonal chimeric immunoglobulins comprising at least one heavy chain chosen from the group consisting of heavy chains of sequence SEQ ID_NO 2, heavy chains of sequence SEQ ID_NO 3 and heavy chains of sequence SEQ ID_NO 4.
  • the invention also relates to a monoclonal chimeric immunoglobulin specific for HLA class II antigens formed of:
  • heavy chains of molecular weight between 40 kDa and 60 kDa, and of;
  • L chains two polypeptide chains, called light (L) chains, of molecular weight between 20 kDa and 30 kDa;
  • monoclonal chimeric immunoglobulins comprising at least one light chain of sequence SEQ ID NO 5, and
  • monoclonal chimeric immunoglobulins comprising at least one heavy chain chosen from the group consisting of heavy chains of sequence SEQ ID NO 6, heavy chains of sequence SEQ ID NO 7 and heavy chains of sequence SEQ ID NO 8.
  • a monoclonal antibody specific for a mono-morphic epitope of class II anti-HLA antigens is designed to recognize an epitope common to substantially all HLA class II antigens.
  • a monoclonal chimeric immunoglobulin specific for class I or class II HLA antigens denotes an immunoglobulin in which:
  • o heavy chains and light chains are human in nature in their constant parts.
  • the constant parts of the strings heavy are selected from the group consisting of constant IgA heavy chain parts, IgG heavy chain constant parts and IgM heavy chain constant parts and the light chain constant portions are selected from the group consisting of group formed of Kappa chains and Lambda chains, and;
  • variable parts of the light and heavy chains are selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for mono-morphic epitopes of HLA class I antigens and monoclonal antibodies specific for mono-morphic epitopes of HLA class II antigens.
  • the constant parts (C H ) of the heavy chains of the human antibody and the constant parts (C L ) of the light chains of the human antibody together represent of the order of 60% by weight of ⁇ monoclonal chimeric immunoglobulin.
  • a monoclonal chimeric immunoglobulin is a monoclonal antibody, that is to say specific for a single mono-morphic epitope.
  • each monoclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies of a vertebrate organism - in particular of a non-human vertebrate organism - specific for mono-morphic epitopes of class I HLA antigens and monoclonal antibodies of a vertebrate organism. -especially of a non-human vertebrate organism-specific mono-morphic epitopes of HLA class II antigens.
  • non-human vertebrate organism means an organized living being superior to the exclusion of man.
  • a vertebrate organism is in particular provided with an immune system.
  • Such a vertebrate organism is in particular chosen from the group consisting of non-human mammals - in particular mice, rats, rabbits and hamsters - amphibians and birds - in particular galliformes.
  • Such non-human vertebrate organisms are in particular laboratory animals.
  • such a monoclonal antibody can be selected from the group consisting of human monoclonal antibodies.
  • each monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of the class I HLA antigens and each monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of the class II HLA antigens is chosen from the group consisting of the monoclonal antibodies of a vertebrate, in particular monoclonal antibodies of a mammal, in particular mice, rats, rabbits, hamsters and humans, and monoclonal antibodies of a non-mammalian vertebrate, particularly a batrachian, a bird, especially a galliform-.
  • the monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of HLA class I antigens is the W6 / 32 antibody.
  • the monoclonal antibody specific for the mono-morphic epitopes of HLA class II antigens is the F3.3 antibody.
  • the invention is further directed to a stable solution of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention in an aqueous composition.
  • the invention also relates to such an aqueous solution of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention, said aqueous solution having a predetermined concentration of said monoclonal chimeric immunoglobulin.
  • the invention also relates to such a monoclonal chimeric immunoglobulin adapted to allow a determination of the amount of anti-HLA antibody of a liquid medium containing antibodies.
  • the invention also extends to a kit for the in vitro quantification of anti-HLA antibodies of a liquid medium, said kit comprising a predetermined quantity of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention and an explanatory note for the implementation of a method according to the invention.
  • the invention aims at an in vitro quantification kit of anti-HLA antibodies of a liquid medium, said kit comprising a quantity predetermined one of at least one monoclonal chimeric immunoglobulin comprising:
  • heavy chains of molecular weight between 40 kDa and 60 kDa, and of;
  • L chains two polypeptide chains, called light (L) chains, of molecular weight between 20 kDa and 30 kDa;
  • each heavy chain (H) comprises:
  • V H variable region of a heavy chain of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of HLA class I antigens and of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the antigens HLA class II, and;
  • C H a constant region (C H ) of a heavy chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgG and IgM;
  • each light (L) chain includes:
  • V L light chain variable region of a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the class I HLA antigens and monoclonal antibodies specific for the mono-morphic epitopes of the antigens HLA class II, and;
  • C L a constant region (C L ) of a light chain of a human immunoglobulin selected from the group consisting of Kappa chains and Lambda chains;
  • kit also comprising an explanatory note for the implementation of a method according to the invention.
  • the invention also relates to a method for determining the amount of anti-HLA antibody in a liquid medium containing antibodies, a monoclonal chimeric immunoglobulin, its use and a kit for this purpose. determination, characterized in combination by all or some of the features mentioned above or hereafter.
  • FIG. 1 is a graphical representation of the temporal variation of the fluorescence intensity of 17 types of beads treated according to a negative control
  • FIG. 2 is a graphical representation of the variation of the fluorescence intensity of 12 types of beads bearing class I HLA antigens of a positive control according to the state of the art as a function of time;
  • FIG. 3 is a graphical representation of the variation of the fluorescence intensity of 5 types of HLA class II beads of a positive control according to the state of the art as a function of time;
  • FIG. 4 is a comparative histogram representation of the fluorescence intensity of a positive control according to the state of the art and of a positive control according to the invention, in which;
  • FIG. 4A is a histogram representation of the fluorescence intensity measured on 12 types of HLA class I beads treated with a positive control according to the state of the art (hatched histogram) and with a positive control according to FIG. invention (solid histogram);
  • FIG. 4B is a histogram representation of the fluorescence intensity measured on 5 types of HLA class II beads treated with a positive control according to the state of the art (hatched histogram) and with a positive control according to the invention. (full histogram);
  • FIG. 5 is a flow cytometric analysis of the binding of class I and class II chimeric monoclonal immunoglobulins according to the invention to T lymphocytes and B lymphocytes;
  • FIG. 6A is a graphical representation of 12 superimposed dose / response curves corresponding to 12 types of HLA class I beads treated with a positive control according to the invention.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration according to the invention is expressed in ⁇ g / ml;
  • FIG. 6B is a graphical representation of the average dose / response curve of 12 types of HLA class I beads treated with a positive control according to the invention corresponding to FIG. 6A.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration according to the invention is expressed in ⁇ g / ml;
  • FIG. 7A is a graphical representation of 5 superimposed dose / response curves corresponding to 5 types of HLA class II beads treated with a positive control according to the invention.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration according to the invention is expressed in ⁇ g / ml;
  • FIG. 7B is a graphical representation of the average dose / response curve of the 5 types of HLA class II beads treated with a positive control according to the invention corresponding to FIG. 7A.
  • the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration according to the invention is expressed in ⁇ g / ml;
  • FIG. 8A is a comparative graphical representation of the dose / response curve of a monoclonal anti-HLA class I chimeric immunoglobulin according to the invention stored in a saline buffer (white square) and preserved in a solution of human albumin at 60 g / L (black diamond);
  • FIG. 8B is a comparative graphical representation of the dose / response curve of a monoclonal anti-HLA class II chimeric immunoglobulin according to the invention preserved in a saline buffer (white square) and preserved in a solution of human albumin at 60 g / L (black diamond);
  • FIG. 9 is a representation of the peptide sequence of the monoclonal anti-HLA class I chimeric immunoglobulin light chain (Hu-IgG1K [W6 / 32]) and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 1;
  • FIG. 10 is a representation of the peptide sequence of the Hu-IgG1 K [W6 / 32] monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 2;
  • FIG. 11 is a representation of the peptide sequence of the monoclonal Hu-Hu chimeric immunoglobulin heavy chain.
  • IgA2 K [W6 / 32] and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 3;
  • FIG. 12 is a representation of the peptide sequence of the Hu-IgM K monoclonal immunoglobulin heavy chain [W6 / 32] and corresponds to the sequence SEQ ID NO 4;
  • FIG. 13 is a representation of the peptide sequence of the monoclonal Hu-IgG1 K [F3.3] chimeric immunoglobulin light chain and corresponds to the sequence SEQ ID NO 5;
  • FIG. 14 is a representation of the peptide sequence of the Hu-IgA2 K [F3.3] monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 6;
  • FIG. 15 is a representation of the peptide sequence of the Hu-IgG1 K [F3.3] monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 7;
  • FIG. 16 is a representation of the peptide sequence of the Hu monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain.
  • IgM K [F3.3] and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 8.
  • EXAMPLE 1 Obtaining an IgG / anti-HLA class I monoclonal chimeric immunoglobulin (Hu-IgG1 K [W6 / 32]) according to the invention.
  • the W6 / 32 antibody has been described for the first time in Barnstable et al. in 1978 (Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A., 1978, Celle, 14 (1), 9-20. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, H LA and other human cell surface antigen-new tools for genetic analysis).
  • This antibody is secreted by a mouse hybridoma derived from the fusion of cells of a mouse myeloma line (P3-NSI / lAg4-l non-secretory mouse immunoglobulin line) with the lymphocytes of a mouse immunized against human cells.
  • HLA-A HLA class I molecules
  • HLA-B HLA-C
  • the epitope recognized is a conformational epitope that depends on the association between the class I alpha heavy chain and microglobulin beta 2.
  • the epitope requires the presence of an arginine at position 3 of beta-2-microglobulin and a lysine at position 121 of the alpha chain (Ladasky JJ, Shum BP, Canavez F, Seuner HN, Parham P., (1999), Immunogenetics, 49 (4), 312-320.) Residue 3 of beta2-microglobulin affects the class I MHC molecules by the W6 / 32 antibody).
  • the transcripts encoding the heavy chain and the light chain of the W6 / 32 antibody were cloned and sequenced.
  • the DNA copy of the mRNA (cDNA) of the heavy chain was amplified by PCR using two primers, one specific for the leader peptide coding region ("leader peptide"), the other targeting part 5 which encodes the CH1 domain of the constant part.
  • a primer targeting the exon of the leader peptide and a primer targeting the 5 'part of the Kappa C domain were used.
  • the cDNA fragments of both chains were cloned in E. coli.
  • the cloned fragments were sequenced.
  • the alignment of the sequences made it possible to establish the consensus of the cDNAs of the heavy chain and the light chain with an identity threshold of 98%.
  • the regions encoding the variable parts were determined by comparison with the sequences present in the IMGT ® database ( "International Immunogenetics Information System").
  • Sequences encoding a light chain primer or heavy chain peptide as appropriate were added at 5 'and the 3' sequences were modified to create a BsiWI restriction site for the light chain DNA and a Nhel restriction site for the heavy chain. These restriction sites are adapted to allow insertion of these nucleic sequences into the cloning vectors pFUSE-CLIg and pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France).
  • the sequences thus defined were synthesized and then cloned in expression vectors comprising either the part coding the constant domain of the chain Human kappa (Km 01 allotype, Genbank accession number: J00241) is the constant part of human IgG1.
  • the restriction site of the expression vector for inserting cDNAs of the variable portions in phase with the regions encoding the constant portions of the immunoglobulin chains.
  • Two expression vectors one encoding a chimeric light chain associating the variable part of the light chain of the W6 / 32 antibody and the human Kappa C domain (VL chain [W6 / 32] -C human Kappa), the other associating the variable part of the heavy chain of the W6 / 32 antibody and the human C gamma 1 domain (human VL [W6 / 32] -Gammal) were thus obtained.
  • Producing clones thus revealed were subjected to a plurality of limiting dilution cloning cycles in order to recruit the clones most effective in the secretion of chimeric IgG1 Kappa, hereinafter referred to as Hu-IgG1K [W6 / 32].
  • the Hu-IgGl K [W6 / 32] secreted into the culture supernatant of transfected CHO cells were purified by elution on capture-staphylococcal protein A linked to Sepharose beads ®.
  • the Kappa IgG1 were eluted at acidic pH in glycine buffer at pH 2.
  • the eluate was buffered extemporaneously with an aqueous solution of di-sodium phosphate at a concentration of 750 mM.
  • Hu-IgG1 K [W6 / 32] solutions are stored at 4 ° C or -80 ° C.
  • the peptide sequence of the chimeric monoclonal immunoglobulin light chain (IgG1-anti-HLA class I) Hu-IgG1K [W6 / 32] is represented in FIG. 9 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 1.
  • the peptide sequence of the monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain (IgG1-anti-HLA class I) Hu-IgG1 K [W6 / 32] is represented in FIG. 10 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 2.
  • T lymphocytes or on density gradient separated B lymphocytes from human blood taken from EDTA tube.
  • the cells were labeled with anti-CD3, anti-CD19 and anti-CD45 antibodies.
  • T cells (CD3 +) and B (CD19 +) are defined among the population of CD45 + lymphocytes.
  • IgG1K [W6 / 32] in the presence of human mononuclear cells (T lymphocytes or B lymphocytes) of the peripheral blood, then three successive washes of said human mononuclear cells are carried out followed by three washes in phosphate buffered saline (PBS). Fastening of monoclonal chimeric immunoglobulins fixed on human mononuclear cells with human goat anti-Fcy antibodies is disclosed. The results are shown in FIG. 5 and indicate that the Hu-IgG1 K antibody [W6 / 32] binds to the B lymphocytes (FIG. 5A) and to the T lymphocytes (FIG. 5C) whereas the Hu-IgG1 K antibody [F3.3] binds to B cells ( Figure 5B) and not to T cells ( Figure 5D).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Hu-IgG1 K [W6 / 32] monoclonal chimeric immunoglobulins was then determined by a multiplexed quantitative fluorimetric technique using commercial kits dispensed by One Lambda ® . This determination is based on an indirect immunofluorescence reaction and uses latex beads coated with HLA antigen from various groups. Antibodies capable of recognizing the HLA antigens present on the latex beads are revealed by phycoerythrin-coupled human anti-IgG antibodies. The fluorescence is quantified on each bead by flow cytometry on a Luminex ® device.
  • a specific fluorescent marking of each type of beads makes it possible to put into play several varieties of beads (recognizable by their fluorescence), each ball being coated with a given mixture of HLA antigens. This makes it possible to demonstrate that all the class I beads are recognized with substantially the same intensity (FIG. 4A, class I beads). This allows us to conclude that monoclonal immunoglobulin Hu-IgG1 K [W6 / 32] recognizes a public epitope present on all HLA class I molecules.
  • EXAMPLE 3 Obtaining chimeric monoclonal anti-HLA antibodies of class I IgA2 and IgM isotype (Hu-IgA2 K [W6 / 32] and Hu-IgM K [W6 / 32]) according to the invention.
  • variable part of the heavy chain W6 / 32 (VH [W6 / 32]) has been cloned into two other expression vectors, the first of which makes it possible to produce chimeric mu chains (variable part of W6 / 32 and constant part of the chain heavy human mu (Genbank accession number: AY510104.1), the other chimeric alpha 2 chains (variable part of W6 / 32 and constant part of the human alpha 2 heavy chain, A2m (l) allotype (No.
  • Genbank access J00221) These two vectors were used to transfect cells of the CHO line previously transfected with the vector allowing the expression of the human VL chimeric light chain [W6 / 32] -K, thus isolating a clone.
  • chimeric IgA was purified on a agarose coupled to peptide M (Inv ivoGen, Toulouse, France) and the chimeric IgM were purified on an agarose support coupled to the L protein (InvivoGen,ière, France) according to the supplier's recommendations.
  • the peptide sequence of the monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain (IgA2-anti-HLA class I) Hu-IgA2 K [W6 / 32] is represented in FIG. 11 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 3.
  • the peptide sequence of the heavy chain of the monoclonal chimeric immunoglobulin (IgM-anti-HLA class I) is represented in FIG. 12 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 4.
  • the method for obtaining a class II anti-HLA monoclonal antibody is comparable to the method for obtaining a class I anti-HLA monoclonal antibody (W6 / 32).
  • the F3.3 antibody (Elsasser, D., Valerius, T., Repp, R., Weiner, GJ, Deo, Y., Kalden, JR, van de Winkel, JG, Stevenson, GT, Glennie, MJ and Gramatzki , M., (1996), Blood, 87 (9), 3803-3812.
  • HLA class II as potential target antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies in combination with granulocyte colony-stimulating factor
  • the F3.3 antibody recognizes at least one public epitope present on the surface of all human cells expressing HLA class II molecules.
  • the F3.3 antibody recognizes all the DR antigens, all the DP antigens and all the antigens of the DQ2 group.
  • the complete coding sequences of the variable parts of the antibody F3.3 are available on GenBank ® (accession numbers: AY058910 [NAV] to the light chain and AY058911 [VH] for the heavy chain).
  • variable parts were synthesized and cloned in phase in the cloning vectors pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France) for the heavy chains and pFUSE-CLIg (InvivoGen, Toulouse, France) for the light chains.
  • the vector (pFUSE-CHIg) allows the production of the chimeric heavy chain VH [F3.3] -C human gamma 1 and the vector (pFUSE-CLIg) allows the production of the light chain VL [F3.3] -C Kappa human.
  • pFUSE-CHIg allows the production of the chimeric heavy chain VH [F3.3] -C human gamma 1
  • pFUSE-CLIg allows the production of the light chain VL [F3.3] -C Kappa human.
  • variable part VH [F3.3] was cloned into expression vectors allowing the production of VH [F3.3] -C human and human VH [F3.3] -C alpha 2 human chimeric heavy chains. .
  • the peptide sequence of the anti-HLA class II monoclonal chimeric immunoglobulin light chain (Hu-IgG1 K [F3.3]) is represented in FIG. 13 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 5.
  • the peptide sequence of the anti-HLA class II monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain (Hu-IgA2K [F3.3]) is represented in FIG. 14 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 6.
  • the peptide sequence of the anti-HLA class II monoclonal chimeric immunoglobulin heavy chain (Hu-IgG1 K [F3.3]) is represented in FIG. 15 and corresponds to the sequence SEQ ID NO 7.
  • Monoclonal immunoglobulin anti-HLA class II (Hu-IgM K [F3.3]) is represented in FIG. 16 and corresponds to the sequence SEQ ID_NO 8.
  • Hu-IgG1 K [F3.3], Hu-IgA2 K [F3.3] and Hu-IgM K [F3.3] directed against HLA class II antigens were produced by CHO cells transfected with the appropriate vectors.
  • the chimeric IgG1 were purified on Protein A Sepharose.
  • the chimeric IgA were purified on M-agarose peptide (InvivoGen,ière, France).
  • the chimeric IgMs were purified on L-agarose protein (InvivoGen, Toulouse, France).
  • the specificity of the monoclonal Hu-IgG1 K [F3.3] monoclonal immunoglobulin binding according to the invention is verified by an indirect immunofluorescence technique by flow cytometry on human mononuclear cells as described in Example 1.
  • the results are presented in FIG. 5 and indicate that the Hu-IgG1 K [F3.3] antibody according to the invention strongly reacts against human cells, in particular with B lymphocytes (FIG. 5B) and with T lymphocytes (FIG. 5D).
  • the Hu-IgG1 K [F3.3] antibody was fixed on all beads carrying the Labscreen mixed ® HLA class II antigens and all the beads carrying the HLA-DR, HLA-DP and HLA-HLA antigens. DQ2 Labscreen single antigen class II ® kit.
  • HLA-A HLA-A, HLA-B and HLA-C
  • HLA-A purified HLA class I antigens
  • HLA-DR HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP
  • polystyrene beads called positive control beads, linked to IgGs; - Polystyrene beads, called negative control beads, free of surface antigen.
  • a lab kit comprises an aqueous suspension of polystyrene beads for screening class I anti-HLA antibodies and class II anti-HLA antibodies.
  • the polystyrene beads of this suspension comprise a plurality of types of polystyrene beads, each type of polystyrene ball being differentiated from other types of polystyrene beads by means of a fluorescent marker and comprising polystyrene beads carrying HLA antigens. class I and HLA class II antigen.
  • each type of polystyrene bead has on the surface polystyrene beads up to six HLA-A antigens (class I), six HLA-B antigens (class I), six HLA-C antigens (class I), or six HLA-DQ antigens (class II), six HLA-DR antigens (class II), six HLA-DP antigens (class II).
  • the laboratory kit (Labscreen mixed ® ) includes 12 types of Class I polystyrene beads and 5 types of Class II beads whose fluorescence intensity of each of the 17 types of polystyrene beads can be measured simultaneously. Thus, the average of the fluorescence intensity of each of the types of polystyrene beads bound to the same set of HLA antigens is calculated. Within this mixture of polystyrene beads, some are free of HLA class I antigen and HLA class II antigen and serve as a negative control.
  • Labscreen mixed ® also requires a negative control serum (LabScreen Negative Control (LSNC) serum) during the anti-HLA antibody test.
  • This serum is characterized by the manufacturer as being devoid of class I anti-HLA antibodies and class II anti-HLA antibodies.
  • the laboratory kit includes, as a positive control, polystyrene beads on the surface of which are grafted purified human IgG. Such a positive control is limited in its use in verifying the functionality of the secondary antibody. Such a positive control does not allow the conversion of a fluorescence intensity value to an anti-HLA antibody concentration value in a liquid medium. Positive polyclonal control
  • kits in particular the immunology laboratories - recommend using, as a positive control during the detection of anti-HLA antibodies in vitro according to the state of the art, a mixture of sera from polyimmunized individuals against HLA antigens.
  • a mixture of sera from polyimmunized individuals against HLA antigens By way of example, the average values of the fluorescence intensity measured over a period of 5 months associated with each type of HLA class I and class II beads of this polyclonal control are given in Table 2 below.
  • the calculated value of the average fluorescence measured on the HLA class I beads treated with a qualitative control according to the state of the The technique is of the order of 5,200 fluorescence units and the standard deviation is of the order of 4900 fluorescence units.
  • the calculated value of the average fluorescence measured on HLA class II beads treated with a qualitative control according to the state of the art is of the order of 8600 fluorescence units and the standard deviation is of the order of 7500 units. fluorescence.
  • the fluorescence intensity of each of the polystyrene bead types of the qualitative control varies between 1000 and 20000.
  • Such a variability of the response of each of the types of polystyrene beads does not make it possible to define a single curve for converting the fluorescence intensity measured into a concentration of reference anti-HLA antibodies.
  • such a conversion curve of the measured fluorescence intensity can not be obtained, given that the concentration of HLA antibody specific for each of the types of HLA antigen can not be determined in the qualitative control of the state of the art.
  • an analysis of the fluorescence of each type of polystyrene bead of the "Labscreen mixed ® " kit shows that the fluorescence associated with each type of ball bearing the a class I antigen (ball type No. 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 and 90 in FIG. 4A) varies between a value of the order of 7000 units average fluorescence and 12,000 units of average fluorescence.
  • the average value of the fluorescence intensities measured on each type of HLA class I ball is of the order of 9600 fluorescence units.
  • the value of the standard deviation of these values is of the order of 3100 fluorescence units.
  • a monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention is used as a quantitative control of the laboratory kit (Labscreen mixed ® ). Solutions of monoclonal anti-HLA class I (Hu-Igl K [W6 / 32]) and / or anti-HLA class II (Hu-Igl K [F3.3]) monoclonal immunoglobulin are prepared as described in Examples 1 to 4 at a known concentration of 2 ⁇ g / mL. An analysis of the average fluorescence intensity associated with each type of polystyrene bead carrying a HLA antigen class I or class II is carried out. The results obtained are presented in FIG. 4 (white histograms).
  • the fluorescence associated with each type of ball bearing a class I antigen (type of ball no. 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 and 90 in FIG. 4 A , solid histograms) is substantially constant and of the order of 22,000 units of average fluorescence.
  • the average value of the fluorescence intensities measured on each type of HLA class I ball is of the order of 21500 fluorescence units.
  • the value of the standard deviation of these values is of the order of 450 fluorescence units;
  • the fluorescence associated with each type of ball bearing a class II antigen is substantially constant and of the order of 22000 units mean fluorescence.
  • the value of the standard deviation of these values is of the order of 700 fluorescence units.
  • This value of fluorescence intensity is substantially constant irrespective of the type of polystyrene ball (whatever the HLA antigen carried by the type of polystyrene ball) and corresponds to an antibody concentration of 2 ⁇ g / ml.
  • Such chimeric monoclonal antibodies according to the invention are adapted to allow a quantitative calibration of the fluorescence response as a function of the concentration of chimeric monoclonal antibodies according to the invention.
  • a range of chimeric monoclonal antibody solutions according to the invention of decreasing chimeric monoclonal antibody concentrations is obtained by successive serial dilutions. Negative and positive controls are treated in the same way in parallel. 20 ⁇ L ⁇ of each of these serial dilutions are dispensed into contact with the polystyrene beads previously placed in the wells of the multi-well plate.
  • Polystyrene bead mixtures and chimeric monoclonal antibodies are incubated at room temperature and protected from light for 30 minutes. At the end, five successive washes of each of the wells are carried out with 250 ⁇ l ⁇ of a washing buffer. Then added 100 uL ⁇ a secondary antibody solution diluted l / 100 th.
  • the secondary antibodies used for the fluorescent labeling of anti-HLA antibodies bound to the polystyrene beads are, for example, goat anti-IgA antibodies coupled to phycoerythrin (anti-IgA-PE, AbSerotec, USA) or goat anti-IgG antibodies coupled to phycoerythrin (anti-IgG-PE, InGen, USA).
  • any other fluorescent group coupled to an antibody capable of recognizing and binding to the constant chains of monoclonal chimeric immunoglobulin according to the invention may be used.
  • the multiwell plates are placed for 30 minutes in the dark and at room temperature before analysis in a Luminex ® immunofluorescence reader.
  • FIGS. 6 and 7 Calibration curves of the "dose / response" type obtained by a process according to the invention are represented in FIGS. 6 (anti-HLA class I) and 7 (anti-HLA class II).
  • the value of the fluorescence intensity is given as a function of the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration according to the invention, expressed in ⁇ g / ml.
  • the minimum observed fluorescence value (MIN) is determined, ie the value of the asymptote at the curve when the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration tends to 0, the maximum observed fluorescence value (MAX) c that is, the value of the asymptote at the curve when the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration tends to infinite value and the value of the monoclonal chimeric immunoglobulin concentration corresponding to 50% of the specific signal (MAX - MIN). These values are given in Table 4 below.
  • results obtained with the monoclonal chimeric immunoglobulins preserved in the saline buffer are identified by white squares ( ⁇ ) and the results obtained with the monoclonal chimeric immunoglobulins preserved in the albuminous buffer are identified by black diamonds ( ⁇ ). No significant difference is observed between the monoclonal chimeric immunoglobulins preserved in saline buffer and the monoclonal chimeric immunoglobulins preserved in albuminous buffer.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.

Description

IMMUNOGLOBULINE CHIMÉRIQUE MONOCLONALE ANTI-HLA, PROCÉDÉ ET KIT METTANT EN ŒUVRE UNE TELLE IMMUNOGLOBULINE CHIMÉRIQUE MONOCLONALE L'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps. L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale anti- HLA de classe I ou anti-HLA de classe II pour la mise en œuvre d'un tel procédé. L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir notamment être utilisée à titre de réactif de standardisation pour le dépistage et la quantification des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide -notamment d'un milieu liquide biologique-. L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale présentant d'une part la fonction d'un anticorps monoclonal et d'autre part une structure chimérique. L'invention vise aussi un procédé standardisé de dépistage des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide et un procédé de quantification des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide dans lesquels on utilise une telle immunoglobuline chimérique monoclonale. En particulier, l'invention concerne un tel procédé de quantification des anticorps anti-HLA du sérum d'un patient -notamment d'un patient greffé ou en attente d'une greffe-.
L'invention concerne en outre un kit de diagnostic pour la mise en œuvre d'un tel procédé. En particulier, l'invention concerne un tel procédé et un tel kit de diagnostic adaptés pour permettre une quantification des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide -notamment d'un fluide biologique prélevé sur un patient- qui soit précise, fiable et rapide.
Dans le domaine de la transplantation d'organes, il est connu depuis les années 1930 que la compatibilité entre le groupe tissulaire du donneur, tel que défini par les antigènes HLA (Human Leucocytes Antigen), et le système immunitaire -notamment les anticorps- du receveur est essentielle pour la réussite de la greffe d'organe. Les antigènes HLA sont portés par deux types de protéines membranaires qui sont très immunogènes : les molécules HLA de classe I et les molécules HLA de classe II. Ainsi, l'exposition d'un individu à des allo-antigènes HLA, c'est-à-dire des antigènes étrangers et distincts des siens, peut entraîner le développement d'une réponse immunitaire contre ces antigènes. Cette réponse immunitaire peut être à médiation cellulaire (lymphocytes T allo-réactifs) ou humorale (synthèse d'anticorps anti-HLA).
Les antigènes HLA de classe I sont codés par trois gènes HLA- A, HLA-B et HLA-C dont le polymorphisme est responsable des trois séries d'allèles respectivement HLA-A, HLA-B et HLA-C. Les antigènes HLA de classe II sont codés par les gènes HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR.
En transplantation d'organes, il est crucial de minimiser -voire de supprimer- les risques de proposer à un patient en attente d'un greffon un greffon exprimant des antigènes HLA contre lequel ce patient est d'ores et déjà immunisé. En effet, dans cette situation le risque qu'intervienne un rejet humoral hyper-aigu -c'est-à-dire dans un délai inférieur à 24 heures suivant la greffe- est majeur. En outre, dans le cadre du suivi de greffe, le dépistage précoce de l'apparition d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon chez le patient receveur du greffon permet de traiter ledit patient receveur du greffon le plus précocement possible afin de tenter d'enrayer le développement de la réponse humorale susceptible d'entraîner la destruction du greffon.
Le suivi de l'allo-immunisation aussi bien des patients greffés que des patients en attente d'une greffe est donc primordial pour assurer la survie des greffons et des patients greffés.
Dans ce contexte, il est indispensable de pouvoir rechercher, identifier et quantifier les anticorps anti-HLA chez les patients en attente de greffe et chez les patients greffés. De nombreuses techniques de recherche de ces anticorps anti-HLA ont déjà été mises au point.
On connaît en particulier la technique dite de « micro - lymphocytotoxicité dépendante du complément ». Cette technique consiste à présenter le sérum d'un patient -notamment un receveur de greffe- à une série de cellules dont le typage HLA est connu en présence de complément de lapin. Si des anticorps (Ac) spécifiques des antigènes HLA portés par ces cellules sont présents dans le sérum testé, et que ces anticorps sont capables d'activer le complément (anticorps de classe IgM et de sous-classe IgG-1 et IgG-3), la lyse cellulaire complément dépendante (CDC, Complément Dépendent Cytotoxycity) révèle la présence des anticorps. Grâce à un panel de cellules exprimant différents antigènes HLA il est ainsi possible de dépister les anticorps, puis d'identifier leur(s) spécificité(s). Cette technique de référence permet de détecter les anticorps anti- HLA cytolytiques qui sont les plus dangereux pour le greffon. Cependant, cette technique présente une sensibilité faible au regard des techniques plus récentes. Cette technique qui nécessite soit de disposer d'une grande variété de lymphocytes provenant de donneurs dont le phénotype HLA est connu, soit de cultiver in vitro un grand nombre de lignées cellulaires typées HLA est donc complexe et lourde dans sa mise en œuvre.
On connaît aussi des techniques plus sensibles, comme le dosage immunoenzymatique sur support solide (« ELISA », pour « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ». En outre, récemment, est apparue la technique d'immunofluorimétrie couplée à une détection en flux conçue sur le principe du cyto mètre en flux. Le principe de l'immunorluorimétrie en flux consiste en la fixation d'antigènes purifiés HLA de classe I ou HLA de classe II à la surface de billes de polystyrène. Les anticorps anti-HLA qui reconnaissent les antigènes HLA de classe I ou HLA de classe II, se lient aux antigènes liés à la surface des billes et sont révélés par des anticorps secondaires anti-IgG couplés à un groupement fluorescent après lavage des billes de polystyrène. Les anticorps secondaires sont détectés par fluorimétrie en flux. Leur intensité de fluorescence est en outre quantifiée.
Pour des tests de dépistage, on utilise en mélange une pluralité de types de billes, chaque type de billes portant en surface une pluralité d'antigènes HLA, soit de classe I, soit de classe II. Une telle approche permet de détecter la présence d'anticorps anti-HLA sans toutefois permettre l'identification de leur(s) spécificité(s). En revanche, pour l'identification et la caractérisation de la spécificité de l'anticorps, on utilise en mélange une pluralité de types de billes, chaque type de billes portant en surface un antigène HLA unique.
Des kits pour la détection et l'identification d'anticorps anti- HLA sont connus. Ils comprennent des billes de polystyrène revêtues d'antigènes HLA de classe I ou d'antigènes HLA de classe II et des billes de polystyrène revêtues d'IgG humaines. Sont également commercialisés, un anticorps secondaire anti-IgG humaine couplée à la phycoérythrine et un sérum dépourvu d'anticorps anti-HLA à titre de contrôle négatif. Un tel contrôle négatif est adapté pour quantifier la fixation non spécifique de l'anticorps secondaire sur les billes de polystyrène. De tels kits ne comprennent aucun contrôle positif, ni aucun contrôle de la sensibilité, ni aucun standard permettant de déduire précisément la concentration des anticorps anti-HLA (exprimée, par exemple, en mole/L ou en g/L) dans le milieu analysé à partir de l'intensité de fluorescence mesurée.
En outre de tels kits dépourvus de témoin de calibration et/ou de sensibilité ne permettent pas de déterminer le seuil de sensibilité de la méthode d'analyse, c'est-à-dire la valeur minimale du signal permettant d'affirmer que le signal observé est significativement supérieur au bruit de fond de la mesure.
Pour pallier à ce défaut de contrôle positif dans les méthodes de dépistage et/ou de quantification des anticorps anti-HLA, les laboratoires d'immunologie et d'histocompatibilité utilisent, à titre de contrôle positif, un mélange de plusieurs sérums de plusieurs individus immunisés contre plusieurs antigènes HLA.
Dans un tel contrôle positif, la concentration respective de chacun des anticorps des sérums des individus immunisés est inconnue. Un tel mélange de sérum ne permet pas de corréler l'intensité de la mesure de fluorescence avec une concentration (mol/L ou g/L) d'un anticorps spécifique du mélange de sérums. Il ne permet donc pas de quantifier les anticorps présents dans le sérum du patient greffé ou en attente d'une greffe. Il ne permet donc pas non plus d'évaluer les risques réels de la survenue d'une réponse humorale hyper-aigue. La réactivité d'un tel mélange de sérums est variable d'un antigène à l'autre et leur utilisation ne permet pas de fixer le seuil de détection pour chaque antigène HLA étudié. De plus, un tel mélange d'anticorps polyclonaux issu de sérums de patient est disponible en quantité limitée et est rapidement épuisé. Il doit donc être remplacé par un autre mélange lui aussi disponible en quantité variable qui ne permet pas des échanges dudit mélange entre les laboratoires en vue d'une standardisation des résultats. La variabilité des mélanges de sérums d'un lot à l'autre nécessite une validation fréquente de ces lots qui ne sont ni comparables ni reproductibles d'un lot à l'autre.
En utilisant un tel mélange de sérums, les inventeurs ont montré (figures 2, 3 et 4) que la valeur de l'intensité de la fluorescence associée à chacun des types de billes de polystyrène dépend de la nature de l'antigène HLA de classe I ou de classe II porté par chacun des types de billes de polystyrène. En outre, cette valeur d'intensité de fluorescence associée à chacun des types de billes de polystyrène montre une variabilité importante dans le temps -notamment sur une période de l'ordre de cinq mois-. Cette valeur varie (figure 4, histogrammes hachurés) entre 1000 et 20000 unités de fluorescence moyenne.
Il en résulte que la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence mesurée sur l'ensemble des billes de polystyrène présente une dispersion (calculée par son écart-type) importante qui ne permet pas de quantifier les anticorps anti-HLA du milieu liquide. Une telle dispersion est présentée en figure 4 (histogrammes hachurés) de la présente demande de brevet donnée à titre d'illustration d'un standard de l'art antérieur.
Une telle dispersion des mesures d'intensité de fluorescence ne permet pas -en particulier pour les valeurs faibles d'intensité de fluorescence- de distinguer une valeur faible d'intensité de fluorescence mais traduisant la présence d'une faible concentration d'anticorps anti-HLA, d'une valeur faible d'intensité de fluorescence qui ne peut être distinguée du bruit de fond de la mesure.
Pour les mêmes raisons exposées précédemment, une telle préparation utilisée à titre de contrôle positif dans l'état de la technique ne permet pas de déterminer précisément la concentration d'anticorps présent dans le milieu liquide, notamment dans un sérum prélevé sur un patient greffé ou en attente d'une greffe.
L'invention vise à résoudre ces inconvénients en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans l'analyse sérologique des anticorps anti- HLA de classe I ou des anticorps anti-HLA de classe II -notamment dans le contexte de la transplantation d'organes-.
L'invention vise à pallier les inconvénients précédemment évoqués en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une quantification fiable d'anticorps anti-HLA dans le sérum d'un patient. Une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est en particulier adaptée pour permettre la détection de la survenue chez un patient d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon, même pour une très faible concentration de cet anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour la standardisation des méthodes de détection d'anticorps anti-HLA. En permettant en particulier de définir précisément le seuil de détection, Γ immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention permet au biologiste de valider la méthode de recherche d'anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une détection la plus précoce possible de la survenue d'anticorps anti-HLA dirigés contre les antigènes HLA du greffon. Une telle détection précoce permet en particulier de déceler la plus rapidement possible le rejet humoral et donc de prescrire rapidement le traitement curatif du rejet de l'organe transplanté.
L'invention vise à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale permettant de standardiser et de calibrer les méthodes de recherche d'anticorps anti-HLA dans un liquide biologique.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale susceptible de permettre l'accréditation d'une méthode standardisée de dépistage, de quantification et de caractérisation d'anticorps anti- HLA selon les nouvelles normes réglementaires d'accréditation des laboratoires d'analyse médicale. En France, les laboratoires d'analyse -notamment d'immunologie- médicale doivent satisfaire à la norme 15189 du COFRAC (Comité Français d'Accréditation).
L'invention vise aussi à proposer une composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de calibration quantitative dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA, notamment par immunofluorimétrie .
L'invention vise en particulier à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme standard de quantification dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA par la technologie « Luminex® ».
L'invention vise aussi à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique comme étalon quantitatif dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA par cytométrie en flux, par la technique ELISA ou la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise donc à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale et une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale à utiliser comme étalon quantitatif en lieu et place d'un mélange complexe d'anticorps issu du mélange d'un ou de plusieurs sérums de patients.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale qui soit disponible en grande quantité et dont la production est parfaitement standardisée en termes de concentration d'anticorps anti-HLA et en termes de composition.
L'invention vise en outre à proposer une solution aqueuse stable d'une telle immunoglobuline chimérique monoclonale dont la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est parfaitement connue pour la standardisation d'une méthode de dépistage et/ou de quantification et/ou de caractérisation d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide. Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, dans lequel :
- on réalise une pluralité de solutions (Sn) -notamment de solutions aqueuses- d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (Sn) présentant une valeur (Cn) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (Sn) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (Cn) de concentration déterminée à une valeur (Vn) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (Vn) mesurée étant représentative d'une quantité (Qn) de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (Cn, Vn) de concentration (Cn) déterminée et de valeur (Vn) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (Vn) mesurée en fonction de la concentration (Cn) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et ;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au- delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel Γ immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Dans tout le texte, les expressions « antigène HLA de classe I » et « antigène HLA de classe II » (HLA pour « Human Leucocyte Antigen ») désignent des antigènes qui sont humains par nature.
L'invention consiste donc aussi à proposer un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA dans lequel on réalise une courbe d'étalonnage à partir d'une solution d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite immunoglobuline chimérique monoclonale présentant une concentration connue dans ladite solution.
En effet, les inventeurs ont constaté qu'il n'existe pas de solution connue dans l'état de la technique pour permettre une évaluation quantitative qui soit fiable et reproductible de la concentration en anticorps anti- HLA de classe I et de classe II dans un milieu liquide.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie. Avantageusement et selon l'invention, la concentration (Cx) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale est au plus égale à 10~4 g/mL, notamment comprise entre 10~10 g/mL et 104 g/mL. Toute concentration inférieure à 104 g/mL peut être obtenue par dilution d'une solution de concentration élevée, en particulier de l'ordre de 104 g/mL.
Avantageusement, on réalise des dilutions progressives croissantes de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On utilise ces solutions (Sn) d' immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention de concentrations connues pour associer chaque concentration (Cn) des solutions (Sn) d' immunoglobuline chimérique monoclonale avec une valeur (Vn) mesurée d'un paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno- fluorimétrie quantitative (technique Luminex® avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, dans un procédé selon l'invention, on choisit chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono- morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère - notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence. Ainsi, chaque valeur (Vn) du paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence. Avantageusement et selon l'invention, on mesure chaque valeur (Vn) mesurée du paramètre par une technique choisie dans le groupe formé de l'immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, de la cytométrie en flux, d'une méthode par dosage immunoenzymatique sur support solide (ELISA), d'une méthode par liaison compétitive et d'une méthode par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
Avantageusement dans une première variante d'un procédé selon l'invention :
a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ; b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photoabsorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ; e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (Vn) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement, dans une deuxième variante et selon l'invention, chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule -notamment une cellule en culture in vitro-.
Avantageusement, dans cette deuxième variante d'un procédé selon l'invention :
i) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule ;
j) on met en contact les antigènes HLA présentés en surface d'au moins une cellule et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA de la (des) cellule(s) et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
k) on élimine par lavage l'immunoglobuline chimérique monoclonale non liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s), puis ;
1) on met en contact l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s) avec une solution d'un anticorps secondaire dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ; m) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ; n) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque cellule et on attribue à cette mesure une valeur (Vn) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex® avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
o) on forme la courbe de calibration, puis ;
p) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement et selon l'invention, le support solide à l'état divisé est sous forme de particules de forme sensiblement sphériques et de dimension adaptée pour permettre leur analyse par fluorimétrie en flux.
Avantageusement et selon l'invention, on détermine la courbe de calibration par régression non linéaire à partir des mesures d'intensité de fluorescence.
Avantageusement et selon l'invention, le milieu liquide est choisi dans le groupe formé des fluides biologiques -notamment d'un sérum- prélevé sur un individu.
Avantageusement et selon l'invention, l'individu est un patient choisi dans le groupe formé des patients en attente d'une greffe et des patients greffés.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3. L'invention vise aussi l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale dans une méthode de dépistage -notamment une méthode de recherche ou une méthode d'identification- ou de quantification d'anticorps anti- HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise en particulier l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale à titre de réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans une méthode de dépistage ou de quantification d'anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno- fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément, caractérisée en ce Γ immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
chaque chaîne (L) légère comprend : o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
On utilise donc une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention dans laquelle les parties constantes (CH) des chaînes lourdes et les parties constantes (CL) des chaînes légères sont constituées des parties constantes d'une IgA humaine dans des essais de compétition. De telles immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention sont adaptées pour inhiber au moins partiellement la fixation d'anticorps poly-clonaux anti-HLA de classe IgG (ou IgM) présent dans le sérum des malades. L'inhibition de la fixation des IgG du sérum par les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention permet de démontrer la spécificité de la fixation des IgG sur les supports immuno-adsorbants utilisés dans les tests de dépistage d'anticorps anti-HLA par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée avec lecture en flux sur appareil « Luminex® », par cytométrie en flux, par les techniques ELIS A, et par la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
En particulier, les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA permettent de différencier un signal spécifique correspondant à la présence réelle d'IgG anti-HLA dans le sérum, vis-à-vis d'un signal non spécifique correspondant à l'adsorption des IgG sur le support présentateur des antigènes HLA. Cette compétition des immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention pour la recherche d'IgG anti-HLA a été démontrée par d' immuno-fluorimétrie quantitative sur Luminex®.
Les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgG et de classe IgM selon l'invention peuvent être employées comme contrôles positifs et contrôles de sensibilité de l'épreuve de compatibilité directe (cross- match) entre un receveur et un donneur d'organe réalisée juste avant la greffe d'organe par toute technique adaptée (micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément ou en cytométrie en flux) et dans toute technique de détection des anticorps de classe IgG ou IgM sur un support immunoabsorbant (ELISA ou immuno-fluorimétrie quantitative sur bille de polystyrène).
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes HLA de classe I est conformé pour pouvoir reconnaître un épitope commun à tous les antigènes HLA de classe I. Avantageusement et selon l'invention, l'immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I est choisie dans le groupe formé :
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne légère de séquence SEQ ID_NO 1, et :
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne lourde choisie dans le groupe formé des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe II formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne lourdes choisie dans le groupe formé des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes anti-HLA de classe II est conformé pour pouvoir reconnaître un épitope commun à sensiblement tous les antigènes HLA de classe II.
Avantageusement, une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I ou de classe II selon l'invention désigne une immunoglobuline dans laquelle :
o les chaînes lourdes et les chaînes légères sont humaines par nature dans leurs parties constantes. En particulier, les parties constantes des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgA, des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgG et des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgM et les parties constantes des chaînes légères sont choisies dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda, et ;
o les parties variables des chaînes légères et des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II. Dans une telle immunoglobuline chimérique monoclonale, les parties constantes (CH) des chaînes lourdes de l'anticorps humain et les parties constantes (CL) des chaînes légères de l'anticorps humain représentent ensemble de l'ordre de 60 % en masse de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale. En outre, une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est un anticorps monoclonal, c'est-à-dire spécifique d'un épitope mono-morphique unique.
Avantageusement, chaque anticorps monoclonal est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré -notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono- morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré -notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II.
Dans tout le texte, on entend par « organisme vertébré non humain », un être vivant organisé supérieur à l'exclusion de l'homme. Un tel organisme vertébré est en particulier pourvu d'un système immunitaire. Un tel organisme vertébré est en particulier choisi dans le groupe formé des mammifères non humains -notamment de la souris, du rat, du lapin et du hamster- des batraciens et des oiseaux -notamment des galliformes-. De tels organismes vertébrés non humains sont en particulier des animaux de laboratoire. Cependant, un tel anticorps monoclonal peut être choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux humains. Avantageusement et selon l'invention, chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère -notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
L'invention vise en outre une solution stable d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention dans une composition aqueuse.
L'invention vise aussi une telle solution aqueuse d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite solution aqueuse présentant une concentration prédéterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale.
L'invention vise aussi une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir permettre une détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
L'invention s'étend par ailleurs à un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention et une notice explicative pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention.
Ainsi, l'invention vise un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comprenant :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda ;
ledit kit comprenant aussi une notice explicative pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, une immunoglobuline chimérique monoclonale, son utilisation et un kit pour cette détermination, caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquels :
- la figure 1 est une représentation graphique de la variation temporelle de l'intensité de fluorescence de 17 types de billes traitées selon un contrôle négatif ;
- la figure 2 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 12 types de billes porteuses d'antigènes HLA de classe I d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
- la figure 3 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 5 types de billes HLA de classe II d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
- la figure 4 est une représentation comparative en histogramme de l'intensité de fluorescence d'un contrôle positif selon l'état de la technique et d'un contrôle positif selon l'invention, dans laquelle ;
o la figure 4 A est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
o la figure 4B est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
- la figure 5 est une analyse par cytométrie en flux de la fixation d' immunoglobulines monoclonales chimériques de classe I et de classe II selon l'invention sur des lymphocytes T et des lymphocytes B ; - la figure 6 A est une représentation graphique de 12 courbes dose/réponse superposées correspondant à 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en μg/mL ;
- la figure 6B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne de 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 6A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en μg/mL ;
- la figure 7A est une représentation graphique de 5 courbes dose/réponse superposées correspondant à 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en μg/mL ;
- la figure 7B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne des 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 7A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en μg/mL ;
- la figure 8A est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti- HLA de classe I selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 8B est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti- HLA de classe II selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 9 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-IgGl K [W6/32]) et correspond à la séquence SEQ ID_NO 1 ; - la figure 10 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgGl K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2 ;
- la figure 11 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-
IgA2 K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3 ;
- la figure 12 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgM K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4 ;
- la figure 13 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgGl K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5 ;
- la figure 14 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgA2 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6 ;
- la figure 15 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgGl K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7 ;
- la figure 16 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-
IgM K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
EXEMPLE 1 - Obtention d'une immunoglobuline chimérique monoclonale IgG/anti-HLA de classe I (Hu-IgGl K [W6/32]) selon l'invention.
L'anticorps W6/32 a été décrit pour la première fois dans la publication de Barnstable et al. en 1978 (Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A., 1978, Celle, 14(1), 9-20. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, H LA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis). Cet anticorps est sécrété par un hybridome de souris provenant de la fusion de cellules d'une lignée de myélome de souris (lignée P3-NSI/lAg4-l non sécrétrice d' immunoglobuline de souris) avec les lymphocytes d'une souris immunisée contre des cellules humaines. Il a été démontré que cet anticorps réagit avec un épitope public retrouvé sur les molécules HLA de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-C). L'épitope reconnu est un épitope de conformation qui dépend de l'association entre la chaîne lourde alpha de classe I et de la microglobuline bêta 2. L'épitope requiert la présence d'une arginine en position 3 de la bêta-2-microglobuline et d'une lysine en position 121 de la chaîne alpha (Ladasky JJ, Shum BP, Canavez F, Seuânez HN, Parham P., (1999), Immunogenetics, 49(4), 312-320. Residue 3 of beta2-microglobulin affects binding of class I MHC molécules by the W6/32 antibody).
Dans une première étape, les transcrits codant la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps W6/32 ont été clonés et séquencés.
La copie ADN des ARNm (ADNc) de la chaîne lourde a été amplifiée par PCR à l'aide de deux amorces, l'une spécifique de la région codant le peptide amorce (« leader peptide »), l'autre ciblant la partie 5' qui code le domaine CH1 de la partie constante.
Pour l'amplification de l'ADNc de la chaîne légère, une amorce ciblant l'exon du peptide leader et une amorce ciblant la partie 5' du domaine C Kappa ont été utilisées. Les fragments d' ADNc des deux chaînes ont été clonés dans E coli. Les fragments clonés ont été séquencés. L'alignement des séquences a permis d'établir les consensus des ADNc de la chaîne lourde et de la chaîne légère avec un seuil d'identité de 98%. Les régions codant les parties variables ont été déterminées par comparaison avec les séquences présentes dans la banque de données de l'IMGT® (« International Immunogenetics Information System »).
Des séquences codant un peptide amorce de chaîne légère ou de chaîne lourde suivant le cas ont été ajoutées en 5' et les séquences en 3' ont été modifiées de façon à créer un site de restriction BsiWI pour l'ADN de la chaîne légère et un site de restriction Nhel pour la chaîne lourde. Ces sites de restrictions sont adaptés pour permettre une insertion de ces séquences nucléiques dans les vecteurs de clonages pFUSE-CLIg et pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France). Les séquences ainsi définies ont été synthétisées puis clonées dans des vecteurs d'expression comportant soit la partie codant le domaine constant de la chaîne Kappa humaine (allotype Km 01 ; numéro d'accès Genbank : J00241) soit la partie constante des IgGl humaines. Le site de restriction du vecteur d'expression permettant d'insérer les ADNc des parties variables en phase avec les régions codant les parties constantes des chaînes d'immunoglobuline.
Deux vecteurs d'expression, l'un codant pour une chaîne légère chimère associant la partie variable de la chaîne légère de l'anticorps W6/32 et le domaine C Kappa humain (chaîne VL [W6/32]-C Kappa humaine), l'autre associant la partie variable de la chaîne lourde de l'anticorps W6/32 et le domaine C gamma 1 humain (VL [W6/32]-C gammal humaine) ont été ainsi obtenus.
Ces deux vecteurs ont été introduits par transfection dans des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells). Pour ce faire, les cellules ont d'abord été transfectées par le vecteur codant la chaîne légère puis par celui codant la chaîne lourde. Les vecteurs d'expression comportent des facteurs de résistances à des drogues cytotoxiques permettant de sélectionner efficacement les cellules doublement transfectées. Après la période de sélection, les cellules doublement transfectées ont été clonées par dilution limite et la présence des IgGl Kappa humaines ont été révélée dans le surnageant des clones par une technique d'ELISA sandwich. Les clones producteurs ainsi révélés ont été soumis à une pluralité de cycles de clonage par dilution limite de manière à recruter les clones les plus efficaces dans la sécrétion de l'IgGl Kappa chimère dénommée ci-après Hu-IgGl K [W6/32].
Les Hu-IgGl K [W6/32] sécrétées dans le surnageant de culture des cellules CHO transfectées ont été purifiées par capture-élution sur la protéine A du staphylocoque liée à des billes de Sépharose®. Les IgGl Kappa ont été éluées à pH acide dans un tampon glycine à pH 2. L'éluat a été tamponné extemporanément par une solution aqueuse de phosphate di-sodique à la concentration de 750 mM. Les solutions d'Hu-IgGl K [W6/32] sont conservées à 4°C ou à -80°C.
La séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu- IgGl K [W6/32] est représentée en figure 9 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 1. La séquence peptidique de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu-IgGl K [W6/32] est représentée en figure 10 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2.
La vérification de la spécificité de la liaison de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgGl K [W6/32] selon l'invention a été réalisée sur des lymphocytes T ou sur des lymphocytes B séparées sur gradient de densité à partir de sang humain prélevé sur tube EDTA. Les cellules ont été marquées par des anticorps anti-CD3, anti-CD19 et anti-CD45. Les lymphocytes T (CD3+) et B (CD 19+) sont définis parmi la population des lymphocytes CD45+.
On incube Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-
IgGl K [W6/32] en présence de cellules mononuclées humaines (lymphocytes T ou lymphocytes B) du sang périphérique, puis on réalise trois lavages successifs desdites cellules mononuclées humaines suivi de trois lavages en tampon phosphate salin (PBS). On révèle la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales fixées sur les cellules mononuclées humaines au moyen d'anticorps de chèvre anti- Fcy humain. Les résultats sont présentés en figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu- IgGl K [W6/32] se fixe sur les lymphocytes B (figure 5A) et avec les lymphocytes T (figure 5C) alors que l'anticorps Hu-IgGl K [F3.3] se fixe sur les lymphocytes B (figure 5B) et pas sur les lymphocytes T (figure 5D).
EXEMPLE 2 - Spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgGl K [W6/32]
La spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgGl K [W6/32] a ensuite été déterminée par une technique de fluorimétrie quantitative multiplexée en utilisant des trousses commerciales distribuées par la société One Lambda®. Cette détermination est fondée sur une réaction d'immunofluorescence indirecte et utilisent des billes de latex revêtues d'antigène HLA de divers groupes. Les anticorps capables de reconnaître les antigènes HLA présents sur les billes de latex sont révélés par des anticorps anti IgG humaines couplés à la phycoérythrine. La fluorescence est quantifiée sur chaque bille par cytométrie en flux sur un appareil Luminex®. Un marquage fluorescent spécifique de chaque type de billes permet de mettre en jeu plusieurs variétés de billes (reconnaissable par leur fluorescence), chaque bille étant revêtue d'un mélange d'antigènes HLA donné. Ceci permet de démontrer que toutes les billes de classe I sont reconnues avec sensiblement la même intensité (figure 4A, billes de classe I). Ceci nous permet de conclure que Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgGl K [W6/32] reconnaît un épitope public présent sur toutes les molécules HLA de classe I.
Des expériences de compétition ont permis de démontrer que l'anticorps monoclonal de souris W6/32 sécrété par l'hybridome de souris inhibe la fixation de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgGl K [W6/32]
EXEMPLE 3 - Obtention d'anticorps monoclonaux chimériques anti-HLA de classe I d'isotype IgA2 et IgM (Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32]) selon l'invention.
La partie variable de la chaîne lourde W6/32 (VH[W6/32]) a été clonée dans deux autres vecteurs d'expression le premier permet de produire des chaînes mu chimères (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine mu (Numéro d'accès Genbank : AY510104.1), l'autres des chaînes alpha 2 chimère (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine alpha 2, allotype A2m(l) (Numéro d'accès Genbank : J00221). Ces deux vecteurs ont été utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO préalablement transfectées par le vecteur permettant l'expression de la chaîne légère chimère VL[W6/32]-K humaine. Nous avons ainsi isolé un clone de cellules CHO sécrétant de grandes quantités d' immunoglobuline chimérique monoclonale Hu- IgA2 K [W6/32] et un autre clone sécrétant une immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [W6/32]. Les IgA chimériques ont été purifiées sur un support d'agarose couplé au peptide M (InvivoGen, Toulouse, France) et les IgM chimériques ont été purifiées sur un support d'agarose couplé à la protéine L (InvivoGen, Toulouse, France) selon les recommandations du fournisseur.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale (IgA2-anti-HLA classe I) Hu-IgA2 K [W6/32] est représentée en figure 11 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgM-anti-HLA classe I) est représentée en figure 12 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4.
La réactivité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32] a été vérifiée en technique Luminex® avec les trousses Labscreen mixed® (One Lambda®) et, à titre d'anticorps secondaires fluorescents, des anticorps de chèvre anti-IgA humaines ou anti-IgM humaines couplés à la phycoérythrine.
EXEMPLE 4 - Obtention d'un anticorps monoclonal anti- HLA de classe II (Hu-IgGl K [F3.3]) selon l'invention.
Dans son principe, le procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe II est comparable au procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe I (W6/32).
L'anticorps F3.3 (Elsasser, D., Valerius, T., Repp, R., Weiner, G.J., Deo, Y., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Stevenson, G.T., Glennie, M.J. and Gramatzki, M., (1996), Blood, 87(9), 3803-3812. HLA class II as potential target antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies in combination with granulocyte colony-stimulating factor) est le produit d'un clone unique d'hybridome de souris. L'anticorps F3.3 reconnaît au moins un épitope public présent à la surface de toutes les cellules humaines exprimant les molécules HLA de classe II. En particulier, l'anticorps F3.3 reconnaît tous les antigènes DR, tous les antigènes DP et tous les antigènes du groupe DQ2. Les séquences complètes codantes des parties variables de l'anticorps F3.3 sont accessibles sur GenBank® (numéros d'accès : AY058910 [VL] pour la chaîne légère et AY058911 [VH] pour la chaîne lourde).
Les séquences des parties variables ont été synthétisées et clonées en phase dans les vecteurs de clonage pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes lourdes et pFUSE-CLIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes légères. Le vecteur (pFUSE-CHIg) permet la production de la chaîne lourde chimère VH[F3.3]-C gamma 1 humaine et le vecteur (pFUSE-CLIg) permet la production de la chaîne légère VL[F3.3]-C Kappa humaine. Ces deux vecteurs d'expressions sont utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO comme décrit à l'exemple 1.
En outre, la partie variable VH[F3.3] a été clonée dans des vecteurs d'expression permettant la production de chaînes lourdes chimères VH[F3.3]-C mu humaine et VH[F3.3]-C alpha 2 humaine.
La séquence peptidique de la chaîne légère de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgGl K [F3.3]) est représentée en figure 13 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgA2 K [F3.3]) est représentée en figure 14 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgGl K [F3.3]) est représentée en figure 15 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de
Γ immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgM K [F3.3]) est représentée en figure 16 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
Les immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgGl K [F3.3], Hu-IgA2 K [F3.3] et Hu-IgM K [F3.3] dirigés contre les antigènes HLA de classe II ont été produits par des cellules CHO transfectées par les vecteurs appropriés. Les IgGl chimères ont été purifiées sur protéine A Sépharose. Les IgA chimères ont été purifiées sur peptide M-agarose (InvivoGen, Toulouse, France). Les IgM chimères ont été purifiées sur protéine L-Agarose (InvivoGen, Toulouse, France).
On vérifie la spécificité de la liaison de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgGl K [F3.3] selon l'invention par une technique d'immunofluorescence indirecte par cytométrie en flux sur des cellules humaines mononuclées telle que décrite à l'exemple 1. Les résultats sont présentés à la figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu-IgGl K [F3.3] selon l'invention réagit fortement contre les cellules humaines, notamment avec les lymphocytes B (figure 5B) et avec les lymphocytes T (figure 5D). En outre, on étudie la spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales anti-HLA de classe II selon l'invention par la technique d'immunofluorimétrie quantitative multiplexée sur Luminex® à l'aide de trousses Labscreen mixed® et Labscreen single antigen® (One Lambda®).
L'anticorps Hu-IgGl K [F3.3] s'est fixé sur toutes les billes portant les antigènes HLA de classe II du kit Labscreen mixed® et sur toutes les billes portant les antigènes HLA-DR, HLA-DP et HLA-DQ2 du kit Labscreen single antigen class II®.
Il a été démontré, par des expériences de compétition, que les immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgGl K [F3.3] et Hu-IgA2 K [F3.3] reconnaissent le même épitope. La réactivité de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] a été étudiée par technique Luminex® avec les trousses Labscreen mixed® (One-Lambda®) en utilisant, comme révélateur de la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [F3.3], des anticorps de chèvre anti-IgA humaines couplés à la phycoérythrine. La réactivité de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] s'est révélée identique à celle de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgGl K [F3.3].
EXEMPLE 5 - Procédé de quantification in vitro des anticorps anti-HLA
Dans un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti- HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps par immunofluorescence selon l'invention, on utilise, à titre d'exemple non limitatif, un kit de laboratoire « Labscreen mixed® » (LSM12, One Lambda® Inc., USA) comprenant :
- des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe I (HLA- A, HLA-B et HLA-C) purifiés, et, en mélange ;
- des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe II (HLA-DR, HLA-DQ et HLA-DP) purifiés ;
- des billes de polystyrène, dites billes de contrôle positif, liées à des IgG ; - des billes de polystyrène, dites billes de contrôle négatif, dépourvues d'antigène surface. Un tel kit de laboratoire (Labscreen mixed®) comprend une suspension aqueuse de billes de polystyrène de dépistage des anticorps anti-HLA de classe I et des anticorps anti-HLA de classe II. Les billes de polystyrène de cette suspension comprennent une pluralité de type de billes de polystyrène, chaque type de bille de polystyrène étant différencié des autres types de bille de polystyrène au moyen d'un marqueur fluorescent et comprenant des billes de polystyrène porteuses d'antigènes HLA de classe I et d'antigène HLA de classe II distincts. En pratique, chaque type de bille de polystyrène présente en surface des billes de polystyrène jusqu'à six antigènes HLA- A (classe I), six antigènes HLA-B (classe I), six antigènes HLA-C (classe I), ou six antigènes HLA- DQ (classe II), six antigènes HLA-DR (classe II), six antigènes HLA-DP (classe II).
Le kit de laboratoire (Labscreen mixed®) comprend 12 types de billes de polystyrène classe I et 5 types de billes de classe II dont l'intensité de fluorescence de chacun des 17 types de billes de polystyrène est susceptible d'être mesurée simultanément. Ainsi, on calcule la moyenne de l'intensité de fluorescence de chacun des types de billes de polystyrène liée à un même ensemble d'antigènes HLA. Au sein de ce mélange de billes de polystyrène, certaines sont dépourvues d'antigène HLA de classe I et d'antigène HLA de classe II et servent de contrôle négatif.
L'utilisation du kit de laboratoire (Labscreen mixed®) nécessite en outre un sérum témoin négatif (LabScreen Négative Control (LSNC) sérum) lors de la réaction de dépistage des anticorps anti-HLA. Ce sérum est caractérisé par le fabriquant comme étant dépourvu d'anticorps anti-HLA de classe I et d'anticorps anti-HLA de classe II.
Les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence observée sur une durée de cinq mois associée à chacun des 12 types de billes porteuses d'antigènes de classe I et à chacun des 5 types de billes porteuses d'antigènes de classe II traitées avec un tel contrôle négatif sont données au tableau 1 ci-après.
Figure imgf000033_0001
Classe d'Ag
HLA Numéro de bille Moyenne de fluorescence Ecart-type reconnue
6 79,82 30,26
7 110,87 39,45
88 118,09 30,31
17 94,16 38,98
69 136,93 54,01
79 136,67 49,73
Classe I
84 109,79 35.61
86 102,07 27,77
87 119.96 32,50
88 100,67 30,04
89 90,89 25,85
90 157,12 73,60
91 112,79 35,91
93 143,52 39,21
Classe II 95 104,89 34,79
96 153,14 55,02
97 117,61 46,14
Tableau 1
Les valeurs présentées au tableau 1 sont faibles et traduisent la fluorescence générée par la liaison non spécifique des IgG sur les billes de polystyrène, et la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire sur ces billes.
Contrôle positif
Le kit de laboratoire (Labscreen mixed®) comprend, à titre de contrôle positif, des billes de polystyrène en surface desquelles sont greffées des IgG humaines purifiées. Un tel contrôle positif est limité dans son utilisation à la vérification de la fonctionnalité de l'anticorps secondaire. Un tel contrôle positif ne permet pas la conversion d'une valeur d'intensité de fluorescence en une valeur de concentration d'anticorps anti-HLA dans un milieu liquide. Contrôle positif polyclonal
Les utilisateurs du kit (Labscreen mixed®) -notamment les laboratoires d'immunologie- préconisent d'utiliser, à titre de contrôle positif lors du dépistage des anticorps anti-HLA in vitro selon l'état de la technique, un mélange de sérums provenant d'individus polyimmunisés contre les antigènes HLA. A titre d'exemple, les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence mesurée sur une période de 5 mois associée à chaque type de billes HLA de classe I et de classe II de ce contrôle polyclonal sont données dans le tableau 2 ci-après.
Figure imgf000035_0001
Tableau 2
La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe I traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la technique est de l'ordre de 5200 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 4900 unités de fluorescence.
La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe II traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la technique est de l'ordre de 8600 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 7500 unités de fluorescence.
L'intensité de fluorescence de chacun des types de bille de polystyrène du contrôle qualitatif varie entre 1000 et 20000. Une telle variabilité de la réponse de chacun des types de billes de polystyrène (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR et HLA-DP) ne permet pas de définir une courbe unique de conversion de l'intensité de fluorescence mesurée en une concentration d'anticorps anti-HLA de référence. En outre, une telle courbe de conversion de l'intensité de fluorescence mesurée ne peut être obtenue, compte tenu du fait que la concentration en anticorps HLA spécifique de chacun des types d'antigène HLA ne peut être déterminée dans le contrôle qualitatif de l'état de la technique.
A titre d'exemple d'un contrôle qualitatif de l'état de la technique, une analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit « Labscreen mixed® » montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe I (type de bille n° 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4 A) varie entre une valeur de l'ordre de 7000 unités de fluorescence moyenne et 12000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 9600 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 3100 unités de fluorescence.
En outre, cette analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit « Labscreen mixed® » montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n° 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B) varie entre une valeur de l'ordre de 1000 unités de fluorescence moyenne et 19000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe II est de l'ordre de 13000 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 8300 unités de fluorescence.
Un tel contrôle est donc limité dans son utilisation à une analyse purement qualitative dès lors que la concentration de chaque anticorps dans le mélange de sérum n'est pas connue.
Immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention
On utilise, à titre de contrôle quantitatif du kit de laboratoire (Labscreen mixed®), une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On prépare des solutions d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-Igl K [W6/32]) et/ou anti-HLA de classe II (Hu-Igl K [F3.3]) telles que décrites aux exemples 1 à 4 à une concentration connue de 2 μg/mL. On réalise une analyse de l'intensité de fluorescence moyenne associée à chaque type de bille de polystyrène porteur d'un antigène-HLA de classe I ou de classe II. Les résultats obtenus sont présentés en figure 4 (histogrammes blancs).
On observe, pour chaque type de bille de polystyrène du kit « Labscreen mixed® » une intensité de fluorescence de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne.
En particulier, cette analyse montre que :
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe I (type de bille n° 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4 A, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 21500 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 450 unités de fluorescence ;
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n° 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 700 unités de fluorescence. Cette valeur d'intensité de fluorescence est sensiblement constante quelle que soit le type de bille de polystyrène (quel que soit l'antigène HLA porté par le type de bille de polystyrène) et correspond à une concentration en anticorps de 2 μg/mL. De tels anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention sont adaptés pour permettre un étalonnage quantitatif de la réponse en fluorescence en fonction de la concentration en anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention.
A titre comparatif de l'invention (histogrammes pleins en figure 4A et 4B) et de l'état de la technique (histogrammes hachuré en figure 4A et 4B), les valeurs de la fluorescence moyenne (et écart- type) relevée sur les billes porteuses d'antigènes HLA de classe I et sur les billes porteuses d'antigènes HLA de classe II sont représentées en figure 4.
EXEMPLE 6 - Procédé de quantification in vitro des anticorps anti-HLA - Courbes « Dose/réponse »
Pour réaliser une courbe « dose/réponse », on distribue dans chacun des puits d'une plaque multi-puits à micro filtre (Multiscreen®) 300 d'un tampon de lavage (PB S). Après 10 minutes on élimine par aspiration le tampon de lavage et on ajoute 5 μL· de suspension homogénéisée de billes « Labscreen mixed® ». Une gamme de solutions d'anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention de concentrations en anticorps monoclonaux chimériques décroissantes est obtenue par des dilutions successives sériées. Les contrôles négatif et positif sont traités de la même façon en parallèle. On distribue 20 μL· de chacune de ces dilutions sériées en contact des billes de polystyrène préalablement placées dans les puits de la plaque de multi-puits. Les mélanges de billes de polystyrène et des anticorps monoclonaux chimériques sont incubés à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. À l'issue, on réalise cinq lavages successifs de chacun des puits avec 250 μL· d'un tampon de lavage. On ajoute ensuite 100 μL· d'une solution d'anticorps secondaire dilué au l/100eme. Les anticorps secondaires utilisés pour le marquage fluorescent des anticorps anti-HLA liés aux billes de polystyrène sont, par exemple, des anticorps de chèvre anti-IgA couplé à la phycoérythrine (anti-IgA-PE, AbSerotec, USA) ou les anticorps de chèvre anti-IgG couplé à la phycoérythrine (anti-IgG-PE, InGen, USA). Bien entendu, tout autre groupement fluorescent couplé à un anticorps susceptible de reconnaître et de se lier aux chaînes constantes de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention peut être utilisé. Les plaques multi-puits sont placées pendant 30 min à l'abri de la lumière et à la température ambiante avant analyse dans un lecteur d'immunofluorescence Luminex®.
Des courbes d'étalonnage du type « dose/réponse » obtenues par un procédé selon l'invention sont représentées en figures 6 (anti-HLA classe I) et 7 (anti-HLA classe II). La valeur de l'intensité de fluorescence est donnée en fonction de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention exprimée en μg/mL.
Les valeurs moyennes et les écart-types de la mesure d'intensité de fluorescence mesurée sur chaque type de billes HLA de classe I (figure 6B) et HLA de classe II (figure 7B) sont reprises dans le tableau 3 ci-après.
Figure imgf000039_0001
Tableau 3
On réalise une analyse statistique par régression non linéaire sigmoïde de type Boltzmann des données relatives aux courbes de titration décrites ci-dessus. On détermine la valeur minimale de fluorescence observée (MIN) c'est-à- dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur 0, la valeur maximale de fluorescence observée (MAX) c'est-à-dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur infinie et la valeur de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale correspondant à 50% du signal spécifique (MAX - MIN). Ces valeurs sont données dans le tableau 4 ci-après.
Figure imgf000040_0001
Tableau 4
EXEMPLE 7 - Analyse de la stabilité des immunoglobuline s chimériques monoclonales Hu-IgGl K [W6/32] et Hu-IGgl K IF3.3] selon l'invention dans un milieu tampon albumineux.
On prépare des dilutions sériées des immunoglobulines chimériques monoclonales selon l'invention conservées pendant une durée de deux mois dans un milieu tampon aqueux contenant de l'albumine humaine à une concentration de 60 g/L. On réalise des courbes « dose/réponse » telles que décrites à l'exemple 6 par la technique Luminex®. Les résultats obtenus avec Γ immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA de classe I (Hu-IgGl K [W6/32]) sont présentés en figure 8A et les résultats obtenus avec Γ immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA de classe II (Hu-IgGl K [F3.3]) sont présentés en figure 8B. Les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées dans le tampon salin sont identifiés par des carrés blancs (□) et les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservés dans le tampon albumineux sont identifiés par des losanges noirs (♦). Aucune différence significative n'est observée entre les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon salin et les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon albumineux.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti- HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, dans lequel :
- on réalise une pluralité de solutions (Sn) d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (Sn) présentant une valeur (Cn) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (Sn) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (Cn) de concentration déterminée à une valeur (Vn) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (Vn) mesurée étant représentative d'une quantité (Qn) de Γ immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (Cn, Vn) de concentration (Cn) déterminée et de valeur (Vn) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (Vn) mesurée en fonction de la concentration (Cn) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et ;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au- delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel Γ immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend : o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
21 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence.
5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que : a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ; b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photo- absorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ; e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (Vn) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence, d'un paramètre de luminescence et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
91 Utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale à titre de réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans une méthode de dépistage ou de quantification d'anticorps anti- HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide et des méthodes par micro- lymphocytotoxicité dépendante du complément, caractérisée en ce que Γ immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend : o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
10/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda. 11/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne légère de séquence SEQ ID_NO 1, et:
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne lourde choisie dans le groupe formé des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
12/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe II formée de :
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaîne lourdes choisie dans le groupe formé des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaînes lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
13/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré.
14/ Immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'une des revendications 10, 11 ou 13, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32. 15/ Immunoglobuline chimérique monoclonale selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques de l'antigène HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
16/ Kit de quantification d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'une des revendications 10 à 15 et une notice explicative pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8.
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