JP2015509586A - 抗ｈｌａキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、該キメラ型モノクローナル免疫グロブリンを使用する方法及びキット - Google Patents

抗ｈｌａキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、該キメラ型モノクローナル免疫グロブリンを使用する方法及びキット Download PDF

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Abstract

本発明は、抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体量の決定方法に関する。

Description

本発明は、抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体量の決定方法に関する。本発明は、かかる方法を実施するための抗ＨＬＡクラスＩ又は抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリンにも関する。本発明は特に、とりわけ液体媒体、とりわけ生物液体媒体の抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング及び定量のための標準化の試薬として用いることができるように適合した、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンに関する。本発明は、特に一方ではモノクローナル抗体の機能、他方ではキメラ構造を示す、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンに関する。本発明は、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを用いる、液体媒体の抗ＨＬＡ抗体の標準化されたスクリーニング方法及び液体媒体の抗ＨＬＡ抗体の定量方法も目的とする。特に、本発明は、患者、とりわけ移植患者又は移植待機患者の血清の抗ＨＬＡ抗体のかかる定量方法に関する。
本発明はさらに、かかる方法の実施のための診断キットに関する。特に、本発明は、正確で、信頼性が高く、迅速である、液体媒体、とりわけ患者から採取した体液の抗ＨＬＡ抗体の定量が可能であるように適合した、かかる方法及びかかる診断キットに関する。
臓器移植の分野では、１９３０年代から、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ Ａｎｔｉｇｅｎ、ヒト白血球抗原）抗原に定義されるようなドナーの組織群と、レシピエントの免疫システム、とりわけ抗体との間の適合性が、臓器移植の成功のために不可欠であることが知られている。
ＨＬＡ抗原は、非常に免疫原性の高い２つのタイプの膜蛋白質、すなわち、クラスＩのＨＬＡ分子及びクラスＩＩのＨＬＡ分子が有している。したがって、個体のＨＬＡアロ抗原、すなわち自身とは異質で別の抗原への曝露は、これらの抗原に対する免疫応答の発現を引き起こすことがある。この免疫応答は、細胞介在性（アロ反応性Ｔリンパ球）又は液性（抗ＨＬＡ抗体の合成）であり得る。
ＨＬＡクラスＩ抗原は、多形性が３つのそれぞれＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子系の原因である、３つのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ遺伝子によってコードされる。ＨＬＡクラスＩＩ抗原は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ遺伝子によってコードされる。
臓器移植では、移植片待機患者に、その患者がすでに免疫化されたＨＬＡ抗原を発現する移植片を提案するリスクを最小限にすること、さらにはなくすことが非常に重要である。実際、この状況で超急性、すなわち移植後２４時間以内の液性拒絶反応が生じるリスクは大きい。さらに、移植の追跡調査では、移植片レシピエント患者での移植片抗原に対する抗体の出現の早期スクリーニングは、前記移植片レシピエント患者を可能な限り早期に処置し、移植片の破壊を引き起こす可能性のある液性応答の発現の抑制を試みることができる。
したがって、移植患者と同様に移植待機患者でもアロ免疫の追跡調査が、移植片及び移植患者の生存を確実にするために最も重要である。
このような背景から、移植待機患者及び移植患者での抗ＨＬＡ抗体を調査、同定、及び定量できることは必要不可欠である。多くのこれら抗ＨＬＡ抗体調査技術がすでに開発されている。
特に、「補体依存性小リンパ球傷害」と呼ばれる技術が知られている。この技術は、患者、とりわけ移植レシピエントの血清を、ＨＬＡ分類法がウサギ補体存在下で既知である細胞系に提示することに存する。これらの細胞が持つＨＬＡ抗原に特異な抗体（Ａｃ）が検査された血清中に存在し、これらの抗体が補体を活性化できる場合（クラスＩｇＭならびにサブクラスＩｇＧ−１及びＩｇＧ−３の抗体）、補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は抗体の存在を明らかにする。様々なＨＬＡ抗原を発現する細胞パネルによって、このように抗体をスクリーニングし、ついでその１つ又は複数の特異性を同定することができる。この照合技術によって、移植片にとって最も危険な細胞溶解性抗ＨＬＡ抗体を検出することができる。しかし、この技術は最新の技術と比較すると、低い感受性を示す。したがって、ＨＬＡ表現型が既知であるドナーを由来とする多種多様のリンパ球を用意する、あるいは大量のＨＬＡ分類された細胞系統をインビトロで培養する必要のあるこの技術は、その実施において複雑で負担が大きい。
固体担体上での免疫酵素定量（「ＥＬＩＳＡ」、「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着アッセイ」を指す）などより感受性の高い技術も知られている。さらに、近年、フローサイトメーターの原理から考案されたフロー検出と対をなす免疫蛍光法の技術が現れた。フロー免疫蛍光法の原理は、精製したＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ抗原をポリスチレンビーズの表面に固定することから成る。ＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ抗原を識別する抗ＨＬＡ抗体は、ビーズの表面と結合した抗原に結合し、ポリスチレンビーズ洗浄後、蛍光基にカップリングした抗ＩｇＧ二次抗体によって明らかになる。二次抗体はフローフルオリメトリーによって検出される。さらに、その蛍光強度が定量される。
スクリーニング検査には、混合物として複数のタイプのビーズを用い、ビーズの各タイプはクラスＩあるいはクラスＩＩの複数のＨＬＡ抗原を表面に持つ。かかるアプローチによって、抗ＨＬＡ抗原の存在を検出できるが、その１つ又は複数の特異性の同定はできない。
反面、抗体の特異性の同定及び特性化には、混合物として複数のタイプのビーズを用い、ビーズの各タイプは表面にＨＬＡ抗原を１つのみ持つ。
抗ＨＬＡ抗体の検出及び同定キットは既知である。これはＨＬＡクラスＩ抗原又はＨＬＡクラスＩＩ抗原で覆われたポリスチレンビーズ及びヒトＩｇＧで覆われたポリスチレンビーズを含む。フィコエリトリンにカップリングしたヒト抗ＩｇＧ二次抗体及び陰性対照として抗ＨＬＡ抗体を欠いた血清も商品化されている。かかる陰性対照は、ポリスチレンビーズ上の二次抗体の非特異的な固定を定量するのに適合している。かかるキットは、陽性対照も感受性対照も測定した蛍光強度から分析した媒体中の抗ＨＬＡ抗体濃度（例えばモル／Ｌ又はｇ／Ｌで表す）を正確に推定することができる基準も全く含まない。
さらに、校正及び／又は感受性の証拠を欠いたかかるキットは、分析方法の感受性の閾値、すなわち観察されたシグナルが測定底部のノイズより有意に大きいと断定できるシグナルの最小値を決定できない。
抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング及び／又は定量の方法における陽性対照のこの欠陥を緩和するため、免疫学及び組織適合性学の研究所は、陽性対照として、複数のＨＬＡ抗原に対して免疫化された複数の個体の複数の血清混合物を用いている。
かかる陽性対照では、免疫化された個体の血清の各抗体のそれぞれの濃度が未知である。かかる血清混合物では、蛍光測定値の強度と血清混合物の特異的な抗体の濃度（ｍｏｌ／Ｌ又はｇ／Ｌ）の相関させることができない。したがって、移植患者又は移植待機患者の血清中に存在する抗体を定量することができない。したがって、超急性液性応答の発生の真のリスクを評価することもできない。
かかる血清混合物の反応性は抗原によって異なり、その使用によって検討した各ＨＬＡ抗原について検出閾値を固定することはできない。さらに、患者の血清を由来とする、かかるポリクローナル抗体混合物は、限定された量しか入手できず、すぐに尽きる。したがって、それ自体も一定でない量の入手となる他の混合物であって、結果の標準化という観点から、研究所間で前記混合物の交換ができないような混合物に代替しなければならない。ロット間での血清混合物の可変性によって、ロット間で比較することも再現することもできないこれらのロットの頻繁な確認が必要となる。
かかる血清混合物を用いて、本発明者らは、各タイプのポリスチレンビーズに関連づけた蛍光強度の値は、各タイプのポリスチレンビーズの持つクラスＩ又はクラスＩＩのＨＬＡ抗原の性質に依存することを明らかにした（図２、３、及び４）。さらに、各タイプのポリスチレンビーズに結合したこの蛍光強度の値は、時間、とりわけ約５カ月の期間で、大きく変動する。この値は平均１０００〜２００００蛍光単位で変動する（図４、ハッチのヒストグラム）。
ポリスチレンビーズ全体で測定された蛍光強度の平均値は、大きな分散度（その標準偏差から計算）を示し、液体媒体中の抗ＨＬＡ抗体を定量することができないという結果となった。かかる分散度は、従来技術の基準の説明として与えられる本特許出願の図４（ハッチのヒストグラム）に示されている。
かかる蛍光強度の測定値の分散度は、特に蛍光強度の値が低い場合、低い蛍光強度の値を判別することができないが、低い濃度の抗ＨＬＡ抗体の存在を、測定底部のノイズから判別できない低い蛍光強度の値から示す。
前述と同様の理由で、先行技術で陽性対照として用いられたかかる調製法では、液体媒体、とりわけ移植患者又は移植待機患者から採取した血清中に存在する抗体の濃度を正確に決定することはできない。
本発明は、抗ＨＬＡクラスＩ抗体又は抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体の血清学的分析における標準化及び陽性対照及び感受性の試薬として、とりわけ臓器移植の状況において、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案し、これらの欠点を解決することを目的とする。
本発明は、患者の血清中の抗ＨＬＡ抗体の信頼性の高い定量ができるように適合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案し、前述に挙げた欠点を緩和することを目的とする。かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、特に移植片の抗原に対する抗体の、患者での発生の検出ができるように、この抗体の濃度が非常に低い場合も適合する。
本発明は、抗ＨＬＡ抗体の検出方法の標準化に適合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案することを目的とする。特に、正確に検出閾値を定義できるため、本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、生物学者が抗体調査方法を有効化することを可能にする。
本発明は、移植片のＨＬＡ抗原に対する抗ＨＬＡ抗体の発生を可能な限り早期に検出できるように適合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案することを目的とする。かかる早期検出によって、特に液性拒絶反応を可能な限り速やかに発見し、したがって移植した臓器の拒絶反応の治療処置を速やかに処方することができる。
本発明は、体液中の抗ＨＬＡ抗体の調査方法を標準化し校正できる、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案することを目的とする。
本発明は、医学分析の研究所の認証の新しい法的規格による抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング、定量、及び特性化の標準化された方法の認証を可能とし得る、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案することも目的とする。フランスでは、医学の分析研究所、とりわけ免疫学の研究所は、ＣＯＦＲＡＣ（フランス認証委員会）の規格第１５１８９号を満たさなければならない。
本発明は、とりわけ免疫蛍光法による抗ＨＬＡ抗体スクリーニング検査において、定量校正の試薬として、少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの組成物を提案することも目的とする。
本発明は、特に「Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）」テクノロジーによる抗ＨＬＡ抗体スクリーニング検査において、定量基準として、少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのかかる組成物を提案することを目的とする。
本発明は、フローサイトメトリーによる、ＥＬＩＳＡ技術又は補体依存性小リンパ球傷害による抗ＨＬＡ抗体スクリーニング検査において、定量標準として、少なくとも１つのキメラ型免疫グロブリンのかかる組成物を提案することも目的とする。
したがって、本発明は、１つ又は複数の患者の血清混合物を由来とする抗体の複合混合物の代わりに定量標準として用いる、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン及び少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのかかる組成物を提案することを目的とする。
本発明は、多量に入手可能であり、生産が抗ＨＬＡ抗体濃度の点及び組成の点から完全に標準化された、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを提案することも目的とする。
さらに、本発明は、キメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度が、液体媒体の抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング及び／又は定量及び／又は特性化方法の標準化のため、完全に既知である、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの安定した水溶液を提案することを目的とする。
このために、本発明は、抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体量の決定方法であって、
− 複数のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）、とりわけ水溶液を作成し、各溶液（Ｓｎ）は前記キメラ型モノクローナル免疫グロブリンの決定濃度値（Ｃｎ）を示し、ついで、
− 各溶液（Ｓｎ）を、同じ決定量の少なくとも１つの固定化ＨＬＡ抗原と接触させ、
− パラメーターからの測定値（Ｖｎ）に各決定濃度値（Ｃｎ）を関連づける較正曲線を作成し、前記測定値（Ｖｎ）は、決定量の各固定化ＨＬＡ抗原に結合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリン量（Ｑｎ）を表し、
− 決定濃度（Ｃｎ）と測定値（Ｖｎ）の対（Ｃｎ、Ｖｎ）から、各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン決定濃度（Ｃｎ）に応じて、測定値（Ｖｎ）の較正曲線及びバラツキを作成し、
− キメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度が有意に０より大きい値を超えるパラメーターの、閾値と呼ばれる値を計算する方法において、
キメラ型モノクローナル免疫グロブリンが、以下：
−４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
−２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
から形成され、
−各重（Ｈ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィック（単型，単形）エピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
を含むことと、
−各軽（Ｌ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び、
・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域（ＣＬ）
を含むこととを特徴とする方法に関する。
本明細書全体において、「ＨＬＡクラスＩ抗原」及び「ＨＬＡクラスＩＩ抗原」（ＨＬＡは「Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ」を指す）の表現は、本質的にヒトのものである抗原を意味する。
したがって、本発明は、本発明による少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの溶液から較正曲線を作成し、前記キメラ型モノクローナル免疫グロブリンが前記溶液中で既知の濃度を示す、抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量方法を提案することにも存する。
実際、本発明者らは、液体媒体中のクラスＩ及びクラスＩＩの抗ＨＬＡ抗体濃度の信頼性が高く再現性のある定量評価が可能となる先行技術で既知の溶液が存在しないことに気づいた。
本発明により、有利には、パラメーターは、蛍光パラメーター、発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択される。
本発明により、有利には、キメラ型モノクローナル免疫グロブリン決定濃度（Ｃｘ）は、多くても１０−４ｇ／ｍＬ、とりわけ１０−１０ｇ／ｍＬ〜１０−４ｇ／ｍＬである。１０−４ｇ／ｍＬ未満のあらゆる、特に約１０−４ｇ／ｍＬの濃度は、高濃度溶液の希釈によって得ることができる。
有利には、本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの漸増段階希釈を実施する。蛍光パラメーター、とりわけ定量的免疫蛍光法（ＨＬＡ抗原に覆われたビーズでのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術）によって、又はフローサイトメトリー技術（リンパ球で実施する）によって測定された蛍光パラメーター、発光パラメーター、とりわけ化学発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択されるパラメーターからの測定値（Ｖｎ）と各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）濃度（Ｃｎ）を関連づけるため、既知の濃度の本発明によるこれらのキメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）を用いる。
本発明により、有利には、本発明による方法において、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体を、脊椎生物モノクローナル抗体、特に哺乳類、とりわけマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、及びヒトのモノクローナル抗体、ならびに哺乳類以外の脊椎生物、とりわけ両生類、鳥類、特にキジ目のモノクローナル抗体から成る群から選択する。
本発明により、有利には、パラメーターは、蛍光パラメーター、発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択される。
本発明により、有利には、蛍光パラメーターは蛍光強度である。したがって、蛍光パラメーターの各値（Ｖｎ）は蛍光強度である。
本発明により、有利には、多重定量的免疫蛍光法、フローサイトメトリー、固体担体上の免疫酵素定量による方法（ＥＬＩＳＡ）、競合結合による方法、及び補体依存性小リンパ球傷害による方法から成る群から選択される技術によってパラメーターからの各測定値（Ｖｎ）を測定する。
有利には、本発明による方法の第１の変形形態において、
ａ）各固定化ＨＬＡ抗原は、粒子から形成される分割された状態の固体担体の粒子の表面に固定化されたＨＬＡ抗原であり、
ｂ）固定化ＨＬＡ抗原と固体担体のＨＬＡ抗原に対する各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液とを、固体担体のＨＬＡ抗原と各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液のキメラ型モノクローナル免疫グロブリンとの間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
ｃ）固体担体のＨＬＡ抗原に結合していないキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを洗浄によって除去し、ついで、
ｄ）固体担体のＨＬＡ抗原に結合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンと、蛍光二次抗体、発光二次抗体、及び光吸収二次抗体から成る群から選択され、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに対する二次抗体溶液とを、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンと二次抗体との間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
ｅ）キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに結合していない二次抗体を洗浄によって除去し、ついで、
ｆ）固体担体の各粒子に結合した二次抗体の少なくとも１つのパラメーターを測定し、この測定値に蛍光パラメーター、とりわけ定量的免疫蛍光法（ＨＬＡ抗原に覆われたビーズでのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術）によって、又はフローサイトメトリー技術（リンパ球で実施する）によって測定された蛍光パラメーター、発光パラメーター、とりわけ化学発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択される前記パラメーターからの測定値（Ｖｎ）を付与し、ついで、
ｇ）校正曲線を作成し、ついで、
ｈ）この校正曲線から、分析溶液中の抗ＨＬＡ抗体の存在の有意な蛍光強度閾値を推定する。
有利には、第２の変形形態において、及び本発明により、各固定化ＨＬＡ抗原は、少なくとも１つの細胞、とりわけインビトロ培養細胞の表面に提示されたＨＬＡ抗原である。
有利には、本発明による方法のこの第２の変形形態において、
ｉ）各固定化ＨＬＡ抗原は少なくとも１つの細胞の表面に提示されたＨＬＡ抗原であり、
ｊ）少なくとも１つの細胞の表面に提示されたＨＬＡ抗原と各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液とを、１つ又は複数の細胞のＨＬＡ抗原と各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液のキメラ型モノクローナル免疫グロブリンとの間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
ｋ）１つ又は複数の細胞のＨＬＡ抗原に結合していないキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを洗浄によって除去し、ついで、
ｌ）１つ又は複数の細胞のＨＬＡ抗原に結合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンと、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに対する二次抗体溶液とを、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンと二次抗体との間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
ｍ）キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに結合していない二次抗体を洗浄によって除去し、ついで、
ｎ）各細胞に結合した二次抗体の少なくとも１つのパラメーターを測定し、この測定値に蛍光パラメーター、とりわけ定量的免疫蛍光法（ＨＬＡ抗原に覆われたビーズでのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術）によって、又はフローサイトメトリー技術（リンパ球で実施する）によって測定された蛍光パラメーター、発光パラメーター、とりわけ化学発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択される前記パラメーターからの測定値（Ｖｎ）を付与し、ついで、
ｏ）校正曲線を作成し、ついで、
ｐ）この校正曲線から、分析溶液中の抗ＨＬＡ抗体の存在の有意な蛍光強度閾値を推定する。
本発明により、有利には、分割された状態の固体担体は、ほぼ球形の粒子の形で、フローフルオリメトリーによってその分析ができるように適合した大きさである。
本発明により、有利には、蛍光強度測定値から非線形回帰によって校正曲線を決定する。
本発明により、有利には、液体媒体は、体液、とりわけ個体から採取した血清から成る群から選択される。
本発明により、有利には、個体は、移植待機患者及び移植患者から成る群から選択される患者である。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、抗体Ｗ６／３２である。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、抗体Ｆ３．３である。
本発明は、多重定量的免疫蛍光法による方法、フローサイトメトリーによる方法、固体担体上の免疫酵素定量による方法（ＥＬＩＳＡ）、及び補体依存性小リンパ球傷害による方法から成る群から選択される抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング方法、とりわけ調査方法もしくは同定方法、又は定量方法におけるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの使用も目的とする。
本発明は、特に多重定量的免疫蛍光法による方法、フローサイトメトリーによる方法、固体担体上の免疫酵素定量による方法、及び補体依存性小リンパ球傷害による方法から成る群から選択される抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング又は定量方法における標準化及び陽性対照及び感受性の試薬としてのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの使用であって、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンが、以下：
−４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
−２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
から形成されることを特徴とし、
−各重（Ｈ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
を含むことと、
−各軽（Ｌ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
を含むこととを特徴とする使用を目的とする。
したがって、重鎖の定常部分（ＣＨ）及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）が、競合試験においてヒトＩｇＡの定常部分から構成される、本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを用いる。本発明によるかかるクラスＩｇＡキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、病人血清中に存在する抗ＨＬＡクラスＩｇＧ（又はＩｇＭ）ポリクローナル抗体の固定を、少なくとも部分的に阻害するのに適合している。本発明によるクラスＩｇＡキメラ型モノクローナル免疫グロブリンによる血清ＩｇＧ固定阻害によって、「Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）」装置へのフロー記録での多重定量的免疫蛍光法による、フローサイトメトリーによる、ＥＬＩＳＡ技術による、及び補体依存性小リンパ球傷害による抗ＨＬＡ抗体スクリーニング検査において用いられる、免疫吸着担体上のＩｇＧ固定の特異性が証明できる。
特に、クラスＩｇＡキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、ＨＬＡ抗原の提示担体上のＩｇＧ吸着に対応する非特異的信号と比べて、血清中の抗ＨＬＡ ＩｇＧの真の存在に対応する特異的信号を区別できる。抗ＨＬＡ ＩｇＧ調査のための本発明によるこのクラスＩｇＡキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの競合は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）での定量的免疫蛍光法によって証明された。
本発明によるクラスＩｇＧ及びクラスＩｇＭキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、適合したあらゆる技術（補体依存性小リンパ球傷害又はフローサイトメトリー）によって、及び免疫吸収担体上のクラスＩｇＧ又はＩｇＭ抗体検出のあらゆる技術（ＥＬＩＳＡ又はポリスチレンビーズでの定量的免疫蛍光法）において、臓器移植の直前に実施される、臓器のレシピエントとドナーとの間の直接的な適合試験（クロスマッチ）の陽性対照及び感受性対照として利用することができる。
本発明は、以下：
−４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
−２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
から形成されるＨＬＡクラスＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンであって、
−各重（Ｈ）鎖が以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
を含むことと、
−各軽（Ｌ）鎖が以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
を含むこととを特徴とするキメラ型モノクローナル免疫グロブリンにも関する。
有利には、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、すべてのＨＬＡクラスＩ抗原に共通のエピトープを識別できるように適合させる。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは以下：
−配列番号１の配列の少なくとも１つの軽鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、及び、
−配列番号２の配列の重鎖、配列番号３の配列の重鎖、及び配列番号４の配列の重鎖から成る群から選択される少なくとも１つの重鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン
から成る群から選択される。
本発明は、以下：
−４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
−２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
から形成されるＨＬＡクラスＩＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンであって、
−配列番号５の配列の少なくとも１つの軽鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、及び、
−配列番号６の配列の重鎖、配列番号７の配列の重鎖、及び配列番号８の配列の重鎖から成る群から選択される少なくとも１つの重鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン
から成る群から選択されることを特徴とするキメラ型モノクローナル免疫グロブリンにも関する。
有利には、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、ほぼすべてのＨＬＡクラスＩＩ抗原に共通のエピトープを識別できるように適合させる。
有利には、本発明によるＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、以下のような免疫グロブリンを意味する。
・重鎖及び軽鎖がその定常部分において本質的にヒトのものである。特に、重鎖の定常部分は、ＩｇＡの重鎖の定常部分、ＩｇＧの重鎖の定常部分、及びＩｇＭの重鎖の定常部分から成る群から選択され、軽鎖の定常部分はκ鎖及びλ鎖から成る群から選択され、
・軽鎖及び重鎖の可変部分がＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択される。かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンにおいて、ヒト抗体重鎖の定常部分（ＣＨ）及びヒト抗体軽鎖の定常部分（ＣＬ）は、合計でキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの約６０質量％に相当する。さらに、かかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、すなわち単一のモノモルフィックエピトープに特異的である。
有利には、各モノクローナル抗体は、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な、脊椎生物、とりわけヒト以外の脊椎生物のモノクローナル抗体、及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な、脊椎生物、とりわけヒト以外の脊椎生物のモノクローナル抗体から成る群から選択される。
本明細書全体において、「ヒト以外の脊椎生物」は、ヒトを除く高等生物を意味する。かかる脊椎生物は特に免疫システムを持っている。かかる脊椎生物は特にヒト以外の哺乳類、とりわけマウス、ラット、ウサギ、及びハムスター、両生類、ならびに鳥類、とりわけキジ目から成る群から選択される。かかるヒト以外の脊椎生物は、特に実験用動物である。しかし、かかるモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択することができる。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体は、脊椎生物モノクローナル抗体、特に哺乳類、とりわけマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、及びヒトのモノクローナル抗体、ならびに哺乳類以外の脊椎生物、とりわけ両生類、鳥類、特にキジ目のモノクローナル抗体から成る群から選択される。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、抗体Ｗ６／３２である。
本発明により、有利には、ＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、抗体Ｆ３．３である。
さらに、本発明は、水性組成物中の本発明による少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの安定した溶液を目的とする。
本発明は、本発明による少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのかかる水溶液も目的とし、前記水溶液は前記キメラ型モノクローナル免疫グロブリンのあらかじめ決定された濃度を示す。
本発明は、抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体量の決定を可能にし得るように適合したかかるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンも目的とする。
本発明は、そのうえ、液体媒体の抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量キットであって、本発明による少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのあらかじめ決定された量及び本発明による方法の実施のための説明書を含むキットに及ぶ。
したがって、本発明は、以下：
−４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
−２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
を含む少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのあらかじめ決定された量を含む液体媒体の抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量キットであって、
−各重（Ｈ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
を含むことと、
−各軽（Ｌ）鎖が、以下：
・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
を含むこととを特徴とするキットを目的とし、前記キットは本発明による方法の実施のための説明書も含む。
本発明は、また、上記又は下記に記載の特徴のすべて又は一部を組み合わせて特徴とする、抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体量の決定方法、キメラ型モノクローナル免疫グロブリン、その使用、及びこの決定のためのキットに関する。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、限定的ではない例としてのみ挙げられた本発明の好ましい実施形態を表す添付図面を参照する以下の説明を読むことにより明らかになる。
陰性対照により処理された１７種のタイプのビーズの蛍光強度の時間的変動を示すグラフである。 時間に応じた先行技術による陽性対照の１２種のタイプのＨＬＡクラスＩ抗原を持つビーズの蛍光強度の変動を示すグラフである。 時間に応じた先行技術による陽性対照の５種のタイプのＨＬＡクラスＩＩビーズの蛍光強度の変動を示すグラフである。 先行技術による陽性対照及び本発明による陽性対照の蛍光強度の比較を示すヒストグラムであって、先行技術による陽性対照（ハッチのヒストグラム）で、及び本発明による陽性対照（純色のヒストグラム）で処理された１２種のタイプのＨＬＡクラスＩビーズ上で測定された蛍光強度を示すヒストグラムである。 先行技術による陽性対照及び本発明による陽性対照の蛍光強度の比較を示すヒストグラムであって、先行技術による陽性対照（ハッチのヒストグラム）で、及び本発明による陽性対照（純色のヒストグラム）で処理された５種のタイプのＨＬＡクラスＩＩビーズ上で測定された蛍光強度を示すヒストグラムである。 Ｔリンパ球及びＢリンパ球上の本発明によるクラスＩ及びクラスＩＩのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの固定のフローサイトメトリー分析である。 本発明による陽性対照で処理された１２種のタイプのＨＬＡクラスＩビーズに対応する重ね合わせた１２本の用量応答曲線を示すグラフである。本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度は、μｇ／ｍＬで表す。 図６Ａに対応する本発明による陽性対照で処理された１２種のタイプのＨＬＡクラスＩビーズの平均用量応答曲線を示すグラフである。本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度は、μｇ／ｍＬで表す。 本発明による陽性対照で処理された５種のタイプのＨＬＡクラスＩＩビーズに対応する重ね合わせた５本の用量応答曲線を示すグラフである。本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度は、μｇ／ｍＬで表す。 図７Ａに対応する本発明による陽性対照で処理された５種のタイプのＨＬＡクラスＩＩビーズの平均用量応答曲線を示すグラフである。本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度は、μｇ／ｍＬで表す。 緩衝生理食塩水で保存した（白色の正方形）、及び６０ｇ／Ｌのヒトアルブミン溶液で保存した（黒色の菱形）本発明による抗ＨＬＡクラスＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの用量応答曲線の比較を示すグラフである。 緩衝生理食塩水で保存した（白色の正方形）、及び６０ｇ／Ｌのヒトアルブミン溶液で保存した（黒色の菱形）本発明による抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの用量応答曲線の比較を示すグラフである。 抗ＨＬＡクラスＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］）の軽鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号１の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号２の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｗ６／３２］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号３の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｗ６／３２］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号４の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］の軽鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号５の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号６の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号７の配列に対応する。 キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｆ３．３］の重鎖のペプチド配列を示す図であり、配列番号８の配列に対応する。
実施例１ 本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＩｇＧ／抗ＨＬＡクラスＩ（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］）の獲得
抗体Ｗ６／３２は、１９７８年、Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅらの刊行物に初めて記載された（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ ＣＪ、Ｂｏｄｍｅｒ ＷＦ、Ｂｒｏｗｎ Ｇ、Ｇａｌｆｒｅ Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＦ、Ｚｉｅｇｌｅｒ Ａ．、１９７８、Ｃｅｌｌｅ、１４（１）、９〜２０．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，ＨＬＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ−ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）。この抗体は、マウス骨髄腫系統（マウス免疫グロブリンで分泌されないＰ３−ＮＳＩ／１Ａｇ４−１系統）の細胞と、ヒト細胞に対して免疫化されたマウスリンパ球との融合を由来とするマウスハイブリドーマから分泌された。この抗体はＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）上に認められた大衆エピトープと反応することが証明された。識別されたエピトープは、クラスＩのα重鎖とβ２ミクログロブリンとの会合に依存するコンホメーションエピトープである。エピトープは、β２ミクログロブリン３位のアルギニン及びα鎖１２１位のリジンの存在を必要とする（Ｌａｄａｓｋｙ ＪＪ、Ｓｈｕｍ ＢＰ、Ｃａｎａｖｅｚ Ｆ、Ｓｅｕａｎｅｚ ＨＮ、Ｐａｒｈａｍ Ｐ．、（１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、４９（４）、３１２〜３２０．Ｒｅｓｉｄｕｅ ３ ｏｆ ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｗ６／３２ ａｎｔｉｂｏｄｙ）。
第１段階では、抗体Ｗ６／３２の重鎖及び軽鎖をコードする転写産物がクローニングされ、配列決定された。
重鎖のｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）は、２つのプライマー、一方はプライマーペプチド（「ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ、リーダーペプチド」）をコードする領域に特異的であり、他方は定常部分のＣＨ１ドメインをコードする部分５’を標的とするプライマーによってＰＣＲ増幅された。
軽鎖のｃＤＮＡ増幅には、リーダーペプチドのエクソンを標的とするプライマー及びＣκドメインの部分５’を標的とするプライマーが用いられた。２つの鎖のｃＤＮＡフラグメントは、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）中でクローニングされた。クローニングされたフラグメントは配列決定された。配列アラインメントによって、重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡのコンセンサスを９８％の相同性閾値で確立することができた。可変部分をコードする領域は、ＩＭＧＴ（登録商標）（「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、国際免疫遺伝学情報システム」）のデータバンクにある配列と比較して決定した。
場合に応じて軽鎖又は重鎖のプライマーペプチドをコードする配列は５’に加えられ、３’の配列は軽鎖ＤＮＡのためのＢｓｉＷＩ制限酵素部位、及び重鎖のためのＮｈｅＩ制限酵素部位を作る形で変更された。これらの制限酵素部位は、クローニングベクターｐＦＵＳＥ−ＣＬＩｇ及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）中にこれらの核酸配列の挿入ができるように適合している。このように決められた配列は合成され、ついで、ヒトκ鎖の定常ドメインをコードする部分（アロタイプＫｍ ０１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｊ００２４１）、あるいはヒトＩｇＧ１の定常部分を含む発現ベクターの中でクローニングされた。発現ベクターの制限酵素部位によって、免疫グロブリン鎖の定常部分をコードする領域に沿って可変部分のｃＤＮＡを挿入することができる。
２つの発現ベクター、一方は抗体Ｗ６／３２軽鎖の可変部分とヒトＣκドメインを会合させるキメラ軽鎖（ＶＬ［Ｗ６／３２］−ヒトＣκ鎖）をコードし、他方は抗体Ｗ６／３２重鎖の可変部分とヒトＣγ１ドメインを会合させる（ＶＬ［Ｗ６／３２］−ヒトＣγ１）ベクターがこのようにして得られた。
これら２つのベクターは、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ、チャイニーズハムスター卵巣細胞）内にトランスフェクションによって導入された。このために、細胞はまず軽鎖をコードするベクターによって、ついで重鎖をコードするベクターによってトランスフェクトされた。発現ベクターは、二重トランスフェクト細胞を効果的に選別できる細胞毒性薬耐性因子を含む。選別期間後、二重トランスフェクト細胞は、限界希釈法によってクローニングされ、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によってヒトＩｇＧ１κがクローン上清中にあることが明らかになった。このようにして明らかになった産生クローンに、下記でＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］と名づけられるキメラＩｇＧ１κ分泌において最も有効なクローンを集められるように複数回限界希釈法によるクローニングサイクルを施した。
トランスフェクトＣＨＯ細胞培養物の上清中に分泌されたＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズに結合したブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｑｕｅ）プロテインＡ上の捕獲−溶出によって精製された。ＩｇＧ１κはｐＨ２のグリシン緩衝液中で酸性ｐＨで溶出された。溶出液は濃度７５０ｍＭのリン酸二ナトリウム水溶液で即時に緩衝化された。Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］溶液は、４℃又は−８０℃で保存された。
キメラ型モノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ１−抗ＨＬＡクラスＩ）Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の軽鎖のペプチド配列は図９に示され、配列番号１の配列に対応する。キメラ型モノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ１−抗ＨＬＡクラスＩ）Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の重鎖のペプチド配列は図１０に示され、配列番号２の配列に対応する。
本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］結合の特異性の検証は、ＥＤＴＡチューブで採取したヒト血液から密度勾配上で分離されたＴリンパ球又はＢリンパ球上で実施された。細胞は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ４５抗体によって標識された。Ｔ（ＣＤ３＋）及びＢ（ＣＤ１９＋）リンパ球は、リンパ球ＣＤ４５＋集団の中から決められた。
末梢血のヒト単核細胞（Ｔリンパ球又はＢリンパ球）存在下で、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］をインキュベートし、ついで前記ヒト単核細胞を連続して３回の洗浄、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回の洗浄を実施する。ヒト抗Ｆｃγヤギ抗体によってヒト単核細胞に固定されたキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの固定が明らかにされる。結果は図５に示され、抗体Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］はＢリンパ球上に固定して（図５Ａ）、Ｔリンパ球上にも固定し（図５Ｃ）、これに対して抗体Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］はＢリンパ球上に固定するが（図５Ｂ）、Ｔリンパ球上には固定しない（図５Ｄ）ことを示す。
実施例２ キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の特異性
次に、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の特異性が、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（登録商標）社販売の市販キットを用いて多重定量的蛍光法によって決定された。この決定は、間接免疫蛍光反応に基づき、様々な群のＨＬＡ抗原に覆われたラテックスビーズを用いる。ラテックスビーズに存在するＨＬＡ抗原を識別できる抗体は、フィコエリトリンにカップリングしたヒト抗ＩｇＧ抗体によって明らかになる。蛍光は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）装置でフローサイトメトリーによって各ビーズ上で定量される。各ビーズは特定のＨＬＡ抗原混合物に覆われているが、ビーズの各タイプの特異的な蛍光標識によって、様々なビーズ（その蛍光から識別できる）を利用することができる。これによって、すべてのクラスＩビーズがほぼ同じ強度で識別されることが証明される（図４Ａ、クラスＩビーズ）。これによって、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］がすべてのＨＬＡクラスＩ分子上に存在する大衆エピトープを識別すると結論づけられる。
競合実験によって、マウスハイブリドーマから分泌されたマウスモノクローナル抗体Ｗ６／３２は、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］の固定を阻害することが証明された。
実施例３ 本発明によるアイソタイプＩｇＡ２及びＩｇＭの抗ＨＬＡクラスＩキメラ型モノクローナル抗体（Ｈｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｗ６／３２］及びＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｗ６／３２］）の獲得
重鎖Ｗ６／３２の可変部分（ＶＨ［Ｗ６／３２］）は、他の２つの発現ベクター、第１のベクターはキメラμ鎖（Ｗ６／３２の可変部分及びヒトμ重鎖（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ５１０１０４．１）の定常部分）、他方はキメラα２鎖（Ｗ６／３２の可変部分及びヒトα２重鎖、アロタイプＡ２ｍ（１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｊ００２２１）の定常部分）を産生できるベクターの中にクローニングされた。これら２つのベクターは、キメラ軽鎖ＶＬ［Ｗ６／３２］−ヒトＫの発現を可能にする、ベクターによってあらかじめトランスフェクトされたＣＨＯ系統細胞をトランスフェクトするために用いられた。このように、多量のキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｗ６／３２］を分泌するＣＨＯ細胞クローン、及びキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｗ６／３２］を分泌する他のクローンを単離した。納入業者の勧めに従い、キメラ型ＩｇＡはペプチドＭにカップリングしたアガロースの担体（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）上で精製し、キメラ型ＩｇＭはプロテインＬにカップリングしたアガロースの担体（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）上で精製した。
キメラ型モノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＡ２−抗ＨＬＡクラスＩ）Ｈｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｗ６／３２］の重鎖のペプチド配列は図１１に示され、配列番号３の配列に対応する。
キメラ型モノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＭ−抗ＨＬＡクラスＩ）の重鎖のペプチド配列は図１２に示され、配列番号４の配列に対応する。
キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｗ６／３２］及びＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｗ６／３２］の反応性は、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）キット（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（登録商標））でのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術で、蛍光二次抗体としてフィコエリトリンにカップリングしたヒト抗ＩｇＡ又はヒト抗ＩｇＭヤギ抗体で検証した。
実施例４ 本発明による抗ＨＬＡクラスＩＩモノクローナル抗体（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］）の獲得
その原理において、抗ＨＬＡクラスＩＩモノクローナル抗体の獲得方法は、抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（Ｗ６／３２）の獲得方法と似通っている。
抗体Ｆ３．３（Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ｄ．、Ｖａｌｅｒｉｕｓ，Ｔ．、Ｒｅｐｐ，Ｒ．、Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．、Ｄｅｏ，Ｙ．、Ｋａｌｄｅｎ，Ｊ．Ｒ．、ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．及びＧｒａｍａｔｚｋｉ，Ｍ．、（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８７（９）、３８０３〜３８１２．ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）は、マウスハイブリドーマの単一クローンの製品である。抗体Ｆ３．３は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現するすべてのヒト細胞の表面に存在する少なくとも１つの大衆エピトープを識別する。特に、抗体Ｆ３．３は、すべてのＤＲ抗原、すべてのＤＰ抗原、及びすべてのＤＱ２群の抗原を識別する。抗体Ｆ３．３の可変部分の完全なコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）でアクセス可能である（アクセス番号：軽鎖についてはＡＹ０５８９１０［ＶＬ］及び重鎖についてはＡＹ０５８９１１［ＶＨ］）。
可変部分の配列は、重鎖についてはｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）及び軽鎖についてはｐＦＵＳＥ−ＣＬＩｇ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）のクローニングベクター中で、適正に合成されクローニングされた。ベクター（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ）は、キメラ重鎖ＶＨ［Ｆ３．３］−ヒトＣγ１の産生を可能にし、ベクター（ｐＦＵＳＥ−ＣＬＩｇ）は、軽鎖ＶＬ［Ｆ３．３］−ヒトＣκの産生を可能にする。これら２つの発現ベクターは、実施例１に記載のようにＣＨＯ系統細胞をトランスフェクトするために用いられる。
さらに、可変部分ＶＨ［Ｆ３．３］は、キメラ重鎖ＶＨ［Ｆ３．３］−ヒトＣμ及びＶＨ［Ｆ３．３］−ヒトＣα２の産生を可能とする発現ベクター中でクローニングされた。
抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］）の軽鎖のペプチド配列は図１３に示され、配列番号５の配列に対応する。
抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］）の重鎖のペプチド配列は図１４に示され、配列番号６の配列に対応する。
抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］）の重鎖のペプチド配列は図１５に示され、配列番号７の配列に対応する。
抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｆ３．３］）の重鎖のペプチド配列は図１６に示され、配列番号８の配列に対応する。
ＨＬＡクラスＩＩ抗原に対するキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］、Ｈｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］、及びＨｕ−ＩｇＭ Ｋ［Ｆ３．３］は、適切なベクターによってトランスフェクトＣＨＯ細胞によって産生された。キメラＩｇＧ１はプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製された。キメラＩｇＡはペプチドＭアガロース（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）上で精製された。キメラＩｇＭはプロテインＬアガロース（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）上で精製された。
本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］の結合の特異性は、実施例１に記載のように、ヒト単核細胞上でフローサイトメトリーによる間接免疫蛍光法によって検証する。結果は図５に示され、本発明による抗体Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］がヒト細胞に対して、とりわけＢリンパ球（図５Ｂ）及びＴリンパ球（図５Ｄ）に、強く反応することを示す。
さらに、本発明による抗ＨＬＡクラスＩＩキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの特異性をＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）での多重定量的免疫蛍光法によって、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）及びＬａｂｓｃｒｅｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ（登録商標）（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（登録商標））キットを用いて検討する。
抗体Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］は、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）キットのＨＬＡクラスＩＩ抗原を持つすべてのビーズ、ならびにＬａｂｓｃｒｅｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ ＩＩ（登録商標）キットのＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、及びＨＬＡ−ＤＱ２抗原を持つすべてのビーズ上に固定した。
競合実験によって、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］及びＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］は、同じエピトープを識別することが証明された。キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］の反応性は、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］の固定を明らかにするために、フィコエリトリンにカップリングしたヒト抗ＩｇＡヤギ抗体を用いて、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）キット（Ｏｎｅ−Ｌａｍｂｄａ（登録商標））を用いたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術によって検討された。キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＡ２ Ｋ［Ｆ３．３］の反応性は、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］の反応性と同一であることが明らかになった。
実施例５ 抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量方法
本発明による免疫蛍光法による抗体を含有する液体媒体の抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量方法において、限定的でない例として、以下を含む研究用キット「Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）」（ＬＳＭ１２、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（登録商標） Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いる。
−精製された及び混合物状態のＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ）に共有的に結合したポリスチレンビーズ、
−精製されたＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＰ）に共有的に結合したポリスチレンビーズ、
−ＩｇＧに結合した、陽性対照ビーズと呼ばれるポリスチレンビーズ、
−表面抗原の欠けている陰性対照ビーズと呼ばれるポリスチレンビーズ。かかる研究用キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））は、抗ＨＬＡクラスＩ抗体及び抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体のスクリーニングのポリスチレンビーズの水性懸濁液を含む。この懸濁液のポリスチレンビーズは、複数のタイプのポリスチレンビーズを含み、各タイプのポリスチレンビーズは、蛍光標識によって他のタイプのポリスチレンビーズと区別され、別のＨＬＡクラスＩ抗原及びＨＬＡクラスＩＩ抗原を持つポリスチレンビーズを含む。実際には、各タイプのポリスチレンビーズは、６つのＨＬＡ−Ａ（クラスＩ）抗原、６つのＨＬＡ−Ｂ（クラスＩ）抗原、６つのＨＬＡ−Ｃ（クラスＩ）抗原、又は６つのＨＬＡ−ＤＱ（クラスＩＩ）抗原、６つのＨＬＡ−ＤＲ（クラスＩＩ）抗原、６つのＨＬＡ−ＤＰ（クラスＩＩ）抗原までポリスチレンビーズの表面に提示する。
研究用キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））は、１７種の各タイプのポリスチレンビーズの蛍光強度が同時に測定可能な、１２種のタイプのクラスＩポリスチレンビーズ及び５種のタイプのクラスＩＩビーズを含む。したがって、同じ集合のＨＬＡ抗原に結合した各タイプのポリスチレンビーズの平均蛍光強度を計算する。このポリスチレンビーズの混合物の中には、ＨＬＡクラスＩ抗原及びＨＬＡクラスＩＩ抗原が欠けているものがあり、陰性対照に利用される。
研究用キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））の使用には、さらに抗ＨＬＡ抗体スクリーニング反応のときに陰性対照血清（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＬＳＮＣ）血清）を必要とする。この血清は、製造者によって、抗ＨＬＡクラスＩ抗体及び抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体が欠けていることを特徴とされている。
かかる陰性対照で処理されるクラスＩ抗原を持つ１２種の各タイプのビーズ及びクラスＩＩ抗原を持つ５種の各タイプのビーズに関連づけた、５カ月間観察された蛍光強度の平均値は下記の表１に示されている。
Figure 2015509586
表１に示された値は小さく、生成された蛍光はポリスチレンビーズ上のＩｇＧの非特異的な結合及びこれらのビーズ上の二次抗体の非特異的な結合によって示される。
陽性対照
研究用キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））は、陽性対照として、表面に精製されたヒトＩｇＧを移植したポリスチレンビーズを含む。かかる陽性対照は、二次抗体の機能性の検証でのその使用において限定的である。かかる陽性対照では、蛍光強度値を液体媒体中の抗ＨＬＡ抗体濃度値に変換することができない。
ポリクローナル陽性対照
キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））使用者、とりわけ免疫学研究所は、先行技術によるインビトロ抗ＨＬＡ抗体スクリーニングのときの陽性対照として、ＨＬＡ抗原に対して多重免疫化した個体を由来とする血清混合物を用いるように推奨している。例として、このポリクローナル対照の各タイプのＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩビーズに関連づけた、５カ月間測定された平均蛍光強度値を下記の表２に示す。
Figure 2015509586
先行技術による定性的対照で処理されたＨＬＡクラスＩビーズ上で測定された平均蛍光の計算された値は、約５２００蛍光単位であり、標準偏差は約４９００蛍光単位である。
先行技術による定性的対照で処理されたＨＬＡクラスＩＩビーズ上で測定された平均蛍光の計算された値は、約８６００蛍光単位であり、標準偏差は約７５００蛍光単位である。
定性的対照の各タイプのポリスチレンビーズの蛍光強度は、１０００〜２００００で変動する。各タイプのポリスチレンビーズ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＤＰ）の応答のかかる可変性では、１つの参照抗ＨＬＡ抗体濃度に対して測定した蛍光強度の単一の変換曲線を決めることはできない。さらに、各タイプのＨＬＡ抗原に特異的なＨＬＡ抗体濃度が先行技術の定性的対照において決定できないという事実を考慮すると、測定した蛍光強度のかかる変換曲線は得られない。
先行技術の定性的対照の例として、キット「Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）」の各タイプのポリスチレンビーズの蛍光分析は、クラスＩ抗原を持つ各タイプのビーズ（図４Ａのビーズ番号６、７、８、１７、６９、７９、８４、８６、８７、８８、８９、及び９０のタイプ）に関連づけた蛍光は、平均約７０００蛍光単位から平均１２０００蛍光単位の値で変動することを示す。各タイプのＨＬＡクラスＩビーズ上で測定された平均蛍光強度値は、約９６００蛍光単位である。これらの値の標準偏差値は、約３１００蛍光単位である。
さらに、キット「Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）」の各タイプのポリスチレンビーズのこの蛍光分析は、クラスＩＩ抗原を持つ各タイプのビーズ（図４Ｂのビーズ番号９１、９３、９５、９６、及び９７のタイプ）に関連づけた蛍光は、平均約１０００蛍光単位から平均１９０００蛍光単位の値で変動することを示す。各タイプのＨＬＡクラスＩＩビーズ上で測定された平均蛍光強度値は、約１３０００蛍光単位である。これらの値の標準偏差値は、約８３００蛍光単位である。
したがって、かかる対照は、血清混合物中の各抗体濃度が既知でない以上、もっぱら定性的である分析での使用において、限定的である。
本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン
研究用キット（Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標））の定量的対照として、本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを用いる。既知の濃度２μｇ／ｍＬで、実施例１から４に記載のように、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］）及び／又は抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］）キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液を調製する。ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ抗原を持つ各タイプのポリスチレンビーズに関連づけた平均蛍光強度分析を実施する。得られた結果は、図４に示されている（白色のヒストグラム）。
キット「Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）」の各タイプのポリスチレンビーズについて、平均約２２０００蛍光単位の蛍光強度が観察される。
特に、この分析は以下を示す。
−クラスＩ抗原を持つ各タイプのビーズ（図４Ａのビーズ番号６、７、８、１７、６９、７９、８４、８６、８７、８８、８９、及び９０のタイプ、純色のヒストグラム）に関連づけた蛍光はほぼ定常であり、平均約２２０００蛍光単位である。各タイプのＨＬＡクラスＩビーズ上で測定された平均蛍光強度値は、約２１５００蛍光単位である。これらの値の標準偏差値は、約４５０蛍光単位である。
−クラスＩＩ抗原を持つ各タイプのビーズ（図４Ｂのビーズ番号９１、９３、９５、９６、及び９７のタイプ、純色のヒストグラム）に関連づけた蛍光はほぼ定常であり、平均約２２０００蛍光単位である。これらの値の標準偏差値は、約７００蛍光単位である。
この蛍光強度値は、ポリスチレンビーズのタイプにかかわらず（ポリスチレンビーズのタイプが持つＨＬＡ抗原にかかわらず）ほぼ定常であり、２μｇ／ｍＬの抗体濃度に対応する。本発明によるかかるキメラ型モノクローナル抗体は、本発明によるキメラ型モノクローナル抗体濃度に応じて、蛍光応答の定量的較正ができるように適合している。
本発明（図４Ａ及び４Ｂの純色のヒストグラム）と先行技術（図４Ａ及び４Ｂのハッチのヒストグラム）との比較として、ＨＬＡクラスＩ抗原を持つビーズ上及びＨＬＡクラスＩＩ抗原を持つビーズ上で明らかになった平均蛍光値（及び標準偏差）は図４に表している。
実施例６ 抗ＨＬＡ抗体のインビトロ定量方法−「用量応答」曲線
「用量応答」曲線を作成するため、マイクロフィルターマルチウェルプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標））の各ウェルに洗浄緩衝液（ＰＢＳ）３００μＬを分配する。１０分後、洗浄緩衝液を吸引除去し、「Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ ｍｉｘｅｄ（登録商標）」ビーズの均質化した懸濁液５μＬを加える。一連の漸減キメラ型モノクローナル抗体濃度の本発明によるキメラ型モノクローナル抗体溶液が連続段階希釈によって得られる。陰性及び陽性対照は平行して同じ形で処理される。これらの各連続希釈液２０μＬを分配し、マルチウェルプレートのウェルにあらかじめ置かれたポリスチレンビーズと接触させる。ポリスチレンビーズとキメラ型モノクローナル抗体との混合物は、遮光下常温で３０分間インキュベートされる。その後、洗浄緩衝液２５０μＬで各ウェルの洗浄を連続して５回実施する。次に、１／１００に希釈した二次抗体溶液１００μＬを加える。ポリスチレンビーズに結合した抗ＨＬＡ抗体の蛍光標識として用いられる二次抗体は、例えばフィコエリトリンにカップリングしたヤギ抗ＩｇＡ抗体（ａｎｔｉ−ＩｇＡ−ＰＥ、ＡｂＳｅｒｏｔｅｃ、ＵＳＡ）又はフィコエリトリンにカップリングしたヤギ抗ＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ−ＩｇＧ−ＰＥ、ＩｎＧｅｎ、ＵＳＡ）である。もちろん、本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン定常鎖に結合可能で識別可能な抗体にカップリングした他のあらゆる蛍光基を用いることができる。マルチウェルプレートは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）免疫蛍光リーダーでの分析前に、遮光下常温に３０分間置く。
本発明による方法によって得た「用量応答」タイプの較正曲線は、図６（抗ＨＬＡクラスＩ）及び図７（抗ＨＬＡクラスＩＩ）に表している。蛍光強度値は、μｇ／ｍＬで表される本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度に応じて示される。
各タイプのＨＬＡクラスＩ（図６Ｂ）及びＨＬＡクラスＩＩ（図７Ｂ）ビーズ上で測定された蛍光強度の測定値の平均値及び標準偏差は、下記の表３にまとめている。
Figure 2015509586
上に記載した滴定曲線に関するデータについてボルツマン型シグモイド非線形回帰による統計的分析を実施する。観察された最小蛍光値（ＭＩＮ）、すなわちキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度が０の値に近づくときの曲線での漸近線の値、観察された最大蛍光値（ＭＡＸ）、すなわちキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度が無限値に近づくときの曲線での漸近線の値、及び特異的シグナルの５０％に対応するキメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度値（ＭＡＸ−ＭＩＮ）を決定する。これらの値は下記の表４に示されている。
Figure 2015509586
実施例７ アルブミン緩衝液媒体中の本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］及びＨｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］の安定性の分析
６０ｇ／Ｌの濃度でのヒトアルブミンを含有する水性緩衝液媒体中に２カ月間保存した本発明によるキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの連続希釈液を調製する。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術によって、実施例６に記載のように「用量応答」曲線を作成する。ＨＬＡクラスＩ抗原に対するキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｗ６／３２］）で得た結果は図８Ａに示され、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に対するキメラ型モノクローナル免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ１ Ｋ［Ｆ３．３］）で得た結果は図８Ｂに示されている。緩衝生理食塩水中で保存したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンで得た結果は白色の正方形（□）で示され、蛋白質緩衝液中で保存したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンで得た結果は黒色の菱形（◆）で示されている。緩衝生理食塩水で保存されたキメラ型モノクローナル免疫グロブリンと蛋白質緩衝液で保存されたキメラ型モノクローナル免疫グロブリンとの間にはいかなる有意な差も観察されなかった。

Claims (16)

  1. − 複数のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）であって、それぞれが該キメラ型モノクローナル免疫グロブリンの決定された濃度値（Ｃｎ）を示す溶液（Ｓｎ）を作製し、ついで、
    − 各溶液（Ｓｎ）を、同じ決定量の少なくとも１つの固定化ＨＬＡ抗原と接触させ、
    − パラメーターからの測定値（Ｖｎ）であって、決定量の各固定化ＨＬＡ抗原に結合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリン量（Ｑｎ）を表す測定値（Ｖｎ）に、各決定濃度値（Ｃｎ）を関連づける較正曲線を作成し、
    − 決定濃度（Ｃｎ）と測定値（Ｖｎ）の対（Ｃｎ、Ｖｎ）から、各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液（Ｓｎ）のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン決定濃度（Ｃｎ）に応じて、測定値（Ｖｎ）の較正曲線及びバラツキを作成し、
    − キメラ型モノクローナル免疫グロブリン濃度が有意に０より大きい値を超えるパラメーターの、閾値と呼ばれる値を計算する、
    抗体を含む液体媒体中の抗ＨＬＡ抗体量の決定方法であって、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンが、
    −４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
    −２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖
    から形成される方法において、
    − 各重（Ｈ）鎖が、
    ・ ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
    ・ ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
    を含むことと、
    − 各軽（Ｌ）鎖が、
    ・ ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
    ・ κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
    を含むことを特徴とする方法。
  2. ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体を脊椎生物モノクローナル抗体から成る群から選択することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. パラメーターが、蛍光パラメーター、発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 蛍光パラメーターが蛍光強度であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. ａ）各固定化ＨＬＡ抗原が、粒子から形成される分割された状態の固体担体の粒子の表面に固定化されたＨＬＡ抗原であり、
    ｂ）固定化ＨＬＡ抗原と固体担体のＨＬＡ抗原に対する各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液とを、固体担体のＨＬＡ抗原と各キメラ型モノクローナル免疫グロブリン溶液のキメラ型モノクローナル免疫グロブリンとの間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
    ｃ）固体担体のＨＬＡ抗原に結合していないキメラ型モノクローナル免疫グロブリンを洗浄によって除去し、ついで、
    ｄ）固体担体のＨＬＡ抗原に結合したキメラ型モノクローナル免疫グロブリンと、蛍光二次抗体、発光二次抗体、及び光吸収二次抗体から成る群から選択された、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに対する二次抗体の溶液とを、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンと二次抗体との間に安定した結合を形成するのに適合した条件下で接触させ、ついで、
    ｅ）キメラ型モノクローナル免疫グロブリンに結合していない二次抗体を洗浄によって除去し、ついで、
    ｆ）固体担体の各粒子に結合した二次抗体の少なくとも１つのパラメーターを測定し、この測定値に蛍光パラメーター、発光パラメーター、及び比色定量パラメーターから成る群から選択される前記パラメーターからの測定値（Ｖｎ）を付与し、ついで、
    ｇ）校正曲線を作成し、ついで、
    ｈ）この校正曲線から、分析溶液中の抗ＨＬＡ抗体の存在の有意な蛍光強度閾値を推定することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 各固定化ＨＬＡ抗原が少なくとも１つの細胞の表面に提示されたＨＬＡ抗原であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体が抗体Ｗ６／３２であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体が抗体Ｆ３．３であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 多重定量的免疫蛍光法による方法、フローサイトメトリーによる方法、固体担体上の免疫酵素定量による方法、及び補体依存性小リンパ球傷害による方法から成る群から選択される抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング又は定量方法における標準化及び陽性対照及び感受性の試薬としてのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンの使用であって、キメラ型モノクローナル免疫グロブリンが、
    −４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
    −２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
    から形成されることを特徴とし、
    −各重（Ｈ）鎖が、
    ・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
    ・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
    を含むことと、
    −各軽（Ｌ）鎖が、
    ・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体及びＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
    ・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
    を含むことを特徴とする使用。
  10. − ４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
    − ２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
    から形成されるＨＬＡクラスＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンであって、
    − 各重（Ｈ）鎖が、
    ・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）、及び、
    ・ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ＣＨ）
    を含むことと、
    −各軽（Ｌ）鎖が、
    ・ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体から成る群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）、及び、
    ・κ鎖及びλ鎖から成る群から選択されるヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）
    を含むことを特徴とする、キメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  11. − 配列番号１の配列の少なくとも１つの軽鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、及び、
    − 配列番号２の配列の重鎖、配列番号３の配列の重鎖、及び配列番号４の配列の重鎖から成る群から選択される少なくとも１つの重鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン
    から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のＨＬＡクラスＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  12. − ４０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量の、重（Ｈ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、及び、
    − ２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量の、軽（Ｌ）鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖、
    から形成されるＨＬＡクラスＩＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリンであって、
    − 配列番号５の配列の少なくとも１つの軽鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン、及び、
    − 配列番号６の配列の重鎖、配列番号７の配列の重鎖、及び配列番号８の配列の重鎖から成る群から選択される少なくとも１つの重鎖を含むキメラ型モノクローナル免疫グロブリン
    から成る群から選択されることを特徴とするキメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  13. ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的な各モノクローナル抗体が脊椎生物モノクローナル抗体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のＨＬＡクラスＩ抗原に特異的なキメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  14. ＨＬＡクラスＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体が抗体Ｗ６／３２であることを特徴とする、請求項１０、１１、又は１３のいずれか一項に記載のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  15. ＨＬＡクラスＩＩ抗原モノモルフィックエピトープに特異的なモノクローナル抗体が抗体Ｆ３．３であることを特徴とする、請求項１２に記載のキメラ型モノクローナル免疫グロブリン。
  16. 液体媒体の抗ＨＬＡ抗体定量キットであって、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラ型モノクローナル免疫グロブリンのあらかじめ決定された量及び請求項１から８のいずれか一項に記載の方法の実施のための説明書を含むキット。
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