EP2030062A1 - Autofokuseinrichtung für die mikroskopie - Google Patents

Autofokuseinrichtung für die mikroskopie

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EP2030062A1
EP2030062A1 EP07785823A EP07785823A EP2030062A1 EP 2030062 A1 EP2030062 A1 EP 2030062A1 EP 07785823 A EP07785823 A EP 07785823A EP 07785823 A EP07785823 A EP 07785823A EP 2030062 A1 EP2030062 A1 EP 2030062A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
autofocus
camera
image
microscope
microscope according
Prior art date
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Granted
Application number
EP07785823A
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English (en)
French (fr)
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EP2030062B1 (de
Inventor
Peter Westphal
Daniel Bublitz
Reiner Mitzkus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss MicroImaging GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss MicroImaging GmbH filed Critical Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Publication of EP2030062A1 publication Critical patent/EP2030062A1/de
Application granted granted Critical
Publication of EP2030062B1 publication Critical patent/EP2030062B1/de
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Anticipated expiration legal-status Critical

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/36—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/244—Devices for focusing using image analysis techniques

Definitions

  • the invention relates to a microscope with a lens projecting a sample along a microscope beam path and an autofocus device, which is reflected by a beam splitter in the microscope beam path.
  • Triangulations In Triangulationsclar a collimated laser beam is reflected in the pupil plane of an objective and closed from the course of this laser beam relative to the imaging beam path to the z position of the laser light reflected from the sample.
  • a slit diaphragm When determining the position by means of an inclined confocal slit, a slit diaphragm is placed in a field stop plane of the illumination beam path and imaged onto the sample. The light reflected from the specimen is directed to a CCD line inclined relative to the slit and the position on the CCD line where the reflected light has a maximum is determined.
  • This process is very fast but has problems with contaminants on the sample or sample surface that can cause intensity fluctuations. Also, a very large Justieraufwand in the image of the gap on the CCD line to apply, because the gap must be very narrow in order to achieve high accuracy can be.
  • An improvement in the position determination by means of an inclined confocal slit is described in DE 10319182 A1.
  • a reference to an interface serving as a reference plane can be done in the prior art either by using a second autofocus device which is focused on the interface.
  • this increases the optical complexity, and usually you have to reserve a range of detection or illumination aperture for this additional autofocus.
  • To use multiple autofocus beam paths is described for example in WO 00/43820.
  • the disadvantage here is that the actual microscopic measurement must be interrupted for the determination of the distance to the reference plane.
  • Such an object can, for. Example, a cell located in a sample, which moves in the sample (eg., In a liquid solution).
  • the invention is therefore based on the object of specifying a microscope with an autofocus device, with which not only the position of the measurement plane can be determined exactly, but at the same time the distance to a reference plane detectable or object tracking or finder is possible.
  • a separate autofocus device which is provided only for determining the reference plane, and / or a repeated adjustment of the focus position in the z-direction should be avoided.
  • a microscope having a lens which has a focus plane lying in a sample volume, and having an autofocus device which comprises: a light modulator for generating a luminous, intensity-modulated modulation object, an autofocus illumination optical system which transmits the luminous modulation object into the focal plane of the objective or this intersecting image, so that an image of the modulation object is produced in the sample volume, wherein the image of the modulation object via a beam splitter, which reflects the beam path of the autofocus illumination optics in the microscope beam, a camera for taking a two-dimensional image, the camera Imaging plane, and an autofocus imaging optics which images the sample volume of the modulation object into an autofocus image plane, the camera image plane intersecting the autofocus image plane when the image of the modulation object is in the focal plane t, and in the autofocus image plane, if the image of the modulation object intersects the focal plane.
  • an autofocus device which comprises: a light modulator for generating a luminous, intensity-modulated modulation object, an autofocus illumination optical
  • the invention thus provides a microscope with a lens projecting a specimen along a microscope beam path and an autofocus device having an autofocus beam path which is coupled into the microscope beam path via a beam splitter and comprising: a light modulator for generating a luminous two-dimensional, intensity-modulated modulation object that in FIG Autofocus beam path is in a plane conjugate to the focal plane of the lens or intersects and is shown in the focal plane of the lens, and - a camera for taking a two-dimensional image on which the autofocus beam path images the image of the modulation object lying in the sample, the image plane of the Camera intersects a plane conjugate to the modulation object or lies in this plane and the camera detects the contrast of the image in the sample of the modulation object, - wherein the modulation object and / or the image plane of the camera a obliquely to the optical axis of the autofocus beam path lie / lies.
  • the invention provides that a preferably two-dimensional modulation object, z. B. by illumination of a corresponding light modulator (grid, LCD or DMD), generated and in the microscope beam path, z. B. the illumination beam path, is reflected in order to achieve a structured autofocus illumination of the sample.
  • the structured illumination takes place via a separate light source, which is independent of the illumination source, preferably via LED.
  • the two-dimensional illumination object radiates in a spectral range that is not needed in the sample imaging.
  • a two-dimensional camera eg CCD or CMOS
  • CCD charge-dimensional camera
  • Either the camera or the modulation object is at an angle to the optical axis. Both can also be at an angle to the optical axis.
  • one dimension of the camera can be assigned to a certain depth range and thus to different focal planes.
  • the selected depth range can be adjusted by selecting the angle.
  • the aim is to determine the position of a backscattering or reflecting (ie reflecting) interface, in or on the sample and / or the position of a sample with intrinsic contrast.
  • the modulation object modulates spatially and can also temporally modulate when using an adjustable light modulator.
  • a temporal modulation is an alternative to a spectral separation to distinguish the illumination by the modulation object from the rest of the microscope illumination.
  • the detection of the autofocus image is preferably synchronized for temporal modulation, z.
  • a lock-in technique can be used.
  • the temporal modulation is carried out with such a high frequency that they can be observed under visual observation in the microscope, z.
  • B. is not perceptible by a microscope eyepiece.
  • a possible frequency range is above the image fusing frequency of the eye, which is about 50 Hz in the bright adapted state, for example between 50 and 200 Hz is a possible range.
  • the coupling and decoupling of the structured illumination as well as the image of the structured illuminated sample on the camera can advantageously be done with splitter mirrors, which have only a small influence on the remaining microscope beam path, z. B. by a high transmittance (about 95% and higher are possible).
  • a dichroic separation in combination with spectrally separated autofocus radiation.
  • the reflectance can also be increased at the expense of the transmittance.
  • the autofocus system z. B. with an infrared (NIR) illumination source so preferably the dichroic beam splitter is natural designed so that it leads the autofocus radiation with high efficiency in the autofocus beam path or off and / or coupled.
  • NIR infrared
  • periodic illumination e.g. Strip lighting where the modulation object is a striped pattern.
  • redundant information can be obtained by means of a second dimension of the camera, whereby a very robust autofocus signal is preferably produced by averaging a plurality of line signals.
  • the structure of a spatially modulated modulation object is preferably alternately shifted laterally in rapid succession (eg, greater than 30 Hz).
  • Possibility which is also given in the case of an adjustable light modulator, is to illuminate only certain partial regions of the object field / sample volume detected by the objective, always or temporarily (eg after finding an object to be microscoped). This allows the image contrast for the autofocus or the
  • the modulation object is oblique to the focal plane of the lens or the camera image plane is oblique to the image plane of the autofocus imaging optics. It can also be both diagonally.
  • the inclination can be achieved in that the modulation object or the camera is oblique to the optical axis. It can therefore be the modulation object obliquely to the optical axis and the image plane of the camera perpendicular to the optical axis, it can be the modulation object perpendicular to the optical axis and the image plane of the camera at an angle to the optical axis, or it is a mutual skew of modulation object and image plane possible , which then have to be inclined in opposite directions relative to the optical axis.
  • a three-dimensional image tracking or autofocus system is also possible.
  • a second camera can be perpendicular to the optical axis, and a third is rotated about a tilt axis that does not coincide with the tilting axis of the first camera.
  • the structured autofocus illumination can of course be realized in transmitted light and / or in dark field illumination. In transmitted light mode, however, the application would then be limited to transparent sample carriers.
  • a mathematical evaluation device which performs the signal evaluation of the camera (s), controls an optionally adjustable light modulator and the control of any existing mechanical actuation units on the microscope (eg., For focus adjustment, xy -Vergorigna, for pivoting and / or switching on filters, etc.) makes. Evaluation and control can be implemented both in terms of circuitry and software.
  • the autofocus system of the invention is, of course, controlled in operation by a control device which comprises the arithmetic evaluation device and initiates measures explained here in order to implement the described procedure.
  • the control unit may be an already provided in the microscope control unit.
  • both camera and modulation object are tilted relative to the optical axis. Both are in mutually conjugate planes. The tilt angle is preferably the same. It is reflected by the sample scattered or reflected light modulated on the camera.
  • the strength of the modulation provides structural information about the sample and may be used for autofocus and / or picture object tracking purposes. Due to the inclination of the modulation object and the camera, one simultaneously obtains structure information from different depths (z positions of the focal plane of the objective) of the sample.
  • the light modulation detected on the camera, d. H. the image of the object imaged in the sample may be affected by speckle effects.
  • a synchronous movement of modulation object and camera is possible.
  • additional cameras can be mirrored in, which derive structural information from the sample. These cameras are then arranged so that different cutting planes of the sample are imaged on them, ie the cameras are arranged with different tilt angles to the optical axis or different angles of rotation about the optical axis.
  • a camera may additionally be attached in a plane that is not conjugate to the light modulator. Due to the corresponding tilt angle, the capture range can be adjusted.
  • the skew of a non-conjugated camera is equivalent to a changed angle included by the modulation object with the optical axis. However, since this angle can hardly be chosen smaller than 30 ° for practical reasons because of spherical aberrations and reflection losses, such a further camera gives the possibility to increase the capture range of the autofocus device.
  • the microscope may be designed in particular as an inverted microscope, as z. B. is used to read titer plates, which have upwardly open cuvettes with liquids. To focus here is regularly on the glass / liquid interface of the titer plate bottom to adhere to the most cells. Since such cells affect the contrast of the imaged modulation object, it is preferable to average over several lines of the two-dimensional camera in order to improve the measurement accuracy.
  • Air or an immersion liquid can be arranged between the objective and the titer plate bottom. Without immersion liquid, the air / glass interface at the titer plate bottom produces the highest contrast. With immersion liquid, the strongest contrast is obtained from the interface between cuvette fluid and titer plate bottom top.
  • the light modulator can be controlled and designed to generate a spatially or temporally intensity-modulated modulation object.
  • This controllability can be achieved by using a lighted LCD or DMD element as the light modulator.
  • the wavelength used here differs preferably from the normal illumination radiation in the microscope.
  • the autofocus device with regard to the light modulator and / or the camera can be coupled into the illumination beam path of an incident-light microscope.
  • an irradiation parallel to the reflected-light illumination beam path in the microscope beam path is possible, ie a separate beam splitter for the autofocus beam path is located in the microscope beam path.
  • the beam splitter is designed so that it reflects only a narrow wavelength range, eg 20 nm, which does not overlap with the 2-photon excitation radiation. In principle, however, the entire visible range and UV can be used for the autofocus function.
  • a particularly simple analysis of the modulation object imaged in the sample is obtained if the modulation object depicted has a periodic structure, e.g. B. has a strip grid structure.
  • the light modulator is thus designed accordingly.
  • the autofocus device will be reflected in the beam path of the microscope via a beam splitter, wherein at the same time the image of the modulation object, as well as the back-imaging of the imaged modulation object is coupled to the camera via the same beam splitter.
  • the structure is then particularly easy to adapt to an existing microscope. However, this is not mandatory.
  • the angle of inclination of the image plane of the camera or modulation object to the optical axis sets the capture range or depth range in which the autofocus device operates.
  • An angle between 20 ° and 70 ° is appropriate.
  • a first approach is a spectral separation.
  • the image of the modulation object is then in a spectral range that is not used or needed in the sample imaging.
  • the image of the modulation object in the sample and the image of this image or the reflections generated in the sample on the camera then takes place via suitable dichroic beam splitters or a central dichroic beam splitter.
  • Another possible means is a temporal modulation of the light modulator, in combination with suitable synchronized detection of the image of the modulation object. In this approach, autofocus radiation and normal sample imaging radiation may be in the same spectral range.
  • Autofokusstrahlengang pass are then preferably suppressed by suitable filters.
  • a particularly good filtering is possible if the image of the modulation object lying in the sample is imaged on the camera with the aid of an intermediate image. Then there is sufficient space to use barrier filters.
  • a further suppression of interfering radiation can be achieved if, at the beam splitter, the illumination in the autofocus beam path, d. H. the mapping of the modulation object into the sample, from the detection d. H. separating the image of the image in the sample onto the camera, providing a radiation trap that absorbs radiation that is not transmitted to this beam splitter.
  • an intermediate image further has the considerable advantage that separates between the beam splitter, the autofocus illumination and autofocus detection, there is a large distance to be detected camera. Unavoidable scattered light from the beam splitter thus only passes through multiple reflections, i. H. heavily attenuated, to the camera.
  • 1 shows a microscope with an autofocus device for reflection measurements
  • 2 shows a microscope with an autofocus device for fluorescence measurements
  • FIG. 3 is a microscope similar to that of FIG. 1, adapted for scattering samples
  • FIG. 4 shows a microscope similar to that of FIG. 1 with an increased catch area
  • FIG. 7 shows a microscope similar to that of FIG. 6, with an autofocus device which is arranged upstream of a camera for intermediate imaging optics, FIG.
  • Fig. 8 is a plan view of an exemplary light modulator
  • the microscope 1 shows a microscope 1 with which a sample 2, which is located on a sample carrier 3, is imaged onto a detector 5 by means of an objective 4.
  • the illustration in Fig. 1 is greatly simplified.
  • the microscope 1 may be a wide field microscope, i. H.
  • the detector 5 is e.g. a camera or an eyepiece viewer.
  • any other microscope design is for the microscope 1 in question, for example, a laser scanning microscope.
  • the microscope beam path still a scanning arrangement is provided, which lies on the optical axis OA1.
  • the lens 4 is adjustable in its focus position, as indicated by the double arrow.
  • the sample carrier 3 can be adjustable.
  • a beam splitter 6 which may optionally be formed as a dichroic or as a plate-shaped color divider, microscope illumination radiation from a microscope illumination source 8 is coupled, which illuminates the sample 2 through the lens 4 via an illumination tube optics 7.
  • An autofocus device is coupled into this illumination beam path by means of a beam splitter 11.
  • the autofocus device has a light modulator 12 which is illuminated by a light source 13, for example an LED, for transmission operation or by a light source 14 (eg an LED) for reflection operation.
  • the illuminated light modulator 12 generates a modulation object. This is projected on the beam splitter 11, the illumination tube optics 7, the beam splitter 6 and the lens 4 in the sample 2, so shown.
  • an autofocus illumination is realized.
  • the In the sample 2 generated image of the modulation object is detected in the opposite way by means of a camera 16, which is preceded by a further beam splitter 15 on the optical axis OA2 of the autofocus device.
  • the optical axis OA3 obtained in this way is passed on to a camera 18 via a beam splitter 17.
  • the beam splitter 11 is designed to be dichroic in a construction according to the invention and the light source 13 or 14 radiates at a wavelength which is not substantially emitted by the microscope illumination source 8 or is not needed for the sample imaging.
  • the autofocus device thus operates in a spectral range which is otherwise not used for imaging the sample 2.
  • the cameras can generally be CCD cameras.
  • the light modulator 12 and thus the modulation object is perpendicular to the optical axis OA2.
  • the camera 16 is with its image plane, however, obliquely to the optical axis O A3. If the light modulator 12, for example, a spatial modulation, z. As a stripe pattern, there is the maximum contrast in a plane perpendicular to the plane line of the camera 16.
  • the position of the line along the camera 16 is a measure of the position of the focal plane along the optical axis, d. H. in the z direction.
  • the modulation object which is generated by the light modulator 12 either in transmission mode (light source 13) or in reflection mode (light source 14), is imaged into the sample.
  • the tilted camera 16 is a depth resolution. By means of the camera 18, a lateral displacement of the structured illuminated sample can additionally be detected.
  • an excitation filter 10 and an emission filter 9 are used.
  • the microscope 1 can also be designed as a scanning microscope, in particular as a laser scanning microscope, without further restriction with regard to the autofocus device.
  • Fig. 2 shows an alternative design of the microscope of Fig. 1 with respect to the autofocus device.
  • the camera 16 detects here the fluorescence contrast of the sample, which can be further enhanced by the structured autofocus illumination.
  • the mapping of the modulation object is similar to the construction according to FIG. 1. However, the detection of the modulation image shown in the sample 2 does not take place out of the illumination beam path, but via an independent beam splitter from the microscope beam path. This is adapted to the wavelength of the autofocus illumination and z. To the same extent dichroic, as the beam splitter 11.
  • the optical characteristic ensures that the image plane of the camera 16 intersects a conjugate plane to the modulation object, ideally near or on the optical axis (as in Fig. 1 also).
  • the signals supplied by the focus device, in particular the camera 16, are utilized to trigger a focus adjustment along the z-axis. This is illustrated schematically in Fig. 1 by a double arrow. The case used control unit is not shown in Figs. 1 and 2.
  • the combination of emission filter 9 and excitation filter 10 is again provided, as well as optionally another spectral filter 21, which ensures that the spectral range of the luminous modulation object is applied to the camera 16 falls and no further interest spectral ranges are hidden in particular the spectral ranges of the sample image.
  • FIG. 3 shows a design of the microscope 1 for highly scattering and low-reflection samples. Elements which have already been explained with reference to FIGS. 1 or 2 will not be further described. They are provided in the figure with the same reference numerals.
  • the autofocus device according to FIG. 3 is modified. It is a device that primarily analyzes the light scattered by the sample.
  • the two-dimensional light modulator 12 with the optical axis OA2 includes an angle between 0 ° and 90 °, preferably between 20 ° and 70 °.
  • the light modulator 12 again corresponds to the already described construction, ie it may be a transmission LCD, a reflection LCD, a DMD or an amplitude grating with a displacement device.
  • the structure preferably again consists of light-dark stripes.
  • the illumination of the light modulator 12 is preferably carried out by one or more powerful LED. This was also possible in FIGS. 1 and 2.
  • a transmission modulator while the light source 13 is provided at a Reflection modulator the light source 14.
  • Conventional optical devices for light homogenization and optics to intermediate images can be used to generate the modulation object with the light modulator 12 and are not shown for the sake of clarity in Fig. 3 (as well as in Figs. 1 and 2).
  • the modulation object is imaged into the sample 2. Since the light modulator 12 and thus the modulation object is not perpendicular to the optical axis, the modulation object (eg alternating light-dark stripes) is imaged obliquely to the optical axis and thus into the depth of the sample.
  • the modulation object eg alternating light-dark stripes
  • the image plane of the camera 18 lies in a plane conjugate to the light modulator 12 and thus to the modulation object. It is thus tilted at the same angle to the optical axis (in this case the optical axis OA3) as the light modulator 12.
  • the optical axis OA3 the optical axis as the light modulator 12.
  • the contrast of the modulation object appears on camera 18 only where it is scattered by the sample. Therefore, the embodiment in Fig. 2 is particularly suitable for thin or non-transparent, scattering samples, for example in material microscopy.
  • the autofocus device for the autofocus function still has the camera 16 whose image plane is inclined with respect to the light modulator 12 and thus the modulation object, since it is perpendicular to the optical axis OA3. It is reflected by a 50% splitter 17 within the autofocus beam path.
  • FIG. 4 shows a further modification of the microscope with regard to the autofocus device.
  • the arrangement of FIG. 4 differs from that of FIG. 3 in that the camera 18 is now tilted in opposite directions to the light modulator.
  • the image plane of the camera 18 and the light modulator 12 are here tilted so that they are not conjugate to each other. As a result, the catch area can be increased, typically doubled.
  • the construction shown by way of example in FIG. 4 has the advantage that the autofocus device can operate very reliably simultaneously with all conventional microscopy processes.
  • the modulation object i. H. the illumination of the light modulator 12 to use radiation whose wavelength is above the wavelengths used for the microscopy operations.
  • a wavelength range above 700 nm, preferably above 800 nm can be used for the autofocus device.
  • An additional spectral filter in front of the camera or the cameras can effectively suppress interfering light of the microscope illumination.
  • Figs. 1 to 4 show the arrangement of the autofocus device in an upright microscope 1 with a slide as a sample holder.
  • a glass coverslip as well as an immersion liquid eg oil, water, glycerol
  • immersion liquid eg oil, water, glycerol
  • apertures e.g. Semi-circular aperture, are introduced into the auto-focus beam path.
  • the beam splitter 11 or 11 ' may be a plane-parallel glass plate, which is non-reflective on one side, without avoiding spurious secondary images.
  • the side of the glass plate serving for the reflection of the autofocus signal may also have a dichroic coating which increases the reflectivity for the long-wavelength autofocus light (if the variant with long-wave autofocus illumination is used) and predominantly transmits the shorter-wavelength useful light of the microscopy (eg fluorescence radiation).
  • a dichroic coating which increases the reflectivity for the long-wavelength autofocus light (if the variant with long-wave autofocus illumination is used) and predominantly transmits the shorter-wavelength useful light of the microscopy (eg fluorescence radiation).
  • other spectral splits are possible.
  • FIG. 5 shows an inverted microscope 1 with an autofocus device according to the invention.
  • Such inverted microscopes are primarily used for reading titer plates which have upwardly opened cuvettes 22 with liquids. To focus here is usually on the glass / liquid interface of the titer plate bottom (or in its vicinity), where the most cells adhere. Because these cells are the contrast of the projected grid, ie the Modulation object, affect, are preferably evaluated in this construction, at least 10 lines of the flat camera 16. As a result, the contrast signal can be averaged over a larger number of lines, which significantly improves the measurement accuracy.
  • Air or an immersion liquid may in turn be located between the objective 4 and the bottom of the titer plate, what has already been said above applies analogously. The only difference is that instead of the embedding medium there is an extended column of liquid which is above the sample in the cuvette 22.
  • the autofocus device is again in the construction of FIG. 5 via its own dichroic beam splitter 11 'in the microscope beam path and not in the
  • Illumination beam path coupled. Otherwise the same applies analogously.
  • Fig. 5 nor the optional spectral filter 21 is located. Also, the illumination optics
  • the illumination optics 23 for generating the modulation object from the light modulator 12 exemplified.
  • the illumination optics 23 also includes a lens.
  • An illumination optics 23 can be used in all variants described.
  • Fig. 5 shows that the signals of the camera 16 are passed to a control unit 26, which performs corresponding calculations and, among other things, the already mentioned z-drive 27 for adjusting the focus position.
  • the control unit 26 is usually also connected to the light modulator 12, provided that it is controllable. The same applies to the light source 13 or 14.
  • the control unit 26 and the associated elements are also in the construction according to FIGS. 1 to 4 possible.
  • FIG. 6 shows a modification of the construction of FIG. 5.
  • the autofocus device is reflected in the illuminating beam path via the beam splitter 11.
  • the separate optics 20 may be omitted, since then no Autofokusbeleuchtungstubusoptik is necessary; their function is fulfilled by the illumination tube optics 7.
  • optional filters 24 and 25 are shown in the illumination beam path.
  • the optics 7, 20 and 28 can also be designed as (motorized) Variooptiken to compensate for different reiweriereiere.
  • Fig. 7 shows a further construction of a microscope with an autofocus device. Components that correspond in their function and / or structure elements from microscopes already described are not explained again here to unnecessary Avoid repetitions.
  • the camera 16 is now preceded by an imaging optics 29, so that not the image of the modulation object in the sample, but an intermediate image 30 is imaged directly on the camera 16.
  • an imaging optics 29 is now preceded by an imaging optics 29, so that not the image of the modulation object in the sample, but an intermediate image 30 is imaged directly on the camera 16.
  • the light modulator embodied here as a transmission grating and the intermediate image 30 lie in planes which are conjugate to the sample focus plane as well as to the plane which intersects the camera 16.
  • the image of the lying in the sample image of the modulation object using the intermediate image 30 has the considerable advantage that the further beam splitter 15, the z. B. as
  • 50: 50 beam splitter can be shown, located at a great distance from the camera 16.
  • the light source 13 used is an IR LED whose centroid wavelength is above 800 nm, preferably at 830 nm.
  • the light source 13 is connected to the controller 26 so as to require it - or switched off, time modulated or adjustable in its brightness.
  • the light modulator 12 is formed as a column-shaped transmission grating.
  • a collimator optics with an anamorphic optic 23 is provided which effects a line-shaped illumination.
  • the light modulator 12 upstream is the filter 21, which is designed as an IR band-pass filter and is adapted to the center wavelength of the IR-LED.
  • the bandpass width is between 10 and 50 nm, whereby unwanted spectral components of the light source 13 are suppressed.
  • the transmission grating is shown by way of example in FIG. 8 in plan view. It consists of a slit-shaped aperture containing a periodic lattice structure. This grid gap is located in the center of the image or in the vicinity of the center of the image to ensure the largest possible capture range of the autofocus device.
  • further grid gaps with other grid periods may be provided to optimize the imaging contrast on the camera by selecting the grid period. The selection is preferably done by appropriate reading of the 2D camera 16. Also, a narrow gap 35 may be provided without grid structure. The reflected from the glass / liquid interface light of Slit image is mapped to a separate portion of the camera 16.
  • the defocusing can be roughly determined on the basis of the imaged brightness distribution over the gap.
  • the controller 26 can determine in which direction the z-adjustment must be made, ie how the drive 27 is to be driven to get back into the primary capture area. If the gap is sufficiently narrow, the brightness is higher due to confocal suppression at the camera 16. From the slope of the brightness distribution of the necessary travel can be derived in the primary capture area. This is done by the control unit 26.
  • a light trap 34 which absorbs radiation from the light modulator 12, which would be transmitted.
  • the light trap 34 is preferably formed as a slanted to the optical axis plate of a highly absorbent material, for. B. as a polished NG 1 plate.
  • NG 1 is a highly absorbent, black glass.
  • the dichroic beam splitter 11 ' reflects only radiation of the wavelength as it is guided after the band-pass filter 21 in the autofocus beam path. Other spectral components are transmitted.
  • the beam splitter 11 ' has an interference layer which largely transmits radiation below 800 nm at an angle of incidence of 45 ° and largely reflects radiation with the centroid wavelength of the IR LED.
  • the beam splitter 11 ' may have a wedge angle to interfere with interferences that would interfere with a laser scanning microscope that may be the microscope of FIG. 7.
  • the beam splitter 11 'can In order to be able to work with light-linear fluorescence excitation, which likewise works with IR radiation in the microscope for sample imaging, the beam splitter 11 'can also have a bandpass-like spectral behavior, so that wavelengths above the autofocus spectral range (eg above 840 nm) also be largely transmitted at 45 ° angle of incidence.
  • these beam splitter features may also be used in other embodiments.
  • the beam splitter changeable, z. B. by means of a change gear or other Kirmechanismusses.
  • the image of the sample in the sample of the modulation object or its intermediate image 30 are preceded by blocking filter 33, which ensure that only radiation of the corresponding autofocus spectral range reaches the camera 16.
  • Other radiation that may originate from the image of the sample eg. B. excitation or fluorescence radiation in the case of a laser scanning microscope, is thereby suppressed again.
  • the imaging optics 29 forms the image of the modulation object lying in the sample or at an interface, eg. B. the glass / liquid interface reflected intermediate image 30 on the camera 16 from.
  • FIGs. 9 and 10 show the contrast signal of the camera 16 in the autofocus system, e.g. FIG. 9 shows the contrast signal in the center of the image field and FIG. 10 shows the image field edge. In both figures, the contrast signal is applied in arbitrary units over the pixel number of the exemplary line-shaped camera (16).
  • the capture range of the autofocus system is predetermined by the range of the z-shift of the objective 4 (or the interface) in which there is still an evaluable contrast signal on the autofocus camera. Two conditions must be fulfilled for this:
  • the contrast signal must still be within the image field. 2.
  • the contrast signal must have a sufficient signal level that is significantly above the noise level.
  • the holding range in which the focus can be maintained by readjustment is limited by the maximum permissible range of the z-shift of the focal plane into the sample.
  • the holding area is exactly half the size of the capture area. This is the case in the illustration of FIG. 9.
  • the contrast decreases from about 110 to about 30 when the contrast center of gravity is shifted from the middle of the image field to the edge of the image field.
  • This deterioration of the signal-to-noise ratio results mainly from spherical aberration and from coma, two aberrations that always increase towards the edge of the frame.
  • a contrast level of 30 can just be meaningfully evaluated. For this reason, the image field size must be selected on the tilted autofocus camera so that the contrast height is just sufficient at the edge of the capture range. The size of the camera is adjusted accordingly.
  • a longitudinal adjustment mechanism 40 which varies the distance between the autofocus lens 31 and autofocus camera 16.
  • all known drive techniques such as spindle drives, stepper motors, DC motors, piezo actuators, etc. are suitable.
  • the variation of the distance between the autofocus objective 31 and the camera 16 is only one example of the generally underlying principle of longitudinal adjustment of the camera 16 to the image plane of the autofocus imaging.
  • the longitudinal adjustment mechanism can effect a displacement of the camera 16, the imaging optics 29 or the light modulator 12.
  • the distance between the autofocus lens and autofocus camera to the desired holding range is adjusted so that the focus of the contrast signal is always in the middle of the frame.
  • the focal plane of the microscope objective 4 is moved into the sample with the aid of the z-drive 27. Simultaneously, the distance between the autofocus lens 31 and the camera 16 is varied so that the contrast centroid remains in the center of the field of the autofocus objective 31.
  • the desired focal plane is set, the already described holding focus function is activated. As a result, all defocusing is compensated by the z-drive, while the distance between the autofocus lens 31 and the camera 16 remains constant. Due to the holding focus function, the contrast center of gravity continues to remain in the middle of the field of view of the autofocus objective 31 and thus in the center of the camera 16.
  • FIG. 11 The effect of the longitudinal adjustment is shown in FIG. 11, which again shows the contrast signal in the middle of the image field.
  • the signal level is compared with Fig. 10 improved by 67% to a level of about 50.
  • the capture or holding range is no longer limited by the image field size of the autofocus objective 31.
  • the capture range can be greatly expanded, typically doubled.
  • the catching or holding area is limited only by the aberrations in the middle of the image field of the autofocus objective 31. These are predominantly spherical aberration.
  • other problems that occur at the edge of the frame such as edge dropping of lighting, vignetting and reflections, etc., are bypassed.
  • the light modulator 12 can be made smaller. It no longer has to run over the entire field of view of the objective 4 in order to maximize the capture range. As a result, less autofocus light is coupled into the microscope beam path, which reduces the scattered light background on the autofocus camera 16. If a smaller (i.e., shorter) light modulator 12 is used, a smaller and thus less expensive camera chip may also be used for the autofocus camera 16.
  • the angle of the camera 16 are preferably adjusted electronically.
  • the adjustment of the angle between the camera 16 and image of the modulation object takes place in the simplest case by rotation of the camera 16 or the light modulator 12 by means of a suitable angle adjustment mechanism.
  • the described adjustment mechanisms 40, 41 emit an adjustment signal, which is supplied to the control unit 26 of the autofocus device.
  • a stripe pattern can be projected as a modulation object on the sample, which is laterally shifted alternately in rapid succession (> 30 Hz). For two positions it would be a phase shift of 180 °, for three positions a phase shift of 120 °.
  • the lattice structure (lattice constant, light / dark ratio) can be easily adapted via the electronic light modulator 12 in the control so that a homogeneous illumination arises in the time average.
  • the adaptation of the optimum grating structure to the lens 4 used or its NA or magnification is also possible.
  • an adjustable, in particular controllable light modulator 12 and thus a variable autofocus illumination structure is to illuminate only the interesting areas of the object field after finding an object. In this way, the image contrast for the tracking device, but possibly also for the normal detection channel can be increased.
  • the structured autofocus illumination e.g. by LCD or DMD, even with a transmitted light microscope and / or as dark field illumination feasible.
  • transmitted light the application is then limited to transparent sample carriers and to scattering or fluorescent samples.
  • a mathematical control and evaluation device for example a computer which carries out the signal analysis and the control of the actuator (z-drive, x-y-table, filter, etc.). Evaluation and control can be implemented by firmware and / or software technology. This control and evaluation takes over all the flow control described here.
  • z. B electrically switchable light modulators (eg., LCD, DMD) and static light modulators (transmission or phase grating) can be used.
  • the projected modulation object may be slidable with tiltable plan plates or other devices on the sample side. Replacement of the grids may also be possible to vary the lattice constant or structure.
  • a planar lattice structure which has a plurality of different lattice periods, for example 2 to 10 lattice gratings arranged next to one another with different lattice frequencies. this shows
  • the light modulator can also be linear or cell-shaped and does not necessarily have to be two-dimensional.
  • the autofocus method according to the invention preferably works with two-dimensional (two-dimensional) cameras, with several grid lines for each application, the most suitable grating can be selected by reading the corresponding camera lines, without having to make mechanical changes (replacement of the grid).
  • light modulators 12 perpendicular to the optical axis are easier to implement as transmission modulators, while inclined light modulators 12 are easier to implement than reflection modulators. If very small objects are to be detected by the tracking system, it may happen that a sufficiently high-frequency illumination modulation is no longer possible. In this case it is also possible to illuminate in a spatially unmodulated manner and to evaluate only the intensity of the scattered or reflected signals.
  • CMOS and all other types of digital cameras are also suitable as spatially resolving detectors.
  • the autofocus device is intended to focus automatically on a particular region of the specimen or to hold it in the focal plane of the objective.
  • an offset typically 0 ... 1000 ⁇ m
  • This offset is varied in steps, it is also possible to take so-called z-stacks of images, each image having a defined and controlled distance to the interface.
  • the operation of the microscope with the autofocus device according to the invention can proceed in such a way that the image of the sample is first made visible, either visually or by means of a known software autofocus system. Subsequently, the autofocus device of the type described is activated and ensures that the distance between the sample plane of interest z. B. a glass / liquid interface and the set focal plane of the microscope objective 4 remains constant.
  • the drive 27 is driven so that the contrast maximum always dwells on the same location of the camera 16. This functionality realizes a so-called holding focus, which ensures a constant focal position even with unavoidable drifting.
  • the camera 16 can be asymmetrical with respect to the respective optical axis (eg optical axis oa2 in FIG.
  • the contrast maximum may be close to an edge of the capture area from the beginning, if one
  • the resolution in the z plane is 5 nm to 5 ⁇ m, depending on the object size of the numerical aperture.
  • the z-resolution is thus always at least 5 times better than the depth of field of the microscope objective 4 used.

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Description

Autofokuseinrichtunq für die Mikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop mit einem eine Probe entlang eines Mikroskopstrahlenganges abbildenden Objektiv und einer Autofokuseinrichtung, welche über einen Strahlteiler in den Mikroskopstrahlengang eingespiegelt ist.
Um mittels einer Abbildungsoptik präzise Abbildungen einer Probe bzw. eines Probenschnitts zu erhalten, ist es erforderlich, die Probe exakt in die Fokusposition des Objektivs zu stellen. Ist die Abbildung unscharf, ist es wichtig zu erfahren, um welchen Betrag und in welcher Richtung eine Lageveränderung der Probe relativ zur Abbildungsoptik bzw. zum Objektiv zu veranlassen ist und gegebenenfalls entsprechende Stellbefehle abzuleiten, die zu einer Nachfokussierung genutzt werden können. In diesem Zusammenhang sind im wesentlichen Triangulationsverfahren, abbildende Verfahren mit Kontrastauswertung und die Positionsbestimmung mittels schräg gestellter konfokaler Spaltblende bekannt. Bei Triangulationsverfahren wird ein kollimierter Laserstrahl in die Pupillenebene eines Objektives eingespiegelt und aus dem Verlauf dieses Laserstrahls relativ zum Abbildungsstrahlengang auf die z-Position des von der Probe reflektierten Laserlichts geschlossen. Bei der Abbildung des Laserlichts in unterschiedlich tief gelegene Ebenen der Probe treten jedoch Bildfehler auf, so daß die Autofokusgüte über einen gegebenen Tiefenschärfebereich stark variiert. Auch sind Schwankungen dahingehend festzustellen, ob das Meßergebnis vom Zentrum oder am Rand der Probe bzw. des verwendeten Detektors ermittelt wird. Üblicherweise wird ein Triangulationsverfahren deshalb iterativ ausgeführt, was verhältnismäßig zeitraubend ist.
Bei abbildenden Verfahren mit Kontrastauswertung wird die Probe mit einer bestimmten Intensitätsverteilung beleuchtet, meist indem in eine Feldblendenebene eines Beleuchtungsstrahlengangs ein Gitter gestellt wird. Man nimmt eine Serie von Bildern mit unterschiedlichen Abständen zwischen Abbildungsoptik und Probe auf und ermittelt in dieser Serie das Bild mit dem höchsten Kontrast, dem dann der optimale Fokusabstand zugeordnet ist. Nachteilig hieran ist, daß zur Aufnahme der Bildserie verschiedene z-Positionen mit hoher Genauigkeit angefahren werden müssen, was wiederum zeitraubend ist. Beispiele für eine Autofokuseinrichtung mittels Kontrastanalyse eines auf eine Probe projizierten Musters finden sich in der US 5604344 oder der US 6545756.
Bei der Positionsbestimmung mittels schräg gestellter konfokaler Spaltblende wird in eine Feldblendenebene des Beleuchtungsstrahlengangs eine Spaltblende gestellt und auf die Probe abgebildet. Das von der Probe reflektierte Licht wird auf eine relativ zur Spaltblende geneigt angeordnete CCD-Zeile gerichtet und es wird die Position auf der CCD-Zeile bestimmt, an dem das reflektierte Licht ein Maximum hat. Dieses Verfahren ist sehr schnell, hat allerdings Probleme mit Verunreinigungen auf der Probe oder Probenoberfläche, die zu Intensitätsschwankungen führen können. Auch ist ein sehr großer Justieraufwand bei der Abbildung des Spaltes auf die CCD-Zeile aufzubringen, denn der Spalt muß, um eine hohe Genauigkeit erreichen zu können, sehr schmal sein. Eine Verbesserung der Positionsbestimmung mittels schräggestellter konfokaler Spaltblende ist in der DE 10319182 A1 geschildert.
Allen Verfahren ist gemein, daß sie die Fokusebene zwar sehr genau finden können, jedoch die Lage dieser Fokusebene innerhalb der Probe, insbesondere bezüglich weiterer Grenzflächen, nur eingeschränkt zu ermitteln erlauben.
Oftmals möchte man jedoch nicht nur die Meßebene exakt finden, sondern auch deren Lage, d. h. deren Abstand zu einer Referenzebene ermitteln. Ein Bezug auf eine als Referenzebene dienende Grenzfläche kann dabei im Stand der Technik entweder dadurch erfolgen, daß eine zweite Autofokuseinrichtung verwendet wird, die auf die Grenzfläche fokussiert wird. Das erhöht natürlich den optischen Aufwand, und meist muß man einen Bereich der Detektions- bzw. Beleuchtungsapertur für diesen zusätzlichen Autofokus reservieren. Mehrere Autofokusstrahlengänge zu verwenden, ist beispielsweise in der WO 00/43820 beschrieben. Zum anderen ist es im Stand der Technik bekannt, für kurze Zeit die Messung zu unterbrechen und durch eine Fokusverstellung die Autofokuseinrichtung auf die gewünschte Referenzebene einzustellen. Der Betrag der Fokusverstellung stellt dann ein Maß für den Abstand der Meßebene zur Referenzebene dar. Nachteilig ist dabei, daß die eigentliche mikroskopische Messung für die Bestimmung des Abstandes zur Referenzebene unterbrochen werden muß.
Die gleiche Problemstellung ergibt sich, wenn in einer Probe ein Objekt, das an unterschiedlichen z-Positionen liegen kann, gefunden oder verfolgt werden soll. Ein solches Objekt kann z. B. eine in einer Probe befindliche Zelle sein, die sich in der Probe (z. B. in einer flüssigen Lösung) bewegt. Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop mit einer Autofokusvorrichtung anzugeben, mit der nicht nur die Lage der Meßebene exakt bestimmt werden kann, sondern zugleich auch der Abstand zu einer Referenzebene erfaßbar oder ein Objektracking oder -finder möglich ist. Insbesondere sollte eine separate Autofokusvorrichtung, die nur zur Bestimmung der Referenzebene vorgesehen ist, und/oder ein wiederholtes Verstellen der Fokuslage in z-Richtung vermieden werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop mit einem Objektiv, das eine in einem Probenvolumen liegende Fokusebene hat, und mit einer Autofokuseinrichtung, die aufweist: einen Lichtmodulator zur Erzeugung eines leuchtenden, intensitätsmodulierten Modulationsobjektes, eine Autofokus-Beleuchtungsoptik, die das leuchtende Modulationsobjekt in die Fokusebene des Objektives oder diese schneidend abbildet, so daß im Probevolumen ein Bild des Modulationsobjektes entsteht, wobei die Abbildung des Modulationsobjektes über einen Strahlteiler erfolgt, der den Strahlengang der Autofokus-Beleuchtungsoptik in den Mikroskopstrahlengang einspiegelt, eine Kamera zur Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes, die eine Kamera-Bildebene aufweist, und eine Autofokus-Abbildungsoptik, die das im Probevolumen liegende Bild des Modulationsobjektes in eine Autofokus-Bildebene abbildet, wobei die Kamera-Bildebene die Autofokus-Bildebene schneidet, wenn das Bild des Modulationsobjektes in der Fokusebene liegt, und in der Autofokus-Bildebene liegt, wenn das Bild des Modulationsobjektes die Fokusebene schneidet.
Die Erfindung sieht also ein Mikroskop vor, mit einem eine Probe entlang eines Mikroskopstrahlenganges abbildenden Objektiv und einer Autofokuseinrichtung, die einen Autofokusstrahlengang, welcher über einen Strahlteiler in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelt ist und der aufweist: einen Lichtmodulator zur Erzeugung eines leuchtenden zweidimensionalen, intensitätsmodulierten Modulationsobjektes das im Autofokusstrahlengang in einer zur Fokusebene des Objektives konjugierten Ebene liegt oder diese schneidet und in die Fokusebene des Objektives abgebildet ist, und - eine Kamera zur Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes, auf die der Autofokusstrahlengang das in der Probe liegende Bild des Modulationsobjektes abbildet, wobei die Bildebene der Kamera eine zum Modulationsobjekt konjugierte Ebene schneidet oder in dieser Ebene liegt und die Kamera den Kontrast des in der Probe (liegenden Bildes des Modulationsobjekt erfaßt, - wobei das Modulationsobjekt und/oder die Bildebene der Kamera schräg zur optischen Achse des Autofokusstrahlenganges liegen/liegt. Die Erfindung sieht vor, daß ein vorzugsweise zweidimensionales Modulationsobjekt, z. B. durch Beleuchtung eines entsprechenden Lichtmodulators (Gitter, LCD oder DMD), erzeugt und in den Mikroskopstrahlengang, z. B. den Beleuchtungsstrahlengang, eingespiegelt wird, um eine strukturierte Autofokus-Beleuchtung der Probe zu erreichen. Die strukturierte Beleuchtung erfolgt dabei über eine separate Lichtquelle, die von der Beleuchtungsquelle unabhängig ist, vorzugsweise über LED. Natürlich sind beliebige Weißlicht- oder farbige Beleuchtungsquellen möglich. Vorzugsweise strahlt das zweidimensionale Beleuchtungsobjekt in einem Spektralbereich, der bei der Probenabbildung nicht benötigt wird. Zusätzlich wird an einer Stelle eine zweidimensionale Kamera (z. B. CCD oder CMOS) in den Strahlengang eingefügt. Verschiedene Orte sind hier möglich. Entweder die Kamera oder das Modulationsobjekt liegt schräg zur optischen Achse. Auch beide können schräg zur optischen Achse liegen. Dadurch kann eine Dimension der Kamera einem gewissen Tiefenbereich und somit verschiedenen Fokusebenen zugeordnet werden. Über die Wahl der Schräglage kann der erfaßte Tiefenbereich eingestellt werden. Ziel ist es, die Lage einer rückstreuenden oder reflektierenden (d.h. spiegelnden) Grenzfläche an, in oder bei der Probe und/oder die Lage einer Probe mit Eigenkontrast zu bestimmen.
Das Modulationsobjekt moduliert räumlich und kann bei Verwendung eines verstellbaren Lichtmodulators auch zusätzlich zeitlich modulieren. Eine zeitliche Modulation ist eine Alternative zu einer spektralen Trennung, um die Beleuchtung durch das Modulationsobjekt von der übrigen Mikroskopbeleuchtung zu unterscheiden. Hierbei ist vorzugsweise die Erfassung der Autofokusabbildung zur zeitlichen Modulation synchronisiert, z. B. kann eine Lock-In- Technik zum Einsatz kommen. Um die Probenabbildung möglichst nicht zu stören, erfolgt vorzugsweise die zeitliche Modulation mit so hoher Frequenz, daß sie bei visueller Beobachtung im Mikroskop, z. B. durch ein Mikroskopokular nicht wahrnehmbar ist. Ein möglicher Frequenzbereich liegt oberhalb der Bildverschmelzungsfrequenz des Auges, die im helladaptierten Zustand etwa 50 Hz beträgt, beispielsweise zwischen 50 und 200 Hz ist ein möglicher Bereich.
Die Ein- und Auskopplung der strukturierten Beleuchtung sowie der Abbildung der strukturiert beleuchteten Probe auf die Kamera kann vorteilhafterweise mit Teilerspiegeln erfolgen, die nur einen geringen Einfluß auf den übrigen Mikroskopstrahlengang haben, z. B. durch einen hohen Transmissionsgrad (ca. 95 % und höher sind möglich). Besonders bevorzugt ist eine dichroitische Trennung in Kombination mit spektral separierter Autofokusstrahlung. Weiter ist es günstig, die/den Teiler einseitig zu entspiegeln, um den übrigen Mikroskopstrahlengang möglichst gering zu beeinflussen. Natürlich kann bei Bedarf der Reflexionsgrad aber auch auf Kosten des Transmissionsgrades erhöht werden. Arbeitet das Autofokussystem z. B. mit einer infraroten (NIR)-Beleuchtungsquelle, so ist vorzugsweise der dichroitischer Strahlteiler natürlich so ausgebildet, daß er die Autofokus-Strahlung mit hoher Effizienz im Autofokus-Strahlengang führt oder aus-/und einkoppelt.
Vorteilhaft erfolgt durch die Abbildung des Modulationsobjekts eine periodische Beleuchtung, z.B. Streifenbeleuchtung, bei der das Modulationsobjekt dann ein Streifenmuster ist. Auf der
Kamera erscheint dann ein entsprechendes periodisches Muster, z.B. ein Streifenmuster, dessen Kontrast in der zur aktuellen Fokusebene konjugierten Ebene maximal ist. Hierdurch läßt sich ein sehr zuverlässiges und genaues Autofokussystem für Grenzflächen an der Probe
(z. B. Glas/Wasser, Glas/Luft oder Wasser/Luft) realisieren. Bei einem zweidimensionalen Lichtmodulator kann mittels einer zweite Dimension der Kamera redundante Informationen erhalten werden, wodurch vorzugsweise über Mittelung mehrerer Zeilensignale ein sehr robustes Autofokussignal entsteht.
Um möglichst geringe Einflüsse durch die Abbildung des Modulationsobjektes in die Probe zu erzeugen, ist bevorzugt die Struktur eines räumlich modulierten Modulationsobjektes in schneller Folge (z. B. mit größer als 30 Hz) alternierend lateral verschoben. Eine weitere
Möglichkeit, die ebenfalls bei einem verstellbaren Lichtmodulator gegeben ist, besteht darin, immer oder zeitweise (z. B. nach Auffinden eines zu mikroskopierenden Objektes) nur noch bestimmte Teil-Bereiche des vom Objektiv erfaßten Objektfeldes/Probenvolumens auszuleuchten. Hierdurch kann der Bildkontrast für den Autofokus bzw. die
Meßobjektnachführung, gegebenenfalls aber auch für die normale Mikroskopdetektion erhöht werden.
Wesentlich für die Erfindung ist, daß entweder das Modulationsobjekt schräg zur Fokusebene des Objektives oder die Kamera-Bildebene schräg zur Bildebene der Autofokus- Abbildungsoptik steht. Es können auch beide entsprechend schräg stehen. Die Schrägstellung kann dadurch erreicht werden, daß das Modulationsobjekt bzw. die Kamera schräg zur optischen Achse steht. Es kann also das Modulationsobjekt schräg zur optischen Achse und die Bildebene der Kamera senkrecht zur optischen Achse stehen, es kann das Modulationsobjekt senkrecht zur optischen Achse und die Bildebene der Kamera schräg zur optischen Achse stehen, oder es ist eine gegenseitige Schrägstellung von Modulationsobjekt und Bildebene möglich, wobei diese dann bezogen auf die optische Achse gegensinnig schräg gestellt sein müssen.
Durch Verwendung mehrerer Kameras ist auch ein dreidimensionales Bildobjektnachführungs- bzw. Autofokus-System möglich. Dann kann zusätzlich eine zweite Kamera senkrecht zur optischen Achse stehen, und eine dritte ist um eine Kippachse gedreht, die nicht mit der Kippachse der ersten Kamera zusammenfällt. Die strukturierte Autofokus-Beleuchtung kann natürlich im Durchlicht und/oder in Dunkelfeldbeleuchtung realisiert werden. Im Durchlichtbetrieb wäre die Anwendung dann allerdings auf transparente Probenträger eingeschränkt.
Bei allen Varianten des Mikroskops ist es vorzuziehen, eine rechnerische Auswertevorrichtung zu verwenden, die die Signalauswertung der Kamera(s) vornimmt, einen gegebenenfalls verstellbaren Lichtmodulator ansteuert und die Steuerung von gegebenenfalls vorhandenen mechanischen Stelleinheiten am Mikroskop (z. B. zur Fokusverstellung, zu x-y-Verstellung, zum Einschwenken und/oder Einschalten von Filtern etc.) vornimmt. Auswertung und Steuerung können sowohl schaltungs- als auch softwaretechnisch implementiert werden. Das Autofokussystem der Erfindung wird im Betrieb natürlich von einem Steuergerät gesteuert, das die rechnerische Auswertevorrichtung umfaßt und hier erläuterten Maßnahmen einleitet, um die beschriebene Vorgehensweise zu realisieren. Bei dem Steuergerät kann es sich um ein ohnehin im Mikroskop vorgesehenes Steuergerät handeln.
Für stark lichtstreuende Oberflächen ist eine Weiterbildung der Erfindung möglich, die das von der Probe reflektierte bzw. gestreute Licht analysiert. Hier ist es vorgesehen, daß sowohl Kamera als auch Modulationsobjekt gegenüber der optischen Achse verkippt sind. Beide liegen in zueinander konjugierten Ebenen. Der Kippwinkel ist vorzugsweise gleich. Es wird von der Probe gestreutes oder reflektiertes Licht moduliert auf die Kamera abgebildet. Die Stärke der Modulation liefert Strukturinformationen über die Probe und kann für Autofokus und/oder Bildobjektnachführungszwecke verwendet werden. Aufgrund der Schrägstellung von Modulationsobjekt und Kamera erhält man simultan Strukturinformation aus verschiedenen Tiefen (z-Positionen der Fokusebene des Objektives) der Probe.
In ungünstigen Fällen kann die Lichtmodulation, die auf der Kamera nachgewiesen wird, d. h. das Bild des in die Probe abgebildeten Objektes, durch Speckle-Effekte beeinträchtigt werden. Für derartige Zwecke kann es vorteilhaftig sein, die Probe oder das Modultionsobjekt und/oder ggf. die diese beleuchtende Lichtquelle gleichförmig oder periodisch zu bewegen, um Speckle- Muster herauszumitteln. Alternativ ist auch ein synchrones Bewegen von Modulationsobjekt und Kamera möglich.
Prinzipiell können weitere Kameras eingespiegelt werden, die Strukturinformationen von der Probe ableiten. Diese Kameras sind dann so angeordnet, daß auf Ihnen unterschiedliche Schnittebenen der Probe abgebildet werden, d. h. die Kameras sind mit unterschiedlichen Kippwinkeln zur optischen Achse bzw. unterschiedlichen Drehwinkeln um die optische Achse angeordnet. Zur Erhöhung des Autofokus-Fangbereiches in z-Richtung kann zusätzlich noch eine Kamera in einer zum Lichtmodulator nicht-konjugierten Ebene angebracht sein. Durch den entsprechenden Verkippwinkel läßt sich der Fangbereich einstellen. Das Schrägstellen einer nicht-konjugiert angeordneten Kamera ist äquivalent zu einem geänderten Winkel, den das Modulationsobjekt mit der optischen Achse einschließt. Da dieser Winkel jedoch aus praktischen Gründen wegen sphärischen Bildfehlern und Reflexionsverlusten kaum kleiner als 30° gewählt werden kann, ergibt sich durch eine solche weitere Kamera die Möglichkeit den Fangbereich der Autofokuseinrichtung zu erhöhen.
Das Mikroskop kann insbesondere als inverses Mikroskop ausgebildet sein, wie es z. B. zum Auslesen von Titerplatten verwendet wird, die nach oben geöffnete Küvetten mit Flüssigkeiten besitzen. Zu Fokussieren ist hier regelmäßig auf die Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche des Titerplattenbodens, an der meist Zellen haften. Da solche Zellen den Kontrast des abgebildeten Modulationsobjektes beeinträchtigen, wird vorzugsweise über mehrere Zeilen der zweidimensionalen Kamera gemittelt, um die Meßgenauigkeit zu verbessern.
Zwischen Objektiv und Titerplattenboden kann Luft oder eine Immersionsflüssigkeit angeordnet werden. Ohne Immersionsflüssigkeit erzeugt die Luft/Glas-Grenzfläche am Titerplattenboden den höchsten Kontrast. Mit Immersionsflüssigkeit erhält man den stärksten Kontrast von der Grenzfläche zwischen Küvettenflüssigkeit und Titerplattenboden-Oberseite.
Eine besonders gute Anpassung an verschiedene Proben ist gegeben, wenn der Lichtmodulator ansteuerbar und zur Erzeugung eines räumlich oder zeitlich intensitätsmodulierten Modulationsobjektes ausgebildet ist. Diese Ansteuerbarkeit kann dadurch erreicht werden, daß als Lichtmodulator ein beleuchtetes LCD- oder DMD-Element verwendet wird. Die dabei eingesetzte Wellenlänge unterscheidet sich vorzugsweise von der normalen Beleuchtungsstrahlung im Mikroskop. Prinzipiell kann die Autofokuseinrichtung hinsichtlich des Lichtmodulators und/oder der Kamera in den Beleuchtungsstrahlengang eines Auflicht-Mikroskopes eingekoppelt werden. Alternativ ist eine Einstrahlung parallel zum Auflichtbeleuchtungsstrahlengang in den Mikroskopstrahlengang möglich, d. h. im Mikroskopstrahlengang befindet sich ein eigener Strahlteiler für den Autofokusstrahlengang. Dann kann Strahlung verwendet werden, die bezüglich Ihrer Wellenlänge oberhalb der für die Mikroskopiervorgänge verwendeten Wellenlängen liegt, da nicht auf die möglicherweise dichroitischen Eigenschaften des Beleuchtungs-Strahlenteilers im Mikroskop Rücksicht genommen werden muß - die Autofokuseinrichtung ist über einen eigenen Strahlenteiler eingebunden. Bei der Fluoreszenzmikroskopie sind für die Autofokus-Beleuchtung Wellenlängen oberhalb 800 nm bevorzugt, da dann für Fluoreszenz- oder Durchlichtmessungen keine nennenswerten Einschränkungen zu befürchten sind. Durch einen geeigneten Spektralfilter vor der Kamera der Autofokuseinrichtung kann potentiell störende Strahlung der Mikroskopbeleuchtung effektiv unterdrückt und bei der Autofokuseinrichtung ausgeblendet werden. Für die simultane Anwendung des Autofokus bei 2-Photonen-Mikroskopie wird der Strahlteiler so ausgelegt, daß er nur einen schmalen Wellenlängenbereich, z.B. 20 nm, der sich nicht mit der 2-Photonen-Anregungsstrahlung überschneidet, reflektiert. Grundsätzlich kann jedoch auch der gesamte sichtbare Bereich und UV für die Autofokusfunktion verwendet werden.
Eine besonders einfache Analyse des in die Probe abgebildeten Modulationsobjektes erhält man, wenn das abgebildete Modulationsobjekt eine periodische Struktur, z. B. eine Streifengitterstruktur aufweist. Der Lichtmodulator ist also entsprechend ausgebildet.
Zweckmäßigerweise wird man die Autofokuseinrichtung in den Strahlengang des Mikroskops über einen Strahlteiler einspiegeln, wobei zugleich die Abbildung des Modulationsobjektes, wie auch die Rück-Abbildung des abgebildeten Modulationsobjektes auf die Kamera über denselben Strahlteiler eingekoppelt ist. Der Aufbau ist dann besonders einfach an ein bestehendes Mikroskop anzupassen. Dies ist jedoch nicht zwingend.
Der Winkel der Schrägstellung von Bildebene der Kamera bzw. Modulationsobjekt zur optischen Achse stellt den Fangbereich bzw. Tiefenbereich ein, in dem die Autofokuseinrichtung arbeitet. Ein Winkel zwischen 20° und 70° ist zweckmäßig. Wie bereits erwähnt, kann man mehrere Kameras verwenden, deren Bildebenen zueinander, insbesondere unterschiedlich, geneigt sind.
Wie bereits erwähnt, gibt es verschiedene Mittel, um das Bild des Modulationsobjektes von der Probenabbildungsstrahlung zu trennen, bzw. unterscheidbar zu machen. Ein erster Ansatz ist eine spektrale Trennung. Das Bild des Modulationsobjektes liegt dann in einem Spektralbereich, der bei der Probenabbildung nicht verwendet oder benötigt wird. Die Abbildung des Modulationsobjektes in die Probe sowie die Abbildung dieses Bildes bzw. der in der Probe erzeugten Reflexe auf die Kamera erfolgt dann über geeignete dichroitische Strahlteiler bzw. einen zentralen dichroitischen Strahlteiler. Ein weiteres mögliches Mittel stellt eine zeitliche Modulation des Lichtmodulators dar, in Kombination mit geeigneter synchronisierter Erfassung des Bildes des Modulationsobjektes. Bei diesem Ansatz können Autofokusstrahlung und normale Probenabbildungsstrahlung im selben Spektralbereich liegen. Um Einflüsse der Autofokuseinrichtung auf die normale Probenabbildung zu vermeiden ist es vorteilhaft, in diesem Fall eine Variation der räumlichen Modulation vorzusehen, so daß beispielsweise ein in die Probe abgebildetes Streifengitter über die Zeit gemittelt nicht in der Probe sichtbar ist, soweit man nicht synchronisiert zu zeitlichen Veränderung erfaßt, wie es bei der Kamera des Autofokusstrahlengangs dann der Fall ist.
Arbeitet man mit einer spektralen Separierung von Autofokusstrahlung und Probenabbildungsstrahlung ist es natürlich vorteilhaft, die Spektralbereiche der
Probenabbildungsstrahlung im Autofokusstrahlengang möglichst zu unterdrücken. Etwaige
Anteile, die also z. B. einen dichroitischen Strahlteiler passieren und damit noch in den
Autofokusstrahlengang gelangen, werden dann vorzugsweise durch geeignete Filter unterdrückt werden. Eine besonders gute Filterung ist möglich, wenn das in der Probe liegende Bild des Modulationsobjektes unter Einschaltung einer Zwischenabbildung auf die Kamera abgebildet wird. Dann besteht ausreichend Bauraum, um Sperrfilter einzusetzen.
Eine weitere Unterdrückung von störender Strahlung erreicht man, wenn man an dem Strahlteiler, der im Autofokusstrahlengang die Beleuchtung, d. h. die Abbildung des Modulationsobjektes in die Probe, von der Detektion d. h. die Abbildung des in der Probe liegenden Bildes auf die Kamera trennt, eine Strahlungsfalle vorsieht, die an diesem Strahlteiler transmittierte Strahlung die nicht weiter verwertet wird, absorbiert.
Die Verwendung einer Zwischenabbildung hat weiter den erheblichen Vorteil, das zwischen dem Strahlteiler, der Autofokusbeleuchtung und Autofokusdetektion trennt, ein großer Abstand zu detektierenden Kamera besteht. Unvermeidbares Streulicht vom Strahlteiler gelangt so nur noch über Mehrfachreflexionen, d. h. stark abgeschwächt, zur Kamera. Durch die Verwendung einer Zwischenabbildung werden darüber hinaus noch Reflexe von Optiken die zwischen dem
Strahlteiler und der Kamera liegen, unterdrückt.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugsnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert.
Es versteht sich, das die vorstehend genannten sowie auch die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Reflexionsmessungen, Fig. 2 ein Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Fluoreszenzmessungen,
Fig. 3 ein Mikroskop ähnlich dem der Fig. 1 , adaptiert für streuende Proben,
Fig. 4 ein Mikroskop ähnlich dem der Fig. 1 mit einem erhöhten Fangbereich,
Fig. 5 ein inverses Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung mit Einspiegelung der
Beleuchtung zwischen Objektiv und Filterwürfel und
Fig. 6 ein inverses Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung mit Einspiegelung im
Mikroskopbeleuchtungsstrahlengang.
Fig. 7 ein Mikroskop ähnlich dem der Fig. 6, mit einer Autofokuseinrichtung, welche einer Kamera eine Zwischenabbildungsoptik vorgeordnet ist,
Fig. 8 eine Draufsicht auf einen exemplarischen Lichtmodulator, und
Fig. 9 bis 11 Kontrastsignale, die von einer Kamera der Autofokuseinrichtung abgegeben werden.
Fig. 1 zeigt ein Mikroskop 1 , mit dem eine Probe 2, die sich auf einem Probenträger 3 befindet mittels eines Objektivs 4 auf einen Detektor 5 abgebildet wird. Die Darstellung in Fig. 1 ist dabei stark vereinfacht. Bei dem Mikroskop 1 kann es sich um ein Weitfeldmikroskop handeln, d. h. der Detektor 5 ist z.B. eine Kamera oder ein Okulareinblick. Aber auch jede andere Mikroskopbauweise kommt für das Mikroskop 1 in Frage, beispielsweise ein Laser-Scanning- Mikroskop. Dann ist dem Mikroskopstrahlengang noch eine Scananordnung vorgesehen, die auf der optischen Achse OA1 liegt. Das Objektiv 4 ist in seiner Fokuslage verstellbar, wie der Doppelpfeil andeutet. Alternativ kann auch der Probenträger 3 verstellbar sein.
An einem Strahlteiler 6, der gegebenenfalls als Dichroit oder als plattenförmiger Farbteiler ausgebildet sein kann, ist Mikroskop-Beleuchtungsstrahlung aus einer Mikroskop- Beleuchtungsquelle 8 eingekoppelt, die über eine Beleuchtungs-Tubusoptik 7 die Probe 2 durch das Objektiv 4 beleuchtet. In diesen Beleuchtungsstrahlengang ist mittels eines Strahlteilers 11 eine Autofokuseinrichtung eingekoppelt. Die Autofokuseinrichtung verfügt über einen Lichtmodulator 12, der von einer Lichtquelle 13, beispielsweise eine LED, für Transmissionsbetrieb oder von einer Lichtquelle 14 (z.B. eine LED) für Reflexionsbetrieb beleuchtet ist. Der beleuchtete Lichtmodulator 12 generiert ein Modulationsobjekt. Dieses wird über den Strahlteiler 11 , die Beleuchtungs-Tubusoptik 7, den Strahlteiler 6 sowie das Objektiv 4 in die Probe 2 projiziert, also abgebildet. Dadurch ist eine Autofokus-Beleuchtung realisiert. Das in der Probe 2 erzeugte Bild des Modulationsobjektes wird im gegenläufigen Weg mittels einer Kamera 16 erfaßt, der ein weiterer Strahlteiler 15 auf der optischen Achse OA2 der Autofokuseinrichtung vorgelagert ist. Die dabei erhaltene optische Achse OA3 ist optional weiter noch über einen Strahlteiler 17 auf eine Kamera 18 geleitet.
Der Strahlteiler 11 ist in einer erfindungsgemäßen Bauweise dichroitisch ausgebildet und die Lichtquelle 13 bzw. 14 strahlt bei einer Wellenlänge, die von der Mikroskop - Beleuchtungsquelle 8 nicht wesentlich abgegeben oder für die Probenabbildung nicht benötigt wird. Die Autofokuseinrichtung arbeitet somit in einem Spektralbereich der für die Abbildung der Probe 2 ansonsten nicht verwendet ist.
Von den Kameras sind in den Figuren generell nur die Bildebenen gezeichnet. Die Kameras können generell CCD-Kameras sein.
In der Bauweise der Fig. 1 liegt der Lichtmodulator 12 und damit das Modulationsobjekt senkrecht zur optischen Achse OA2. Die Kamera 16 steht mit ihrer Bildebene dagegen schräg zur optischen Achse O A3. Nimmt der Lichtmodulator 12 beispielsweise eine räumliche Modulation vor, z. B. ein Streifenmuster, findet sich der maximale Kontrast in einer senkrecht zur Zeichenebene liegenden Zeile der Kamera 16. Die Lage der Zeile längs der Kamera 16 ist ein Maß für die Lage der Fokusebene längs der optischen Achse, d. h. in z-Richtung.
Mit Hilfe der Beleuchtungstubusoptik 7 und des Objektivs 4 wird das Modulationsobjekt, das vom Lichtmodulator 12 entweder in Transmissionsbetrieb (Lichtquelle 13) oder im Reflexionsbetrieb (Lichtquelle 14) erzeugt wird, in die Probe abgebildet. Durch die schräggestellte Kamera 16 erfolgt eine Tiefenauflösung. Mittels der Kamera 18 kann zusätzlich eine laterale Verschiebung der strukturiert beleuchteten Probe detektiert werden.
Im Falle eines Fluoreszenzmikroskops werden ein Anregungsfilter 10 sowie ein Emissionsfilter 9 (für die Fluoreszenzstrahlung) verwendet. Das Mikroskop 1 kann ohne weitere Einschränkung hinsichtlich der Autofokuseinrichtung auch als scannendes Mikroskop, insbesondere als Laser- Scanning-Mikroskop ausgebildet sein.
Fig. 2 zeigt eine alternative Gestaltung des Mikroskops der Fig. 1 hinsichtlich der Autofokuseinrichtung. Im Mikroskop der Fig. 2 sind Bauteile, die bereits anhand Fig. 1 erläutert wurden, mit denselben Bezugszeichen versehen; auf ihre wiederholte Beschreibung wird deshalb verzichtet. Die Kamera 16 detektiert hier den Fluoreszenzkontrast der Probe, welcher durch die strukturierte Autofokus-Beleuchtung noch verstärkt werden kann. Die Abbildung des Modulationsobjektes erfolgt ähnlich wie bei der Bauweise gemäß Fig. 1. Die Erfassung des in die Probe 2 abgebildeten Modulationsbildes geschieht jedoch nicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang heraus, sondern über einen eigenständigen Strahlteiler aus dem Mikroskopstrahlengang. Dieser ist an die Wellenlänge der Autofokus-Beleuchtung angepaßt und z. B. im gleichen Maße dichroitisch, wie der Strahlteiler 11. Um das in die Probe abgebildete Modulationsobjekt bzw. dadurch erzeugte Reflexe oder Rückstreuungen mittels der Kamera 16 erfassen zu können, ist dieser Kamera eine entsprechende Relaisoptik 20 vorgeordnet, deren optische Charakteristik dafür sorgt, daß die Bildebene der Kamera 16 eine konjugierte Ebene zum Modulationsobjekt schneidet, idealerweise nahe oder auf der optischen Achse (wie bei Fig. 1 auch).
Die von der Fokuseinrichtung, insbesondere der Kamera 16 gelieferten Signale werden zur Ansteuerung einer Fokusverstellung längs der z-Achse verwertet. Dies ist in Fig. 1 schematisch durch einen Doppelpfeil veranschaulicht. Das dabei eingesetzte Steuergerät ist in den Fig. 1 und 2 nicht gezeigt.
Ist das Mikroskop 1 in Fig. 2 als Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet, wird wiederum die Kombination aus Emissionsfilter 9 und Anregungsfilter 10 vorgesehen, wie auch optional ein weiterer Spektralfilter 21 , der dafür sorgt, daß auf die Kamera 16 der Spektralbereich des leuchtenden Modulationsobjektes fällt und nicht weiter interessierende Spektralbereiche ausgeblendet sind insbesondere die Spektralbereiche der Probenabbildung.
Fig. 3 zeigt eine Ausbildung des Mikroskops 1 für stark streuende und wenig reflektierende Proben. Elemente, die bereits anhand der Figuren 1 oder 2 erläutert wurden, werden nicht weiter beschrieben. Sie sind in der Figur mit den gleichen Bezugszeichen versehen.
Für stark lichtstreuende Oberflächen, wie z. B. Gewebeschnitte ist die Autofokuseinrichtung gemäß Fig. 3 abgewandelt. Es handelt sich um eine Einrichtung, die vorwiegend das von der Probe gestreute Licht analysiert.
Bei dieser Anordnung schließt der zweidimensionale Lichtmodulator 12 mit der optischen Achse OA2 einen Winkel zwischen 0° und 90°, bevorzugt zwischen 20° und 70° ein. Der Lichtmodulator 12 entspricht wieder der bereits geschilderten Bauweise, d. h. es kann sich um ein Transmissions-LCD, ein Reflexions-LCD, ein DMD oder ein Amplitudengitter mit Verschiebevorrichtung handeln. Die Struktur besteht vorzugsweise wiederum aus Hell-Dunkel- Streifen. Die Beleuchtung des Lichtmodulators 12 erfolgt vorzugsweise durch eine oder mehrere leistungsstarke LED. Auch dies war bei den Fig. 1 und 2 möglich. Bei einem Transmissionsmodulator ist dabei die Lichtquelle 13 vorgesehen, bei einem Reflexionsmodulator die Lichtquelle 14. Übliche optische Vorrichtungen zur Lichthomogenisierungen und Optiken zu Zwischenabbildungen können zur Erzeugung des Modulationsobjektes mit dem Lichtmodulator 12 verwendet werden und sind aus Gründen der Übersicht in der Fig. 3 (wie auch in den Fig. 1 und 2) nicht dargestellt.
Mit Hilfe der Beleuchtungstubusoptik 7 und des Objektivs 4 wird das Modulationsobjekt in die Probe 2 abgebildet. Da der Lichtmodulator 12 und damit das Modulationsobjekt nicht senkrecht zur optischen Achse steht, wird das Modulationsobjekt (z. B. alternierende Hell-Dunkel-Streifen) schräg zur optischen Achse und damit in die Tiefe der Probe abgebildet.
Die Bildebene der Kamera 18 liegt in einer zum Lichtmodulator 12 und damit zum Modulationsobjekt konjugierten Ebene. Sie ist also im gleichen Winkel zur optischen Achse (hier die optische Achse OA3) verkippt, wie der Lichtmodulator 12. Hierdurch wird von der Probe gestreutes Licht moduliert auf die Kamera 18 abgebildet. Der Kontrast des Modulationsobjektes erscheint auf Kamera 18 nur dort, wo er von der Probe gestreut wird. Daher ist die Ausführung in Fig. 2 besonders für dünne oder intransparente, streuende Proben geeignet, beispielsweise in der Materialmikroskopie.
Zusätzlich weist die Autofokuseinrichtung für die Autofokusfunktion noch die Kamera 16 auf, deren Bildebene gegenüber dem Lichtmodulator 12 und damit dem Modulationsobjekt schräg steht, da sie senkrecht zur optischen Achse OA3 liegt. Sie ist über einen 50 %-Splitter 17 innerhalb des Autofokusstrahlenganges eingespiegelt.
Fig. 4 zeigt eine weitere Abwandlung des Mikroskops hinsichtlich der Autofokuseinrichtung. Die Anordnung der Fig. 4 unterscheidet sich von der der Fig. 3 dadurch, daß die Kamera 18 nun gegensinnig zum Lichtmodulator verkippt ist. Die Bildebene der Kamera 18 und der Lichtmodulator 12 sind hier derart verkippt, daß sie nicht konjugiert zueinander liegen. Hierdurch kann der Fangbereich vergrößert, typischerweise verdoppelt werden.
Fig. 4 zeigt gestrichelt noch eine Alternative zur Ankopplung der Autofokuseinrichtung an den Strahlengang des Mikroskops 1. Diese Alternative ist prinzipiell für alle Bauweisen der Autofokuseinrichtung möglich und sieht einen eigenständigen dichroitischen Strahlteiler 11' im Mikroskopstrahlengang vor, der die Strahlung des Lichtmodulators 12 einkoppelt und die Darstellung des in die Probe abgebildeten Modulationsobjektes auf die Kamera 16 bzw. 18 leitet. In der Darstellung der Fig. 4 entfällt bei dieser Bauweise dann der Strahlteiler 11. Statt dessen ist optional ein Umlenkspiegel 11" vorgesehen. Auch erfolgt die Einkopplung über den Strahlteiler 11 mittels einer optionalen Optik 20, die eine gegebenenfalls nötige Zwischenabbildung erzeugt und sicherstellt, daß das Modulationsobjekt, d. h. der beleuchtete Lichtmodulator 12, in einer zur Fokusebene des Objektives 4 konjugierten Ebene liegt, mithin das Modulationsobjekt durch das Objektiv 4 in die Probe 2 abgebildet wird. Dieses Konzept wird später anhand Fig. 7 noch in einer Variante geschildert.
Die in Fig. 4 exemplarisch alternativ eingezeichnete Bauweise hat den Vorteil, daß die Autofokuseinrichtung sehr zuverlässig simultan zu allen gängigen Mikroskopiervorgängen arbeiten kann. Insbesondere ist es möglich, für das Modulationsobjekt, d. h. die Beleuchtung des Lichtmodulators 12, Strahlung zu verwenden, die mit ihrer Wellenlänge oberhalb der für die Mikroskopiervorgänge verwendeten Wellenlängen liegt. Bei Fluoreszenz- oder Durchlichtmessungen kann ein Wellenlängenbereich oberhalb von 700 nm, vorzugsweise oberhalb von 800 nm für die Autofokuseinrichtung verwendet werden. Ein zusätzlicher Spektralfilter vor der Kamera bzw. den Kameras kann potentiell störendes Licht der Mikroskopbeleuchtung effektiv unterdrücken.
Die Bauweisen der Fig. 1 bis 4 zeigen die Anordnung der Autofokuseinrichtung bei einem aufrechten Mikroskop 1 mit einem Objektträger als Probenhalter. Zwischen Objektträger und Objektiv kann sich ein Deckglas wie auch eine Immersionsflüssigkeit (z. B. öl, Wasser, Glycerin) befinden. Dies ist aber nicht zwingend erforderlich. Es gibt also zwei zu unterscheidende Anwendungsfälle: Ohne Immersionsflüssigkeit erhält man den höchsten Gitterkontrast von der Luft/Glas-Grenzfläche an der Deckglas- oder Objektträgeroberseite. Mit Immersionsflüssigkeit erhält man den höchsten Gitterkontrast von der Grenzfläche zwischen Deckglas-Unterseite und Einbettmedium. Zur Unterdrückung von Streulicht oder unerwünschten Reflexen können Blenden, z.B. halbkreisförmige Blenden, in den Autofokus-Strahlengang eingebracht werden.
Der Strahlteiler 11 oder 11' kann eine planparallele Glasplatte sein, die auf einer Seite entspiegelt ist, ohne störende Sekundärbilder zu vermeiden. Die der Reflexion des Autofokussignals dienende Seite der Glasplatte kann auch eine dichroitische Beschichtung aufweisen, die die Reflektivität für das langwellige Autofokuslicht erhöht (wenn die Variante mit langwelliger Autofokusbeleuchtung verwendet wird) und das kurzwelligere Nutzlicht der Mikroskopie (z. B. Fluoreszenzstrahlung) überwiegend transmittieren. Natürlich sind auch andere spektrale Aufteilungen möglich.
Fig. 5 zeigt ein inverses Mikroskop 1 mit einer erfindungsgemäßen Autofokuseinrichtung. Solche inversen Mikroskope werden vorwiegend zum Auslesen von Titerplatten verwendet, welche nach oben geöffente Küvetten 22 mit Flüssigkeiten besitzen. Zu Fokussieren ist hier meist auf die der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche des Titerplattenbodens (oder in dessen Nähe), wo dem meist Zellen haften. Da diese Zellen den Kontrast des projizierten Gitters, d. h. des Modulationsobjektes, beeinträchtigen, werden bei dieser Bauweise vorzugsweise mindestens 10 Zeilen der flächigen Kamera 16 ausgewertet. Dadurch kann das Kontrastsignal über eine größere Anzahl von Zeilen gemittelt werden, was die Meßgenauigkeit wesentlich verbessert. Zwischen Objektiv 4 und Titerplattenboden kann sich wiederum Luft oder eine Immersionsflüssigkeit befinden, das oben bereits Gesagte gilt analog. Der einzige Unterschied besteht darin, daß anstelle des Einbettmediums eine ausgedehnte Flüssigkeitssäule vorliegt, die über der Probe in der Küvette 22 steht.
Die Autofokuseinrichtung ist in der Bauweise der Fig. 5 wiederum über einen eigenen dichroitischen Strahlteiler 11' in den Mikroskopstrahlengang und nicht in den
Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt. Ansonsten gilt das bereits Gesagte analog. Zusätzlich ist in Fig. 5 noch das optionale Spektralfilter 21 eingezeichnet. Auch ist die Ausleuchtungsoptik
23 zur Erzeugung des Modulationsobjektes aus dem Lichtmodulator 12 exemplarisch dargestellt. Zur homogenen Ausleuchtung des Lichtmodulators 12 enthält vorzugsweise die Ausleuchtungsoptik 23 auch eine Streuscheibe. Eine Ausleuchtungsoptik 23 kann in allen beschriebenen Varianten verwendet werden.
Weiter zeigt Fig. 5, daß die Signale der Kamera 16 an ein Steuergerät 26 geleitet werden, das entsprechende Berechnungen vornimmt und unter anderem den bereits erwähnten z-Antrieb 27 zur Verstellung der Fokuslage ansteuert. Natürlich ist das Steuergerät 26 in der Regel auch mit dem Lichtmodulator 12 verbunden, sofern dieser ansteuerbar ist. Gleiches gilt für die Lichtquelle 13. oder 14. Das Steuergerät 26 und die damit verbundenen Elemente sind auch bei den Bauweisen gemäß Fig. 1 bis 4 möglich.
Fig. 6 zeigt eine Abwandlung der Bauweise der Fig. 5. Hier ist nun analog zur Bauweise der Fig. 1 die Autofokuseinrichtung über den Strahlteiler 11 in den Beleuchtungsstrahlengang eingespiegelt. Die separate Optik 20 kann entfallen, da dann keine Autofokusbeleuchtungstubusoptik nötig ist; deren Funktion wird von der Beleuchtungstubusoptik 7 erfüllt. Zusätzlich sind in Fig. 6 noch optionale Filter 24 und 25 im Beleuchtungsstrahlengang eingezeichnet. Auch ist der Einkopplung über den Strahlteiler 11 in Abbildungsrichtung des Modulationsobjektes eine Verkleinerungsoptik 28 vorgeordnet, die den Fangbereich der Autofokuseinrichtung beeinflußt und so dessen ideale Auslegung ermöglicht. Die Optiken 7, 20 und 28 können auch als (motorisierte) Variooptiken ausgelegt sein, um unterschiedliche Objektiwergrößerungen auszugleichen.
Fig. 7 zeigt eine weitere Bauweise eines Mikroskops mit einer Autofokuseinrichtung. Bauelemente, die in ihrer Funktion und/oder Struktur Elementen aus bereits beschriebenen Mikroskopen entsprechen, werden auch hier nicht noch einmal erläutert, um unnötige Wiederholungen zu vermeiden. In der Autofokuseinrichtung der Fig. 7 ist der Kamera 16 nun eine Abbildungsoptik 29 vorgeordnet, so daß nicht das Bild des Modulationsobjektes in der Probe direkt, sondern ein Zwischenbild 30 auf die Kamera 16 abgebildet wird. Natürlich kann dieses Prinzip, das in Fig. 7 am Beispiel eines inversen Mikroskops gezeigt wird, ganz grundsätzlich Anwendung finden. Der hier als Transmissionsgitter ausgebildete Lichtmodulator und das Zwischenbild 30 liegen in Ebenen, die zur Probenfokusebene sowie zu der Ebene, welche die Kamera 16 schneidet, konjugiert sind.
Die Abbildung des in der Probe liegenden Bildes des Modulationsobjektes unter Verwendung des Zwischenbildes 30 hat den erheblichen Vorteil, das der weitere Strahlteiler 15, der z. B. als
50:50-Strahlteiler abgebildet sein kann, in großer Entfernung zur Kamera 16 liegt.
Unvermeidbares Streulicht vom weiteren Strahlteiler 15 gelangt so nur noch über
Mehrfachreflexionen, d. h. stark abgeschwächt zur Kamera 16. Zusätzlich werden durch die
Zwischenbildeinkopplung auch alle von Optiken rechts des weiteren Strahlteilers 15 Reflexe zur Kamera 16 hin vermieden.
In einer exemplarischen Bauweise der Autofokuseinrichtung für das Mikroskop der Fig. 7 wird als Lichtquelle 13 eine IR-LED verwendet, deren Schwerpunktwellenlänge oberhalb 800 nm liegt, vorzugsweise bei 830 nm. Die Lichtquelle 13 ist mit dem Steuergerät 26 verbunden, so daß sie Bedarf ein- oder ausgeschaltet, zeitlich moduliert oder in ihrer Helligkeit regulierbar wird.
Der Lichtmodulator 12 ist als spaltenförmiges Transmissionsgitter ausgebildet. Um die Spalten möglichst homogen auszuleuchten und die Strahlung der Beleuchtungsquelle 13 somit möglichst effizient zu nutzen, ist eine Kollimatoroptik mit einer anamorphotischen Optik 23 vorgesehen, die eine linienförmige Beleuchtung bewirkt. Dem Lichtmodulator 12 vorgeordnet (alternativ auch nachgeordnet) ist das Filter 21 , das als IR-Bandpaßfilter ausgebildet ist und an die Schwerpunktwellenlänge der IR-LED angepaßt ist. Die Bandpaßbreite liegt zwischen 10 und 50 nm, wodurch unerwünschte spektrale Anteile der Lichtquelle 13 unterdrückt werden.
Das Transmissionsgitter ist exemplarisch in Fig. 8 in Draufsicht gezeigt. Es besteht aus einer spaltförmige Blende, die eine periodische Gitterstruktur enthält. Dieser Gitterspalt befindet sich in der Bildmitte oder in der Nähe der Bildmitte, um eine möglichst großen Fangbereich der Autofokuseinrichtung zu gewährleisten. Optional können, wie in Fig. 8 zu sehen ist, weitere Gitterspalte mit anderen Gitterperioden vorgesehen sein, um durch Auswahl der Gitterperiode den Abbildungskontrast auf der Kamera zu optimieren. Die Auswahl geschieht vorzugsweise durch entsprechendes Auslesen der 2D-Kamera 16. Auch kann ein schmaler Spalt 35 ohne Gitterstruktur vorgesehen sein. Das von der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche reflektierte Licht des Spaltbildes wird auf einen separaten Anteil der Kamera 16 abgebildet. Damit kann außerhalb des eigentlichen Fangbereichs anhand der abgebildeten Helligkeitsverteilung über den Spalt die Defokusierung grob ermittelt werden. Somit ist eine Vorfokussierung möglich, auch wenn noch kein Kontrastsignal vom Gitter an der Kamera 16 vorliegt. Damit kann das Steuergerät 26 ermitteln, in welche Richtung die z-Verstellung erfolgen muß, d. h. wie der Antrieb 27 anzusteuern ist, um wieder in den primären Fangbereich zu gelangen. Ist der Spalt hinreichend schmal, so ist die Helligkeit aufgrund konfokaler Unterdrückung an der Kamera 16 höher. Aus der Steigung der Helligkeitsverteilung kann der notwendige Verfahrweg in den primären Fangbereich abgeleitet werden. Dies führt das Steuergerät 26 durch.
Am weiteren Strahlteiler 15 ist eine Lichtfalle 34 vorgesehen, die Strahlung vom Lichtmodulator 12, welche transmittiert würde, absorbiert. Die Lichtfalle 34 ist vorzugsweise als schräg zur optischen Achse gestellte Platte eines stark absorbierenden Materials ausgebildet, z. B. als polierte NG 1 -Platte. NG 1 ist ein stark absorbierendes, schwarzes Glas.
Der dichroitisch Strahlteiler 11' reflektiert nur Strahlung der Wellenlänge, wie sie nach dem Bandpaßfilter 21 im Autofokusstrahlengang geführt ist. Andere Spektralanteile werden transmittiert. Dazu weist der Strahlteiler 11' eine Interferenzschicht auf, die Strahlung unterhalb 800 nm bei einem Einfallswinkel von 45° weitgehend transmittiert und Strahlung mit der Schwerpunktwellenlänge der IR-LED weitgehend reflektiert. Auch kann der Strahlteiler 11 ' einen Keilwinkel aufweisen, um Interferenzen, die bei einem Laser-Scanningmikroskop, als das das Mikroskop der Fig. 7 ausgebildet sein kann, stören würden. Um auch mit lichtlinearer Fluoreszenzanregung arbeiten zu können, welche ebenfalls mit IR-Strahlung im Mikroskop zur Probenabbildung arbeitet, kann der Strahlteiler 11' auch ein bandpaßartiges Spektralverhalten aufweisen, so daß Wellenlängen oberhalb des Autofokus-Spektralbereiches (z. B. oberhalb 840 nm) ebenfalls bei 45° Einfallswinkel weitgehend transmittiert werden. Natürlich können diese Strahlteilermerkmale auch in anderen Ausführungsformen verwendet werden.
Weiter ist es vorzugsweise möglich, den Strahlteiler wechselbar zu gestalten, z. B. mittels eines Wechselrades oder eines anderen Wechselmechanismusses.
Der Abbildung des in der Probe liegenden Bildes des Modulationsobjektes bzw. dessen Zwischenbild 30 sind Sperrfilter 33 vorgelagert, die dafür sorgen, daß nur Strahlung des entsprechenden Autofokus-Spektralbereiches zur Kamera 16 gelangt. Andere Strahlung die aus der Abbildung der Probe stammen kann, z. B. Anregungs- oder Fluoreszenzstrahlung in Falle eines Laser-Scanning-Mikroskops, wird dadurch nochmals unterdrückt. Die Abbildungsoptik 29 bildet das in der Probe liegende Bild des Modulationsobjektes bzw. das an einer Grenzfläche, z. B. der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche reflektierte Zwischenbild 30 auf die Kamera 16 ab. Die Abbildungsoptik 29 kann z. B. aus einer Tubuslinse 32 und einem Standardobjektiv 31 mit kleiner numerischer Apertur (z. B. NA=0,2) aufgebaut sein.
Die Fig. 9 und 10 zeigen das Kontrastsignal der Kamera 16 beim Autofokussystem, z. B. der Bauweise gemäß Fig. 7. Fig. 9 zeigt das Kontrastsignal in der Bildfeldmitte und Fig. 10 das am Bildfeldrand. Dabei ist in beiden Figuren das Kontrastsignal in willkürlichen Einheiten über der Pixelnummer der hier exemplarisch zeilenförmigen Kamera (16) aufgetragen.
Der Fangbereich des Autofokussystems ist vorgegeben durch den Bereich der z-Verschiebung des Objektivs 4 (oder der Grenzfläche), in dem noch ein auswertbares Kontrastsignal auf der Autofokuskamera vorliegt. Zwei Bedingungen müssen hierzu erfüllt sein:
1. Das Kontrastsignal muß sich noch innerhalb des Bildfeldes befinden. 2. Das Kontrastsignal muß einen hinreichenden Signalpegel aufweisen, der signifikant über dem Rauschpegel liegt.
Der Haltebereich, in dem durch Nachregeln der Fokus gehalten werden kann, ist begrenzt durch den maximal zulässigen Bereich der z-Verschiebung der Fokusebene in die Probe hinein. Für den Fall, daß sich der Kontrastschwerpunkt in der Bildfeldmitte befindet, wenn die Fokusebene des Mikroskop-Objektivs 4 genau auf der Grenzfläche liegt, ist der Haltebereich genau halb so groß wie der Fangbereich. Dies ist in der Darstellung der Fig. 9 der Fall.
Aus den Fig. 9 und 10 ist nun zu entnehmen, daß der Kontrast bei Verschiebung des Kontrastschwerpunkts von der Bildfeldmitte zum am Bildfeldrand von etwa 110 auf etwa 30 abnimmt. Diese Verschlechterung des Signal/Rausch-Verhältnisses resultiert hauptsächlich aus sphärischer Aberration und aus Koma, zwei Bildfehlern, die zum Bildfeldrand stets zunehmen.
Ein Kontrastpegel von 30 kann gerade noch sinnvoll ausgewertet werden. Aus diesem Grund muß die Bildfeldgröße auf der schräg gestellten Autofokuskamera so gewählt werden, daß am Rand des Fangbereichs die Kontrasthöhe gerade noch ausreicht. Die Größe der Kamera ist entsprechend angepaßt.
Es ist deshalb optional eine Weiterbildung vorgesehen, die exemplarisch in Fig. 7 gestrichelt eingezeichnet ist. Dort ist ein Längs-Verstellmechanismus 40 vorgesehen, der den Abstand zwischen Autofokus-Objektiv 31 und Autofokus-Kamera 16 variiert. Dazu kann wahlweise das Objektiv 31 gegenüber der feststehenden Kamera 16 oder die Kamera 16 gegenüber dem feststehenden Objektiv 31 längs der optischen Achse bewegt werden. Für den vorzugsweise elektronisch angesteuerte Längs-Verstellmechanismus sind alle bekannten Antriebstechniken, wie Spindelantriebe, Schrittmotoren, Gleichstrommotoren, Piezosteller usw. geeignet. Die Variation des Abstandes zwischen Autofokus-Objektiv 31 und Kamera 16 ist nur ein Beispiel für das allgemein zugrundeliegende Prinzip, der Längsverstellung von Kamera 16 zur Bildebene der Autofokus-Abbildung. Im einfachsten Fall kann der Längs-Verstellmechanismus eine Verschiebung der Kamera 16, der Abbildungsoptik 29 oder des Lichtmodulators 12 bewirken.
Die Weiterbildung behebt die beschriebene Limitierung des Fang- bzw. Haltebereichs.
Nun wird der Abstand zwischen Autofokus-Objektiv und Autofokuskamera an den gewünschten Haltebereich so angepaßt, daß der Schwerpunkt des Kontrastsignals immer in der Bildfeldmitte liegt. Hierzu werden folgende Schritte durchgeführt:
1. Mit Hilfe des z-Antriebs 27 des Mikroskops wird die Grenzfläche in die Fokusebene des Mikroskop-Objektivs 4 gebracht. Dies ist die Ausgangsposition für den erweiterten
Haltefokusmodus. Der Schwerpunkt des Kontrastsignals befindet sich jetzt in der Bildfeldmitte des Autofokus-Objektivs 31 , wo die Bildfehler am geringsten sind.
2. Die Fokusebene des Mikroskop-Objektivs 4 wird mit Hilfe des z-Antriebs 27 in die Probe hinein gefahren. Simultan hierzu wird der Abstand zwischen Autofokus-Objektiv 31 und Kamera 16 so variiert, daß der Kontrastschwerpunkt in der Bildfeldmitte des Autofokus-Objektivs 31 verbleibt.
3. Ist die gewünschte Fokusebene eingestellt, wird die bereits geschilderte Haltefokus- Funktion aktiviert. Dadurch werden alle Defokussierungen durch den z-Antrieb ausgeglichen, während der Abstand zwischen Autofokus-Objektiv 31 und Kamera 16 konstant bleibt. Durch die Haltefokus-Funktion verbleibt der Kontrastschwerpunkt auch weiterhin in der Bildfeldmitte des Autofokus-Objektivs 31 und damit in der Mitte der Kamera 16.
Die Wirkung der Längs-Verstellung zeigt Fig. 11 , die das Kontrastsignal wieder in der Bildfeldmitte aufweist. Die Signalhöhe ist verglichen, mit Fig. 10 um 67% auf einen Pegel von etwa 50 verbessert. Durch diese Verstellmöglichkeit bzw. Vorgehensweise ist der Fang- bzw. Haltebereich nicht mehr durch die Bildfeldgröße des Autofokus-Objektivs 31 limitiert. Der Fangbereich kann erheblich erweitert, typischerweise verdoppelt, werden.
Begrenzt ist der Fang- bzw. Haltebereich lediglich durch die Bildfehler in der Bildfeldmitte des Autofokus-Objektivs 31. Dabei handelt es sich vorwiegend um sphärische Aberration. Die zum Bildfeldrand hin deutlich zunehmenden Aberrationen, vor allem Koma und Wölbung, wirken sich nun nicht mehr störend aus. Zusätzlich werden noch andere Probleme, die am Bildfeldrand auftreten, wie Randabfall der Beleuchtung, Vignettierung und Reflexe etc. umgangen.
Weil das Kontrastsignal in der Bildfeldmitte verbleibt, kann auch der Lichtmodulator 12 kleiner ausgelegt werden. Es muß nun nicht mehr über das gesamte Bildfeld des Objektivs 4 verlaufen, um den Fangbereich zu maximieren. Dadurch wird weniger Autofokuslicht in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelt, was den Streulichtuntergrund auf der Autofokus-Kamera 16 verringert. Wenn ein kleinerer (d.h. kürzerer) Lichtmodulator 12 verwendet wird, kann auch ein kleinerer und damit kostengünstigerer Kamerachip für die Autofokus-Kamera 16 verwendet werden.
Die auf die Kamera 16 abgebildete Struktur des Lichtmodulators 12, dem Winkel zwischen der Kamera 16, die Auflösung der Kamera u. statistische Intensitätsschwankungen während der Messung beeinflussen die Regelgenauigkeit der z-Position. Um die Regelgenauigkeit z. B. während des Haltefokus verändern zu können, durchaus auch abhängig vom Mikroskopobjektiv, können optional mehrere als Lichtmodulator 12 nebeneinanderliegende Gitterstrukturen mit unterschiedlichen Perioden ausgewertet werden und/oder der Schrägstellungswinkel des Lichtmodulators 12 oder der Kamera 16 wird die Messung entsprechend einer geforderten Regelgenauigkeit angepaßt. Die letztere Variante ist in Fig. 7 gestrichelt eingezeichnet. Dort ist ein Winkel-Verstellmechanismus 41 vorgesehen.
Ist der Haltefokuseinstellvorgang abgeschlossen, kann so nach vorher definierten Genauigkeitsanforderungen z.B. der Winkel der Kamera 16 vorzugsweise elektronisch verstellt werden. Die Verstellung des Winkels zwischen Kamera 16 und Bild des Modulationsobjektes erfolgt in einfachsten Fall durch Rotation des Kamera 16 oder des Lichtmodulators 12 mittels eines geeigneten Winkel-Verstellmechanismus.
Hierzu eignen sich alle bekannten Techniken, wie Spindelantriebe, Schrittmotoren, Gleichstrommotoren, Linearmotore, Piezosteller usw. Bei geeignetem Winkel, und entsprechend ausgewählten Gitter mit geeignetem Gitterabstand, kann die Genauigkeitsauflösung angepaßt werden.
Die geschilderten Verstellmechanismen 40, 41 geben ein Verstellsignal ab, das dem Steuergerät 26 der Autofokuseinrichtung zugeführt ist.
Für alle Ausführungsformen des Mikroskops 1 mit Autofokuseinrichtung gilt folgendes: Die geschilderten Erweiterungen hinsichtlich Fangbereich bzw. Verstellung der Positioniergenauigkeit lassen sich natürlich nicht nur bei der Bauweise der Fig. 7, sondern bei allen Ausführungsformen einsetzen.
Um bei einem Online-Tracking möglichst geringe Einflüsse durch die strukturierte Beleuchtung, d. h. das Bild des Modulationsobjektes, zu produzieren, kann als Modulationsobjekt ein Streifenmuster auf die Probe projiziert werden, das in schneller Folge (>30 Hz) alternierend lateral verschoben wird. Bei zwei Positionen wäre es eine Phasenverschiebung um 180°, bei drei Positionen eine Phasenverschiebung um 120°. Die Gitterstruktur (Gitterkonstante, Hell/Dunkel-Verhältnis) kann dabei über den elektronischen Lichtmodulator 12 in der Ansteuerung leicht derart angepaßt werden, daß im zeitlichen Mittel eine homogene Beleuchtung entsteht. Die Anpassung der optimalen Gitterstruktur an das jeweils verwendete Objektiv 4 bzw. dessen NA oder Vergrößerung ist auch möglich.
Ein weiterer Vorteil eines verstellbaren, insbesondere ansteuerbaren Lichtmodulators 12 und damit einer variablen Autofokus-Beleuchtungsstruktur besteht darin, nach dem Auffinden eines Objektes nur noch die interessanten Bereiche des Objektfeldes auszuleuchten. Hierdurch kann der Bildkontrast für die Tracking-Vorrichtung, gegebenenfalls aber auch für den normalen Detektionskanal erhöht werden.
Prinzipiell ist die strukturierte Autofokus-Beleuchtung, z.B. mittels LCD oder DMD, auch bei einem Durchlichtmikroskop und/oder als Dunkelfeldbeleuchtung realisierbar. Im Durchlicht ist die Anwendung dann aber auf transparente Probenträger sowie auf streuende oder fluoreszierende Proben eingeschränkt.
Bei allen Varianten des Autofokus- und Tracking-Systems wird eine rechnerische Steuer- und Auswerteeinrichtung (z.B. ein Computer) verwendet, die die Signalanalyse und die Steuerung des Aktuatoren (z-Trieb, x-y-Tisch, Filter etc.) vornimmt. Auswertung und Steuerung können Firmware- und/oder Software-technisch implementiert werden. Diese Steuer- und Auswerteeinrichtung übernimmt sämtliche hier geschilderte Ablaufsteuerung.
Statt verstellbarer, z. B. elektrisch schaltbarer Lichtmodulatoren (z. B. LCD, DMD) können auch statische Lichtmodulatoren (Transmissions- oder Phasengitter) verwendet werden. Das projizierte Modulationsobjekt kann mit verkippbaren Planplatten oder anderen Vorrichtungen probenseitig verschiebbar sein. Ein Austausch der Gitter kann zur Variation der Gitterkonstante oder -struktur ebenfalls möglich sein. Wie erläutert kann auch eine flächige Gitterstruktur verwendet werden, die mehrere unterschiedliche Gitterperioden aufweist, beispielsweise 2 bis 10 nebeneinander angeordnete Streifengitter mit unterschiedlichen Gitterfrequenzen. Dies zeigt exemplarisch, daß der Lichtmodulator auch linien- bzw. zellenförmig sein kann und nicht zwingend zweidimensional sein muß.
Da das erfindungsgemäße Autofokusverfahren aber vorzugsweise mit flächigen (zweidimensionalen) Kameras arbeitet, kann bei mehreren Gitterzeilen für jeden Anwendungsfall das am besten geeignete Gitter durch Auslesen der entsprechenden Kamerazeilen gewählt werden, ohne mechanische Änderungen (Austausch des Gitters) vornehmen zu müssen. Grundsätzlich sind senkrecht zur optischen Achse stehende Lichtmodulatoren 12 als Transmissionsmodulatoren leichter implementierbar, während geneigte Lichtmodulatoren 12 leichter als Reflexionsmodulatoren realisierbar sind. Sollen sehr kleine Objekte durch das Tracking-System erfaßt werden, so kann es vorkommen, daß eine hinreichend hochfrequente Beleuchtungsmodulation nicht mehr möglich ist. In diesem Fall kann auch räumlich unmoduliert beleuchtet und nur die Intensität der gestreuten oder reflektierten Signale ausgewertet werden. Als ortsauflösende Detektoren kommen neben CCD-Kameras auch CMOS- sowie alle anderen Arten von Digitalkameras in Frage.
Die Autofokuseinrichtung soll einen bestimmten Bereich der Probe automatisch fokussieren oder in der Fokusebene des Objektivs halten. Hierzu kann ein Offset (typisch 0 ... 1000 μm) zwischen Grenzfläche und relevanter Probenebene vorgegeben werden. Wird dieser Offset in Stufen variiert, so ist es auch möglich sogenannte z-Stapel von Bildern aufzunehmen, wobei jedes Bild einen definierten und kontrollierten Abstand zur Grenzfläche hat. Die Anordnung kann in Verbindung mit allen gängigen Kontrastverfahren der Mikroskopie verwendet werden: u.a. Fluoreszenz, Durchlicht, Phasenkontrast, Interferenzkontrast, Polarisationskontrast, Auflicht, Luminiszenz, CARS (= Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), OCT (= Optical Coherence Tomography), SPIM (= Selective Plane Illumination) etc.
Soweit in dieser Beschreibung Verfahrensschritte bzw. besondere Betriebsweisen oder -Modi geschildert sind, werden diese durch ein zur Autofokuseinrichtug gehörenden Steuereinrichtung z. B. wie im Steuergerät 26, realisiert. Natürlich kann auch eine im Mikroskop 1 ohnehin vorhandene Steuereinrichtung die entsprechenden Steueraufgaben mit übernehmen.
Der Betrieb des Mikroskopes mit der erfindungsgemäßen Autofokuseinrichtung kann derart ablaufen, das die Abbildung der Probe zuerst visuell oder mittels eines bekannten Software- Autofokussystems scharf gestellt wird. Anschließend wird die Autofokuseinrichtung der beschriebenen Art aktiviert und sorgt dafür, das der Abstand zwischen der interessierenden Probenebene z. B. einer Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche und der eingestellten Fokusebene des Mikroskop-Objektivs 4 konstant bleibt. Hierzu wird der Antrieb 27 so angesteuert, daß das Kontrastmaximum stets auf der gleichen Stelle der Kamera 16 verweilt. Diese Funktionalität realisiert einen sogenannten Haltefokus, der auch bei unvermeidlichem Driften eine konstante Fokuslage sicherstellt.
Um mit der Autofokuseinrichtung möglichst weit in die Probe hinein messen zu können, kann die Kamera 16 asymmetrisch zur jeweiligen optischen Achse, (z. B. optischen Achse oa2 in Fig.
7) angeordnet sein, so daß sich ein asymmetrischer Fangbereich ergibt. Beispielsweise kann das Kontrastmaximum von Anfang an nahe einem Rand des Fangbereiches liegen, wenn eine
Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche mit der eingestellten Fokusebene des Mikroskopobjektivs 4 zusammenfällt. Der andere Rand des Fangbereichs entspricht dann dem maximalen Abstand von der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche zur eingestellten Fokusebene, in dem noch der Fokus fixiert werden kann, also dem maximalen Haltebereich.
Je nach Objektiwergrößerungen sind Fang- bzw. Haltebereiche von 10 μm bis 10mm erreichbar. Die Auflösung in z-Ebene beträgt je nach Objektiwergrößerung numerischer Apertur 5 nm bis 5 μm. Die z-Auflösung ist also stets mindestens 5-mal besser als die Schärfentiefe des verwendeten Mikroskopobjektivs 4.

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskop mit einem Objektiv (4), das eine in einem Probenvolumen (2) liegende Fokusebene aufweist, und einer Autofokuseinrichtung, die aufweist einen Lichtmodulator (12) zur Erzeugung eines leuchtenden, intensitätsmodulierten
Modulationsobjektes, eine Autofokus-Beleuchtungsoptik (7; 20; 7, 28), die das leuchtende Modulationsobjekt in die Fokusebene des Objektives (4) oder diese schneidend abbildet, so daß im Probevolumen (2) ein Bild des Modulationsobjektes entsteht, wobei die Abbildung des Modulationsobjektes über einen Strahlteiler (6, 11') erfolgt, der den Strahlengang der Autofokus-Beleuchtungsoptik in den Mikroskopstrahlengang einspiegelt, eine Kamera (16) zur Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes, die eine Kamera- Bildebene aufweist, - eine Autofokus-Abbildungsoptik (7; 20; 7, 28; 20, 29 ), die das im Probevolumen (2) liegende Bild des Modulationsobjektes in eine Autofokus-Bildebene abbildet, wobei die Kamera-Bildebene die Autofokus-Bildebene schneidet, wenn das Bild des
Modulationsobjektes in der Fokusebene liegt, und in der Autofokus-Bildebene liegt, wenn das
Bild des Modulationsobjektes die Fokusebene schneidet.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) ansteuerbar und zur Erzeugung eines räumlich oder zeitlich intensitätsmodulierten Modulationsobjektes angesteuert ist und die Kamera den Kontrast zu dieser zeitlichen Modulation erfaßt.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) ein beleuchtetes LCD- oder DMD-Element aufweist.
4. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das abgebildete Modulationsobjekt mindestens eine periodische Struktur, insbesondere eine Streifengitterstruktur oder mehrere unterschiedliche Streifenstrukturen, aufweist.
5. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das die Autofokus-Beleuchtungsoptik einen zwischen Lichtmodulator (12) und Strahlteiler (6) liegenden weiteren Strahlteiler (15) aufweist.
6. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) un/oder die Karmera-Bildebene in einem Winkel von 10° bis 80° zur optischen Achse (OA2, OA3) liegt/liegen.
7. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Autofokus-Beleuchtungsoptik (7; 20) das Modulationsobjekt in einen Auflichtbeleuchtungsstrahlen- gang des Mikroskops einspiegelt.
8. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Autofokus- Abbildungsoptik (20) die Kamera (16) parallel zum Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (7) des Mikroskops (1 ) in den Mikroskopstrahlengang einspiegelt.
9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler die Autofokus-Beleuchtung bzw. Autofokus-Abbildung parallel zu einem Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (7, 8) des Mikroskops (1 ) einspiegelt.
10. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Kamera (18) vorgesehen ist, deren Bildebenen zu der der ersten Kamera (16) geneigt ist und auf welche die Autofokus-Abbildungsoptik ebenfalls das Bild des Modulationsobjektes abbildet.
11. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator ein transmittiv arbeitet und insbesondere als ein festes Transmissionsgitter ausgebildet ist.
12. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlenteiler (6, 11') ein Dichroit ist.
13. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) von einer oder mehreren LED beleuchtet ist.
14. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) in einem Autofokus-Spektralbereich leuchtet oder beleuchtet ist, der von einem für die Probenabbildung im Mikroskop (1 ) verwendeten Spektralbereich verschieden ist, und die Autofokus-Abbildungsoptik mindestens einen Filter (21 , 33) aufweist, der außerhalb des Autofokus-Spektralbereiches liegende Spektralanteile unterdrückt oder ausgefiltert.
15. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Autofokus-Abbildungsoptik eine der Kamera (16) vorgeordnete Optik (29) aufweist und so das Bild des Modulationsobjekt mit einer Zwischenabbildung auf der Kamera (16) abbildet.
16. Mikroskop nach den Ansprüchen 5 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenbild (30) zwischen der vorgeordneten Optik (29) und dem weiterem Strahlteiler (15) liegt.
17. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtmodulator (12) mit einer anamorphotischen Optik (23) beleuchtet ist.
18. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche in Verbindung mit Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen Strahlungsfalle (34), die am weiteren Strahlteiler (5) transmittierte Strahlung absorbiert.
19. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Längs- Verstellmechanismus (40) zur Verstellung des Abstandes zwischen der Kamera (16) und der Autofokus-Abbildungsoptik (29), wobei der Längs-Verstellmechanismus (40) eine Lagerückmeldung, welche den Verstellweg über ein Wegsignal anzeigt, aufweist.
20 Mikroskop nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch ein Steuergerät (26), welches das Wegsignal empfängt und mittels Ansteuerung des Längs-Verstellmechanismus (40) ein Kontrastsignal der Kamera (16) auf einen Maximalwert regelt.
21. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Winkel- Verstellmechanismus vorgesehen ist, der im Falle der die Autofokus-Bildebene schneidenden Kamera-Bildebene einen Winkel zwischen Kamera-Bildebene und der Abbildungsoptik- Bildebene verstellt, im Falle des die Fokusebene schneidenden Bild des Modulationsobjektes einen Winkel zwischen Fokusebene und Bild des Modulationsobjektes verstellt, wobei der Winkel-Verstellmechanismus eine Lagerückmeldung, welche den Verstellwinkel über ein Winkelsignal anzeigt, aufweist.
22. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel- Verstellmechanismus im Falle der die Autofokus-Bildebene schneidenden Kamera-Bildebene die Kamera einstellbar kippt und im Falle des die Fokusebene schneidenden Bild des Modulationsobjektes den Lichtmodulator einstellbar kippt.
23. Mikroskop nach Anspruch 21 oder 22, gekennzeichnet durch ein Steuergerät (26), welches das Winkelsignal empfängt und mittels Ansteuerung des Winkel-Verstellmechanismus die Autofokusauflösung einstellt.
24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstellmechanismus einen oder mehrere der folgenden Antriebe aufweist: Spindelantrieb, Schrittmotor, Gleichstrommotor, Linearmotor, Piezosteller.
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