EP2049085A1 - Microparticules a base de copolymere amphiphile et de principe(s) actif(s) a liberation modifiee et formulations pharmaceutiques en contenant - Google Patents

Microparticules a base de copolymere amphiphile et de principe(s) actif(s) a liberation modifiee et formulations pharmaceutiques en contenant

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Publication number
EP2049085A1
EP2049085A1 EP07801468A EP07801468A EP2049085A1 EP 2049085 A1 EP2049085 A1 EP 2049085A1 EP 07801468 A EP07801468 A EP 07801468A EP 07801468 A EP07801468 A EP 07801468A EP 2049085 A1 EP2049085 A1 EP 2049085A1
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EP
European Patent Office
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microparticles
group
polymer
suspension
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07801468A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alain Constancis
You-Ping Chan
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Flamel Ireland Ltd
Original Assignee
Flamel Technologies SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Flamel Technologies SA filed Critical Flamel Technologies SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy

Definitions

  • the present invention relates to novel transporters of the active principle (s) -PA-, in particular protein (s) and peptide (s), as well as new modified-release pharmaceutical formulations containing said transporters of PA.
  • the therapeutic applications (human and veterinary) of these formulations are numerous.
  • the PA reference used throughout this disclosure is directed to at least one active ingredient.
  • modified release is meant a prolonged or delayed or pulsatile release.
  • novel PA transporters to which the invention relates are microparticles of amphiphilic polymers, for example polyamino acids modified with hydrophobic groups. These microparticles contain at least one PA associated with the polymer and may be in the form of colloidal suspensions or in dry form.
  • the plasma concentration of therapeutic protein then has a sawtooth profile, characterized by high concentration peaks and very low concentration minima. Concentration peaks, much higher than the basal concentration in healthy subjects, have very significant adverse effects due to the high toxicity of therapeutic proteins such as interleukin IL-2. In addition, the concentration minima are lower than the concentration required to have a therapeutic effect, which leads to poor therapeutic coverage of the patient and serious consequences in the long term.
  • sustained-release forms of therapeutic protein consisting of suspensions, liquid and low viscosity, of nanoparticles. particles loaded with therapeutic proteins. These suspensions allowed the easy administration of native therapeutic proteins.
  • the therapeutic protein has been associated with nanoparticles of a copolyamino acid comprising hydrophobic groups and hydrophilic groups.
  • US-B-5,904,936 discloses submicron particles (NPV) - average size between 0.01 and 0.5 microns - and micrometric particles (micron) (MPV) - average size between 0.5 and 20 ⁇ m - of amphiphilic copolymer of polyamino acids comprising at least two types of amino acids, one being hydrophilic neutral, the other being ionizable. Proteins such as insulin adsorb spontaneously in aqueous solution to these particles.
  • the polyamino acid copolymer is, for example, a block copolymer of sodium poly (L-leucine-bL-glutamate).
  • This patent describes the aggregation of NPV in MPV by addition to a colloidal suspension of poly-Leu / Glu of monocation salts (ammonium sulfate), polycationic (Fe 2+ , Fe 3+ , Zn 2+ , Ca 2+ , Al 2+ , Al 3+ or Cu 2+ ), acid (HCl) or cationic polymers (polylysine).
  • the patent application WO-A-03/104303 discloses amphiphilic polyamino acids comprising aspartic residues or glutamic residues, at least a portion of these residues carrying grafting agents comprising at least one alpha-tocopherol unit (for example: polyglutamate or polyaspartate grafted with alpha tocopherol of synthetic or natural origin).
  • grafting agents comprising at least one alpha-tocopherol unit (for example: polyglutamate or polyaspartate grafted with alpha tocopherol of synthetic or natural origin).
  • alpha-tocopherol unit for example: polyglutamate or polyaspartate grafted with alpha tocopherol of synthetic or natural origin.
  • the in vivo release time of the active protein (s) (e.g., insulin) vectorized by the suspensions according to US-B-5,904,936 or WO-A-2003/104303 would benefit from being increased.
  • the increase in the release time has been partially achieved by the pharmaceutical forms disclosed in PCT application WO-A-05/051416.
  • the protein is then slowly released over a period of typically one week.
  • the therapeutic protein concentration to be administered is relatively high, as is the case for example for human growth hormone, the release time is limited to a few days only.
  • PAs eg proteins, therapeutic peptides and small molecules
  • multivalent ions such as Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ or mixtures thereof or Al 3+ , Fe 3+ or mixtures thereof, confer excellent tolerance to such a liquid pharmaceutical formulation for prolonged release of AP.
  • n is the valence of said multivalent ions
  • [IM] is the molar concentration of multivalent ions
  • - [GI] is the molar concentration of ionizable groups GI
  • micrometric particles are derived from the aggregation of a large number of amphiphilic copolymer nanoparticles.
  • a suspension of microparticles loaded with PA (for example hGH) can thus be manufactured by flocculation with multivalent ions Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ Al 3+ or Fe 3+ , this flocculation being followed by maturation and washing.
  • the suspension can then be lyophilized or atomized and then reconstituted with water to make a formulation ready to inject.
  • this reconstituted suspension can be easily injected by passage through a hollow needle associated with a syringe or an injection pen (insulin pen type).
  • an injection pen insulin pen type
  • one of the essential objectives of the invention would be to propose new microparticles obtained by aggregation of amphiphilic polymer nanoparticles, biodegradable and water-soluble, for example of the type according to the formulation described in WO-A-05. / 051416, these microparticles being loaded with PA and having vocation to have improved properties, especially in dry solid form, in particular with regard to their dispersibility (or dispersibility), and, as regards the reconstituted suspension, its stability and its ability to be easily manipulated and injected.
  • Another objective of the invention is to propose novel microparticles obtained by aggregation of amphiphilic, biodegradable and water-soluble amphiphilic polymer nanoparticles, said microparticles being loaded with PA and having good properties. dispersion whether in aqueous or organic phase, while maintaining the integrity of said microparticles.
  • Another object of the invention is to provide novel microparticles obtained by aggregation of amphiphilic polymer bioparticles, biodegradable and water-soluble, said microparticles being loaded with PA and having excellent stability properties in solid and dry form.
  • Another objective of the invention is to propose a new process for the preparation of microparticles in solid and dry form, these microparticles being moreover:
  • biodegradable and water-soluble amphiphilic polymer nanoparticles Obtained by aggregation of biodegradable and water-soluble amphiphilic polymer nanoparticles, for example of the type of those according to the formulation described in WO-A-05/051416;
  • Another object of the invention is to provide a method for preparing microparticles in solid and dry form, of the type referred to in the previous objective and which is otherwise simple, economic and industrial.
  • Another object of the invention is to provide a pharmaceutical formulation comprising novel microparticles obtained by aggregation of amphiphilic polymer nanoparticles, biodegradable and water-soluble, for example of the type according to the formulation described in WO-A-03/104303, these microparticles being otherwise:
  • Another object of the invention is to provide a pharmaceutical formulation for the sustained release of PA, remedying deficiencies of the prior art, and in particular allowing after parenteral injection (eg subcutaneous) to obtain a prolonged in vivo release of PA (eg, proteins, therapeutic peptides or small molecules) undenatured.
  • Another object of the invention is to provide a pharmaceutical formulation allowing, after parenteral injection (eg subcutaneous), to obtain a prolonged in vivo release time of highly concentrated therapeutic proteins or peptides, for example at several mg / ml.
  • Another object of the invention is to provide a sustained-release pharmaceutical formulation of PA in vivo, which is stable to conservation both physico-chemical and biological.
  • Another object of the invention is to provide a sustained-release pharmaceutical formulation of PA in vivo, which has at least one of the following properties: biocompatibility, biodegradability, non-toxicity, good local tolerance.
  • Another object of the invention is to provide a pharmaceutical formulation for the slow sustained release of PA in vivo, comprising microparticles of amphiphilic PO polymer self-associated with at least one PA (PO / PA microparticles), the PO polymer being a biodegradable, water-soluble polymer carrying hydrophobic groups (GH) and hydrophilic groups (preferably ionizable (GI) at least in part) ionized) forming spontaneously in water a suspension of colloidal nanoparticles, this PO polymer being, for example, a polyamino acid whose main chain is formed by aspartic residues or glutamic residues, at least a portion of these residues being modified by grafting at least one hydrophobic group GH, in the chain or at the end of the chain.
  • GH hydrophobic groups
  • GI ionizable
  • Another objective of the invention is to propose a kit for reconstituting the formulation as defined in the above-mentioned objectives, this kit being for example simple to use, so that it can be easily implemented by the patient or by the medical staff.
  • Another object of the invention is to provide a method for reconstituting the formulation as defined in the above-mentioned objectives, this method being for example simple to implement in particular by the patient or the medical staff.
  • Another object of the invention is to provide a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of PA, in particular a dry powder form for inhalation and pulmonary administration:
  • the inventors have had the merit of discovering, after long and laborious research, that, quite surprisingly and unexpectedly, the atomization of formulations based on amphiphilic PO (for example of copolyamino acids) and PA leads to very stable, dry PO / PA microparticles, making it possible to reconstitute aqueous suspensions of microparticles in a liquid medium whose size is between 0.5 and 100 ⁇ m.
  • the inventors have had the merit of developing means for reconstituting a suspension from these microparticles, said means making it possible to optimize their dispersion both in the aqueous liquid phase and in the organic liquid phase.
  • Atomization is a known industrial technique for obtaining dry particles from a solution or suspension of the constituent material of said particles.
  • the atomization or spray drying is to evaporate very quickly in a stream of air or hot inert gas nebulized droplets of this solution or suspension.
  • the atomization can be delicate because it imposes a thermal stress which may be prohibitive for certain heat-sensitive PAs such as PAs based on proteins or other peptide compounds.
  • the use of atomization to produce dry particles based excipients and PA is not therefore obvious, except to select excipients capable of preventing or minimizing the denaturation of PA peptides.
  • the application US-A-2005/0158392 discloses the preparation of lipophilic solid microparticles loaded with peptide PA by atomization.
  • the latter consists either in atomizing an aqueous solution containing hyaluronic acid, PA and a lipophilic surfactant (eg lecithin) or even another surfactant of Tween 80 type; either, in a first step, atomizing an aqueous solution containing hyaluronic acid, PA and optionally a surfactant like Tween ® 80 to obtain primary particles, and, secondly, atomizing an alcoholic solution of lipophilic surfactant (eg lecithin) in which the primary particles are dispersed.
  • a lipophilic surfactant eg lecithin
  • hyaluronic acid and lipophilic surfactant eg lecithin
  • hyaluronic acid and lipophilic surfactant eg lecithin
  • amphiphilic POs and even less amphiphilic copolyamino acids as excipients or carriers of PA together forming the microparticles.
  • amphiphilic POs and even less amphiphilic copolyamino acids as excipients or carriers of PA together forming the microparticles.
  • Another example of atomization is that described in the article Maa et al, J Pharm
  • PA human growth hormone
  • microparticles being characterized: a. in that they are obtained by atomization of a solution or a colloidal suspension of PO comprising at least one PA, b. by a size, measured in a T test, between 0.5 and 100 ⁇ m, preferably between 1 and 70 ⁇ m, preferably between 2 and 40 ⁇ m, c. and in that they are dispersible in colloidal suspension in a DPl dispersibility test.
  • the invention relates to a process for preparing microparticles of polymer PO associated with at least one active principle (PA), these microparticles PO / PA being in particular those defined above according to the first aspect of the invention.
  • PA active principle
  • microparticles having a size, measured in a T test, between 0.5 and 100 ⁇ m, preferably between 1 and 70 ⁇ m, preferably between 2 and 40 ⁇ m, characterized in that it consists essentially in atomizing a solution or a colloidal suspension of PO containing PA.
  • the microparticles obtained by atomization are redispersed in a substantially aqueous liquid medium (preferably comprising multivalent ions as dispersing means) and then the dispersion obtained is freeze-dried.
  • a substantially aqueous liquid medium preferably comprising multivalent ions as dispersing means
  • the invention in a third aspect, relates to a liquid pharmaceutical formulation for the sustained release of PA, characterized in that it comprises a low viscosity colloidal suspension based on PO microparticles, containing at least minus one PA, these microparticles being those defined above according to the first aspect of the invention or those obtained by the process defined above according to the second aspect of the invention.
  • the invention relates to a reconstitution kit in particular of the formulation as defined above according to a third aspect of the invention, characterized in that it comprises:
  • Microparticles of PO containing at least one AP are those defined above according to the first aspect of the invention or those obtained by the process defined above according to the second aspect of the invention;
  • the invention relates to a method of reconstitution, in particular of the formulation as defined above according to a third aspect of the invention, characterized in that it consists essentially of:
  • the invention relates to a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of PA, characterized in that it comprises a dry powder form for inhalation and pulmonary administration:
  • microparticles of PO containing at least one PA Based on microparticles of PO containing at least one PA, these microparticles being those defined above according to the first aspect of the invention or those obtained by the process defined above according to the second aspect of the invention;
  • hydrophobic groups of the PO polymers which can assemble into hydrophobic domains, play an important role in the PA modified release process, as well as in the stabilization of the latter. .
  • the affinity of the protein for the PO polymer makes it possible to limit the protein aggregation phenomena and other degradations that may occur during the atomization process, without the need to resort to other stabilizers (eg sugars, surfactants).
  • This protective effect of PO also makes it easy to obtain storage-stable liquid formulations.
  • the PO when it has an essentially amorphous character (especially when it is a polyamino acid), gives the microparticles excellent properties of physical stability when they are kept in dry form.
  • amphiphilic PO polyamino acids provides additional levers for the modified release of the PA as well as for its stabilization with respect to aggregation or possible chemical degradation.
  • amphiphilic nature of the PO polymer makes it possible, during the atomization process, to be able to use either an entirely aqueous phase, or a fully volatile organic phase, or a volatile mixture of aqueous and organic phase, which offers great flexibility in the implementation of the method.
  • microparticles formed from a (co) polyamino acid type PO are biodegradable, biocompatible and generally have good local tolerance properties.
  • microparticles according to the invention namely the atomization
  • the microparticles according to the invention and the formulations containing them are non-toxic and well tolerated locally.
  • a linear alkyl which may include at least one heteroatom (O, N or S) or at least one unsaturation may have two heteroatoms, N and S, and unsaturation.
  • the term “submicronic particles” or “nanoparticles” designates particles of size (measured in a T test described below), greater than or equal to 1 nm and less than 500 nm, preferably between 5 and 250 nm.
  • the term “polyamino acid” covers both natural polyamino acids and synthetic polyamino acids, as well as oligoamino acids comprising from 10 to 20 amino acid residues in the same way as polyamino acids comprising more than 20 amino acid residues.
  • the preferred amino acid residues of the main polyamino acid chain are those having the L configuration; the preferred type of binding is the alpha type, i.e., a peptide bond between an alpha-amino group of an amino acid and the carboxyl group at the 1-position of another alpha-amino acid.
  • protein designates, for example, a protein as well as a peptide, whether it be an oligo or a polypeptide.
  • This protein (or this peptide) can be modified or not, for example, by grafting one or more polyoxyethylene groups.
  • association For the purposes of the invention and throughout this presentation, the terms "association" or
  • "associate" employees to qualify the relationship between one or more PA and PO polymers mean in particular that the active ingredient (s) are bound to the polymer (s) PO by a non-covalent bond, for example by electrostatic or hydrophobic interaction or hydrogen bond or steric hindrance.
  • the bactericidal microparticles (a) the bactericidal microparticles (a);
  • the PA for example a protein or another peptide compound
  • an amphiphilic PO polymer such as a (co) polyamino acid amphiphilic
  • the physical atomization treatment confers on the solid dry microparticles obtained a particular structure at the origin of many of their advantageous properties. This structure is correctly characterized by this method of obtaining by atomization, as well as by the functions attached to these advantageous properties.
  • Characteristic (b) This characteristic is defined objectively by the T test described below. T test for measuring the size of the microparticles by laser diffraction:
  • the circulating fluid stored in the dispersion system liquid channel at rest is drained and replaced with heptane.
  • the agitation of the Hydro 2000SM module is positioned at 2400 rpm.
  • Data on the D50 is obtained, which is the diameter below which 50% of the objects analyzed are found.
  • the sample to be analyzed is introduced into the cell as it is or may optionally be rediluted by water in the case of highly diffusing samples. 3 Analysis of the sample
  • the circulating fluid stored in the liquid dispersion system at rest is drained and replaced with fresh demineralized water.
  • the agitation of the Hydro 2000SM module is positioned at 2400 rpm.
  • Data on the D50 is obtained, which is the diameter below which 50% of the objects analyzed are found.
  • test sample 400 ⁇ L of the test sample should be diluted in a 5 mL test tube with 600 ⁇ L of heptane and vortexed for 10 ⁇ 5 s.
  • the circulating fluid stored in the dispersion system liquid channel at rest is drained and replaced with heptane.
  • the agitation of the Hydro 2000SM module is positioned at 2400 rpm.
  • the entire suspension is aspirated through a 1 ml syringe (Braun Injeckt-F Luer type 1 ml - ref 9166017V) equipped with a 25G needle and transferred to a new vial beforehand. calibrated and the mass m 3 of solution recovered is determined.
  • the powder has good dispersion properties in the liquid if: the suspension obtained contains microparticles with a mean diameter of between 2 and 40 ⁇ m, the appearance of the suspension is homogeneous, it can be injected through a needle 25G and if - at least 80% of the suspension can be recovered.
  • microparticles according to the invention can be defined objectively by the fact that they are stable in an ST1 test or in an ST2 test.
  • the size of the microparticles present in the atomized dry powder is measured in the week following the atomization of the powder on a laser granulometer according to the TO test.
  • the powder is then placed in an oven at 30 ° C for one week.
  • a control sample is left at 5 ° C.
  • a measurement of size is carried out again after dispersion under the same conditions as time tO. The particle distributions before and after aging are compared.
  • the microparticle powder is dispersed in the dispersion liquid with magnetic stirring at the concentration at which it is desired to observe its stability and is allowed to stir with moderate magnetic stirring for at least 2 hours (measurement t0).
  • the size of the particles is measured on a laser granulometer according to the Tl or T2 test depending on the medium (aqueous or organic) dispersion.
  • the suspension is then allowed to stand for 7 days at 5 ° C.
  • the sedimentation pellet is dispersed by stirring for a few minutes (until a homogeneous suspension is obtained after visual observation).
  • a measurement of size is carried out again after dispersion under the same conditions as time tO.
  • the PO polymers according to the invention are biodegradable, water-soluble polymers carrying hydrophobic groups GH and groups hydrophilic (preferably ionizable GI groups, at least partially ionized).
  • the hydrophobic groups GH may be in reduced number vis-à-vis the rest of the chain and may be located laterally to the chain or interspersed in the chain, and be randomly distributed (random copolymer) or distributed in the form of sequences or grafts (block copolymers or block copolymers).
  • the PO polymer is an amphiphilic (co) polyamino acid.
  • Such a choice of PO provides excellent compatibility with PAs of the protein (s) / peptide (s) type. It is thus possible to greatly simplify the composition of the starting solution or suspension of the protein (s) / peptide (PA) -type PA with the PO polymer.
  • This starting solution or suspension may comprise only PA and PO in an aqueous or organic phase. The absence of other ingredients allows such a solution or starting suspension can be filtered (pore size: 0.2 microns) before atomization, which allows the latter to be carried out under aseptic conditions.
  • the PO is chosen from the
  • the polyamino acids according to the present invention are oligomers or homopolymers comprising recurring glutamic or aspartic acid residues or copolymers comprising a mixture of these two types of residues.
  • the residues considered in these polymers are amino acids having the D, L or D / L configuration and are linked by their alpha or gamma positions for the glutamate or glutamic residue and alpha or beta for the aspartic or aspartate residue.
  • the polymer PO is a polyamino acid formed by aspartic residues or glutamic residues, at least a portion of these residues carrying scions comprising at least one hydrophobic group GH.
  • These polyamino acids are in particular of the type described in PCT patent application WO-A-00/30618.
  • the (or) PO is (are) set (s) by the formula ggéénnéérraallee ((II)) ssuuiivvaannttee ((tthhee rraaddiiccaall - CCOOOORR 33 i includes forms wherein the bond between the carboxyl and R 3 is an ionic bond - COO "+ R 3 ):
  • R 1 is selected from the group consisting of H, linear C2 to C 10 alkyl, branched C 3 -C 10, benzyl, and -R 4 - [GH], or "NHR 1 is a terminal amino acid residue;
  • R 2 is selected from the group consisting of H, C 2 -C 10 linear acyl, C 3 -C 10 branched acyl, and -R 4 - [GH] or "R 2 is a terminal pyroglutamate residue;
  • R + is preferably selected from the group comprising: metal cations advantageously chosen from the subgroup comprising: sodium, potassium, calcium, magnesium, organic cations advantageously chosen from the subgroup comprising:
  • the cations based on amino acid (s) advantageously chosen from the class comprising cations based on lysine or arginine, or cationic polyamino acids advantageously chosen from the subgroup comprising polylysine or oligolysine ;
  • R 4 represents a direct bond or a spacer based on 1 to 4 amino acid residues
  • A is independently -CH 2 - (aspartic residue) or - CH 2 -CH 2 - (glutamic residue);
  • GH is selected from the group consisting of alkoxy radicals of the type: OCH 2 (CH 2 -CH 2 ) 3 g -CH 3 , oleyl, tocopheryl or cholesteryl, and R 4 represents a single valence bond.
  • GH represents a hydrophobic group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 30 is a C2-CO bivalent linear alkylene chain;
  • R 3 ' is H, or "1 H 3' is preferably selected from the group consisting of:
  • the metal cations advantageously chosen from the subgroup comprising: sodium, potassium, calcium, magnesium, the organic cations advantageously chosen from the subgroup comprising:
  • cations based on amino acid (s) advantageously chosen from the class comprising cations based on lysine or arginine,
  • R 50 is a C1 to C8 divalent linear alkylene chain in which one or two methylenes, preferably at each end of R 50 , may be independently replaced by -O- or -NH-;
  • R 4 represents a direct bond or a spacer based on 1 to 4 amino acid residues
  • A independently represents a radical -CH 2 - (aspartic residue) or -CH 2 - CH 2 - (glutamic residue);
  • n '+ m' or n " is defined as the degree of polymerization and varies from 10 to 1000, preferably between 50 and 300.
  • R 4 represents a simple valence bond.
  • PO comprises at least one essentially neutral copolyhydroxyalkylglutamine (preferably alkyl is ethyl) comprising a multiplicity of pendant hydrophobic groups (GH), which are identical or different from each other.
  • the copolyhydroxyalkylglutamine carries hydroxyalkylamino groups. These hydroxyalkylamino groups are preferably bonded to the copolymer via an amide bond.
  • hydroxyalkylamines that can be used to amidify the carboxyl of glutamate residues and to give this copolyhydroxyalkylglutamine are identical or different from each other and are, for example, chosen from 2-hydroxyethylamine, 3-hydroxypropylamine, 2,3-dihydroxypropylamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane and 6-hydroxyhexylamine.
  • At least one of the hydrophobic groups GH is included in a hydrophobic graft comprising at least one patella (or pattern) spacing (spacer) for connecting the hydrophobic group GH to a main chain of copolyglutamates.
  • This patella may comprise, e.g. at least one direct covalent bond or at least one amide bond or at least one ester bond.
  • the patella may be of the type belonging to the group comprising in particular: residues amino acids, aminoalcohol derivatives, polyamine derivatives (eg diamines), polyol derivatives (eg diols) and hydroxy acid derivatives.
  • the grafting of the GH on the copolyglutamate or polyhydroxyalkylglutamine chain can be carried out by the use of precursors of GH, able to bind to the copolyglutamate or copolyhydroxyalkylglutamine chain.
  • the precursors of GH are, in practice and without being limited to, selected from the group comprising alcohols and amines, these compounds being easily functionalized by those skilled in the art.
  • this copolhydroxyalkylglutamine preferably alkyl is ethyl
  • all or part of the hydrophobic radicals GH of the POs are independently selected from the group of radicals comprising: a linear or branched alkoxy having from 6 to 30 atoms of carbon and may comprise at least one heteroatom (preferably O, N or S) or at least one unsaturation,
  • alkoxy having 6 to 30 carbon atoms and having one or more annealed cycloalkyls and optionally containing at least one unsaturation or at least one heteroatom (preferably O, N or S),
  • the hydrophobic group GH is chosen from the group comprising the alkoxy radicals of the type: OCH 2 (CH 2 -CH 2 ) 3 g -CH 3 , oleyl, tocopheryl or cholesteryl, and R 4 represents a single valence bond.
  • n GH groups of the PO in particular according to at least one of the three aforementioned contingencies, each independently represent a monovalent radical of the following formula:
  • R 5 is methyl (alanine residue), isopropyl (valine), isobutyl (leucine), secbutyl (isoleucine), benzyl (phenylalanine);
  • R 6 represents a hydrophobic radical containing from 6 to 30 carbon atoms
  • - 1 varies from 0 to 6.
  • all or part of the hydrophobic radicals R 6 of the PO are independently selected from the group of radicals comprising: a linear or branched alkoxy having from 6 to 30 carbon atoms and which may comprise at least minus one heteroatom (preferably O, N or S) or at least one unsaturation,
  • alkoxy having 6 to 30 carbon atoms and having one or more annealed cycloalkyls and optionally containing at least one unsaturation or at least one heteroatom (preferably O, N or S),
  • the hydrophobic radical R 6 of the PO graft is chosen from the group comprising the alkoxy radicals of the type: OCH 2 (CH 2 -CH 2 ) 3 g -CH 3 , oleyl, tocopheryl or cholesteryl.
  • the main chain of the polyamino acid is: a homopolymer of alpha-L-glutamate or alpha-L-glutamic acid; a homopolymer of alpha-L-aspartate or alpha-L-aspartic acid
  • the distribution of the aspartic or glutamic residues of the main polyamino acid chain of the PO is such that the polymer thus constituted is either random, or of the block type, or of the multiblock type.
  • PO has a molar mass which is between 2,000 and 100,000 g / mol, and preferably between 5,000 and 40,000 g / mol.
  • PO carries at least one graft of polyalkylene glycol type bound to a glutamate or aspartate residue.
  • this graft is of polyalkylene glycol type is of formula (V) below.
  • X is a heteroatom selected from the group consisting of oxygen, nitrogen or sulfur;
  • R 7 and R 8 independently represent H, linear C 1 -C 4 alkyl
  • the polyalkylene glycol is for example a polyethylene glycol.
  • the molar percentage of grafting of the polyalkylene glycol ranges from 1 to 30%.
  • PA active principles such as proteins, peptides or small molecules can spontaneously associate with PO polyamino acid nanoparticles.
  • POs contain ionizable groups which are, depending on the pH and the composition, either neutral (for example -COOH) or ionized (for example -COO " ).
  • the solubility in one phase Aqueous solution is directly a function of the fraction of ionized functions and therefore of the pH
  • the counterion may be a metal cation such as sodium, calcium or magnesium, or an organic cation such as the protonated forms of triethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane or a polyamine such as polyethyleneimine.
  • PO polyamino acid type are obtained, for example, by methods known to those skilled in the art.
  • the random polyamino acids can be obtained by grafting the hydrophobic graft, previously functionalized by the spacer, directly onto the polymer by a conventional coupling reaction.
  • the block or multiblock polyamino acid POs can be obtained by sequential polymerization of the corresponding N-carboxy-amino acid anhydrides (NCA).
  • a polyamino acid, homopolyglutamate, homopolyaspartate or a glutamate / aspartate, block, multiblock or random copolymer is prepared according to conventional methods.
  • NCA N-carboxy-amino acid anhydrides
  • polymers usable according to the invention for example of the poly (alpha-L-aspartic), poly (alpha-L-glutamic), poly (alpha-D-glutamic) and poly (gamma-L-glutamic) type variable masses are commercially available.
  • Alpha-beta polyaspartic acid is obtained by condensation of aspartic acid (to obtain polysuccinimide) followed by basic hydrolysis (see Tomida et al., Polymer, 1997, 18:
  • Coupling of the graft with an acidic function of the polymer is easily achieved by reaction of the polyamino acid in the presence of a carbodiimide as coupling agent and optionally a catalyst such as 4-dimethylaminopyridine and in a suitable solvent such as dimethylformamide (DMF) N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a carbodiimide is, for example, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide.
  • the degree of grafting is chemically controlled by the stoichiometry of the constituents and reactants or the reaction time. Hydrophobic grafts functionalized by a spacer are obtained by conventional peptide coupling or by direct condensation by acid catalysis. These techniques are well known to those skilled in the art.
  • NCA derivatives previously synthesized with the hydrophobic graft are used.
  • the NCA-hydrophobic derivative is copolymerized with the NCA-O-Bz and then the benzyl groups are selectively removed by hydrolysis.
  • PA it is preferably chosen from the group comprising: proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains [preferably polyethylene glycol (PEG): “PEGylated proteins”], peptides, polysaccharides, liposaccharides, oligonucleotides, polynucleotides and mixtures thereof, and, more preferably still, in the subgroup of erythropoietin, oxytocin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, epidermal growth factor, platelet growth factor (PDGF), hematopoietic growth factors and their mixtures, factors VIII and IX, hemoglobins, cytochromes , albumin, prolactin, luteinizing hormone releasing hormone (LHRH), LHRH antagonists, LHRH agonists, human growth hormone (GH), porcine or bovine, growth hormone releasing hormone, insulin , somatostatin, glucagon, interleukins or their
  • PA is a small hydrophobic, hydrophilic or amphiphilic organic molecule of the type belonging to the family of anthracyclines, taxoids or camptothecins or of the type belonging to the family of peptides such as leuprolide or cyclosporine. and their mixtures
  • a small molecule is especially a small non-protein molecule, for example, free of amino acids.
  • the PA is advantageously chosen from at least one of the following families of active substances: alcohol abuse treatment agents, agents for treating Alzheimer's disease, anesthetics, acromegaly treatment agents, analgesics, anti-asthmatics, allergy treatment agents, anti-cancer agents, anti-inflammatories, anticoagulants and antithrombotics, anticonvulsants, antiepileptics, antidiabetics, antiemetics, antiglaucoma, antihistamines, antiinfectives, antibiotics, antifungals, antivirals, antiparkinsonians, anti-cholinergics, antitussives, carbonic anhydrase inhibitors, cardiovascular agents, lipid-lowering agents, anti-arrhythmics, vasodilators, anti-anginal medications, antihypertensives, vasoprotectants, cholinesterase inhibitors, dice central nervous system
  • the mass fraction of PA not associated with micrometric particles [non-associated PA] in% by weight is such that: o [PA not associated] ⁇ 1 o preferably [PA not associated] ⁇ 0.5.
  • 2 nd aspect of the invention the process for obtaining the microparticles by atomization of a solution or a colloidal suspension of PO containing PA.
  • the PO contained in the solution or the colloidal suspension intended to be atomized is at least partly in the form of PO nanoparticles having a size, measured in the Tl test, of less than 500 nm. preferably between 10 and 300 nm, and more preferably still between 10 and 100 nm.
  • the concentration of PO in the solution or the colloidal suspension to be atomized is, for example, between 5 mg / ml and 100 mg / ml, preferably between 10 mg / ml and 40 mg / ml.
  • the PA / PO combination is carried out before or during the atomization step.
  • the PO or PA may be in solid form (preferably a powder) or in the form of a liquid suspension.
  • the PO polymer microparticles associated with at least one active principle (PA) are dispersed in a substantially aqueous liquid medium, said medium preferably containing a dispersion means M1, and the dispersion obtained is freeze-dried.
  • PA active principle
  • the lyophilisate thus obtained has the advantage of facilitating the preparation of liquid formulations based on microparticles (3 rd aspect of the invention described below) because it lyophilisate disperses rapidly in the useful reconstituting liquid for preparing the above liquid formulations .
  • the dispersion means M1 is chosen from the group consisting of: multivalent ions whose polarity is opposite to the polarity of the ionizable groups of the PO polymer and which are contained in the aqueous continuous phase; ii- at least one hydrophilic compound (preferably usable for an injectable preparation) added to the suspension / PO solution to be atomized and thus contained in the atomized PO / PA microparticles; iii- at least one coating of the microparticles with at least one film of at least one hydrophilic compound (preferably used for an injectable preparation); iv- change of pH; v- and combinations of at least two of the means (i) to (iv); the means (i) being particularly preferred.
  • liquid dispersion medium it may contain the same additives as those described for the reconstitution liquid defined below.
  • Liquid Formulations based microparticles obtained by spray-drying a solution or a colloidal suspension of PO containing PA.
  • the formulation according to the invention may be a liquid pharmaceutical form for the prolonged release of PA comprising a low viscosity colloidal suspension, based on PO microparticles associated with at least one PA, these microparticles being those as defined above or those obtained by the process also as defined above and in the examples infra.
  • the qualifiers "low” or “very low viscosity” correspond, advantageously, to a dynamic viscosity at 20 ° C. of less than or equal to 1000 mPa.s.
  • the dynamic viscosity of the formulation measured at 20 ° C, for a shear rate of 1000 s -1 , is preferably less than or equal to 500 mPa ⁇ s, preferably between 2 and 200 mPa ⁇ s. for example, between 1, 0 and 100 mPa.s, or between 1, 0 and 50 mPa.s.
  • the reference measurement for the dynamic viscosity can be carried out, for example, at 20 ° C. using an AR1000 rheometer (TA Instruments) equipped with a cone-plane geometry (4 cm, 2 °). Viscosity v is measured for a shear rate of 10 s * 1 .
  • This low viscosity makes the formulations of the invention easily injectable parenterally, particularly mucosally, subcutaneously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally or into a tumor.
  • the formulation according to the invention can also be administered orally, nasally, pulmonary, vaginal or ocular, among others.
  • the viscosity of the liquid formulations of the invention is low both at injection temperatures corresponding to ambient temperatures, for example between 4 and 30 ° C, than at physiological temperature.
  • dry microparticles formed by atomization of amphiphilic PO may further be readily redispersed to form low viscosity suspensions or microparticulate solutions.
  • said formulation comprises a means M2 for dispersing the microparticles of PO / PA.
  • M2 of dispersion may differ depending on the nature of the continuous phase (that is to say the reconstitution liquid) of the suspension forming part of the formulation.
  • the continuous phase of the suspension is essentially aqueous
  • the continuous phase of the suspension is an essentially organic phase miscible with water.
  • the continuous phase of the suspension is an essentially organic phase immiscible with water.
  • the continuous phase of the suspension is an essentially organic phase miscible or not with water.
  • continuous essentially aqueous phase is meant, for example, a liquid containing at least 60% by weight of water.
  • essentially organic continuous phase is meant, for example, a liquid containing at least 60% by weight of organic phase.
  • dispersion means M2 is for example chosen from the group consisting of: multivalent ions whose polarity is opposite to the polarity of the ionizable groups PO polymer and which are contained in the aqueous continuous phase; ii- at least one hydrophilic compound (preferably usable for an injectable preparation) added to the suspension / PO solution to be atomized and thus contained in the atomized PO / PA microparticles; iii- at least one coating of the microparticles with at least one film of at least one hydrophilic compound (preferably used for an injectable preparation); iv- change of pH; v- and combinations of at least two of the means (i) to (iv); the means (i) being particularly preferred.
  • the dispersion means M2 is for example chosen from the group consisting of: multivalent ions whose polarity is opposite to the polarity of the ionizable groups PO polymer and which are contained in the aqueous continuous phase; ii- at least one hydrophilic compound (
  • the dispersion means M2 may comprise multivalent ions whose polarity is opposite to the polarity of the ionizable groups GI (at least partially ionized) of the polymer PO and which are introduced into the phase aqueous continuous, when reconstituting the suspension / solution that forms the suspension.
  • multivalent ions denotes, for example, divalent ions, trivalent ions, tetravalent ions and mixtures of these ions.
  • the multivalent ions are multivalent cations, preferably divalent cations, more preferably still selected from the group consisting of: Mg + , Ca + , Zn + , Fe + , Cu 2+ or mixtures thereof, or trivalent cations, more preferably still selected from the group consisting of: Al 3+ , Fe 3+ or mixtures thereof.
  • the formulation according to the invention contains monovalent ions (eg cations), possibly active in the aggregation of nanoparticles into microparticles.
  • multivalent ions are brought into the formulation of the invention, preferably in the form of aqueous saline solution (organic or inorganic), for example a solution of sulfate, chloride, acetate, gluconate or glutamate (or other anionic amino acid) of cations. multivalent.
  • This multivalent ion-dispersing means M2 is more preferable in the case where the amphiphilic PO (for example a (co) polyamino acid) is relatively hydrophilic.
  • the amphiphilic PO for example a (co) polyamino acid
  • the dispersion means M2 can essentially comprise:
  • At least one hydrophilic compound (preferably used for an injectable preparation) added to the suspension / PO solution to be atomized and thus contained in the atomized PO / PA microparticles;
  • M2 of dispersion can be incorporated in the formulation according to several modes.
  • At least one hydrophilic compound chosen from those used in an injectable preparation preferably selected from the group comprising:
  • ⁇ amino acids eg lysine, arginine, glycine
  • Polyalkylene glycols preferably polyethylene glycols
  • Copolyalkylene glycols preferably ethylene glycol-propylene glycol copolymers (of the Poloxamer, Pluronic or Lutrol type);
  • Cellulosic polymers and their derivatives preferably carboxyalkylcelluloses (eg carboxymethylcelluloses) or alkylcelluloses (eg methylcelluloses);
  • Polyols such as propylene glycol or glycerol
  • Nitrogen-containing (co) polymers preferably those contained in the group comprising polyacrylamides, poly-N-vinylamides, polyvinylpyrrolidones (PVP) and polyvinylvinyl lactams;
  • the microparticles are coated with at least one layer of at least one hydrophilic compound as defined above.
  • the hydrophilic compound preferably comprises at least one hydrophilic polymer chosen from hydrophilic compounds as defined above.
  • the M2 (ii) dispersion means based on at least one hydrophilic compound has proved particularly suitable for amphiphilic POs having a sufficiently high hydrophobicity, for example a level of GH groups greater than or equal to 10 mol% for a PO constituted by at least one polyamino acid.
  • the coating (average M2 (iii)) of the microparticles with such a layer of hydrophilic and biocompatible compound can be, for example, carried out by two successive atomizations; the second atomization, carried out on a suspension of particles in a solvent immiscible with said microparticles, can contribute to facilitating the dispersion of these particles.
  • M2 (iii) of dispersion by hydrophilic coating of the microparticles, allows the suspension of microparticles to remain intact and stable for at least a few days, which makes its handling easier.
  • the combination of a means M2 (ii) or (iii) for dispersing the microparticles based on hydrophilic compound (s) and a divalent ion-based dispersion medium M2 (i), contained in the aqueous phase during the reconstitution of the formulation allows accelerated dispersion.
  • the aqueous continuous phase or the hydrophilic coating may also contain at least one injectable surfactant such as
  • Tween® 80 a lecithin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine or a polyoxypropylene-polyoxyethylene copolymer (trade name: Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
  • Another dispersible means that can be envisaged according to the invention consists of a means of dispersion by pH change, preferably before atomization.
  • This type of means has proved suitable especially in the case where the amphiphilic PO (for example polyamino acid) is a compound bearing ionizable functions and is otherwise very hydrophilic, that is to say comprising, for example, less than 10 mol% of hydrophobic groups GH.
  • this pH changing dispersion means (iv) before atomization is applied to the suspension / PO solution just before the atomization.
  • M2 (ii) or (iii) of dispersion based on hydrophilic compound preferably by coating M2 (iii) microparticles with at least one hydrophilic polymer.
  • the dispersing means consists of this organic phase which is miscible with water.
  • This phase can thus contain, for example, ethanol, N-methylpyrrolidone, dimethylsulfoxide, isopropanol, glycerol or glycofurol (tetrahydrofurfuryl alcohol polyethylene glycol ether).
  • the dispersing means comprises a lipophilic liquid, whose melting temperature is preferably less than or equal to 15 C, contained in the continuous organic phase immiscible with water.
  • the lipophilic liquid comprises at least one mixture of triglycerides of saturated fatty acids or at least one vegetable oil or at least one lipid or at least one lipid derivative or at least one fatty acid or at least one acid derivative.
  • the lipophilic liquid comprises:
  • At least one vegetable oil preferably soybean oil, palm oil, linseed oil, cottonseed oil, sesame oil, sunflower oil, peanut, • at least one lipid, preferably liquid lecithin, synthetic or natural vitamin E;
  • At least one lipid derivative preferably arachidoylphosphatidylcholine and stearoylphosphatidylcholine, At least one fatty acid, preferably oleic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and their salts;
  • At least one fatty acid derivative preferably a mono-, di- or triglyceride derivative, ethyl oleate, lauryl lactate, glyceryl stearate, sorbitan palmitate, sorbitan stearate, sorbitan monoleate, polysorbate;
  • the triglyceride derivatives of fatty acids are particularly preferred, in particular a mixture of triglycerides of saturated C 8 -C 0 0 fatty acids derived from coconut oil, for example that marketed under the name Miglyol 812 by Sasol) .
  • Other long-chain fatty acid triglycerides that can be used include vegetable oils such as soybean oil, palm oil, linseed oil, cottonseed oil, sesame oil, and the like. , sunflower oil or peanut oil.
  • Atomized PO / PA powders disperse readily into this water-immiscible organic phase to give stable suspensions of microparticles which retain their integrity for several days and are, therefore, again easily manipulable. This dispersion is particularly rapid without the need to add other means (s) of dispersion, even if this possibility is possible.
  • the dispersing means comprises a coating of the microparticles with at least one film-forming coating compound (preferably used for an injectable preparation).
  • the film-forming compound comprises at least one hydrophobic polymer chosen from the group comprising polylactides, polyglycolides, poly (lactide-co-glycolide), polyorthoesters, polyanhydrides, polyhydroxybutyric acids and polycaprolactones. polyalkylcarbonates, water-insoluble PO polymers, their derivatives and mixtures thereof.
  • the film-forming coating compound is of lipidic nature and has a melting point of preferably greater than or equal to 15 ° C. and comprises at least one mixture of saturated fatty acid triglycerides or at least one vegetable oil. or at least one lipid or at least one lipid derivative or at least one fatty acid or at least one fatty acid derivative or a mixture of these products.
  • the organic continuous phase for example hydrophobic, or hydrophobic coating bit (s) may also contain at least one injectable surfactant such as Tween ® 80, lecithin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine or a polyoxypropylene-polyoxyethylene copolymer (trade name: Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
  • injectable surfactant such as Tween ® 80, lecithin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine or a polyoxypropylene-polyoxyethylene copolymer (trade name: Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
  • the injectable formulation comprises other additives, on the one hand those hereafter referred to as "excipients / stabilizers", and on the other hand conventional excipients.
  • excipients / stabilizers may be selected from the group consisting of:
  • Polyalkylene glycols preferably polyethylene glycols; Copolyalkylene glycols, preferably ethylene glycol-propylene glycol copolymers (of the Poloxamer, Pluronic or Lutrol type);
  • Cellulosic polymers and their derivatives preferably carboxyalkylcelluloses (eg carboxymethylcelluloses) or alkylcelluloses (eg methylcelluloses);
  • sorbitan esters of fatty acid preferably polyoxyalkylene (eg ethylene) glycol esters and at least one acid (eg oleic acid), of the Tween type, (or polysorbate);
  • Polyols such as propylene glycol or glycerol; -> gelatin preferably hydrolysed; nitrogen-containing (co) polymers, preferably in the group comprising polyacrylamides, poly-vinyl-vinylamides, polyvinylpyrrolidones (PVP) and poly-N-vinyl-lactams;
  • PVA polyvinyl alcohols
  • One of the excipients (stabilizers) preferred according to the invention is formed by nanoparticles of at least one PO polymer, identical or different (preferably identical) from that constituting the microparticles.
  • the amount of excipient / stabilizer used in the formulation is preferably between 0.01 and 10% by weight, and more preferably between 0.1 and 5% by weight.
  • the stabilizers comprising nanoparticles
  • they are advantageously used in the formulation in a proportion of 1.5 to 3.5% by weight, for example 2.0 to 3.0 ( ⁇ 2.5)% by weight.
  • the reconstitution liquid used in the preparation of the formulation according to the invention may comprise, for example: at least one buffer or at least one injectable salt (phosphate buffer, citrate buffer, chloride of sodium) in concentration for example between 0.001 M and 0.1 M, preferably between 0.005 M and 0.02 M, this buffer or injectable salt for adjusting the pH of the solution; at least one injectable surfactant, preferably of the polysorbate type, such as
  • the reconstitution liquid may further contain densifying agents such as saccharides, ie e.g. sucrose, D-mannitol or trehalose in concentrations of between 0.1% and 10%, preferably between 0.5 and 5%.
  • densifying agents such as saccharides, ie e.g. sucrose, D-mannitol or trehalose in concentrations of between 0.1% and 10%, preferably between 0.5 and 5%.
  • the reconstitution solution may also contain an injectable viscosifying polymer selected from the group consisting of polysaccharides, synthetic polymers (eg, sodium carboxymethylcellulose), polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyalkylene glycols (e.g. polyethylene glycols) and mixtures thereof.
  • amphiphilic PO eg polyamino acid
  • ad hoc means of reconstitution thus makes it possible to meet the double objective which is to be able to obtain pharmaceutical formulations both stable and easily dispersible to allow their parenteral injection.
  • the other conventional excipients which can be added to the suspension / solution to be atomized or to the formulation according to the invention are, for example, antimicrobials, buffers, antioxidants, or isotonicity adjusting agents known to those skilled in the art.
  • antimicrobials for example, antimicrobials, buffers, antioxidants, or isotonicity adjusting agents known to those skilled in the art.
  • buffers for example, buffers, antioxidants, or isotonicity adjusting agents known to those skilled in the art.
  • isotonicity adjusting agents known to those skilled in the art.
  • formulation according to the invention is preferably pharmaceutical, this does not exclude cosmetic, dietary or phytosanitary formulations comprising at least one PO as defined above and at least one PA.
  • the PO / PA microparticles and the essentially aqueous reconstitution liquids, the essentially organic and water miscible reconstitution liquids and the essentially water-immiscible organic liquids are defined above.
  • the PO / PA microparticles and the essentially aqueous reconstitution liquids, the essentially organic and water miscible reconstitution liquids and the essentially water-immiscible organic liquids are defined above.
  • This formulation for the sustained release of PA comprises a dry powder form for inhalation and pulmonary administration based on PO / PA microparticles defined above.
  • the present invention also relates to solid products derived from the microparticles of PO according to the invention.
  • these derived products may in particular be constituted by powders, gels, implants or films, among others.
  • the invention relates to products derived from the formulation according to the invention, taken as such, regardless of their method of production.
  • the invention also relates to a method of therapeutic treatment consisting essentially of administering a therapeutically effective amount of the formulation as described herein, parenterally, in particular mucosally, subcutaneously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally. , intracerebral or in a tumor.
  • the formulation according to the invention can also be administered orally, nasally, pulmonary, vaginal or ocular, among others.
  • this method of therapeutic treatment consists in administering the formulation as described above by parenteral injection: subcutaneously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally or in a tumor, preferably so that it forms a deposit at the injection site.
  • the solution was cooled to 15 ° C and successively 2.5 g of D, L-alpha-tocopherol (> 98%, obtained from Fluka ®), previously solubilized in 8 ml of DMF, 280 mg of 4-dimethylaminopyridine dissolved beforehand in 1 ml of DMF and 1.6 g of diisopropylcarbodiimide previously solubilized in 6 ml of DMF.
  • the precipitated polymer is then recovered by filtration, washed with 0.1 N hydrochloric acid, water and with diisopropyl ether.
  • the polymer is then dried in an oven under vacuum at 40 ° C. A yield of the order of 90% is obtained.
  • the molar mass measured by size exclusion chromatography is 15500 relative to a polyoxyethylene standard.
  • the grafted tocopherol level, estimated by proton NMR spectroscopy, is 5.1 mol%.
  • a suspension of nanoparticles of the polymer in water is obtained by solubilizing it in water and adjusting the pH to 7 ⁇ 1 (neutralization of the carboxylates).
  • EXAMPLE 2 SYNTHESIS OF AN AMPHIPHILE PO-B POLYMER
  • Example 2 is adapted from Example 1, aiming for a grafting rate of 20%
  • the mixture is left for 14 hours at room temperature.
  • the solution is filtered through a 0.2 ⁇ m sterilizing filter.
  • the solution is atomized on a spray-drying apparatus of B ⁇ chi B290 type.
  • the liquid solution is aspirated at a rate of 5 ml / min and nebulized through a spray nozzle fed with nitrogen (700 kPa - 900 1 / h).
  • the suction flow rate (drying air) is 40 m 3 / h.
  • the inlet temperature is maintained at 90 ° C., which induces under these conditions a temperature at the outlet of 45 ° C.
  • the HFN assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the PO polymer and interferon solution is prepared in the same manner as in Example 3. 0.9 g of polysorbate 80 are added to the solution before atomization.
  • the IFN assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the PIFN assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • a powder of dry microparticles of PO-A and IFN polymer is obtained from a PO-A / IFN mixture according to the protocol used in Example 3.
  • the IFN assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the PIFN assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • EXAMPLE 8 PREPARATION OF DRY MICROMETRIC PARTICLES OF POLYMER PO-A CONTAINING HGH
  • a recombinant human growth hormone solution (concentration 3.9 mg / g) are thawed for 90 min at 25 ° C. and concentrated approximately 6 times by frontal ultrafiltration on an exclusion limit membrane of 10 kD until to obtain a concentration of 24 mg / g (controlled by HPLC).
  • the HPLC assay of hGH is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the mixture containing 20 mg / g of PO polymer and 1.25 mg / g of IL-2 is left overnight at room temperature and then filtered through a 0.2 ⁇ m sterilizing filter.
  • the IL-2 assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the solution is then atomized on a spray-drying apparatus of B ⁇ chi B290 type.
  • the liquid solution is aspirated at a rate of 5 ml / min and nebulized through a spray nozzle fed with nitrogen (700 kPa - 900 1 / h).
  • the suction flow rate (drying air) is 40 m 3 Vh.
  • the inlet temperature is maintained at 120 ° C., which induces under these conditions a temperature at the outlet of 70 ° C.
  • the insulin assay by HPLC is identical to that of the solution before atomization. No degraded form is detected.
  • the size of the microparticles is measured according to the TO test and the stability according to the S 1 test.
  • the evaluation of the degradation of the protein is carried out by HPLC by comparing a chromatogram of the formulation before and after atomization.
  • Atomization is a method that can degrade the protein. HPLC analysis shows that no form of degradation is observed by comparing the chromatograms before and after atomization.
  • the atomization of a protein in the presence of an amphiphilic polyamino acid leads to microparticles that are stable over time and does not induce degradation of the protein.
  • powders can be used in solid form (inhalation, needleless injection by a pressure gun for example) or in the form of an injectable suspension after reconstitution in a suitable medium.
  • EXAMPLE 12 SUSPENSION RECONSTITUTION FROM THE POWDERS OF EXAMPLES 3 TO 10
  • the samples are then evaluated by carrying out the following steps: dispersion in one of the abovementioned media transfer into a syringe and injection through a 25G syringe
  • the suspension is considered to have good properties if at least 80% is recovered by suction / injection through a 25G needle.
  • EXAMPLE 13 VISCOSITY MEASUREMENT OF THE RECONSTITUTED FORMULATIONS
  • a dispersion of the powders at 30 mg / ml in the media B and C of the preceding examples (except for 5 in the medium B) give stable, low-viscosity suspensions; in medium B, the viscosities measured are all less than 10 mPa.s and in medium C, the viscosities are all of the order of 30 to 40 mPa.s.
  • a composition of the same nanoparticulate polymers according to the prior art can not be obtained at this concentration (30 mg / mL) in the acceptable viscosity values ( ⁇ 100 mPa.s).
  • the particles are first prepared as described in Example 3.
  • the atomization step is performed under aseptic conditions and the particles are recovered in a sterile container.
  • the particles are recovered and redispersed under aseptic conditions in an aqueous solution of MgCl 2 0.10 M.
  • the amount of MgCl 2 solution added is adjusted so that the polymer concentration PO-A in the suspension is approximately 40 mg / ml.
  • the pH is adjusted to 6.5 by adding 1N sodium hydroxide. Lyophilization
  • the suspension is divided into Lyoguard ® containers to keep the suspension sterile during lyophilization: the containers are then sterilized lyophilized during a 72 h cycle on a laboratory freeze-dryer (Christ benchtop module, Osterode, Germany). The powder is sterilely distributed in vials before use.
  • EXAMPLE 15 COMPARISON OF THE RECONSTITUTION OF THE POWDERS OF MICROPARTICLES OBTAINED FROM EXAMPLE 3 AND THOSE OF EXAMPLE 14
  • the volumes of reconstituted suspension are identical in both cases (about 1 ml) and the reconstitution vials are identical (3 ml glass vials).
  • the amounts of powder are adjusted so that the two suspensions finally contain 40 mg / ml of polymer and 0.5 mg / ml of IFN- ⁇ -2b.
  • the powder of Example 3 is reconstituted in an aqueous solution of MgCl 2 0.1 M while the powder of Example 14 (which already contains Mg 2+ ions) is reconstituted in pure water.
  • the bottles are stirred manually. While the powder of Example 3 requires at least 15 min to redisperse, the dispersion is faster for the powder of Example 14 and in less than 5 min, a homogeneous suspension is obtained. A magnetic bar is then inserted into the flasks and the two flasks are shaken in an identical manner for 1 h.
  • the characteristics of the two suspensions are compared: the particle size and the viscosity of the two suspensions are similar.
  • EXAMPLE 16 PHARMACOKINETICS OF IFN IN THE DOG AFTER SUB-CUTANEOUS INJECTION OF A FORMULATION BASED ON AMPHIPHILIC POLYAMINOACIDES IN THE MICROPARTICULAR FORM Eight naive Beagle dogs (weight of 9 ⁇ 0.6 kg) were treated with the following formulations:
  • IR-IFN IR for immediate release, ie immediate release
  • PCGen a recombinant human interferon solution
  • the particles of the formulation 1 are prepared according to Example 14 from the same batch of interferon PCGen: the lyophilized powder is resuspended in water sterilely (in a laminar flow hood) according to a process similar to that described in example 15.
  • C max is the maximum serum concentration in IFN
  • T> 50 ⁇ g / ml is the time when the serum concentration of IFN is greater than
  • AUC represents the area under the serum IFN concentration versus time curve
  • RBA represents bioavailability compared to an Immediate Release formulation
  • T 50 o / oauc represents the time required to release 50% of released PIFN in total.
  • the IFN IR has a rapid release profile with a peak serum concentration of 25.2 ⁇ 0.4 ng / mL achieved after a median time of 5 h (range: 3-5 h).
  • the circulating IFN is no longer quantifiable beyond 24 hours.
  • Formulation 1 provides a major change in the pharmacokinetic profile of IFN, with very slow release, and a peak serum concentration of 0.5 ⁇ 0.2 ng / mL (50 times lower than that of the IR form) reached after a median time of 60 h (range: 48 - 96 h).
  • the general pattern of pharmacokinetics is a flat profile pseudoplatter.
  • the circulating IFN level returns to an unquantifiable concentration between 192 h and 240 h (8 and 10 days).
  • the T 5 o % aUc is about 20 times higher than that of the IFN IR.
  • EXAMPLE 17 PHARMACOD YNAMIE OF INSULIN IN DOGS AFTER SUBCUTANEOUS INJECTION OF A FORMULATION BASED ON AMPHIPHILIC POLYAMINO ACIDS IN MICROP ARTICULAR FORM
  • Lantus ® is a modified insulin analog (insulin glargine - Sanofi-Aventis).
  • the modification of two amino acids on the primary structure of human insulin gives Lantus ® extended release properties over a 24 hour period via in situ precipitation.
  • a group of 6 healthy Beagle dogs (weight of 11.4 ⁇ 1 kg) were treated with the Lantus formulation in a 2-period crossover trial and a group of 8 healthy Beagle dogs (weight 1 1, 8 ⁇ 1 kg) was treated with Formulation 2, two by two, in a 4-period crossover trial.
  • the summary table of treatments is summarized below:
  • the particles of the formulation 2 are prepared according to Example 10 by aiming at a ratio of 30 mg of PO polymer for 3.5 mg (100 IU) of insulin.
  • the formulation is prepared by dispersing the atomized powder in 0.1 M MgCl 2 and magnetic stirring of the suspension for 1 h.
  • the pH of the formulation is 6.2 and the osmolality is 348 mOsm.
  • the blood glucose is measured by enzymatic method (hexokinase) on an automaton of biochemical blood tests (Advia 1650, Bayer Diagnostics).
  • the analysis of pharmacodynamic results is performed on the percentage of basal glucose as a function of time.
  • the pharmacodynamic data are grouped in the following table:
  • Area Percent Glycemia Curve represents the area between the basal blood glucose (100%) and the curve representing the evolution of blood glucose
  • - T 50 % APGC represents the time required to obtain 50% of the APGC 0-36I1 .
  • the administration of the Lantus ® reference leads to a rapid decrease in blood glucose levels in the first hour.
  • the hypoglycemic action of insulin glargine is then maintained over a period of between 18 and 36 hours (return of blood glucose to basal level after 30 hours on average).
  • the duration of action of the formulation 2 is clearly greater than that of the long-acting reference Lantus ® . This is illustrated by an average value of T50% APGC higher for formulation 2.

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles microparticules de polyaminoacides amphiphiles transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdites microparticules de PA. Le but de l'invention est de mettre au point de nouvelles microparticules chargées en PA obtenues par agrégation de nanoparticules de polyaminoacides amphiphiles, et ayant des propriétés améliorées, notamment sous forme solide sèche, au regard de leur aptitude à la dispersion, et, s'agissant de la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être facilement manipulée et injectée. L'invention concerne dans un premier aspect, des microparticules de polyaminoacide amphiphile (PO) contenant au moins un PA (associé de façon non covalente), formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique; lesdites microparticules étant caractérisées a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taillecomprise entre 0,5 et 100 µm, c. et en ce qu'elles sont dispersables en suspension colloïdale. L'invention concerne également le procédé de préparation de ces microparticules, une formulation liquide comprenant une suspension de ces microparticules PO/PA, un procédé et un nécessaire de reconstitution de cette formulation, et une forme sèche de cette formulation.

Description

MICROPARTICULES À BASE DE COPOLYMÈRE AMPHTPÏHLE ET DE
PRINCIPE(S) ACTIF(S) À LIBÉRATION MODIFIÉE ET FORMULATIONS
PHARMACEUTIQUES EN CONTENANT
Domaine de l'invention La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits transporteurs de PA. Les applications thérapeutiques (humaines et vétérinaires) de ces formulations sont nombreuses. La référence PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe actif.
Par "libération modifiée", on désigne une libération prolongée ou retardée ou pulsatile.
Plus précisément les nouveaux transporteurs de PA visés par l'invention sont des microparticules de polymères amphiphiles, par exemple des polyaminoacides modifiés par des groupements hydrophobes. Ces microparticules contiennent au moins un PA associé au polymère et peuvent se présenter sous forme de suspensions colloïdales ou sous forme sèche.
Contexte de l'invention Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques, notamment des peptides et protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma, ce qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil en dents de scie, caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que l'interleukine IL-2. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des conséquences graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ;
2 - viscosité de la formulation suffisamment basse pour être aisément injectable ;
3 - forme biocompatible et biodégradable ;
4 - forme ne présentant ni toxicité, ni immunogénicité ; 5 - forme ayant une excellente tolérance locale.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses, de nano- particules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'adminis- tration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la protéine thérapeutique a été associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles. Le brevet US-B-5,904,936 décrit des particules submicroniques (NPV) - de taille moyenne comprise entre 0,01 et 0,5 μm - et des particules micrométriques (microniques) (MPV) - de taille moyenne comprise entre 0,5 et 20 μm - de copolymère amphiphile de poly- aminoacides comprenant au moins deux types d'aminoacides, l'un étant neutre hydro- phobe, l'autre étant ionisable. Des protéines telles que l'insuline s'adsorbent spontanément en solution aqueuse à ces particules. Le copolymère de polyaminoacide est, par exemple, un copolymère bloc de poly(L-leucine-b-L-glutamate de sodium). Ce brevet décrit l'agrégation de NPV en MPV par addition à une suspension colloïdale de poly-Leu/Glu de sels monocationiques (sulfate d'ammonium), polycationiques (Fe2+, Fe3+, Zn2+, Ca2+, Al2+, Al3+ ou Cu2+), d'acide (HCl) ou de polymères cationiques (polylysine). La demande de brevet WO-A-03/104303 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au moins une partie de ces résidus étant porteurs de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol (par ex.: polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou naturelle). Ces homopolyaminoacides modifiés hydrophobes forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à s'associer aisément en suspension aqueuse à pH = 7,4 avec au moins une protéine active (insuline). La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (par ex. insuline) vectorisée par les suspensions selon US-B-5,904,936 ou WO- A-2003/104303 gagnerait à être augmentée. L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette demande est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001 - 0,5 μm) de poly(L- glutamate de sodium) modifié hydrophobe, utilisée à une concentration telle qu'après injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typiquement d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours seulement.
Objectifs de l'invention
II est souhaitable d'améliorer cet art antérieur en proposant une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée de PA :
• permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée pour des PA (par ex. protéines, peptides thérapeutiques et petites molécules) non dénaturés et fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
• et qui serait stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique.
Pour ce faire, il convient d'agréger entre elles les nanoparticules de la formulation selon WO 05/051416 en microparticules, au moyen d'ions multivalents de polarité opposée à celle des groupements (GI) ionisables du polyaminoacide amphiphile, lesdits ions étant présents dans des proportions bien définies. Cela conduit à une sélection d'une population spécifique de microparticules, permettant une prolongation significative de la durée de libération du PA (par ex. protéine ou peptide) avec lequel elles sont associées. Certains ions multivalents, comme Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+Ou leurs mélanges ou Al3+, Fe3+ ou leurs mélanges, confèrent une excellente tolérance à une telle formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA. Cette formulation peut par exemple comprendre une suspension colloïdale, aqueuse, de basse viscosité, à base de particules micrométriques de polyglutamate greffé par l'alpha- tocophérol d'origine synthétique, de taille comprise entre 0,5 et 100 μm, contenant des ions multivalents Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ Al3+ ou Fe3+, avec un rapport r, répondant à la formule r = « χ k — y , où
- n est la valence desdits ions multivalents,
- [IM] est la concentration molaire en ions multivalents, - [GI] est la concentration molaire en groupements ionisables GI,
compris entre 0,3 et 10.
Ces particules micrométriques sélectionnées sont issues de l'agrégation d'un grand nombre de nanoparticules de copolymère amphiphile.
Une suspension de microparticules chargée en PA (par ex. hGH) peut ainsi être fabriquée par floculation avec des ions multivalents Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ Al3+ ou Fe3+, cette floculation étant suivie d'une maturation et d'un lavage. La suspension peut être ensuite lyophilisée ou atomisée puis reconstituée avec de l'eau pour réaliser une formulation prête à injecter.
Il est clair que ces formes de poudres sèches de microparticules sont a priori avantageuses au regard de la conservation. En effet, elles devraient permettre d'accroître la stabilité physique de ces microparticules et la stabilité du PA. Cependant, dans le cadre d'une utilisation thérapeutique de ces poudres de microparticules par voie parentérale, la difficulté consiste à pouvoir aisément disperser (ou mettre en suspension) extemporanément ces poudres pour obtenir une forme liquide micro- particulaire, plus précisément une suspension reconstituée qui soit stable, par exemple au moins pendant quelques minutes, voire au moins quelques dizaines de minutes, à température ambiante. Cette stabilité est notamment recherchée afin de permettre une manipulation aisée de cette suspension reconstituée. Il importe également que cette suspension reconstituée puisse être facilement injectée par passage au travers d'une aiguille creuse associée à une seringue ou à un stylo d'injection (type stylo à insuline). Enfin, il convient de tenir compte du fait que les opérations de dispersion, de manipulation et d'injection de la suspension reconstituée sont destinées à être exécutées par les patients ou le personnel médical.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention serait de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-05/051416, ces microparticules étant chargées en PA et ayant vocation à présenter des propriétés améliorées, notamment sous forme solide sèche, en particulier au regard de leur aptitude à la dispersion (ou dispersibilité), et, s'agissant de la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être facilement manipulée et injectée. Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant de bonnes propriétés de dispersion que ce soit en phase aqueuse ou organique, tout en conservant l'intégrité desdites microparticules.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant d'excellentes propriétés de stabilité sous forme solide et sèche.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation de microparticules sous forme solide et sèche, ces microparticules étant par ailleurs :
— » obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-05/051416, -» chargées en PA,
— » et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation de microparticules sous forme solide et sèche, du type de celui visé dans l'objectif précédent et qui soit par ailleurs simple, économique et industriel.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique comprenant de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-03/ 104303, ces microparticules étant par ailleurs :
— » chargées en PA,
— » et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée de PA, remédiant aux carences de l'art antérieur, et en particulier permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée de PA (par ex. protéines, peptides thérapeutiques ou petites molécules) non dénaturés. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous- cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée de protéines ou peptides thérapeutiques fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à libération prolongée du PA in vivo, qui soit stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à libération prolongée du PA in vivo, qui présente au moins l'une des propriétés suivantes : biocompatibilité, biodégradabilité, atoxicité, bonne tolérance locale.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée lente de PA in vivo, comprenant des microparticules de polymère PO amphiphile auto-associées à au moins un PA (microparticules PO/PA), le polymère PO étant un polymère biodégradable, hydrosoluble, porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI) au moins en partie ionisés) formant spontanément dans l'eau une suspension de nanoparticules colloïdales, ce polymère PO étant, par exemple, un polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement hydrophobe GH, dans la chaîne ou en bout de chaîne.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nécessaire de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce nécessaire étant par exemple simple à l'utilisation, de sorte qu'il puisse être mis en œuvre aisément par le patient ou par le personnel médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce procédé étant par exemple simple à mettre en œuvre en particulier par le patient ou le personnel médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA, en particulier une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire :
• à base de microparticules de PO associées à au moins un PA telles que définies dans les objectifs sus-énoncés ; ou
• obtenue à partir de la formulation telle que définie dans les objectifs sus- énoncés.
Brève description de l'invention
Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à fait surprenante et inattendue, l'atomisation de formulations à base de PO amphiphile (par exemple de copolyamino-acides) et de PA conduit à des microparticules PO/PA sèches, très stables, permettant de reconstituer des suspensions aqueuses de microparticules en milieu liquide dont la taille est comprise entre 0,5 et 100 μm. Par ailleurs, les inventeurs ont eu le mérite de mettre au point des moyens de reconstitution d'une suspension à partir de ces microparticules, lesdits moyens permettant d'optimiser leur dispersion aussi bien en phase liquide aqueuse qu'en phase liquide organique.
Une dispersion aisée, de bonne qualité et stable est en effet un préalable à l'utilisation de ces suspensions reconstituées à partir de microparticules sèches PO/PA, à titre de formulations injectables. L'atomisation est une technique industrielle connue pour obtenir des particules sèches à partir d'une solution ou suspension de la matière constitutive desdites particules. L'atomisation ou spray drying consiste à évaporer très rapidement dans un flux d'air ou de gaz inerte chaud des gouttelettes nébulisées de cette solution ou suspension. Dans le domaine pharmaceutique, l'atomisation peut être délicate car elle impose une contrainte thermique qui peut s'avérer rédhibitoire pour certains PA thermosensibles tels que les PA à base de protéines ou d'autres composés peptidiques. Le recours à l'atomisation pour produire des particules sèches à base d'excipients et de PA ne va donc pas de soi, sauf à choisir des excipients aptes à empêcher ou à minimiser la dénaturation des PA peptidiques.
C'est ainsi que la demande US-A-2005/0158392 divulgue la préparation de microparticules solides lipophiles chargées en PA peptidique par atomisation. Cette dernière consiste soit à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et un agent de surface lipophile (par ex. lécithine) voire un autre tensioactif du type Tween 80 ; soit, dans un premier temps, à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et éventuellement un tensioactif du type Tween® 80 pour obtenir des particules primaires, et, dans un deuxième temps, à atomiser une solution alcoolique d'agent de surface lipophile (par ex. lécithine) dans laquelle sont dispersées les particules primaires. On met l'accent dans cette demande US sur la combinaison protectrice acide hyaluronique et agent de surface lipophile (par ex. lécithine), ce dernier étant destiné à former un film d'enrobage des microparticules à base d'acide hyaluronique et de PA. Ce document ne fait pas mention ni même allusion à la mise en œuvre de PO amphiphiles et encore moins de copolyaminoacides amphiphiles, à titre d'excipients ou de transporteurs de PA formant ensemble les microparticules. Un autre exemple d'atomisation est celui décrit dans l'article Maa et al, J Pharm
Sci, 87(2), 152-159, 1988. Selon ce document, le PA (l'hormone de croissance humaine) est complexé par du zinc en présence de tensio-actifs biodégradables, avant d'être atomisé en microparticules.
Il apparaît donc que l'atomisation de protéines est une opération délicate nécessitant l'utilisation de formulations complexes comprenant de nombreux excipients présents pour protéger le PA lors du procédé et garantir sa stabilité au stockage, ce qui est particulièrement crucial pour certaines molécules sensibles telles que l'hormone de croissance humaine ("human Growth Hormone" hGH).
Par ailleurs, le mérite des inventeurs est d'autant plus grand que l'art antérieur n'enseigne rien sur le difficile problème de la dispersion et de la stabilisation dans un liquide de microparticules sèches (s'agissant notamment des microparticules de PO amphiphile) conçues pour la libération prolongée de PA. D'où il s'ensuit que l'invention concerne dans un premier aspect, des microparticules de polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère PO :
• étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles,
• formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique,
• et étant associé de façon non covalente avec le PA ; lesdites microparticules étant caractérisées : a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 μm, de préférence entre 1 et 70 μm, de préférence entre 2 et 40 μm, c. et en ce qu'elles sont dispersibles en suspension colloïdale dans un test de dispersibilité DPl .
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation de microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA), ces microparticules PO/PA étant en particulier celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention, i. le polymère PO :
• étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés), • formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique,
• et étant associé de façon non covalente avec le PA ; ii. lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 μm, de préférence entre 1 et 70 μm, de préférence entre 2 et 40 μm, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution ou une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
Selon une variante intéressante, les microparticules obtenues par atomisation sont redispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux (de préférence comprenant des ions multivalents comme moyen de dispersion) puis la dispersion obtenue est lyophilisée.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO, contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention.
Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un nécessaire de reconstitution en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
• des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
• et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant :
-» les liquides essentiellement aqueux ; — » les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau ; → et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
Dans un cinquième aspect, l'invention concerne un procédé de reconstitution en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement :
• à mélanger : => des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ; => et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : — » les liquides essentiellement aqueux ;
-» les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau ; — » et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
• et à agiter ce mélange.
Dans un sixième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire :
• à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
• ou obtenue à partir de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention. Avantages :
Sans vouloir être lié à la théorie, on peut penser que les groupements hydrophobes des polymères PO, qui peuvent s'assembler en domaines hydrophobes, jouent un rôle important dans le processus de libération modifiée du PA, tout comme dans la stabilisation de celui-ci.
On peut avancer que des interactions physiques (non covalentes) se développent entre les domaines hydrophobes du polymère amphiphile PO et le PA, en particulier protéinique. Cette forte affinité de la protéine pour le polymère conduit à sa libération prolongée après administration sous-cutanée. Ce mécanisme de libération diffère notablement, et peut être éventuellement conjugué, à celui observé pour les microparticules d'acide polylactique, d'acide polylactique-glycolique ou encore à celles de hyaluronate de sodium, dans lesquelles la libération du PA est essentiellement liée à la diffusion de l'actif et à la dégradation/érosion de la particule.
L'affinité de la protéine pour le polymère PO permet de limiter le phénomènes d'agrégation des protéines et autres dégradations qui peuvent intervenir lors du procédé d'atomisation, sans nécessité d'avoir recours à d'autres stabilisants (par ex. sucres, tensio- actifs). Cet effet protecteur de PO permet également d'obtenir aisément des formulations liquides stables au stockage. Enfin le PO, lorsqu'il a un caractère essentiellement amorphe (notamment lorsque c'est un polyaminoacide), confère aux microparticules d'excellentes propriétés de stabilité physique lorsqu'elles sont conservées sous forme sèche.
Il apparaît donc que la présence de ces polyaminoacides amphiphiles PO apporte des leviers supplémentaires pour la libération modifiée du PA ainsi que pour sa stabilisation vis-à-vis de l'agrégation ou d'éventuelles dégradations chimiques.
De plus, la nature amphiphile du polymère PO permet, lors du procédé d'atomisation, de pouvoir utiliser soit une phase entièrement aqueuse, soit une phase entièrement organique volatile, soit un mélange volatil de phase aqueuse et organique, ce qui offre une grande souplesse dans la mise en œuvre du procédé.
En outre, du fait de leur nature chimique, les microparticules formées à partir d'un PO du type (co)polyaminoacide sont biodégradables, biocompatibles et elles possèdent généralement de bonnes propriétés de tolérance locale.
Concernant le procédé d'obtention des microparticules solides et sèches suivant l'invention, à savoir l'atomisation, il est par nature facilement industrialisable. Enfin, les microparticules selon l'invention et les formulations en contenant sont non toxiques et bien tolérées localement.
Description détaillée de l'invention Définitions :
Dans l'ensemble de cette demande, la conjonction "ou" doit être prise dans le sens inclusif de "l'un ou l'autre ou les deux".
Ainsi, par exemple, un alkyle linéaire pouvant comporter au moins un hétéroatome (O, N ou S) ou au moins une insaturation peut avoir deux hétéroatomes, N et S, et une insaturation.
Dans tout le présent exposé, à la différence des microparticules selon l'invention, le terme "particules submicroniques" ou "nanoparticules" désigne des particules de taille (mesurée dans un test T décrit ci-après), supérieure ou égale à 1 nm et inférieure à 500 nm, de préférence comprise entre 5 et 250 nm. Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme "polyaminoacide" couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques, ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 10 à 20 résidus acide aminé au même titre que les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus acide aminé.
Les résidus acide aminé préférés de la chaîne polyaminoacide principale sont ceux ayant la configuration L ; le type de liaison préféré est le type alpha, c'est-à-dire une liaison peptidique entre un groupe alpha-amino d'un aminoacide et le groupe carboxyle, en position 1, d'un autre alpha-aminoacide.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne, par exemple, aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine (ou ce peptide) peut être modifiée ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs groupements polyoxyéthyléniques.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou
"associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs PA et les polymères PO signifient en particulier que le ou les principes actifs sont liés au(x) polymère(s) PO par une liaison non covalente, par exemple par interaction électrostatique ou hydrophobe ou liaison hydrogène ou gêne stérique.
1er aspect de l'invention : les microparticules Çaractéri stique .(a);.
Le fait d'associer, avant atomisation, le PA, par exemple une protéine ou un autre composé peptidique, avec un polymère PO amphiphile, tel qu'un (co)polyaminoacide amphiphile, présente de nombreux avantages, à la fois au niveau du procédé lui-même et au niveau des propriétés des microparticules produites par atomisation.
Le traitement physique d'atomisation confère aux microparticules sèches solides obtenues une structure particulière à l'origine de bon nombre de leurs propriétés avantageuses. Cette structure est correctement caractérisée par ce mode d'obtention par atomisation, de même que par les fonctions attachées à ces propriétés avantageuses.
Caractéristique.(b).: Cette caractéristique est définie objectivement par le test T décrit ci-après. Test T de mesure de Ia taille des microparticules par diffraction laser :
a-Test TO dans le cas où les microparticules sont sous forme sèche
1 Matériel et conditions opératoires
2 Préparation de l 'échantillon
- Préparer une solution de Span 80 à 0,1 % dans l'heptane (pour cela peser 0,01 g de poudre de Span 80 dans un flacon de 20 ml puis ajouter par pesée de l'heptane afin d'obtenir au final 10 g),
Peser environ 6 mg de poudre dans un tube à essai de 5 mL,
Ajouter 0,7 g d'heptane contenant 0,1 % de Span80 dans le dans le tube à essai,
- Placer le tube à essai pendant 2 min dans un bain à ultrason afin de bien disperser la poudre. 3 Analyse de l 'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
b- Test Tl dans le cas où les microparticules sont sous forme de dispersion aqueuse
1 Matériel et conditions opératoires
2 Préparation de l 'échantillon
L'échantillon à analyser est introduit dans la cellule tel quel ou peut éventuellement être redilué par de l'eau dans le cas d'échantillons très diffusants. 3 Analyse de l 'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'eau déminéralisée fraîche. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que Pobscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
c-Test T2 dans le cas où les microparticules sont en dispersion dans un solvant organique
Ce test est analogue au test Tl. Il faut remplacer néanmoins dans ce cas l'eau par un solvant parfaitement miscible au liquide de dispersion et dans lequel les particules ne gonflent pas. Dans de nombreux cas l'heptane est utilisé.
/ Matériel et conditions opératoires
2 Préparation de l 'échantillon
Pour préparer l'échantillon à analyser, il faut diluer 400 μL de l'échantillon à analyser dans un tube à essai de 5 mL avec 600 μL d'heptane, puis passer la préparation au vortex pendant 10 ± 5 s.
3 Analyse de l 'échantillon
Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées : - alignement du faisceau laser,
- enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition. On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
C.aractéristique.(c).:. Cette caractéristique est définie objectivement par le test DPl décrit ci-après.
Test de dispersibilité DPl des poudres :
30 mg environ de poudre de particules sont introduits dans un flacon de 3 ml muni d'un septum. La masse précise des particules est alors déterminée (mi). 1 ml de solution de reconstitution est ajouté à la poudre à travers le septum à l'aide d'une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de 25G 5/8 - 0,5x16 mm (de type BD Microlance™3 par exemple) et le flacon est agité de manière manuelle par intermittence pendant 15 min. Le flacon est pesé de façon à connaître la masse exacte de solution introduite (m2). À l'issue de ce temps, la totalité de la suspension est aspirée à travers une seringue de 1 ml (de type Braun Injeckt-F Luer 1 ml - ref 9166017V) munie d'une aiguille de 25G et transvasée dans un nouveau flacon préalablement taré et on détermine la masse m3 de solution récupérée.
On note l'aspect qualitatif de la dispersion (facilité à disperser, opacité, homogénéité visuelle de la solution), la possibilité ou non de l'injecter à travers une aiguille de 25G, le pourcentage de solution récupérée : % = m3 x 100/(mi+m2) et on mesure la taille des microparticules selon un test Tl ou T2 (selon que le liquide de dispersion est une solution aqueuse ou un liquide organique).
On considère que la poudre a de bonnes propriétés de dispersion dans le liquide si : la suspension obtenue contient des microparticules de diamètre moyen compris entre 2 et 40 μm, l'aspect de la suspension est homogène, - elle peut être injectée à travers une aiguille de 25G et si - au moins 80 % de la suspension peuvent être ainsi récupérés.
Au-delà des caractéristiques (a), (b) & (c), les microparticules selon l'invention peuvent être définies objectivement par le fait qu'elles sont stables dans un test STl ou dans un test ST2. Test STl de stabilité physique des microparticules sèches :
La taille des microparticules présentes dans la poudre sèche atomisée est mesurée dans la semaine qui suit l'atomisation de la poudre sur un granulomètre laser selon le test TO. La poudre est alors placée dans une étuve à 30 °C pendant une semaine. Un échantillon témoin est laissé à 5 °C. Une mesure de taille est réalisée à nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO. Les distributions des particules avant et après vieillissement sont comparées.
Test ST2 de stabilité colloïdale des particules en suspension :
La poudre de microparticules est dispersée dans le liquide de dispersion sous agitation magnétique à la concentration à laquelle on veut observer sa stabilité et est laissée à agiter sous agitation magnétique modérée pendant au minimum 2 h (mesure tO). La taille des particules est mesurée sur un granulomètre laser selon le test Tl ou T2 en fonction du milieu (aqueux ou organique) de dispersion.
La suspension est ensuite laissée au repos pendant 7 jours à 5 °C. Le culot de sédimentation est dispersé par agitation quelques minutes (jusqu'à obtention d'une suspension homogène après observation visuelle). Une mesure de taille est réalisée à nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO.
Le polymère PO
Les polymères PO selon l'invention sont des polymères biodégradables, hydrosolubles et porteurs de groupements hydrophobes GH et de groupements hydrophiles (de préférence des groupements GI ionisables, au moins en partie ionisés). Les groupements hydrophobes GH peuvent être en nombre réduit vis-à-vis du reste de la chaîne et peuvent se situer latéralement à la chaîne ou intercalés dans la chaîne, et être répartis de façon aléatoire (copolymère statistique) ou répartis sous forme de séquences ou de greffons (copolymères blocs ou copolymères séquences).
Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un (co)polyaminoacide amphiphile.
Un tel choix de PO procure une excellente compatibilité avec les PA de type protéine(s)/peptide(s). Il est ainsi possible de simplifier grandement la composition de la solution ou suspension de départ du PA de type protéine(s)/peptide(s) avec le polymère PO. Cette solution ou suspension de départ peut comprendre uniquement le PA et le PO dans une phase aqueuse ou organique. L'absence d'autres ingrédients permet qu'une telle solution ou suspension de départ peut être filtrée (taille des pores : 0,2 μm) avant l'atomisation, ce qui permet de réaliser cette dernière dans des conditions aseptiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le PO est choisi parmi les
(co)polyaminoacides amphiphiles et leurs mélanges.
De préférence, les polyaminoacides selon la présente invention sont des oligomères ou des homopolymères comprenant des résidus récurrents acide glutamique ou aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de résidus . Les résidus considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D, L ou D/L et sont liés par leurs positions alpha ou gamma pour le résidu glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou aspartate.
Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un polyaminoacide formé par des résidus aspartiques ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant porteuse de greffons comportant au moins un groupement hydrophobe GH. Ces polyaminoacides sont notamment du type de ceux décrits dans la demande de brevet PCT WO-A-00/30618.
Selon une première éventualité, le (ou les) PO est (sont) défini(s) par la formule ggéénnéérraallee ((II)) ssuuiivvaannttee ((llee rraaddiiccaall —— CCOOOORR33 i inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3 est une liaison ionique — COO" +R3) :
(I) dans laquelle :
1 R1 est choisi dans le groupe constitué par H, alkyle linéaire en C2 à C 10, alkyle ramifié en C3 à C 10, benzyle, et -R4- [GH], ou " NHR1 est un résidu acide aminé terminal ; ' R2 est choisi dans le groupe constitué par H, acyle linéaire en C2 à C 10, acyle ramifié en C3 à C 10, et -R4-[GH] ou " R2 est un résidu pyroglutamate terminal ;
• R3 est H, ou
• +R est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
• les cations à base d'aminé,
• les cations à base d'oligoamine,
• les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée),
• les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ;
• R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
' A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou - CH2-CH2- (résidu glutamique) ;
" n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH = 7 et à 25 0C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de PO ; de préférence n/(n + m) est compris entre 1 et 25 % molaire et mieux encore entre 1 et 15 % molaire ; " n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ; " GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone. Dans une forme préférée de réalisation de l'invention :
GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : — OCH2(CH2-CH2)3 g-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et R4 représente une liaison de valence simple.
Selon une deuxième éventualité, PO répond à l'une des formules générales (II),
(III) e tt ((IIVV)) ssuuiivvaanntteess ((llee rraaddiiccaall —— CCOOOORR33 ' iinncclluutt les formes où la liaison entre le carboxyle et R3 ' est une liaison ionique — COO" 4H3 ) :
(IV) dans lesquelles :
" GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;
" R30 est une chaine alkylène linéaire bivalente en C2 à CO ; • R3 ' est H, ou " "1H3 ' est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
• les cations à base d'aminé,
• les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée),
• les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine,
- ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine,
• R50 est une chaine alkylène linéaire bivalente en Cl à C8 dans laquelle une ou deux unités méthylènes, de préférence à chaque extrémité de R50, peuvent être indépendamment remplacées par -O- ou -NH- ;
" R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
• A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2- CH2- (résidu glutamique) ;
• n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300.
Suivant une variante intéressante, R4 représente une liaison de valence simple.
Selon une troisième éventualité, PO comprend au moins une copolyhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl) essentiellement neutre comprenant une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants, identiques ou différents entre eux. La copolyhydroxy-alkylglutamine est porteuse de groupes hydroxy- alkylamino. Ces groupes hydroxyalkylamino sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Les hydroxyalkylamines utilisables pour amidifier le carboxyle de résidus glutamates et donner cette copolyhydroxyalkylglutamine sont identiques ou différentes entre elles et sont par exemple choisies parmi la 2- hydroxyéthylamine, la 3-hydroxypropylamine, la 2,3-dihydroxypropylamine, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane et la 6-hydroxyhexylamine.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement {spacer) permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne principale de copolyglutamates. Cette rotule peut comprendre, par ex. au moins une liaison covalente directe ou au moins une liaison amide ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus acide aminé, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple des diamines), les dérivés des polyols (par exemple des diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamate ou polyhydroxyalkylglutamine peut passer par la mise en œuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamate ou copolyhydroxyalkylglutamine. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur cette copolhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl), on se référera au FR-A- 2881 140
Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant : " un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S) ou au moins une insaturation,
" un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu- ration ou au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S),
• un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S).
Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, le groupement hydrophobe GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : — OCH2(CH2-CH2)3 g-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et R4 représente une liaison de valence simple.
Suivant une autre variante avantageuse, les n groupements GH du PO, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
(GH) dans laquelle :
- R5 est méthyle (résidu alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone ;
- 1 varie de 0 à 6.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante, dans le groupe de radicaux comportant : " un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S) ou au moins une insaturation,
" un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S),
" un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O, N ou S).
En pratique et sans que cela ne soit limitatif, le radical hydrophobe R6 du greffon du PO est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : — OCH2(CH2-CH2)3 g-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle.
Avantageusement, la chaîne principale du polyaminoacide est : >- un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique ; ^ un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique
^ ou un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/ alpha-L-glutamique.
De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques ou glutamiques de la chaîne polyaminoacide principale du PO est telle que le polymère ainsi constitué est soit aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc.
Selon un autre mode de définition, PO a une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 100 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mol. Selon une variante, PO est porteur d'au moins un greffon de type polyalkylène- glycol lié à une résidu glutamate ou aspartate.
Avantageusement, ce greffon est de type polyalkylène-glycol est de formule (V) suivante.
(V) dans laquelle : - R'4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
- X est un hétéroatome choisi dans le groupe comportant l'oxygène, l'azote ou un soufre ;
- R7 et R8 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en Ci à C4 ;
- n'" varie de 10 à 1000, de préférence de 50 à 300.
En pratique, le polyalkylèneglycol est par exemple un polyéthylène glycol.
Il est souhaitable, conformément à l'invention, que le pourcentage molaire de greffage du polyalkylène glycol varie de 1 à 30 %. Les polyaminoacides PO sont en outre extrêmement intéressants, du fait qu'à un taux de greffage ajustable, ils se dispersent dans l'eau à pH = 7,4 (par exemple avec un tampon phosphate) pour donner des suspensions colloïdales.
De plus, des principes actifs PA tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules peuvent s'associer spontanément à des nanoparticules de polyaminoacides PO. II convient de comprendre que les PO contiennent des groupes ionisables qui sont, selon le pH et la composition, soit neutres (par exemple -COOH), soit ionisés (par exemple -COO"),. Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction de la fraction de fonctions ionisées et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que les formes protonées de la triéthanolamine, du tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou d'une polyamine telle que la polyéthylèneimine.
Les PO de type polyaminoacide sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par l'espaceur, directement sur le polymère par une réaction classique de couplage. Les PO polyaminoacides blocs ou multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides de N- carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.
On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate, homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou aléatoire selon des méthodes classiques. Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf
' 'alpha- Aminoacid-N-Carboxy- Anhydrides and related Heterocycles" Springer-Verlag
5 (1987). Lorsque la chaine latérale possède une fonction acide carboxylique, les dérivés de
NCA sont de préférence des esters NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = méthyl,
Et = éthyl et Bz = benzyl). Les polymères sont ensuite hydrolyses dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans la demande FR- A-2 801 226 de la demanderesse. Un certain
10 nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L- aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-L- glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer, 1997, 18 :
15 4733-36).
Le couplage du greffon avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le 0 diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo- diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stœchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un espaceur sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues 5 de l'homme de l'art.
Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA préalablement synthétisés avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé NCA- hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Bz puis on enlève par hydrolyse sélectivement les groupes benzyles. 0
Le(s) principe(s) actiffs) PA
Concernant le PA, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de5 préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe de érythropoïétine, ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotrope, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance plaquettaire (PDGF), facteurs de croissance hématopoïétiques et leurs mélanges, facteurs VIII et IX, hémoglobines, cytochromes, albumines, prolactine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH), antagonistes de la LHRH, agonistes de la LHRH, hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, hormone de libération de l'hormone de croissance, insuline, somatostatine, glucagon, interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), interférons-α, β ou γ, gastrine, tétragastrine, pentagastrine, urogastrone, sécrétine, calcitonine, enképhalines, endorphines, angiotensines, hormone de libération de la thyrotropine (TRH), facteurs de nécrose tumorale (TNF), facteurs neurotrophiques (NGF), facteur de croissance granulocytaire (G- CSF), facteur de croissance des granulocytes et macrophages (GM-CSF), facteur de croissance des macrophages (M-CSF), héparinase, protéine morphogénique osseuse (BMP), peptide auriculaire natriurétique (hANP), glucagon-like peptide 1 (GLP-I), facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), antigène recombinant de l'hépatite B (rHBs), rénine, cytokines, bradykinine, bacitracines, polymyxines, colistines, tyrocidine, gramicidines, cyclosporines et analogues synthétiques, modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins.
Selon une variante, le PA est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges
Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite molécule non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés. Selon une autre variante, le PA est avantageusement choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les antiinfectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les antihypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les antidouleurs non analgésiques, les antiépileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
Sur le plan quantitatif, il est particulièrement intéressant que la fraction massique en PA non associé aux particules micrométriques [PA non associé] en % en poids soit telle que : o [PA non associé] < 1 o de préférence [PA non associé] < 0,5.
2eme aspect de l'invention : le procédé d'obtention des microparticules par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
Selon une modalité préférée du procédé selon l'invention, le PO contenu dans la solution ou la suspension colloïdale destinée à être atomisée est au moins en partie sous forme de nanoparticules de PO ayant une taille, mesurée dans le test Tl, inférieure à 500 nm, de préférence comprise entre 10 et 300 nm , et plus préférentiellement encore comprise entre 10 et 100 nm.
Avantageusement, la concentration en PO dans la solution ou la suspension colloïdale à atomiser est, par exemple, comprise entre 5 mg/ml et 100 mg/ml de préférence entre 10 mg/ml et 40 mg/ml.
Dans le cadre de l'invention, l'association PA/PO est réalisée avant ou pendant l'étape d'atomisation.
Pour cette association le PO ou le PA peut être sous forme solide (de préférence une poudre) ou sous forme de suspension liquide.
Des techniques d'association d'un ou de plusieurs PA à PO avant l'étape d'atomisation sont décrites notamment dans la demande de brevet WO-A-00/30618. Elles consistent par exemple à mélanger une suspension colloïdale de PO à une solution ou une suspension de PA. Selon une variante, le PA sous forme poudre est mélangé à la suspension de PO.
Suivant une variante intéressante de ce procédé d'obtention, les microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA) sont dispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux, ledit milieu contenant de préférence un moyen Ml de dispersion, et la dispersion obtenue est lyophilisée.
Le lyophilisât ainsi obtenu a pour avantage de faciliter la préparation des formulations liquides à base des microparticules (3ème aspect de l'invention décrit ci-après), car ce lyophilisât se disperse rapidement dans le liquide de reconstitution utile pour prépare les susdites formulations liquides.
Avantageusement, le moyen de dispersion Ml est choisi dans le groupe constitué par: i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse; ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées; iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable); iv- le changement de pH; v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv); le moyen (i) étant particulièrement préféré.
Pour plus de détails sur des exemples de possibilités d'exécution des moyens Ml (i) à (iv), on se reportera à la description qui suit des moyens de dispersion M2.
De même, s'agissant du milieu liquide de dispersion, celui-ci peut contenir les mêmes additifs que ceux décrits pour le liquide de reconstitution défini infra
3ème aspect de l'invention: Formulations liquides à base des microparticules obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
La formulation suivant l'invention peut être une forme pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA comprenant une suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO associées à au moins un PA, ces microparticules étant celles telles que définies ci-dessus ou celles obtenues par le procédé lui aussi tel que défini ci-dessus et dans les exemples infra.
Cette formulation a pour avantage d'être injectable par voie parentérale et d'être liquide dans les conditions d'injection. Suivant l'invention, les qualificatifs "basse" ou "très faible viscosité" correspondent, avantageusement, à une viscosité dynamique à 20 °C inférieure ou égale à 1000 mPa.s. De préférence, la viscosité dynamique de la formulation, mesurée à 20 °C, pour un gradient de cisaillement de 1000 s"1, est préférablement inférieure ou égale à 500 mPa.s., de préférence comprise entre 2 et 200 mPa.s. par exemple, comprise entre 1 ,0 et 100 mPa.s, voire entre 1 ,0 et 50 mPa.s.
Mesure de Ia viscosité dynamique
La mesure de référence pour la viscosité dynamique peut être réalisée, par exemple, à 20 °C à l'aide d'un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4 cm, 2°). La viscosité v est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10 s*1. Cette faible viscosité rend les formulations de l'invention aisément injectables par voie parentérale, en particulier par voie muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur. La formulation selon l'invention peut aussi être administrée par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, entre autres. La viscosité des formulations liquides de l'invention est faible aussi bien à des températures d'injection correspondant à des températures ambiantes, par exemple comprises entre 4 et 30°C, qu'à la température physiologique.
Les microparticules sèches formées par atomisation de PO (par ex. polyamino- acide) amphiphile peuvent de plus être aisément redispersées pour former des suspensions ou des solutions microparticulaires faiblement visqueuses.
Moyen M2 de dispersion
S'agissant précisément de la dispersion ou mise en suspension des microparticules PO/PA atomisées dans un liquide de reconstitution pour préparer la formulation, il est prévu selon l'invention que ladite formulation comprenne un moyen M2 de dispersion des microparticules de PO/PA.
Ce moyen M2 de dispersion peut différer selon la nature de la phase continue (c'est-à-dire du liquide de reconstitution) de la suspension entrant dans la constitution de la formulation. Ainsi, quatre possibilités sont notamment envisageables selon l'invention :
1. La phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse
2. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible à l'eau. 3. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique non miscible à l'eau.
4. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible ou non à l'eau. Par "phase continue essentiellement aqueuse", on entend, par exemple un liquide contenant au moins 60 % en masse d'eau.
Par "phase continue essentiellement organique" , on entend, par exemple un liquide contenant au moins 60 % en masse de phase organique.
1. La. phase .ç.Qntinue.de .la. suspension, est.essentielle.ment.aqueuse
Plusieurs types de moyens M2 de dispersion, éventuellement combinés entre eux, sont envisageables, à savoir que le moyen M2 de dispersion est par exemple choisi dans le groupe constitué par: i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse; ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées; iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable); iv- le changement de pH; v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv); le moyen (i) étant particulièrement préféré.
(i). Moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents
Dans le cas où PO présente des groupements GI ionisables, le moyen M2 de dispersion peut comprendre des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables GI (au moins en partie ionisés) du polymère PO et qui sont introduits dans la phase continue aqueuse, lors de la reconstitution de la suspension/solution qui forme la suspension.
Au sens de l'invention, le terme "ions multivalents" désigne par exemple des ions divalents, des ions trivalents, des ions tétravalents et des mélanges de ces ions. Dans le cas où PO présente des groupements GI anioniques, les ions multivalents sont des cations multivalents, de préférence des cations divalents, plus préférentiellement encore choisis dans le groupe comprenant : Mg +, Ca +, Zn +, Fe +, Cu2+ou leurs mélanges, ou des cations trivalents, plus préférentiellement encore choisis dans le groupe comprenant : Al3+, Fe3+ ou leurs mélanges. Il est possible qu'outre des ions multivalents, la formulation selon l'invention contienne des ions (par ex. cations) monovalents, éventuellement actifs dans l'agrégation des nanoparticules en microparticules.
Ces ions multivalents sont amenés dans la formulation de l'invention, de préférence sous forme de solution saline (organique ou minérale) aqueuse, par exemple une solution de sulfate, chlorure, acétate, gluconate ou glutamate (ou autre acide aminé anionique) de cations multivalents.
Ce moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents convient plus préférentiellement dans le cas où PO amphiphile (par ex. un (co)polyaminoacide) est relativement hydrophile.
(H) et (Hi) Moyen M2 de dispersion à base de composé(s) hydrophile(s) ou comprenant au moins un enrobage à base de composé(s) hydrophile(s)
Le moyen M2 de dispersion peut comprendre essentiellement :
- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenu dans les microparticules PO/PA atomisées ;
- ou au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
Ces moyens M2 de dispersion peuvent être incorporés dans la formulation selon plusieurs modes.
Suivant un premier mode, on ajoute à la suspension/solution de PO à atomiser au moins un composé hydrophile choisi parmi ceux utilisables dans une préparation injectable, de préférence choisi dans le groupe comprenant :
→ les acides aminés (par ex. lysine, arginine, glycine) ; — > les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
— > les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycol- propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol);
— » les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les carboxyalkyl- celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par ex. les méthylcelluloses) ;
-> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose ;
->• les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ;
-> les gélatines de préférence hydrolysées ; → les (co)polymères azotés, de préférence ceux contenus dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly- yV-vinyl-lactames ;
-> les alcools polyvinyliques (APV); — > le polyglutamate de sodium ; -> et leurs mélanges ; ledit composé hydrophile d'enrobage comprenant de préférence au moins un polymère hydrophile. Suivant un deuxième mode, les microparticules sont enrobées par au moins une couche d'au moins un composé hydrophile tel que défini ci-dessus. Dans ce deuxième mode, le composé hydrophile comprend, de préférence, au moins un polymère hydrophile choisi parmi les composés hydrophiles tels que définis ci-dessus.
Le moyen M2 (ii) de dispersion à base d'au moins un composé hydrophile s'est avéré particulièrement adapté pour les PO amphiphiles présentant une hydrophobie suffisamment élevée, par exemple un taux de groupements GH supérieur ou égal à 10 % molaire pour un PO constitué par au moins un polyaminoacide.
L'enrobage (moyen M2 (iii)) des microparticules par une telle couche de composé hydrophile et biocompatible peut être, par exemple, réalisé par deux atomisations successives ; la deuxième atomisation, réalisée sur une suspension de particules dans un solvant non miscible avec lesdites microparticules, peut contribuer à faciliter la dispersion de ces particules.
Ce moyen M2 (iii) de dispersion, par enrobage hydrophile des microparticules, permet à la suspension de microparticules de rester intègre et stable au moins pendant quelques jours, ce qui rend sa manipulation plus aisée.
Avantageusement, la combinaison d'un moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion des microparticules à base de composé(s) hydrophile(s) et d'un moyen M2 (i) de dispersion à base d'ions divalents, contenus dans la phase aqueuse lors de la reconstitution de la formulation, permet une dispersion accélérée.
Suivant un autre mode particulier de réalisation, la phase continue aqueuse ou l'enrobage hydrophile peut aussi contenir au moins un tensioactif injectable tel que le
Tween® 80, une lécithine, phosphatidyléthanolamine, phosphatidylsérine ou un copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène (dénomination commerciale : Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
(iv) Moyen M2 de dispersion par changement de pH
Un autre moyen de dispersion envisageable selon l'invention consiste en un moyen de dispersion par changement de pH, de préférence avant atomisation. Ce type de moyen s'est avéré adapté notamment dans le cas où le PO amphiphile (par ex. polyaminoacide) est un composé porteur de fonctions ionisables et est par ailleurs très hydrophile, c'est-à-dire comprenant par exemple moins de 10 % molaire de groupements hydrophobes GH. En effet, la mise en œuvre d'un tel moyen M2 (iv) permet d'augmenter l'hydrophobie du PO amphiphile, en amenant le pH à une valeur telle que les fonctions ionisables du PO (par ex. du polyaminoacide) deviennent non ionisées (par exemple acidification dans le cas où le PO est un polyaminoacide hydrophile du type polyGlu ou polyAsp).
De préférence, ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant atomisation est appliqué à la suspension/solution de PO juste avant l'atomisation.
Ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant atomisation peut être combiné ou non : • avec le moyen M2 (i) de dispersion à base d'ions multivalents mis en œuvre après atomi-sation, dans l'étape de reconstitution ; ou
• avec le moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion à base de composé hydrophile, de préférence par enrobage M2 (iii) des microparticules par au moins un polymère hydrophile.
2. La..pMs.e..çpntmue. de..la.. susRension..est..une..^ .m.isçi.bl.Ç..à.l.'.eâu..
Le moyen de dispersion consiste dans cette phase organique miscible à l'eau. Cette phase peut ainsi par exemple contenir éthanol, N-méthylpyrrolidone, diméthylsulfoxyde, isopropanol, glycérol, ou glycofurol (tétrahydrofurfuryl alcool polyéthylène glycol éther).
3. U.pMse. continue. deja.^ miscible .à .l'eau
Suivant une voie intéressante de mise en œuvre, le moyen de dispersion comprend un liquide lipophile, dont la température de fusion est de préférence inférieure ou égale à 15 C, contenu dans la phase continue organique non miscible à l'eau.
De préférence, le liquide lipophile comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras. Plus préférentiellement encore, le liquide lipophile comprend :
• un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en Cg -Ci0 issu de l'huile de noix de coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par Sasol) ;
• au moins une huile végétale, de préférence l'huile de soja, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol, l'huile d'arachide, • au moins un lipide, de préférence une lécithine liquide, la vitamine E synthétique ou naturelle ;
• au moins un dérivé de lipide, de préférence l'arachidoylphosphatidylcholine et la stéaroylphosphatidyl-choline, • au moins un acide gras, de préférence l'acide oléique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, et leurs sels ;
• au moins un dérivé d'acide gras, de préférence un dérivé de mono-, di- ou triglycéride, l'oléate d'éthyle, le lactate de lauryle, le stéarate de glycéryle, le palmitate de sorbitane, le stéarate de sorbitane, le monoléate de sorbitane, le polysorbate ;
• et leurs mélanges ; avec la condition selon laquelle, dans le cas où certains des produits énumérés ci-dessus pris séparément ne sont pas liquides à une température inférieure ou égale par exemple à 15 °C, alors ces produits sont en mélange avec d'autres, de sorte qu'ils soient liquides à une température inférieure ou égale par exemple à 15°C.
Les dérivés de triglycérides d'acides gras sont particulièrement préférés, notamment un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en C8 -Ci0 issu de l'huile de noix de coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par Sasol). D'autres triglycérides à chaînes longues d'acides gras utilisables sont notamment présents dans des huiles végétales telles que l'huile de soja, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol ou l'huile d'arachide.
Les poudres de PO/PA atomisées se dispersent aisément dans cette phase organique non miscible à l'eau, pour donner des suspensions stables de microparticules qui conservent leur intégrité pendant plusieurs jours et sont donc, là encore, aisément manipulables. Cette dispersion est particulièrement rapide sans qu'il soit nécessaire d'ajouter d'autre(s) moyen(s) de dispersion, même si cette éventualité est envisageable.
4. La.. phase..continue... de..l.a^^ misci.b.le .ou.non.à.reau
Suivant une alternative intéressante de mise en œuvre compatible avec les 2ème &
3ème possibilités s'agissant de la nature de la phase continue de la suspension/solution constituant la formulation, le moyen de dispersion comprend un enrobage des microparticules par au moins un composé filmogène d'enrobage (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
De préférence, le composé filmogène d'enrobage comprend au moins un polymère hydrophobe choisi dans le groupe comprenant les polylactides, les polyglycolides, les poly(lactide-co-glycolide), les polyorthoesters, les polyanhydrides, les acides poly- hydroxybutyriques, les polycaprolactones, les polyalkylcarbonates, les polymères PO insolubles dans l'eau, leurs dérivés et leurs mélanges.
Suivant une variante, le composé filmogène d'enrobage est de nature lipidique et présente une température de fusion de préférence supérieure ou égale à 15°C et comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras ou un mélange de ces produits.
Suivant un autre mode intéressant de réalisation, la phase continue organique, par exemple hydrophobe, ou l'enrobage hydrophobe peu(ven)t aussi contenir au moins un tensioactif injectable tel que le Tween® 80, une lécithine, une phosphatidyléthanolamine, une phosphatidylsérine ou un copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène (dénomination commerciale : Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
Excipients/stabilisants
II peut également être avantageux, pour faciliter les propriétés de dispersion en phase aqueuse ou améliorer encore la stabilité des suspensions aqueuses, que la formulation injectable comporte d'autres additifs, d'une part ceux ci-après désignés "excipients/ stabilisants",et d'autre part des excipients classiques.
Les excipients/stabilisants peuvent être sélectionnés dans le groupe comprenant :
— >• les nanoparticules d'au moins un polymère PO, PO étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles ionisables (GI), au moins en partie ionisés, et formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique ; -» les acides aminés ;
-» les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ; — » les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycol- propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol) ;
— > les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les carboxyalkyl- celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par ex. les méthyl- celluloses) ;
-> les esters de sorbitane et d'acide(s) gras, de préférence les esters de polyoxy- alkylène (par ex. éthylène) glycol et d'au moins un acide (par ex. l'acide oléique), de type Tween (ou polysorbate) ;
-» les tensioactifs à base de phospholipides et de polyalkylène glycols, de préférence de polyéthylène glycols ;
-> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose ;
— > les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ; — > les gélatines de préférence hydrolysées ; -> les (co)polymères azotés, de préférence dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-iV-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly-N- vinyl-lactames ;
-> les alcools polyvinyliques (APV) ; -> et leurs mélanges.
L'un des excipients (stabilisants) préférés conformément à l'invention est formé par des nanoparticules d'au moins un polymère PO, identique ou différent (de préférence identique) de celui constituant les microparticules. La quantité de d'excipient/stabilisant mis en œuvre dans la formulation est de préférence comprise entre 0,01 et 10 % en poids, et plus préférentiellement encore entre 0,1 et 5 % en poids.
S'agissant des stabilisants comprenant des nanoparticules, ils sont avantageusement utilisés dans la formulation à raison de 1,5 à 3,5 % en poids, par exemple de 2,0 à 3,0 (≈ 2,5) % poids.
Le liquide de reconstitution
Outre les moyens de dispersion décrits ci-dessus, le liquide de reconstitution mis en œuvre dans la préparation de la formulation selon l'invention peut comprendre par exemple : au moins un tampon ou au moins un sel injectable (tampon phosphate, tampon citrate, chlorure de sodium) en concentration par exemple entre 0,001 M et 0,1 M de préférence entre 0,005 M et 0,02 M, ce tampon ou ce sel injectable permettant d'ajuster le pH de la solution ; - au moins un tensioactif injectable, de préférence de type polysorbate tels le
Tween® 20 et le Tween® 80 ou de type Poloxamer tels le Lutrol® F38, le Lutrol® F68 ou le Lutrol® F 127 dans des concentrations par exemple comprises entre 0,01 % et 2 %, de préférence entre 0,05 et 0,5 %.
Le liquide de reconstitution peut contenir de plus des agents densifiants tels que des saccharides, à savoir par ex. le saccharose, le D-mannitol ou le tréhalose dans des concentrations comprises entre 0,1 % et 10 %, de préférence entre 0,5 et 5 %. La solution de reconstitution peut également contenir un polymère viscosifiant injectable choisi dans le groupe comprenant les polysaccharides, les polymères synthétiques (par ex. la carboxy- méthylcellulose sodique), l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les poly- alkylène glycols (par ex. polyéthylène glycols) et leurs mélanges.
L'utilisation de microparticules sèches de PO (par ex. polyaminoacide) amphiphile et l'utilisation d'un moyen ad hoc de reconstitution permet donc de répondre au double objectif qui est de pouvoir obtenir des formulations pharmaceutiques à la fois stables et facilement dispersibles pour permettre leur injection par voie parentérale.
Outre les excipients/stabilisants susvisés pour l'amélioration de la dispersion et de la stabilité, les autres excipients classiques qui peuvent être ajoutés à la suspension/ solution à atomiser ou à la formulation selon l'invention, sont, par exemple, des antimicrobiens, des tampons, des antioxydants ou des agents permettant d'ajuster l'isotonicité, qui sont connus de l'homme de l'art. On pourra par exemple se référer à l'ouvrage : Injectable Drug Development, P. K. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado 1999.
Cet ajout d'excipients classiques peut être réalisé soit dans la phase aqueuse de dispersion, soit dans la solution/suspension avant atomisation.
Application de la formulation liquide selon l'invention
Bien que la formulation selon l'invention soit de préférence pharmaceutique, cela n'exclut pas pour autant les formulations cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires comprenant au moins un PO tel que défini ci-dessus et au moins un PA.
4ème aspect de l'invention : Nécessaire de reconstitution de la formulation selon l'invention
Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles à l'eau et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-dessus.
5ème aspect de l'invention : Procédé de reconstitution, en particulier de la formulation selon l'invention
Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles à l'eau et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-dessus.
Conformément à l'invention, il est envisageable de prévoir une filtration stérilisante, sur des filtres de porosité égale, par exemple, à 0,2 μm, de la suspension liquide de nanoparticules de laquelle sont issues les particules micrométriques de la formulation selon l'invention. L'agrégation en conditions stériles selon les modes de préparation décrits ci-dessus permet ainsi d'injecter directement la formulation à un patient.
6 me aspect de l'invention : Formulation pharmaceutique solide
Cette formulation pour la libération prolongée de PA comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire à base de microparticules PO/PA ci- dessus définies.
Autres aspects de l'invention La présente invention vise également des produits solides, dérivés des microparticules de PO selon l'invention.
En pratique, ces produits dérivés peuvent notamment être constitués par des poudres, des gels, des implants ou des films, entre autres.
Ainsi, l'invention vise des produits dérivés de la formulation selon l'invention, pris en tant que tels, quel que soit leur procédé d'obtention.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer une quantité efficace au plan thérapeutique de la formulation telle que décrite dans le présent exposé, par voie parentérale, en particulier par voie muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intra- cérébrale ou dans une tumeur. La formulation selon l'invention peut aussi être administrée par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, entre autres.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste à administrer la formulation telle que décrite supra par injection parentérale : sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt au site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en œuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des PO formés par des polyaminoacides greffés par un groupement hydrophobe, leur transformation en système de libération prolongée de PA, à savoir en formulation selon l'invention (poudre de microparticules sèches) et les caractéristiques de stabilité et de redispersibilité de tels systèmes.
EXEMPLES :
EXEMPLE 1 : SYNTHÈSE D'UN POLYMÈRE AMPHIPHILE PO-A Synthèse d'un polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique
On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique (de masse équivalente à environ 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène, et obtenu par polymérisation de NCAGIuOMe suivie d'une hydrolyse, comme décrit dans la demande FR-A-2801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 °C jusqu'à solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 °C et on ajoute successivement 2,5 g de D,L-alpha- tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka®) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF et 1 ,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 % de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 0C. On obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 15500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol greffé, estimé par spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire. Une suspension de nanoparticules du polymère dans l'eau est obtenue en le solubilisant dans l'eau et en ajustant le pH à 7 ± 1 (neutralisation des carboxylates).
EXEMPLE 2 : SYNTHÈSE D'UN POLYMÈRE AMPHIPHILE PO-B
L'exemple 2 est adapté de l'exemple 1 en visant un taux de greffage de 20%
EXEMPLE 3 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE
POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L' IFN-α-2b
Préparation d'une solution contenant 20 mg/g de polymère et 0,25 mg/g d'IFN
200 g de solution de polymère PO-A à 30 mg/g sont introduits dans un flacon de 500 ml.
68 g d'eau sont ensuite introduits dans le flacon contenant le polymère. Une solution congelée d'IFN-α-2b concentrée à 2,8 mg/g est décongelée à 25 °C pendant 1 h et 26,8 g de cette solution congelée sont introduits dans le flacon contenant la solution de polymère.
Le mélange est laissé pendant 14 h à température ambiante.
La solution est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 μm.
Atomisation de la solution polymère-IFN La solution est atomisée sur un appareil de spray-drying de type Bϋchi B290. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa - 900 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 90 °C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 45 0C.
Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de HFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 4 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L' IFN-α-2b ET DU POLYSORBATE 80
La solution de polymère PO et d'interféron est préparée à l'identique de l'exemple 3. 0,9 g de polysorbate 80 sont ajoutés à la solution avant atomisation.
Atomisation de la solution polvmère-IFN en présence de polysorbate La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 5 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES ACIDIFIÉES DE POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L' IFN-α-2b
La solution de polymère PO-A et d'IFN est préparée à l'identique de l'exemple 3. Elle est ensuite diluée par ajout d'eau de façon à ce que la concentration en polymère PO-A soit de 15 mg/g (la concentration en IFN étant alors de 0,188 mg/g). Après filtration sur 0,2 μm, la solution est acidifiée par ajout de HCl 1 N jusqu'à obtention d'un pH = 4. La solution ainsi obtenue est opalescente.
Atomisation de la solution polymère-IFN acidifiée
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3. Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de PIFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 6 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-A ENROBÉES DE PVP ET CONTENANT DE L' IFN-α-2b
Une poudre de microparticules sèches de polymère PO-A et d'IFN est obtenue à partir d'un mélange PO-A/IFN selon le protocole utilisé à l'exemple 3.
À l'issue de l'étape d'atomisation, 1,5 g de cette poudre sont remis en suspension dans une solution éthanolique contenant 7 g/1 de polyvinylpyrrolidone (PVP) de grade injectable de type PVP K30. La suspension éthanolique est agitée 2 h puis elle est atomisée une deuxième fois sur l'appareil de spray-drying de type Bϋchi B290 muni d'un piège d'extraction pour solvant organique (boucle d'inertage à -20 °C) et fonctionnant en circuit fermé sous azote. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa - 670 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 80 °C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 55 0C.
Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 6 μm. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 7 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-B CONTENANT DE L' IFN-α-2b
Le protocole de préparation de la solution polymère-IFN et d'atomisation est identique à celui décrit dans l'exemple 3, mais en remplaçant le polymère PO-A par le polymère PO- B.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 4 μm. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de PIFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 8 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L'hGH
Préparation de la solution d'hGH concentrée :
60 g d'une solution d'hormone de croissance humaine recombinante (concentration 3,9 mg/g) sont décongelés pendant 90 min à 25 0C et concentrés environ 6 fois par ultrafiltration frontale sur membrane à limite d'exclusion de 10 kD jusqu'à obtention d'une concentration de 24 mg/g (contrôlée par HPLC).
Mélange avec la solution de polymère 52 g d'une solution concentrée de polymère PO-A à 30 mg/g sont dilués à 19,5 mg/g par ajout de 28 g d'eau. 8 g de la solution d'hGH à 24 mg/g sont versés lentement sur la solution de polymère ainsi diluée. Le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante puis filtré sur filtre stérilisant (taille des pores : 0,2 μm).
Atomisation de la solution polymère-hGH
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'hGH par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 9 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L'IL-2
Préparation de la solution d'IL-2 concentrée i
100 g d'une solution congelée d'IL-2 à la concentration de 2 g/1 stabilisée par du SDS sont décongelés à température ambiante puis la solution est refroidie à une température comprise entre 0 et 2 °C. 100 g d'éthanol absolu sont ajoutés lentement à cette solution de façon à précipiter la protéine. Le précipité est récupéré par filtration sur une membrane de 0,65/0,45 μm dans une cellule de diafiltration frontale et lavé avec 200 g d'eau. Le précipité est séché par application d'un flux d'azote. Le précipité est alors dissous dans 10 g de soude 0,02 N préalablement refroidie (< 5 °C) de façon à obtenir une solution limpide de protéine à 20 mg/g et pH = 12 exempte de SDS. Le titre exact de la solution est déterminé par une méthode HPLC.
Mélange avec la solution de polymère
96 g d'une solution concentrée de polymère PO de l'exemple 1 (à 30 mg/g) sont dilués par ajout de 39 g d'eau. 9 g de la solution d'IL-2 concentrée précédente à 20 mg/g sont lentement versés sur la solution de polymère ainsi diluée.
Le mélange contenant 20 mg/g de polymère PO et 1,25 mg/g d'IL-2 est laissé pendant une nuit à température ambiante puis filtré sur filtre stérilisant 0,2 μm.
Atomisation de la solution polymère-IL-2
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d' atomisation, le dosage de l'IL-2 par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 10 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE
POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L'INSULINE
Préparation de 40 g d'une solution d'insuline concentrée à 20,3 mg/g : 0,83 g d'insuline humaine recombinante (poudre) d'activité 28,7 Ul/g et contenant 2,5 % d'humidité sont introduits dans un flacon en verre. 23,62 g d'eau sont ajoutés et l'insuline est dispersée sous agitation magnétique lente. 6,22 g d'HCl 0,1 N sont ajoutés jusqu'à obtention d'une solution limpide d'insuline acide. 9,32 g de soude 0,1 N sont alors ajoutés de façon à obtenir une solution finale limpide ayant un pH compris entre 7 et 8. La solution d'insuline est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 μm.
Mélange avec la solution de polymère
37,66 g de la solution d'insuline concentrée précédente sont lentement versés (sous agitation magnétique) sur 220 g de solution de polymère PO à 30 mg/g. 72,34 g d'eau sont ajoutés à la solution. Le mélange est laissé pendant 4 h à température ambiante puis filtré sur 0,2 μm.
Atomisation de la solution polymère-insuline La solution est ensuite atomisée sur un appareil de spray-drying de type Bϋchi B290. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa - 900 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3 Vh. La température d'entrée est maintenue à 120 °C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 70 °C.
Atomisation de la solution polymère-insuline
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 μm.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d' atomisation, le dosage de l'insuline par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 11 : CARACTERISTIQUES DES MICROPARTICULES OBTENUES SELON L'INVENTION : TAILLE ET STABILITÉ
La taille des microparticules est mesurée selon le test TO et la stabilité selon la test S 1. L'évaluation de la dégradation de la protéine est réalisée par HPLC en comparant un chromatogramme de la formulation avant et après atomisation.
« aucune » signifie qu'aucune forme dégradée n'a été observée. Les résultats démontrent que l'atomisation des protéines en présence d'un polyaminoacide amphiphile permet de préserver la stabilité de la protéine. Sous forme solide la poudre est stable selon le protocole décrit. Il s'agit d'une condition forcée et il est anticipé que la stabilité des poudres est d'au moins 2 ans à 5 °C.
L'atomisation est une méthode susceptible de dégrader la protéine. L'analyse par HPLC montrent qu'aucune forme de dégradation est observée en comparant les chromatogrammes avant et après atomisation.
L'atomisation d'une protéine en présence d'un polyaminoacide amphiphile conduit à des microparticules stables dans le temps et n'induit pas de dégradation de la protéine.
Ces poudres peuvent être utilisés sous forme solide (inhalation, injection sans aiguille par un pistolet sous pression par exemple) ou sous forme d'une suspension injectable après reconstitution dans un milieu approprié.
EXEMPLE 12 : RECONSTITUTION DE SUSPENSION A PARTIR DES POUDRES DES EXEMPLES 3 A lO.
Le reconstitution des poudres est réalisé dans trois milieux différents selon le protocole décrit pour réaliser le test DPl : A. Une solution aqueuse de tampon phosphate salin à pH 7.4
B. Une solution aqueuse de chlorure de magnésium à 0,1 M
C. Une solution de triglycéride d'acide caprique (Miglyol® 812)
Les échantillons sont ensuite évalués en réalisant les étapes suivants : - dispersion dans un des milieux cités ci-dessus transfert dans une seringue puis injection à travers une seringue de 25G La suspension est considérée avoir des bonnes propriétés si au moins 80 % est récupérer par aspiration/injection à travers une aiguille de 25G.
Résultats :
II a été mesuré également que la protéine n'est pas dégradée après reconstitution dans les milieux A, B et C lors du test de stabilité.
Ces résultats montrent que l'obtention d'une suspension stable et injectable des microparticules dans l'eau tamponnée par du PBS à pH = 7,4 n'est possible qu'avec la composition de l'exemple 7. Pour la plupart des exemples (sauf la 5), le milieu de reconstitution comportant un sel divalent permet l'améliorer ces propriétés. En milieu Miglyol, toutes les formulations sont facilement dispersibles, injectables et stables.
L'ensemble de ces propriétés n'est pas obtenu aisément selon le polymère utilisé. Il est du mérite des inventeurs d'avoir trouvé après de nombreux essais que certains excipients et milieux de reconstitution permettent d' obtenir ces propriétés.
EXEMPLE 13 : MESURE DE VISCOSITE DES FORMULATIONS RECONSTITUEES Une dispersion des poudres à 30 mg/mL dans les milieux B et C des exemples précédents (sauf la 5 dans le milieu B) donnent des suspension stables peu visqueuses ; dans le milieu B, les viscosités mesurées sont tous inférieures à 10 mPa.s et dans le milieu C, les viscosités sont tous de l'ordre de 30 à 40 mPa.s. À titre de comparaison, une composition des mêmes polymères sous forme nanoparticulaire selon l'art antérieure, ne peux pas être obtenue à cette concentration (30 mg/mL) dans les valeurs de viscosités acceptables (< 100 mPa.s).
EXEMPLE 14 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SÈCHES DE POLYMÈRE PO-A CONTENANT DE L' IFN-α-2b OBTENUES SOUS FORME DE POUDRE LYOPHILISÉE
Les particules sont tout d'abord préparées comme décrit à l'exemple 3. L'étape d'atomisation est réalisée dans des conditions aseptiques et les particules sont récupérées dans un récipient stérile.
Redispersion des particules en présence d'ions Mg +
Tout de suite après la phase d'atomisation les particules sont récupérées et redispersées en conditions aseptiques dans une solution aqueuse de MgCl2 à 0,10 M. La quantité de solution de MgCl2 ajoutée est ajustée de façon à ce que la concentration en polymère PO-A dans la suspension soit environ de 40 mg/ml. Le pH est ajusté à 6,5 par ajout de soude 1 N. Lyophilisation
La suspension est répartie en récipients de type Lyoguard® permettant de garder la suspension stérile lors de la lyophilisation : les récipients sont ensuite lyophilisés stérilement pendant un cycle de 72 h sur un lyophilisateur de laboratoire (module de paillasse Christ, Osterode, Allemagne). La poudre est répartie stérilement en flacons avant utilisation.
EXEMPLE 15 : COMPARAISON DE LA RECONSTITUTION DES POUDRES DE MICROPARTICULES OBTENUES À PARTIR DE L'EXEMPLE 3 ET CELLES DE L'EXEMPLE 14
Pour cette comparaison, les volumes de suspension reconstituée sont identiques dans les deux cas (environ 1 ml) et les flacons de reconstitution sont identiques (flacons en verre de 3 ml). Les quantités de poudre sont ajustées de façon à ce que les deux suspensions contiennent au final 40 mg/ml de polymère et 0,5 mg/ml d'IFN-α-2b. La poudre de l'exemple 3 est reconstituée dans une solution aqueuse de MgCl2 0,1 M alors que la poudre de l'exemple 14 (qui contient déjà des ions Mg2+) est reconstituée dans l'eau pure.
Dans un premier temps, les flacons sont agités manuellement. Alors que la poudre de l'exemple 3 requiert au moins 15 min pour se redisperser, la dispersion est plus rapide pour la poudre de l'exemple 14 et en moins de 5 min, on obtient une suspension homogène. Un barreau magnétique est alors inséré dans les flacons et les deux flacons sont agités de façon identique pendant 1 h.
À l'issue de cette agitation, les caractéristiques des deux suspensions sont comparées : la taille des particules et la viscosité des deux suspensions sont semblables.
EXEMPLE 16 : PHARMACOCINETIQUE DE L' IFN CHEZ LE CHIEN APRÈS INJECTION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION À BASE DE POLYAMINOACIDES AMPHIPHILES SOUS FORME MICROPARTICULAIRE Huit chiens Beagle naïfs (poids de 9 ± 0,6 kg) ont été traités avec les formulations suivantes :
L 'IFN IR (IR pour immédiate release, c'est-à-dire libération immédiate) correspond à une solution d'interféron humain recombinant (PCGen, lot IB05.0516) ajustée en concentration, pH et osmolarité ([IFN] = 0,5 mg/ml, pH = 6,5, et 354 mOsm).
Les particules de la formulation 1 sont préparées selon l'exemple 14 à partir du même lot d'interféron PCGen : la poudre lyophilisée est remise en suspension dans l'eau stérilement (sous hotte à flux laminaire) selon un procédé analogue à celui décrit dans l'exemple 15.
Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau suivant :
où :
Cmax est la concentration sérique maximale en IFN ;
T > 50 pg/ml est le temps où la concentration sérique en IFN est supérieure à
50 pg/ml ;
AUC représente l'aire sous la courbe concentration sérique en IFN en fonction du temps ;
RBA représente la biodisponibilité par rapport à une formulation Immédiate Release;
T50o/oauc représente le temps nécessaire pour relarguer 50% de PIFN relargué au total.
L 'IFN IR présente un profil de libération rapide avec une concentration sérique maximale de 25,2 ± 0,4 ng/mL, atteinte après un temps médian de 5 h (étendue : 3 - 5 h). L'IFN circulant n'est plus quantifiable au-delà de 24 h.
La formulation 1 offre une modification majeure du profil pharmacocinétique de l'IFN, avec une libération très lente, et une concentration sérique maximale de 0,5 ± 0,2 ng/mL (50 fois inférieure à celle de la forme IR) atteinte après un temps médian de 60 h (étendue : 48 - 96 h). L'allure générale de la pharmacocinétique est un profil plat en pseudoplateau. Le niveau d'IFN circulant retourne à une concentration non quantifiable entre 192 h et 240 h (8 et 10 jours). Cette formulation présente une AUC plus basse : perte de biodisponibilité relative de 66 % (RBA = 34%). Le T5o%aUc est environ 20 fois supérieur à celui de l'IFN IR.
EXEMPLE 17 : PHARMACOD YNAMIE DE L'INSULINE CHEZ LE CHIEN APRES INJECTION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION À BASE DE POLYAMINO- ACIDES AMPHIPHILES SOUS FORME MICROP ARTICULAIRE
La référence de cet exemple, le Lantus®, est un analogue d'insuline modifiée (insuline glargine - Sanofi-Aventis). La modification de deux aminoacides sur la structure primaire de l'insuline humaine confère au Lantus® des propriétés de libération prolongée sur une période de 24 h via une précipitation in situ.
Un groupe de 6 chiens Beagle sains (poids de 11,4 ± 1 kg) a été traité avec la formulation Lantus au cours d'un essai croisé à 2 périodes et un groupe de 8 chiens Beagle sains (poids de 1 1 ,8 ± 1 kg) a été traité par la formulation 2, deux par deux, au cours d'un essai croisé à 4 périodes. Le tableau récapitulatif des traitements est résumé ci-dessous :
Les particules de la formulation 2 sont préparées selon l'exemple 10 en visant un ratio de 30 mg de polymère PO pour 3,5 mg (100 UI) d'insuline. La formulation est préparée par dispersion de la poudre atomisée dans MgCl2 0,1 M et agitation magnétique de la suspension pendant 1 h. Le pH de la formulation est de 6,2 et l'osmolalité de 348 mOsm. La taille des particules correspondantes, mesurée dans un test Ti, est : D50 = 12 μm et la viscosité de la formulation est d'environ 5 mPa.s à 20 °C.
La glycémie est dosée par méthode enzymatique (hexokinase) sur un automate d'analyses biochimiques du sang (Advia 1650, Bayer Diagnostics).
L'analyse des résultats de pharmacodynamie est réalisée sur le pourcentage de la glycémie basale en fonction du temps. Les données pharmacodynamiques sont regroupées dans le tableau suivant :
ou :
- Cmjn est le pourcentage minimum observé de la glycémie basale ;
- APGC0-36h ("Area Percent Glycemia Curve") représente la surface entre la glycémie basale (100%) et la courbe représentant l'évolution de la glycémie
(exprimée en % de la glycémie basale) au cours du temps entre 0 et 36 h post-dose;
- T5O%APGC représente le temps nécessaire pour obtenir 50 % de l'APGC0-36I1.
L'administration de la référence Lantus® conduit à une baisse rapide de la glycémie dès la première heure. L'action hypoglycémiante de l'insuline glargine est ensuite maintenue sur une période comprise entre 18 et 36 h (retour de la glycémie à son niveau basai après 30 h en moyenne).
En comparaison, l'administration de la formulation 2 conduit également à une baisse rapide de la glycémie dès la lre heure. Le pourcentage de la glycémie basale est ensuite maintenu en plateau jusqu'à 36 h en moyenne. La Cmin obtenue avec la formulation 1 est en moyenne plus haute que celle de la référence Lantus®, ce qui devrait permettre de réduire considérablement les phénomènes d'hypoglycémie sévère chez les patients diabétiques.
La durée d'action de la formulation 2 est nettement supérieure à celle de la référence longue action Lantus®. Ceci est illustré par une valeur moyenne de T50%APGC plus élevée pour la formulation 2.
Une perte d'APGC0-36h de seulement 24 % a été observée pour la formulation 2 par rapport à la référence Lantus®.

Claims

REVENDICATIONS
- 1 - Microparticules de polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère PO: • étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles,
• formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique,
• et étant associé de façon non covalente avec le PA; lesdites microparticules étant caractérisées: a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 μm, de préférence entre 1 et 70 μm, de préférence entre 2 et 40 μm, c. et en ce qu'elles sont dispersibles en suspension colloïdale dans un test de dispersibilité DP 1.
- 2 - Microparticules selon la revendication 1 caractérisées en ce qu'elles sont stables dans un test STl ou dans un test ST2.
- 3- Microparticules selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que PO est un copolymère de type bloc ou aléatoire.
- 4 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les groupements hydrophiles du PO sont des groupements ionisables (GI), au moins en partie ionisés.
- 5 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le polymère PO est un (co)polyaminoacide amphiphile ou un mélange de (co)polyaminoacides amphiphiles.
- 6 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que PO est un polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des résidus aspartiques ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant modifiées par greffage d'au moins un groupement hydrophobe (GH), dans la chaîne ou en bout de chaîne. - 7 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le polymère PO est défini par la formule générale (I) suivante (le radical — COOR3 inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3 est une liaison ionique -COO" +R3):
(I) dans laquelle :
R1 est choisi dans le groupe constitué par H, alkyle linéaire en C2 à CiQ, alkyle ramifié en C3 à CIQ, benzyle, et -R4- [GH], ou NHR1 est un résidu acide aminé terminal ;
R2 est choisi dans le groupe constitué par H, acyle linéaire en C2 à CIQ, acyle ramifié en C3 à C 10, et -R4-[GH] ou R2 est un résidu pyroglutamate terminal ; R3 est H, ou +R3 est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
• les cations à base d'aminé,
• les cations à base d'oligoamine,
• les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée),
• les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine,
- ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ; R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide aminé ; A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -
CH2-CH2- (résidu glutamique) ; n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH = 7 et à
25 °C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de
PO ; de préférence n/(n + m) est compris entre 1 et 25 % molaire et mieux encore entre 1 et 15 % molaire ; n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ;
GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone.
- 8 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le (ou les) PO répond à l'une des formules générales (II), (III) et (IV) suivantes (le radical — COOR3 ' inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R est une liaison ionique — COO" +R3 ):
dans lesquelles :
' GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;
" R30 est une chaine alkylène linéaire bivalente en C2 à CÔ ; • R3 ' est H, ou " +R3 ' est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium,
- les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
• les cations à base d'aminé,
• les cations à base d'oligoamine,
• les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine,
- ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine,
• R50 est une chaine alkylène linéaire bivalente en Cl à C8 dans laquelle une ou deux unités méthylènes, de préférence à chaque extrémité de R50, peuvent être indépendamment remplacées par -O- ou -NH- ; " R représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
" A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2- CH2- (résidu glutamique) ;
1 n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300.
- 9 - Microparticules selon la revendication 7 ou 8 caractérisées en ce que R4 représente une liaison de valence simple.
- 10 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisées en ce que le (ou les) PO comprend au moins une copolhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl) essentiellement neutre comprenant une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants, identiques ou différents entre eux..
- 11 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en ce que tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant : " un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O ou N ou S) ou au moins une insaturation, • un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O ou N ou S),
• un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O ou N ou S).
- 12 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en ce que le groupement hydrophobe GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : — OCH2(CH2-CH2)3 g-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et R4 représente une liaison de valence simple.
- 13 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en ce que les n groupements GH du PO représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
(GH) dans laquelle :
- R5 est méthyle, isopropyle, isobutyle, secbutyle, benzyle; - R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone ;
- 1 varie de 0 à 6.
- 14 - Microparticules selon la revendication 13 caractérisées en ce que tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :
• un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O ou N ou S) ou au moins une insaturation, " un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence O ou N ou S),
• un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéro- atome (de préférence O ou N ou S). - 15 - Microparticules selon la revendication 13 ou 14 caractérisées en ce que le radical hydrophobe R6 du greffon du PO est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : — OCH2(CH2-CH2)3 8-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle.
- 16 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 1 1 à 15 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique.
- 17 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 11 à 15 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique.
- 18 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 11 à 15 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un copolymère d'alpha- L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique .
- 19 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 caractérisées en ce que PO comprend GH, (n/n+m) dans la formule (I), à hauteur d'au moins 10% molaire, de préférence d'au moins 15% molaire.
- 20 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 19 caractérisées en ce que la masse molaire du PO se situe entre 2000 et 100 000 g/mol, et de préférence entre 5000 et 40 000 g/mol.
- 21 - Procédé de préparation de microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA), ces microparticules étant en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, i. le polymère PO:
• étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés),
• et formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique,
• et étant associé de façon non covalente avec le PA ii.lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test Tl, comprise entre 0,5 et 100 μm, de préférence entre 1 et 70 μm, de préférence entre 2 et 40 μm, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution ou une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
- 22 - Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que le PO contenu dans la solution ou la suspension colloïdale est au moins en partie sous forme de nanoparticules de PO ayant une taille, mesurée dans le test Tl, inférieure à 500 nm, de préférence comprise entre 10 et 300 nm , et plus préférentiellement encore comprise entre 10 et 100 nm.
- 23 - Procédé selon la revendication 21 ou 22 caractérisé en ce que les microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA) sont dispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux, ledit milieu contenant de préférence un moyen Ml de dispersion, et en ce que la dispersion obtenue est lyophilisée.
- 24 - Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que le moyen de dispersion Ml est choisi dans le groupe constitué par: i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse; ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées; iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable); iv- le changement de pH; v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv); le moyen (i) étant particulièrement préféré.
- 25 - Formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 24.
- 26 - Formulation selon la revendication 25 caractérisée en ce qu'elle comprend un moyen M2 de dispersion des microparticules de PO associées à au moins un PA. - 27 - Formulation selon la revendication 25 ou 26 caractérisée en ce que la phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse.
- 28 - Formulation selon la revendication 25 ou 26 caractérisée en ce que la phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible à l'eau.
- 29 - Formulation selon la revendication 25 ou 26 caractérisée en ce que la phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique non miscible à l'eau.
- 30 - Formulation selon la revendication 25 ou 26, éventuellement 27 caractérisée en ce que le moyen de dispersion M2 est choisi dans le groupe constitué par: i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse; ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées; iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable); iv- le changement de pH; v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv); le moyen (i) étant particulièrement préféré.
- 31 - Formulation selon la revendication 30 caractérisée en ce que le composé hydrophile d'enrobage est choisi dans le groupe comprenant :
— » les acides aminés;
— > les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
→ les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycol- propylène-glycol; → les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les carboxyalkyl- celluloses ou les alkylcelluloses;
→ les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose ;
— » les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ; -> les gélatines de préférence hydrolysées ;
— > les (co)polymères azotés, de préférence ceux contenus dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly- jV-vinyl-lactames ; → les alcools polyvinyliques (APV); -> le polyglutamate de sodium ; — » et leurs mélanges ; ledit composé hydrophile d'enrobage comprenant de préférence au moins un polymère hydrophile.
- 32 - Formulation selon les revendications 25 et 27 ou 28 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend un liquide lipophile, dont la température de fusion est de préférence inférieure ou égale à 15°C et contenu dans la phase continue miscible ou non à l'eau.
- 33 - Formulation selon la revendication 32 caractérisée en ce que le liquide lipophile comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras.
- 34 - Formulation selon la revendication 33 caractérisée en ce que le liquide lipophile comprend un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en C8 -C]0 issu de l'huile de noix de coco; • au moins une huile végétale, de préférence l'huile de soja, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol, l'huile d'arachide,
• au moins un lipide, de préférence une lécithine liquide, la vitamine E synthétique ou naturelle ;
• au moins un dérivé de lipide, de préférence l'arachidoylphosphatidylcholine et la stéaroylphosphatidyl-choline,
• au moins un acide gras, de préférence l'acide oléique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, et leurs sels ;
• au moins un dérivé d'acide gras, de préférence un dérivé de mono-, di- ou triglycéride, Poléate d'éthyle, le lactate de lauryle, le stéarate de glycéryle, le palmitate de sorbitane, le stéarate de sorbitane, le monoléate de sorbitane, le polysorbate ;
• et leurs mélanges ; avec la condition selon laquelle, dans le cas où certains des produits énumérés ci-dessus pris séparément ne sont pas liquides à une température inférieure ou égale par exemple à 15°C, alors ces produits sont en mélange avec d'autres, de sorte qu'ils soient liquides à une température inférieure ou égale par exemple à 15°C.
- 36 - Formulation selon les revendications 25 et 27 ou 28 et éventuellement 32, 33 ou 34 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend un enrobage des microparticules par au moins un composé filmogène d'enrobage (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
- 37 - Formulation selon la revendication 36 caractérisée en ce que le composé filmogène d'enrobage comprend au moins un polymère hydrophobe choisi dans le groupe comprenant les polylactides, les polyglycolides, les poly(lactide-co-glycolide), les polyorthoesters, les polyanhydrides, les acides polyhydroxybutyriques, les polycapro- lactones, les polyalkylcarbonates, les polymères PO insolubles dans l'eau, leurs dérivés et leurs mélanges.
- 38 - Formulation selon les revendications 25 et 27 ou 29 et éventuellement au moins l'une des revendications 31 à 36 caractérisée en ce que le composé filmogène d'enrobage est de nature lipidique et présente une température de fusion de préférence supérieure ou égale à 15°C et comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras ou un mélange de ces produits.
- 39 - Nécessaire de reconstitution en particulier de la formulation selon l'une quelconque des revendications 24 à 38 caractérisé en ce qu'il comprend : • des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon la revendication 21 ou 22;
• et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant:
-> les liquides essentiellement aqueux; -> les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau;
— > et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
- 40 - Procédé de reconstitution en particulier de la formulation selon l'une quelconque des revendications 24 à 38 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement: • à mélanger
=> des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon la revendication 21 ou 22.
=> et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : -> les liquides essentiellement aqueux ;
— » les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau ;
-» et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
• et à agiter ce mélange. - 41 - Formulation pharmaceutique solide pour la libération de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche :
• à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon la revendication 21 ou 22 ;
• ou obtenue à partir de la formulation selon l'une quelconque des revendications 24 à 38.
- 42 - Formulation pharmaceutique solide selon la revendication 41 pour inhalation et administration pulmonaire.
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