CA2862287A1 - Immunoglobuline chimerique monoclonale anti-hla, procede et kit mettant en oeuvre une telle immunoglobuline chimerique monoclonale - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
Description
wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 IMMUNOGLOBULINE CHIMÉRIQUE MONOCLONALE ANTI-HLA, PROCÉDÉ ET KIT METTANT EN UVRE UNE TELLE
IMMUNOGLOBULINE CHIMÉRIQUE MONOCLONALE
L'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I ou anti-HLA de classe II pour la mise en oeuvre d'un tel procédé.
L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir notamment être utilisée à titre de réactif de standardisation pour le dépistage et la quantification des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide -notamment d'un milieu liquide biologique-. L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale présentant d'une part la fonction d'un anticorps monoclonal et d'autre part une structure chimérique.
L'invention vise aussi un procédé standardisé de dépistage des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide et un procédé de quantification des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide dans lesquels on utilise une telle immunoglobuline chimérique monoclonale. En particulier, l'invention concerne un tel procédé de quantification des anticorps anti-HLA du sérum d'un patient -notamment d'un patient greffé ou en attente d'une greffe-.
L'invention concerne en outre un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. En particulier, l'invention concerne un tel procédé
et un tel kit de diagnostic adaptés pour permettre une quantification des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide -notamment d'un fluide biologique prélevé sur un patient- qui soit précise, fiable et rapide.
Dans le domaine de la transplantation d'organes, il est connu depuis les années 1930 que la compatibilité entre le groupe tissulaire du donneur, tel que défini par les antigènes HLA (Human Leucocytes Antigen), et le système immunitaire -notamment les anticorps- du receveur est essentielle pour la réussite de la greffe d'organe.
IMMUNOGLOBULINE CHIMÉRIQUE MONOCLONALE
L'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I ou anti-HLA de classe II pour la mise en oeuvre d'un tel procédé.
L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir notamment être utilisée à titre de réactif de standardisation pour le dépistage et la quantification des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide -notamment d'un milieu liquide biologique-. L'invention concerne en particulier une telle immunoglobuline chimérique monoclonale présentant d'une part la fonction d'un anticorps monoclonal et d'autre part une structure chimérique.
L'invention vise aussi un procédé standardisé de dépistage des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide et un procédé de quantification des anticorps anti-HLA
d'un milieu liquide dans lesquels on utilise une telle immunoglobuline chimérique monoclonale. En particulier, l'invention concerne un tel procédé de quantification des anticorps anti-HLA du sérum d'un patient -notamment d'un patient greffé ou en attente d'une greffe-.
L'invention concerne en outre un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. En particulier, l'invention concerne un tel procédé
et un tel kit de diagnostic adaptés pour permettre une quantification des anticorps anti-HLA d'un milieu liquide -notamment d'un fluide biologique prélevé sur un patient- qui soit précise, fiable et rapide.
Dans le domaine de la transplantation d'organes, il est connu depuis les années 1930 que la compatibilité entre le groupe tissulaire du donneur, tel que défini par les antigènes HLA (Human Leucocytes Antigen), et le système immunitaire -notamment les anticorps- du receveur est essentielle pour la réussite de la greffe d'organe.
2 Les antigènes HLA sont portés par deux types de protéines membranaires qui sont très immunogènes : les molécules HLA de classe I et les molécules HLA de classe II. Ainsi, l'exposition d'un individu à des allo-antigènes HLA, c'est-à-dire des antigènes étrangers et distincts des siens, peut entraîner le développement d'une réponse immunitaire contre ces antigènes. Cette réponse immunitaire peut être à médiation cellulaire (lymphocytes T allo-réactifs) ou humorale (synthèse d'anticorps anti-HLA).
Les antigènes HLA de classe I sont codés par trois gènes HLA-A, HLA-B et HLA-C dont le polymorphisme est responsable des trois séries d'allèles respectivement HLA-A, HLA-B et HLA-C. Les antigènes HLA de classe H sont codés par les gènes HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR.
En transplantation d'organes, il est crucial de minimiser -voire de supprimer- les risques de proposer à un patient en attente d'un greffon un greffon exprimant des antigènes HLA contre lequel ce patient est d'ores et déjà
immunisé. En effet, dans cette situation le risque qu'intervienne un rejet humoral hyper-aigu -c'est-à-dire dans un délai inférieur à 24 heures suivant la greffe-est majeur. En outre, dans le cadre du suivi de greffe, le dépistage précoce de l'apparition d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon chez le patient receveur du greffon permet de traiter ledit patient receveur du greffon le plus précocement possible afin de tenter d'enrayer le développement de la réponse humorale susceptible d'entrainer la destruction du greffon.
Le suivi de l'allo-immunisation aussi bien des patients greffés que des patients en attente d'une greffe est donc primordial pour assurer la survie des greffons et des patients greffés.
Dans ce contexte, il est indispensable de pouvoir rechercher, identifier et quantifier les anticorps anti-HLA chez les patients en attente de greffe et chez les patients greffés. De nombreuses techniques de recherche de ces anticorps anti-HLA ont déjà été mises au point.
On connaît en particulier la technique dite de micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément . Cette technique consiste à
présenter le sérum d'un patient -notamment un receveur de greffe- à une série de
Les antigènes HLA de classe I sont codés par trois gènes HLA-A, HLA-B et HLA-C dont le polymorphisme est responsable des trois séries d'allèles respectivement HLA-A, HLA-B et HLA-C. Les antigènes HLA de classe H sont codés par les gènes HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR.
En transplantation d'organes, il est crucial de minimiser -voire de supprimer- les risques de proposer à un patient en attente d'un greffon un greffon exprimant des antigènes HLA contre lequel ce patient est d'ores et déjà
immunisé. En effet, dans cette situation le risque qu'intervienne un rejet humoral hyper-aigu -c'est-à-dire dans un délai inférieur à 24 heures suivant la greffe-est majeur. En outre, dans le cadre du suivi de greffe, le dépistage précoce de l'apparition d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon chez le patient receveur du greffon permet de traiter ledit patient receveur du greffon le plus précocement possible afin de tenter d'enrayer le développement de la réponse humorale susceptible d'entrainer la destruction du greffon.
Le suivi de l'allo-immunisation aussi bien des patients greffés que des patients en attente d'une greffe est donc primordial pour assurer la survie des greffons et des patients greffés.
Dans ce contexte, il est indispensable de pouvoir rechercher, identifier et quantifier les anticorps anti-HLA chez les patients en attente de greffe et chez les patients greffés. De nombreuses techniques de recherche de ces anticorps anti-HLA ont déjà été mises au point.
On connaît en particulier la technique dite de micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément . Cette technique consiste à
présenter le sérum d'un patient -notamment un receveur de greffe- à une série de
3 cellules dont le typage HLA est connu en présence de complément de lapin. Si des anticorps (Ac) spécifiques des antigènes HLA portés par ces cellules sont présents dans le sérum testé, et que ces anticorps sont capables d'activer le complément (anticorps de classe IgM et de sous-classe IgG-1 et IgG-3), la lyse cellulaire complément dépendante (CDC, Complement Dependent Cytotoxycity) révèle la présence des anticorps. Grâce à un panel de cellules exprimant différents antigènes HLA il est ainsi possible de dépister les anticorps, puis d'identifier leur(s) spécificité(s). Cette technique de référence permet de détecter les anticorps anti-HLA cytolytiques qui sont les plus dangereux pour le greffon. Cependant, cette technique présente une sensibilité faible au regard des techniques plus récentes.
Cette technique qui nécessite soit de disposer d'une grande variété de lymphocytes provenant de donneurs dont le phénotype HLA est connu, soit de cultiver in vitro un grand nombre de lignées cellulaires typées HLA est donc complexe et lourde dans sa mise en oeuvre.
On connaît aussi des techniques plus sensibles, comme le dosage immunoenzymatique sur support solide ( ELISA , pour Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay . En outre, récemment, est apparue la technique d'immunofluorimétrie couplée à une détection en flux conçue sur le principe du cytomètre en flux. Le principe de l'immunofluorimétrie en flux consiste en la fixation d'antigènes purifiés HLA de classe I ou HLA de classe II à la surface de billes de polystyrène. Les anticorps anti-HLA qui reconnaissent les antigènes HLA
de classe I ou HLA de classe II, se lient aux antigènes liés à la surface des billes et sont révélés par des anticorps secondaires anti-IgG couplés à un groupement fluorescent après lavage des billes de polystyrène. Les anticorps secondaires sont détectés par fluorimétrie en flux. Leur intensité de fluorescence est en outre quantifiée.
Pour des tests de dépistage, on utilise en mélange une pluralité
de types de billes, chaque type de billes portant en surface une pluralité
d'antigènes HLA, soit de classe I, soit de classe II. Une telle approche permet de détecter la présence d'anticorps anti-HLA sans toutefois permettre l'identification de leur(s) spécificité(s).
Cette technique qui nécessite soit de disposer d'une grande variété de lymphocytes provenant de donneurs dont le phénotype HLA est connu, soit de cultiver in vitro un grand nombre de lignées cellulaires typées HLA est donc complexe et lourde dans sa mise en oeuvre.
On connaît aussi des techniques plus sensibles, comme le dosage immunoenzymatique sur support solide ( ELISA , pour Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay . En outre, récemment, est apparue la technique d'immunofluorimétrie couplée à une détection en flux conçue sur le principe du cytomètre en flux. Le principe de l'immunofluorimétrie en flux consiste en la fixation d'antigènes purifiés HLA de classe I ou HLA de classe II à la surface de billes de polystyrène. Les anticorps anti-HLA qui reconnaissent les antigènes HLA
de classe I ou HLA de classe II, se lient aux antigènes liés à la surface des billes et sont révélés par des anticorps secondaires anti-IgG couplés à un groupement fluorescent après lavage des billes de polystyrène. Les anticorps secondaires sont détectés par fluorimétrie en flux. Leur intensité de fluorescence est en outre quantifiée.
Pour des tests de dépistage, on utilise en mélange une pluralité
de types de billes, chaque type de billes portant en surface une pluralité
d'antigènes HLA, soit de classe I, soit de classe II. Une telle approche permet de détecter la présence d'anticorps anti-HLA sans toutefois permettre l'identification de leur(s) spécificité(s).
4 En revanche, pour l'identification et la caractérisation de la spécificité de l'anticorps, on utilise en mélange une pluralité de types de billes, chaque type de billes portant en surface un antigène HLA unique.
Des kits pour la détection et l'identification d'anticorps anti-HLA sont connus. Ils comprennent des billes de polystyrène revêtues d'antigènes HLA de classe I ou d'antigènes HLA de classe II et des billes de polystyrène revêtues d'IgG humaines. Sont également commercialisés, un anticorps secondaire anti-IgG humaine couplée à la phycoérythrine et un sérum dépourvu d'anticorps anti-HLA à titre de contrôle négatif. Un tel contrôle négatif est adapté pour quantifier la fixation non spécifique de l'anticorps secondaire sur les billes de polystyrène. De tels kits ne comprennent aucun contrôle positif, ni aucun contrôle de la sensibilité, ni aucun standard permettant de déduire précisément la concentration des anticorps anti-HLA (exprimée, par exemple, en mole/L ou en g/L) dans le milieu analysé à partir de l'intensité de fluorescence mesurée.
En outre de tels kits dépourvus de témoin de calibration et/ou de sensibilité ne permettent pas de déterminer le seuil de sensibilité de la méthode d'analyse, c'est-à-dire la valeur minimale du signal permettant d'affirmer que le signal observé est significativement supérieur au bruit de fond de la mesure.
Pour pallier à ce défaut de contrôle positif dans les méthodes de dépistage et/ou de quantification des anticorps anti-HLA, les laboratoires d'immunologie et d'histocompatibilité utilisent, à titre de contrôle positif, un mélange de plusieurs sérums de plusieurs individus immunisés contre plusieurs antigènes HLA.
Dans un tel contrôle positif, la concentration respective de chacun des anticorps des sérums des individus immunisés est inconnue. Un tel mélange de sérum ne permet pas de corréler l'intensité de la mesure de fluorescence avec une concentration (mol/L ou g/L) d'un anticorps spécifique du mélange de sérums. Il ne permet donc pas de quantifier les anticorps présents dans le sérum du patient greffé ou en attente d'une greffe. Il ne permet donc pas non plus d'évaluer les risques réels de la survenue d'une réponse humorale hyper-aigue.
La réactivité d'un tel mélange de sérums est variable d'un antigène à l'autre et leur utilisation ne permet pas de fixer le seuil de détection pour chaque antigène HLA étudié. De plus, un tel mélange d'anticorps polyclonaux issu de sérums de patient est disponible en quantité limitée et est rapidement épuisé. Il
Des kits pour la détection et l'identification d'anticorps anti-HLA sont connus. Ils comprennent des billes de polystyrène revêtues d'antigènes HLA de classe I ou d'antigènes HLA de classe II et des billes de polystyrène revêtues d'IgG humaines. Sont également commercialisés, un anticorps secondaire anti-IgG humaine couplée à la phycoérythrine et un sérum dépourvu d'anticorps anti-HLA à titre de contrôle négatif. Un tel contrôle négatif est adapté pour quantifier la fixation non spécifique de l'anticorps secondaire sur les billes de polystyrène. De tels kits ne comprennent aucun contrôle positif, ni aucun contrôle de la sensibilité, ni aucun standard permettant de déduire précisément la concentration des anticorps anti-HLA (exprimée, par exemple, en mole/L ou en g/L) dans le milieu analysé à partir de l'intensité de fluorescence mesurée.
En outre de tels kits dépourvus de témoin de calibration et/ou de sensibilité ne permettent pas de déterminer le seuil de sensibilité de la méthode d'analyse, c'est-à-dire la valeur minimale du signal permettant d'affirmer que le signal observé est significativement supérieur au bruit de fond de la mesure.
Pour pallier à ce défaut de contrôle positif dans les méthodes de dépistage et/ou de quantification des anticorps anti-HLA, les laboratoires d'immunologie et d'histocompatibilité utilisent, à titre de contrôle positif, un mélange de plusieurs sérums de plusieurs individus immunisés contre plusieurs antigènes HLA.
Dans un tel contrôle positif, la concentration respective de chacun des anticorps des sérums des individus immunisés est inconnue. Un tel mélange de sérum ne permet pas de corréler l'intensité de la mesure de fluorescence avec une concentration (mol/L ou g/L) d'un anticorps spécifique du mélange de sérums. Il ne permet donc pas de quantifier les anticorps présents dans le sérum du patient greffé ou en attente d'une greffe. Il ne permet donc pas non plus d'évaluer les risques réels de la survenue d'une réponse humorale hyper-aigue.
La réactivité d'un tel mélange de sérums est variable d'un antigène à l'autre et leur utilisation ne permet pas de fixer le seuil de détection pour chaque antigène HLA étudié. De plus, un tel mélange d'anticorps polyclonaux issu de sérums de patient est disponible en quantité limitée et est rapidement épuisé. Il
5 doit donc être remplacé par un autre mélange lui aussi disponible en quantité
variable qui ne permet pas des échanges dudit mélange entre les laboratoires en vue d'une standardisation des résultats. La variabilité des mélanges de sérums d'un lot à
l'autre nécessite une validation fréquente de ces lots qui ne sont ni comparables ni reproductibles d'un lot à l'autre.
En utilisant un tel mélange de sérums, les inventeurs ont montré (figures 2, 3 et 4) que la valeur de l'intensité de la fluorescence associée à
chacun des types de billes de polystyrène dépend de la nature de l'antigène HLA de classe I ou de classe II porté par chacun des types de billes de polystyrène.
En outre, cette valeur d'intensité de fluorescence associée à chacun des types de billes de polystyrène montre une variabilité importante dans le temps -notamment sur une période de l'ordre de cinq mois-. Cette valeur varie (figure 4, histogrammes hachurés) entre 1000 et 20000 unités de fluorescence moyenne.
Il en résulte que la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence mesurée sur l'ensemble des billes de polystyrène présente une dispersion (calculée par son écart-type) importante qui ne permet pas de quantifier les anticorps anti-HLA du milieu liquide. Une telle dispersion est présentée en figure 4 (histogrammes hachurés) de la présente demande de brevet donnée à
titre d'illustration d'un standard de l'art antérieur.
Une telle dispersion des mesures d'intensité de fluorescence ne permet pas -en particulier pour les valeurs faibles d'intensité de fluorescence- de distinguer une valeur faible d'intensité de fluorescence mais traduisant la présence d'une faible concentration d'anticorps anti-HLA, d'une valeur faible d'intensité de fluorescence qui ne peut être distinguée du bruit de fond de la mesure.
Pour les mêmes raisons exposées précédemment, une telle préparation utilisée à titre de contrôle positif dans l'état de la technique ne permet pas de déterminer précisément la concentration d'anticorps présent dans le milieu
variable qui ne permet pas des échanges dudit mélange entre les laboratoires en vue d'une standardisation des résultats. La variabilité des mélanges de sérums d'un lot à
l'autre nécessite une validation fréquente de ces lots qui ne sont ni comparables ni reproductibles d'un lot à l'autre.
En utilisant un tel mélange de sérums, les inventeurs ont montré (figures 2, 3 et 4) que la valeur de l'intensité de la fluorescence associée à
chacun des types de billes de polystyrène dépend de la nature de l'antigène HLA de classe I ou de classe II porté par chacun des types de billes de polystyrène.
En outre, cette valeur d'intensité de fluorescence associée à chacun des types de billes de polystyrène montre une variabilité importante dans le temps -notamment sur une période de l'ordre de cinq mois-. Cette valeur varie (figure 4, histogrammes hachurés) entre 1000 et 20000 unités de fluorescence moyenne.
Il en résulte que la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence mesurée sur l'ensemble des billes de polystyrène présente une dispersion (calculée par son écart-type) importante qui ne permet pas de quantifier les anticorps anti-HLA du milieu liquide. Une telle dispersion est présentée en figure 4 (histogrammes hachurés) de la présente demande de brevet donnée à
titre d'illustration d'un standard de l'art antérieur.
Une telle dispersion des mesures d'intensité de fluorescence ne permet pas -en particulier pour les valeurs faibles d'intensité de fluorescence- de distinguer une valeur faible d'intensité de fluorescence mais traduisant la présence d'une faible concentration d'anticorps anti-HLA, d'une valeur faible d'intensité de fluorescence qui ne peut être distinguée du bruit de fond de la mesure.
Pour les mêmes raisons exposées précédemment, une telle préparation utilisée à titre de contrôle positif dans l'état de la technique ne permet pas de déterminer précisément la concentration d'anticorps présent dans le milieu
6
7 PCT/FR2013/050315 liquide, notamment dans un sérum prélevé sur un patient greffé ou en attente d'une greffe.
L'invention vise à résoudre ces inconvénients en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans l'analyse sérologique des anticorps anti-HLA de classe I ou des anticorps anti-HLA de classe II -notamment dans le contexte de la transplantation d'organes-.
L'invention vise à pallier les inconvénients précédemment évoqués en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une quantification fiable d'anticorps anti-HLA dans le sérum d'un patient.
Une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est en particulier adaptée pour permettre la détection de la survenue chez un patient d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon, même pour une très faible concentration de cet anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour la standardisation des méthodes de détection d'anticorps anti-HLA. En permettant en particulier de définir précisément le seuil de détection, l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention permet au biologiste de valider la méthode de recherche d'anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une détection la plus précoce possible de la survenue d'anticorps anti-HLA dirigés contre les antigènes HLA du greffon. Une telle détection précoce permet en particulier de déceler la plus rapidement possible le rejet humoral et donc de prescrire rapidement le traitement curatif du rejet de l'organe transplanté.
L'invention vise à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale permettant de standardiser et de calibrer les méthodes de recherche d'anticorps anti-HLA dans un liquide biologique.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale susceptible de permettre l'accréditation d'une méthode standardisée de dépistage, de quantification et de caractérisation d'anticorps anti-HLA selon les nouvelles normes réglementaires d'accréditation des laboratoires d'analyse médicale. En France, les laboratoires d'analyse -notamment d'immunologie- médicale doivent satisfaire à la norme 15189 du COFRAC (Comité
Français d'Accréditation).
L'invention vise aussi à proposer une composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de calibration quantitative dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA, notamment par immunofluorimétrie.
L'invention vise en particulier à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme standard de quantification dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA
par la technologie Luminex .
L'invention vise aussi à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique comme étalon quantitatif dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA par cytométrie en flux, par la technique ELISA ou la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise donc à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale et une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale à utiliser comme étalon quantitatif en lieu et place d'un mélange complexe d'anticorps issu du mélange d'un ou de plusieurs sérums de patients.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale qui soit disponible en grande quantité et dont la production est parfaitement standardisée en termes de concentration d'anticorps anti-HLA
et en termes de composition.
L'invention vise en outre à proposer une solution aqueuse stable d'une telle immunoglobuline chimérique monoclonale dont la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est parfaitement connue pour la standardisation d'une méthode de dépistage et/ou de quantification et/ou de caractérisation d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide.
L'invention vise à résoudre ces inconvénients en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans l'analyse sérologique des anticorps anti-HLA de classe I ou des anticorps anti-HLA de classe II -notamment dans le contexte de la transplantation d'organes-.
L'invention vise à pallier les inconvénients précédemment évoqués en proposant une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une quantification fiable d'anticorps anti-HLA dans le sérum d'un patient.
Une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est en particulier adaptée pour permettre la détection de la survenue chez un patient d'anticorps dirigés contre les antigènes du greffon, même pour une très faible concentration de cet anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour la standardisation des méthodes de détection d'anticorps anti-HLA. En permettant en particulier de définir précisément le seuil de détection, l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention permet au biologiste de valider la méthode de recherche d'anticorps.
L'invention vise à proposer une immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour permettre une détection la plus précoce possible de la survenue d'anticorps anti-HLA dirigés contre les antigènes HLA du greffon. Une telle détection précoce permet en particulier de déceler la plus rapidement possible le rejet humoral et donc de prescrire rapidement le traitement curatif du rejet de l'organe transplanté.
L'invention vise à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale permettant de standardiser et de calibrer les méthodes de recherche d'anticorps anti-HLA dans un liquide biologique.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale susceptible de permettre l'accréditation d'une méthode standardisée de dépistage, de quantification et de caractérisation d'anticorps anti-HLA selon les nouvelles normes réglementaires d'accréditation des laboratoires d'analyse médicale. En France, les laboratoires d'analyse -notamment d'immunologie- médicale doivent satisfaire à la norme 15189 du COFRAC (Comité
Français d'Accréditation).
L'invention vise aussi à proposer une composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme réactif de calibration quantitative dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA, notamment par immunofluorimétrie.
L'invention vise en particulier à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comme standard de quantification dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA
par la technologie Luminex .
L'invention vise aussi à proposer une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique comme étalon quantitatif dans les tests de dépistage des anticorps anti-HLA par cytométrie en flux, par la technique ELISA ou la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise donc à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale et une telle composition d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale à utiliser comme étalon quantitatif en lieu et place d'un mélange complexe d'anticorps issu du mélange d'un ou de plusieurs sérums de patients.
L'invention vise aussi à proposer une telle immunoglobuline chimérique monoclonale qui soit disponible en grande quantité et dont la production est parfaitement standardisée en termes de concentration d'anticorps anti-HLA
et en termes de composition.
L'invention vise en outre à proposer une solution aqueuse stable d'une telle immunoglobuline chimérique monoclonale dont la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est parfaitement connue pour la standardisation d'une méthode de dépistage et/ou de quantification et/ou de caractérisation d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide.
8 Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, dans lequel :
- on réalise une pluralité de solutions (Sn) -notamment de solutions aqueuses- d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (Sn) présentant une valeur (Ce) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (Sn) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (Ce) de concentration déterminée à une valeur (Va) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (Va) mesurée étant représentative d'une quantité
(Qn) de l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (Ce, Vn) de concentration (Ce) déterminée et de valeur (Va) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (Va) mesurée en fonction de la concentration (Ce) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (S.) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au-delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des
- on réalise une pluralité de solutions (Sn) -notamment de solutions aqueuses- d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (Sn) présentant une valeur (Ce) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (Sn) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (Ce) de concentration déterminée à une valeur (Va) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (Va) mesurée étant représentative d'une quantité
(Qn) de l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (Ce, Vn) de concentration (Ce) déterminée et de valeur (Va) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (Va) mesurée en fonction de la concentration (Ce) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (S.) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au-delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des
9 épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Dans tout le texte, les expressions antigène HLA de classe I et antigène HLA de classe II (HLA pour Human Leucocyte Antigen ) désignent des antigènes qui sont humains par nature.
L'invention consiste donc aussi à proposer un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA dans lequel on réalise une courbe d'étalonnage à partir d'une solution d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite immunoglobuline chimérique monoclonale présentant une concentration connue dans ladite solution.
En effet, les inventeurs ont constaté qu'il n'existe pas de solution connue dans l'état de la technique pour permettre une évaluation quantitative qui soit fiable et reproductible de la concentration en anticorps anti-HLA de classe I et de classe II dans un milieu liquide.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
'o Avantageusement et selon l'invention, la concentration (Cg) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale est au plus égale à
104 g/mL, notamment comprise entre 10-1 g/mL et 10-4 g/mL. Toute concentration inférieure à 10-4 g/mL peut être obtenue par dilution d'une solution de concentration élevée, en particulier de l'ordre de 10-4 g/mL.
Avantageusement, on réalise des dilutions progressives croissantes de l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On utilise ces solutions (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention de concentrations connues pour associer chaque concentration (Ce) des solutions (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale avec une valeur (Va) mesurée d'un paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, dans un procédé selon l'invention, on choisit chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère -notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence. Ainsi, chaque valeur (Va) du paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence.
wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 Avantageusement et selon l'invention, on mesure chaque valeur (Va) mesurée du paramètre par une technique choisie dans le groupe formé
de l'immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, de la cytométrie en flux, d'une méthode par dosage immunoenzymatique sur support solide (ELISA), d'une Avantageusement dans une première variante d'un procédé
selon l'invention :
a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ;
b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photo-absorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (Va) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement, dans une deuxième variante et selon l'invention, chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule -notamment une cellule en culture in vitro-.
Avantageusement, dans cette deuxième variante d'un procédé
selon l'invention :
i) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule ;
j) on met en contact les antigènes HLA présentés en surface d'au moins une cellule et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA de la (des) cellule(s) et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
k) on élimine par lavage l'immunoglobuline chimérique monoclonale non liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s), puis ;
1) on met en contact l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s) avec une solution d'un anticorps secondaire dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
m) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
n) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque cellule et on attribue à cette mesure une valeur (Va) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
o) on forme la courbe de calibration, puis ;
p) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement et selon l'invention, le support solide à
l'état divisé est sous forme de particules de forme sensiblement sphériques et de dimension adaptée pour permettre leur analyse par fluorimétrie en flux.
Avantageusement et selon l'invention, on détermine la courbe de calibration par régression non linéaire à partir des mesures d'intensité de fluorescence.
Avantageusement et selon l'invention, le milieu liquide est choisi dans le groupe formé des fluides biologiques -notamment d'un sérum-prélevé sur un individu.
Avantageusement et selon l'invention, l'individu est un patient choisi dans le groupe formé des patients en attente d'une greffe et des patients greffés.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
L'invention vise aussi l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale dans une méthode de dépistage -notamment une méthode de recherche ou une méthode d'identification- ou de quantification d' anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise en particulier l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale à titre de réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans une méthode de dépistage ou de quantification d'anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément, caractérisée en ce l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de:
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que:
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que:
- chaque chaîne (L) légère comprend :
0 une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de 5 classe II, et;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
On utilise donc une immunoglobuline chimérique
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Dans tout le texte, les expressions antigène HLA de classe I et antigène HLA de classe II (HLA pour Human Leucocyte Antigen ) désignent des antigènes qui sont humains par nature.
L'invention consiste donc aussi à proposer un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA dans lequel on réalise une courbe d'étalonnage à partir d'une solution d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite immunoglobuline chimérique monoclonale présentant une concentration connue dans ladite solution.
En effet, les inventeurs ont constaté qu'il n'existe pas de solution connue dans l'état de la technique pour permettre une évaluation quantitative qui soit fiable et reproductible de la concentration en anticorps anti-HLA de classe I et de classe II dans un milieu liquide.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
'o Avantageusement et selon l'invention, la concentration (Cg) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale est au plus égale à
104 g/mL, notamment comprise entre 10-1 g/mL et 10-4 g/mL. Toute concentration inférieure à 10-4 g/mL peut être obtenue par dilution d'une solution de concentration élevée, en particulier de l'ordre de 10-4 g/mL.
Avantageusement, on réalise des dilutions progressives croissantes de l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On utilise ces solutions (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention de concentrations connues pour associer chaque concentration (Ce) des solutions (Sn) d'immunoglobuline chimérique monoclonale avec une valeur (Va) mesurée d'un paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, dans un procédé selon l'invention, on choisit chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère -notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
Avantageusement et selon l'invention, le paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence. Ainsi, chaque valeur (Va) du paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence.
wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 Avantageusement et selon l'invention, on mesure chaque valeur (Va) mesurée du paramètre par une technique choisie dans le groupe formé
de l'immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, de la cytométrie en flux, d'une méthode par dosage immunoenzymatique sur support solide (ELISA), d'une Avantageusement dans une première variante d'un procédé
selon l'invention :
a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ;
b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photo-absorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (Va) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement, dans une deuxième variante et selon l'invention, chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule -notamment une cellule en culture in vitro-.
Avantageusement, dans cette deuxième variante d'un procédé
selon l'invention :
i) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule ;
j) on met en contact les antigènes HLA présentés en surface d'au moins une cellule et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA de la (des) cellule(s) et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
k) on élimine par lavage l'immunoglobuline chimérique monoclonale non liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s), puis ;
1) on met en contact l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée aux antigènes HLA de la (des) cellule(s) avec une solution d'un anticorps secondaire dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
m) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
n) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque cellule et on attribue à cette mesure une valeur (Va) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence -notamment d'un paramètre de fluorescence mesuré par immuno-fluorimétrie quantitative (technique Luminex avec des billes revêtues d'antigènes HLA) ou par la technique de cytométrie en flux (réalisée avec des lymphocytes)-, d'un paramètre de luminescence -notamment d'un paramètre de chemiluminescence- et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
o) on forme la courbe de calibration, puis ;
p) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
Avantageusement et selon l'invention, le support solide à
l'état divisé est sous forme de particules de forme sensiblement sphériques et de dimension adaptée pour permettre leur analyse par fluorimétrie en flux.
Avantageusement et selon l'invention, on détermine la courbe de calibration par régression non linéaire à partir des mesures d'intensité de fluorescence.
Avantageusement et selon l'invention, le milieu liquide est choisi dans le groupe formé des fluides biologiques -notamment d'un sérum-prélevé sur un individu.
Avantageusement et selon l'invention, l'individu est un patient choisi dans le groupe formé des patients en attente d'une greffe et des patients greffés.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
L'invention vise aussi l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale dans une méthode de dépistage -notamment une méthode de recherche ou une méthode d'identification- ou de quantification d' anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
L'invention vise en particulier l'utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale à titre de réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans une méthode de dépistage ou de quantification d'anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément, caractérisée en ce l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de:
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que:
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que:
- chaque chaîne (L) légère comprend :
0 une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de 5 classe II, et;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
On utilise donc une immunoglobuline chimérique
10 monoclonale selon l'invention dans laquelle les parties constantes (CH) des chaînes lourdes et les parties constantes (CL) des chaînes légères sont constituées des parties constantes d'une IgA humaine dans des essais de compétition. De telles immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention sont adaptées pour inhiber au moins partiellement la fixation d'anticorps poly-clonaux 15 anti-HLA de classe IgG (ou IgM) présent dans le sérum des malades.
L'inhibition de la fixation des IgG du sérum par les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention permet de démontrer la spécificité de la fixation des IgG sur les supports immuno-adsorbants utilisés dans les tests de dépistage d'anticorps anti-HLA par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée avec lecture en flux sur appareil Luminex , par cytométrie en flux, par les techniques ELISA, et par la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
En particulier, les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA permettent de différencier un signal spécifique correspondant à la présence réelle d'IgG anti-HLA dans le sérum, vis-à-vis d'un signal non spécifique correspondant à l'adsorption des IgG sur le support présentateur des antigènes HLA. Cette compétition des immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention pour la recherche d'IgG
anti-HLA a été démontrée par d'immuno-fluorimétrie quantitative sur Luminex .
Les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgG et de classe IgM selon l'invention peuvent être employées comme contrôles positifs et contrôles de sensibilité de l'épreuve de compatibilité directe (cross-match) entre un receveur et un donneur d'organe réalisée juste avant la greffe d'organe par toute technique adaptée (micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément ou en cytométrie en flux) et dans toute technique de détection des anticorps de classe IgG ou IgM sur un support immunoabsorbant (ELISA ou immuno-fluorimétrie quantitative sur bille de polystyrène).
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que:
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe, et;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes HLA de classe I est conformé pour pouvoir reconnaitre un épitope commun à tous les antigènes HLA de classe I.
Avantageusement et selon l'invention, l'immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 1, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourde choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe II formée de :
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourdes choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes anti-HLA de classe II est conformé pour pouvoir reconnaitre un épitope commun à sensiblement tous les antigènes HLA de classe II.
Avantageusement, une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I ou de classe II selon l'invention désigne une immunoglobuline dans laquelle :
o les chaînes lourdes et les chaînes légères sont humaines par nature dans leurs parties constantes. En particulier, les parties constantes des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgA, des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgG et des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgM et les parties constantes des chaînes légères sont choisies dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda, et;
o les parties variables des chaines légères et des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II. Dans une telle immunoglobuline chimérique monoclonale, les parties constantes (CH) des chaînes lourdes de l'anticorps humain et les parties constantes (CL) des chaînes légères de l'anticorps humain représentent ensemble de l'ordre de 60 % en masse de l'immunoglobuline chimérique monoclonale. En outre, une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est un anticorps monoclonal, c'est-à-dire spécifique d'un épitope mono-morphique unique.
Avantageusement, chaque anticorps monoclonal est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré
-notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré -notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II.
Dans tout le texte, on entend par organisme vertébré non humain , un être vivant organisé supérieur à l'exclusion de l'homme. Un tel organisme vertébré est en particulier pourvu d'un système immunitaire. Un tel organisme vertébré est en particulier choisi dans le groupe formé des mammifères non humains -notamment de la souris, du rat, du lapin et du hamster- des batraciens et des oiseaux -notamment des galliformes-. De tels organismes vertébrés non humains sont en particulier des animaux de laboratoire. Cependant, un tel anticorps monoclonal peut être choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux humains.
wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 Avantageusement et selon l'invention, chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère -notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
L'invention vise en outre une solution stable d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention dans une composition aqueuse.
L'invention vise aussi une telle solution aqueuse d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite solution aqueuse présentant une concentration prédéterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale.
L'invention vise aussi une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir permettre une détermination de la quantité
d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
L'invention s'étend par ailleurs à un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité
prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention et une notice explicative pour la mise en oeuvre d'un procédé
selon l'invention.
Ainsi, l'invention vise un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité
prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comprenant :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
5 - deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce que:
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda ;
ledit kit comprenant aussi une notice explicative pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, une immunoglobuline chimérique monoclonale, son utilisation et un kit pour cette détermination, caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquels :
¨ la figure 1 est une représentation graphique de la variation temporelle de l'intensité de fluorescence de 17 types de billes traitées selon un contrôle négatif ;
¨ la figure 2 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 12 types de billes porteuses d'antigènes HLA
de classe I d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
¨ la figure 3 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 5 types de billes HLA de classe II d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
¨ la figure 4 est une représentation comparative en histogramme de l'intensité de fluorescence d'un contrôle positif selon l'état de la technique et d'un contrôle positif selon l'invention, dans laquelle ;
o la figure 4A est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
o la figure 4B est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
¨ la figure 5 est une analyse par cytométrie en flux de la fixation d'immunoglobulines monoclonales chimériques de classe I et de classe II
selon l'invention sur des lymphocytes T et des lymphocytes B ;
- la figure 6A est une représentation graphique de 12 courbes dose/réponse superposées correspondant à 12 types de billes HLA de classe I
traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g /mL ;
- la figure 6B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne de 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 6A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g/mL ;
- la figure 7A est une représentation graphique de 5 courbes dose/réponse superposées correspondant à 5 types de billes HLA de classe II
traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en pig/mL ;
- la figure 7B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne des 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 7A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g /mL ;
- la figure 8A est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 8B est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré
blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 9 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) et correspond à la séquence SEQ ID_NO 1;
- la figure 10 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2;
- la figure 11 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3;
- la figure 12 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4;
- la figure 13 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5 ;
- la figure 14 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6;
- la figure 15 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7;
- la figure 16 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
EXEMPLE 1 - Obtention d'une immunoglobuline chimérique monoclonale IgG/anti-HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) selon l'invention.
L'anticorps W6/32 a été décrit pour la première fois dans la publication de Barnstable et al. en 1978 (Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A., 1978, Celle, 14(1), 9-20.
Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis). Cet anticorps est sécrété
par un hybridome de souris provenant de la fusion de cellules d'une lignée de myélome de souris (lignée P3-NSI/1 Ag4-1 non sécrétrice d'immunoglobuline de souris) avec les lymphocytes d'une souris immunisée contre des cellules humaines. Il a été
démontré que cet anticorps réagit avec un épitope public retrouvé sur les molécules HLA de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-C). L'épitope reconnu est un épitope de conformation qui dépend de l'association entre la chaîne lourde alpha de classe I et de la microglobuline bêta 2. L'épitope requiert la présence d'une arginine en position 3 de la bêta-2-microglobuline et d'une lysine en position 121 de la chaîne alpha (Ladasky JJ, Shum BP, Canavez F, Seuànez HN, Parham P., (1999), Immunogenetics, 49(4), 312-320. Residue 3 of beta2-microglobulin affects binding of class I MHC molecules by the W6/32 antibody).
Dans une première étape, les transcrits codant la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps W6/32 ont été clonés et séquencés.
La copie ADN des ARNm (ADNc) de la chaîne lourde a été
amplifiée par PCR à l'aide de deux amorces, l'une spécifique de la région codant le peptide amorce ( leader peptide ), l'autre ciblant la partie 5' qui code le domaine CH1 de la partie constante.
Pour l'amplification de l'ADNc de la chaîne légère, une amorce ciblant l'exon du peptide leader et une amorce ciblant la partie 5' du domaine C Kappa ont été utilisées. Les fragments d'ADNc des deux chaînes ont été
clonés dans E coli. Les fragments clonés ont été séquencés. L'alignement des séquences a permis d'établir les consensus des ADNc de la chaîne lourde et de la chaîne légère avec un seuil d'identité de 98%. Les régions codant les parties variables ont été déterminées par comparaison avec les séquences présentes dans la banque de données de l'IMGT ( International Immunogenetics Information System ).
Des séquences codant un peptide amorce de chaîne légère ou de chaîne lourde suivant le cas ont été ajoutées en 5' et les séquences en 3' ont été
modifiées de façon à créer un site de restriction B siWI pour l'ADN de la chaîne légère et un site de restriction NheI pour la chaîne lourde. Ces sites de restrictions sont adaptés pour permettre une insertion de ces séquences nucléiques dans les vecteurs de clonages pFUSE-CLIg et pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France).
Les séquences ainsi définies ont été synthétisées puis clonées dans des vecteurs d'expression comportant soit la partie codant le domaine constant de la chaîne Kappa humaine (allotype Km 01; numéro d'accès Genbank : J00241) soit la partie constante des IgG1 humaines. Le site de restriction du vecteur d'expression permettant d'insérer les ADNc des parties variables en phase avec les régions codant les parties constantes des chaînes d'immunoglobuline.
5 Deux vecteurs d'expression, l'un codant pour une chaîne légère chimère associant la partie variable de la chaîne légère de l'anticorps et le domaine C Kappa humain (chaîne VL [W6/32]-C Kappa humaine), l'autre associant la partie variable de la chaîne lourde de l'anticorps W6/32 et le domaine C
gamma 1 humain (VL [W6/32]-C gammal humaine) ont été ainsi obtenus.
10 Ces deux vecteurs ont été introduits par transfection dans des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells). Pour ce faire, les cellules ont d'abord été transfectées par le vecteur codant la chaîne légère puis par celui codant la chaîne lourde. Les vecteurs d'expression comportent des facteurs de résistances à des drogues cytotoxiques permettant de sélectionner efficacement les cellules doublement transfectées. Après la période de sélection, les cellules doublement transfectées ont été clonées par dilution limite et la présence des IgG1 Kappa humaines ont été révélée dans le surnageant des clones par une technique d'ELISA
sandwich. Les clones producteurs ainsi révélés ont été soumis à une pluralité
de cycles de clonage par dilution limite de manière à recruter les clones les plus efficaces dans la sécrétion de l'IgG1 Kappa chimère dénommée ci-après Hu-IgG1 K
[W6/32] .
Les Hu-IgG1 K [W6/32] sécrétées dans le surnageant de culture des cellules CHO transfectées ont été purifiées par capture-élution sur la protéine A du staphylocoque liée à des billes de Sépharose . Les IgG1 Kappa ont 25 été
éluées à pH acide dans un tampon glycine à pH 2. L'éluat a été tamponné
extemporanément par une solution aqueuse de phosphate di-sodique à la concentration de 750 mM. Les solutions d'Hu-IgG1 K [W6/32] sont conservées à
4 C ou à -80 C.
La séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu-IgG1 K [W6/32] est représentée en figure 9 et correspond à la séquence SEQ
ID_NO 1. La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu-IgG1 K [W6/32] est représentée en figure 10 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2.
La vérification de la spécificité de la liaison de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] selon l'invention a été réalisée sur des lymphocytes T ou sur des lymphocytes B séparées sur gradient de densité à partir de sang humain prélevé sur tube EDTA. Les cellules ont été
marquées par des anticorps anti-CD3, anti-CD19 et anti-CD45. Les lymphocytes T
(CD3+) et B (CD19+) sont définis parmi la population des lymphocytes CD45+.
On incube l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] en présence de cellules mononuclées humaines (lymphocytes T ou lymphocytes B) du sang périphérique, puis on réalise trois lavages successifs desdites cellules mononuclées humaines suivi de trois lavages en tampon phosphate salin (PBS). On révèle la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales fixées sur les cellules mononuclées humaines au moyen d'anticorps de chèvre anti-Fcy humain. Les résultats sont présentés en figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu-IgG1 K [W6/32] se fixe sur les lymphocytes B (figure 5A) et avec les lymphocytes T (figure 5C) alors que l'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] se fixe sur les lymphocytes B
(figure 5B) et pas sur les lymphocytes T (figure 5D).
EXEMPLE 2 ¨ Spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32]
La spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32] a ensuite été déterminée par une technique de fluorimétrie quantitative multiplexée en utilisant des trousses commerciales distribuées par la société One Lambda . Cette détermination est fondée sur une réaction d'immunofluorescence indirecte et utilisent des billes de latex revêtues d'antigène HLA de divers groupes. Les anticorps capables de reconnaitre les antigènes HLA présents sur les billes de latex sont révélés par des anticorps anti IgG humaines couplés à la phycoérythrine. La fluorescence est quantifiée sur chaque bille par cytométrie en flux sur un appareil Luminex . Un marquage fluorescent spécifique de chaque type de billes permet de mettre en jeu plusieurs variétés de billes (reconnaissable par leur fluorescence), chaque bille étant revêtue d'un mélange d'antigènes HLA donné. Ceci permet de démontrer que toutes les billes de classe I sont reconnues avec sensiblement la même intensité (figure 4A, billes de classe I). Ceci nous permet de conclure que l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] reconnait un épitope public présent sur toutes les molécules HLA de classe I.
Des expériences de compétition ont permis de démontrer que l'anticorps monoclonal de souris W6/32 sécrété par l'hybridome de souris inhibe la fixation de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32]
EXEMPLE 3 - Obtention d'anticorps monoclonaux chimériques anti-HLA de classe I d'isotype IgA2 et IgM (Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32]) selon l'invention.
La partie variable de la chaîne lourde W6/32 (VH[W6/32]) a été clonée dans deux autres vecteurs d'expression le premier permet de produire des chaînes mu chimères (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine mu (Numéro d'accès Genbank : AY510104.1), l'autres des chaînes alpha 2 chimère (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine alpha 2, allotype A2m(1) (Numéro d'accès Genbank : J00221). Ces deux vecteurs ont été utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO
préalablement transfectées par le vecteur permettant l'expression de la chaîne légère chimère VL[W6/32]-K humaine. Nous avons ainsi isolé un clone de cellules CHO
sécrétant de grandes quantités d'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [W6/32] et un autre clone sécrétant une immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [W6/32]. Les IgA chimériques ont été purifiées sur un support d' agarose couplé au peptide M (InvivoGen, Toulouse, France) et les IgM
chimériques ont été purifiées sur un support d' agarose couplé à la protéine L
(InvivoGen, Toulouse, France) selon les recommandations du fournisseur.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgA2-anti-HLA classe I) Hu-IgA2 K
[W6/32] est représentée en figure 11 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgM-anti-HLA classe I) est représentée en figure 12 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4.
La réactivité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32] a été vérifiée en technique Luminex avec les trousses Labscreen mixed (One Lambda ) et, à
titre d'anticorps secondaires fluorescents, des anticorps de chèvre anti-IgA
humaines ou anti-IgM humaines couplés à la phycoérythrine.
EXEMPLE 4 ¨ Obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K [F3.3]) selon l'invention.
Dans son principe, le procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe II est comparable au procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe I (W6/32).
L'anticorps F3.3 (Elsasser, D., Valerius, T., Repp, R., Weiner, G.J., Deo, Y., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Stevenson, G.T., Glennie, M.J. and Gramatzki, M., (1996), Blood, 87(9), 3803-3812. HLA class II as potential target antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies in combination with granulocyte colony-stimulating factor) est le produit d'un clone unique d'hybridome de souris. L'anticorps F3.3 reconnait au moins un épitope public présent à la surface de toutes les cellules humaines exprimant les molécules HLA de classe II. En particulier, l'anticorps F3.3 reconnait tous les antigènes DR, tous les antigènes DP et tous les antigènes du groupe DQ2. Les séquences complètes codantes des parties variables de l'anticorps F3.3 sont accessibles sur GenBank (numéros d'accès : AY058910 [VL] pour la chaîne légère et AY058911 [VH] pour la chaîne lourde).
Les séquences des parties variables ont été synthétisées et clonées en phase dans les vecteurs de clonage pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes lourdes et pFUSE-CLIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes légères. Le vecteur (pFUSE-CHIg) permet la production de la chaîne lourde chimère VH[F3.3]-C gamma 1 humaine et le vecteur (pFUSE-CLIg) permet la production de la chaîne légère VL[F3.3]-C Kappa humaine. Ces deux vecteurs d'expressions sont utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO
comme décrit à l'exemple 1.
En outre, la partie variable VH[F3.3] a été clonée dans des vecteurs d'expression permettant la production de chaînes lourdes chimères VH[F3.3]-C mu humaine et VH[F3.3]-C alpha 2 humaine.
La séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K
[F3.3]) est représentée en figure 13 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgA2 K
[F3.3]) est représentée en figure 14 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K
[F3.3]) est représentée en figure 15 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgM K
[F3.3]) est représentée en figure 16 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
Les immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K
[F3.3], Hu-IgA2 K [F3.3] et Hu-IgM K [F3.3] dirigés contre les antigènes HLA
de classe II ont été produits par des cellules CHO transfectées par les vecteurs appropriés. Les IgG1 chimères ont été purifiées sur protéine A Sépharose. Les IgA
chimères ont été purifiées sur peptide M-agarose (InvivoGen, Toulouse, France).
Les IgM chimères ont été purifiées sur protéine L-Agarose (InvivoGen, Toulouse, France).
On vérifie la spécificité de la liaison de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] selon l'invention par une technique d'immunofluorescence indirecte par cytométrie en flux sur des cellules humaines mononuclées telle que décrite à l'exemple 1. Les résultats sont présentés à la figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] selon l'invention réagit fortement contre les cellules humaines, notamment avec les lymphocytes B
(figure 5B) et avec les lymphocytes T (figure 5D).
En outre, on étudie la spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales anti-HLA de classe II selon l'invention par la technique d'immunofluorimétrie quantitative multiplexée sur Luminex à l'aide de trousses Labscreen mixed et Labscreen single antigen (One Lambda ).
5 L'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] s'est fixé sur toutes les billes portant les antigènes HLA de classe II du kit Labscreen mixed et sur toutes les billes portant les antigènes HLA-DR, HLA-DP et HLA-DQ2 du kit Labscreen single antigen class Il .
Il a été démontré, par des expériences de compétition, que les 10 immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [F3.3] et Hu-IgA2 K
[F3.3] reconnaissent le même épitope. La réactivité de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] a été étudiée par technique Luminex avec les trousses Labscreen mixed (One-Lambda ) en utilisant, comme révélateur de la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [F3.3], 15 des anticorps de chèvre anti-IgA humaines couplés à la phycoérythrine. La réactivité de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] s'est révélée identique à celle de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3].
EXEMPLE 5 - Procédé de quantification in vitro des 20 anticorps anti-HLA
Dans un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps par immunofluorescence selon l'invention, on utilise, à titre d'exemple non limitatif, un kit de laboratoire Labscreen mixed (LSM12, One Lambda Inc., USA) comprenant :
25 - des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) purifiés, et, en mélange ;
- des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe II (HLA-DR, HLA-DQ et HLA-DP) purifiés ;
- des billes de polystyrène, dites billes de contrôle positif, 30 liées à des IgG ;
¨ des billes de polystyrène, dites billes de contrôle négatif, dépourvues d'antigène surface. Un tel kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend une suspension aqueuse de billes de polystyrène de dépistage des anticorps anti-HLA de classe I et des anticorps anti-HLA de classe II. Les billes de polystyrène de cette suspension comprennent une pluralité de type de billes de polystyrène, chaque type de bille de polystyrène étant différencié des autres types de bille de polystyrène au moyen d'un marqueur fluorescent et comprenant des billes de polystyrène porteuses d'antigènes HLA de classe I et d'antigène HLA
de classe II distincts. En pratique, chaque type de bille de polystyrène présente en surface des billes de polystyrène jusqu'à six antigènes HLA-A (classe I), six antigènes HLA-B (classe I), six antigènes HLA-C (classe I), ou six antigènes HLA-DQ (classe II), six antigènes HLA-DR (classe II), six antigènes HLA-DP (classe II).
Le kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend 12 types de billes de polystyrène classe I et 5 types de billes de classe II dont l'intensité de fluorescence de chacun des 17 types de billes de polystyrène est susceptible d'être mesurée simultanément. Ainsi, on calcule la moyenne de l'intensité de fluorescence de chacun des types de billes de polystyrène liée à un même ensemble d'antigènes HLA. Au sein de ce mélange de billes de polystyrène, certaines sont dépourvues d'antigène HLA de classe I et d'antigène HLA de classe II et servent de contrôle négatif.
L'utilisation du kit de laboratoire (Labscreen mixed ) nécessite en outre un sérum témoin négatif (LabScreen Negative Control (LSNC) serum) lors de la réaction de dépistage des anticorps anti-HLA. Ce sérum est caractérisé par le fabriquant comme étant dépourvu d'anticorps anti-HLA de classe I et d'anticorps anti-HLA de classe II.
Les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence observée sur une durée de cinq mois associée à chacun des 12 types de billes porteuses d'antigènes de classe I et à chacun des 5 types de billes porteuses d'antigènes de classe II traitées avec un tel contrôle négatif sont données au tableau 1 ci-après.
Classe d'Ag HLA Numéro de bille Moyenne de fluorescence Ecart-type reconnue 6 79,82 30,26 7 110,87 39,45 88 118,09 30,31 17 94,16 38,98 69 136,93 54,01 79 136,67 49,73 Classe I
84 109,79 35.61 86 102,07 27,77 87 119.96 32,50 88 100,67 30,04 89 90,89 25,85 90 157,12 73,60 91 112,79 35,91 93 143,52 39,21 Classe II 95 104,89 34,79 96 153,14 55,02 97 117,61 46,14 Tableau 1 Les valeurs présentées au tableau 1 sont faibles et traduisent la fluorescence générée par la liaison non spécifique des IgG sur les billes de polystyrène, et la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire sur ces billes.
Contrôle positif Le kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend, à titre de contrôle positif, des billes de polystyrène en surface desquelles sont greffées des IgG humaines purifiées. Un tel contrôle positif est limité dans son utilisation à la vérification de la fonctionnalité de l'anticorps secondaire. Un tel contrôle positif ne permet pas la conversion d'une valeur d'intensité de fluorescence en une valeur de concentration d'anticorps anti-HLA dans un milieu liquide.
Contrôle positif polyclonal Les utilisateurs du kit (Labscreen mixed ) -notamment les laboratoires d'immunologie- préconisent d'utiliser, à titre de contrôle positif lors du dépistage des anticorps anti-HLA in vitro selon l'état de la technique, un mélange de sérums provenant d'individus polyimmunisés contre les antigènes HLA. A titre d'exemple, les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence mesurée sur une période de 5 mois associée à chaque type de billes HLA de classe I et de classe II de ce contrôle polyclonal sont données dans le tableau 2 ci-après.
Classe d'Ag HLA Numéro de bille Moyenne de fluorescence Ecart-type reconnue 6 3821,21 1980,68 7 5313,44 2261,91 88 4103,80 1812,89 17 3808,23 1726,83 69 2699,31 1759,92 79 2316,98 1341,26 Classe I
84 2437,50 1672,73 86 3163,40 1765,90 87 1836,57 1379,55 88 2082,32 1364,82 89 15691,55 1791,89 90 15158,40 2072,65 91 14433,92 2197,01 93 13343,17 2492,20 Classe II 95 14550,62 2162,28 96 207,17 232,44 97 589,34 670,31 Tableau 2 La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe I traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 technique est de l'ordre de 5200 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 4900 unités de fluorescence.
La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe II traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la technique est de l'ordre de 8600 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 7500 unités de fluorescence.
L'intensité de fluorescence de chacun des types de bille de polystyrène du contrôle qualitatif varie entre 1000 et 20000. Une telle variabilité de la réponse de chacun des types de billes de polystyrène (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR et HLA-DP) ne permet pas de définir une courbe unique de conversion de l'intensité de fluorescence mesurée en une concentration d'anticorps anti-HLA de référence. En outre, une telle courbe de conversion de l'intensité
de fluorescence mesurée ne peut être obtenue, compte tenu du fait que la concentration en anticorps HLA spécifique de chacun des types d'antigène HLA ne peut être déterminée dans le contrôle qualitatif de l'état de la technique.
A titre d'exemple d'un contrôle qualitatif de l'état de la technique, une analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit Labscreen mixed montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe I (type de bille n 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4A) varie entre une valeur de l'ordre de 7000 unités de fluorescence moyenne et 12000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 9600 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 3100 unités de fluorescence.
En outre, cette analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit Labscreen mixed montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B) varie entre une valeur de l'ordre de 1000 unités de fluorescence moyenne et 19000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe II est de l'ordre de 13000 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 8300 unités de fluorescence.
Un tel contrôle est donc limité dans son utilisation à une analyse purement qualitative dès lors que la concentration de chaque anticorps dans 5 le mélange de sérum n'est pas connue.
Immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention On utilise, à titre de contrôle quantitatif du kit de laboratoire (Labscreen mixed ), une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On prépare des solutions d'une immunoglobuline chimérique 10 monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-Ig 1 K [W6/32]) et/ou anti-HLA de classe II
(Hu-Igl K [F3.3]) telles que décrites aux exemples 1 à 4 à une concentration connue de 2 pig/mL. On réalise une analyse de l'intensité de fluorescence moyenne associée à chaque type de bille de polystyrène porteur d'un antigène-HLA de classe I ou de classe II. Les résultats obtenus sont présentés en figure 4 (histogrammes blancs).
15 On observe, pour chaque type de bille de polystyrène du kit Lab screen mixed une intensité de fluorescence de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne.
En particulier, cette analyse montre que :
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un 20 antigène de classe I (type de bille n 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4A, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 21500 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 450 unités de 25 fluorescence ;
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 700 30 unités de fluorescence.
Cette valeur d'intensité de fluorescence est sensiblement constante quelle que soit le type de bille de polystyrène (quel que soit l'antigène HLA porté par le type de bille de polystyrène) et correspond à une concentration en anticorps de 2 pig/mL. De tels anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention sont adaptés pour permettre un étalonnage quantitatif de la réponse en fluorescence en fonction de la concentration en anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention.
A titre comparatif de l'invention (histogrammes pleins en figure 4A et 4B) et de l'état de la technique (histogrammes hachuré en figure 4A et 4B), les valeurs de la fluorescence moyenne (et écart-type) relevée sur les billes porteuses d'antigènes HLA de classe I et sur les billes porteuses d'antigènes HLA
de classe II sont représentées en figure 4.
EXEMPLE 6 ¨ Procédé de quantification in vitro des anticorps anti-HLA ¨ Courbes Dose/réponse Pour réaliser une courbe dose/réponse , on distribue dans chacun des puits d'une plaque multi-puits à micro filtre (Multiscreen ) 300 luiL d'un tampon de lavage (PBS). Après 10 minutes on élimine par aspiration le tampon de lavage et on ajoute 5 luiL de suspension homogénéisée de billes Labscreen mixed . Une gamme de solutions d'anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention de concentrations en anticorps monoclonaux chimériques décroissantes est obtenue par des dilutions successives sériées.
Les contrôles négatif et positif sont traités de la même façon en parallèle. On distribue 20 lut de chacune de ces dilutions sériées en contact des billes de polystyrène préalablement placées dans les puits de la plaque de multi-puits. Les mélanges de billes de polystyrène et des anticorps monoclonaux chimériques sont incubés à
température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. A l'issue, on réalise cinq lavages successifs de chacun des puits avec 250 lut d'un tampon de lavage. On ajoute ensuite 100 lut d'une solution d'anticorps secondaire dilué
au 1/100ème. Les anticorps secondaires utilisés pour le marquage fluorescent des anticorps anti-HLA liés aux billes de polystyrène sont, par exemple, des anticorps de chèvre anti-IgA couplé à la phycoérythrine (anti-IgA-PE, AbSerotec, USA) ou les anticorps de chèvre anti-IgG couplé à la phycoérythrine (anti-IgG-PE, InGen, USA). Bien entendu, tout autre groupement fluorescent couplé à un anticorps susceptible de reconnaître et de se lier aux chaînes constantes de l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention peut être utilisé. Les plaques multi-puits sont placées pendant 30 min à l'abri de la lumière et à la température ambiante avant analyse dans un lecteur d'immunofluorescence Luminex .
Des courbes d'étalonnage du type dose/réponse obtenues par un procédé selon l'invention sont représentées en figures 6 (anti-HLA
classe I) et 7 (anti-HLA classe II). La valeur de l'intensité de fluorescence est donnée en fonction de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention exprimée en luig/mL.
Les valeurs moyennes et les écart-types de la mesure d'intensité de fluorescence mesurée sur chaque type de billes HLA de classe I
(figure 6B) et HLA de classe II (figure 7B) sont reprises dans le tableau 3 ci-après.
Anticorps, HLA de classe I HLA de classe II
lui g /mL Moyenne Ecart-type Moyenne Ecart-type 5 .10-4 589,25 31,15 316,30 29,6 2 .10-3 1433,18 103,03 1086,38 72,15 7,8. 10-3 3028,43 143,22 3518,68 145,09 3,13. 10-2 7781,63 342,02 9129,82 273,56 1,25. 10-1 15190,29 685,49 17955,55 298,79 5 .10-1 20548,53 441,7 22755,75 160,45 2.10 22621,17 255,88 23578,19 167 Tableau 3 On réalise une analyse statistique par régression non linéaire sigmoïde de type Boltzmann des données relatives aux courbes de titration décrites ci-dessus. On détermine la valeur minimale de fluorescence observée (MIN) c'est-à-dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur 0, la valeur maximale de fluorescence observée (MAX) c'est-à-dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur infinie et la valeur de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale correspondant à 50% du signal spécifique (MAX ¨ MIN). Ces valeurs sont données dans le tableau 4 ci-après.
Immunoglobuline chimérique MIN MAX (MAX-MIN)*50%, monoclonale lui g/mL
Anti-Classe I 65 22400 0,06 Anti-Classe II 88 24600 0,05 Tableau 4 EXEMPLE 7 ¨ Analyse de la stabilité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32] et Hu-IGg 1 K 1F3.3] selon l'invention dans un milieu tampon albumineux.
On prépare des dilutions sériées des immunoglobulines chimériques monoclonales selon l'invention conservées pendant une durée de deux mois dans un milieu tampon aqueux contenant de l'albumine humaine à une concentration de 60 g/L. On réalise des courbes dose/réponse telles que décrites à l'exemple 6 par la technique Luminex . Les résultats obtenus avec l'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) sont présentés en figure 8A et les résultats obtenus avec l'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA
de classe II (Hu-IgG1 K [F3.3]) sont présentés en figure 8B. Les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées dans le tampon salin sont identifiés par des carrés blancs (o) et les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservés dans le tampon albumineux sont identifiés par des losanges noirs (*). Aucune différence significative n'est observée entre les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon salin et les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon albumineux.
L'inhibition de la fixation des IgG du sérum par les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention permet de démontrer la spécificité de la fixation des IgG sur les supports immuno-adsorbants utilisés dans les tests de dépistage d'anticorps anti-HLA par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée avec lecture en flux sur appareil Luminex , par cytométrie en flux, par les techniques ELISA, et par la micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément.
En particulier, les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA permettent de différencier un signal spécifique correspondant à la présence réelle d'IgG anti-HLA dans le sérum, vis-à-vis d'un signal non spécifique correspondant à l'adsorption des IgG sur le support présentateur des antigènes HLA. Cette compétition des immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgA selon l'invention pour la recherche d'IgG
anti-HLA a été démontrée par d'immuno-fluorimétrie quantitative sur Luminex .
Les immunoglobulines chimériques monoclonales de classe IgG et de classe IgM selon l'invention peuvent être employées comme contrôles positifs et contrôles de sensibilité de l'épreuve de compatibilité directe (cross-match) entre un receveur et un donneur d'organe réalisée juste avant la greffe d'organe par toute technique adaptée (micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément ou en cytométrie en flux) et dans toute technique de détection des anticorps de classe IgG ou IgM sur un support immunoabsorbant (ELISA ou immuno-fluorimétrie quantitative sur bille de polystyrène).
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que:
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe, et;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes HLA de classe I est conformé pour pouvoir reconnaitre un épitope commun à tous les antigènes HLA de classe I.
Avantageusement et selon l'invention, l'immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 1, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourde choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
L'invention concerne aussi une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe II formée de :
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourdes choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
Avantageusement, un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope mono-morphique des antigènes anti-HLA de classe II est conformé pour pouvoir reconnaitre un épitope commun à sensiblement tous les antigènes HLA de classe II.
Avantageusement, une immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I ou de classe II selon l'invention désigne une immunoglobuline dans laquelle :
o les chaînes lourdes et les chaînes légères sont humaines par nature dans leurs parties constantes. En particulier, les parties constantes des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgA, des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgG et des parties constantes des chaînes lourdes d'une IgM et les parties constantes des chaînes légères sont choisies dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda, et;
o les parties variables des chaines légères et des chaînes lourdes sont choisies dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II. Dans une telle immunoglobuline chimérique monoclonale, les parties constantes (CH) des chaînes lourdes de l'anticorps humain et les parties constantes (CL) des chaînes légères de l'anticorps humain représentent ensemble de l'ordre de 60 % en masse de l'immunoglobuline chimérique monoclonale. En outre, une telle immunoglobuline chimérique monoclonale est un anticorps monoclonal, c'est-à-dire spécifique d'un épitope mono-morphique unique.
Avantageusement, chaque anticorps monoclonal est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré
-notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux d'un organisme vertébré -notamment d'un organisme vertébré non humain- spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II.
Dans tout le texte, on entend par organisme vertébré non humain , un être vivant organisé supérieur à l'exclusion de l'homme. Un tel organisme vertébré est en particulier pourvu d'un système immunitaire. Un tel organisme vertébré est en particulier choisi dans le groupe formé des mammifères non humains -notamment de la souris, du rat, du lapin et du hamster- des batraciens et des oiseaux -notamment des galliformes-. De tels organismes vertébrés non humains sont en particulier des animaux de laboratoire. Cependant, un tel anticorps monoclonal peut être choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux humains.
wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 Avantageusement et selon l'invention, chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré, en particulier des anticorps monoclonaux d'un mammifère -notamment de souris, de rat, de lapin, de hamster et de l'homme- et des anticorps monoclonaux d'un vertébré non mammifère -notamment d'un batracien, d'un oiseau, en particulier d'un galliforme-.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
Avantageusement et selon l'invention, l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
L'invention vise en outre une solution stable d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention dans une composition aqueuse.
L'invention vise aussi une telle solution aqueuse d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention, ladite solution aqueuse présentant une concentration prédéterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale.
L'invention vise aussi une telle immunoglobuline chimérique monoclonale adaptée pour pouvoir permettre une détermination de la quantité
d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps.
L'invention s'étend par ailleurs à un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité
prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention et une notice explicative pour la mise en oeuvre d'un procédé
selon l'invention.
Ainsi, l'invention vise un kit de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité
prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale comprenant :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
5 - deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa;
caractérisée en ce que:
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
o une région (VH) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CH) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
o une région (VL) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
o une région (CL) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda ;
ledit kit comprenant aussi une notice explicative pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, une immunoglobuline chimérique monoclonale, son utilisation et un kit pour cette détermination, caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquels :
¨ la figure 1 est une représentation graphique de la variation temporelle de l'intensité de fluorescence de 17 types de billes traitées selon un contrôle négatif ;
¨ la figure 2 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 12 types de billes porteuses d'antigènes HLA
de classe I d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
¨ la figure 3 est une représentation graphique de la variation de l'intensité de fluorescence de 5 types de billes HLA de classe II d'un contrôle positif selon l'état de la technique en fonction du temps ;
¨ la figure 4 est une représentation comparative en histogramme de l'intensité de fluorescence d'un contrôle positif selon l'état de la technique et d'un contrôle positif selon l'invention, dans laquelle ;
o la figure 4A est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
o la figure 4B est une représentation en histogramme de l'intensité de fluorescence mesurée sur 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'état de la technique (histogramme hachuré) et avec un contrôle positif selon l'invention (histogramme plein) ;
¨ la figure 5 est une analyse par cytométrie en flux de la fixation d'immunoglobulines monoclonales chimériques de classe I et de classe II
selon l'invention sur des lymphocytes T et des lymphocytes B ;
- la figure 6A est une représentation graphique de 12 courbes dose/réponse superposées correspondant à 12 types de billes HLA de classe I
traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g /mL ;
- la figure 6B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne de 12 types de billes HLA de classe I traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 6A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g/mL ;
- la figure 7A est une représentation graphique de 5 courbes dose/réponse superposées correspondant à 5 types de billes HLA de classe II
traitées avec un contrôle positif selon l'invention. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en pig/mL ;
- la figure 7B est une représentation graphique de la courbe dose/réponse moyenne des 5 types de billes HLA de classe II traitées avec un contrôle positif selon l'invention correspondant à la figure 7A. La concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention est exprimée en lui g /mL ;
- la figure 8A est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 8B est une représentation graphique comparative de la courbe dose/réponse d'une immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II selon l'invention conservée dans un tampon salin (carré
blanc) et conservée dans une solution d'albumine humaine à 60 g/L (losange noir) ;
- la figure 9 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) et correspond à la séquence SEQ ID_NO 1;
- la figure 10 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2;
- la figure 11 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3;
- la figure 12 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [W6/32] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4;
- la figure 13 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5 ;
- la figure 14 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6;
- la figure 15 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7;
- la figure 16 est une représentation de la séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [F3.3] et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
EXEMPLE 1 - Obtention d'une immunoglobuline chimérique monoclonale IgG/anti-HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) selon l'invention.
L'anticorps W6/32 a été décrit pour la première fois dans la publication de Barnstable et al. en 1978 (Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A., 1978, Celle, 14(1), 9-20.
Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis). Cet anticorps est sécrété
par un hybridome de souris provenant de la fusion de cellules d'une lignée de myélome de souris (lignée P3-NSI/1 Ag4-1 non sécrétrice d'immunoglobuline de souris) avec les lymphocytes d'une souris immunisée contre des cellules humaines. Il a été
démontré que cet anticorps réagit avec un épitope public retrouvé sur les molécules HLA de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-C). L'épitope reconnu est un épitope de conformation qui dépend de l'association entre la chaîne lourde alpha de classe I et de la microglobuline bêta 2. L'épitope requiert la présence d'une arginine en position 3 de la bêta-2-microglobuline et d'une lysine en position 121 de la chaîne alpha (Ladasky JJ, Shum BP, Canavez F, Seuànez HN, Parham P., (1999), Immunogenetics, 49(4), 312-320. Residue 3 of beta2-microglobulin affects binding of class I MHC molecules by the W6/32 antibody).
Dans une première étape, les transcrits codant la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps W6/32 ont été clonés et séquencés.
La copie ADN des ARNm (ADNc) de la chaîne lourde a été
amplifiée par PCR à l'aide de deux amorces, l'une spécifique de la région codant le peptide amorce ( leader peptide ), l'autre ciblant la partie 5' qui code le domaine CH1 de la partie constante.
Pour l'amplification de l'ADNc de la chaîne légère, une amorce ciblant l'exon du peptide leader et une amorce ciblant la partie 5' du domaine C Kappa ont été utilisées. Les fragments d'ADNc des deux chaînes ont été
clonés dans E coli. Les fragments clonés ont été séquencés. L'alignement des séquences a permis d'établir les consensus des ADNc de la chaîne lourde et de la chaîne légère avec un seuil d'identité de 98%. Les régions codant les parties variables ont été déterminées par comparaison avec les séquences présentes dans la banque de données de l'IMGT ( International Immunogenetics Information System ).
Des séquences codant un peptide amorce de chaîne légère ou de chaîne lourde suivant le cas ont été ajoutées en 5' et les séquences en 3' ont été
modifiées de façon à créer un site de restriction B siWI pour l'ADN de la chaîne légère et un site de restriction NheI pour la chaîne lourde. Ces sites de restrictions sont adaptés pour permettre une insertion de ces séquences nucléiques dans les vecteurs de clonages pFUSE-CLIg et pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France).
Les séquences ainsi définies ont été synthétisées puis clonées dans des vecteurs d'expression comportant soit la partie codant le domaine constant de la chaîne Kappa humaine (allotype Km 01; numéro d'accès Genbank : J00241) soit la partie constante des IgG1 humaines. Le site de restriction du vecteur d'expression permettant d'insérer les ADNc des parties variables en phase avec les régions codant les parties constantes des chaînes d'immunoglobuline.
5 Deux vecteurs d'expression, l'un codant pour une chaîne légère chimère associant la partie variable de la chaîne légère de l'anticorps et le domaine C Kappa humain (chaîne VL [W6/32]-C Kappa humaine), l'autre associant la partie variable de la chaîne lourde de l'anticorps W6/32 et le domaine C
gamma 1 humain (VL [W6/32]-C gammal humaine) ont été ainsi obtenus.
10 Ces deux vecteurs ont été introduits par transfection dans des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells). Pour ce faire, les cellules ont d'abord été transfectées par le vecteur codant la chaîne légère puis par celui codant la chaîne lourde. Les vecteurs d'expression comportent des facteurs de résistances à des drogues cytotoxiques permettant de sélectionner efficacement les cellules doublement transfectées. Après la période de sélection, les cellules doublement transfectées ont été clonées par dilution limite et la présence des IgG1 Kappa humaines ont été révélée dans le surnageant des clones par une technique d'ELISA
sandwich. Les clones producteurs ainsi révélés ont été soumis à une pluralité
de cycles de clonage par dilution limite de manière à recruter les clones les plus efficaces dans la sécrétion de l'IgG1 Kappa chimère dénommée ci-après Hu-IgG1 K
[W6/32] .
Les Hu-IgG1 K [W6/32] sécrétées dans le surnageant de culture des cellules CHO transfectées ont été purifiées par capture-élution sur la protéine A du staphylocoque liée à des billes de Sépharose . Les IgG1 Kappa ont 25 été
éluées à pH acide dans un tampon glycine à pH 2. L'éluat a été tamponné
extemporanément par une solution aqueuse de phosphate di-sodique à la concentration de 750 mM. Les solutions d'Hu-IgG1 K [W6/32] sont conservées à
4 C ou à -80 C.
La séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu-IgG1 K [W6/32] est représentée en figure 9 et correspond à la séquence SEQ
ID_NO 1. La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgGl-anti-HLA classe I) Hu-IgG1 K [W6/32] est représentée en figure 10 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 2.
La vérification de la spécificité de la liaison de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] selon l'invention a été réalisée sur des lymphocytes T ou sur des lymphocytes B séparées sur gradient de densité à partir de sang humain prélevé sur tube EDTA. Les cellules ont été
marquées par des anticorps anti-CD3, anti-CD19 et anti-CD45. Les lymphocytes T
(CD3+) et B (CD19+) sont définis parmi la population des lymphocytes CD45+.
On incube l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] en présence de cellules mononuclées humaines (lymphocytes T ou lymphocytes B) du sang périphérique, puis on réalise trois lavages successifs desdites cellules mononuclées humaines suivi de trois lavages en tampon phosphate salin (PBS). On révèle la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales fixées sur les cellules mononuclées humaines au moyen d'anticorps de chèvre anti-Fcy humain. Les résultats sont présentés en figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu-IgG1 K [W6/32] se fixe sur les lymphocytes B (figure 5A) et avec les lymphocytes T (figure 5C) alors que l'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] se fixe sur les lymphocytes B
(figure 5B) et pas sur les lymphocytes T (figure 5D).
EXEMPLE 2 ¨ Spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32]
La spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32] a ensuite été déterminée par une technique de fluorimétrie quantitative multiplexée en utilisant des trousses commerciales distribuées par la société One Lambda . Cette détermination est fondée sur une réaction d'immunofluorescence indirecte et utilisent des billes de latex revêtues d'antigène HLA de divers groupes. Les anticorps capables de reconnaitre les antigènes HLA présents sur les billes de latex sont révélés par des anticorps anti IgG humaines couplés à la phycoérythrine. La fluorescence est quantifiée sur chaque bille par cytométrie en flux sur un appareil Luminex . Un marquage fluorescent spécifique de chaque type de billes permet de mettre en jeu plusieurs variétés de billes (reconnaissable par leur fluorescence), chaque bille étant revêtue d'un mélange d'antigènes HLA donné. Ceci permet de démontrer que toutes les billes de classe I sont reconnues avec sensiblement la même intensité (figure 4A, billes de classe I). Ceci nous permet de conclure que l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32] reconnait un épitope public présent sur toutes les molécules HLA de classe I.
Des expériences de compétition ont permis de démontrer que l'anticorps monoclonal de souris W6/32 sécrété par l'hybridome de souris inhibe la fixation de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [W6/32]
EXEMPLE 3 - Obtention d'anticorps monoclonaux chimériques anti-HLA de classe I d'isotype IgA2 et IgM (Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32]) selon l'invention.
La partie variable de la chaîne lourde W6/32 (VH[W6/32]) a été clonée dans deux autres vecteurs d'expression le premier permet de produire des chaînes mu chimères (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine mu (Numéro d'accès Genbank : AY510104.1), l'autres des chaînes alpha 2 chimère (partie variable de W6/32 et partie constante de la chaîne lourde humaine alpha 2, allotype A2m(1) (Numéro d'accès Genbank : J00221). Ces deux vecteurs ont été utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO
préalablement transfectées par le vecteur permettant l'expression de la chaîne légère chimère VL[W6/32]-K humaine. Nous avons ainsi isolé un clone de cellules CHO
sécrétant de grandes quantités d'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [W6/32] et un autre clone sécrétant une immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgM K [W6/32]. Les IgA chimériques ont été purifiées sur un support d' agarose couplé au peptide M (InvivoGen, Toulouse, France) et les IgM
chimériques ont été purifiées sur un support d' agarose couplé à la protéine L
(InvivoGen, Toulouse, France) selon les recommandations du fournisseur.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgA2-anti-HLA classe I) Hu-IgA2 K
[W6/32] est représentée en figure 11 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 3.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale (IgM-anti-HLA classe I) est représentée en figure 12 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 4.
La réactivité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [W6/32] et Hu-IgM K [W6/32] a été vérifiée en technique Luminex avec les trousses Labscreen mixed (One Lambda ) et, à
titre d'anticorps secondaires fluorescents, des anticorps de chèvre anti-IgA
humaines ou anti-IgM humaines couplés à la phycoérythrine.
EXEMPLE 4 ¨ Obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K [F3.3]) selon l'invention.
Dans son principe, le procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe II est comparable au procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal anti-HLA de classe I (W6/32).
L'anticorps F3.3 (Elsasser, D., Valerius, T., Repp, R., Weiner, G.J., Deo, Y., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Stevenson, G.T., Glennie, M.J. and Gramatzki, M., (1996), Blood, 87(9), 3803-3812. HLA class II as potential target antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies in combination with granulocyte colony-stimulating factor) est le produit d'un clone unique d'hybridome de souris. L'anticorps F3.3 reconnait au moins un épitope public présent à la surface de toutes les cellules humaines exprimant les molécules HLA de classe II. En particulier, l'anticorps F3.3 reconnait tous les antigènes DR, tous les antigènes DP et tous les antigènes du groupe DQ2. Les séquences complètes codantes des parties variables de l'anticorps F3.3 sont accessibles sur GenBank (numéros d'accès : AY058910 [VL] pour la chaîne légère et AY058911 [VH] pour la chaîne lourde).
Les séquences des parties variables ont été synthétisées et clonées en phase dans les vecteurs de clonage pFUSE-CHIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes lourdes et pFUSE-CLIg (InvivoGen, Toulouse, France) pour les chaînes légères. Le vecteur (pFUSE-CHIg) permet la production de la chaîne lourde chimère VH[F3.3]-C gamma 1 humaine et le vecteur (pFUSE-CLIg) permet la production de la chaîne légère VL[F3.3]-C Kappa humaine. Ces deux vecteurs d'expressions sont utilisés pour transfecter des cellules de la lignée CHO
comme décrit à l'exemple 1.
En outre, la partie variable VH[F3.3] a été clonée dans des vecteurs d'expression permettant la production de chaînes lourdes chimères VH[F3.3]-C mu humaine et VH[F3.3]-C alpha 2 humaine.
La séquence peptidique de la chaîne légère de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K
[F3.3]) est représentée en figure 13 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 5.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgA2 K
[F3.3]) est représentée en figure 14 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 6.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgG1 K
[F3.3]) est représentée en figure 15 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 7.
La séquence peptidique de la chaîne lourde de l'immunoglobuline chimérique monoclonale anti-HLA de classe II (Hu-IgM K
[F3.3]) est représentée en figure 16 et correspond à la séquence SEQ ID_NO 8.
Les immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K
[F3.3], Hu-IgA2 K [F3.3] et Hu-IgM K [F3.3] dirigés contre les antigènes HLA
de classe II ont été produits par des cellules CHO transfectées par les vecteurs appropriés. Les IgG1 chimères ont été purifiées sur protéine A Sépharose. Les IgA
chimères ont été purifiées sur peptide M-agarose (InvivoGen, Toulouse, France).
Les IgM chimères ont été purifiées sur protéine L-Agarose (InvivoGen, Toulouse, France).
On vérifie la spécificité de la liaison de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3] selon l'invention par une technique d'immunofluorescence indirecte par cytométrie en flux sur des cellules humaines mononuclées telle que décrite à l'exemple 1. Les résultats sont présentés à la figure 5 et indiquent que l'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] selon l'invention réagit fortement contre les cellules humaines, notamment avec les lymphocytes B
(figure 5B) et avec les lymphocytes T (figure 5D).
En outre, on étudie la spécificité des immunoglobulines chimériques monoclonales anti-HLA de classe II selon l'invention par la technique d'immunofluorimétrie quantitative multiplexée sur Luminex à l'aide de trousses Labscreen mixed et Labscreen single antigen (One Lambda ).
5 L'anticorps Hu-IgG1 K [F3.3] s'est fixé sur toutes les billes portant les antigènes HLA de classe II du kit Labscreen mixed et sur toutes les billes portant les antigènes HLA-DR, HLA-DP et HLA-DQ2 du kit Labscreen single antigen class Il .
Il a été démontré, par des expériences de compétition, que les 10 immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [F3.3] et Hu-IgA2 K
[F3.3] reconnaissent le même épitope. La réactivité de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] a été étudiée par technique Luminex avec les trousses Labscreen mixed (One-Lambda ) en utilisant, comme révélateur de la fixation des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgA2 K [F3.3], 15 des anticorps de chèvre anti-IgA humaines couplés à la phycoérythrine. La réactivité de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgA2 K [F3.3] s'est révélée identique à celle de l'immunoglobuline chimérique monoclonale Hu-IgG1 K [F3.3].
EXEMPLE 5 - Procédé de quantification in vitro des 20 anticorps anti-HLA
Dans un procédé de quantification in vitro d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps par immunofluorescence selon l'invention, on utilise, à titre d'exemple non limitatif, un kit de laboratoire Labscreen mixed (LSM12, One Lambda Inc., USA) comprenant :
25 - des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) purifiés, et, en mélange ;
- des billes de polystyrène liées de façon covalente à des antigènes HLA de classe II (HLA-DR, HLA-DQ et HLA-DP) purifiés ;
- des billes de polystyrène, dites billes de contrôle positif, 30 liées à des IgG ;
¨ des billes de polystyrène, dites billes de contrôle négatif, dépourvues d'antigène surface. Un tel kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend une suspension aqueuse de billes de polystyrène de dépistage des anticorps anti-HLA de classe I et des anticorps anti-HLA de classe II. Les billes de polystyrène de cette suspension comprennent une pluralité de type de billes de polystyrène, chaque type de bille de polystyrène étant différencié des autres types de bille de polystyrène au moyen d'un marqueur fluorescent et comprenant des billes de polystyrène porteuses d'antigènes HLA de classe I et d'antigène HLA
de classe II distincts. En pratique, chaque type de bille de polystyrène présente en surface des billes de polystyrène jusqu'à six antigènes HLA-A (classe I), six antigènes HLA-B (classe I), six antigènes HLA-C (classe I), ou six antigènes HLA-DQ (classe II), six antigènes HLA-DR (classe II), six antigènes HLA-DP (classe II).
Le kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend 12 types de billes de polystyrène classe I et 5 types de billes de classe II dont l'intensité de fluorescence de chacun des 17 types de billes de polystyrène est susceptible d'être mesurée simultanément. Ainsi, on calcule la moyenne de l'intensité de fluorescence de chacun des types de billes de polystyrène liée à un même ensemble d'antigènes HLA. Au sein de ce mélange de billes de polystyrène, certaines sont dépourvues d'antigène HLA de classe I et d'antigène HLA de classe II et servent de contrôle négatif.
L'utilisation du kit de laboratoire (Labscreen mixed ) nécessite en outre un sérum témoin négatif (LabScreen Negative Control (LSNC) serum) lors de la réaction de dépistage des anticorps anti-HLA. Ce sérum est caractérisé par le fabriquant comme étant dépourvu d'anticorps anti-HLA de classe I et d'anticorps anti-HLA de classe II.
Les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence observée sur une durée de cinq mois associée à chacun des 12 types de billes porteuses d'antigènes de classe I et à chacun des 5 types de billes porteuses d'antigènes de classe II traitées avec un tel contrôle négatif sont données au tableau 1 ci-après.
Classe d'Ag HLA Numéro de bille Moyenne de fluorescence Ecart-type reconnue 6 79,82 30,26 7 110,87 39,45 88 118,09 30,31 17 94,16 38,98 69 136,93 54,01 79 136,67 49,73 Classe I
84 109,79 35.61 86 102,07 27,77 87 119.96 32,50 88 100,67 30,04 89 90,89 25,85 90 157,12 73,60 91 112,79 35,91 93 143,52 39,21 Classe II 95 104,89 34,79 96 153,14 55,02 97 117,61 46,14 Tableau 1 Les valeurs présentées au tableau 1 sont faibles et traduisent la fluorescence générée par la liaison non spécifique des IgG sur les billes de polystyrène, et la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire sur ces billes.
Contrôle positif Le kit de laboratoire (Labscreen mixed ) comprend, à titre de contrôle positif, des billes de polystyrène en surface desquelles sont greffées des IgG humaines purifiées. Un tel contrôle positif est limité dans son utilisation à la vérification de la fonctionnalité de l'anticorps secondaire. Un tel contrôle positif ne permet pas la conversion d'une valeur d'intensité de fluorescence en une valeur de concentration d'anticorps anti-HLA dans un milieu liquide.
Contrôle positif polyclonal Les utilisateurs du kit (Labscreen mixed ) -notamment les laboratoires d'immunologie- préconisent d'utiliser, à titre de contrôle positif lors du dépistage des anticorps anti-HLA in vitro selon l'état de la technique, un mélange de sérums provenant d'individus polyimmunisés contre les antigènes HLA. A titre d'exemple, les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence mesurée sur une période de 5 mois associée à chaque type de billes HLA de classe I et de classe II de ce contrôle polyclonal sont données dans le tableau 2 ci-après.
Classe d'Ag HLA Numéro de bille Moyenne de fluorescence Ecart-type reconnue 6 3821,21 1980,68 7 5313,44 2261,91 88 4103,80 1812,89 17 3808,23 1726,83 69 2699,31 1759,92 79 2316,98 1341,26 Classe I
84 2437,50 1672,73 86 3163,40 1765,90 87 1836,57 1379,55 88 2082,32 1364,82 89 15691,55 1791,89 90 15158,40 2072,65 91 14433,92 2197,01 93 13343,17 2492,20 Classe II 95 14550,62 2162,28 96 207,17 232,44 97 589,34 670,31 Tableau 2 La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe I traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la wo 2013/121157 PCT/FR2013/050315 technique est de l'ordre de 5200 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 4900 unités de fluorescence.
La valeur calculée de la fluorescence moyenne mesurée sur les billes HLA de classe II traitées avec un contrôle qualitatif selon l'état de la technique est de l'ordre de 8600 unités de fluorescence et l'écart type est de l'ordre de 7500 unités de fluorescence.
L'intensité de fluorescence de chacun des types de bille de polystyrène du contrôle qualitatif varie entre 1000 et 20000. Une telle variabilité de la réponse de chacun des types de billes de polystyrène (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR et HLA-DP) ne permet pas de définir une courbe unique de conversion de l'intensité de fluorescence mesurée en une concentration d'anticorps anti-HLA de référence. En outre, une telle courbe de conversion de l'intensité
de fluorescence mesurée ne peut être obtenue, compte tenu du fait que la concentration en anticorps HLA spécifique de chacun des types d'antigène HLA ne peut être déterminée dans le contrôle qualitatif de l'état de la technique.
A titre d'exemple d'un contrôle qualitatif de l'état de la technique, une analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit Labscreen mixed montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe I (type de bille n 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4A) varie entre une valeur de l'ordre de 7000 unités de fluorescence moyenne et 12000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 9600 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 3100 unités de fluorescence.
En outre, cette analyse de la fluorescence de chaque type de bille de polystyrène du kit Labscreen mixed montre que la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B) varie entre une valeur de l'ordre de 1000 unités de fluorescence moyenne et 19000 unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe II est de l'ordre de 13000 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 8300 unités de fluorescence.
Un tel contrôle est donc limité dans son utilisation à une analyse purement qualitative dès lors que la concentration de chaque anticorps dans 5 le mélange de sérum n'est pas connue.
Immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention On utilise, à titre de contrôle quantitatif du kit de laboratoire (Labscreen mixed ), une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention. On prépare des solutions d'une immunoglobuline chimérique 10 monoclonale anti-HLA de classe I (Hu-Ig 1 K [W6/32]) et/ou anti-HLA de classe II
(Hu-Igl K [F3.3]) telles que décrites aux exemples 1 à 4 à une concentration connue de 2 pig/mL. On réalise une analyse de l'intensité de fluorescence moyenne associée à chaque type de bille de polystyrène porteur d'un antigène-HLA de classe I ou de classe II. Les résultats obtenus sont présentés en figure 4 (histogrammes blancs).
15 On observe, pour chaque type de bille de polystyrène du kit Lab screen mixed une intensité de fluorescence de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne.
En particulier, cette analyse montre que :
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un 20 antigène de classe I (type de bille n 6, 7, 8, 17, 69, 79, 84, 86, 87, 88, 89 et 90 en figure 4A, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de unités de fluorescence moyenne. La valeur moyenne des intensités de fluorescence mesurée sur chaque type de bille HLA de classe I est de l'ordre de 21500 unités de fluorescence. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 450 unités de 25 fluorescence ;
- la fluorescence associée à chaque type de bille porteur d'un antigène de classe II (type de bille n 91, 93, 95, 96 et 97 en figure 4B, histogrammes pleins) est sensiblement constante et de l'ordre de 22000 unités de fluorescence moyenne. La valeur de l'écart type de ces valeurs est de l'ordre de 700 30 unités de fluorescence.
Cette valeur d'intensité de fluorescence est sensiblement constante quelle que soit le type de bille de polystyrène (quel que soit l'antigène HLA porté par le type de bille de polystyrène) et correspond à une concentration en anticorps de 2 pig/mL. De tels anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention sont adaptés pour permettre un étalonnage quantitatif de la réponse en fluorescence en fonction de la concentration en anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention.
A titre comparatif de l'invention (histogrammes pleins en figure 4A et 4B) et de l'état de la technique (histogrammes hachuré en figure 4A et 4B), les valeurs de la fluorescence moyenne (et écart-type) relevée sur les billes porteuses d'antigènes HLA de classe I et sur les billes porteuses d'antigènes HLA
de classe II sont représentées en figure 4.
EXEMPLE 6 ¨ Procédé de quantification in vitro des anticorps anti-HLA ¨ Courbes Dose/réponse Pour réaliser une courbe dose/réponse , on distribue dans chacun des puits d'une plaque multi-puits à micro filtre (Multiscreen ) 300 luiL d'un tampon de lavage (PBS). Après 10 minutes on élimine par aspiration le tampon de lavage et on ajoute 5 luiL de suspension homogénéisée de billes Labscreen mixed . Une gamme de solutions d'anticorps monoclonaux chimériques selon l'invention de concentrations en anticorps monoclonaux chimériques décroissantes est obtenue par des dilutions successives sériées.
Les contrôles négatif et positif sont traités de la même façon en parallèle. On distribue 20 lut de chacune de ces dilutions sériées en contact des billes de polystyrène préalablement placées dans les puits de la plaque de multi-puits. Les mélanges de billes de polystyrène et des anticorps monoclonaux chimériques sont incubés à
température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. A l'issue, on réalise cinq lavages successifs de chacun des puits avec 250 lut d'un tampon de lavage. On ajoute ensuite 100 lut d'une solution d'anticorps secondaire dilué
au 1/100ème. Les anticorps secondaires utilisés pour le marquage fluorescent des anticorps anti-HLA liés aux billes de polystyrène sont, par exemple, des anticorps de chèvre anti-IgA couplé à la phycoérythrine (anti-IgA-PE, AbSerotec, USA) ou les anticorps de chèvre anti-IgG couplé à la phycoérythrine (anti-IgG-PE, InGen, USA). Bien entendu, tout autre groupement fluorescent couplé à un anticorps susceptible de reconnaître et de se lier aux chaînes constantes de l'immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention peut être utilisé. Les plaques multi-puits sont placées pendant 30 min à l'abri de la lumière et à la température ambiante avant analyse dans un lecteur d'immunofluorescence Luminex .
Des courbes d'étalonnage du type dose/réponse obtenues par un procédé selon l'invention sont représentées en figures 6 (anti-HLA
classe I) et 7 (anti-HLA classe II). La valeur de l'intensité de fluorescence est donnée en fonction de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'invention exprimée en luig/mL.
Les valeurs moyennes et les écart-types de la mesure d'intensité de fluorescence mesurée sur chaque type de billes HLA de classe I
(figure 6B) et HLA de classe II (figure 7B) sont reprises dans le tableau 3 ci-après.
Anticorps, HLA de classe I HLA de classe II
lui g /mL Moyenne Ecart-type Moyenne Ecart-type 5 .10-4 589,25 31,15 316,30 29,6 2 .10-3 1433,18 103,03 1086,38 72,15 7,8. 10-3 3028,43 143,22 3518,68 145,09 3,13. 10-2 7781,63 342,02 9129,82 273,56 1,25. 10-1 15190,29 685,49 17955,55 298,79 5 .10-1 20548,53 441,7 22755,75 160,45 2.10 22621,17 255,88 23578,19 167 Tableau 3 On réalise une analyse statistique par régression non linéaire sigmoïde de type Boltzmann des données relatives aux courbes de titration décrites ci-dessus. On détermine la valeur minimale de fluorescence observée (MIN) c'est-à-dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur 0, la valeur maximale de fluorescence observée (MAX) c'est-à-dire la valeur de l'asymptote à la courbe lorsque la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale tend vers la valeur infinie et la valeur de la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale correspondant à 50% du signal spécifique (MAX ¨ MIN). Ces valeurs sont données dans le tableau 4 ci-après.
Immunoglobuline chimérique MIN MAX (MAX-MIN)*50%, monoclonale lui g/mL
Anti-Classe I 65 22400 0,06 Anti-Classe II 88 24600 0,05 Tableau 4 EXEMPLE 7 ¨ Analyse de la stabilité des immunoglobulines chimériques monoclonales Hu-IgG1 K [W6/32] et Hu-IGg 1 K 1F3.3] selon l'invention dans un milieu tampon albumineux.
On prépare des dilutions sériées des immunoglobulines chimériques monoclonales selon l'invention conservées pendant une durée de deux mois dans un milieu tampon aqueux contenant de l'albumine humaine à une concentration de 60 g/L. On réalise des courbes dose/réponse telles que décrites à l'exemple 6 par la technique Luminex . Les résultats obtenus avec l'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA de classe I (Hu-IgG1 K [W6/32]) sont présentés en figure 8A et les résultats obtenus avec l'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA
de classe II (Hu-IgG1 K [F3.3]) sont présentés en figure 8B. Les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées dans le tampon salin sont identifiés par des carrés blancs (o) et les résultats obtenus avec les immunoglobulines chimériques monoclonales conservés dans le tampon albumineux sont identifiés par des losanges noirs (*). Aucune différence significative n'est observée entre les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon salin et les immunoglobulines chimériques monoclonales conservées en tampon albumineux.
Claims (16)
1/
Procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, dans lequel :
- on réalise une pluralité de solutions (S n) d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (S n) présentant une valeur (C n) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (S n) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (C n) de concentration déterminée à une valeur (V n) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (V n) mesurée étant représentative d'une quantité (Q n) de l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (C n, V n) de concentration (C n) déterminée et de valeur (V n) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (V n) mesurée en fonction de la concentration (C n) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (S n) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et ;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au-delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C H) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C L) constante d' une chaîne légère d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
Procédé de détermination de la quantité d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide contenant des anticorps, dans lequel :
- on réalise une pluralité de solutions (S n) d'une immunoglobuline chimérique monoclonale, chaque solution (S n) présentant une valeur (C n) de concentration déterminée de ladite immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
- on place chaque solution (S n) en contact avec une même quantité déterminée d'au moins un antigène HLA immobilisé, et ;
- on construit une courbe d'étalonnage dans laquelle on associe chaque valeur (C n) de concentration déterminée à une valeur (V n) mesurée d'un paramètre, ladite valeur (V n) mesurée étant représentative d'une quantité (Q n) de l'immunoglobuline chimérique monoclonale liée à la quantité déterminée de chaque antigène HLA immobilisé ;
- on forme, à partir des paires (C n, V n) de concentration (C n) déterminée et de valeur (V n) mesurée, la courbe d'étalonnage et de variation de la valeur (V n) mesurée en fonction de la concentration (C n) déterminée en immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution (S n) d'immunoglobuline chimérique monoclonale, et ;
- on calcule une valeur, dite valeur seuil, du paramètre au-delà de laquelle la concentration en immunoglobuline chimérique monoclonale est significativement supérieure à 0 ;
procédé dans lequel l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisé en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C H) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C L) constante d' une chaîne légère d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le paramètre est choisi dans le groupe formé des paramètres de fluorescence, des paramètres de luminescence et des paramètres de colorimétrie.
4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le paramètre de fluorescence est une intensité de fluorescence.
5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé
en ce que :
a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ;
b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photo-absorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (V n) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence, d'un paramètre de luminescence et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
en ce que :
a) chaque antigène HLA immobilisé étant un antigène HLA immobilisé en surface de particules d'un support solide à l'état divisé formé de particules ;
b) on met en contact les antigènes HLA immobilisés et chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale dirigée contre les antigènes HLA du support solide dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre les antigènes HLA du support solide et l'immunoglobuline chimérique monoclonale de chaque solution d'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
c) on élimine par lavage les immunoglobulines chimériques monoclonales non liées aux antigènes HLA du support solide, puis ;
d) on met en contact les immunoglobulines chimériques monoclonales liées aux antigènes HLA du support solide avec une solution d'un anticorps secondaire choisi dans le groupe formé des anticorps secondaires fluorescents, des anticorps secondaires luminescents et des anticorps secondaires photo-absorbants et dirigé contre l'immunoglobuline chimérique monoclonale, dans des conditions adaptées pour former une liaison stable entre l'immunoglobuline chimérique monoclonale et l'anticorps secondaire, puis ;
e) on élimine par lavage l'anticorps secondaire non lié à l'immunoglobuline chimérique monoclonale, puis ;
f) on mesure au moins un paramètre de l'anticorps secondaire lié à chaque particule du support solide et on attribue à cette mesure une valeur (V n) mesurée dudit paramètre choisi dans le groupe formé d'un paramètre de fluorescence, d'un paramètre de luminescence et d'un paramètre de colorimétrie, puis ;
g) on forme la courbe de calibration, puis ;
h) on déduit de cette courbe de calibration une valeur seuil d'intensité de fluorescence significative de la présence de l'anticorps anti-HLA dans une solution à analyser.
6/
Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé
en ce que chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé
en ce que chaque antigène HLA immobilisé est un antigène HLA présenté en surface d'au moins une cellule.
7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé
en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l'anticorps W6/32.
8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé
en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
9/ Utilisation d'une immunoglobuline chimérique monoclonale à titre de réactif de standardisation et de contrôle positif et de sensibilité dans une méthode de dépistage ou de quantification d'anticorps anti-HLA choisie dans le groupe formé des méthodes par immuno-fluorimétrie quantitative multiplexée, des méthodes par cytométrie en flux, des méthodes par dosage immuno-enzymatique sur support solide et des méthodes par micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément, caractérisée en ce que l'immunoglobuline chimérique monoclonale est formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C H) constante d' une chaîne lourde d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C L) constante d' une chaîne légère d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C H) constante d' une chaîne lourde d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I et des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe II, et ;
.circle. une région (C L) constante d' une chaîne légère d' une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
10/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I formée de :
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
.circle. une région (C H) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
.circle. une région (C L) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
- deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce que :
- chaque chaîne (H) lourde comprend :
.circle. une région (V H) variable d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
.circle. une région (C H) constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des IgA, des IgG et des IgM ;
et en ce que :
- chaque chaîne (L) légère comprend :
.circle. une région (V L) variable d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux spécifiques des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I, et ;
.circle. une région (C L) constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine choisie dans le groupe formé des chaînes Kappa et des chaînes Lambda.
11/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 1, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourde choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 1, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourde choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 2, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 3 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 4.
12/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe II formée de :
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourdes choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (H) lourdes, de poids moléculaire compris entre 40 kDa et 60 kDa, et de ;
¨ deux chaînes polypeptidiques, dites chaînes (L) légères, de poids moléculaire compris entre 20 kDa et 30 kDa ;
caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe formé :
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine légère de séquence SEQ ID_NO 5, et:
¨ des immunoglobulines chimériques monoclonales comprenant au moins une chaine lourdes choisie dans le groupe formé des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 6, des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 7 et des chaines lourdes de séquence SEQ ID_NO 8.
13/ Immunoglobuline chimérique monoclonale spécifique des antigènes HLA de classe I selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que chaque anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est choisi dans le groupe formé des anticorps monoclonaux d'un vertébré.
14/ Immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'une des revendications 10, 11 ou 13, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques des antigènes HLA de classe I est l' anticorps W6/32.
15/ Immunoglobuline chimérique monoclonale selon la revendication 12, caractérisée en ce que l' anticorps monoclonal spécifique des épitopes mono-morphiques de l'antigène HLA de classe II est l'anticorps F3.3.
16/ Kit de quantification d'anticorps anti-HLA d'un milieu liquide, ledit kit comprenant une quantité prédéterminée d'au moins une immunoglobuline chimérique monoclonale selon l'une des revendications 10 à 15 et une notice explicative pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8.
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| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20180215 |