EP2376063A1 - Nouvelle forme d'administration de complexes de protéines ostéogéniques - Google Patents

Nouvelle forme d'administration de complexes de protéines ostéogéniques

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EP2376063A1
EP2376063A1 EP09809027A EP09809027A EP2376063A1 EP 2376063 A1 EP2376063 A1 EP 2376063A1 EP 09809027 A EP09809027 A EP 09809027A EP 09809027 A EP09809027 A EP 09809027A EP 2376063 A1 EP2376063 A1 EP 2376063A1
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EP
European Patent Office
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polysaccharide
solution
group
calcium
bmp
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Withdrawn
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EP09809027A
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German (de)
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Inventor
Gérard Soula
Rémi SOULA
Olivier Soula
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Adocia SAS
Original Assignee
Adocia SAS
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to the field of osteogenic formulations and more particularly formulations of osteogenic proteins belonging to the family of Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • OPs Osteogenic Proteins
  • BMPs are expressed as propeptides which, after post-translational processing, have a length of between 104 and 139 residues. They have a great homology of sequences between them and have similar three-dimensional structures. In particular, they have 6 cysteine residues involved in intramolecular disulfide bonds forming a "cysteine knot" (Scheufler C. 2004 J. Mol Biol 1999, 287, 103, Schlunegger MP, J. Mol Biol 1993, 231, 445). Some of them have a 7th cysteine also involved in an intermolecular disulfide bridge at the origin of dimer formation (Scheufler C. 2004 J. Mol Biol 1999: 287: 103).
  • the BMPs In their active form, the BMPs assemble into homodimers or heterodimers as described by Israel et al. (Israel DI, Growth Factors, 1996, 13 (3-4), 291). Dimeric BMPs interact with BMPR transmembrane receptors (Mundy et al., Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). This recognition is at the origin of a cascade of intracellular signaling involving Smad proteins in particular resulting in the activation or repression of target genes.
  • BMPs with the exception of BMPs 1 and 3, play a direct and indirect role on the differentiation of mesenchymal cells causing their differentiation into osteoblasts (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-). 1552). They further possess chemotactic properties and induce proliferation, differentiation and angiogenesis.
  • recombinant human BMPs and in particular rhBMP-2 and rhBMP-7 have clearly shown an ability to induce bone formation in vivo in humans and have been approved for certain medical applications.
  • recombinant human BMP-2 dibotermin alfa according to the international nonproprietary name, is formulated in the products marketed under the name InFUSE® in the United States and InductOs® in Europe. This product is prescribed in the fusion of the lumbar vertebrae and bone regeneration of the tibia for so-called non-union fractures.
  • the surgical procedure consists first of all, to soak a collagen sponge with a solution of rhBMP-2, then to place the sponge in a hollow cage, LT Cage, previously implanted between the vertebrae.
  • the recombinant human BMP-7 has the same therapeutic indications as BMP-2 and is the basis of two products: OP-I Implant for open fractures of the tibia and OP-I Putty for fusion of lumbar vertebrae.
  • OP-1 Implant consists of a powder containing rhBMP-7 and collagen to be taken up in 0.9% saline solution. The paste obtained is then applied to the fracture during a surgical procedure.
  • OP-I Putty comes in the form of two powders: one containing rhBMP-7 and collagen, the other carboxymethylcellulose (CMC). During surgery, CMC is reconstituted with 0.9% saline and mixed with rhBMP-7 and collagen. The paste thus obtained is applied to the site to be treated.
  • osteogenic proteins are a major problem because of their instability and the need to obtain osteogenic formulations containing a minimal amount of osteogenic protein. This is to avoid the side effects generated by high concentrations of these proteins and also because of the price of these proteins.
  • Many formulations have been and are developed as for example those mentioned in the review of Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine 2002, 27 (16 Suppl 1), S16-S23.), Wherein the importance of the nature of the delivery system is emphasized.
  • the delivery systems used must make it possible to increase the retention time of the proteins at the site of administration, to obtain a total release of the quantity of protein used and to avoid a too sudden release which may lead to broadcast outside the administration site.
  • the delivery system used must also be able to serve as a matrix for bone growth on the site to be treated while allowing to limit this bone growth on the site to be treated.
  • materials are employed in delivery systems to date, natural polymers, synthetic polymers, inorganic materials and mixtures of these materials. None of the systems developed has nevertheless significantly reduced the dose of BMP. This is related to, among other things, the instability of the protein in the formulation, or the poor bioavailability of the latter due to the structure of the support.
  • natural polymers collagen, hyaluronans, fibrin, chitosans, alginates and other natural polysaccharides are used.
  • the other natural polysaccharides in the form of hydrogels essentially have the defect of being resorbed too quickly, except to be previously crosslinked in the form of gels, which leads to the same disadvantages as those mentioned above for collagen sponges.
  • the most commonly used polymers are poly ( ⁇ -hydroxy acids) such as polylactide (PLA), polyglycolide (PLG) and their copolymers (PLGA).
  • Ceramics based on calcium phosphate such as hydroxyapatite (PAH) and tricalcium phosphate (TCP) and "non-ceramic" calcium phosphates, such as calcium-based cements.
  • PHA hydroxyapatite
  • TCP tricalcium phosphate
  • non-ceramic calcium phosphates such as calcium-based cements.
  • CPCs calcium phosphates
  • BMP-2 is greater in a ceramic than in a collagen sponge.
  • a clinical study of posterolateral fusion in humans (Boden, SD et al., Spine 2002, 27 (23), 2662-2673.) Reports that the dose of BMP-2 (40 mg) is greater with granules of BCP (60% PAH and 40% TCP) product developed by the company
  • MEDTRONIC SOFAMOR only in a collagen sponge that does not contain calcium phosphate (12 mg).
  • a very large number of systems have been developed based on non-ceramic calcium phosphate and among these are calcium phosphate cements.
  • the cements were discovered in the 1980s by Brown and Chow and meet the following definition: "Calcium phosphate cements consist of an aqueous solution and one or more calcium phosphates. When mixing is done, the calcium phosphate (s) dissolve and precipitate into a less soluble calcium phosphate salt. During precipitation, the calcium phosphate crystals grow and become entangled, leading to the mechanical rigidity of the cement. (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.).
  • cement in general, is obtained by reacting a salt of soluble calcium phosphate with a solid calcium phosphate salt treated at more than 400 0 C to make it reagent.
  • the reaction between these two compounds is uncontrolled, mostly exothermic and leads to a monolithic structure cement which sequesters the protein in its mass.
  • the Applicant has developed new osteogenic compositions composed of a coprecipitate which contains at least one insoluble calcium salt and at least one complex between an osteogenic protein and a polysaccharide, said coprecipitate being in divided form.
  • the conjunction of these two events makes it possible to obtain highly osteogenic formulations containing much smaller amounts of protein.
  • osteogenic compositions comprising at least one osteogenic protein, a soluble salt of divalent cation and a matrix.
  • osteogenic compositions comprising at least one osteogenic protein, at least one protein angiogenic, a soluble salt of divalent cation, optionally an anionic polysaccharide and optionally a matrix.
  • osteogenic compositions comprising at least one osteogenic protein complex / anionic polysaccharide a soluble salt of at least divalent cation and a matrix.
  • the invention also relates to formulations, pharmaceuticals and medical devices comprising said coprecipitate.
  • the compositions and kits for implementing this method and obtaining the coprecipitate are also inventions described below.
  • the coprecipitate results from simultaneous precipitation.
  • the coprecipitate results from sequential precipitation.
  • the complex between the anionic polymer and the osteogenic protein is obtained by adding the anionic polysaccharide solution to the osteogenic protein solution.
  • the precipitation of the calcium salt is carried out in the form of calcium phosphate, by addition of a soluble phosphate solution.
  • coprecipitate may vary according to the pH of the solutions used because the calcium phosphate salts have different solid phases depending on the pH and as a function of the anionic polysaccharide and the protein constituting the complex.
  • the invention relates to a coprecipitate comprising at least one complex between an osteogenic protein and a polysaccharide in its insolubilized form and at least one insoluble calcium salt, said coprecipitate being in divided form.
  • it further comprises at least one growth factor having a chemo-attractant and angiogenic potency.
  • the insoluble calcium salt is selected from the group consisting of calcium orthophosphates in anhydrous or hydrated form alone or in admixture.
  • the coprecipitate further comprises at least one insoluble calcium salt selected from the group consisting of calcium oxalate, calcium ascorbate, calcium carbonate or calcium sulfate.
  • Said insoluble calcium salts may be mixed salts formed between cationic calcium ions and anionic ions such as phosphates, mono, di or tribasic, carboxylates polysaccharides, carbonates, hydroxides and any anions carried by the basics.
  • Calcium orthophosphates are salts that result from the neutralization of different acidities of phosphoric acid by calcium salts and according to the literature the pKa range from 2.12 to 12.67 at 25 ° C.
  • the main insoluble calcium orthophosphates are dicalcium phosphates, DCP, anhydrous or dihydrate, octacalcic phosphates,
  • OCP tricalcium phosphates
  • TCP tricalcium phosphates
  • phosphacalcic hydroxyapatites PAHs or PCAs
  • tetracalcium phosphate TTCP
  • the anionic polymer / osteogenic protein complexes consist of the complexes described in application PCT / EP2008 / 059832 in the name of the Applicant.
  • This coprecipitation according to the desired effect is optionally carried out in the presence of a base for adjusting the pH to a predetermined value.
  • This solid chemical composition in the divided state, is obtained spontaneously under ambient temperature conditions, and its divided state is stable under in vitro physiological conditions.
  • the invention consists of a kit for the preparation of an osteogenic implant comprising at least: a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one polysaccharide, a composition comprising at least one soluble calcium salt, a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium,
  • the kit further comprises an additional composition comprising at least one base.
  • a second base can be added to compositions b, c or d.
  • compositions comprising the osteogenic protein may also comprise the polysaccharide to form the complex.
  • the composition comprising the osteogenic protein or the composition comprising the complex may also comprise the soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium and / or a base.
  • the composition comprising the polysaccharide may also comprise the soluble salt of an anion capable of forming an insoluble calcium salt and / or a base.
  • the composition comprising the soluble calcium salt may also comprise a base.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt calcium, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt, d - a composition comprising at least one base.
  • a second identical or different base base of the composition d can be added to the compositions b and c.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt and at least one base d - a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium.
  • a second identical or different base base of the composition c can be added to the compositions b and d.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide and at least one base, c - a composition comprising at least one calcium salt soluble, d - a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, b - a composition comprising at least one polysaccharide anionic compound, - a composition comprising at least one soluble calcium salt, d - a composition comprising at least one base.
  • a second identical or different base base of the composition d can be added to the compositions b and c.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt, d - a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium and at least one base.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt, d - a composition comprising at least one base.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide, at least one base and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt.
  • the kit comprises a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt, c - a composition comprising at least one base.
  • a second identical or different base base of the composition c can be added to the other compositions.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt calcium, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt and at least one base.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one osteogenic protein, b - a composition comprising at least one anionic polysaccharide and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt calcium, c - a composition comprising at least one soluble calcium salt.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt and at least one base, c - a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium.
  • a second identical or different base base of the composition b can be added to the other compositions.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt, c - a composition comprising at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt, c - a composition comprising at least one soluble salt an anion capable of forming an insoluble salt of calcium and at least one base.
  • a second identical or different base base of the composition c can be added to the other compositions.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt. In one embodiment, the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt and at least one base.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble calcium salt and at least one base, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt.
  • the kit comprises: a - a composition comprising at least one anionic polysaccharide osteogenic protein complex and at least one soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt of calcium and at least one base, b - a composition comprising at least one soluble calcium salt and at least one base.
  • the composition comprising at least one osteogenic protein further comprises at least one growth factor having a chemo-attractant and angiogenic power
  • the kit further comprises at least one organic matrix or a mineral matrix or a mixed matrix.
  • the compositions constituting the kit are aqueous solutions.
  • the compositions constituting the kit are lyophilizates.
  • compositions constituting the kit are lyophilizates.
  • the lyophilizates are rehydrated before reaction, with water or one of the other compositions in solution.
  • composition comprising the osteogenic protein in the form of a lyophilizate can be rehydrated with the solution comprising an anionic polysaccharide, or with the solution comprising an anionic polysaccharide and a soluble salt of an anion capable of forming an insoluble salt. of calcium and / or a base.
  • the formulations, medical devices and pharmaceuticals comprising said precipitate are aqueous suspensions.
  • the formulations and pharmaceuticals comprising said precipitate are lyophilizates.
  • the lyophilizates are rehydrated before use, by means of saline or blood.
  • Osteogenic protein is understood to mean an osteogenic growth factor or BMP alone or in combination with a BMP chosen from the group of therapeutically active BMPs (Bone Morphogenetic Proteins).
  • the osteogenic proteins are chosen from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5 alone. or in combination.
  • BMPs used are human recombinant BMPs, obtained according to the techniques known to those skilled in the art or purchased from suppliers such as the company Research Diagnostic Inc. (USA).
  • growth factor having a chemo-attractant and angiogenic power is meant proteins such as PDGFs, in particular PDGF-BB, VEGFs or FGFs, in particular FGF-2.
  • the osteogenic protein is selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and BMP-14.
  • GDF-5 alone or in combination and at Less growth factor with chemoattractant and angiogenic potency is PDGF.
  • the composition comprises at least one of the
  • composition comprises at least one of the
  • the composition comprises at least one
  • GDF-5 and PDGF-BB are GDF-5 and PDGF-BB.
  • the osteogenic protein is selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the osteogenic protein is selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7
  • the soluble calcium salt is a calcium salt whose anion is selected from the group consisting of chloride, D-gluconate, formate,
  • D-saccharate acetate, L-lactate, glutamate or aspartate.
  • the soluble calcium salt is calcium chloride.
  • soluble salt of an anion capable of forming a precipitate with the calcium ion a soluble salt whose anion is selected from the group consisting of phosphate anions comprising the phosphate ion PO 4 3 " the ion hydrogenphosphate HPO 4 2 " and dihydrogen phosphate ion H 2 PO 4" .
  • a second anion selected from the group consisting of oxalate anions, ascorbate, carbonate or sulfate is further added to the composition comprising a phosphate anion.
  • the soluble salts of an anion capable of forming a precipitate with the calcium ion are chosen from the group consisting of sodium phosphates, sodium oxalate, sodium ascorbate, sodium carbonate, sodium sulphate and sodium hydrogencarbonate.
  • anionic polysaccharide is meant a polysaccharide selected from the group of polysaccharides functionalized with hydrophobic derivatives.
  • the polysaccharides are chosen from the group of polysaccharide derivatives, predominantly having linkages glycosidic agents of (1,4) and / or (1,3) and / or (1,2) type, functionalized with at least one tryptophan derivative as described in application FR08 / 55567.
  • These polysaccharides consist mainly of glycoside bonds of (1,4) and / or (1,3) and / or (1,2) type. They can be neutral, that is to say they can not carry acidic or anionic functions and carry acid functions.
  • Trp tryptophan derivative
  • said tryptophan derivative being grafted or bound to the polysaccharides by coupling with an acid function, said acid function possibly being an acid function of an anionic polysaccharide and / or an acid function carried by a linker R bonded to the polysaccharide by a function F, said function F resulting from the coupling between the linker R and a function -OH of the neutral or anionic polysaccharide, - F being either an ester function, thioester amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine,
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N and / or S, and having at least one acid function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L or D, produces a coupling between the tryptophan amine and the at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the anionic polysaccharide.
  • the polysaccharide predominantly comprising glycoside bonds of (1,4), (1,3) and / or (1,2) type, functionalized by at least one derivative of tryptophan may correspond to the formula following general I:
  • Formula I the polysaccharide predominantly consisting of glycoside bonds of (1,4) and / or (1,3) and / or (1,2) type, F resulting from the coupling between the linker R and an OH function of the neutral or anionic polysaccharide, being either an ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine function,
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acidic function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L or D, produces coupling between the amine of the tryptophan derivative and the at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the anionic polysaccharide.
  • n represents the molar fraction of the Rs substituted by Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • i represents the mole fraction of acid functions carried by the group R per saccharide unit and is between 0 and 2
  • j represents the mole fraction of acid functional groups carried by the anionic polysaccharide per saccharide unit and is between 0 and
  • 1, - (i + j) represents the mole fraction of acid functions per saccharide unit and is between 0.1 and 2, when R is not substituted by Trp, then the acid or acids of the R group are carboxylates of cation, alkali preferably as Na or K.
  • the polysaccharide is an anionic polysaccharide, when one or more acid functions of the polysaccharide are not substituted by Trp, then they are salified by a cation, alkali preferably as Na + or K + , said polysaccharides being amphiphilic at neutral pH.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) type is selected from the group consisting of pullulan, alginate, hyaluronan, xylan, galacturonan or a soluble cellulose. in water. In one embodiment, the polysaccharide is a pullulan.
  • the polysaccharide is an alginate.
  • the polysaccharide is a hyaluronan.
  • the polysaccharide is a xylan. [000141] In one embodiment, the polysaccharide is a galacturonan.
  • the polysaccharide is a water-soluble cellulose.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,3) type. In one embodiment, the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,3) type is a curdlane.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,2) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,2) type is an inulin.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type is a glucan. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4), and (1,3) and (1,2) type.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) type, and (1,3) and (1,2) is mannan.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their cation salts. alkaline.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the tryptophan esters of formula II.
  • the polysaccharide may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • the polysaccharides are chosen from the group of dextrans functionalized with hydrophobic amino acids such as tryptophan and tryptophan derivatives as described in application FR 07/02316.
  • the functionalized dextran can satisfy the following general formula III:
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • R.sub.t group represents the mole fraction of FR- [AA] n substituent by glycoside unit and is between 0.1 and 2
  • p represents the mole fraction of the R substituted by AA and is between 0.05 and 1
  • the acid or acids of R group are cation carboxylates, alkali preferably as Na +, K +, said dextran being amphiphilic at neutral pH.
  • the alkaline cation is Na +.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the polysaccharide according to the invention is a carboxymethyl dextran of formula IV.
  • the polysaccharide according to the invention is a dextran monosuccinic ester of formula V:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the dextran according to the invention is characterized in that the hydrophobic amino acid is chosen from the derivatives of tryptophan, such as tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts.
  • the dextran according to the invention is characterized in that the tryptophan derivatives are chosen from the tryptophan esters of formula II as defined above. In one embodiment, the dextran according to the invention is a ca:
  • the dextran according to the invention is a tryptophan-modified dextran monosuccinic ester of formula VII:
  • the dextran according to the invention is characterized in that the hydrophobic amino acid is chosen from phenylalanine, leucine, isoleucine and valine and their alcohol, amide or decarboxylated derivatives. In one embodiment, the dextran according to the invention is characterized in that the derivatives of phenylalanine, leucine, isoleucine and valine are chosen from the esters of these amino acids of formula VIII .
  • the dextran according to the invention is characterized in that the hydrophobic amino acid is phenylalanine, and its alcohol, amide or decarboxylated derivatives.
  • the dextran may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • the polysaccharides are chosen from the group of polysaccharides comprising carboxyl functional groups such as those described. in the application FR 08/05506 at least one of which is substituted by a hydrophobic alcohol derivative, denoted Ah: said hydrophobic alcohol (Ah) being grafted or bonded to the anionic polysaccharide by a coupling arm R, said coupling arm being bonded to the anionic polysaccharide by a function F 'said function F' resulting from the coupling between the amine function of the linker R and a carboxyl function of the anionic polysaccharide, and said coupling arm being linked to the hydrophobic alcohol by a function G resulting from the coupling between a carboxyl, isocyanate, thioacid or alcohol function of the coupling arm and a function of the hydrophobic alcohol, the carboxyl functions of the anionic polys
  • F ' being an amide function
  • G being either an ester, thioester, carbonate or carbamate function
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated, optionally comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function,
  • Ah being a residue of a hydrophobic alcohol, produces coupling between the hydroxyl function of the hydrophobic alcohol and at least one electrophilic function carried by the R group, said polysaccharide comprising carboxyl functional groups being amphiphilic at neutral pH.
  • the polysaccharide comprising carboxyl functional groups partially substituted by hydrophobic alcohols is chosen from polysaccharides comprising carboxyl functional groups of general formula IX:
  • q represents the mole fraction of the carboxyl functions of the polysaccharide substituted with F-R-G-Ah and is between 0.01 and 0.7
  • the carboxyl functional group (s) of the polysaccharide are carboxylates of cation, alkali preferably as Na + or K + .
  • the polysaccharides comprising carboxyl functional groups are polysaccharides naturally carrying carboxyl functional groups and are chosen from the group consisting of alginate, hyaluronan and galacturonan.
  • the polysaccharides comprising carboxyl functional groups are synthetic polysaccharides obtained from polysaccharides naturally comprising carboxyl functional groups or from neutral polysaccharides on which at least 15 carboxyl functional groups per 100 saccharide units have been used. have been grafted with the general formula X.
  • the natural polysaccharides being chosen from the group of polysaccharides consisting mainly of glycoside bonds of (1,6) and / or (1,4) and / or (1,3) and / or (1,2) type, L being a bond resulting from the coupling between the linker Q and an OH function of the polysaccharide and being either an ester, thioester, carbonate, carbamate or ether function,
  • r represents the mole fraction of the L-Q substitutions per saccharide unit of the polysaccharide
  • the polysaccharide being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N and / or S, and comprising at least one carboxyl functional group, - CO 2 H [000179]
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,6) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,6) type is dextran.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) type is selected from the group consisting of pullulan, alginate, hyaluronan, xylan, galacturonan or a soluble cellulose. in water. [000183] In one embodiment, the polysaccharide is a pullulan.
  • the polysaccharide is an alginate.
  • the polysaccharide is a hyaluronan.
  • the polysaccharide is a xylan.
  • the polysaccharide is a galacturonan. [000188] In one embodiment, the polysaccharide is a water-soluble cellulose.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,3) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,3) type is a curdlane.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,2) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,2) type is an inulin. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type is a glucan. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) and (1,2) type. In one embodiment, the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) and (1,2) type is mannan. [000197] In one embodiment, the polysaccharide according to the invention is characterized in ts:
  • r is between 0.1 and 2.
  • r is between 0.2 and 1.5.
  • the group R according to the invention is characterized in that it is chosen from amino acids.
  • the amino acids are selected from alpha amino acids.
  • the alpha amino acids are chosen from alpha natural amino acids.
  • the natural alpha amino acids are chosen from leucine, alanine, iso-leucine, glycine, phenylalanine, thryptophan and valine.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from fatty alcohols.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from alcohols consisting of an unsaturated or saturated alkyl chain comprising from 4 to 18 carbons.
  • the fatty alcohol is selected from meristyl, cetyl, stearyl, cetearyl, butyl, oleyl and lanolin.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from cholesterol derivatives.
  • the cholesterol derivative is cholesterol
  • the hydrophobic alcohol Ah is chosen from tocopherols.
  • the tocopherol is alpha tocopherol.
  • alpha tocopherol is the racemic alpha tocopherol.
  • the hydrophobic alcohol is chosen from alcohols bearing an aryl group.
  • the aryl group-bearing alcohol is chosen from benzyl alcohol and phenethyl alcohol.
  • the polysaccharide may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • the polysaccharide is selected from the group consisting of dextran functionalized with tryptophan, dextran functionalized with octanol phenylalaninate, dextran functionalized with octanol glycinate, dextran functionalized with glycinate. of dodecanol or dextran functionalized with the ethyl ester of tryptophan.
  • the bases are chosen from inorganic or organic bases.
  • mineral bases mention may be made of sodium hydroxide, sodium hydrogencarbonate or sodium carbonate.
  • imidazole and its derivatives include histidine, proline, ethanolamine or serine.
  • an organic matrix may be used to promote repair, it is chosen from matrices based on purified natural collagen, sterilized and crosslinked.
  • Natural polymers such as collagen are components of the extracellular matrix that promote attachment, migration and cell differentiation. They have the advantage of being extremely biocompatible and are degraded by enzymatic digestion mechanisms.
  • Collagen-based matrices are obtained from fibrillar type I or IV collagen extracted from tendon or beef or pork bone. These collagens are first purified before being crosslinked and then sterilized. They can also be obtained by acid resorption of autologous bone, leading to the loss of the majority of the mineralized components but the preservation of collagen or non-collagenic proteins, including growth factors. These demineralized matrices can also be prepared in inactive form after extraction with chaotropic agents. These matrices are essentially composed of insoluble and crosslinked Type I collagen.
  • Mixed materials may also be used, for example a matrix that combines collagen and inorganic particles.
  • These materials can be in the form of a composite material with enhanced mechanical properties or in the form of a "putty" or collagen plays a role of binder.
  • the inorganic materials that can be used essentially comprise calcium phosphate-based ceramics such as hydroxyapatite (HA), tricalcium calcium phosphate (TCP), biphasic calcium phosphate (BCP) or amorphous calcium phosphate ( ACP) which have as their main interest a chemical composition very close to that of bone. These materials have good mechanical properties and are immunologically inert. These materials can be in various forms such as powders, aggregates or blocks. These materials have very different degradation rates depending on their compositions.
  • hydroxyapatite degrades very slowly (several months) while the tricalcium calcium phosphate degrades more quickly (several weeks). It is for this purpose that biphasic calcium phosphates have been developed because they have intermediate resorption rates. These inorganic materials are known to be primarily osteoconductive.
  • the organic matrix is a crosslinked hydrogel.
  • a crosslinked hydrogel is obtained by crosslinking polymer chains. Interchain covalent bonds defining an organic matrix. Polymers which can be used for the constitution of an organic matrix are described in Hoffman's review Hydrogels for Biomedical Applications (Adv Drug Deliv Rev, 2002, 43, 3-12).
  • the implant may comprise an uncrosslinked hydrogel.
  • uncrosslinked hydrogel a three-dimensional hydrophilic polymer network capable of adsorbing a large quantity of water or biological fluids (Peppas et al., Eur J Pharm Biopharm 2000, 50, 27 -46). This hydrogel consists of physical interactions and is therefore not obtained by chemical crosslinking of the polymer chains.
  • hydrogels The list of polymers forming hydrogels is very broad and an important but not exhaustive list is given in Hoffman's review titled Hydrogels for Biomedical Applications (Adv Drug Deliv Rev., 2002, 43, 3-12). Among these polymers, synthetic polymers can be found as well as natural polymers. Another review covering hydrogel-forming polysaccharides allows selection of a polymer useful for the invention (Alhaic et al J. Control Release, 2007, 119, 5-24).
  • the hydrogel-forming polymer is chosen from the group of synthetic polymers, among which the copolymers of ethylene glycol and lactic acid, the copolymers of ethylene glycol and of the acid.
  • glycolic poly (N-vinyl pyrrolidone), polyvinyl acids, polyacrylamides, polyacrylic acids.
  • the hydrogel-forming polymer is chosen from the group of natural polymers, among which hyaluronic acid, keratane, pullulan, pectin, dextran, cellulose and cellulose derivatives. alginic acid, xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin, collagen, gelatin, polylysine, fibrin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of polysaccharides forming hydrogels, among which hyaluronic acid, alginic acid, dextran, pectin, cellulose and its derivatives, pullulan, xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of polysaccharides forming hydrogels, among which hyaluronic acid, alginic acid and their biologically acceptable salts.
  • the hydrogel can be prepared just before implantation or injection.
  • the hydrogel can be prepared and stored in a pre-filled syringe in order to then be implanted or injected.
  • the hydrogel may be prepared by rehydrating a lyophilisate just prior to implantation or injection, or implanted in dehydrated form.
  • collagen sponges As Helistat ® (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey), the DBM (Demineralized Bone Matrix) alone or mixed with other organic materials such as polysaccharides, glycerol or gelatins such as Osteofil ® (Medtronic), Allomatrix ® (WRIGHT), Grafton ® (Osteotech), DBX ® (MTF / Synthes), Bioset ® (Regeneration Technologies), matrices made up of mineral phases like Vitoss ® (Orthivista), Osteoset ® (Wright) or the matrices like MasterGraft ® (Medtronic), Healos ® (Depuy Spine) CopiOs ®
  • the system after formation of the coprecipitate consists of two phases, a liquid phase and a solid phase. [000241] In the following description when the concept of volume is used, it is the total volume comprising the two phases.
  • the total amounts of the various proteins per unit volume are between 0.01 mg and 2 mg, preferably between 0.05 mg and 1.5 mg, and more preferably between 0, 1 mg and 1.5 mg per ml of suspension obtained.
  • the total amounts of phosphates per unit volume are between 0.02 mmol and 0.5 mmol, preferably between 0.05 and 0.25 mmol per ml of suspension obtained.
  • the total amounts of calcium per unit volume are between 0.01 mmol and 1 mmol, preferably between 0.05 and 1 mmol and more preferably between 0.1 mmol and 0.5 mmol, per unit of volume.
  • the percentage of calcium ions in the solid phase is between
  • the total amounts of polysaccharides per unit volume are between 1 and 100 mg, preferably between 2 and 40 mg per ml of suspension obtained.
  • the percentage of polysaccharides in the solid phase is greater than 80% of the introduced polysaccharide.
  • the basic amounts used correspond to about 0.1 to 2 equivalents relative to the protons provided by the phosphate ions.
  • the quantities used in the starting compositions can be determined by calculation. This can be done for the various embodiments of the kits.
  • the osteogenic growth factor doses will be between 0.01 mg and 20 mg, preferably between 0.05 mg and 8 mg, preferably between 0.1 mg and 4 mg, more preferably between 0.1 mg and 2 mg, while the commonly accepted doses in the literature are between 8 and 12 mg.
  • the doses of angiogenic growth factor will be between 0.05 mg and 8 mg, preferably between 0.1 mg and 4 mg, more preferably between 0.1. mg and 2 mg.
  • a kit comprising three flasks is produced, said flasks containing:
  • the second bottle further contains a solution of sodium bicarbonate at a concentration between 0.05 and 0.8 M.
  • the second and third vials additionally contain a solution of histidine at a concentration between 0.02 and 0.2 M.
  • the third bottle further contains a proline solution at a concentration of between 0.05 and 0.3M.
  • the solutions are added simultaneously or successively before implantation on a collagen sponge with a volume of between 15 and 30 ml.
  • a solution of sodium bicarbonate at a concentration between 0.20 and 0.4 M is added to the mixture obtained.
  • a histidine solution at a concentration of between 0.02 and 0.15 M is added to the mixture obtained.
  • a solution of proline at a concentration of between 0.05 and 0.3M is added to the mixture obtained.
  • the mixture comprising the coprecipitate according to the invention is then freeze-dried. At the time of implementation, it is rehydrated with injectable water and / or blood at about 35% of the initial volume.
  • the invention also relates to the use of the compositions of the invention by implantation, for example, to fill bone defects, to perform vertebral fusions or maxillofacial repairs or for the treatment of bone fractures, in particular non-union type.
  • the invention also relates to the use of the compositions of the invention by injection for the treatment of bone defects, in particular those caused by osteoporosis and for any other pathology that can be treated percutaneously.
  • the invention also relates to the use of the compositions according to the invention as bone implants.
  • the compositions may be used in combination with a prosthetic device of the type of vertebral prosthesis or vertebral fusion cage.
  • the invention also relates to therapeutic and surgical methods using the compositions in bone reconstruction.
  • the size of the matrix and the amount of osteogenic growth factor are a function of the volume of the site to be treated. [000275] Examples of the various embodiments of the invention are given below.
  • kits are given for information only and are not limiting.
  • Kit 1 A kit of 5 vials comprises a vial containing the lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a freeze-dried polymer or in solution, a vial containing a sodium salt, freeze-dried soluble calcium or in solution, a vial containing a soluble phosphate salt freeze-dried or in solution and a vial containing a freeze-dried or dissolved base.
  • Kit 2 A kit of 4 vials comprises a vial containing the freeze-dried or solution-containing osteogenic protein, a vial containing a freeze-dried or dissolved polymer, a vial containing a freeze-dried soluble calcium salt or in solution and a vial containing a soluble phosphate salt freeze-dried or in solution.
  • Kit 3 A kit of 4 vials comprises a vial containing the lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a polymer, a soluble phosphate salt which is freeze-dried or in solution, a vial containing a lyophilized or dissolved soluble calcium salt and a vial containing a lyophilized or solution base.
  • a kit of 4 vials comprises a vial containing the lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a polymer, a soluble phosphate salt which is freeze-dried or in solution, a vial containing a lyophilized or dissolved soluble calcium salt and a vial containing a lyophilized or solution base.
  • Kit 4 A kit of 4 vials comprises a vial containing lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a freeze-dried or dissolved polymer, a vial containing a soluble calcium salt and a lyophilized or in solution base and a vial containing a soluble phosphate salt freeze-dried or in solution.
  • Kit 5 A kit of 4 vials comprises a vial containing the complex between the osteogenic protein and a lyophilized polymer or in solution, a vial containing a freeze-dried soluble calcium salt or in solution, a vial containing a soluble phosphate salt lyophilized or in solution and a vial containing a freeze-dried or dissolved base.
  • Kit 6 A kit of 3 vials comprises a vial containing the lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a polymer and a soluble phosphate salt lyophilized or in solution, a vial containing a soluble calcium salt and a base freeze-dried or in solution.
  • Kit 7 A kit of 3 vials comprises a vial containing the lyophilized or in solution osteogenic protein, a vial containing a polymer and a soluble phosphate salt lyophilized or in solution, a vial containing a freeze-dried soluble calcium salt or in solution.
  • Example 8 Preparation of a kit containing 3 flasks
  • Kit 8 A kit of 3 vials comprises a vial containing the complex between the osteogenic protein and a freeze-dried polymer or in solution, a vial containing a soluble phosphate salt lyophilized or in solution, a vial containing a soluble calcium salt and a lyophilized or in solution base.
  • Kit 9 A kit of 3 vials comprises a vial containing the complex between the osteogenic protein and a freeze-dried polymer or in solution, a vial containing a soluble phosphate salt freeze-dried or in solution, a vial containing a soluble calcium salt freeze-dried or in solution.
  • Kit 10 A kit of 2 vials comprises a vial containing the complex between the osteogenic protein and a freeze-dried polymer and a soluble phosphate salt which is lyophilized or in solution, a vial containing a freeze-dried soluble calcium salt or solution.
  • Kit 11 A kit of 2 vials comprises a vial containing the complex between the osteogenic protein and a freeze-dried polymer and a soluble phosphate salt which is lyophilized or in solution, a vial containing a soluble calcium salt and a lyophilized or in solution base.
  • the polymer 1 is a sodium dextranmethylcarboxylate modified with the sodium salt of L-tryptophan obtained from a dextran of average molar mass by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the application for FR07.02316 patent.
  • the mole fraction of sodium methylcarboxylate, whether or not modified with tryptophan, is in formula III of the present application is 1.03.
  • the molar fraction of tryptophan-modified sodium methylcarboxylates, p in formula III of the present application, is 0.36.
  • the polymer 2 is a sodium dextranemethylcarboxylate modified with the octanoic ester of L-phenylalanine obtained from a dextran of average molar mass by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process. described in patent application PCT / IB2009007054.
  • the mole fraction of sodium methylcarboxylate, modified or not with the octanoic ester of L-phenylalanine, in the formula X of the present application is 1.11.
  • the molar fraction of octanoic ester-modified sodium methylcarboxylates of L-phenylalanine, q in formula IX of the present application is 0.09.
  • the polymer solution 2 at the end of production is 30.45 mg / ml.
  • EXAMPLE 14 Preparation of an Octanol Glycinate Functionalized Dextran Polymer 3 is a L-glycine octanoic ester modified sodium dextranemethylcarboxylate obtained from a dextran of average molar mass by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the patent application FR08.05506.
  • the mole fraction of sodium methylcarboxylate, whether or not modified by the octanoic ester of L-glycine, is in formula X of the present application is 1.09.
  • the molar fraction of octanoic ester-modified sodium methylcarboxylates of L-glycine, q in formula IX of the present application is 0.22.
  • Example IS Preparation of a Tryptophan Functional Dextran
  • Polymer 4 is sodium dextranmethylcarboxylate modified with the sodium salt of L-tryptophan obtained from a weight average molar mass dextran of 70 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the patent application FR07.02316.
  • the mole fraction of sodium methylcarboxylate, whether or not modified with tryptophan, is in formula III of the present application is 1.14.
  • the mole fraction of tryptophan-modified sodium methylcarboxylates p in Formula III of the present application is 0.41.
  • Example 16 Preparation of a Dextran Functionalized with Octanol Phenylalaninate
  • Polymer 5 is an octanoic ester modified sodium dextranemethylcarboxylate of L-phenylalanine obtained from a dextran of average molar mass by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the patent application FR08.05506.
  • the polymer 6 is a sodium dextranemethylcarboxylate modified with the dodecanoic ester of L-glycine obtained from a dextran of average molar mass by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the application FR08.05506.
  • the molar fraction of sodium methylcarboxylate, whether or not modified with the L-glycine dodecanoic ester, in the formula X of the present application is 1.04.
  • the molar fraction of sodium methylcarboxylate modified with the L-glycine dodecanoic ester in formula IX of the present application is 0.13.
  • Example 18 Preparation of a Dextran Functionalized by the Tryptophan Ethyl Ester
  • the polymer 7 is a sodium dextranemethylcarboxylate modified with the ethyl ester of L-tryptophan obtained from a dextran of average molar mass by weight 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the patent application FR07.02316.
  • the mole fraction of sodium methylcarboxylate, whether or not modified with the ethyl ester of tryptophan, is in formula III of the present application is 1.09.
  • the molar fraction of sodium methylcarboxylate modified with tryptophan ethyl ester, p in formula III of the present application is 0.47.
  • Example 19 Preparation of a solution of a dextran functionalized with tryptophan [000297]
  • a concentrated solution of polymer 1 is prepared by solubilizing 9.13 g of lyophilizate of polymer 1 (water content of about 25%) in 35.24 g of water. The solution is stirred for 30 minutes. The concentration of polymer 1 is 162.9 mg / g determined by dry extract. The density is 1.08. The concentration of polymer 1 is therefore 175.9 mg / ml.
  • a solution of polymer 2 at 40 mg / g is prepared by solubilizing 3.12 g of polymer lyophilizate 2 (water content of 14%) in 64 g of water.
  • Example 22 rhBMP-2 solution in 1 mM HCI buffer
  • 1L of InFUSE buffer is prepared by solubilizing in a 1L volumetric flask filled with 800 ml of water 5 g of sucrose, 25 g of glycine, 3.72 g of glutamic acid, 0.11 g of sodium chloride and 0.11 g of polysorbate 80. The pH of this solution is then adjusted to 4.5 by adding 16.8 ml of 1N sodium hydroxide. The volumetric flask is finally filled to the line to obtain the InFUSE buffer. 1 ml of a solution of rhBMP-2 at 1.5 mg / ml in InFUSE buffer is prepared by adding 1 ml of 1.5 mg lyophilized rhBMP-2 buffer. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m. [000303] This solution can also be freeze-dried.
  • Example 24 rhBMP-7 solution in 10 mM HCI buffer
  • a solution of rhBMP-7 at 3.8 mg / ml is prepared by adding 1 ml of a 1 mM HCl solution to 3.8 mg lyophilized rhBMP-7. The pH of this solution is 2.2. This solution is incubated for 15 minutes at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 25 RhBMP-7 solution in 5% lactose buffer pH 3.5
  • a solution of rhBMP-7 at 3.8 mg / ml is prepared by adding 7.8 ml of a 5% lactose solution whose pH has been fixed at 3.5 by addition of HCl 1. M at 30.3 mg lyophilized rhBMP-7. The pH of this solution is 3.5. This solution is incubated for 15 minutes at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 26 rhGDF-5 solution in 10 mM HCl buffer
  • 1 ml of a solution of rhGDF-5 at 1.5 mg / ml is prepared by adding 1 ml of a 10 mM HCl solution to 1.5 mg lyophilized rhGDF-5. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Examples of the preparation of soluble phosphate salt solutions are given for information only and are not limiting.
  • a 1M sodium phosphate solution is prepared in a volumetric flask from an equimolar mixture of anhydrous sodium hydrogenphosphate and sodium dihydrogenphosphate (Sigma). This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m. More dilute solutions of sodium phosphate are prepared from the stock solution described above.
  • Solution 1 A 2M solution of calcium chloride is prepared in a volumetric flask from anhydrous calcium chloride or dihydrate (Sigma). This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 29 0.75M Calcium Chloride Solution
  • Solution 2 A solution of 0.75M calcium chloride is prepared by dilution from the 2M calcium chloride solution described in the example previous. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Solution 3 A solution of 0.75 M calcium acetate is prepared in a volumetric flask from calcium acetate (Sigma). This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 31 0.75M Calcium Gluconate Solution
  • Solution 4 A solution of calcium gluconate 0.75 M is prepared in a volumetric flask from calcium gluconate (Sigma). This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 32 Histidine solution at 1M [000316]
  • Solution 5 A solution of histidine at 1M is prepared in a 1L volumetric flask by solubilizing 155.2 g of L-histidine (Sigma) in the volume of deionized water needed to reach the mark. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 33 2 M Proline Solution [000317]
  • Solution 6 A 2 M solution of proline is prepared in a 1 L volumetric flask by adding 230.2 g of L-proline (Sigma), 200 ml of 10 N sodium hydroxide. and the volume of deionized water required to reach the mark. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 34 2 M serine solution
  • Solution 7 A 2 M serine solution is prepared in a 1 L volumetric flask by adding 210.2 g of L-serine (Sigma), 200 ml of 10 N sodium hydroxide and the volume of deionized water required for to reach the mark of gauge. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through
  • Solution 8 A 2 M glycine solution is prepared in a 1 L volumetric flask by adding 150.1 g of L-glycine (Sigma), 200 ml of 10 N sodium hydroxide and the volume of deionized water required for to reach the mark of gauge. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through
  • Solution 9 A solution of alanine at 2M is prepared in a 1L volumetric flask by adding 178.2 g of L-alanine (Sigma), 200 mL of 10N sodium hydroxide and the volume of deionized water required for to reach the mark of gauge. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through
  • Example 37 2M Lysine Solution [000321]
  • Solution 10 A solution of 2M lysine is prepared in a 1L volumetric flask by adding 292.4 g of L-lysine (Sigma), 200 mL of 10N sodium hydroxide. and the volume of deionized water required to reach the mark. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through
  • Example 38 Sodium hydrogen carbonate solution
  • a solution of 1.2 M sodium hydrogen carbonate is prepared in a volumetric flask from anhydrous sodium hydrogen carbonate (Sigma). This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • a solution of 0.5 M tris (hydroxymethyl) aminomethane is prepared in a volumetric flask from ultrapure tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • Example 40 Solution Comprising Polymer 1 and Sodium Phosphate at pH 6.5
  • Solution 11 A solution comprising polymer 1 at 40 mg / mL and 0.45 M phosphate is prepared by mixing 8.6 mL of the polymer solution 1 at 175.9 mg / mL described in FIG. Example 15, 17 mL of the solution
  • Example 27 1 M sodium phosphate described in Example 27 and 11.9 mL water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 41 Solution Comprising Polymer 1 and Sodium Phosphate
  • Solution 12 A solution comprising polymer 1 at 40 mg / mL and 0.23M sodium phosphate is prepared by mixing 5.5 mL of polymer solution 1 at 175.9 mg / g described. in Example 15, 5.5 mL of the 1M sodium phosphate solution described in Example 27 and 13.0 mL of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 42 Solution Comprising Polymer 2 and Sodium Phosphate at pH 6.5
  • Solution 13 A solution comprising Polymer 2 at 20 mg / mL and 0.45M phosphate is prepared by mixing 10 mL of the Polymer solution 2 at 40 mg / g described in Example 20, 9 ml of the 1 M sodium phosphate solution described in Example 27 and 1 ml of water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 43 Solution comprising polymer 1, sodium phosphate and hydrogen carbonate
  • Solution 14 A solution comprising polymer 1 at 40 mg / mL, 0.23M sodium phosphate and 0.31M sodium hydrogen carbonate is prepared by mixing 5.5 mL of the polymer solution 1 to 175.9 mg / g described in Example 15, 5.5 mL of the 1 M sodium phosphate solution described in Example 27, 12.4 mL of a solution of 0.6 M sodium hydrogen carbonate obtained by diluting the stock solution described in Example 38 and 0.6 ml of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 44 Solution Comprising Polymer 1, Sodium Phosphate and Histidine Solution 15: A solution comprising Polymer 1 at 40 mg / ml, 0.23 M sodium phosphate and histidine to 0.09 M is prepared by mixing 5.5 ml of the 175.9 mg / g polymer solution 1 described in Example 15 with 5.5 ml of the 1 M sodium phosphate solution described in Example 27, 10.8 mL of a 0.2 M histidine solution obtained by diluting the stock solution described in Example 32 and 2.2 mL of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 45 Solution Comprising Polymer 2, Sodium Phosphate and Hydrogen Carbonate Solution 16: A solution comprising Polymer 2 at 10 mg / ml, 0.23 M sodium phosphate and hydrogencarbonate 0.31 M sodium is prepared by mixing 3.45 mL of the 30.45 mg / mL polymer solution 2 described in Example 13 with 2.0 mL of the 1.2 M phosphate solution. sodium salt obtained according to Example 27, 2.7 ml of a 1.2 M sodium hydrogen carbonate solution described in Example 38 and 2.4 ml of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 46 Solution Comprising Polymer S, Sodium Phosphate and Bicarbonate
  • Solution 17 A solution comprising Polymer 5 at 20 mg / mL, 0.23M sodium phosphate and hydrogencarbonate 0.31 M sodium is prepared by mixing 1.3 mL of the 36.87 mg / mL polymer solution described in Example 16 with 0.45 mL of the 1.2 M phosphate solution. of sodium obtained according to Example 27 and 0.6 ml of a solution of 1.2 M sodium hydrogen carbonate described in Example 38. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered on 0.22 ⁇ m.
  • Example 47 Solution Comprising Polymer 6, Sodium Phosphate and Hydrogen Carbonate Solution 18: A solution comprising Polymer 6 at 20 mg / ml, 0.23 M sodium phosphate and hydrogencarbonate 0.31 M sodium is prepared by mixing 1.0 mL of the 46.7 mg / mL polymer solution 6 described in Example 17 with 0.45 mL of the 1.2 M phosphate solution. of sodium obtained according to Example 27, 0.6 ml of a 1.2 M sodium hydrogen carbonate solution described in Example 38 and 0.3 ml of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 48 Solution comprising polymer 7, sodium phosphate and hydrogen carbonate
  • Solution 19 A solution comprising Polymer 7 at 40 mg / ml, 0.23 M sodium phosphate and 0.31 M sodium hydrogen carbonate is prepared by mixing 1.26 ml of the 7 to 75.9 mg / ml polymer solution described in Example 18, 0.45 ml of the 1.2 M sodium phosphate solution obtained according to Example 27, 0.6 ml of a solution 1.2 M sodium hydrogen carbonate described in Example 38 and 0.06 mL of sterile water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Solution 20 22 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 1.46 mg / ml are added to 267 ⁇ l of a solution of polymer 1 at 60.0 mg / ml and at 351 ⁇ l of sterile water .
  • This solution of rhBMP-2 and polymer 1 is at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Solution 21 50 ⁇ l of a solution of rhBMP-7 at 1.5 mg / ml is mixed with 100 ⁇ l of a polymer solution 1 at 60.6 mg / ml. This solution of rhBMP-7 and polymer 1 is at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Solution 22 50 ⁇ l of a rhBMP-7 solution at 0.15 mg / ml is mixed with 100 ⁇ l of a polymer solution 2 at 22.7 mg / ml. This solution of rhBMP-7 and polymer 2 is at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Solution 23 50 ⁇ l of a solution of rhGDF-5 at 1.5 mg / ml is mixed with 100 ⁇ l of a polymer solution 2 at 22.7 mg / ml. This solution of rhGDF-5 and polymer 2 is at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 53 Preparation of a RhBMP-2 / Polymer 1 Complex in the Presence of Sodium Phosphate
  • Solution 24 184.0 mg of freeze-dried rhBMP-2 in InFUSE buffer containing only 7.85 mg of rhBMP-2 are taken up in 19 ml of the solution described in Example 41. The solution is left to incubate two hours at 4 ° C. The solution obtained is clear and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 54 Preparation of rhBMP-2 / Polymer 1 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 25: 165.5 mg of rhBMP-2 lyophilizate in InFUSE buffer containing only 6, 95 mg of rhBMP-2 are taken up in 17.1 ml of the solution described in Example 43. The solution is incubated for two hours at 4 ° C. The solution obtained is clear and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 55 Preparation of a rhBMP-2 / Polymer 1 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Histidine [000343] Solution 26: 165.5 mg of lyophilisate of rhBMP-2 in the Buffer
  • InFUSE containing only 6.95 mg rhBMP-2 are taken up in 17.1 mL of the solution described in Example 44. The solution is incubated for two hours at 4 ° C. The solution obtained is clear and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 56 Preparation of rhBMP-2 / Polymer 1 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 27: 1.98 mL of a solution of rhBMP-2 at 1.55 mg / ml mL in InFuse buffer is added to 3.5 mL of Polymer Solution 1 at 174.7 mg / g. Then, 9.6 mL of a solution containing 0.74 M sodium phosphate and 1.2 M sodium hydrogen carbonate and 0.28 mL of sterile water are also added. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m. The composition of the mixture is 0.2 mg / ml rhBMP-2, 40 mg / ml polymer 1, 0.45 M sodium phosphate and 0.75 M sodium hydrogen carbonate.
  • Example 57 Preparation of rhBMP-7 / Polymer 1 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 28: 1.71 mL of a solution of rhBMP-7 at 3.69 mg / ml mL in 10 mM HCl buffer are added to 3.4 mL of the polymer solution 1 at 175.9 mg / g described in Example 15. Then, 3.3 mL of the 1 M sodium phosphate solution described in Example 27 and 7.5 mL of a 0.6M sodium hydrogen carbonate solution obtained by diluting the stock solution described in Example 38 and 14.1 mL of sterile water are added.
  • composition of the mixture is 0.2 mg / mL in rhBMP-7, 20 mg / mL in polymer 1, 0.11 M sodium phosphate and 0.15 M sodium hydrogen carbonate.
  • Example 58 Preparation of a rhBMP-2 / Polymer 2 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 29: 65.2 mg of a lyophilizate of rhBMP-2 in the InFuse buffer are taken up with 10.5 ml of Solution 16. This solution is incubated for 1 hour at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m. The composition of the mixture is 0.4 mg / ml rhBMP-2, 10 mg / ml polymer 2, 0.23 M sodium phosphate and 0.31 M sodium hydrogen carbonate.
  • Example 59 Preparation of a rhBMP-2 / Polymer 5 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 30: 25.7 mg of a lyophilizate of rhBMP-2 in the InFuse buffer are taken up with 2.4 ml of Solution 17. This solution is incubated for 1 hour at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m. The composition of the mixture is 1.5 mg / ml rhBMP-2, 20 mg / ml polymer 5, 0.23 M sodium phosphate and 0.31 M sodium hydrogen carbonate.
  • Example 60 Preparation of a rhBMP-2 / Polymer 6 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 31: 24.8 mg of a lyophilizate of rhBMP-2 in the InFuse buffer are taken up with 2.4 ml of Solution 18. This solution is incubated for 1 hour at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m. The composition of the mixture is 1.5 mg / ml rhBMP-2, 20 mg / ml polymer 6, 0.23 M sodium phosphate and 0.31 M sodium hydrogen carbonate.
  • Example 61 Preparation of a rhBMP-2 / Polymer 7 Complex in the Presence of Sodium Phosphate and Sodium Bicarbonate Solution 32: 25.6 mg of a lyophilizate of rhBMP-2 in the InFuse buffer are taken up with 2.4 ml of Solution 19. This solution is incubated for 1 hour at room temperature and is sterile filtered through 0.22 ⁇ m. The composition of the mixture is 1.5 mg / ml rhBMP-2, 40 mg / ml polymer 7, 0.23 M sodium phosphate and 0.31 M sodium hydrogen carbonate. [000350] Examples of preparation of solutions comprising a soluble calcium salt and a base are given for information only and not limiting.
  • Example 62 Calcium chloride and histidine solution
  • Solution 33 A solution containing 0.75 M calcium chloride and 0.4 M histidine is prepared by adding 112.5 ml of a 2M solution of calcium chloride, 120 mL of 1M histidine solution and 67.5 mL of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 63 Solution of calcium chloride and proline Solution 34: A solution containing 0.75 M calcium chloride and 0.75 M proline is prepared by adding 112.5 ml of a solution of calcium chloride to 2M, 112.5 mL of a 2M proline solution and 75 mL of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 64 Solution of calcium chloride and glycine
  • Solution 35 A solution containing 0.75M calcium chloride and 0.75M glycine is prepared by adding 112.5 mL of a 2M calcium chloride solution, 112.5 mL of a 2 M glycine solution and 75 ml of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 65 Solution of calcium chloride and alanine Solution 36: A solution containing 0.75 M calcium chloride and 0.75 M alanine is prepared by adding 112.5 ml of a 2M calcium chloride solution, 112.5 mL of a 2M alanine solution and 75 mL of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 66 Solution of Calcium Chloride and Lysine [000355]
  • Solution 37 A solution containing 0.75 M calcium chloride and 0.75 M lysine is prepared by adding 112.5 ml of a solution of 2 M calcium chloride, 112.5 mL of a 2M lysine solution and 75 mL of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m.
  • Example 67 Solution of Calcium Chloride and Serine Solution 38: A solution containing 0.75 M calcium chloride and 0.75 M serine is prepared by adding 112.5 ml of a solution of 2 M calcium chloride, 112.5 mL of a 2M serine solution and 75 mL of deionized water. This solution is incubated for 30 minutes at room temperature and sterile filtered through 0.22 ⁇ m. [000357] Examples of preparation of injectable suspensions comprising a BMP, a polymer, a soluble calcium salt, a soluble phosphate salt and / or a base are given for information and not limitation.
  • Example 68 Preparation of an injectable suspension of a rhBMP-2 / Polymer 2 complex in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • An osteogenic suspension based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 2 complex and calcium phosphate particles was obtained by mixing 400 ⁇ l of Solution 29 containing rhBMP-2 at 0.4 mg / ml. or 160 ⁇ g of rhBMP-2, Polymer 2 at 10 mg / ml, ie 4 mg of polymer 2, sodium phosphate at 0.23 M, ie 92 ⁇ mol, and sodium hydrogencarbonate at 0.31. M, ie 124 .mu.mol, and 400 .mu.l of a solution of calcium chloride at 0.38 M, ie 153 .mu.mol. The suspension obtained is stored for 15 minutes at room temperature before injection. This suspension is injectable with 27-gauge needles.
  • Example 69 Preparation of an injectable suspension of a rhBMP-2 / Polymer 1 complex in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate [000359]
  • An osteogenic suspension based on a coprecipitation of the BMP-2 complex Polymer 1 and calcium phosphate particles were obtained by mixing 1250 ⁇ l of a solution containing BMP-2 at 0.52 mg / ml, ie 650 ⁇ g of BMP-2, and Polymer 1 at 20 mg / ml.
  • Implant 1 40 ⁇ l of Solution 20 are introduced into a sterile 200 mm3 crosslinked collagen sponge. The solution is allowed to incubate for 30 minutes in the collagen sponge before adding 10 .mu.l of a solution of calcium chloride at a concentration of 1.64 M. Finally, 90 .mu.l of a neutralized sodium phosphate solution at a concentration of 0.053 M obtained by mixing 80 .mu.l of sodium phosphate (22.5 mg / ml) and 10 .mu.l of 1N hydrochloric acid are added to the sponge. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of rhBMP-2 in the sponge is 2 ⁇ g.
  • EXAMPLE 71 Preparation of Collagen Sponge Implants / RhBMP-2 Complex / Polymer 1 in the Presence of Lyophilized Calcium Chloride and Sodium Phosphate Implant 2: 40 ⁇ l of Solution 20 are introduced into a cross-linked collagen sponge of 200 mm3 sterile. The solution is incubated for 30 minutes in the collagen sponge before adding 10 ⁇ l of a solution of calcium chloride at a concentration of 6.85 M. Finally, 90 ⁇ l of a neutralized sodium phosphate solution at a concentration of 0.22 M obtained by mixing 80 ⁇ l of sodium phosphate (93.8 mg / ml) and 10 ⁇ l of 1 N hydrochloric acid are added to the sponge. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of rhBMP-2 is 2 ⁇ g.
  • Example 72 Preparation of collagen sponge / BMP-2 complex / Polymer 1 implants in the presence of freeze-dried calcium chloride and sodium ascorbate
  • Implant 3 40 ⁇ l of the Solution 20 are introduced into a crosslinked collagen sponge 200 mm3 sterile. The solution is incubated for 30 minutes in the collagen sponge before adding 10 .mu.l of a solution of calcium chloride at a concentration of 1.64 mg / ml. Finally, 80 ⁇ l of sodium ascorbate solution at a concentration of 0.41 M are added to the sponge. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of rhBMP-2 is 2 ⁇ g.
  • Example 73 Preparation of collagen sponge implants / rhBMP-2 complex / Polymer 1 in the presence of freeze-dried calcium chloride and sodium phosphate
  • Implant 4 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained from a cross-linked collagen sponge of dimensions 5.02 ⁇ 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 ml_.
  • Implant 5 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 mL.
  • Implant 6 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 mL.
  • Implant 7 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 4 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml_. On this sponge are added 2 ml of a 0.040 mg / ml solution of rhBMP-2, ie 80 ⁇ g of rhBMP-2, at 8 mg / ml of Polymer 4, or 16 mg, and at 0.18 M of sodium phosphate at pH 7.4, ie 360 ⁇ mol, then 500 ⁇ L of a solution of calcium chloride at 1.2 M, ie
  • Implant 8 Osteogenic implants based on coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 4 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 mL.
  • Example 78 Preparation of Collagen Sponge Implants / rhBMP-2 Complex / Polymer 4 in the Presence of Calcium Chloride and Sodium Phosphate
  • Implant 9 Osteogenic Implants Based on Coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 4 Complex and Particles Calcium phosphate was obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a volume of sponge of 4.52 ml.
  • Implant 10 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 4 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml_. On this sponge are added 1060 ⁇ l of a 0.311 mg / ml solution of rhBMP-2, ie 330 ⁇ g of rhBMP-2, at 62.3 mg / ml of Polymer 4, ie 66 mg and 0.34 M sodium phosphate pH 7.4 is 360 ⁇ mol, and finally 540 .mu.l of a solution of 1.7 M calcium chloride, or 920 micromol.
  • Example 80 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 complex / Polymer 1 implants in the presence of lyophilized calcium chloride and sodium phosphate
  • Implant 11 An osteogenic implant based on a precipitation of the rhBMP-2 / Polymer complex 1 and calcium phosphate particles was obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml. 1500 ⁇ l of a 0.107 mg / ml solution of rhBMP-2, ie 160 ⁇ g of rhBMP-2, at 21.3 mg / ml of Polymer 1, or 32 mg, are added to this sponge, followed by 500 ⁇ l of a solution.
  • the implant is then frozen at -80 ° C. and freeze-dried.
  • the lyophilized sponge is soaked with 1 ml of autologous blood 30 min before implantation.
  • Example 81 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 complex / Polymer 4 implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and histidine [000373]
  • Implant 12 Osteogenic implants based on coprecipitation of the rhBMP-complex 2 / Polymer 4 and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml.
  • Implant 13 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 4 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 mL.
  • 800 ⁇ l of a 0.413 mg / ml solution of rhBMP-2, ie 330 ⁇ g of rhBMP-2, 20.65 mg / ml of Polymer 4 or 16.5 mg and 0, are added to this sponge; 24 M of sodium phosphate at pH 7.4, ie 192 ⁇ mol, and finally 800 ⁇ l of a 0.4 M solution of calcium chloride, ie 320 ⁇ mol and 0.4 M of histidine or 320 ⁇ mol.
  • Example 83 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 complex / Polymer 1 implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • Implant 14 Osteogenic implants based on coprecipitation of the rhBMP-complex 2 / Polymer 1 and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml. On this sponge are added 800 ⁇ L of a 0.2 mg / mL solution of rhBMP-2, ie 160 ⁇ g of rhBMP-2, at 40 mg / mL of Polymer 1, or 32 mg, at 0.45M.
  • sodium phosphate pH 7.4 is 360 ⁇ mol, and 0.75 M sodium hydrogen carbonate, 600 micromol, and finally 800 .mu.l of a 0.75 M solution of calcium chloride or 600 micromol.
  • Example 84 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 / Polymer 1 complex implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • Implant 15 Osteogenic implants based on a coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, a sponge volume of 4.52 mL. 800 ⁇ L of a solution containing BMP-2 at 0.2 mg / mL, ie 160 ⁇ g of rhBMP-2, Polymer 1 at 8 mg / mL or 6.4 mg, of the sodium phosphate at 0.45 M, ie 360 ⁇ mol, and 0.75 M sodium hydrogen carbonate, ie 600 ⁇ mol, and finally 800 ⁇ L of a solution of calcium chloride at 0.75 M, ie 600 ⁇ mol.
  • Example 85 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 / Polymer 1 complex implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • Implant 16 Osteogenic implants based on coprecipitation of rhBMP-2 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained from a crosslinked collagen sponge of dimensions 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 ml. On this sponge are added 800 ⁇ l of a solution containing BMP-2 at 0.2 mg / ml, ie 160 ⁇ g of rhBMP-2, Polymer 1 at 20.6 mg / ml or 16.5 mg. sodium phosphate at 0.24 M, ie 192 ⁇ mol, and sodium hydrogencarbonate at 0.75 M, ie 600 ⁇ mol, and finally 800 ⁇ l of a 0.4 M calcium chloride solution, that is 320 ⁇ mol.
  • Example 86 Preparation of collagen sponge / rhBMP-7 / Polymer 1 complex implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • Implant 17 Osteogenic implants based on a coprecipitation of the BMP-7 / Polymer 1 complex and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a cylindrical cross-linked type I collagen sponge of 198 ⁇ l per 70 ⁇ l of a 0.071 mg / ml solution of BMP-7, ie 5 ⁇ g of BMP-7, at 31.3 mg / ml of Polymer 1, ie 1.5 mg of Polymer 1,
  • Example 87 Preparation of collagen sponge / rhBMP-2 complex / Polymer 2 implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate Implant 18: Osteogenic implants based on coprecipitation of the rhBMP-complex 2 / Polymer 2 and calcium phosphate particles were obtained from a cross-linked collagen sponge with sponge volume of 2.25 mL.
  • Example 88 Preparation of collagen sponge / rhBMP-7 complex / Polymer 3 implants in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate
  • Implant 19 Osteogenic implants based on coprecipitation of the BMP-7 / Polymer 3 complex and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a cross-linked type-I collagen sponge with a volume of 4520 ⁇ l per 800 ⁇ l of a solution containing BMP-7 at 0.41 mg / ml, ie 330 ⁇ g of BMP-7 Polymer 3 at 17.5 mg / mL, ie 14 mg of Polymer 3, 0.45 M sodium phosphate, ie 360 ⁇ mol, then with 800 ⁇ L of a solution containing 0.4% calcium chloride. M, ie 648 ⁇ mol and proline at 0.61 M, ie 488 ⁇ mol. Each solution is left for 15 minutes in contact with the sponge after addition. After these times of impregnation, the sponge is ready for implantation.
  • Example 89 Preparation of collagen sponge implants / rhGDF-5 complex / Polymer 2 in the presence of freeze-dried calcium chloride, sodium phosphate and histidine
  • Implant 20 Osteogenic implants based on a coprecipitation of the complex GDF-5 / Polymer 2 and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a type-I collagen sponge crosslinked with a volume of 4520 ⁇ L per 1500 ⁇ L of a solution containing GDF-5 at 0.5 mg / mL, ie 750 ⁇ g of GDF-5, Polymer 2 at 20 mg / mL, ie 30 mg of Polymer 2, then 750 ⁇ L of a solution containing calcium chloride at 0.8 M, ie 600 ⁇ mol and histidine at 0.38 M, ie 285 ⁇ mol and finally with a solution containing sodium phosphate at 0.48 M, ie 360 ⁇ mol.
  • CRM Compressive Resistant Matrix
  • This material is a mixed matrix composed of bovine collagen type I and a calcium phosphate mineral phase composed of 15% hydroxyapatite and 85% beta-tricalcium phosphate marketed by Medtronic under the name MasterGraft Matrix.
  • the volume of this matrix varies according to the application, 140 ⁇ L for an ectopic site application in the rat, 5 mL for a spinal fusion application in the rabbit.
  • Example 90 Preparation of collagen sponge implants surrounding a CRM containing rhBMP-2 / Polymer 2 complex in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate Implant 21: Implant 16 is wrapped around a dry CRM volume
  • Example 91 Preparation of CRM implants / rhBMP-2 complex / Polymer 2 in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate Implant 22: Osteogenic implants based on coprecipitation of the BMP-2 complex Polymer 2 and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a CRM of a volume of 140 ⁇ l per 35 ⁇ l of a 0.14 mg / ml solution of BMP-2, ie 5 ⁇ g of BMP-2. 2, at 14 mg / ml of Polymer 2, ie 0.5 mg of Polymer 2, at 0.23 M of sodium phosphate or 8 ⁇ mol, and at 0.31 M of sodium hydrogencarbonate or 11 ⁇ mol for 15 minutes. then with 35 ⁇ l of a 0.38 M solution of calcium chloride, ie 13 ⁇ mol for 15 minutes. CRMs are ready for implementation.
  • Example 92 Preparation of CRM implants / rhG DF-S / Polymer 2 complex in the presence of freeze-dried calcium chloride, sodium phosphate and histidine
  • Implant 23 Osteogenic implants based on a coprecipitation of the complex GDF-5 / Polymer 2 and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a CRM with a volume of 140 ⁇ L per 35 ⁇ L of a solution containing 0.86 mg / ml of GDF-5, ie 30 ⁇ g of GDF-5, at 14 mg / ml of Polymer 2, ie 0.5 mg of Polymer 2, at 0.23 M of sodium phosphate or 8 ⁇ mol for 15 minutes, then with 17.5 ⁇ l of a 0.34 M histidine solution, ie 6 ⁇ mol for 15 minutes and finally with 17.5 ⁇ l of a 0.74 M calcium chloride solution. or 13 ⁇ mol.
  • the CRMs are then frozen at -80 ° C. and lyophilized. Freeze-dried CRMs are soaked with 45 ⁇ L of autologous blood 30 min before implantation.
  • Example 93 Preparation of CRM implants / rhBMP-2 complex / Polymer 1 in the presence of calcium chloride, sodium phosphate and hydrogencarbonate Implant 24: Osteogenic implants based on coprecipitation of the BMP-2 complex Polymer 1 and calcium phosphate particles were obtained after successive impregnations of a CRM with a volume of 5.0 ml per 1250 ⁇ l of a 0.52 mg / ml solution of BMP-2 or 650 ⁇ g of BMP-2.
  • Implant 25 40 .mu.l of a solution of rhBMP-2 at 0.5 mg / ml in a INFUSE-type buffer are sterilized in a sterile cross-linked collagen sponge of 200 mm.sup.3. The solution is left for 30 minutes in the collagen sponge before implantation. [000388] The dose of rhBMP-2 in implant 25 is 20 ⁇ g.
  • Implant 26 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.05 mg / ml in a INFUSE-type buffer are introduced sterile in a Helistat-type, 200 mm3, sterile collagen sponge (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is left for 30 minutes in the collagen sponge before implantation. [000390] The dose of rhBMP-2 in implant 26 is 2 ⁇ g.
  • Implant 27 Freeze-dried osteogenic implants based on BMP-7 were obtained after impregnation of a crosslinked type-I collagen sponge of 198 .mu.l per 140 .mu.l of a 0.036 mg / ml solution of BMP. -7 is 5 ⁇ g. The implants are then frozen at -80 ° C. and lyophilized. The lyophilized sponges are impregnated with 45 ⁇ L of autologous blood 30 min before implantation.
  • Implant 28 Osteogenic implants were obtained by impregnation of a cross-linked type I collagen sponge of dimensions 5.02 ⁇ 2.54 ⁇ 0.35 cm, ie a volume of sponge of 4.52 mL per 1600 ⁇ L of a 1.45 mg / mL solution of rhBMP-2, ie 2.3 mg. The solution is left for 30 minutes in the collagen sponge before implantation.
  • Counterexample S Preparation of collagen sponge implants containing 1.3 mg of rhBMP-2
  • Implant 29 Osteogenic implants were obtained by impregnating a cross-linked type I collagen sponge of dimensions 5.02 ⁇ 2.54 ⁇ 0.35 cm, ie a sponge volume of 4.52 mL per 1600 ⁇ l_ of a solution to
  • the objective of this study is to demonstrate the osteoinductive power of the different formulations in a model of ectopic bone formation in rats.
  • Male rats of 150 to 250 g Male rats of 150 to 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B.P. 109, 69592 ArbresIe) are used for this study.
  • An analgesic treatment (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) is administered before the surgical procedure. Rats are anesthetized by inhalation of a 02 isoflurane (1-4%) mixture. The fur is removed by shaving over a wide dorsal area.
  • the rats are then returned to their respective cages and kept under observation during their recovery. At 21 days, the animals are anesthetized by an injection of tiletamine-zolazepam (ZOLETIL®25-50 mg / kg, IM, VIRBAC, France).
  • each of the explants is removed from its implantation site and macroscopic photographs are taken. The size and weight of the explants are then determined. Each explant is then stored in 10% buffered formalin solution.
  • a dose of 20 ⁇ g of rhBMP-2 in a collagen sponge leads to obtaining ossified explants of 38 mg of average mass after 21 days.
  • the objective of this study is to demonstrate the osteoinductive power of the various formulations in a posterolateral fusion model in rabbits.
  • This study is conducted according to the experimental protocol described in the publication of JP Lawrence (Lawrence, JP et al., Spine 2007, 32 (11), 1206-1213) with the exception of nicotine treatment since the induction of a pseudarthrosis is not desired.
  • Fusion of the vertebrae is evaluated by manual palpation of the explanted vertebral column.
  • the lack of mobility between the vertebrae is synonymous with fusion.
  • the spine is also analyzed by micro-CT at 12 weeks to assess the presence of bones in the vertebrae. The results obtained for the various implants are summarized in the following table.
  • the implants containing the BMP-7 polymer complex co-precipitated with the calcium phosphate salt also lead to the fusion of the vertebrae for low doses of BMP-7, 0.33 mg of BMP-7 per implant.
  • the results of the literature show that a 100% rabbit spinal fusion is not even at a dose of 3.5 mg of BMP-7, a dose much higher than that studied (Yao, G. et al., Spine 2008, 33 (18), 1935-1942).

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Abstract

L'invention concerne des compositions ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide, ledit coprécipitat étant sous forme divisée, elle concerne également les kits permettant la mise en oeuvre de l'invention. Elle concerne également le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée, contenant au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide. L'invention concerne également les formulations, les produits pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat.

Description

Nouvelle forme d'administration de complexes de protéines ostéogéniques
[0001] La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
[0002] Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
[0003] Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un « cystéine knot » (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287: 103.).
[0004] Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israël et al. (Israël DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.
[0005] Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse.
[0006] Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE® aux Etats-Unis et de InductOs® en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE® pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.
[0007] La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-I Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-I Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-I Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.
[0008] , L'administration des protéines ostéogéniques est un problème majeur en raison de leur instabilité et de la nécessité qui apparaît d'obtenir des formulations ostéogéniques contenant une quantité minimale de protéine ostéogénique. Ceci afin d'éviter les effets secondaires générés par des concentrations importantes de ces protéines et également en raison du prix de ces protéines. [0009] De nombreuses formulations ont été et sont développées comme par exemple celles citées dans la revue de Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine 2002, 27 (16 Suppl 1), S16-S23.), dans laquelle l'importance de la nature du système de délivrance est soulignée.
[00010] Les systèmes de délivrance utilisés doivent permettre d'augmenter le temps de rétention des protéines au site d'administration, d'obtenir une libération totale de la quantité de protéine mise en œuvre et d'éviter une libération trop brutale pouvant entraîner une diffusion hors du site d'administration. [00011] Le système de délivrance utilisé doit également pouvoir servir de matrice à la croissance osseuse sur le site à traiter tout en permettant de circonscrire cette croissance osseuse sur le site à traiter. [00012] Quatre types de matériaux sont employés dans les systèmes de délivrance à ce jour, les polymères naturels, les polymères synthétiques, les matériaux inorganiques et les mélanges de ces matériaux. [00013] Aucun des systèmes développés n'a néanmoins permis de réduire significativement la dose de BMP. Cela est lié entre autres, soit à l'instabilité de la protéine dans la formulation, soit à la mauvaise biodisponibilité de celle-ci en raison de la structure du support. [00014] S'agissant des polymères naturels le collagène, les hyaluronanes, la fibrine, les chitosans, les alginates et d'autres polysaccharides naturels sont utilisés.
[00015] Si les éponges à base de collagène recombinant permettent d'éïiminer la plupart des inconvénients connus de ce polymère naturel, l'introduction dans les éponges de la protéine ostéogénique n'est pas à ce jour satisfaisante.
[00016] Les autres polysaccharides naturels sous forme d'hydrogels présentent essentiellement le défaut d'être trop rapidement résorbés, sauf à être préalablement réticulés sous forme de gels, ce qui conduit aux mêmes inconvénients que ceux précités pour les éponges de collagène. [00017] S'agissant des polymères synthétiques, les plus couramment utilisés sont des polymères de poly(α-hydroxyacides) comme le polylactide (PLA), le polyglycolide (PLG) et leurs copolymères (PLGA).
[00018] Les inconvénients majeurs de ces polymères sont les abaissements de pH dus à leur dégradation et les réactions inflammatoires qu'ils peuvent induire. [00019] S'agissant des matériaux inorganiques, des systèmes de délivrance combinant des phosphates de calcium avec une protéine ostéoinductrice ont été développés.
[00020] Parmi ceux-ci, on citera les céramiques à base de phosphate de calcium, comme l'hydroxyapatite (HAP) et le phosphate tricalcique (TCP) et les phosphates de calcium « non-céramiques », comme les ciments à base de phosphates de calcium (CPCs).
[00021] II est connu depuis les années 1970 que les céramiques de phosphate de calcium peuvent avoir un intérêt pour la reconstruction osseuse comme cela est rappelé dans la revue de M. Bohner (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37- 47.).
[00022] Mais il est admis que la dose de BMP-2 efficace est plus importante dans une céramique que dans une éponge de collagène. Une étude clinique de fusion postérolatérale chez l'homme (Boden, S. D. et al., Spine 2002, 27 (23), 2662-2673.) rapporte que la dose de BMP-2 (40 mg) est plus importante avec des granules de BCP (60 % HAP et 40 % TCP) produit développé par la société
MEDTRONIC SOFAMOR, que dans une éponge de collagène qui ne contient pas de phosphate de calcium (12 mg). [00023] Afin de pallier cet inconvénient, un très grand nombre de systèmes ont été développés à base de phosphate de calcium non-céramique et parmi ceux-ci figurent les ciments de phosphate de calcium. Les ciments ont été découverts dans les années 1980 par Brown et Chow et répondent à la définition suivante : « Les ciments de phosphate de calcium sont constitués d'une solution aqueuse et de un ou plusieurs phosphates de calcium. Lorsque le mélange est effectué, le(s) phosphate(s) de calcium se dissolve(nt) et précipite(nt) en un sel de phosphate de calcium moins soluble. Au cours de la précipitation, les cristaux de phosphate de calcium grossissent et s'enchevêtrent, ce qui conduit à la rigidité mécanique du ciment. » (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.).
[00024] Un article de Kim (Kim, H. D. et al., Methods Mol Biol 2004, 238, 49- 64.) décrit l'emploi d'un ciment développé par la société Etex, l'aplha-BSM, avec de la BMP-2. Ce nouveau produit conduit bien à une acivité ostéoinductrice de la matrice. [00025] Cependant, la BMP-2 introduite dans cette matrice perd une partie importante de son activité ce qui conduit à devoir augmenter la quantité de BMP-2 embarquée. Ainsi une dose de 40 μg de BMP-2 est employée dans le modèle de la formation d'os ectopique chez le rat au lieu des 20 μg de BMP-2 employés dans une éponge de collagène. [00026] En effet, les ciments présentent deux inconvénients. Tout d'abord, le ou les phosphates de calcium qui en sont les précurseurs doivent être synthétisés au préalable dans des conditions incompatibles avec des protéines. Ainsi dans le brevet US 5650176 sont décrites les conditions réactionnelles nécessaires pour la préparation du phosphate de calcium amorphe qui est un des composés de l'alpha-BSM. Ces conditions sont incompatibles avec les protéines car une quantité très importante de soude est employée. De plus, ces produits nécessitent une purification poussée puisque des composés toxiques tels que le calcium nitrate sont utilisés. [00027] D'autres exemples de ciments tels que ceux décrits par la société Graftys dans le brevet EP1891984A1 sont obtenus dans des conditions incompatibles avec les protéines puisque du dichlorométhane est employé lors de la synthèse du phosphate de calcium. Les ciments décrits par la société Lisopharm dans le brevet US2009/0155320 sont obtenus en présence d'hydroxide de calcium ce qui est également incompatible avec les protéines. [00028] De plus, d'une façon générale, la formation de ciment s'obtient en faisant réagir un sel de phosphate de calcium soluble avec un sel de phosphate de calcium solide traité à plus de 4000C afin de rendre celui-ci réactif. La réaction entre ces deux composés est incontrôlée, la plupart du temps exothermique et conduit à un ciment à structure monolithique qui séquestre dans sa masse la protéine.
[00029] Dans le brevet US563461 il est mentionné la présence de « lacunes réactives » dans le solide sans que l'on sache si cela est néfaste à la stabilité chimique de la BMP-2.
[00030] Afin de réduire les pertes de protéine dans la masse de solide formé, il a été décrit dans le brevet US5650176 qu'il est avantageux d'ajouter au mélange réactif des composés effervescents susceptibles de réduire le caractère « monolithique » du ciment. [00031] Malgré ces améliorations, force est de constater que les quantités en protéine nécessaires pour obtenir une formation d'os dans le modèle de rat ectopique, restent importantes.
[00032] S'agissant des systèmes mixtes, ceux-ci n'ont pas permis à ce jour de résoudre les problèmes ci-dessus évoqués. [00033] En résumé, les systèmes décrits dans l'art antérieur concernant l'emploi de polymères synthétiques, des polymères naturels ou encore des matériaux inorganiques tels que les céramiques ou les ciments de phosphates de calcium ne permettent pas de répondre complètement au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse. [00034] II est du mérite de la demanderesse d'avoir développé une approche originale qui consiste à mettre en présence la protéine ostéogénique avec des sels solubles de calcium et des sels solubles de phosphate qui permettent de répondre au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse. [00035] Cette approche originale permet d'une part de précipiter la protéine, en évitant toute dégradation chimique au contact des réactifs présents, et d'autre part de la co-précipiter avec un sel insoluble de calcium, de préférence le phosphate de calcium, ledit coprécipité étant sous forme divisée, ce qui limite très nettement les pertes dans la masse de solide telles que constatées avec les ciments. [00036] Ainsi, la demanderesse a mis au point de nouvelles compositions ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide, ledit coprécipitat étant sous forme divisée. [00037] La conjonction de ces deux événements permet d'obtenir des formulations très ostéogéniques contenant des quantités beaucoup plus faibles de protéine. [00038] Ces nouvelles compositions présentent ainsi l'avantage de contenir de plus faibles quantités de protéines qui est l'objectif majeur ceci afin de réduire les effets secondaires après administration chez les patients.
[00039] De plus, elles permettent de réduire les coûts des traitements en réduisant la quantité de protéine car ces protéines sont très chères.
[00040] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129023 et 61/129617 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation divalent et une matrice.
[00041] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129011 et 61/129618 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, au moins une protéine angiogénique, un sel soluble de cation divalent, éventuellement un polysaccharide anionique et éventuellement une matrice.
[00042] On connaît au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129616 et 61/129012 dont les entiers contenus sont incorporés dans la présente par référence qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique /polysaccharide anionique un sel soluble de cation au moins divalent et une matrice.
[00043] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro US61/193216 dont l'entier contenu est incorporé dans la présente par référence qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique/polysaccharide anionique, un sel soluble de cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel. [00044] On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro US61/193217 déposée le 6 novembre 2008 dont l'entier contenu est incorporé dans la présente par référence qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel. [00045] S'agissant de la présente invention, la demanderesse a également mis au point le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée, contenant au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide.
[00046] L'invention concerne également les formulations, les produits pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat. [00047] Les compositions et les kits permettant de mettre en œuvre ce procédé et d'obtenir le coprécipitat sont également des inventions ci-après décrites.
[00048] La coprécipitation est obtenue par :
[00049] - la précipitation du complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique par addition de la solution de sel d'ions calcium,
[00050] - la précipitation des ions calcium par l'addition d'une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium à un pH déterminé.
[00051] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations simultanées.
[00052] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat résulte de précipitations séquentielles.
[00053] Le complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique étant obtenu par addition de la solution de polysaccharide anionique à la solution de protéine ostéogénique.
[00054] Dans un mode de réalisation, la précipitation du sel de calcium est effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de phosphate soluble.
[00055] La nature et la forme du coprécipitat peuvent varier en fonction du pH des solutions mises en présence car les sels de phosphates de calcium présentent différentes phases solides en fonction du pH et en fonction du polysaccharide anionique et de la protéine constituant le complexe.
[00056] L'invention concerne un coprécipitat consistant en au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide sous sa forme insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat étant sous forme divisée.
[00057] Dans un mode de réalisation, il comprend en outre au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique.
[00058] Dans un mode de réalisation, le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou hydratée seuls ou en mélange.
[00059] Dans un mode de réalisation, le coprécipitat comprend en outre au moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par l'oxalate de calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de calcium. [00060] Lesdits sels de calcium insolubles peuvent être des sels mixtes formés entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques tels que les phosphates, mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, les carbonates, les hydroxydes et les éventuels anions portés par les bases. [00061] Les orthophosphates de calcium sont des sels qui résultent de la neutralisation des différentes acidités de l'acide phosphorique par les sels de calcium et selon la littérature les pKa varient de 2,12 à 12,67 à 25°C.
[00062] Les principaux orthophosphates de calcium insolubles sont les phosphates dicalciques, DCP, anhydre ou dihydraté, les phosphates octacalciques,
OCP, les phosphates tricalciques, TCP, les hydroxyapatites phosphacalciques, HAP ou PCA, et le phosphate tétracalcique, TTCP.
[00063] Les complexes polymère anionique/protéine ostéogénique consistent en les complexes décrits dans la demande PCT/EP2008/059832 au nom de la demanderesse.
[00064] Ils sont insolubilisés par addition d'un sel de calcium soluble tel que décrit dans les demandes FR 08 54621 et 61/129616 .
[00065] Cette coprécipitation en fonction de l'effet recherché est effectuée éventuellement en présence d'une base permettant d'ajuster le pH à une valeur prédéterminée.
[00066] Elle permet d'obtenir une composition chimique solide, à l'état divisé, qui permet notamment de contrôler la délivrance de la protéine ostéogénique contenue dans la composition.
[00067] Cette composition chimique solide, à l'état divisé, est obtenue spontanément dans des conditions de température ambiante, et son état divisé est stable en conditions physiologiques in vitro.
[00068] Dans un mode de réalisation, l'invention consiste en un kit pour la préparation d'un implant ostéogénique comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,
[00069] Dans un mode de réalisation, le kit comprend en outre, une composition supplémentaire comprenant au moins une base.
[00070] Dans un mode de réalisation, une deuxième base peut être additionnée aux compositions b, c ou d.
[00071] Certaines de ces compositions sont susceptibles d'être réunies avant la formation du coprécipitat afin de diminuer le nombre de flacons. [00072] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant la protéine ostéogénique peut comprendre également le polysaccharide pour former le complexe. [00073] La composition comprenant la protéine ostéogénique ou la composition comprenant le complexe peut également comprendre le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base. [00074] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le polysaccharide peut comprendre également le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
[00075] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le sel de calcium soluble peut comprendre également une base. [00076] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.
[00077] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c.
[00078] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00079] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux compositions b et d.
[00080] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins une base, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00081] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée aux compositions c et d. [00082] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.
[00083] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c.
[00084] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base.
[00085] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c. [00086] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.
[00087] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c. [00088] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, au moins une base et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
[00089] Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins une base.
[00090] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres compositions.
[00091] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.
[00092] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée à la composition b. [00093] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [00094] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.
[00095] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée aux autres compositions.
[00096] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium. [00097] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base. [00098] Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée aux autres compositions. [00099] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [000100] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base. [000101] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble. [000102] Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins un complexe protéine ostéogénique polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.
[000103] Dans un mode de réalisation, la composition comprenant au moins une protéine ostéogénique comprend en outre au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique, [000104] Dans un mode de réalisation, le kit, comprend en outre au moins une matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte. [000105] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des solutions aqueuses. [000106] Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des lyophilisats.
[000107] Dans un mode de réalisation, certaines des compositions constituant le kit sont des lyophilisats. [000108] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant réaction, par de l'eau ou une des autres compositions en solution.
[000109] Ainsi par exemple, la composition comprenant la protéine ostéogénique sous forme de lyophilisât peut être réhydratée avec la solution comprenant un polysaccharide anionique, ou avec la solution comprenant un polysaccharide anionique et un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
[000110] Dans un mode de réalisation, les formulations, les dispositifs médicaux et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitât sont des suspensions aqueuses.
[000111] Dans un mode de réalisation, les formulations et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitât sont des lyophilisats.
[000112] Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant emploi, au moyen de sérum physiologique ou de sang.
[000113] On entend par protéine ostéogénique un facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison avec une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
[000114] Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison. [000115] Les BMPs utilisées sont des BMPs recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA). [000116] On entend par facteur de croissance ayant un pouvoir chémo- attractant et angiogénique des protéines telles que les PDGF, notamment le PDGF- BB, les VEGF ou les FGF, notamment le FGF-2. [000117] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF.
[000118] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la
BMP-2 et du PDGF-BB. [000119] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la
BMP-7 et du PDGF-BB.
[000120] Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins du
GDF-5 et du PDGF-BB.
[000121] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
[000122] Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7
(Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le FGF.
[000123] Le sel soluble de calcium est un sel de calcium dont l'anion est choisi dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le
D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate.
[000124] Dans un mode de réalisation, le sel soluble de calcium est du chlorure de calcium.
[000125] On entend par sel soluble d'un anion susceptible de former un précipité avec l'ion calcium un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe constitué des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO4 3" l'ion hydrogénophosphate HPO4 2" et l'ion dihydrogénophosphate H2PO4".
[000126] Dans un mode de réalisation, un deuxième anion choisi dans le groupe constitué par les anions oxalate, ascorbate, carbonate ou sulfate est en outre ajouté à la composition comprenant un anion phosphate.
[000127] Les sels solubles d'un anion susceptibles de former un précipité avec l'ion calcium sont choisis dans le groupe constitué par les phosphates de sodium, d'oxalate de sodium, l'ascorbate de sodium, le carbonate de sodium, le sulfate de sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium. [000128] On entend par polysaccharide anionique un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.
[000129] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des dérivés de polysaccharides, comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane tels que décrits dans la demande FR08/55567. [000130] Ces polysaccharides sont constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2). Ils peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteur de fonctions acides ou anioniques et porteurs de fonctions acides.
[000131] Ils sont fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane, noté Trp : ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, - F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide, [000132] Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.
[000133] Selon l'invention, le polysaccharide comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane peut répondre à la formule générale I suivante :
Polysaccharide
F
[ Trp 1 R [ Trp ] n i
Formule I le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. - i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et
1, - (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2, lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K. - lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+, lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre. [000134] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
[000135] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[000136] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau. [000137] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
[000138] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
[000139] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
[000140] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane. [000141] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
[000142] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.
[000143] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3). [000144] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
[000145] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[000146] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.
[000147] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3).
[000148] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane. [000149] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
[000150] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
[000151] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
ou leurs sels de cations alcalins.
[000152] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
[000153] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II.
Formule II [000154] E étant un groupement pouvant être :
- un alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C8. un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20. [000155] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
[000156] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
[000157] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
[000158] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des dextranes fonctionnalisés avec des acides aminés hydrophobes tels que le tryptophane et les dérivés du tryptophane tels que décrits dans la demande FR 07/02316.
[000159] Selon l'invention, le dextrane fonctionnalisé peut répondre à la formule générale III suivante :
Dextran
Formule III
R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, • AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R. t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1, et, lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+, K+, ledit dextrane étant amphiphile à pH neutre.
[000160] Dans un mode de réalisation, le cation alcalin est Na+.
[000161] Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
[000162] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un carboxymethyl dextrane de formule IV.
Formule IV ou l'acide correspondant.
[000163] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane de formule V :
Formule V ou l'acide correspondant.
[000164] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
ou leurs sels de cations alcalins.
[000165] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2- indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
[000166] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés du tryptophane sont choisis parmi les esters du tryptophane de formule II tels que définis précédemment. [000167] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un ca :
Formule VI [000168] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane modifié par le tryptophane de formule VII :
Formule VII
[000169] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou décarboxylés. [000170] Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés de la phenylalanine, de la leucine, de l'isoleucine et de la valine sont choisis parmi les esters de ces acides aminés de formule VIII.
Formules VIII
E étant défini comme précédemment. [000171] Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est la phénylalanine, et ses dérivés alcool, amide ou décarboxylés.
[000172] Le dextrane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
[000173] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
[000174] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500. [000175] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles tels que ceux décrits dans la demande FR 08/05506 dont au moins un est substitué par un dérivé d'alcool hydrophobe, noté Ah : ledit alcool hydrophobe (Ah) étant greffé ou lié au polysaccharide anionique par un bras de couplage R, ledit bras de couplage étant lié au polysaccharide anionique par une fonction F' ladite fonction F' résultant du couplage entre la fonction aminé du bras de liaison R et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, et ledit bras de couplage étant lié à l'alcool hydrophobe par une fonction G résultant du couplage entre une fonction carboxyle, isocyanate, thioacide ou alcool du bras de couplage et une fonction de l'alcool hydrophobe, les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
• F' étant une fonction amide, « G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R, ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre. [000176] Le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes est choisi parmi les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles de formule générale IX :
Polysaccharide + carboxyle
F1
I R
I G
Ah
" Formule IX
- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7,
- F', R, G et Ah répondant aux définitions données ci-dessus, et lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. [000177] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides naturellement porteurs de groupes fonctionnels carboxyles et sont choisis dans le groupe constitué par l'alginate, le hyaluronane, le galacturonane.
[000178] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffées de formule générale X.
Polysaccharide
Q x
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), - L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther,
- r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide,
- Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, - CO2H [000179] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
[000180] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane.
[000181] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[000182] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau. [000183] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
[000184] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
[000185] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
[000186] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
[000187] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane. [000188] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.
[000189] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
[000190] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
[000191] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[000192] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline. [000193] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3)
[000194] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane. [000195] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2). [000196] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane. [000197] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ts :
[000198] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,1 et 2.
[000199] Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,2 et 1,5. [000200] Dans un mode de réalisation, le groupement R selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés.
[000201] Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés.
[000202] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés naturels.
[000203] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont choisis parmi la leucine, l'alanine, l'iso-leucine, la glycine, la phénylalanine, le thryptophane, la valine.
[000204] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras.
[000205] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée comprenant de 4 à 18 carbones.
[000206] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.
[000207] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol.
[000208] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol.
[000209] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe Ah est choisi parmi les tocophérols.
[000210] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.
[000211] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol. [000212] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle.
[000213] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique. [000214] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
[000215] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
[000216] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
[000217] Dans un mode de réaliastion le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par le dextran fonctionnalisé par le tryptophane, le dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol, le dextran fonctionnalisé par le glycinate de dodécanol ou le dextran fonctionnalisé par l'ester éthylique du tryptophane.
[000218] Afin de neutraliser les composés acides présents dans le mélange, les bases sont choisies parmi les bases minérales ou organiques.
[000219] Parmi les bases minérales, on citera la soude, l'hydrogénocarbonate de sodium ou le carbonate de sodium.
[000220] Parmi les bases organiques, on citera les aminés et les acides aminés déprotonés.
[000221] Parmi les bases organiques, on citera l'imidazole et ses dérivés notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la serine. [000222] Dans un mode de réalisation, une matrice organique peut être utilisée afin de favoriser la réparation, elle est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
[000223] Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de bœuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés. [000224] Elles peuvent également être obtenues par résorption en milieu acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance. Ces matrices déminéralisées peuvent également être préparées sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques. Ces matrices sont essentiellement composées de collagène de Type I insoluble et réticulé.
[000225] Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques. Ces matériaux qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un « putty » ou la collagène joue un rôle de liant. [000226] Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes. Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions. Ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs.
[000227] Dans un mode de réalisation, la matrice organique est un hydrogel réticulé. [000228] Un hydrogel réticulé est obtenu par réticulation de chaînes de polymères. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12). [000229] Dans un mode de réalisation, l'implant peut comprendre un hydrogel non réticulé.
[000230] On entend par hydrogel non réticulé un réseau tri-dimensionel hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Cet hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu par réticulation chimique des chaînes de polymère.
[000231] La liste des polymères formant des hydrogels est très large et une liste importante mais non exhaustive est donnée dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, 43, 3-12). Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des polymères naturels. Une autre revue couvrant les polysaccharides formant des hydrogels permet de choisir un polymère utile pour l'invention (Alhaique et al. J. Control. Release, 2007, 119, 5-24).
[000232] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.
[000233] Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
[000234] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
[000235] Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables. [000236] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant l'implantation ou l'injection.
[000237] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté ou injecté. [000238] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par réhydratation d'un lyophilisât juste avant l'implantation ou l'injection, ou être implanté sous forme déshydraté.
[000239] Parmi les différentes matrices utilisables on citera à titre d'exemples les éponges de collagène comme Helistat® (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey), les DBM (Demineralized Bone Matrix) seules ou en mélange avec d'autres matériaux organiques comme des polysaccharides, du glycérol ou des gélatines comme Osteofil® (Medtronic), Allomatrix® (WRIGHT), Grafton® (Osteotech), DBX® (MTF/Synthes), Bioset® (Régénération Technologies), les matrices constituées de phases minérales comme Vitoss® (Orthivista), Osteoset® (Wright) ou les matrices mixtes comme MasterGraft® (Medtronic), Healos® (Depuy Spine)CopiOs®
(Zimmer), Sunnmax Collagen Bone Graft Matrix (Sunmax).
[000240] Le système après formation du coprécipitat est constitué de deux phases, une phase liquide et une phase solide. [000241] Dans la suite de l'exposé lorsque la notion de volume est employée, il s'agit du volume total comprenant les deux phases.
[000242] Les quantités par unité de volume dans le produit résultant après mélange des compositions des différentes formes du kit sont données ci-après et ne comprennent pas les quantités d'ions calcium ou d'ions phosphate provenant de la matrice lorsque des matrices minérales ou mixtes sont utilisées..
[000243] Dans un mode de réalisation, les quantités totales des différentes protéines par unité de volume sont comprises entre 0,01 mg et 2 mg, de préférence entre 0,05 mg et 1,5 mg, et encore de préférence entre 0,1 mg et 1,5 mg par ml de suspension obtenue. [000244] Les quantités totales de phosphates par unité de volume sont comprises entre 0,02 mmol à 0,5 mmol, de préférence entre 0,05 à 0,25 mmol par ml de suspension obtenue.
[000245] Les quantités totales de calcium par unité de volume sont comprises entre 0,01 mmol et 1 mmol, de préférence entre 0,05 et 1 mmol et encore de préférence entre 0,1 mmol et 0,5 mmol, par unité de volume.
[000246] Le pourcentage des ions calcium dans la phase solide est compris entre
60 et 95 % des ions calcium introduits.
[000247] Les quantités totales de polysaccharides par unité de volume sont comprises entre 1 et 100 mg, de préférence entre 2 et 40 mg par ml de suspension obtenue. Le pourcentage de polysaccharides dans la phase solide est supérieur à 80 % du polysaccharide introduit.
[000248] Les quantités de base mises en œuvre correspondent à environ 0,1 à 2 équivalents par rapport aux protons apportés par les ions phosphates.
[000249] En fonction des volumes mis en œuvre et du nombre de compositions, on peut déterminer par le calcul les quantités mises en œuvre dans les compositions de départ. Cela peut être réalisé pour les différents modes de réalisation des kits.
[000250] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,01 mg et 20 mg, de préférence entre 0,05 mg et 8 mg de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg. [000251] Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg. [000252] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention, on réalise un kit comprenant trois flacons, lesdits flacons contenant :
[000253] le premier entre 2 et 10 mg de protéine ostéogénique sous forme lyophilisée, [000254] le second entre 2 et 6 ml d'une solution d'un polysaccharide à une concentration comprise entre 10 et 50 mg/ml et d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 de concentration comprise entre 0,15 et 0,50 M, [000255] le troisième entre 2 et 6 ml d'une solution de chlorure de calcium à une concentration comprise entre 0,25 et 0,90 M. [000256] Dans un mode de réalisation, le deuxième flacon contient en outre une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,05 et 0,8 M.
[000257] Dans un mode de réalisation, le deuxième et le troisième flacon contiennent en outre une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,2 M.
[000258] Dans un mode de réalisation, le troisième flacon contient en outre une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M. [000259] Les solutions sont additionnées simultanément ou successivement avant implantation sur une éponge de collagène d'un volume compris entre 15 et 30 ml.
[000260] Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention on mélange trois solutions comprenant : [000261] la première d'un volume entre 1 et 3 ml contenant une protéine ostéogénique à une concentration comprise entre 0,33 et 2 mg/ml.
[000262] la seconde d'un volume entre 1 et 3 ml contenant un polysaccharide à une concentration comprise entre 5 et 15 mg/ml et un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 de concentration comprise entre 0,05 et 0,15 M, [000263] la troisième d'un volume entre 1 et 3 ml contenant du chlorure de calcium à une concentration comprise ente 0,25 et 0,50 M. [000264] Dans un mode de réalisation, une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,20 et 0,4 M est additionnée au mélange obtenu.
[000265] Dans un mode de réalisation, une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,15 M est additionnée au mélange obtenu.
[000266] Dans un mode de réalisation, une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M est additionnée au mélange obtenu.
[000267] Le mélange comprenant le coprécipitat selon l'invention est ensuite lyophilisé. [000268] Au moment de la mise en œuvre celui-ci est réhydraté avec de l'eau injectable et/ou du sang à environ 35 % du volume initial.
[000269] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de l'invention par implantation, par exemple, pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement des fractures osseuses en particulier du type pseudarthrose.
[000270] L'invention concerne également l'utilisation des compositions de l'invention par injection pour le traitement des défauts osseux, notamment ceux causés par l'ostéoporose et pour toute autre pathologie pouvant être traitée par voie percutanée. [000271] L'invention concerne également l'utilisation des compositions selon l'invention comme implant osseux.
[000272] Dans un mode de réalisation, les compositions pourront être utilisées en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale. [000273] L'invention concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant les compositions dans la reconstruction osseuse.
[000274] Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à traiter. [000275] Des exemples des différents modes de réalisation de l'invention sont donnés ci-après.
[000276] Des exemples de kits sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 1 : Préparation d'un kit contenant S flacons [000277] Kit 1 : Un kit de 5 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.
Exemple 2 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000278] Kit 2 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 3 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons [000279] Kit 3 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution. Exemple 4 : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000280] Kit 4 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple S : Préparation d'un kit contenant 4 flacons
[000281] Kit 5 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.
Exemple 6 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000282] Kit 6 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Exemple 7 ; Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000283] Kit 7 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un polymère et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution. Exemple 8 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000284] Kit 8 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Exemple 9 : Préparation d'un kit contenant 3 flacons
[000285] Kit 9 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisés ou en solution.
Exemple 10 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons [000286] Kit 10 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 11 : Préparation d'un kit contenant 2 flacons [000287] Kit 11 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant le complexe entre la protéine ostéogénique et un polymère lyophilisé et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
[000288] Des exemples de synthèses de polymères sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 12 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane
[000289] Le polymère 1 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,03. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,36.
Exemple 13 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol.
[000290] Le polymère 2 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet PCT/IB2009007054. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,11. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,09. [000291] La solution de polymère 2 en fin de production est à 30,45 mg/mL.
Exemple 14 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol [000292] Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-glycine, soit r dans la formule X de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-glycine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,22.
Exemple IS : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane [000293] Le polymère 4 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 70 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,14. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,41.
Exemple 16 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol [000294] Le polymère 5 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit r dans la formule X de la présente demande, est de 1,12. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,22. Exemple 17 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate de dodécanol.
[000295] Le polymère 6 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester dodécanoique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR08.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester dodécanoique de la L-glycine, soit r dans la formule X de la présente demande est de 1,04. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester dodécanoique de la L-glycine, soit q dans la formule IX de la présente demande est de 0,13.
Exemple 18 : Préparation d'un dextran fonctionnalisé par l'ester éthylique du tryptophane [000296] Le polymère 7 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par l'ester éthylique du tryptophane, soit t dans la formule III de la présente demande est de 1,09. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester éthylique du tryptophane, soit p dans la formule III de la présente demande est de 0,47.
Exemple 19 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le tryptophane [000297] Une solution concentrée de polymère 1 est préparée en solubilisant 9.13 g de lyophilisât de polymère 1 (teneur en eau d'environ 25%) dans 35,24 g d'eau. La solution est mise sous agitation pendant 30 minutes. La concentration en polymère 1 est de 162,9 mg/g déterminée par extrait sec. La densité est de 1.08. La concentration en polymère 1 est donc de 175,9 mg/mL.
Exemple 20 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le phénylalaninate d'octanol
[000298] Une solution de polymère 2 à 40 mg/g est préparée en solubilisant 3,12 g de lyophilisât de polymère 2 (teneur en eau de 14%) dans 64 g d'eau.
Exemple 21 : Préparation d'une solution d'un dextran fonctionnalisé par le glycinate d'octanol [000299] Une solution de polymère 3 à 38 mg/g est préparée en solubilisant
3,95 g de lyophilisât de polymère 3 (teneur en eau de 4%) dans 100 g d'eau. [000300] Des exemples de solution ou de lyophilisât de protéines ostéogéniques sont donnés à titre indicatif et non limitatif. Exemple 22 : Solution de rhBMP-2 en tampon HCI 1 mM
[000301] 10 ml_ d'une solution de rhBMP-2 à 0,15 mg/ml sont préparés par ajout de 10 ml_ d'une solution d'HCI 1 mM à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 23 : Solution de rhBMP-2 en tampon InFUSE
[000302] 1 L de tampon InFUSE est préparé en solubilisant dans une fiole jaugée de 1 L remplie de 800 ml_ d'eau 5 g de sucrose, 25 g de glycine, 3,72 g d'acide glutamique, 0,11 g de chlorure de sodium et 0,11 g de polysorbate 80. Le pH de cette solution est ensuite ajusté à 4,5 par ajout de 16,8 mL de soude 1 N. La fiole jaugée est enfin remplie au trait pour obtenir le tampon InFUSE. 1 mL d'une solution de rhBMP-2 à 1,5 mg/ml dans le tampon InFUSE est préparé par ajout de 1 mL de tampon à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000303] Cette solution peut en outre être lyophilisée. Exemple 24 : Solution de rhBMP-7 en tampon HCI 10 mM
[000304] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 1 mM à 3,8 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 2,2. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 25 : Solution de rhBMP-7 en tampon lactose 5% pH 3,5
[000305] Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 7,8 mL d'une solution de lactose à 5% dont le pH a été fixé à 3,5 par ajout d'HCI 1 M à 30,3 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 3,5. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 26 : Solution de rhGDF-5 en tampon HCI 10 mM [000306] 1 mL d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est préparé par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 10 mM à 1,5 mg de rhGDF-5 lyophilisé. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000307] Des exemples de préparation de solutions de sels de phosphates solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 27 : Solution de phosphate de sodium
[000308] Une solution de phosphate de sodium à 1 M est préparée en fiole jaugée à partir d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium anhydre et de dihydrogénophosphate de sodium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000309] Des solutions plus diluées de phosphate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus.
[000310] Des exemples de préparation de solutions de sels de calcium solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 28 : Solution de chlorure de calcium à 2 M
[000311] Solution 1 : Une solution de chlorure de calcium à 2 M est préparée en fiole jaugée à partir de chlorure de calcium anhydre ou dihydrate (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 29 : Solution de chlorure de calcium à 0,75 M [000312] Solution 2 : Une solution de chlorure de calcium à 0,75 M est préparée par dilution à partir de la solution de chlorure de calcium 2 M décrite dans l'exemple précédent. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 30 : Solution d'acétate de calcium à 0,75 M
[000313] Solution 3 : Une solution d'acétate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir d'acétate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 31 : Solution de gluconate de calcium à 0,75 M
[000314] Solution 4 : Une solution de gluconate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir de gluconate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
[000315] Des exemples de préparation de solutions de bases sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 32 : Solution d'histidine à 1 M [000316] Solution 5 : Une solution d'histidine à 1 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en solubilisant 155,2 g de L-histidine (Sigma) dans le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 33 : Solution de proline à 2 M [000317] Solution 6 : Une solution de proline à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 230,2 g de L-proline (Sigma), 200 ml_ de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 34 : Solution de serine à 2 M
[000318] Solution 7 : Une solution de serine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 210,2 g de L-serine (Sigma), 200 ml_ de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 μm.
Exemple 35 ; Solution de glycine à 2 M
[000319] Solution 8 : Une solution de glycine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 150,1 g de L-glycine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 μm.
Exemple 36 : Solution d'alanine à 2 M
[000320] Solution 9 : Une solution de alanine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 178,2 g de L-alanine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 μm.
Exemple 37 : Solution de lysine à 2 M [000321] Solution 10 : Une solution de lysine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 292,4 g de L-lysine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur
0,22 μm. [000322] Des solutions de concentration plus faible de ces différentes bases sont obtenues par dilution soit avec de l'eau, soit avec une solution de sels de calcium décrites précédemment.
Exemple 38 : Solution d'hydrogénocarbonate de sodium
[000323] Une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M est préparée en fiole jaugée à partir d'hydrogénocarbonate de sodium anhydre (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
[000324] Des solutions plus diluées d'hydrogénocarbonate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus. Exemple 39 : Solution de TRIS
[000325] Une solution de tris(hydroxymethyl)aminomethane à 0,5 M est préparée en fiole jaugée à partir de tris(hydroxymethyl)aminomethane ultrapure
(Sigma) et ajustée à pH 7,4 avec de l'acide chlorhydrique 1 M. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
[000326] Des exemples de préparation de solutions comprenant un polymère et un sel de phosphate soluble sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 40 : Solution comprenant le polymère 1 et du phosphate de sodium à pH 6.5
[000327] Solution 11 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 8,6 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/mL décrite dans l'Exemple 15, de 17 mL de la solution
1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 11,9 mL d'eau. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 41 : Solution comprenant le polymère 1 et du phosphate de sodium
[000328] Solution 12 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL et du phosphate de sodium à 0,23 M est préparée par mélange de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 13,0 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 42 : Solution comprenant le polymère 2 et du phosphate de sodium à pH 6.5 [000329] Solution 13 : Une solution comprenant le polymère 2 à 20 mg/mL et du phosphate à 0,45 M est préparée par mélange de 10 mL de la solution de polymère 2 à 40 mg/g décrite dans l'Exemple 20, de 9 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et de 1 mL d'eau. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 43 : Solution comprenant le polymère 1, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000330] Solution 14 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 5,5 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27, de 12,4 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'exemple 38 et de 0,6 ml_ d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 44 : Solution comprenant le polymère 1, du phosphate de sodium et de l'histidine [000331] Solution 15 : Une solution comprenant le polymère 1 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'histidine à 0,09 M est préparée par mélange de 5,5 ml_ de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15, de 5,5 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27, de 10,8 mL d'une solution d'histidine à 0,2 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'Exemple 32 et de 2,2 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 45 : Solution comprenant le polymère 2, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000332] Solution 16 : Une solution comprenant le polymère 2 à 10 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 3,45 mL de la solution de polymère 2 à 30,45 mg/mL décrite dans l'Exemple 13, de 2,0 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 2,7 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 2,4 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 46 : Solution comprenant le polymère S, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000333] Solution 17 : Une solution comprenant le polymère 5 à 20 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,3 mL de la solution de polymère 5 à 36,87 mg/mL décrite dans l'Exemple 16, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27 et de 0,6 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 47 : Solution comprenant le polymère 6, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate [000334] Solution 18 : Une solution comprenant le polymère 6 à 20 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,0 mL de la solution de polymère 6 à 46,7 mg/mL décrite dans l'Exemple 17, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 ml_ d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,3 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 48 : Solution comprenant le polymère 7, du phosphate de sodium et de l'hydrogénocarbonate
[000335] Solution 19 : Une solution comprenant le polymère 7 à 40 mg/mL, du phosphate de sodium à 0,23 M et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M est préparée par mélange de 1,26 ml_ de la solution de polymère 7 à 75,9 mg/mL décrite dans l'Exemple 18, de 0,45 mL de la solution 1,2 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 27, de 0,6 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M décrite dans l'exemple 38 et de 0,06 mL d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
[000336] Des exemples de préparation de complexes entre des protéines ostéogéniques et des polymères sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 49 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1
[000337] Solution 20 : 22 μl d'une solution de rhBMP-2 à 1,46 mg/ml sont ajoutés à 267 μl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml et à 351 μL d'eau stérile. Cette solution de rhBMP-2 et de polymère 1 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple SO : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 1
[000338] Solution 21 : 50 μl d'une solution de rhBMP-7 à 1,5 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 1 à 60,6 mg/ml. Cette solution de rhBMP-7 et de polymère 1 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple Sl : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 2
[000339] Solution 22 : 50 μl d'une solution de rhBMP-7 à 0,15 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de rhBMP-7 et de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 52 : Préparation d'un complexe rhGDF-S/ Polymère 2
[000340] Solution 23 : 50 μl d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est mélangé à 100 μl d'une solution de polymère 2 à 22,7 mg/ml. Cette solution de rhGDF-5 et de polymère 2 est à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 53 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium
[000341] Solution 24 : 184,0 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFUSE contenant seulement 7,85 mg de rhBMP-2 sont repris par 19 ml_ de la solution décrite dans l'Exemple 41. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 54 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000342] Solution 25 : 165,5 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la solution décrite dans l'Exemple 43. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 55 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'histidine [000343] Solution 26 : 165,5 mg de lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon
InFUSE contenant seulement 6,95 mg de rhBMP-2 sont repris par 17,1 mL de la solution décrite dans l'Exemple 44. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 56 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000344] Solution 27 : 1,98 mL d'une solution de rhBMP-2 à 1,55 mg/mL dans le tampon InFuse sont ajoutés à 3,5 mL de la solution de polymère 1 à 174,7 mg/g. Puis, 9,6 mL d'une solution contenant 0,74 M de phosphate de sodium et 1,2 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 0,28 mL d'eau stérile sont également ajoutés. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP- 2, de 40 mg/mL en polymère 1, de 0,45 M en phosphate de sodium et de 0,75 M en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 57 : Préparation d'un complexe rhBMP-7/ Polymère 1 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000345] Solution 28 : 1,71 mL d'une solution de rhBMP-7 à 3,69 mg/mL dans un tampon 10 mM HCI sont ajoutés à 3,4 mL de la solution de polymère 1 à 175,9 mg/g décrite dans l'Exemple 15. Puis, 3,3 mL de la solution 1 M de phosphate de sodium décrite dans l'Exemple 27 et 7,5 mL d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,6 M obtenue par dilution de la solution mère décrite dans l'exemple 38 et 14,1 mL d'eau stérile sont ajoutés. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.2 mg/mL en rhBMP-7, de 20 mg/mL en polymère 1, de 0,11 M en phosphate de sodium et de 0,15 M en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 58 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000346] Solution 29 : 65,2 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 10,5 mL de la Solution 16. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 0.4 mg/mL en rhBMP-2, de 10 mg/mL en polymère 2, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 59 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 5 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000347] Solution 30 : 25,7 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 17. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en polymère 5, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 60 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 6 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000348] Solution 31 : 24,8 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 18. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 20 mg/mL en polymère 6, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium.
Exemple 61 : Préparation d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 7 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium [000349] Solution 32 : 25,6 mg d'un lyophilisât de rhBMP-2 dans le tampon InFuse sont repris avec 2,4 mL de la Solution 19. Cette solution est laissée à incuber 1 heure à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 μm. La composition du mélange est de 1.5 mg/mL en rhBMP-2, de 40 mg/mL en polymère 7, de 0,23 M en phosphate de sodium et de 0,31 M en hydrogénocarbonate de sodium. [000350] Des exemples de préparation de solutions comprenant un sel de calcium soluble et une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 62 : Solution de chlorure de calcium et d'histidine [000351] Solution 33 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de l'histidine à 0,4 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 120 mL d'une solution d'histidine à 1 M et 67,5 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 63 ; Solution de chlorure de calcium et de proline [000352] Solution 34 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de proline à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de proline à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. Exemple 64 : Solution de chlorure de calcium et de glycine
[000353] Solution 35 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de glycine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de glycine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 65 : Solution de chlorure de calcium et d'alanine [000354] Solution 36 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et d'alanine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution d'alanine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 66 : Solution de chlorure de calcium et de lysine [000355] Solution 37 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de lysine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de lysine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm.
Exemple 67 : Solution de chlorure de calcium et de serine [000356] Solution 38 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de serine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de serine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 μm. [000357] Des exemples de préparation de suspensions injectables comprenant une BMP, un polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif. Exemple 68 : Préparation d'une suspension injectable d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000358] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium a été obtenue par mélange de 400 μl_ de la Solution 29 contenant de la rhBMP-2 à 0,4 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4 mg de polymère 2, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 124 μmol, et de 400 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 μmol. La suspension obtenue est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.
Exemple 69 : Préparation d'une suspension injectable d'un complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000359] Une suspension ostéogénique basée sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été obtenue par mélange de 1250 μl_ d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,52 mg/mL soit 650 μg de BMP-2, le Polymère 1 à 20 mg/mL, soit 25 mg de Polymère 1, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 288 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 388 μmol, et de 1250 μL d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 477 μmol. La suspension obtenue est conservée 15 minutes à température ambiante avant injection. Cette suspension est injectable avec des aiguilles de 27 gauges.
[000360] Des exemples de préparation d'implants comprenant une BMP, un polymère, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
[000361] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec une éponge de collagène de type-I réticulée stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). Le volume de cette éponge varie selon l'application, 200 μL pour une application en site ectopique chez le rat, 4,5 mL pour une application de fusion vertébrale chez le lapin. Exemple 70 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés
[000362] Implant 1 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 1,64 M. Enfin, 90 μl_ d'une solution de phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,053 M obtenue par mélange de 80 μl_ de phosphate de sodium (22,5 mg/mL) et 10 μl_ d'acide chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 dans l'éponge est de 2 μg.
Exemple 71 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés [000363] Implant 2 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 6,85 M. Enfin, 90 μL d'une solution de phosphate de sodium neutralisée à une concentration de 0,22 M obtenue par mélange de 80 μL de phosphate de sodium (93,8 mg/mL) et 10 μL d'acide chlorhydrique 1 N sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.
Exemple 72 : Préparation d'implants éponge collagène / complexe BMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et d'ascorbate de sodium lyophilisés
[000364] Implant 3 : 40 μl de la Solution 20 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 1,64 mg/ml. Enfin, 80 μL d'une solution d'ascorbate de sodium à une concentration de 0,41 M sont ajoutés à l'éponge. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.
Exemple 73 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés
[000365] Implant 4 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,325 mg/mL de rhBMP-2, soit 650 μg de rhBMP-2, à 64,5 mg/mL de Polymère 1, soit 129 mg Polymère 1, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M soit 600 μmol de chlorure de calcium et enfin de 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 74 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés
[000366] Implant 5 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,163 mg/mL de rhBMP-2, soit 326 μg de rhBMP-2, à 32,5 mg/mL de Polymère 1, soit 65 mg de Polymère 1, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M soit 600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 75 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés
[000367] Implant 6 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 mL d'une solution à 0,081 mg/mL de rhBMP-2, soit 162 μg de rhBMP-2, à 16,3 mg/mL de Polymère 1, soit 32,5 mg et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M, soit 600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation. Exemple 76 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés
[000368] Implant 7 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 2 ml_ d'une solution à 0,040 mg/mL de rhBMP-2, soit 80 μg de rhBMP-2, à 8 mg/mL de Polymère 4, soit 16 mg, et à 0,18 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 500 μL d'une solution de chlorure de calcium à 1,2 M, soit
600 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. Ces implants sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Chacune des éponges lyophilisées est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation. Exemple 77 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium
[000369] Implant 8 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μL d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 270 μL d'une solution de chlorure de calcium à 3,4 M, soit 920 μmol, et enfin 270 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à
1,37 M, soit 370 μmol d'hydroxyde de sodium.
Exemple 78 ; Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium [000370] Implant 9 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μL d'une solution à 0,151 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 30,2 mg/mL de Polymère 4, soit 32 mg, et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, puis 270 μL d'une solution de chlorure de calcium à 3,4 M, soit 920 μmol, et enfin 270 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 1,37 M, soit 370 μmol d'hydroxyde de sodium. Exemple 79 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium
[000371] Implant 10 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 1060 μl_ d'une solution à 0,311 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP-2, à 62,3 mg/mL de Polymère 4, soit 66 mg et à 0,34 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, et enfin 540 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 1,7 M, soit 920 μmol.
Exemple 80 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés [000372] Implant 11 : Un implant ostéogénique basé sur une précipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium a été obtenu à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 1500 μl_ d'une solution à 0,107 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 21.3 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, puis 500 μL d'une solution à 1,2 M de chlorure de calcium soit 600 μmol, puis 500 μL d'une solution à 0,72 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol et enfin 500 μL d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,54 M soit 270 μmol d'hydroxyde de sodium. L'implant est ensuite congelé à -800C et lyophilisé. L'éponge lyophilisée est imbibée par 1 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 81 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine [000373] Implant 12 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP- 2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,115 M de phosphate de sodium à pH 7,4, soit 92 μmol, et enfin 800 μL d'une solution à 0,3 M de chlorure de calcium, soit 240 μmol, et à 0,2 M d'histidine, soit 160 μmol. Exemple 82 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 4 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine
[000374] Implant 13 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 4 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μl_ d'une solution à 0,413 mg/mL de rhBMP-2, soit 330 μg de rhBMP- 2, à 20,65 mg/mL de Polymère 4, soit 16,5 mg et à 0,24 M de phosphate de sodium à pH 7,4, soit 192 μmol, et enfin 800 μl_ d'une solution à 0,4 M de chlorure de calcium, soit 320 μmol et à 0,4 M d'histidine soit 320 μmol.
Exemple 83 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000375] Implant 14 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution à 0,2 mg/mL de rhBMP-2, soit 160 μg de rhBMP-2, à 40 mg/mL de Polymère 1, soit 32 mg, à 0,45 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 360 μmol, et à 0,75 M d'hydrogénocarbonate de sodium, soit 600 μmol, et enfin 800 μL d'une solution à 0,75 M de chlorure de calcium soit 600 μmol.
Exemple 84 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000376] Implant 15 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μL d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 1 à 8 mg/mL, soit 6,4 mg, du phosphate de sodium à 0,45 M, soit 360 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit 600 μmol, et enfin 800 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,75 M, soit 600 μmol.
Exemple 85 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000377] Implant 16 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm, soit un volume d'épongé de 4.52 ml_. Sur cette éponge, sont ajoutés 800 μl_ d'une solution contenant de la BMP-2 à 0,2 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 1 à 20,6 mg/mL, soit 16,5 mg, du phosphate de sodium à 0,24 M, soit 192 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,75 M, soit 600 μmol, et enfin 800 μl_ d'une solution de chlorure de calcium à 0,4 M, soit 320 μmol.
Exemple 86 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-7/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000378] Implant 17 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-7/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée cylindrique de 198 μL par 70 μL d'une solution à 0,071 mg/mL de BMP-7 soit 5 μg de BMP-7, à 31,3 mg/mL de Polymère 1, soit 1,5 mg de Polymère 1, à
0,24 M de phosphate de sodium à pH 7,4 soit 16,8 μmol, et à 0,4 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 28 μmol, puis par 70 μL d'une solution à 0,4 M de chlorure de calcium, soit 28 μmol. Les implants sont ensuite congelés à - 800C et lyophilisés. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 87 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000379] Implant 18 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe rhBMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus à partir d'une éponge de collagène réticulée de volume d'épongé de 2.25 mL. Sur cette éponge, sont ajoutés 400 μL de la Solution 29 contenant de la rhBMP-2 à 0,4 mg/mL, soit 160 μg de rhBMP-2, le Polymère 2 à 10 mg/mL, soit 4 mg, du phosphate de sodium à 0,23 M, soit 92 μmol, et de l'hydrogénocarbonate de sodium à 0,31 M, soit 124 μmol, et enfin 400 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,38 M, soit 153 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge est prête pour l'implantation.
Exemple 88 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-7/ Polymère 3 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate
[000380] Implant 19 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-7/Polymère 3 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 4520 μl_ par 800 μl_ d'une solution contenant de la BMP-7 à 0,41 mg/mL, soit 330 μg de BMP-7, le Polymère 3 à 17,5 mg/mL, soit 14 mg de Polymère 3, du phosphate de sodium à 0,45 M, soit 360 μmol, puis par 800 μL d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,4 M, soit 648 μmol et de la proline à 0.61 M, soit 488 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, l'éponge est prête pour l'implantation.
Exemple 89 : Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhGDF-5/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine lyophilisés
[000381] Implant 20 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'une éponge de collagène de type-I réticulée d'un volume de 4520 μL par 1500 μL d'une solution contenant du GDF-5 à 0,5 mg/mL, soit 750 μg de GDF-5, le Polymère 2 à 20 mg/mL, soit 30 mg de Polymère 2, puis par 750 μL d'une solution contenant du chlorure de calcium à 0,8 M, soit 600 μmol et de l'histidine à 0.38 M, soit 285 μmol et enfin par une solution contenant du phosphate de sodium à 0,48 M, soit 360 μmol. Chaque solution est laissée 15 minutes en contact avec l'éponge après ajout. Après ces durées d'imprégnation, les éponges sont congelées à -800C et lyophilisées. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 1,5 mL de sang autologue 30 min avant implantation.
[000382] Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec une matrice résistante à la compression, CRM pour Compressive Résistant Matrix. Ce matériau est une matrice mixte composée de collagène bovin de type I et d'une phase minérale de phosphate de calcium composée à 15% d'hydroxyapatite et à 85% de beta-tricalcium phosphate commercialisé par Medtronic sous le nom de MasterGraft Matrix. Le volume de cette matrice varie selon l'application, 140 μL pour une application en site ectopique chez le rat, 5 mL pour une application de fusion vertébrale chez le lapin. Exemple 90 : Préparation d'implants éponge de collagène entourant un CRM contenant un complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000383] Implant 21 : L'Implant 16 est enroulé autour d'un CRM sec de volume
5.0 mL (5,0 * 1,0 * 1,0 cm) avant implantation chez le lapin.
Exemple 91 : Préparation d'implants CRM / complexe rhBMP-2/ Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000384] Implant 22 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 μl_ par 35 μl_ d'une solution à 0,14 mg/mL de BMP-2 soit 5 μg de BMP-2, à 14 mg/mL de Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 8 μmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 11 μmol pendant 15 minutes, puis par 35 μl_ d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 13 μmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour l'implantation.
Exemple 92 : Préparation d'implants CRM / complexe rhG DF-S /Polymère 2 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'histidine lyophilisés
[000385] Implant 23 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe GDF-5/Polymère 2 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 140 μL par 35 μL d'une solution à 0,86 mg/mL de GDF-5 soit 30 μg de GDF-5, à 14 mg/mL de Polymère 2, soit 0,5 mg de Polymère 2, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 8 μmol pendant 15 minutes, puis par 17,5 μL d'une solution d'histidine à 0,34 M, soit 6 μmol pendant 15 minutes et enfin par 17,5 μL d'une solution de chlorure de calcium à 0,74 M, soit 13 μmol. Les CRM sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Les CRM lyophilisés sont imbibés par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.
Exemple 93 : Préparation d'implants CRM / complexe rhBMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate [000386] Implant 24 : Des implants ostéogéniques basés sur une coprécipitation du complexe BMP-2/Polymère 1 et de particules de phosphate de calcium ont été obtenus après imprégnations successives d'un CRM d'un volume de 5.0 mL par 1250 μL d'une solution à 0,52 mg/mL de BMP-2 soit 650 μg de BMP-2, à 20 mg/mL de Polymère 1, soit 25 mg de Polymère 1, à 0,23 M de phosphate de sodium soit 288 μmol, et à 0,31 M d'hydrogénocarbonate de sodium soit 388 μmol pendant 15 minutes, puis par 1250 μL d'une solution à 0,38 M de chlorure de calcium, soit 477 μmol pendant 15 minutes. Les CRM sont prêts pour l'implantation.
Contre-exemple 1 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 20 μg de rhBMP-2
[000387] Implant 25 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml dans un tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. [000388] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 25 est de 20 μg.
Contre-exemple 2 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 2 μg de rhBMP-2 [000389] Implant 26 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml dans un tampon de type INFUSE sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile, de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. [000390] La dose de rhBMP-2 dans l'implant 26 est de 2 μg.
Contre-Exemple 3 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant S μg de rhBMP-7
[000391] Implant 27 : Des implants ostéogéniques lyophilisés à base de BMP-7 ont été obtenus après imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée cylindrique de 198 μL par 140 μL d'une solution à 0,036 mg/mL de BMP-7 soit 5 μg. Les implants sont ensuite congelés à -800C et lyophilisés. Les éponges lyophilisées sont imbibées par 45 μL de sang autologue 30 min avant implantation.
Contre-Exemple 4 : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 2,3 mg de rhBMP-2
[000392] Implant 28 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm soit un volume d'épongé de 4.52 mL par 1600 μL d'une solution à 1,45 mg/mL de rhBMP-2 soit 2,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. Contre-Exemple S : Préparation d'implants éponge de collagène contenant 1,3 mg de rhBMP-2
[000393] Implant 29 : Des implants ostéogéniques ont été obtenus par imprégnation d'une éponge de collagène de type-I réticulée de dimensions 5,02 x 2,54 x 0,35 cm soit un volume d'épongé de 4.52 mL par 1600 μl_ d'une solution à
0,80 mg/mL de rhBMP-2 soit 1,3 mg. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation.
Exemple 94 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations
[000394] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B. P. 109, 69592 l'ArbresIe) sont utilisés pour cette étude. [000395] Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine® solution, Vetoquinol, France). [000396] Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site). L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non- absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement. [000397] A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETILΘ25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).
[000398] Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL®, VETOQUINOL, France). Une observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et cotée selon le barème suivant : 0: absence, 1 : faible, 2: modéré, 3: marqué, 4: important.
[000399] Chacun des explants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des explants sont ensuite déterminés. Chaque explant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.
Résultats :
[000400] Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 placée dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique. Les résultats des différents exemples sont résumés dans le tableau suivant.
[000401] Une dose de 20 μg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant 25, Contre-exemple 1) conduit à l'obtention d'expiants ossifiés de 38 mg de masse moyenne après 21 jours.
[000402] Une dose de 2 μg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Implant
26, Contre-exemple 2) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours. [000403] En présence de complexe rhBMP-2/polymère 1, de chlorure de calcium et de phosphate de sodium, une dose de rhBMP-2 de 2 μg lyophilisée dans l'éponge de collagène (Implant 1, Exemple 70 et Implant 2, Exemple 71) permet de générer des explants ossifiés contrairement à la rhBMP-2 seule à la même dose. De plus, ces explants sont de masse 4 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la rhBMP-2 seule. Cette formulation permet donc d'améliorer l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. [000404] De façon équivalente, l'ajout d'ascorbate de sodium à l'éponge de collagène contenant le complexe rhBMP-2/polymère 1 et du chlorure de calcium (Implant 3, Exemple 72) permet également d'obtenir des explants ossifiés de masse 4 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la rhBMP-2 seule. Cette formulation permet également d'améliorer l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. Exemple 95 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations en fusion postéro-latérale
[000405] L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinducteur des différentes formulations dans un modèle de fusion postérolatérale chez le lapin. Cette étude est menée suivant le protocole expérimental décrit dans la publication de JP Lawrence (Lawrence, J. P. et al., Spine 2007, 32 (11), 1206- 1213.) à l'exception du traitement à la nicotine puisque Pinduction d'une pseudarthrose n'est pas souhaitée.
[000406] La fusion des vertèbres est évaluée par palpation manuelle de la colonne vertébrale explantée. L'absence de mobilité entre les vertèbres est synonyme de fusion. La colonne vertébrale est également analysée par micro-CT à 12 semaines pour évaluer la présence d'os au niveau des vertèbres. Les résultats obtenus pour les différents implants sont résumés dans le tableau suivant.
1.
[000407] De ces études de fusion postérolatérale chez le lapin, il ressort que le complexe BMP-2 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium permet de réduire les doses de BMP-2 d'un facteur 4 à 8 par rapport la BMP-2 seule à 1,3 mg de BMP-2 seule, dose efficace dans ce modèle d'après la littérature, avec des résultats de fusion équivalents. Même à des doses de BMP-2 de 0,16 mg, la fusion postérolatérale est observée chez tous les lapins dans le cas du complexe BMP-2 polymère co-précipité avec le sel de phosphate de calcium. [000408] Les implants contenant le complexe BMP-7 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium conduisent également à la fusion des vertèbres pour des doses faibles de BMP-7, 0,33 mg de BMP-7 par implant. Les résultats de la littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est pas atteinte même à une dose de 3.5 mg de BMP-7, dose bien supérieure à celle étudiée (Yao, G. et al., Spine 2008, 33 (18), 1935-1942.)-
[000409] Les implants contenant le complexe GDF-5 polymère co-précipités avec le sel de phosphate de calcium conduisent également à 100% de fusion vertébrale pour des doses faibles de GDF-5, 750 μg de GDF-5 par implant. Les résultats de la littérature démontrent qu'une fusion vertébrale chez le lapin de 100% n'est pas atteinte même à une dose de 2.5 mg de GDF-5, dose bien supérieure à celle étudiée (Magit, David P. ét al., Spine 2006, 31 (19), 2180-2188.).

Claims

REVENDICATIONS
1. Coprécipitat consistant en au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide anionique sous sa forme insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat étant sous forme divisée.
2. Coprécipitat selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou hydratée seuls ou en mélange.
3. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par l'oxalate de calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de calcium.
4. Coprécipitat selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par des sels mixtes formés entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques tels que les phosphates, mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, les carbonates, les hydroxydes et les éventuels anions portés par les bases.
5. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique.
6. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.
7. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes de formule générale IX :
Formule IX
- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7,
- F' étant une fonction amide,
- G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R.
- lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+ ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre.
8. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffées de formule générale X.
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2),
- L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther,
- r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide
Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, - CO2H.
9. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides anioniques comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2) , fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane répondant à la formule générale I suivante :
Polysaccharide
F [ Trp ]o
[ Trp ]n i
Formule I
le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1,
(i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K. - lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
10. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides anioniques fonctionnalisés de formule générale III suivante :
Formule III
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, • AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R. Ledit amino-acide hydrophobe étant choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin ou choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou décarboxylés. t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1.
Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+, K+.
ll. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine- alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison.
12. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo- attractant et angiogénique est le PDGF.
13. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB.
14. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB.
15. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins du GDF-5 et du PDGF-BB.
16. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine- alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
17. Kit pour la préparation d'un implant ostéogénique comprenant au moins :
a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium,
18. Kit selon la revendication précédente, comprenant en outre, une composition supplémentaire comprenant au moins une base.
19. Kit selon la revendication précédente, comprenant en outre, une deuxième base peut être additionnée aux compositions b, c ou d.
20. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la composition comprenant la protéine ostéogénique peut comprendre également le polysaccharide pour former le complexe.
21. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la composition comprenant le complexe peut également comprendre le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
22. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la composition comprenant le polysaccharide peut comprendre également le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
23. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la composition comprenant le sel de calcium soluble peut comprendre également une base.
24. Kit comprenant : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique, au moins une base et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
25. Kit comprenant : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un polysaccharide anionique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.
26. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 25, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.
27. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes de formule générale IX :
Formule IX
- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7,
- F' étant une fonction amide,
- G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, ISI ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R.
- lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+ ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre.
28. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffées de formule générale X. Polysaccharide
Q
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2),
- L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther,
- r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide
Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, - CO2H.
29. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides anioniques comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2) , fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane répondant à la formule générale I suivante :
Formule I
le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), • F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1,
(i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K. - lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
30. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le polysaccharide anionique est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides anioniques fonctionnalisés de formule générale III suivante :
Formule III
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R. Ledit amino-acide hydrophobe étant choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin ou choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou décarboxylés.
t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1.
Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+, K+.
31. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison.
32. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce que le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF.
33. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB.
34. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB.
35. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend au moins du GDF-5 et du PDGF-BB.
36. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 30, caractérisé en ce quel la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la
BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
37. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 36, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est choisi dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate de calcium.
38. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 36, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est du chlorure de calcium.
39. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 38, caractérisé en ce que le sel soluble d'un anion susceptible de former un précipité avec l'ion calcium est un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe constitué des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO4 3" l'ion hydrogénophosphate HPO4 2" et l'ion dihydrogénophosphate H2PO4 ".
40. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 38, caractérisé en ce que la base est choisie parmi les bases minérales ou organiques.
41. Kit selon la revendication 40, caractérisé en ce que la base minérale est choisie dans le groupe constitué par la soude, l'hydrogénocarbonate de sodium ou le carbonate de sodium.
42. Kit selon la revendication 40, caractérisé en ce que la base organique est choisie dans le groupe constitué par les aminés et les acides aminés déprotonés.
43. Kit selon la revendication 40, caractérisé en ce que la base organique est choisie dans le groupe constitué par l'imidazole et ses dérivés notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la serine.
44. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 43, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte.
45. Kit selon selon la revendication 44, caractérisé en ce que la matrice est une matrice organique choisie dans le groupe constitué par les hydrogels et/ou les matrices à base de polymère réticulé.
46. Kit selon la revendication 45, caractérisé en ce que l'hydrogel est un hydrogel obtenu par réticulation chimique ou physique de chaîne de polymères
47. Kit selon la revendication 45, caractérisé en ce que le polymère réticulé est du collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
48. Kit selon la revendication 46, caractérisé en ce que l'hydrogel est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, et polyacrylamides et les acides polyacryliques.
49. Kit selon la revendication 45, caractérisé en ce que l'hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
50. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 50, caractérisé en ce que les compositions constituant le kit sont des solutions aqueuses.
51. Kit selon l'une des quelconques des revendications 17 à 50, caractérisé en ce que les compositions constituant le kit sont des lyophilisats.
52. Procédé de préparation du coprécipitat tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 16, qui comprend une étape de coprécipitation est obtenue par : - la précipitation du complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique par addition de la solution de sel d'ions calcium, - la précipitation des ions calcium par l'addition d'une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium à un pH déterminé, le complexe entre le polymère anionique et la protéine ostéogénique étant obtenu par addition de la solution de polysaccharide anionique anionique à la solution de protéine ostéogénique.
53. Procédé selon la revendication 52, caractérisé en ce que la précipitation du sel de calcium est effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de phosphate soluble.
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