MX2011005275A - Nueva forma de administración de complejos de proteína osteogénica. - Google Patents

Nueva forma de administración de complejos de proteína osteogénica.

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MX2011005275A
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Olivier Soula
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones ontogénicas compuestas de un coprecipitado que contiene al menos una sal de calcio insoluble y al menos un complejo entre una proteína ontogénica y un polisacárido, el coprecipitado está en forma dividida. La invención también se refiere a los procesos para preparar el coprecipitado en forma dividida, que contienen al menos una sal de calcio insoluble y al menos un complejo entre una proteína ontogénica y un polisacárido. La invención también se refiere a las formulaciones, productos farmacéuticos y dispositivos médicos que comprende dicho coprecipitado.

Description

NUEVA FORMA DE ADMINISTRACIÓN DE COMPLEJOS DE PROTEÍNA OSTEOGÉNICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de formulaciones osteogénicas y más particularmente a formulaciones de proteínas osteogénicas que pertenecen a la familia de Proteínas Morfogenéticas Óseas, BMPs .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) , son factores de crecimiento involucrados en mecanismos de osteoinducción. Las BMPs también conocidas como proteínas osteogénicas (OP) , fueron inicialmente caracterizadas por Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893) . Estas proteínas aisladas de hueso cortical, tienen la capacidad de inducir la formación de hueso en un gran número de animales (Urist MR. Science 1965; 150, 893) .
Las BMPs son expresadas en la forma de propéptidos los cuales, después de la maduración post-traduccional, tienen una longitud de entre 104 y 139 residuos. Tienen gran homología de secuencia entre ellas y tienen estructuras tridimensionales similares. En particular, contienen tienen seis residuos de cisteína involucrados en puentes disulfuro intramoleculares que forman un "nudo de cisteína" (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103; Schlunegger MP, Mol. Biol. 1993; 231, 445). Algunas de ellas tienen una séptima cisteina también involucrada en un puente disulfuro intermolecular, el cual es el origen de la formación del dimero (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103).
En su forma activa, las BMPs son ensambladas en homodimeros o aún en heterodímeros, como se ha descrito por Israel et al., (Israel DI, Growth Factors, 1996, 13(3-4), 291) . Las BMP diméricas interactúan con receptores de la transmembrana de tipo BMPR (Mundy et al., Growth Factors, 2004, 22(4), 233). Este reconocimiento es el origen de una cascada de señalización intracelular que involucra especialmente, las proteínas Smad, de este modo resultando en la activación o represión de los genes objetivo.
Con la excepción de BMP 1 y 3, las BMPs juegan un papel directo e indirecto en la diferenciación de células mesenquimales, causando su diferenciación en osteoblastos (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 200, 85A 1544-1552). También tienen propiedades de quimiotácticas e inducen proliferación, diferenciación y angiogénesis .
Ciertas BMPs recombinantes humanas y, especialmente rhBMP-2 y rhBMP-7, han mostrado claramente una capacidad para inducir formación ósea In vivo en el hombre y han sido aprobadas para ciertas aplicaciones médicas. De este modo, la BMP-2 recombinante humana, dibotermina alfa de conformidad con el nombre no propietario internacional, es formulada en productos comercializados bajo el nombre InFUSE® en los Estados Unidos, y bajo el nombre InductOs® en Europa. Este producto es prescrito para la fusión de vértebras lumbares y para la regeneración ósea de la tibia por lo que se conocen como fracturas "sin uniones". En el caso de InFUSE® para la fusión de vértebra lumbar, la intervención quirúrgica consiste, en primer lugar, remojar una esponja de colágeno en una solución de rhBMP-2, y después colocar la esponja en una jaula hueca, Jaula LT, previamente implantada entre la vértebra .
La BMP-7 recombinante humana, eptotermina alfa de conformidad con el nombre no propietario internacional, tiene las mismas indicaciones terapéuticas como BMP-2 y es la base de dos productos: el Implante OP-1 para fracturas abiertas de la tibia y Masilla OP-1 para la fusión de las vértebras lumbares. El Implante OP-1 está compuesto de un polvo que contiene rhBMP-7 y colágeno que debe tomarse en una solución salina al 0.9%. La pasta obtenida es entonces aplicada a la fractura durante una intervención quirúrgica. La Masilla OP-1 está en la forma de dos polvos: uno que contiene rhBMP-7 y colágeno, el otro carboximetilcelulosa (CMC) . Durante la intervención quirúrgica, la CMC es reconstituida con solución salina al 0.9% y mezclada con rhMBP-7 y el colágeno. La pasta de este modo obtenida es aplicada al sitio a ser tratado.
La administración de proteínas osteogénicas es un problema importante debido a su inestabilidad y de las necesidades que origina obtener formulaciones osteogénicas que contienen una cantidad mínima de proteína osteogénica. Esto es para evitar los efectos secundarios generados por altas concentraciones de estas proteínas, y también debido a los costos de estas proteínas.
Muchas formulaciones han sido y están siendo desarrolladas, por ejemplo, aquellas citadas en la revisión por Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine 2002, 27 (16 Suppl. 1), S16-S23.)/ en las cuales se enfatiza la importancia de la naturaleza del sistema de suministro.
Los sistemas de suministro usados deben hacer posible incrementar el tiempo de retención de las proteínas en el sitio de administración, para obtener liberación total de la cantidad de proteína usada y evitar una liberación excesivamente precipitada que puede conducir a difusión fuera del sitio de administración.
El sistema de suministro usado también debe ser capaz de servir como una matriz para el crecimiento óseo en el sitio a ser tratado, mientras al mismo tiempo define los límites de este crecimiento óseo en el sitio a ser tratado.
Se usan cuatro tipos de material en sistemas de suministro en la actualidad: polímeros naturales, polímeros sintéticos, materiales inorgánicos, y mezclas de estos materiales .
Sin embargo, ninguno de los sistemas desarrollados ha hecho posible reducir significantemente la dosis de BMP. Esto está asociado, entre otros, ya sea con la inestabilidad de la proteina en la formulación, o con su escasa biodisponibilidad debido a la estructura del soporte.
Con respecto a polímeros naturales, se usan colágeno, hialuronanos, fibrina, quitosanes, alginatos y otros polisacáridos naturales.
Aunque las esponjas a base de colágeno recombinante hacen posible superar la mayoría de las desventajas conocidas de este polímero natural, la introducción de la proteína osteogénica en las esponjas no es satisfactoria en la actualidad.
Los otros polisacáridos naturales en la forma de hidrogeles esencialmente tienen el defecto de ser resorbidos también rápidamente, a menos que sean reticulados anteriormente en la forma de ágeles, lo cual conduce a algunas desventajas como aquellas mencionadas previamente para las esponjas de colágeno.
Con respecto a polímeros sintéticos, los más comúnmente usados son polímeros poli (a-hidroxiácidos) tales como poliláctido (PLA) , poliglicólido (PLG) y copolímeros de los mismos (PLGA) .
Las principales desventajas de estos polímeros son la reducción del pH debido a su degradación y las reacciones de inflamación que pueden inducir.
Con respecto a materiales inorgánicds, se han desarrollado sistemas de suministro que combinan fosfatos de calcio con una proteina osteo-inductora.
Entre estos, se hará mención de cerámicas a base de fosfato de calcio, tales como hidroxiapatito (HAP) y fosfato tricálcico (TCP) , y fosfatos de calcio "no cerámicos", por ejemplo, cementos a base de fosfato de calcio (CPCs) .
Se ha conocido desde los años 70, que las cerámicas de fosfato de calcio pueden ser de valor en la reconstrucción ósea, como se recuerda en la revisión por M. Bohner (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl. 4, 37-47.).
Sin embargo, se acepta que la dosis efectiva de BMP-2 es superior en una cerámica que en una esponja de colágeno. Un estudio clínico de fusión posterolateral en hombres (Boden, S. D. et al., Spine 2002, 27 (23), 2662-2673.) reporta que la dosis de BMP-2 (40 mg) es superior con gránulos de BCP (60% HAP y 40% TCP), un producto desarrollado por la compañía Medtronic Sofamor, que en una esponja de colágeno que no contiene fosfato de calcio (12 mg) .
Para superar esta desventaja, se han desarrollado un número muy grande de sistemas basados en fosfatos de calcio no cerámicos, entre los cuales están cementos de fosfato de calcio. Los cementos se descubrieron en los años 80 por Brown y Chow y corresponden a la siguiente definición: "Los cementos de fosfato de calcio están constituidos de una solución acuosa y de uno o más fosfatos de calcio. Cuando se mezclan juntos, el (los) fosfato (s) de calcio se disuelve (n) y precipita (n) como una sal de fosfato de calcio menos soluble. Durante la precipitación, los cristales de fosfato de calcio se agrandan y superponen, lo cual conduce a la rigidez mecánica del cemento." (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl . 4, 37-47. ) .
Un articulo por Kim (Kim, H. D. et al., Methods Mol Biol. 2004, 238, 49-64.) describe el uso de un cemento desarrollado por la compañía Etex, alfa-BSM, con BMP-2. Este nuevo producto sin embargo conduce a actividad de osteoinducción de la matriz.
Sin embargo, la BMP-2 introducida en esta matriz pierde una gran parte de su actividad, conduciendo a la necesidad de incrementar la cantidad de BMP-2 incorporada. De este modo, una dosis de 40 pg de BMP-2 se emplea en el modelo de formación de hueso ectópico en ratas, en lugar de 20 µg de BMP-2 empleada en una esponja de colágeno.
En realidad, los cementos tienen dos desventajas. Primero, el (los) fosfato (s) de calcio que son sus precursores deben ser sintetizados anteriormente bajo- condiciones que son incompatibles con proteínas. De este modo, la patente US 5 650 176 describe las condiciones de reacción necesarias para la preparación de fosfato de calcio amorfo, el cual es uno de los compuestos de alfa-BSM. Estas condiciones son incompatibles con proteínas puesto que se usa una cantidad muy grande de hidróxido de sodio. Además, estos productos requieren purificación vigorosa puesto que se usan compuestos tóxicos tales como nitrato de calcio.
Otros ejemplos de cementos tales como aquellos descritos por la compañía Graftys en la patente EP 1 891 984 Al se obtienen bajo condiciones que son incompatibles con proteínas puesto que se usa diclorometano en la síntesis del fosfato de calcio. Los cementos descritos por la compañía Lisopharm en la patente US 2009/0 155 320 se obtienen en la presencia de hidróxido de calcio, el cual es también incompatible con proteínas.
Además, en general, la formación de cemento se obtiene haciendo reaccionar una sal de fosfato de calcio soluble con una sal de fosfato de calcio sólida tratada a más de 400°C para hacerla reactiva. La reacción entre estos dos compuestos es incontrolada, principalmente exotérmica, y conduce a un cemento de estructura monolítica que secuestra proteínas en su volumen.
En la Patente US 563 461, se hace mención de la presencia de "agujeros reactivos" en el sólido, sin indicar si esta es nociva a la estabilidad química de la BMP-2.
Para reducir las pérdidas de proteína en la masa de sólido formado, se ha descrito en la patente US 5 650 176 que es ventajoso agregar a la mezcla de reacción compuestos efervescentes capaces de reducir la naturaleza "monolítica" del cemento.
Debido a estos mejoramientos, no se puede evitar la observación que las cantidades de proteína requeridas para obtener una formación ósea en el modelo de rata ectópica permanecen altas.
Con respecto a sistemas mezclados que tienen hasta la fecha no han permitido superar los problemas mencionados anteriormente .
En resumen, los sistemas descritos en la técnica anterior que se refieren al uso de polímeros sintéticos, polímeros naturales o materiales inorgánicos tales como cementos de fosfato de calcio o cerámicas no satisfacen completamente las especificaciones impuestas para aplicaciones en la reparación ósea.
El Solicitante ha, en su haber, desarrollado un nuevo procedimiento que consiste en colocar proteína osteogénica en contacto con sales de calcio insolubles y sales de fosfato solubles, las cuales pueden satisfacer las especificaciones impuestas para aplicaciones en reparación ósea .
Este nuevo procedimiento hace posible, por un lado, precipitar la proteína, mientras se evita cualquier degradación química en contacto con los reactivos presentes, y, por otro lado, coprecipitarla con una sal de calcio insoluble, preferiblemente fosfato de calcio, el coprecipitado está en forma dividida, lo cual limita muy marcadamente las pérdidas en la masa de sólido como se observa con cementos.
De este modo, el Solicitante ha desarrollado nuevas composiciones osteogénicas compuestas de un coprecipitado que contiene al menos una sal de calcio insoluble y al menos un complejo entre una proteína osteogénica y un polisacárido, el coprecipitado está en forma dividida.
La conjunción de estos dos eventos hace posible obtener formulaciones muy osteogénicas que contienen cantidades mucho menores de proteína.
Estas nuevas composiciones de este modo tienen la ventaja de que contienen cantidades más pequeñas de proteína, lo cual es el principal objetivo, para reducir los efectos secundarios después de la administración a pacientes.
Además, permiten una reducción en el costo de tratamientos reduciendo la cantidad de proteína, puesto que estas proteínas son muy costosas.
Se conocen las solicitudes de patente provisiona 61/129 023 y 61/129 617 a nombre del Solicitante, los contenidos completos de las cuales las solicitudes están incorporadas en la presente solicitud por referencia, la cual describe y reivindica composiciones osteogénicas que comprenden al menos una proteina osteogénica, una sal soluble de un catión divalente y una matriz.
Se conocen las solicitudes de patente provisionales 61/129 011 y 61/129 618 a nombre del Solicitante, los contenidos completos de las cuales las solicitudes son incorporadas en la presente solicitud de patente por referencia, la cual describe y reivindica composiciones osteogénicas que comprenden al menos una proteina osteogénica, al menos una proteina angiogénica, una sal soluble de un catión divalente, opcionalmente un polisacárido aniónico y opcionalmente una matriz.
El Solicitante ha descrito los números de solicitud provisional 61/129 616 y 61/129 012, el contenido de las cuales se incorpora en la presente solicitud por referencia, y la cual describe y reivindica composiciones osteogénicas que comprenden al menos un complejo de polisacárido aniónico/ proteina osteogénica, una sal soluble de al menos un catión divalente y una matriz.
El solicitante ha descrito en el número de solicitud provisional US 61/193 216, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente solicitud por referencia, y la cual describe y reivindica composiciones osteogénicas que comprenden al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica, una sal soluble de al menos un catión divalente y un polímero que forma un hidrogel.
Se conoce la solicitud de patente provisional US 61/193 217 presentada el 6 de Noviembre de 2008 a nombre del Solicitante, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente solicitud por referencia, la cual describe y reivindica composiciones osteogénicas que comprenden al menos una proteína osteogénica, una sal soluble de al menos un catión divalente, y un polímero que forma un hidrogel.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con respecto a la presente solicitud, el Solicitante también ha desarrollado el proceso para preparar el coprecipitado, en forma dividida, que contiene al menos una sal de calcio insoluble y al menos un complejo entre una proteína osteogénica y un polisacárido .
La invención también se refiere a las formulaciones, los productos farmacéuticos y los dispositivos médicos que comprenden el coprecipitado.
Las composiciones y kits para usar este proceso y para obtener el coprecipitado también son invenciones descritas aquí posteriormente.
La coprecipitación se obtiene por: - precipitación del complejo entre el polímero aniónico y la proteína osteogénica por adición de la solución de una sal de iones de calcio, - precipitación de los iones de calcio por adición de una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluole a un pH dado .
En una modalidad, el coprecipitado resulta de precipitaciones simultáneas.
En una modalidad, el coprecipitado resulta de precipitaciones secuenciales .
El complejo entre el polímero aniónico y la proteína osteogénica se obtiene agregando la solución de polisacárido aniónico a la solución de proteína osteogénica.
En una modalidad, la precipitación de la sal de calcio toma lugar en la forma de fosfato de calcio, por adición de una solución de fosfato soluble.
La naturaleza y forma del coprecipitado puede variar como una función del pH de las soluciones puestas en contacto, puesto que las sales de fosfato de calcio tienen diferentes fases sólidas como una función del pH y como una función del polisacárido aniónico y la proteína que constituye el complejo.
La invención se refiere a un coprecipitado constituido de al menos un complejo entre una proteína osteogénica y un polisacárido en su forma no disuelta y al menos una sal de calcio insoluble, el coprecipitado está en forma dividida.
En una modalidad, también comprende al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente .
En una modalidad, la sal de calcio insoluble se elige del grupo constituido de ortofosfatos de calcio en forma anhidra o hidratada, sola o como una mezcla.
En una modalidad, el coprecipitado también comprende al menos una sal de calcio insoluble elegida del grupo constituido de oxalato de calcio, ascorbato de calcio, carbonato de calcio y sulfato de calcio.
Dichas sales de calcio insolubles pueden ser sales mezcladas formadas entre iones de calcio catiónicos e iones aniónicos tales como fosfatos mono-, di- o tribásicos, carboxilatos de polisacáridos, carbonatos, hidróxidos y los posibles aniones originados por bases.
Los ortofosfatos de calcio son sales que resultan de la neutralización de las varias acideces de ácido fosfórico con sales de calcio, y, de conformidad con la literatura, los valores de pKa varían de 2.12 a 12.67 a 25°C.
Los principales ortofosfatos de calcio insolubles son difosfatos de calcio, DCP, anhidros o dihidratados, ortofosfatos de calcio, OCP, trifosfatos de calcio, TCP, hidroxiapatitos fosfocálcicos, HAP o PCA, y tetrafosfato de calcio, TTCP.
Los complejos de proteína osteogénica/polímero aniónico consisten de los complejos descritos en la solicitud PCT/EP2008/059832 a nombre del Solicitante.
Son insolubilizados por adición de una sal de calcio soluble tal como se describe en las solicitudes FR 08 54621 y 61/129 616.
Esta coprecipitación como una función del efecto deseado es opcionalmente obtenida en la presencia de una base que permite al pH ser ajustado a un valor predeterminado.
Se hace posible obtener una composición química sólida, en forma dividida, la cual especialmente hace posible controlar el suministro de la proteína osteogénica contenida en la composición.
Esta composición química sólida, en forma dividida, se obtiene espontáneamente bajo condiciones de temperatura ambiente, y su estado dividido es estable bajo condiciones fisiológicas in vitro.
En una modalidad, la invención consiste de un kit para preparar un implante osteogénico que comprende al menos: a - una composición que comprende al menos una proteína osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble .
En una modalidad, el kit también comprende una composición adicional que comprende al menos una base.
En una modalidad, una segunda base puede ser agregada a las composiciones b, c o d.
Algunas de estas composiciones pueden ser combinadas antes de la formación del coprecipitado para reducir el número de viales.
En una modalidad, la composición que comprende la proteína osteogénica también puede comprender el polisacárido para formar el complejo.
La composición que comprende la proteína osteogénica o la composición que comprende el complejo también puede comprender la sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y/o una base.
En una modalidad, la composición que comprende el polisacárido también puede comprender la sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y/o una base .
En una modalidad, la composición que comprende la sal de calcio soluble también puede comprender una base.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos una proteína osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una base .
En esta modalidad, una segunda base, la cual puede ser idéntica o diferente que la base de la composición d, puede ser agregada a las composiciones b y c.
En una modalidad, el kit comprende a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base, d - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble.
En esta modalidad, una segunda base, la cual puede ser idéntica o diferente que la base de la composición c, puede ser agregada a las composiciones b y d.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos una proteína osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una base, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble .
En esta modalidad, una segunda base que es idéntica a o diferente de la base de la composición b puede ser agregada a las composiciones c y d.
En una modalidad, el kit comprende a - una composición que comprende al menos una proteína osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal, de calcio insoluble, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una base .
En esta modalidad, una segunda base, la cual puede ser idéntica o diferente que la base de la composición d, puede ser agregada a las composiciones b y c.
En una modalidad, el kit comprende a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y al menos una base.
En esta modalidad, una segunda base, la cual puede ser idéntica o diferente que la base de la composición d, puede ser agregada a las composiciones b y c.
En una modalidad, el kit comprende a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una base .
En esta modalidad, una segunda base, la cual puede ser idéntica o diferente que la base de la composición d, puede ser agregada a las composiciones b y c.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico, al menos una base y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, c - una composición que comprende al menos una base .
En esta modalidad, una segunda base que es idéntica a, o diferente de la base de la composición c puede ser agregada a las otras composiciones.
En una modalidad,, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base.
En esta modalidad, una segunda base que es idéntica a, o diferente de la base de la composición c puede ser agregada a la composición b.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos una proteína osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base, c - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble .
En esta modalidad, una segunda base que es idéntica a, o diferente de la base de la composición b puede ser agregada a las otras composiciones.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, c - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble .
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, c - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y al menos una base.
En esta modalidad, una segunda base que es idéntica a, o diferente de la base de la composición c puede ser agregada a las otras composiciones.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteina osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteína osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteína osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y al menos una base, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble.
En una modalidad, el kit comprende: a - una composición que comprende al menos un complejo de polisacárido aniónico/proteína osteogénica y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y al menos una base, b - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base.
En una modalidad, la composición que comprende al menos una proteína osteogénica también comprende al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente .
En una modalidad, el kit también comprende al menos una matriz orgánica o una matriz mineral o una matriz mezclada.
En una modalidad, las composiciones que constituyen el kit son soluciones acuosas.
En una modalidad, las composiciones que constituyen el kit son liofilizados .
En una modalidad, algunas de las composiciones que constituyen el kit son liofilizados .
En esta modalidad, los liofilizados son rehidratados antes de la reacción, con agua o una de las otras composiciones en solución.
Dé este modo, por ejemplo, la composición que comprende la proteina osteogénica en forma liofilizada puede ser rehidratada con la solución que comprende un polisacárido aniónico, o con la solución que comprende un polisacárido aniónico y una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y/o una base.
En una modalidad, las formulaciones, dispositivos médicos y productos farmacéuticos que comprenden el precipitado son suspensiones acuosas.
En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas y productos que comprenden el precipitado son liofilizados.
En esta modalidad, los liofilizados son rehidratados antes del uso, con solución salina fisiológica o sangre .
El término "proteína osteogénica" significa un factor de crecimiento osteogénico o BMP, sola o en combinación con una BMP elegida del grupo de BMPs (Proteínas Morfogenéticas Óseas) terapéuticamente activas.
Más particularmente, las proteínas osteogénicas son elegidas del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, solas o en combinación.
Las BMPs usadas son BMPs humanas recombinantes, obtenidas de conformidad con las técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica o adquiridas de proveedores, por ejemplo la compañía Research Diagnostic Inc. (USA) .
El término "factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente" significa proteínas tales como PDGF, especialmente PDGF-BB, VEGF o FGF, especialmente FGF-2.
En una modalidad, la proteína osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación, y al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es PDGF.
En una modalidad, la composición comprende al menos BMP-2 y PDGF-BB .
En una modalidad, la composición comprende al menos BMP-7 y PDGF-BB.
En una modalidad, la composición comprende al menos GDF-5 y PDGF-BB.
En una modalidad, la proteina osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación, y al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es VEGF.
En una modalidad, la proteina osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación, y al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es FGF.
La sal de calcio soluble es una sal de calcio cuyo anión se elige del grupo constituido de cloruro, D-gluconato, formiato, D-sacarato, acetato, L-lactato, glutamato y aspartato .
En una modalidad, la sal de calcio soluble es cloruro de calcio.
El término "sal soluble de un anión capaz de formar un precipitado con el ión de calcio" significa una sal soluble cuyo anión se elige del grupo constituido de aniones de fosfato que comprenden el ión de fosfato P043~, el ión de fosfato de hidrógeno HP02~ y el ión de fosfato de dihidrógeno H2P04".
En una modalidad, un segundo anión elegido del grupo constituido de iones de oxalato, ascorbato, carbonato y sulfato también se agrega a la composición que comprende un anión de fosfato.
Las sales solubles de un anión que pueden formar un precipitado con el ión de calcio son elegidas del grupo constituido de fosfatos de sodio, oxalato de sodio, ascorbato de sodio, carbonato de sodio, sulfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio.
El término "polisacárido aniónico" significa un polisacárido elegido del grupo de polisacáridos funcionalizados con derivados hidrofóbicos .
En una modalidad, los polisacáridos son elegidos del grupo de derivados de polisacáridos que comprenden predominantemente enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), funcionalizados con al menos un derivado de triptofano como se describe en la solicitud de patente FR 08/55567.
Estos polisacáridos están principalmente constituidos de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2). Pueden ser neutrales, es decir, no portan funciones aniónicas o de ácidos y portan funciones de ácidos.
Son funcionalizados con al menos un derivado de triptofano, indicado Trp: el derivado de triptofano es injertado o ligado a los polisacáridos por acoplamiento con una función de ácido, la función de ácido posiblemente es una función de ácido de un polisacárido aniónico y/o una función de ácido originada por un enlazador R ligado al polisacárido vía una función F, la función F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, - F es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, El Trp es un residuo de un derivado de triptofano, L o D, producido por acoplamiento entre la amina de triptofano y al menos un ácido originado por el grupo R y/o un ácido originado por el polisacárido aniónico.
De conformidad con la invención, el polisacárido predominantemente que comprende enlaces glicosidicos de tipo (1,4), (1,3) y/o (1,2), funcionalizado con al menos un derivado de triptofano, puede corresponder a la fórmula general I siguiente: Fórmula I el polisacárido está constituido principalmente de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteróátomos , tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • Trp es un residuo de un derivado de triptofano, L o D, producido por acoplamiento entre la amina del derivado de triptofano y al menos un ácido originado por el grupo R y/o un ácido originado por el polisacárido aniónico, n representa la fracción en mole de los grupos R sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, o representa la fracción en mole de las funciones de ácido de los polisacáridos que son sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, i representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el grupo R por unidad de sacárido y es entre 0 y 2, j representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el polisacárido aniónico por unidad de sacárido y es entre 0 y 1, (i + j) representa la fracción en mole de las funciones de ácido por unidad de sacárido y es entre 0.1 y 2, cuando R no es sustituido con Trp, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un metal álcali tal como Na o K, cuando el polisacárido es un polisacárido aniónico, cuando una o más funciones de ácido del polisacárido no son sustituidas con Trp, entonces son salificadas con un catión, preferiblemente un catión de metal álcali tal como Na+ o K+, los polisacáridos son anfifilicos a pH neutral .
En una modalidad, F es ya sea un éster, un carbonato, un carbamato o un éter.
En una modalidad, el polisacárido es predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) .
En una modalidad, el polisacárido predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) se elige del grupo constituido de pululano, alginato, hialuronano, xilano, galacturonano o una celulosa soluble en agua.
En una modalidad, el polisacárido es un pululano.
En una modalidad, el polisacárido es un alginato. En una modalidad, el polisacárido es un hialuronano .
En una modalidad, el polisacárido es un xilano.
En una modalidad, el polisacárido es un galacturonano .
En una modalidad, el polisacárido es una celulosa soluble en agua.
En una modalidad, el polisacárido es predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,3) .
En una modalidad, el polisacárido predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,3) es un curdlano.
En una modalidad, el polisacárido es predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,2).
En una modalidad, el polisacárido predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,2) es una inulina .
En una modalidad, el polisacárido es predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) .
En una modalidad, el polisacárido predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) es un glucano.
En una modalidad, el polisacárido es predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) y (1,2) .
En una modalidad, el polisacárido predominantemente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) y (1,2) es mañano .
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención se caracteriza porque el grupo R se elige de los siguientes grupos: o sales de los mismos de cationes de metal álcali.
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención se caracteriza porque el derivado de triptofano se elige del grupo constituido de triptofano, triptofanol, triptofanamida y 2-indoletilamina, y las sales de los mismos de un catión de metal álcali.
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención se caracteriza porque el derivado de triptofano se elige de los ésteres de triptofano de la fórmula II: E es un grupo, el cual puede ser: un alquilo Ci a Ca lineal o ramificado, un alquilarilo o arilalquilo C6 a C2o lineal o ramificado .
El polisacárido puede tener un grado de polimerización m de entre 10 y 10 000.
En una modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 1000.
En otra modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 500.
En una modalidad, los polisacáridos son elegidos del grupo de dextranos funcionalizados con aminoácidos hidrofóbicos tales como triptofano y derivados de triptofano como se describe en la solicitud de patente FR 07/02316.
De conformidad con la invención, el dextrano funcionalizado puede corresponder a la fórmula general III siguiente: Dextrano Fórmula III • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, · AA es un residuo de aminoácido hidrofóbico, L o D, producido por acoplamiento entre la amina del aminoácido y un ácido originado por el grupo R, - t representa la fracción en mole del sustituyente F-R- [AA] n por unidad glicosidica, y es entre 0.1 y 2, - p representa la fracción en mole de R sustituido con AA y es entre 0.05 y 1, y cuando R no es sustituido con AA, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un catión de metal álcali tal como Na+, K+, dicho dextrano es anfifilico a pH neutral.
En una modalidad, el catión de metal álcali es Na+ .
En una modalidad, F es ya sea un éster, un carbonato, un carbamato o un éter.
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención es un carboximetil dextrano de la fórmula IV.
Fórmula IV o el ácido correspondiente.
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención es un éster monosuccinico de dextrano de la fórmula V: Fórmula V o el ácido correspondiente.
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención se caracteriza porque el grupo R se elige de los siguientes grupos: o las sales de los mismos de cationes de metal álcali.
En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención se caracteriza porque el aminoácido hidrofóbico se elige de derivados de triptofano, tales como triptofano, triptofanol, triptofanamida o 2-indoletilamina, y sales de los mismos de un catión de metal álcali.
En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención se caracteriza porque los derivados de triptofanos se eligen de ésteres de triptofano de la fórmula II como se define previamente.
En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención es un carboximetil dextrano modificado con triptofano, de la fórmula VI: Fórmuía VI En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención es un éster monosuccínico de dextrano modificado con triptofano, de la fórmula VII: En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención se caracteriza porque el aminoácido hidrofóbico se elige de fenilalanina, leucina, isoleucina y valina, y alcohol, amida o derivados descarboxilados de los mismos.
En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención se caracteriza porque los derivados fenilalanina, leucina, isoleucina y valina se eligen de los ésteres de estos aminoácidos, de la fórmula VIII: Fórmula VIII E es como se define previamente.
En una modalidad, el dextrano de conformidad con la invención se caracteriza porque el aminoácido hidrofóbico es fenilalanina, y alcohol, amida o derivados descarboxilados de los mismos.
El dextrano puede tener un grado de polimerización m de entre 10 y 10 000.
En una modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 1000.
En otra modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 500.
En una modalidad, los polisacáridos son elegidos del grupo de polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo tales como aquellos descritos en la solicitud de patente FR 08/05506, al menos uno de los cuales es sustituido con un derivado de alcohol hidrofóbico, indicado Ah: dicho alcohol hidrofóbico (Ah) es injertado o ligado al polisacárido aniónico vía un brazo de acoplamiento R, el brazo de acoplamiento está ligado al polisacárido aniónico vía una función F' , la función F' que resulta del acoplamiento entre la función amina del enlazador R y una función carboxilo del polisacárido aniónico, y del brazo de acoplamiento está ligada al alcohol hidrofóbico via una función G que resulta del acoplamiento entre una función carboxilo, isocianato, tioácido o alcohol del brazo de acoplamiento y una función del alcohol hidrofóbico, las funciones carboxilo del polisacárido aniónico que no son sustituidas están en la forma de carboxilato de un catión, preferiblemente de un catión de metal álcali tal como Na+ o K+.
· F' es una función amida, • G es ya sea una función éster, tioéster, carbonato o carbamato, • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, opcionalmente que comprende uno o más heteroátomos, tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, Ah es un residuo de un alcohol hidrofóbico, producido por acoplamiento entre la función hidroxilo del alcohol hidrofóbico y al menos una función electrofilica originadas por el grupo R, el polisacárido que comprende grupos funcionales carboxilo es anfifilico a pH neutral.
El polisacárido que comprende grupos funcionales carboxilos parcialmente sustituidos con alcoholes hidrofóbicos se elige de polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo de la fórmula general IX: Polisacárido + carboxilo F I R I G ¡ Ah Formula IX - en la cual q representa la fracción en mole de funciones carboxilo del polisacárido que son sustituidas con F-R-G-Ah y es entre 0.01 y 0.7, - F' , R, G y A corresponden a las definiciones dadas anteriormente, y cuando la función carboxilo del polisacárido no es sustituida con F' -R-G-Ah, entonces la función carboxilo al (los) grupo (s) del polisacárido son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un catión de metal álcali tal como Na+ o K+.
En una modalidad, los polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo son polisacáridos que portan naturalmente grupos funcionales carboxilo y son elegidos del grupo constituido de alginato, hialuronano y galacturonano .
En una modalidad, los polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo son polisacáridos sintéticos obtenidos de polisacáridos que comprenden naturalmente grupos funcionales carboxilo o de polisacáridos neutrales en los cuales al menos 15 grupos funcionales carboxilo por 100 unidades de sacáridos han sido injertados, de la fórmula general X: X - los polisacáridos naturales son elegidos del grupo de polisacáridos principalmente constituidos de enlaces glicosídicos de tipo (1,6) y/o (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), - L es un enlace que resulta del acoplamiento entre el enlazador Q y una - función OH del polisacárido, y es ya sea una función éster, tioéster, carbonato, carbamato o éter, - r representa la fracción en mole de los sustituyentes L-Q por unidad de sacárido del polisacárido, - Q es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos , tales como O, N y/o S, y que comprende al menos un grupo funcional carboxilo, -CO2H.
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1, 6) .
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1, 6) es dextrano .
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4).
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) se elige del grupo constituido de pululano, alginato, hialuronano, xilano, galacturonano o una celulosa soluble en agua.
En una modalidad, el polisacárido es un pululano.
En una modalidad, el polisacárido es un alginato.
En una modalidad, el polisacárido es un hialuronano.
En una modalidad, el polisacárido es un xilano.
En una modalidad, el polisacárido es un galacturonano .
En una modalidad, el polisacárido es una celulosa soluble en agua.
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1.3) .
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,3) es un curdlano .
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,2) .
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,2) es una inulina.
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1.4) y (1,3) .
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) es un glucano.
En una modalidad, el polisacárido está principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) y (1,2) .
En una modalidad, el polisacárido principalmente constituido de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y (1,3) y (1,2) es mañano .
En una modalidad, el polisacárido de conformidad con la invención se caracteriza porque el grupo Q se elige de los siguientes grupos: En una modalidad, r es entre 0.1 y 2.
En una modalidad, r es entre 0.2 y 1.5.
En una modalidad, el grupo R de conformidad con la invención se caracteriza porque se elige de aminoácidos.
En una modalidad, los aminoácidos se eligen de a-aminoácidos.
En una modalidad, los a-aminoácidos se eligen de a-aminoácidos naturales.
En una modalidad, los a- minoácidos naturales se eligen de leucina, alanina, isoleucina, glicina, fenilalanina, triptofano y valina.
En una modalidad, el alcohol hidrofóbico se elige de alcoholes grasos.
En una modalidad, el alcohol hidrofóbico se elige de alcoholes constituidos de una cadena alquilo saturada o insaturada que comprende de 4 a 18 carbonos.
En una modalidad, el alcohol graso se elige de alcohol miristílico, alcohol cetílico, alcohol estearílico, alcohol cetearílico, alcohol butílico, alcohol oleílico y lanolina.
En una modalidad, el alcohol hidrofóbico se elige de derivados de colesterol.
En una modalidad, el derivado de colesterol es colesterol .
En una modalidad, el alcohol hidrofóbico Ah se elige de tocoferóles.
En una modalidad, el tocoferol es a-tocoferol.
En una modalidad, el a-tocoferol es a-tocoferol racémico .
En una modalidad, el alcohol hidrofóbico se elige de alcoholes que portan un grupo arilo.
En una modalidad, el alcohol que porta un grupo arilo se elige de alcohol bencílico y alcohol fenetílico.
El polisacárido puede tener un grado de polimerización m de entre 10 y 10 000.
En una modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 1000.
En otra modalidad, tiene un grado de polimerización m de entre 10 y 500.
En una modalidad, el polisacárido es elegido del grupo constituido de dextrano funcionalizado con triptofano, dextrano funcionalizado con octanol fenilalaninato, dextrano funcionalizado con octanol glicinato, dextrano funcionalizado con dodecanol glicinato o dextrano funcionalizado con éster etílico de triptofano.
Para neutralizar los compuestos acídicos presentes en la mezcla, las bases se eligen de bases orgánicas o minerales .
Entre las bases minerales, se hará mención de hidróxido de sodio, carbonato hidrógeno de sodio y carbonato de sodio.
Entre las bases orgánicas, se hará mención de aminas y aminoácidos desprotonados .
Entre las bases orgánicas, se hará mención de imidazol y derivados de los mismos, especialmente histidina, prolina, etanolamina y serina.
En una modalidad, una matriz orgánica puede ser usada para promover la reparación; se elige de matrices a base de colágeno natural purificado, esterilizado y reticulado .
Polímeros naturales tales como colágeno son componentes de la matriz extracelular que promueve la unión, migración y diferenciación celular. Tienen la ventaja de ser extremadamente biocompatibles y son degradados por mecanismos de digestión enzimática. Las matrices a base de colágeno son obtenidas de colágeno fibrilar de tipo I o IV extraído de tendón o hueso de porcino o bovino. Estos colágenos son primero purificados, antes de ser reticulados y después esterilizados .
También se pueden obtener por resorción en medio acídico de hueso autólogo, conduciendo a la pérdida de la mayoría de los componentes mineralizados, pero a preservación de las proteínas de colágeno o no colágeno, que incluyen factores de crecimiento. Estas matrices desmineralizadas también pueden ser preparadas en forma inactiva después de la extracción con agentes caotrópicos. Estas matrices están esencialmente compuestas de colágeno insoluble y reticulado de tipo I.
También pueden ser usados materiales mezclados, por ejemplo una matriz que combina colágeno y partículas inorgánicas. Estos materiales pueden estar en la forma de un material compuesto con propiedades mecánicas reforzadas o en la forma de una "masilla" en la cual el colágeno actúa como un aglutinante.
Los materiales inorgánicos que pueden ser usados comprenden esencialmente cerámicas a base de fosfato de calcio tales como hidroxiapatito (HA) , trifosfato de calcio (TCP) , fosfato de calcio bifásico (BCP) o fosfato de calcio amorfo (ACP) , el valor principal del cual es que tienen una composición química muy similar a aquella del hueso. Estos materiales tienen buenas propiedades mecánicas y son inmunológicamente inertes. Estos materiales pueden estar en varias formas, tales como polvos, granulados o bloques. Estos materiales tienen velocidades de degradación muy diferentes como una función de su composición. De este modo, el hidroxiapatito se degrada muy lentamente (varios meses) , mientras el trifosfato de calcio se degrada más rápidamente (varias semanas) . Es por esta razón que se desarrollaron fosfatos de calcio bifásicos, puesto que tienen velocidades de resorción intermedias. Estos materiales inorgánicos se conocen por ser principalmente ^osteo-conductores .
En una modalidad, la matriz orgánica es un hidrogel reticulado .
Un hidrogel reticulado se obtiene reticulando cadenas poliméricas. Los enlaces covalentes inter-cadenas definen una matriz orgánica. Los polímeros que pueden ser usados para constituir una matriz orgánica se describen en la revisión por Hoffman titulada Hidrogeles para aplicaciones biomédicas (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12) .
En una modalidad, el implante puede comprender un hidrogel no reticulado.
El término "hidrogel no reticulado" significa una red de polímero tri-dimensional hidrofilico capaz de adsorber una gran cantidad de agua o de líquidos biológicos (Peppas et al., Eur. J. Farm. Biofarm. 2000, 50, 27-46). Este hidrogel está constituido de interacciones físicas y por lo tanto no se obtiene por reticulación química de las cadenas poliméricas .
La lista de polímeros que forman hidrogeles es muy larga, y una lista larga pero no exhaustiva se proporciona en la revisión por Hoffman titulada Hidrogeles para aplicaciones biomédicas (Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, 43, 3-12). Entre estos polímeros están polímeros sintéticos y polímeros naturales. Otra revisión que cubre polisacáridos que forman hidrogeles hace posible elegir un polímero que es útil para la invención (Alhaique et al. J. Control. Reléase, 2007, 119, 5-24) .
En una modalidad, el polímero que forma un hidrogel se elige del grupo de polímeros sintéticos, que incluyen copolímeros de etilen glicol y de ácido láctico, copolímeros de etilen glicol y de ácido glicólico, poli (N-vinilpirrolidona) , ácidos polivinílicos, poliacrilamidas y ácidos poliacrílicos .
En una modalidad, el polímero que forma un hidrogel se elige del grupo de polímeros naturales, que incluyen ácido hialurónico, queratán, pululano, pectina, dextrano, celulosa y derivados de celulosa, ácido algínico, xantano, carragenano, quitosán, condroitina, colágeno, gelatina, polilisina, fibrina y sales de los mismos biológicamente aceptables .
En una modalidad, el polímero natural se elige del grupo de polisacáridos que forman hidrogeles, que incluyen ácido hialurónico, ácido algínico, dextrano, pectina, celulosa y derivados de los mismos, pululano, xantano, carragenano, quitosán, condroitina, y sales de los mismos biológicamente aceptables.
En una modalidad, el polímero natural se elige del grupo de polisacáridos que forman hidrogeles, que incluyen ácido hialurónico, ácido algínico, y sales de los mismos biológicamente aceptables.
En una modalidad, el hidrogel puede ser preparado solo antes de implantar o inyectar.
En una modalidad, el hidrogel puede ser preparado y almacenado en una jeringa prellenada para después ser implantado o inyectado.
En una modalidad, el hidrogel puede ser preparado por rehidratación de un liofilizado solo antes de implantar o inyectar, o puede ser implantado en forma deshidratada.
Entre las varias matrices las cuales pueden ser usadas, se hará mención, por medio del ejemplo, de esponjas de colágeno tales como Helistat® (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey) , DBMs (Matriz Ósea Desmineralizada) solas o como una mezcla con otros materiales orgánicos tales como polisacáridos, glicerol o gelatinas tales como Osteofil® (Medtronic), Allomatrix® ( right), Grafton® (Osteotech) , DBX® (MTF/Synthes) , Bioset® (Regeneration Technologies), matrices constituidas de fases minerales tales como Vitoss® (Orthivista) , Osteoset® (Wright) o matrices mezcladas tales como MasterGraft® (Medtronic) , Healos® (Depuy Spine) , CopiOs® (Zimmer) , Matriz de Injerto Óseo de Colágeno Sunnmax (Sunmax) .
El sistema después de la formación del coprecipitado está constituido de dos fases, una fase líquida y una fase sólida.
En el resto de la especificación, cuando se emplea la noción de volumen, es el volumen total que comprende las dos fases.
Las cantidades por unidad de volumen en el producto que resulta después de mezclar en conjunto las composiciones de las varias formas del kit se proporcionan abajo y no comprenden las cantidades de iones de calcio o iones de fosfato que se originan de la matriz cuando las matrices minerales o mezcladas son usadas.
En una modalidad, las cantidades totales de las varias proteínas por unidad de volumen son entre 0.01 mg y 2 mg, preferiblemente entre 0.05 mg y 1.5 mg y más preferiblemente entre 0.1 mg y 1.5 mg por mi de suspensión obtenida .
Las cantidades totales de fosfatos por unidad de volumen son entre 0.02 mmol y 0.5 mmol y preferiblemente entre 0.05 y 0.25 mmol por mi de suspensión obtenida.
Las cantidades totales de calcio por unidad de volumen son entre 0.01 mmol y 1 mmol, preferiblemente entre 0.05 y 1 mmol y más preferiblemente entre 0.1 mmol y 0.5 mmol por unidad de volumen.
El porcentaje de iones de calcio en la fase sólida es entre 60% y 95% de los iones de calcio introducidos.
Las cantidades totales de polisacáridos por unidad de volumen son entre 1 y 100 mg, preferiblemente entre 2 y 40 mg por mi de suspensión obtenida. El porcentaje de polisacáridos en la fase sólida es mayor que 80% del polisacárido introducido.
Las cantidades de base usadas corresponden a aproximadamente 0.1 a 2 equivalentes con relación a los protones proporcionados por los iones de fosfatos.
Como una función de volúmenes usados y del número de composiciones, las cantidades usadas en las composiciones de partida pueden ser determinadas por cálculo. Esto puede ser realizado por las varias modalidades de los kits.
En una modalidad, para un implante vertebral, las dosis de factor de crecimiento osteogénico serán entre 0.01 mg y 20 mg, preferiblemente entre 0.05 mg y 8 mg, preferiblemente entre 0.1 mg y 4 mg y más preferiblemente entre 0.1 mg y 2 mg, mientras las dosis comúnmente aceptadas en la literatura son entre 8 y 12 mg.
En una modalidad, para un implante vertebral, las dosis del factor de crecimiento angiogénico serán entre 0.05 mg y 8 mg, preferiblemente entre 0.1 mg y 4 mg y más preferiblemente entre 0.1 mg y 2 mg.
En una modalidad, para la formulación de un implante que comprende el coprecipitado de conformidad con la invención, se prepara un kit que comprende tres viales, los viales contienen: en el primero, entre 2 y 10 mg de proteina osteogénica en forma liofilizada, en el segundo, entre 2 y 6 mi de una solución de un polisacárido a una concentración de entre 10 y 50 mg/ml y de una mezcla equimolar de fosfato hidrógeno de sodio Na2HP04 y de fosfato dihidrógeno de sodio NaH2P04 con una concentración de entre 0.15 y 0.50 M, en el tercero, entre 2 y 6 mi de una solución de cloruro de calcio a una concentración de entre 0.25 y 0.90 M.
En una modalidad, el segundo vial también contiene una solución de bicarbonato de sodio a una concentración de entre 0.05 y 0.8 M.
En una modalidad, el segundo y tercer viales también contienen una solución de histidina a una concentración de entre 0.02 y 0.2 M.
En una modalidad, el tercer vial también contiene una solución de prolina a una concentración de entre 0.05 y 0.3 M.
Las soluciones se agregan simultáneamente o sucesivamente antes del implante, a una esponja de colágeno con un volumen de entre 15 y 30 mi.
En una modalidad, para la formulación de un implante que comprende el coprecipitado de conformidad con la invención, se mezclan en conjunto tres soluciones, que comprenden: en la primera, un volumen de entre 1 y 3 mi que contiene una proteina osteogénica a una concentración de entre 0.33 y 2 mg/ml, en la segunda, un volumen de entre 1 y 3 mi que contiene un polisacárido a una concentración de entre 5 y 15 mg/ml y una mezcla equimolar de fosfato hidrógeno de sodio Na2HP04 y de fosfato dihidrógeno de sodio NaH2P04 con una concentración de entre 0.05 y 0.15 M, en la tercera, un volumen de entre 1 y 3 mi que contiene cloruro de calcio a una concentración de entre 0.25 y 0.50 M.
En una modalidad, una solución de bicarbonato de sodio a una concentración de entre 0.20 y 0.4 M se agrega a la mezcla obtenida.
En una modalidad, una solución de histidina a una concentración de entre 0.02 y 0.15 M se agrega a la mezcla obtenida .
En una modalidad, una solución de prolina a una concentración de entre 0.05 y 0.3 M se agrega a la mezcla obtenida .
La mezcla que comprende el precipitado de conformidad con la invención después se liofiliza.
Al tiempo de uso, se rehidrató con agua inyectable y/o sangre hasta aproximadamente 35% del volumen inicial.
La invención también se refiere al uso de las composiciones de la invención por implante, por ejemplo, para relleno de defectos óseos, para realizar fusiones vertebrales o reparaciones maxilo-facial, o para tratar fracturas óseas, en particular del tipo pseudartrosis .
La invención también se refiere al uso de las composiciones de la invención por inyección para el tratamiento de defectos óseos, especialmente aquellos causados por osteoporosis, y para cualquier otra patología la cual se puede tratar percutáneamente .
La invención también se refiere al uso de las composiciones de conformidad con la invención como implantes óseos .
En una modalidad, las composiciones se pueden usar en combinación con un dispositivo prostético de la prótesis vertebral o tipo de caja de fusión vertebral.
La invención también se refiere a métodos terapéuticos o quirúrgicos que usan las composiciones en reconstrucción ósea.
En estos variados usos terapéuticos, el tamaño de la matriz y la cantidad del factor de crecimiento osteogénico depende del volumen del tamaño a ser tratado.
Ejemplos de varias modalidades de la invención se proporcionan aquí posteriormente.
Ejemplos de kits se proporcionan como guías no limitantes .
Ejemplo 1: Preparación de un kit que contiene 5 viales Kit 1: Un kit de 5 viales comprende un vial que contiene proteína osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución y un vial que contiene una base en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 2: Preparación de un kit que contiene 4 viales Kit 2: Un kit de 4 viales comprende un vial que contiene proteina osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución y un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 1: Preparación de un kit que contiene 4 viales Kit 1: Un kit de 4 viales comprende un vial que contiene proteína osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero y una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución y un vial que contiene una base en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 2: Preparación de un kit que contiene 4 viales Kit 2: Un kit de 4 viales comprende un vial que contiene proteína osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble y una base en forma liofilizada o solución y un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 3: Preparación de un kit que contiene 4 viales Kit 3: Un kit de 4 viales comprende un vial que contiene el complejo entre la proteína osteogénica y un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución y un vial que contiene una base en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 4: Preparación de un kit que contiene 3 viales Kit 4: Un kit de 3 viales comprende un vial que contiene proteína osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero y una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble y una base en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 5: Preparación de un kit que contiene 3 viales Kit 5: Un kit de 3 viales comprende un vial que contiene proteína osteogénica en forma liofilizada o solución, un vial que contiene un polímero y una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 8: Preparación de un kit que contiene 3 viales Kit 8: Un kit de 3 viales comprende un vial que contiene el complejo entre la proteina osteogénica y un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de calcio soluble y una base en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 9: Preparación de un kit que contiene 3 viales Kit 9: Un kit de 3 viales comprende un vial que contiene el complejo entre la proteína osteogénica y un polímero en forma liofilizada o solución, un vial que contiene una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, y un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 10: Preparación de un kit que contiene 2 viales Kit 10: Un kit de 2 viales comprende un vial que contiene el complejo entre la proteína osteogénica y un polímero liofilizado y una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, y un vial que contiene una sal de calcio soluble en forma liofilizada o solución.
Ejemplo 11: Preparación de un kit que contiene 2 viales Kit 11: Un kit de 2 viales comprende un vial que contiene el complejo entre la proteina osteogénica y un polímero liofilizado y una sal de fosfato soluble en forma liofilizada o solución, y un vial que contiene una sal de calcio soluble y una. base en forma liofilizada o solución.
Se proporcionan ejemplos de síntesis de polímeros como indicaciones no limitantes.
Ejemplo 12: Preparación de un dextrano funcionalizado con triptofano Polímero 1 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con la sal de sodio de L-triptofano, obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 07/02316. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio, no modificado o modificado con triptofano, es decir, t en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 1.03. La fracción en mol de metilcarboxilato sodio modificado con triptofano, es decir, p en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 0.36.
Ejemplo 13: Preparación de un dextrano funcionalizado con octanol fenilalaninato Polímero 2 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina, obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos ) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente PCT/IB2009007054. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio, no modificado o modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina, es decir, r en la fórmula X de la presente solicitud de patente, es 1.11. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina, es decir, q en la fórmula IX de la presente solicitud de patente, es 0.09.
La solución de polímero 2 al final de la producción es 30.45 mg/mL.
Ejemplo 14 : Preparación de un dextrano funcionalizado con octanol glicinato Polímero 3 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-glicina, obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 08/05506. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio, no modificado o modificado con el éster octanoico de L-glicina, es decir, r en la fórmula X de la presente solicitud de patente, es 1.09. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-glicina, es decir, q en la fórmula IX de la presente solicitud de patente, es 0.22.
Ejemplo 15: Preparación de un dextrano funcionalizado con triptofano Polímero 4 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con la sal de sodio de L-triptofano, obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 70 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 07/02316. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio, no modificado o modificado con triptofano, es decir, t en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 1.14. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con triptofano, es decir, p en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 0.41.
Ejemplo 16: Preparación de un dextrano funcionalizado con octanol fenilalaninato Polímero 5 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 08/05506. La fracción en mol de sodio metilcarboxilato, no modificado o modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina, es decir, r en la fórmula X de la presente solicitud de patente, es 1.12. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con el éster octanoico de L-fenilalanina, es decir, q en la fórmula IX de la presente solicitud de patente, es 0.22.
Ejemplo 17: Preparación de un dextrano funcionalizado con dodecanol glicinato Polímero 6 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con el éster dodecanoico de L-glicina obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 08/05506. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio, no modificado o modificado con el éster dodecanoico de L-fenilglicina, es decir, r en la fórmula X de la presente solicitud de patente, es 1.04. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con el éster dodecanoico de L-glicina, es decir, q en la fórmula IX de la presente solicitud de patente, es 0.13.
Ejemplo 18: Preparación de un dextrano funcionalizado con el éster etílico de triptofano Polímero 7 es un dextran metilcarboxilato de sodio modificado con el éster etílico de L-triptofano obtenido de un dextrano con una masa molar con promedio en peso de 40 kg/mol (Pharmacosmos) de conformidad con el proceso descrito en la solicitud de patente FR 07/02316. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio no modificado o modificado con el éster etílico de triptofano, es decir, t en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 1.09. La fracción en mol de metilcarboxilato de sodio modificado con el éster etílico de triptofano, es decir, p en la fórmula III de la presente solicitud de patente, es 0.47.
Ejemplo 19: Preparación de una solución de un dextrano funcionalizado con triptofano Se preparó una solución concentrada del polímero 1 disolviendo 9.13 g de liofilizado del polímero 1 (contenido de agua de aproximadamente 25%) en 35.24 g de agua. La solución se agita por 30 minutos. La concentración del polímero 1 es 162.9 mg/g, determinada en el extracto seco. La densidad es 1.08. La concentración de polímero 1 es de esta forma 175.9 mg/mL.
Ejemplo 20: Preparación de una solución de un dextrano funcionalizado con octanol fenilalaninato Una solución del polímero 2 de 40 mg/g se preparó disolviendo 3.12 g de liofilizado del polímero 2 (contenido de agua de 14%) en 64 g de agua.
Ejemplo 21: Preparación de una solución de un dextrano funcionalizado con octanol glicinato Una solución del polímero 3 de 38 mg/g se preparó disolviendo 3.95 g de liofilizado del polímero 3 (contenido de agua de 4%) en 100 g de agua.
Ejemplos de soluciones o liofilizados de proteína osteogénicas se proporcionan como guías no limitantes.
Ejemplo 22: Solución de rhBMP-2 en amortiguador HC1 1 mM Se preparan 10 mL de una solución 0.15 mg/ml de rhBMP-2 agregando 10 mL de una solución HC1 1 mM a 1.5 mg de rhBMP-2 liofilizado. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 23: Solución de rhBMP-2 en Amortiguador infundido Se preparó 1 1 de amortiguador infundido disolviendo, en un matraz graduado de 1 1 rellenado con 800 mL de agua, 5 g de sacarosa, 25 g de glicina, 3.72 g de ácido glutámico, 0.11 g de cloruro de sodio y 0.11 g de polisorbato 80. El pH de esta solución entonces se ajustó a 4.5 agregando 16.8 mL de hidróxido de sodio 1 N. El matraz graduado finalmente se rellenó hasta la marca de graduación para obtener el amortiguador infundido. Se preparó 1 mL de una solución de rhBMP-2 a 1.5 mg/ml en el amortiguador infundido, agregando 1 mL del amortiguador a 1.5 mg de rhBMP-2 liofilizado. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente, a través de una membrana de 0.22 um La solución puede también ser liofilizada.
Ejemplo 24: Solución de rhBMP-7 en un amortiguador HCl 10 itiM Se preparó una solución de rhBMP-7 a 3.8 mg/ml agregando 1 mL de una Solución HCl 1 mM a 3.8 mg de rhBMP-7 liofilizado. El pH de esta solución es 2.2. Esta solución se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 25: Solución de rhBMP-7 en un amortiguador de lactosa al 5% pH 3.5 Se preparó una solución de rhBMP-7 a 3.8 mg/ml agregando 7.8 mL de una solución de lactosa al 5% cuyo pH se ha fijado a 3.5 agregando HCl 1 M a 30.3 mg de rhBMP-7 liofilizado. El pH de esta solución es 3.5. Esta solución se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 26: Solución de rhGDF-5 en un amortiguador HCl 10 mM Se preparó 1 mL de una solución de rhGDF-5 a 1.5 mg/ml agregando 1 mL de una solución HCl 10 mM a 1.5 mg de rhGDF-5 liofilizado. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Se proporcionan ejemplos de preparación de soluciones de sales de fosfato solubles como guias no limitantes .
Ejemplo 27: Solución de fosfato de sodio Se preparó una solución de fosfato de sodio 1 M en matraz graduado de una mezcla equimolar de fosfato hidrógeno de sodio anhidro y fosfato dihidrógeno de sodio (Sigma) . Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Se prepararon soluciones de fosfato de sodio más diluidas a partir de la solución base descrita anteriormente.
Se proporcionan ejemplos de preparación de soluciones de sales de calcio solubles como guias no limitantes .
Ejemplo 28: solución de cloruro de calcio 2M Solución 1: Una solución de cloruro de calcio 2M se preparó en matraz graduado a partir de cloruro de calcio anhidro o deshidratado (Sigma) . Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 29: solución de cloruro de calcio 0.75M Solución 2: Una solución de cloruro de calcio 0.75M se preparó diluyendo la solución de cloruro de calcio 2M descrita en el ejemplo precedente. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 30: solución de acetato de calcio 0.75M Solución 3: Una solución de acetato de calcio 0.75M se preparó en matraz graduado a partir de acetato de calcio (Sigma) . Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 31: solución de gluconato de calcio 0.75M Solución 4: Una solución de gluconato de calcio 0.75M se preparó en matraz graduado a partir de gluconato de calcio (Sigma) . Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplos de preparación de soluciones de bases se proporcionan como ilustraciones no limitantes.
Ejemplo 32: solución de histidina 1M Solución 5: Una solución de histidina 1 se preparó en un matraz graduado de 1 1 disolviendo 155.2 g de L-histidina (Sigma) en el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 33: solución de prolina 2M Solución 6: Una solución de prolina 2M se preparó en un matraz graduado de 1 1 agregando 230.2 g de L-prolina (Sigma) , 200 mL de hidróxido de sodio 10 N y el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 34: solución de serina 2M Solución 7: una solución de serina 2M se preparó en un matraz graduado de 1 1 agregando 210.2 g de L-serina (Sigma) , 200 mL de hidróxido de sodio 10 N y el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 35: solución de glicina 2M Solución 8: una solución de glicina 2M se preparó en un matraz graduado de 1 1 agregando 150.1 g de L-glicina (Sigma) , 200 mL de hidróxido de sodio 10 N y el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 36: solución de alanina 2M Solución 9: Una solución de alanina 2M se preparó en un matraz graduado de 1 1 agregando 178.2 g de L-alanina (Sigma) , 200 mL de hidróxido de sodio ION y el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 37: solución de lisina 2M Solución 10: Una solución de lisina 2M se preparó en un matraz graduado de 1 1 agregando 292.4 g de L-lisina (Sigma), 200 mL de hidróxido de sodio 10 N y el volumen de agua desionizada necesaria para alcanzar la marca de graduación. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Soluciones de concentración inferior de de estas bases variadas se obtienen por dilución ya sea con agua o con una solución de las sales de calcio previamente descritas.
Ejemplo 38: Solución de carbonato hidrógeno de sodio Una solución de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M se preparó en matraz graduado a partir de carbonato hidrógeno de sodio anhidro (Sigma) . Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Se prepararon Soluciones de carbonato hidrógeno de sodio más diluidas a partir de la solución base descrita anteriormente .
Ejemplo 39: Solución TRIS Una solución de tris (hidroximetil) aminometano 0.5 M se preparó en matraz graduado a partir de tris (hidroximetil) aminometano ultrapuro (Sigma) y se ajustó a pH 7.4 usando ácido clorhídrico 1M. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Se proporcionan ejemplos de preparación de soluciones que comprende un polímero y una sal de fosfato soluble como guías no limitantes.
Ejemplo 40: Solución que comprende polímero 1 y fosfato de sodio a pH 6.5 Solución 11: Una solución que comprende polímero 1 a 40 mg/mL y fosfato 0.45 M se preparó mezclando 8.6 mL de la solución de polímero 1 a 175.9 mg/mL descrito en el Ejemplo 15, 17 mL de la solución de fosfato de sodio 1 M descrita en el Ejemplo 27 y 11.9 mL de agua. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 41: Solución que comprende polímero 1 y fosfato de sodio Solución 12: Una solución que comprende polímero 1 a 40 mg/mL y fosfato de sodio a 0.23 M se preparó mezclando 5.5 mL de la solución de polímero 1 a 175.9 mg/g descrita en el Ejemplo 15, 5.5 mL de la solución de fosfato de sodio 1 M descrita en el Ejemplo 27 y 13.0 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 42: Solución que comprende polímero 2 y fosfato de sodio a pH 6.5 Solución 13: Una solución que comprende polímero 2 a 20 mg/mL y fosfato 0.45 M se preparó mezclando 10 mL de la solución de polímero 2 a 40 mg/g descrita en el Ejemplo 20, 9 mL de la solución de fosfato de sodio 1M descrita en el Ejemplo 27 y 1 mL de agua. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 43: Solución que comprende polímero 1, fosfato de sodio y carbonato de hidrógeno Solución 14: Una solución que comprende polímero 1 a 40 mg/mL, fosfato de sodio 0.23 M y carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M se preparó mezclando 5.5 mL de la solución de polímero 1 a 175.9 mg/g descrita en el Ejemplo 15, 5.5 mL de la solución de fosfato de sodio 1M descrita en el Ejemplo 27, 12.4 mL de a 0.6 M solución de carbonato hidrógeno de sodio obtenida diluyendo la solución base descrita en el Ejemplo 38 y 0.6 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 44: Solución que comprende polímero 1, fosfato de sodio e histidina Solución 15: Una solución que comprende polímero 1 a 40 mg/mL, fosfato de sodio 0.23 M y histidina 0.09 M se preparó mezclando 5.5 mL de la solución de polímero 1 a 175.9 mg/g descrita en el Ejemplo 15, 5.5 mL de la solución de fosfato de sodio 1M descrita en el Ejemplo 27, 10.8 mL de una solución de histidina obtenida 0.2 M diluyendo la solución base descrita en el Ejemplo 32 y 2.2 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 45: Solución que comprende polímero 2, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 16: Una solución que comprende polímero 2 a 10 mg/mL, fosfato de sodio a 0.23 M y carbonato hidrógeno de sodio a 0.31 M se preparó mezclando 3.45 mL de la solución de polímero 2 a 30.45 mg/mL descrita en el Ejemplo 13, 2.0 mL de la solución de fosfato de sodio 1.2 M obtenida en el Ejemplo 27, 2.7 mL de una solución de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M descrita en el Ejemplo 38 y 2.4 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 46: Solución que comprende polímero 5, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 17: Una solución que comprende polímero 5 a 20 mg/mL, fosfato de sodio a 0.23 y carbonato hidrógeno de sodio a 0.31 M se preparó mezclando 1.3 mL de la solución de polímero 5 a 36.87 mg/mL descrita en el Ejemplo 16, 0.45 mL de la solución de fosfato de sodio 1.2 M obtenida en el Ejemplo 27 y 0.6 mL de una solución de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M descrita en el Ejemplo 38. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 47: Solución que comprende polímero 6, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 18: Una solución que comprende polímero 6 a 20 mg/mL, fosfato de sodio a 0.23 M y carbonato hidrógeno de sodio a 0.31 M se preparó mezclando 1.0 mL de la solución de polímero 6 a 46.7 mg/mL descrita en el Ejemplo 17, 0.45 mL de la solución de fosfato de sodio 1.2 M obtenida en el Ejemplo 27, 0.6 mL de una solución de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M descrita en el Ejemplo 38 y 0.3 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 48: Solución que comprende polímero 7, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 19: Una solución que comprende polímero 7 a 40 mg/mL, fosfato de sodio a 0.23 M y carbonato hidrógeno de sodio a 0.31 M se preparó mezclando 1.26 mL de la solución de polímero 7 a 75.9 mg/mL descrita en el Ejemplo 18, 0.45 mL de la solución de fosfato de sodio 1.2 M obtenida en el Ejemplo 27, 0.6 mL de una solución de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M descrita en el Ejemplo 38 y 0.06 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Se proporcionan ejemplos de preparación de complejos entre proteina osteogénicas y polímeros como guías > no limitantes.
Ejemplo 49: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 1 Solución 20: se agregaron 22 µ? de una solución de rhBMP-2 a 1.46 mg/ml a 267 µ? de una solución de polímero 1 a 60.0 mg/ml y 351 pL de agua estéril. Esta solución de rhBMP-2 y de polímero 1 está a pH 7.4. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 50: Preparación de un complejo rhBMP-7/polímero 1 Solución 21: Se mezcló 50 µ? de una solución de rhBMP-7 a 1.5 mg/ml con 100 µ? de una solución de polímero 1 a 60.6 mg/ml. Esta solución de rhBMP-7 y de polímero 1 está a pH 7.4. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 51: Preparación de un complejo rhBMP-7/polímero 2 Solución 22: Se mezcló 50 µ? de una solución de rhBMP-7 a 0.15 mg/ml con 100 µ? de una solución de polímero 2 a 22.7 mg/ml. Esta solución de rhBMP-7 y de polímero 2 está a pH 7.4. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 52: Preparación de un complejo rhGDF-5/polímero 2 Solución 23: Se mezcló 50 µ? de una solución de rhGDF-2 a 1.5 mg/ml con 100 µ? de una solución de polímero 2 a 22.7 mg/ml. Esta solución de rhGDF-5 y de polímero 2 está a pH 7.4. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 µp?.
Ejemplo 53: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de fosfato de sodio Solución 24: Se recuperaron 184.0 mg de rhBMP-2 liofilizado en amortiguador infundido que contiene únicamente 7.85 mg de rhBMP-2 en 19 mL de la solución descrita en el Ejemplo 41. La solución se incubó por dos horas a 4°C. La solución obtenida es clara, y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 54: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 25: Se recuperaron 165.5 mg de rhBMP-2 liofilizado en amortiguador infundido que contiene únicamente 6.95 mg de rhBMP-2 en 17.1 mL en la solución descrita en el Ejemplo 43. Esta solución se incubó por dos horas a 4°C. La solución obtenida es clara, y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 55: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de fosfato de sodio e histidina Solución 26: Se recuperaron 165.5 mg de rhBMP-2 liofilizado en amortiguador infundido que contiene únicamente 6.95 mg de rhBMP-2 en 17.1 mL de la solución descrita en el Ejemplo 44. La solución se incubó por dos horas a 4°C. La solución obtenida es clara, y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 56: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 27: Se agregaron 1.98 mL de una solución de rhBMP-2 a 1.55 mg/mL en amortiguador infundido a 3.5 mL de la solución de polímero 1 a 174.7 mg/g. Después, también se agregaron 9.6 mL de una solución que contiene de fosfato de sodio 0.74 y de carbonato hidrógeno de sodio 1.2 M y 0.28 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente, y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 0.2 mg/mL de rhBMP-2, 40 mg/mL de polímero 1, de fosfato de sodio 0.45 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.75 M.
Ejemplo 57: Preparación de un complejo rhBMP-7/polímero 1 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 28: Se agregaron 1.71 mL de una solución de rhBMP-7 a 3.69 mg/mL en un amortiguador HCl 10 mM a 3.4 mL de la solución de polímero 1 a 175.9 mg/g descrita en el Ejemplo 15. Después, 3.3 mL de la solución de fosfato de sodio 1M descrita en el Ejemplo 27 y 7.5 mL de una solución de carbonato hidrógeno de sodio a 0.6 obtenida diluyendo la solución base descrita en el Ejemplo 38, y se agregaron 14.1 mL de agua estéril. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente, y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 0.2 mg/mL de rhBMP-7, 20 mg/mL de polímero 1, de fosfato de sodio 0.11 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.15 M.
Ejemplo 58: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 2 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 29: Se recuperaron 65.2 mg de un liofilizado de rhBMP-2 en amortiguador infundido en 10.5 mL de la solución 16. Esta solución se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 0.4 mg/mL de rhBMP-2, 10 mg/mL de polímero 2,. de fosfato de sodio 0.23 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M.
Ejemplo 59: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 5 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 30: Se recuperaron 25.7 mg de un liofilizado de rhBMP-2 en amortiguador infundido en 2.4 mL de la solución 17. Esta solución se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 1.5 mg/mL de rhBMP-2, 20 mg/mL de polímero 5, de fosfato de sodio 0.23 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M.
Ejemplo 60: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 6 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 31: Se recuperaron 24.8 mg de un liofilizado de rhBMP-2 en Amortiguador infundido en 2.4 mL de Solución 18. Esta solución se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 1.5 mg/mL de rhBMP-2, 20 mg/mL de polímero, 6, de fosfato de sodio 0.23 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M.
Ejemplo 61: Preparación de un complejo rhBMP-2/polímero 7 en la presencia de fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Solución 32: Se recuperaron 25.6 mg de un liofilizado de rhBMP-2 en Amortiguador infundido en 2.4 mL de Solución 19. Esta solución se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y se filtró asépticamente a través de una membrana de 0.22 um. La composición de la mezcla es 1.5 mg/mL de rhBMP-2, 40 mg/mL de polímero 7, de fosfato de sodio 0.23 M y de carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M.
Se proporcionan ejemplos de preparación de soluciones que comprende una sal de calcio soluble y una base como guías no limitantes.
Ejemplo 62: Solución de cloruro de calcio e histidina Solución 33: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75 M y 0.4 M histidina se preparó agregando 112.5 rtiL de una solución de cloruro de calcio 2M, 120 mL de una solución de histidina 1M y 67.5 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 63: Solución de cloruro de calcio y prolina Solución 34: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75 M y prolina 0.75 M se preparó agregando 112.5 mL de una solución de cloruro de calcio 2M, 112.5 mL de una solución de prolina 2M y 75 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 64: Solución de cloruro de calcio y glicina Solución 35: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75 M y glicina 0.75 M se preparó agregando 112.5 mL de una solución de cloruro de calcio 2 , 112.5 mL de una solución de glicina 2M y 75 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 65: Solución de cloruro de calcio y alanina Solución 36: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75 M y alanina 0.75 M se preparó agregando 112.5 mL de una solución de cloruro de calcio 2M, 112.5 mL de una solución de alanina 2M y 75 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 66: Solución de cloruro de calcio y lisina Solución 37: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75 M y 0.75 M lisina se preparó agregando 112.5 mL de solución de cloruro de calcio 2M, 112.5 mL de una solución de lisina 2M y 75 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplo 67: Solución de cloruro de calcio y serina Solución 38: Una solución que contiene cloruro de calcio 0.75M y serina 0.75 M se preparó agregando 112.5 mL de una solución de cloruro de calcio 2M, 112.5 mL de una solución de serina 2M y 75 mL de agua desionizada. Esta solución se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se filtró asépticamente en una membrana de 0.22 um.
Ejemplos de preparación de suspensiones inyectables que comprende un BMP, un polímero, una sal de calcio soluble, una sal de fosfato soluble y/o una base se proporcionan como guías no limitantes.
Ejemplo 68: Preparación de una suspensión inyectable de un complejo rhBMP-2/ polímero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Una suspensión osteogénica en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/ polímero 2 y de partículas de fosfato de calcio se obtuvo mezclando 400 pL de Solución 29 que contiene rhBMP-2 a 0.4 mg/mL, es decir, 160 pg de rhBMP-2, polímero 2 a 10 mg/mL, es decir, 4 mg de polímero 2, fosfato de sodio a 0.23 M, es decir, 92 umol, y carbonato hidrógeno de sodio 0.31 M, es decir, 124 umol, y 400 pL de una solución de cloruro de calcio 0.38 M, es decir, 153 umol. La suspensión obtenida se almacenó por 15 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección. Esta suspensión es inyectable con agujas de calibre 27.
Ejemplo 69: Preparación de una suspensión inyectable de un complejo rhBMP-2/ polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Una suspensión osteogénica en base a una precipitación del complejo BMP-2/ polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio se obtuvo mezclando 1250 pL de una solución que contiene BMP-2 a 0.52 mg/mL, es decir, 650 pg de BMP-2, polímero 1 a 20 mg/itiL, es decir, 25 mg de polímero 1, fosfato de sodio 0.23 M, es decir, 288 umol, y 0.31 M carbonato hidrógeno de sodio, es decir, 388 umol, y 1250 pL de una solución de cloruro de calcio 0.38 M, es decir, 477 umol. La suspensión obtenida se almacenó por 15 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección. Esta suspensión es inyectable con agujas de calibre 27.
Se proporcionan ejemplos de preparación de implantes que comprende un BMP, un polímero, una sal de calcio soluble, una sal de fosfato soluble y/o una base como guías no limitantes.
Los implantes descrito en los siguientes ejemplos se prepararon con una esponja de colágeno de de reticulación estéril tipo I tal como Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey) . El volumen de esta esponja varía de conformidad con la aplicación, 200 ]ÍL por una aplicación a un sitio ectópico en ratas, 4.5 mL por una aplicación de fusión vertebral en conejos.
Ejemplo 70: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polimero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 1: Se introdujeron 40 µ? de Solución 20 en una esponja de colágeno reticulada de 200 mm3. La solución se incubó por 30 minutos en la esponja de colágeno, seguido por adición de 10 µ? de una solución de cloruro de calcio a una concentración de 1.64 M. Finalmente, se agregaron 90 L de una solución de fosfato de sodio neutralizado a una concentración de 0.053 M obtenida mezclando 80 \i de fosfato de sodio (22.5 mg/mL) y 10 µL de ácido clorhídrico 1N a la esponja. La esponja después se congeló y liofilizó asépticamente. La dosis de rhBMP-2 en la esponja es 2 ug.
Ejemplo 71: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 2: Se introdujeron 40 µ? de Solución 20 en una esponja de colágeno reticulada de 200 mm3. La solución se incubó por 30 minutos en la esponja de colágeno, seguido por adición de 10 µ? de una solución de cloruro de calcio a una concentración de 6.85 M. Finalmente, se agregaron 90 µL de una solución neutralizada de fosfato de sodio a una concentración de 0.22 M obtenida mezclando 80 µL de fosfato de sodio (93.8 mg/mL) y 10 µL de ácido clorhídrico 1N a la esponja. La esponja después se congeló y liofilizó asépticamente. La dosis de rhBMP-2 es 2 µg.
Ejemplo 72: Preparación de esponja implantes del complejo de colágeno/BMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y ascorbato de sodio liofilizado Implante 3: Se introdujeron 40 µ? de Solución 20 en una esponja de colágeno reticulada de 200 mm3. La solución se incubó por 30 minutos en la esponja de colágeno, seguido por adición de 10 µ? de una solución de cloruro de calcio a una concentración de 1.64 mg/ml. Finalmente, se agregaron 80 µ?_ de una solución de ascorbato de sodio a una concentración de 0.41 M a la esponja. La esponja después se congeló y liofilizó asépticamente. La dosis de rhBMP-2 es 2 g.
Ejemplo 73: Preparación de esponja de implantes del complejo colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 4: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polimero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno, de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 2 mL a 0.325 mg/itiL de una solución de rhBMP-2, es decir, 650 µg de rhBMP-2, a 64.5 mg/iriL de polímero 1, es decir, 129 mg de polímero 1, y a 0.18 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 500 µL de una solución de cloruro de calcio 1.2M, es decir, 600 umol de cloruro de calcio, y finalmente 500 µ?^ de una hidróxido de sodio solución 0.54 M, es decir, 270 umol de hidróxido de sodio. Estos implantes después se congelaron a -80°C y liofilizaron. Cada una de las esponjas liofilizadas es mojada con 1 mL de sangre autologa 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 74: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 5: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 2 mL de una solución a 0.163 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 326 ]iq de rhBMP-2, a 32.5 mg/mL de polímero 1, es decir, 65 mg de polímero 1, y a 0.18 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 500 L de una solución de cloruro de calcio 1.2M, es decir, 600 umol, y finalmente 500 L de una solución de hidróxido de sodio 0.54M, es decir, 270 umol de hidróxido de sodio. Estos implantes después se congelaron a -80°C y liofilizaron. Cada una de las esponjas liofilizadas es mojada con 1 mL de sangre autologa 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 75: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 6: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 2 mL de una solución a 0.081 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 162 pg de rhBMP-2, a 16.3 mg/mL de polímero 1, es decir, 32.5 mg, y a 0.18 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 500 pL de una solución de cloruro de calcio 1.2M, es decir, 600 umol, y finalmente 500 pL de una solución de hidróxido de sodio 0.54M, es decir, 270 umol de hidróxido de sodio. Estos implantes después se congelaron a -80°C y liofilizaron. Cada una de las esponjas liofilizadas es mojada con 1 mL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante .
Ejemplo 76: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 4 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 7: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhB P-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 2 mL de una solución a 0.040 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 80 \iq de rhBMP-2, a 8 mg/mL de polímero 4, es decir, 16 mg, y a 0.18 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 500 pL de una solución de cloruro de calcio 1.2 , es decir, 600 umol, y finalmente 500 pL de una solución de hidróxido de sodio 0.54M, es decir, 270 umol de hidróxido de sodio. Estos implantes después se congelaron a -80 °C y liofilizaron . Cada una de las esponjas liofilizadas es mojada con 1 mL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 77: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polimero 4 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio Implante 8: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 1060 pL de una solución a 0.311 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 330 ]ig de rhBMP-2, a 62.3 mg/mL de polímero 4, es decir, 66 mg, y a 0.34 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 270 ]ih de una solución de cloruro de calcio 3.4M, es decir, 920 umol, y finalmente 270 uL de una hidróxido de sodio solución 1.37 M, es decir, 370 umol de hidróxido de sodio.
Ejemplo 78: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 4 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio Implante 9: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 1060 µ?? de una solución a 0.151 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 160 pg de rhBMP-2, a 30.2 mg/mL de polímero 4, es decir, 32 mg, y a 0.34 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, seguido por 270 ]iL de una solución de cloruro de calcio 3.4M, es decir, 920 umol, y finalmente 270 \ih de una solución de hidróxido de sodio 1.37M, es decir, 370 umol de hidróxido de sodio.
Ejemplo 79: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 4 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio Implante 10: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 1060 pL de una solución a 0.311 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 330 pg de rhBMP-2, a 62.3 mg/mL de polímero 4, es decir, 66 mg, y a 0.34 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 pmol, y finalmente 540 pL de una solución de cloruro de calcio 1.7M, es decir, 920 umol.
Ejemplo 80: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio y fosfato de sodio liofilizado Implante 11: Se obtuvo un implante osteogénico en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 1500 pL de una solución a 0.107 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 160 pg de rhBMP-2, a 21.3 mg/mL de polímero 1, es decir, 32 mg, seguido por 500 pL de una solución de cloruro de calcio 1.2M, es decir, 600 umol, seguido por 500 pL de una solución de fosfato de sodio 0.72 M a pH 7.4, es decir, 360 umol y finalmente 500 pL de una solución de hidróxido de sodio 0.54M, es decir, 270 umol de hidróxido de sodio. El implante después se congeló a -80°C y liofilizó. La esponja liofilizada es mojada con 1 mL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 81: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 4 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio e histidina Implante 12: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhB P-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 800 ]ÍL de una solución a 0.413 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 330 pg de rhBMP-2, a 20.65 mg/mL de polímero 4, es decir, 16.5 mg, y a 0.115 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 92 umol, y finalmente 800 µ?? de una solución de cloruro de calcio 0.3 M, es decir, 240 umol, y a 0.2 M de histidina, es decir, 160 umol.
Ejemplo 82: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhB P-2/polímero 4 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio e histidina Implante 13: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 4 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 800 de una solución a 0.413 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 330 ]ig de rhBMP-2, a 20.65 mg/mL de polímero 4, es decir, 16.5 mg, y a 0.24 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 192 umol, y finalmente 800 pL de una solución de cloruro de calcio 0.4 M, es decir, 320 umol y a 0.4 M de histidina, es decir, 320 umol.
Ejemplo 83: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 14: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 800 L de una solución a 0.2 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 160 pg de rhBMP-2, a 40 mg/mL de polímero 1, es decir, 32 mg, a 0.45 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 360 umol, y a 0.75 M de carbonato hidrógeno de sodio, es decir, 600 umol, y finalmente 800 pL de una solución de cloruro de calcio 0.75M, es decir, 600 umol.
Ejemplo 84: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 15: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 800 µ?. de una solución que contiene BMP-2 a 0.2 mg/mL, es decir, 160 ]iq de rhBMP-2, polímero l a 8 mg/mL, es decir, 6.4 mg, fosfato de sodio a 0.45 M, es decir, 360 umol, y carbonato hidrógeno de sodio a 0.75 M, es decir, 600 umol, y finalmente 800 pL de una solución de cloruro de calcio a 0.75 M, es decir, 600 umol.
Ejemplo 85: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 16: Se obtuvieron Implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL. A esta esponja se agregaron 800 uL de una solución que contiene BMP-2 a 0.2 mg/mL, es decir, 160 pg de rhBMP-2, polímero 1 a 20.6 mg/mL, es decir, 16.5 mg, fosfato de sodio a 0.24 M, es decir, 192 umol, y carbonato hidrógeno de sodio a 0.75 M, es decir, 600 umol, y finalmente 800 \iL de una solución de cloruro de calcio a 0.4 M, es decir, 320 umol.
Ejemplo 86: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhB P-7/polímero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 17: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo ???-7/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de de una esponja de colágeno reticulada cilindrica tipo I de 198 µ?. con 70 de una solución a 0.071 mg/mL de BMP-7, es decir, 5 g de BMP-7, a 31.3 mg/mL de polímero 1, es decir, 1.5 mg de polímero 1, a 0.24 M de fosfato de sodio a pH 7.4, es decir, 16.8 umol, y a 0.4 M de carbonato hidrógeno de sodio, es decir, 28 umol, después con 70 µ? de una solución a 0.4 M de cloruro de calcio, es decir, 28 umol. Los implantes después se congelaron a -80°C y liofilizaron . Las esponjas liofilizadas se mojaron con 45 uL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 87: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-2/polímero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 18: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo rhBMP-2/ polímero 2 y de partículas de fosfato de calcio de una esponja reticulada de colágeno con un volumen de esponja de 2.25 mL. 400 L de solución 29 que contiene rhBMP-2 a 0.4 mg/mL, es decir, 160 ]iq de rhBMP-2, polímero 2 a 10 mg/mL, es decir, 4 mg, fosfato de sodio a 0.23 M, es decir, 92 umol y carbonato hidrógeno de sodio a 0.31 M, es decir, 124 umol, y finalmente 400 pL de una solución de cloruro de calcio 0.38 M, es decir, 153 umol, se agregaron a esta esponja. Cada solución se dejó por 15 minutos en contacto con la esponja después de la adición. Después de estos tiempos de impregnación, la esponja está lista para implantación.
Ejemplo 88: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhBMP-7/polímero 3 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 19: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo BMP-7/ polímero 3 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de una esponja de colágeno reticulada tipo I de 4520 \iL en volumen con 800 pL de una solución que contiene BMP-7 a 0.41 mg/mL, es decir, 330 µ? de BMP-7, polímero 3 a 17.5 mg/mL, es decir, 14 mg de polímero 3, 0.45 M fosfato de sodio, es decir, 360 umol, y después 800 µ?, de una solución que contiene cloruro de calcio a 0.4 M, es decir, 648 umol, y de prolina a 0.61 M, es decir, 488 umol. Cada solución se dejó por 15 minutos en contacto con la esponja después de la adición. Después de estos tiempos de impregnación, la esponja está lista para implante.
Ejemplo 89: Preparación de implantes del complejo esponja de colágeno/rhGDF-5/polimero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio e histidina liofilizados Implante 20: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo GDF-5/ polímero 2 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de una esponja de colágeno reticulada tipo I de 4520 µ?? en volumen con 1500 pL de una solución que contiene GDF-5 a 0.5 mg/mL, es decir, 750 ]iq de GDF-5, polímero 2 a 20 mg/mL, es decir, 30 mg de polímero 2, y después 750 pL de una solución que contiene cloruro de calcio a 0.8 M, es decir, 600 umol de histidina a 0.38 M, es decir, 285 umol, y finalmente con una solución que contiene fosfato de sodio a 0.48 M, es decir, 360 umol. Cada solución se dejó por 15 minutos en contacto con la esponja después de la adición. Después de estos tiempos de impregnación, las esponjas se congelaron a -80°C y liofilizaron. Las esponjas liofilizadas se mojaron con 1.5 mL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante .
Los implantes descritos en los siguientes ejemplos se prepararon con una Matriz Resistente a la Compresión, CRM. Este material es una matriz mezclada compuesta de colágeno de bovino tipo I y de una fase mineral de fosfato de calcio compuesto de 15% de hidroxiapatito y 85% de fosfato beta-tricálcico vendido por Medtronic bajo en nombre Matriz MasterGraft. El volumen de esta matriz varía de conformidad con la aplicación, 140 µ? para una aplicación a un sitio ectópico en ratas y 5 mi de una aplicación de fusión vertebral en conejos.
Ejemplo 90: Preparación de implantes esponja de colágeno que rodea una CRM que contiene un complejo rhBMP-2/polímero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 21: El Implante 16 es enrollado alrededor de una CRM seca 5.0 mL en volumen (5.0 * 1.0 * 1.0 cm) antes del implante en el conejo.
Ejemplo 91: Preparación de implantes del complejo CRM/rhBMP-2/polimero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 22: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo BMP-2/ polímero 2 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de una CRM 140 uL en volumen con 35 uL de una solución a 0.14 mg/mL de BMP-2, es decir, 5 \ig de BMP-2, a 14 mg/mL de polímero 2, es decir, 0.5 mg de polímero 2, a 0.23 M de fosfato de sodio, es decir, 8 umol, y a 0.31 M de carbonato hidrógeno' de sodio, es decir, 11 umol, por 15 minutos, seguido por 35 ]íL de una solución a 0.38 M de cloruro de calcio, es decir, 13 umol, por 15 minutos. Las CRM están listas para implantación.
Ejemplo 92: Preparación de implantes del complejo CRM/rhGDF-5/polimero 2 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio e histidina liofilizados Implante 23: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo GDF-5/ polímero 2 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de una CRM 140 L en volumen con 35 µL de una solución a 0.86 mg/mL de GDF-5, es decir, 30 yg de GDF-5, a 14 mg/mL de polímero 2, es decir, 0.5 mg de polímero 2, a 0.23 M de fosfato de sodio, es decir, 8 umol, por 15 minutos, y después con 17.5 µ?, de una solución de histidina a 0.34 M, es decir, 6 umol, por 15 minutos, y finalmente con 17.5 \i de una solución de cloruro de calcio a 0.74 M, es decir, 13 umol. Las CRM después se congelaron a -80°C y liofilizaron. Las CRM liofilizadas se mojaron con 45 µL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante.
Ejemplo 93: Preparación de implantes del complejo CRM/rhBMP-2/polimero 1 en la presencia de cloruro de calcio, fosfato de sodio y carbonato hidrógeno de sodio Implante 24: Se obtuvieron implantes osteogénicos en base a una precipitación del complejo BMP-2/polímero 1 y de partículas de fosfato de calcio después de impregnaciones sucesivas de una CRM 5.0 mL en volumen con 1250 µ?? de una solución a 0.52 mg/mL de BMP-2, es decir, 650 pg de BMP-2, a 20 mg/mL de polímero 1, es decir, 25 mg de polímero 1, a 0.23 M de fosfato de sodio, es decir, 288 umol, y a 0.31 M de carbonato hidrógeno de sodio, es decir, 388 umol, por 15 minutos, y después con 1250 L de una solución a 0.38 M de cloruro de calcio, es decir, 477 umol, por 15 minutos. Las CRM están listas para implante.
Contraejemplo 1: Preparación dé implantes de esponja de colágeno que contiene 20 g de rhBMP-2 Implante 25: Se introdujeron asépticamente 40 µ? de una solución 0.5 mg/ml de rhBMP-2 en un amortiguador de tipo Infuse en una esponja de colágeno reticulada de 200 mm3. La solución se dejó por 30 minutos en la esponja de colágeno antes del implante.
La dosis de rhBMP-2 en el implante 25 es 20 µg.
Contraejemplo 2: Preparación de esponja de implantes colágeno que contiene 2 de rhBMP-2 Implante 26: Se introdujeron asépticamente 40 µ? de una solución 0.05 mg/ml de rhBMP-2 en un amortiguador de tipo Infuse en una esponja de colágeno reticulada de 200 mm3 de tipo Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey) .
La solución se dejó por 30 minutos en la esponja de colágeno antes del implante.
La dosis de rhBMP-2 en el implante 26 es 2 g.
Contraejemplo 3: Preparación de implantes de esponja de colágeno que contiene 5 pg de rhBMP-7 Implante 27: Se obtuvieron implantes osteogénicos liofilizados en base a BMP-7 después de impregnación de una esponja de colágeno reticulada cilindrica tipo I de 198 L con 140 uL de una solución a 0.036 mg/mL de BMP-7, es decir, 5 \xg. Los implantes después se congelaron a -80 °C y liofilizaron. Las esponjas liofilizadas se mojaron con 45 yL de sangre autóloga 30 minutos antes del implante.
Contraejemplo 4: Preparación de implantes de esponja de colágeno que contiene 2.3 mg de rhBMP-2 Implante 28: Se obtuvieron implantes osteogénicos impregnando una esponja de colágeno reticulada tipo I de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 era, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL, con 1600 L de una solución a 1.45 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 2.3 mg. La solución se dejó por 30 minutos en la esponja de colágeno antes del implante.
Contraejemplo 5: Preparación de implantes de esponja de colágeno que contiene 1.3 mg de rhBMP-2 Implante 29: Se obtuvieron implantes osteogénicos impregnando una esponja de colágeno reticulada tipo I de dimensiones 5.02 x 2.54 x 0.35 cm, es decir, un volumen de esponja de 4.52 mL, con 1600 L de una solución a 0.80 mg/mL de rhBMP-2, es decir, 1.3 mg. La solución se dejó por 30 minutos en la esponja de colágeno antes del implante.
E emplo 94 : Evaluación del polvo osteo-inductivo de formulaciones variadas El objetivo de este estudio es para demostrar el polvo osteo-inductivo de las formulaciones variadas en un modelo de formación ósea ectópica en ratas. Se usaron ratas macho que pesan 150 hasta 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories Francia, B.P. 109, 69592 l'Arbresle) para este estudio.
Se administra un tratamiento analgésico (buprenorfina, Temgesic®, Pfizer, Francia) antes de la intervención quirúrgica. Las ratas son anestesiadas por inhalación de una mezcla de 02 e isoflurano (1-4%) . La piel se remueve afeitando sobre una amplia área dorsal. La piel de esta área dorsal se desinfecta con solución de yoduro de povidona (solución Vetedine®, Vetoquinol, Francia) .
Se hacen incisiones paravertebrales de aproximadamente 1 cm para exponer los músculos dorsales paravertebrales derecho e izquierdo. Se realiza un acceso a los músculos por incisión transfacial. Cada uno de los implantes se colocan en una bolsa de forma que no haya compresión que pueda ser ejercida en estos. Se implantan cuatro implantes por rata (dos implantes por sitio) . Las aberturas del implante después se suturan usando hilo de polipropileno (Prolene 4/0, Ethicon, Francia) . La piel se cierra usando una sutura no absorbible. Las ratas después se regresan a sus respectivas jaulas y se mantienen en observación durante su recuperación.
A los 21 días, los animales se anestesian por inyección de tiletamina-zolazepam (ZOLETIL® 25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, Francia) .
Los animales después se sacrifican por inyección de una dosis de pentobarbital (DOLETHAL®, VETOQUINOL, Francia) .
Cada sitio es después observado macroscópicamente, se registra cualquier signo de intolerancia local (inflamación, necrosis, hemorragia) y la presencia de tejido óseo y/o cartilaginoso y se valoró de conformidad con la siguiente escala: 0: ausencia, 1: débil, 2: moderado, 3: marcado, 4: considerable .
Se removió cada uno de explantes de su tejido de implantación y se tomaron fotografías macroscópicas. Después se determinaron el tamaño y peso de los explantes. Cada explantes después se almacena en solución de formaldehido al 10% amortiguada.
Resultados : Este experimento in vivo hace posible medir el efecto osteo-inducido de rhBMP-2 colocado en un músculo dorsal de una rata. Este sitio no óseo se dice que es ectópico. Los resultados de los ejemplos variados se cotejan en la siguiente tabla.
Presencia de tejido Masa de explantes óseo (mg) Implante 25 3.6 38 Implante 26 - Implante 1 3.4 100 Implante 2 3.1 132 Implante 3 3.5 124 Una dosis de 20 µg de rhBMP-2 en una esponja de colágeno (Implante 25, Contraejemplo 1) conduce a la obtención de explantes osificados con una masa promedio de 38 mg después de 21 días.
Una dosis de 2 yg de rhBMP-2 en una esponja de colágeno (Implante 26, Contraejemplo 2) no tiene cualquier poder osteo-inductivo que sea suficiente para que los implantes de colágeno sean encontrados después de 21 días.
En la presencia del complejo rhBMP-2/polímero 1, cloruro de calcio y fosfato de sodio, una dosis de rhBMP-2 de 2 ]iq liofilizado en la esponja de colágeno (Implante 1, Ejemplo 70 e Implante 2, Ejemplo 71) hace posible generar explantes osificados, en contraste con rhBMP-2 solo en la misma dosis. Además, estos explantes tienen una masa de 4 veces mayor con un equivalente de registro óseo a aquellos con rhBMP-2 solo. Esta formulación así hace posible mejorar la actividad osteogénica de rhBMP-2.
En una manera equivalente, la adición de ascorbato de sodio a la esponja de colágeno que contiene el complejo rhBMP-2/polímero 1 y cloruro de calcio (Implante 3, Ejemplo 72) también hace posible obtener explantes osificados cuatro veces mayor en masa con un equivalente de registro óseo que con rhBMP-2 solo. Esta formulación también hace posible mejorar la actividad osteogénica de rhBMP-2.
Ejemplo 95: Evaluación del poder osteo-inductivo de las formulaciones variadas en fusión postero-lateral El objeto de este estudio es demostrar el poder osteo-inductivo de las formulaciones variadas en un modelo de fusión posterolateral en conejos. Este estudio se conduce de conformidad con el protocolo experimental descrito en la publicación por J.P Lawrence (Lawrence, J.P. et al., Spine 2007, 32(11), 1206-1213), con la excepción del tratamiento con nicotina, ya que la inducción de una pseudoartrosis no es deseable .
Se evalúa la fusión de vértebras por palpación manual de la columna espinal explantada. La ausencia de movilidad entre las vértebras es sinónimo con fusión. La columna espinal también se analiza por micro-CT a 12 semanas para evaluar la presencia de óseo en vértebras. Los resultados obtenidos para los implantes variados se resumen en la siguiente tabla A partir de estos estudios de fusión posterolateral en conejos, se desprende que el complejo BMP-2/polímero 2 coprecipitado con la sal de fosfato de calcio hace posible reducir las dosis de BMP-2 por un factor de 4 hasta 8 veces con respecto a BMP-2 solo a 1.3 mg de BMP-2 solo, esto es una dosis efectiva en este modelo de conformidad con la literatura, con resultados de fusión equivalente. Aún a dosis de BMP-2 de 0.16 mg, se observa fusión posterolateral en todos los conejos en el caso del complejo BMP-2/polímero coprecipitado con la sal de fosfato de calcio.
Los implantes que contienen el complejo BMP-7/copolímero coprecipitado con la sal de fosfato de calcio también lleva a fusión vertebral para dosis bajas de BMP-7, 0.33 mg de BMP-7 por implante. Los resultados de la literatura demuestran que la fusión vertebral en conejos del 100% no se logran aún a dosis de 3.5 mg de BMP-7, esta dosis es ahora superior al estudiado (Yao, G. et al., Spine 2008, 33(18), 1935-1942).
Los implantes que contienen el complejo GFD-5/polímero coprecipitado con la sal de fosfato de calcio también lleva al 100% de fusión vertebral para dosis bajas de GDF-5, 750 iq de GDF-5 por implante. Los resultados de literatura demuestran que la fusión vertebral en conejos del 100% no se logra, aún para una dosis de 2.5 mg de GDF-5, esta dosis es ahora superior que la estudiada (Magit, David P. et al., Spine 2006, 31(19), 2180-2188).

Claims (53)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
1. Un coprecipitado caracterizado porque está constituido de al menos un complejo entre una proteina osteogénica y un polisacárido aniónico en su forma insolubilizada y al menos una sal de calcio insoluble, el coprecipitado está en forma dividida.
2. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sal de calcio insoluble se elige del grupo constituido de ortofosfatos de calcio en forma anhidra o hidratada, sola o como una mezcla.
3. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque también comprende al menos una sal de calcio insoluble elegida del grupo constituido de oxalato de calcio, ascorbato de calcio, carbonato de calcio y sulfato de calcio.
4. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sal de calcio insoluble se elige del grupo constituido de sales mezcladas formadas entre iones de calcio catiónicos e iones aniónicos tales como fosfatos mono-, di- o tribásicos, carboxilatos de polisacáridos, carbonatos, hidróxidos y los posibles aniones originados por bases.
5. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque también comprende al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente .
6. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos funcionalizados con derivados hidrofóbicos .
7. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo parcialmente sustituidos con alcoholes hidrofóbicos, de la fórmula general IX: Polisacárido + carboxilo F n Fórmula IX - en la cual q representa la fracción en mole de funciones carboxilo del polisacárido que son sustituidas con F-R-G-Ah y es entre 0.01 y 0.7, - F' es una función amida, - G es una función éster, tioéster, carbonato o carbamato, - R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, opcionalmente que comprende uno o más heteroátomos tales como O, N y/o S, y que tiene al menos una función de ácido, Ah es un residuo de alcohol hidrofóbico, producido por acoplamiento entre la función hidroxilo del alcohol hidrofóbico y al menos una función electrofilica originadas por el grupo R, - cuando la función carboxilo del polisacárido no es sustituida con F'-R-G-Ah, después la función del (los) grupo (s) carboxilo (s) del polisacárido son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un catión de metal álcali tal como Na+ o K+, el polisacárido que comprende grupos funcionales carboxilo es anfifílico a pH neutral.
8. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo son polisacáridos sintéticos obtenidos de polisacáridos que comprenden naturalmente grupos funcionales carboxilo o de polisacáridos neutrales en los cuales al menos 15 grupos funcionales carboxilo por 100 unidades de sacáridos han sido injertados, de la fórmula general X: - los polisacáridos naturales son elegidos del grupo de polisacáridos principalmente constituidos de enlaces glicosidicos de tipo (1,6) y/o (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), - L es un enlace que resulta del acoplamiento entre el enlazador Q y una - función OH del polisacárido, y es ya sea una función éster, tioéster, carbonato, carbamato o éter, - r representa la fracción en mole de los sustituyentes L-Q por unidad de sacárido del polisacárido, Q es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como O, N y/o S, y que comprende al menos un grupo funcional carboxilo, -CO2H.
9. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos aniónicos principalmente que comprende enlaces glicosídicos de tipo (1,4), (1,3) y/o (1,2), funcionalizado con al menos un derivado de triptofano que corresponde a la fórmula general I siguiente: Fórmula I • el polisacárido está constituido principalmente de enlaces glicosídicos de tipo (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • Trp es un residuo de un derivado de triptofano, L o D, producido por acoplamiento entre la amina del derivado de triptofano y al. menos un ácido originado por el grupo R y/o un ácido originado por el polisacárido aniónico, n representa la fracción en mole de los grupos R sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, o representa la fracción en mole de las funciones de ácido de los polisacáridos que son sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, i representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el grupo R por unidad de sacárido y es entre 0 y 2, j representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el polisacárido aniónico por unidad de sacárido y es entre 0 y 1, (i + j) representa la fracción en mole de las funciones de ácido por unidad de sacárido y es entre 0.1 y 2, - cuando R no es sustituido con Trp, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un metal álcali tal como Na o K, - cuando el polisacárido es un polisacárido aniónico, cuando una o más funciones de ácido del polisacárido no son sustituidas con Trp, entonces son salificadas con un catión, preferiblemente un catión de metal álcali tal como Na+ o K+, los polisacáridos son anfifílicos a pH neutral.
10. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de los polisacáridos aniónicos funcionalizados de la fórmula general III siguiente: Dextrano Fórmula III • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como O, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, • AA es un residuo de aminoácido hidrofóbico, L o D, producido por el acoplamiento entre la amina del aminoácido y un ácido originado por el grupo R, dicho aminoácido hidrofóbico es elegido de derivados de triptofano, tales como triptofano, triptofanol, triptofanamida y 2-indoletilamina, y sales de los mismos de un catión de metal álcali, o elegido de fenilalanina, leucina, isoleucina y valina, y alcohol, amida o derivados descarboxilados de los mismos . t representa la fracción en mole del sustituyente F-R- [AA] n por unidad glicosidica, y es entre 0.1 y 2, p representa la fracción en mole de grupos R sustituidos con AA y es entre 0.05 y 1. Cuando R no es sustituido por AA, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un metal álcali tal como Na+ o K+.
11. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteina osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación.
12. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, caracterizado porque al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es PDGF.
13. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque comprende al menos BMP-2 y PDGF-BB.
14. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque comprende al menos BMP-7 y PDGF-BB. .
15. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque comprende al menos GDF-5 y PDGF-BB.
16. El coprecipitado como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque la proteina osteoqénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación, y al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es VEGF.
17. Un kit para preparar un implante osteogénico, caracterizado porque comprende al menos: a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b una composición que comprende al menos un polisacárido, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble, d - una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble .
18. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque también comprende una composición adicional que comprende al menos una base.
19. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque también comprende una segunda base que puede ser agregada a las composiciones b, c o d.
20. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la composición que comprende la proteina osteogénica también puede comprender el polisacárido para formar el complejo .
21. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la composición que comprende el complejo también puede comprender la sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y/o una base.
22. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la composición que comprende el polisacárido también puede comprender la sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble y/o una base.
23. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la composición que comprende la sal de calcio soluble también puede comprender una base.
24. Un kit caracterizado porque comprende: a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico, al menos una base y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble.
25. Un kit caracterizado porque comprende: a - una composición que comprende al menos una proteina osteogénica, b - una composición que comprende al menos un polisacárido aniónico y al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble, c - una composición que comprende al menos una sal de calcio soluble y al menos una base.
26. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos funcionalizados con derivados hidrofóbicos .
27. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo parcialmente sustituidos con alcoholes hidrofóbicos, de la fórmula general IX: - en la cual q representa la fracción en mole de funciones carboxilo del polisacárido que son sustituidos con F-R-G-Ah y es entre 0.01 y 0.7, - Ff es una función amida, - G es una función áster, tioéster, carbonato o carbamato, - R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, opcionalmente que comprende uno o más heteroátomos tales como 0, N y/o S y que tiene al menos una función de ácido, Ah es un residuo de alcohol hidrofóbico, producido por acoplamiento entre la función hidroxilo del alcohol hidrofóbico y al menos una función electrofilica originadas por el grupo R, - cuando la función carboxilo del polisacárido no es sustituida con F'-R-G-Ah, después la función del (los) grupo (s) carboxilo (s) del polisacárido son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un catión de metal álcali tal como Na+ o K+, el polisacárido que comprende grupos funcionales carboxilo es anfifilico a pH neutral.
28. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los polisacáridos que comprenden grupos funcionales carboxilo son polisacáridos sintéticos obtenidos de polisacáridos que comprenden naturalmente grupos funcionales carboxilo o de polisacáridos neutrales en los cuales al menos 15 grupos funcionales carboxilo por 100 unidades de sacáridos han sido injertados, de la fórmula general X: - los polisacáridos naturales son elegidos del grupo de polisacáridos principalmente constituidos de enlaces glicosidicos de tipo (1,6) y/o (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), - L es un enlace que resulta del acoplamiento entre el enlazador Q y una función -OH del polisacárido, y es ya sea una función éster, tioéster, carbonato, carbamato o éter, - r representa la fracción en mole de los sustituyentes L-Q por unidad de sacárido del polisacárido, Q es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como O, N y/o S, y que comprende al menos un grupo funcional carboxilo, -CO2H.
29. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de polisacáridos aniónicos principalmente que comprenden enlaces glicosidicos de tipo (1/4) y/o (1,3) y/o (1,2), funcionalizados con al menos un derivado de triptofano que corresponde a la fórmula general I siguiente: Fórmula t • el polisacárido está constituido principalmente de enlaces glicosidicos de tipo (1,4) y/o (1,3) y/o (1,2), • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como 0, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • Trp es un residuo de un derivado de triptofano, L o D, producido por acoplamiento entre la amina del derivado de triptofano y al menos un ácido originado por el grupo R y/o un ácido originado por el polisacárido aniónico, n representa la fracción en mole de los grupos R sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, 0 representa la fracción en mole de las funciones de ácido de los polisacáridos que son sustituidos con Trp y es entre 0.05 y 0.7, 1 representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el grupo R por unidad de sacárido y es entre 0 y 2, j representa la fracción en mole de las funciones de ácido originadas por el polisacárido aniónico por unidad de sacárido y es entre 0 y 1, (i + j) representa la fracción en mole de las funciones de ácido por unidad de sacárido y es entre 0.1 y 2, - cuando R no es sustituido con Trp, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un metal álcali tal como Na o K, - cuando el polisacárido es un polisacárido aniónico, cuando una o más funciones de ácido del polisacárido no son sustituidas con Trp, entonces son salificadas con un catión, preferiblemente un catión de metal álcali tal como Na+ o K+, los polisacáridos son anfifílicos a pH neutral.
30. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polisacárido aniónico se elige del grupo constituido de los polisacáridos aniónicos funcionalizados de la fórmula general III siguiente : Dextrano R r ¿ , i ' MM I Jp Fórmula III • R es una cadena que comprende entre 1 y 18 carbonos, opcionalmente ramificada y/o insaturada, que comprende uno o más heteroátomos, tales como O, N y/o S, y que tienen al menos una función de ácido, • F que resulta del acoplamiento entre el enlazador R y una función -OH del polisacárido aniónico o neutral, es ya sea una función éster, tioéster, amida, carbonato, carbamato, éter, tioéter o amina, • AA es un residuo de aminoácido hidrofóbico, L o D, producido por el acoplamiento entre la amina del aminoácido y un ácido originado por el grupo R, dicho aminoácido hidrofóbico es elegido de derivados de triptofano, tales como triptofano, triptofanol, triptofanamida y 2-indoletilamina, y sales de los mismos de un catión de metal álcali, o elegido de fenilalanina, leucina, isoleucina y valina, y alcohol, amida o derivados descarboxilados de los mismos . t representa la fracción en mole del sustituyente F-R- [AA] n por unidad glicosídica, y es entre 0.1 y 2, p representa la fracción en mole de grupos R sustituidos con AA y es entre 0.05 y 1. Cuando R no es sustituido por AA, entonces el (los) ácido (s) del grupo R son carboxilatos de un catión, preferiblemente de un metal álcali tal como Na+ o K+.
31. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque la proteina osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación.
32. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimioatrayente es PDGF.
33. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque comprende al menos BMP-2 y PDGF-BB.
34. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque comprende al menos BMP-7 y PDGF-BB.
35. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque comprende al menos GDF-5 y PDGF-BB.
36. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, caracterizado porque la proteina osteogénica se elige del grupo constituido de BMP-2 (dibotermina-alfa) , BMP-4, BMP-7 (eptotermina-alfa) , BMP-14 y GDF-5, sola o en combinación, y al menos un factor de crecimiento con potencia angiogénica y quimio-atrayente es VEGF.
37. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 36, caracterizado porque la sal de calcio soluble se elige del grupo constituido de cloruro de calcio, D-gluconato, formiato, D-sacarato, acetato, L-lactato, glutamato y aspartato.
38. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 36, caracterizado porque la sal de calcio soluble es cloruro de calcio.
39. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 38, caracterizado porque la sal soluble de un anión capaz de formar un precipitado con el ión de calcio es una sal soluble cuyo anión se elige del grupo constituido de aniones de fosfato que comprenden el ión de fosfato P043~, el ión de fosfato de hidrógeno HP042" y el ión de fosfato de dihidrógeno H2P04~.
40. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 38, caracterizado porque la base se elige de bases orgánicas y minerales.
41. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la base mineral se elige del grupo constituido de hidróxido de sodio, carbonato hidrógeno de sodio y carbonato de sodio.
42. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la base orgánica se elige del grupo constituido de aminas y aminoácidos desprotonados .
43. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la base orgánica se elige del grupo constituido de imidazol y derivados de los mismos, especialmente histidina, prolina, etanolamina y serina .
44. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 43, caracterizado porque también comprende al menos una matriz orgánica o una matriz mineral o una matriz mezclada.
45. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la matriz es una matriz orgánica elegida del grupo constituido de hidrogeles y/o matrices a base de un polímero reticulado.
46. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el hidrogel es un hidrogel obtenido por reticulación química o física de cadenas poliméricas.
47. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el polímero reticulado es colágeno natural purificado esterilizado y reticulado .
48. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el hidrogel se elige del grupo de polímeros sintéticos que incluyen copolímeros de etilen glicol y de ácido láctico, copolímeros de etilen glicol y de ácido glicólico, poli (N-vinilpirrolidona) , ácidos polivinílicos, y poliacrilamidas y ácidos poliacrílicos .
49. El kit como se reivindica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el hidrogel se elige del grupo de polímeros naturales que incluyen ácido hialurónico, queratán, pululano, pectina, dextrano, celulosa y derivados de celulosa, ácido algínico, xantano, carragenano, quitosán, condroitina, colágeno, gelatina, polilisina, fibrina, y sales de los mismos biológicamente aceptables .
50. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 50, caracterizado porque las composiciones que constituyen el kit son soluciones acuosas.
51. El kit como se reivindica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 50, caracterizado porque las composiciones que constituyen el kit son liofilizados .
52. Un proceso para preparar el coprecipitado como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende una etapa de coprecipitación obtenida por: - precipitar el complejo entre el polímero aniónico y la proteína osteogénica por adición de la solución de sal de ión de calcio, - precipitar los iones de calcio por adición de una composición que comprende al menos una sal soluble de un anión capaz de formar una sal de calcio insoluble a un pH dado, el complejo entre el complejo de proteína osteogénica y polímero aniónico se obtiene agregando la solución de polisacárido aniónico a la solución de proteína osteogénica.
53. El proceso como se reivindica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la precipitación de la sal de calcio toma lugar en la forma de fosfato de calcio, por adición de una solución de fosfato soluble.
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