DE102008018951A1

DE102008018951A1 - Mikroskop mit Haltefokuseinheit

Info

Publication number: DE102008018951A1
Application number: DE102008018951A
Authority: DE
Inventors: Reiner Mitzkus; Eugen Dr. Wehner; Stefan Steinborn; Gleb Milinovici; Steffen Leidenbach; Peter Dr. Westphal
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2008-04-15
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2009-10-22
Also published as: WO2009127337A2; WO2009127337A3; US20110043905A1; US8563912B2

Abstract

Es wird bereitgestellt ein Mikroskop mit einem Probentisch (2) zum Tragen einer zu untersuchenden Probe (3), einem Aufnahmesensor (4), einer Abbildungsoptik (5) zum Abbilden der Probe (3) auf den Aufnahmesensor (4), einer Bewegungseinheit (6), mit der der Abstand zwischen Probentisch (2) und Abbildungsoptik (5) verändert werden kann, einer Steuereinheit (9) zur Steuerung einer Bildaufnahme der Probe (3) und einer Haltefokuseinheit (11) zum Beibehalten einer vorbestimmten Fokuslage für zeitlich zueinander beabstandete Bildaufnahmen der Probe (3), wobei die Haltefokuseinrichtung (11) zumindest ein Hardwareelement (12) und ein Softwaremodul (13) enthält, wobei die Haltefokuseinheit (11) sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit (9) integriert ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Probentisch zum Tragen einer zu untersuchenden Probe, einem Aufnahmesensor, einer Abbildungsoptik zum Abbilden der Probe auf den Aufnahmesensor, einer Bewegungseinheit, mit der der Abstand zwischen Probentisch und Abbildungsoptik verändert werden kann, einer Steuereinheit zur Steuerung einer Bildaufnahme der Probe und einer Haltefokuseinheit zum Beibehalten einer vorbestimmten Fokuslage für zeitlich zueinander beabstandete Bildaufnahmen der Probe, wobei die Haltefokuseinrichtung zumindest ein Hardwareelement und ein Softwareelement enthält.
Ein Mikroskop mit einer Haltefokuseinheit wird insbesondere bei der Beobachtung von zeitlich über mehrere Stunden oder sogar mehrere Tage ablaufenden Vorgängen verwendet, um sicherzustellen, daß alle Aufnahmen in der gleichen Fokuslage bzw. Abbildungslage erfolgen.
Bisher bekannte Haltefokuseinheiten sind als vom Mikroskop getrenntes Modul ausgebildet, das nachträglich an ein bestehendes Mikroskop montiert und angeschlossen wird. Zur Bedienung ist in der Regel ein separates Bedienpult vorgesehen. Dies macht die Handhabung bzw. den Einsatz der Haltefokuseinheit aufwendig und umständlich. Insbesondere steigt der Platzbedarf, da ein weiteres Bedienpult notwendig ist.
Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß die Haltefokuseinheit einfach und mit geringem Platzbedarf vorgesehen werden kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß die Haltefokuseinheit sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit integriert ist.
Dies führt einerseits dazu, daß kein separates Bedienpult für die Haltefokuseinheit notwendig ist. Die Steuerung bzw. die Ein- und Ausgabe von Informationen für die Haltefokuseinheit kann über die bei dem Mikroskop üblicherweise bereits vorhandene Ausgabe-/Eingabeeinheit erfolgen.
Ferner bietet die vollständige Integration der Haltefokuseinheit in die Steuereinheit eine Vielzahl von Vorteilen für den Betrieb des Mikroskopes.
So kann die Haltefokuseinheit auf alle technisch relevanten Daten des Mikroskopes zugreifen und diese bei der Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage berücksichtigen. Dabei handelt es sich insbesondere um Daten, die die Abbildungsoptik kennzeichnen, wie z. B. die Vergrößerung, den Schärfentiefebereich, die verwendeten Wellenlängen, usw.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann durch die Intergration der Haltefokuseinheit in die Steuereinheit die Haltefokus-Funktionalität nahtlos in das Bedienkonzept des Mikroskopes eingebunden werden, ohne daß eine weitere Bedienkonsole und/oder spezielle Software zur Steuerung der Haltefokus-Funktionalität notwendig wäre. Auch kann die Haltefokuseinheit eine eigenständige Kalibrierung mit unbekannten Mikroskopobjektiven der Abbildungsoptik durchführen und/oder die Vergrößerung der Abbildungsoptik mittels der Haltefokuseinheit bestimmen. Ferner können Mikroskopdaten, die technische Eigenschaften des Mikroskops beschreiben, von der Haltefokuseinheit abgefragt und zur Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage verwendet werden. Die Haltefokuseinheit kann ihrerseits ermittelte Daten für das Mikroskop in einem entsprechenden Speicher ablegen.
Wenn die Abbildungsoptik Objektive mit einem Chip zur Speicherung von Objektivdaten aufweist, kann die Haltefokuseinheit diesen Chip auslesen und/oder diesen Chip beschreiben.
Ferner kann die Haltefokuseinheit eine Deckglasdicke und/oder eine Dicke des Bodens eines Gefäßes, in dem die Probe liegt, wie z. B. eine Petrischale oder ein Kulturgefäß, bestimmen. Auch ist es möglich, mittels der Haltefokuseinheit eine gewünschte Fokuslage automatisch zu ermitteln.
Insbesondere können mittels der Haltefokuseinheit verschiedene Betriebsmodi des Mikroskops umgesetzt werden. Bei den Betriebsmodi kann es sich um die Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik, die Bestimmung der Deckglasdicke und/oder Bodendicke eines Gefäßes für die Probe und/oder die Bestimmung einer gewünschten Fokusebene handeln.
Die Haltefokuseinheit kann die Bewegungseinheit zur Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage ansteuern. Insbesondere kann die Haltefokuseinheit eine vorgegebene Fokus- bzw. Abbildungslage (z. B. nachdem der Probentisch stark in Abbildungsrichtung verfahren wurde, um die Probe zu manipulieren oder zu wechseln) selbsttätig oder auf Anforderung durch den Bediener anfahren. Die Haltefokuseinheit kann zusätzlich weitere Komponenten des Mikroskops ansteuern. So kann sie beispielsweise, falls sie dies für notwendig erachtet, einen Objektivwechsel durchführen.
Bei der Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage wird eine eingestellte Objektlage optisch zur Abbildungsoptik konstant gehalten. In anderen Worten, die optische Weglänge wird konstant gehalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann die Steuereinheit einen zugeordneten Speicher aufweisen, auf den die Haltefokuseinheit schreibend und/oder lesend zugreifen kann. Der Speicher kann insbesondere als Hardwareelement direkt in der Steuereinheit 9 integriert oder mit dieser verbunden sein. Die Haltefokuseinheit kann beispielsweise von ihr gewonnene technisch relevante Daten des Mikroskops, wie z. B. die Vergrößerung des gerade eingesetzten Objektives der Abbildungsoptik, in dem Speicher der Steuereinheit 9 hinterlegen bzw. einschreiben. Ferner kann die Haltefokuseinheit auf den Speicher der Steuereinheit natürlich auch lesend zugreifen, um dort hinterlegte technisch relevante Daten des Mikroskops auszulesen und bei der Haltefokussteuerung zu berücksichtigen.
Ferner kann auf den Speicher der Steuereinheit von weiteren Komponenten des Mikroskops zugegriffen werden. Dabei kann es sich wiederum um einen schreibenden und/oder lesenden Zugriff handeln.
Das Mikroskop kann zumindest ein Objektiv mit einem Speicher aufweisen, auf den die Haltefokuseinheit schreibend und/oder lesend zugreifen kann. In dem Speicher des Objektivs sind bevorzugt Daten enthalten, die das Objektiv und seine Eigenschaften kennzeichnen. Natürlich kann die Abbildungsoptik des Mikroskops mehrere Objektive aufweisen, die mittels eines Objektivrevolvers selektiv in den Abbildungsstrahlengang eingebracht werden können. Die mehreren Objektive können jeweils einen eigenen Speicher aufweisen, auf den jeweils die Haltefokuseinheit schreibend und/oder lesend zugreifen kann.
Es ist darüber hinaus möglich, daß weitere Komponenten des Mikroskops auf den Speicher des Objektives bzw. der Objektive zugreifen können.
Das Mikroskop kann als Auflicht- oder Durchlichtmikroskop, konfokales Mikroskop und/oder Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet sein. Ferner kann das Mikroskop als Fluoreszenzmikroskop verwirklicht werden. Das Mikroskop kann eine Beleuchtungseinheit umfassen.
Die Haltefokuseinheit (insbesondere die optische Realisierung) kann z. B. so ausgebildet werden, wie in der WO2007/144197 A1 beschrieben ist. Auch eine ähnliche Ausbildung der Haltefokuseinheit ist natürlich möglich. Der Inhalt der WO2007/144197 A1 wird hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen.
Es wird ferner ein Mikroskopierverfahren bereitgestellt, bei dem unter Steuerung einer Steuereinheit zeitlich zueinander beabstandete Aufnahmen einer zu untersuchenden Probe über eine Abbildungsoptik, die die Probe auf einen Aufnahmesensor abbildet, aufgenommen werden, wobei eine Haltefokuseinheit, die zumindest ein Hardwareelement oder ein Softwaremodul enthält, zum Beibehalten einer vorbestimmten Fokuslage für die zeitlich zueinander beabstandeten Bildaufnahmen der Probe vorgesehen wird, wobei ferner die Haltefokuseinheit sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit integriert wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahren kann die Haltefokus-Funktionalität nahtlos in das Bedienkonzept der Steuereinheit eingebunden werden, was insgesamt zu einem einfacher zu bedienenden Mikroskop führt.
Bei dem Mikroskopierverfahren kann mittels der Haltefokuseinheit die Vergrößerung der Abbildungsoptik bestimmt werden. Dies läßt sich beispielsweise dadurch realisieren, daß die Haltefokuseinheit die zu untersuchende Probe über die Abbildungsoptik detektiert und dabei der Abstand zwischen Abbildungsoptik und Probe variiert wird. Aus der sich dabei ergebenden Änderung des detektierten Signals (beispielsweise einer Verschiebung des detektierten Signals in einer Ebene eines Fokusmeßsensors der Haltefokuseinheit) kann dann die Vergrößerung der Abbildungsoptik abgeleitet werden.
Ferner ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, mittels der Haltefokuseinheit die Dicke eines Deckglases, unter dem die Probe liegt, oder die Dicke des Bodens eines Gefäßes, in dem die Probe angeordnet ist, zu bestimmen.
Diese Dickenbestimmung kann beispielsweise dadurch durchgeführt werden, daß die Haltefokuseinheit das Deckglas bzw. den Gefäßboden beleuchtet und die dabei an Ober- und Unterseite des Deckglases bzw. des Gefäßbodens erzeugten Reflexe detektiert und daraus die zu bestimmende Dicke ableitet. Die Detektion der Reflexe von Ober- und Unterseite werden dabei bevorzugt unter gleichen Abbildungsbedingungen detektiert. Beispielsweise können die beiden Reflexe gleichzeitig auf einen Fokusmeßsensor der Haltefokuseinheit abgebildet werden.
Ferner kann zur Dickenbestimmung die Haltefokuseinheit das Deckglas bzw. den Gefäßboden beleuchten, den Abstand zwischen Abbildungsoptik und Deckglas bzw. Gefäßboden so ändern, daß zeitlich nacheinander der an Ober- und Unterseite des Deckglases bzw. des Gefäßbodens erzeugte Reflex detektiert und daraus unter Berücksichtigung der Abstandsänderung die zu bestimmende Dicke abgeleitet wird.
Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren kann ferner Schritte aufweisen, die bei dem Betrieb des erfindungsgemäßen Mikroskops (einschließlich seiner Weiterbildungen) ausgeführt werden.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Ansicht einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops;
2 eine Darstellung zur Erläuterung der Ermittlung der Vergrößerung der Abbildungsoptik 5;
3 eine Darstellung der bei der Bestimmung von 2 mittels des Detektors 8 gemessenen Signale;
4 eine Darstellung zur Erläuterung der Bestimmung der Deckglasdicke;
5 eine Darstellung der Meßergebnisse des Detektors 8 bei der Deckglasdickenbestimmung gemäß 4;
6 eine Darstellung zur Erläuterung der Deckglasdicke gemäß einer weiteren Ausführungsform;
7a und 7b Darstellungen der Meßsignale des Sensors 8 bei der Deckglasdickenbestimmung gemäß 6;
8 eine Darstellung zur Erläuterung der Fokuslagen-Ermittlung, und
9 Meßsignale des Sensors 8 bei der Fokuslagenbestimmung gemäß 8.
Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Mikroskop 1, das bevorzugt als inverses Mikroskop ausgebildet ist, einen Probentisch 2, der eine Probe 3 trägt, einen Aufnahmesensor 4 sowie eine Abbildungsoptik 5, die die Probe 3 auf den Aufnahmesensor 4 abbildet.
Das Mikroskop 1 enthält ferner eine Bewegungseinheit 6, die den Abstand zwischen der Abbildungsoptik 5 und dem Probentisch 2 und somit der Probe 3 entlang der Aufnahmerichtung der Abbildungsoptik 5 verstellen und einstellen kann.
Zwischen der Abbildungsoptik 5 und dem Aufnahmesensor 4 ist ein teiltransparenter Spiegel 7 angeordnet, der die Strahlung zur Abbildung der Probe 3 auf den Aufnahmesensor 4 nahezu unverändert durchläßt und die Fokusmeßstrahlung (z. B. Infrarotstrahlung) auf einen Fokusmeßsensor 8 lenkt. Die Fokusmeßstrahlung wird z. B. mit einer im Bereich des Fokusmeßsensors 8 angeordneten Strahlungsquelle (nicht gezeigt) erzeugt, über den Spiegel 7 und die Abbildungsoptik 5 auf die Probe 3 abgebildet, von der Probe 3 reflektiert und über die Abbildungsoptik 5 und den Spiegel 7, wie bereits erwähnt, auf den Fokusmeßsensor 8 gelenkt. Der Fokusmeßsensor 8 gibt ein Signal an eine Steuereinheit 9 des Mikroskopes 1 aus. Ferner ist die Steuereinheit 9 noch mit der Bewegungseinheit 6 verbunden.
Mit der Bewegungseinheit 6 kann der Abstand (in Beobachtungsrichtung) zwischen der Abbildungsoptik 5 und dem Probentisch 2 und somit der Probe 3 verändert werden. Dies ist durch die Linien 12 und 13 angedeutet. Bevorzugt bewegt die Bewegungseinheit 6 entweder nur die Abbildungsoptik 5 oder den Probentisch 2. Dies vereinfacht den mechanischen Aufbau.
Die Steuereinheit 9 dient zur Steuerung des Mikroskopes und insbesondere zur Durchführung einer Bildaufnahme der Probe 3.
Der Aufnahmesensor 4 ist mit einem nicht gezeigten Steuermodul verbunden.
Die Steuereinheit 9 ist mit einer Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 verbunden, die beispielsweise als berührungsempfindlicher Bildschirm ausgebildet ist.
Ferner enthält die Steuereinheit 9 eine Haltefokuseinheit 11 mit zumindest einem Hardwareelement 12 und einem Softwaremodul 13. Die Haltefokuseinheit 11 kann in einen ersten Zustand, in dem sie zur Beibehaltung einer vorbestimmten Fokuslage mittels der Bewegungseinheit 6 den Abstand zwischen Probentisch 2 und Abbildungsoptik 5 ändert, und in einem zweiten Zustand, in dem sie keine Abstandsänderung bewirkt, gesetzt werden. Die Haltefokuseinheit 11 wird bevorzugt bei mikroskopischen Untersuchungen, die sich zeitlich über mehrere Stunden oder sogar mehrere Tage erstrecken können, in den ersten Zustand gesetzt, um zu gewährleisten, daß die vorbestimmte Fokuslage dauerhaft beibehalten wird.
Wie in der schematischen Darstellung von 1 angedeutet ist, ist die Haltefokuseinheit 11 sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit 9 des Mikroskopes 1 integriert. Dadurch kann die Haltefokuseinheit 11 über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 bedient werden und ist Bestandteil der Softwareumgebung der Steuereinheit 9, so daß die Haltefokuseinheit 11 direkt mit allen Systemkomponenten der Steuereinheit 9 bzw. des Mikroskopes 1 kommunizieren kann. Die Systemkomponenten können jedoch auch mit der Haltefokuseinheit 11 kommunizieren. So können beispielsweise Informationen der Haltefokuseinheit 11 von den Systemkomponenten abgefragt und für den Betrieb des Mikroskopes 1 verwendet werden.
Durch diese vollständige Integration der Haltefokuseinheit 11 in die Steuereinheit 9 des Mikroskopes 1 ist auch kein zusätzliches Bedienteil für die Haltefokuseinheit 11 notwendig. Alle Funktionalitäten der Haltefokuseinheit 11 können über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 bedient werden. Die gewählten Betriebszustände oder auch Fehlerzustände der Haltefokuseinheit 11 können wiederum über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 dem Benutzer angezeigt werden. Die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 kann somit zur interaktiven Steuerung bzw. Einstellung der Haltefokuseinheit 11 verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann daher die Haltefokuseinheit 11 direkt in das Bedienkonzept des Mikroskopes 1 eingebunden werden, ohne daß eine weitere Bedienkonsole notwendig ist.
Das Hardwareelement 12 der Haltefokuseinheit, das beispielsweise der Controller sein kann, kann an das interne Bussystem (nicht gezeigt) des Mikroskops 1 angeschlossen sein. Die Haltefokuseinheit 11 kann so in die Steuereinheit 9 integriert sein, daß die Steuereinheit 9 einerseits und die Haltefokuseinheit 11 voneinander getrennt ein- und ausgeschaltet werden können.
Wenn die Steuereinheit 9 ausgeschaltet ist und die Haltefokuseinheit 11 eingeschaltet wird, versucht die Haltefokuseinheit 11 einmalig über das Bussystem Kontakt mit der Steuereinheit 9 aufzunehmen. Dies ist wegen der ausgeschalteten Steuereinheit 9 nicht möglich.
Wird nun die Steuereinheit 9 eingeschaltet, fragt diese nach vorhandenen Komponenten. In diesem Fall würde sich die Haltefokuseinheit 11 anmelden. Dies führt dazu, daß die entsprechenden Ausgaben und Anzeigen auf der Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 angepaßt werden, um auch die Haltefokuseinheit 11 steuern zu können.
Wenn die Steuereinheit 9 eingeschaltet ist und dabei noch kein Kontakt mit der Haltefokuseinheit 11 vorliegt, wird auf der Ausgabe-/Eingabeeinheit bezüglich der Haltefokuseinheit keine Ausgabe erzeugt. Wenn nun die Haltefokuseinheit 11 eingeschaltet wird, erfolgt die Anmeldung der Steuereinheit 9 über das Bussystem und als Folge davon wird die Anzeige der Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 aktualisiert.
Durch die Integration der Haltefokuseinheit 11 in die Steuereinheit 9 kann die Haltefokuseinheit 11 auf alle technisch relevanten Daten des Mikroskopes 1 zugreifen. Bei den technisch relevanten Daten handelt es sich insbesondere um den Objektivtyp mit Objektivrevolverposition, wenn die Abbildungsoptik 5 als Objektivrevolver mit mehreren Objektiven ausgebildet ist, und die vom entsprechenden Objektiv abgeleiteten Objektivdaten, wie z. B. Vergrößerung, Apertur, Immersion, Schärfentiefenbereich, verwendeter Wellenlängenbereich.
Ferner kann es sich bei den technisch relevanten Daten um die verwendete Beleuchtung (z. B. Auflicht, Durchlicht, Fluoreszenz), LSM-Aktivitäten (LSM = Laser Scanning Mikroskop), Laserexposition, z-Position des Probentisches, der Status anderer Komponenten im System sowie um ein gegebenenfalls verwendetes Kontrastverfahren (wie z. B. DIC = differentieller Interferenz Kontrast, Ph = Phasenkontrast, Varel-Kontrast, ...) handeln.
Bei einem angeschlossenen Inkubator können natürlich auch die technisch relevanten Daten des Inkubators (wie z. B. die Temperatur) berücksichtigt werden.
Ferner können diese Komponenten direkt von der Haltefokuseinheit 11 beeinflußt werden. So kann die Haltefokuseinheit 11, falls es erforderlich ist, einen Objektivwechsel durchführen, einen Shutter bzw. eine Blende betätigen, den ACR-Inhalt (ACR = Automatic Component Recognition = automatische Komponentenerkennung) von Objektiven auslesen bzw. aktualisieren (also schreiben) oder beispielsweise die Helligkeit der Beleuchtung des Mikroskopes steuern.
Damit die Haltefokuseinheit 11 die vorbestimmte Fokuslage beibehalten kann, sind Kenntnisse über die Abbildungsoptik 5 notwendig, insbesondere die Vergrößerung der Abbildungsoptik 5. Unter Umständen kann diese der Steuereinheit 9 nicht bekannt sein oder der vorliegende Eintrag kann nicht korrekt sein. In diesem Fall würde die Haltefokuseinheit 11 die vorbestimmte Fokuslage nicht sicher beibehalten können.
Die Haltefokuseinheit 11 weist die Möglichkeit auf, die Vergrößerung der Abbildungsoptik 5 feststellen zu können.
Dazu legt man auf den Probentisch 2 als Probe eine Glasplatte mit genügender Dicke (ca. 1 mm), vorzugsweise einen Objektträger oder einen Spiegel auf. Auf diese Probe 3 wird fokussiert, so daß die Abbildungsoptik 5 in der schematisch in 2 gezeigten rechten Stellung relativ zur Probe 3 positioniert ist. Dies führt auf dem Fokusmeßsensor 8 zu dem rechten Signal S1 (3).
Dann wird über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 der Menüpunkt zur Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik 5 aufgerufen. Daraufhin steuert die Haltefokuseinheit 11 die Bewegungseinheit 6 so an, daß der Abstand zwischen der Abbildungsoptik 5 und der Probe 3 vergrößert wird. Der Abstand wird so lange vergrößert, bis das Signal auf dem Fokusmeßsensor 8 von der rechten Seite bis zur linken Seite gewandert ist (3). Das dann vorliegende Signal S2 ist in 3 gestrichelt dargestellt. In gleicher Weise ist die dann vorliegende Position der Abbildungsoptik 5 in 2 gestrichelt eingezeichnet.
Aus der Abstandsänderung Δz sowie der auf dem Aufnahmesensor 4 vorliegenden Signalverschiebung ΔC läßt sich gemäß der nachfolgenden Formel (1) die Vergrößerung v der Abbildungsoptik 5 berechnen:
Diese Formel ergibt sich für die konkrete Ausbildung des erfindungsgemäßen Mikroskops von 1 aus der nachfolgenden Formel (2):
Der Formel (2) liegt zugrunde, daß eine nicht gezeigte Fokusoptik vor dem Fokusmeßsensor 8 ein Prüfobjektiv mit der Brennweite f'_P und eine Tubuslinse mit der Brennweite f_TL aufweist, zwischen der optischen Achse der Fokusoptik und der Senkrechten des Fokusmeßsensors 8 ein Winkel α vorliegt, n die Brechzahl des Immersionsmediums ist und der Abstand benachbarter Pixel des Fokusmeßsensors 8 k2 beträgt. Mit den vorliegenden Werten von α = 50°, f'_P = 16,559 mm, f_TL = 164,5 mm und k2 = 6,7 μm gelangt man dann zu der obigen Formel (1) für die Vergrößerung v, wobei k1 = sinα·k2 = 253,26. Die Brechzahl n beträgt für Luft beispielsweise 1, für Wasser beispielsweise 1,328 und für Glycerin beispielsweise 1,4477.
Die so berechnete Vergrößerung v der Abbildungsoptik 5 verwendet dann die Haltefokuseinheit 11 für die Haltefokusregelung, wenn z. B. der Haltefokuseinheit keine Vergrößerung (beispielsweise aus den Systemdaten des Mikroskops) bekannt ist.
Man kann beispielsweise diese Bestimmung der Vergrößerung v der Abbildungsoptik 5 auch während der Regelung des Haltefokus automatisch durchführen lassen, wenn gewisse Grenzwerte des Regelverhaltens (Geschwindigkeit, Genauigkeit, etc.) überschritten werden.
Natürlich ist es auch möglich, einen Menüpunkt über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 anzuzeigen, der dem Bediener ermöglicht, die beschriebene Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik 5 von der Haltefokuseinheit 11 durchführen zu lassen. Die dabei ermittelte Vergrößerung kann dann bei der Verwendung von ACR-Objektiven im entsprechenden ACR-Chip des Objektives hinterlegt werden. Dies kann natürlich abhängig von einer notwendigen Eingabe des Bedieners durchgeführt werden.
Die Haltefokuseinheit 11 kann so ausgebildet sein, daß sie, wenn sie beispielsweise von dem Bediener eingeschaltet wird, alle für die Regelung notwendigen Einstellparameter ausliest und für die Regelung verwendet. Dies kann automatisch und ohne weitere Kenntnis des Bedieners erfolgen, wenn beispielsweise ACR-Objektive verwendet werden. Diese Objektive haben alle erforderlichen Informationen im dem Objektiv zugeordneten ACR-Chip gespeichert. Hierbei wird die Definition des Objektivs automatisch mit seinen Einstellparametern in der Steuereinheit 9 hinterlegt, sobald der Bediener das Einlesen aktiviert.
Alternativ besteht die Möglichkeit, bei jedem Objektivwechsel die ACR-Information neu zu lesen und in der Steuereinheit 9 zu hinterlegen, um den Objektiveintrag möglichst aktuell zu halten.
Ferner besteht die Möglichkeit, das Objektiv manuell über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 oder auch über eine extern zugreifende Software zu definieren. Hierbei kann die Zuordnung des Objektivs über einen Eintrag des Objektivnamens oder die Bestellnummer erleichtert werden. Die für die Haltefokuseinheit 11 notwendigen Parameter werden dann automatisch mit eingetragen.
Ferner ist es möglich, daß die Haltefokuseinheit 11 ihre gewonnenen Erkenntnisse bzw. Kenngrößen in den Speicherchip des Objektivs, sofern ein entsprechendes Objektiv verwendet wird, ablegt. Zusätzlich oder alternativ können die gewonnenen Erkenntnisse bzw. Kenngrößen in den Systemspeicher der Steuereinheit 9 hinterlegt werden. In diesem Fall wären diese Erkenntnisse bzw. Kenngrößen auch für andere von außen zugreifende Komponenten verfügbar.
Die Proben 3 sind häufig nicht direkt auf dem Probentisch 2 bzw. zwischen der Probe 3 und der Abbildungsoptik 5 ist häufig ein Deckglas (bei aufrechter Mikroskopie, nicht gezeigt) oder der Boden eines Kulturgefäßes bzw. einer Petrischale ist zwischen Probe 3 und der Abbildungsoptik, wie z. B. bei der inversen Mikroskopie, die in 1 angedeutet ist. Für eine gute Bildaufnahme ist es erforderlich, die Dicke des Deckglases bzw. die Bodendicke genau zu kennen. In diesem Fall können die dafür ausgelegten Objektive der Abbildungsoptik dann unter Kenntnis der Dicke entsprechend mittels eines Einstellringes korrigiert werden.
Um diese Dicke genau ermitteln zu können, können beispielsweise die beiden Reflexe, die an den beiden Grenzflächen des Deckglases (nachfolgend wird der Begriff Deckglas für Deckglas oder auch für den Boden eines Gefäßes, in dem die Probe angeordnet ist, verwendet) zum umgebenden Medium 11 erzeugt werden (wie in 4 angedeutet ist), ausgewertet werden. Die beiden Reflexe R1, R2 sind mit dem Fokussensor 8 erfaßbar, wobei der Reflex R1 der Reflex an der Oberseite des Deckglases DG ist und der Reflex R2 der Reflex an der Unterseite des Deckglases DG ist. Die Vergrößerung der Abbildungsoptik 5 ist dabei so zu wählen, daß beide Reflexe R1, R2 auf dem Fokusmeßsensor 8 abgebildet sind.
Aus dem auf dem Sensor 8 vorliegenden Abstand ΔC zwischen den beiden Reflexen R1 und R2 kann gemäß der nachfolgenden Formel (3) die Dicke d des Deckglases DG ermittelt werden:
wobei Δz sich aus der obigen Formel (2) unter Kenntnis von ΔC und dem Vergrößerungsfaktor v der Abbildungsoptik 5 ergibt. n ist wiederum die Brechzahl des Immersionsmediums und n_DG ist die Brechzahl des Deckglases.
Alternativ kann man die Vergrößerung der Abbildungsoptik 5 so wählen, daß nur der Reflex der vorderen oder der hinteren Grenzfläche im Fokusmeßsensor 8 erfaßt wird. In einer ersten Stellung wird dabei bevorzugt zunächst der Reflex R1 der Oberseite ermittelt (6 und 7a).
Dann wird der Abstand zwischen Deckglas DG und Abbildungsoptik 5 so verändert, daß der Reflex R2 der Unterseite (gestrichelte Darstellung in 6 und 7b) an der gleichen Position im Fokusmeßsensor 8 liegt, wie der erste Reflex R1. Diese Schritte werden bevorzugt automatisch durchgeführt, z. B. auf Anforderung durch den Bediener.
Aus der dazu nötigen Abstandsänderung Δz kann gemäß der obigen Formel 3 dann die Deckglasdicke d berechnet werden.
Die Fokussuche kann mit der Haltefokuseinheit 11 wie folgt durchgeführt werden. Zunächst wird der Abstand zwischen der Abbildungsoptik 5 und der Probe 3 durch den Bediener auf einen minimalen Wert eingestellt. Die Abbildungsoptik ist somit also sehr nahe an der Probe. Dann wird über die Ausgabe-/Eingabeeinheit 10 der Menüpunkt Fokussuche ausgewählt.
Die Haltefokuseinheit 11 steuert dann die Bewegungseinheit 6 so an, daß der Abstand zwischen Probe 3 und Abbildungsoptik 5 vergrößert wird. Während dieser Abstandsänderung werden vorzugsweise in definierten Wegabständen Δz_KG die mittels des Fokusmeßsensors 8 ermittelten Haltefokussignale erfaßt und abgespeichert. Die Wegabstände Δz_KG sind bevorzugt so gewählt, daß sich die Haltefokussignale des Fokusmeßsensors 8 in z-Richtung (Beobachtungsrichtung) überlappen. Dies ist in 9 schematisch dadurch dargestellt, daß die entsprechenden Abbildungen des Fokusmeßsensors 8 überlappend dargestellt sind. Anhand der Fokusmeßsignale M1–M3 wird dann die vorbestimmte Fokuslage ermittelt, die für die Haltefokusregelung verwendet wird. Man kann beispielsweise die maximale Amplitude des Fokussignals aus den Fokussignalen M1–M3 als vorbestimmte Fokuslage als wahrscheinlichste Fokusebene und somit vorbestimmte Fokuslage annehmen.
Bei der Verwendung einer Abbildungsoptik, bei der das Objektiv kein Immersionsmedium benutzt und somit als Luft-Mikroskopobjektiv bezeichnet werden kann, können beim Durchfahren des erwarteten Fokusbereiches zumindest zwei auswertbare Haltefokussignale erkannt werden, die der Grenzfläche zwischen der oberen Glasbodenebene und der Probe 3 (z. B. Einbettflüssigkeit (meistens Wasser) von Zellen) sowie der Grenzfläche zwischen der unteren Glasbodenebene und der Luft entsprechen. Wird der Reflex der Grenzfläche zwischen der unteren Glasbodenebene und der Luft als Bezugsfläche verwendet, die parallel zur Fokusebene liegt, muß die Fokusebene um die Bodenglasdicke versetzt angefahren werden. Dazu muß die Bodenglasdicke bekannt sein, ermittelt oder eingegeben werden.
Bei Wasser-immergierten Objektiven wird man zwei etwa gleich starke Haltefokus-Signale erkennen. Das erste Signal ist der Fokusebene sehr nah und wird dabei als wahrscheinlichste Fokusebene erkannt.
Bei Immersionsmedien, die einen Brechindex nahe des Brechungsindexes des Glasbodens aufweisen, entfällt der Reflex zwischen Glasboden und Immersionsmedium. In diesem Fall wird mit hoher Wahrscheinlichkeit der Reflex zwischen der Probe (z. B. dem Einbettmedium der Zellen) und des Kulturgefäß-Materials detektiert, der wiederum nahe der Fokusebene liegt.
Bevorzugt werden bei den Aufnahmen mittels des Fokusmeßsensors gleich Auswertungen anhand üblicher Haltefokuskriterien durchgeführt. Hierbei können Filtertechniken und Schwellwertbetrachtungen herangezogen werden, die schon eine Vorselektion dahingehend durchführen, ob es sich bei dem detektierten Signal überhaupt um ein Haltefokussignal handeln kann. Es kann daher vorkommen, daß z. B. nur in einer Aufnahme M2 das Haltefokussignal erkannt wird. Die anderen Aufnahmen M1, M3 signalisieren, daß dort kein Fokus zu erwarten ist.
Erkennt die Haltefokuseinheit 11 allerdings mehrere Bereiche (Aufnahmen M1–M3) als möglichen Fokus, da auch in diesen Aufnahmen Haltefokussignale erkannt werden, so können die Bereiche bzw. Aufnahmen nach den oben beschriebenen Kriterien, der Amplitude, dem Rauschverhalten, der Signalqualität und/oder der realistischen Einschätzung der Ebene zum Startpunkt etc. ausgewertet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- WO 2007/144197 A1 [0020, 0020]

Claims

Mikroskop mit einem Probentisch (2) zum Tragen einer zu untersuchenden Probe (3), einem Aufnahmesensor (4), einer Abbildungsoptik (5) zum Abbilden der Probe (3) auf den Aufnahmesensor (4), einer Bewegungseinheit (6), mit der der Abstand zwischen Probentisch (2) und Abbildungsoptik (5) verändert werden kann, einer Steuereinheit (9) zur Steuerung einer Bildaufnahme der Probe (3) und einer Haltefokuseinheit (11) zum Beibehalten einer vorbestimmten Fokuslage für zeitlich zueinander beabstandete Bildaufnahmen der Probe (3), wobei die Haltefokuseinrichtung (11) zumindest ein Hardwareelement (12) und ein Softwaremodul (13) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltefokuseinheit (11) sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit (9) integriert ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit der Haltefokuseinheit (11) verschiedene Betriebsmodi des Mikroskops umgesetzt werden können.
Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Betriebsmodus die Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Betriebsmodus die Bestimmung der Dicke eines Deckglases, unter dem die Probe liegt, oder der Dicke des Bodens eines Gefäßes, in dem die Probe angeordnet ist, ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Betriebsmodus die Ermittlung der vorbestimmten Fokusebene ist.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltefokuseinheit neben der Bewegungseinheit weitere Komponenten des Mikroskopes ansteuert.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltefokuseinheit zur Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage auf Daten zugreift, die eine oder mehrere technische Eigenschaften des Mikroskopes beschreiben.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltefokuseinheit zur Beibehaltung der vorbestimmten Fokuslage die Vergrößerung der Abbildungsoptik berücksichtigt.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinheit (9) einen zugeordneten Speicher aufweist, auf den die Haltefokuseinheit (11) schreibend und/oder lesend zugreifen kann.
Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Speicher der Steuereinheit (9) weitere Komponenten des Mikroskops zugreifen können.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungsoptik (5) zumindest ein Objektiv mit einem Speicher aufweist, auf den die Haltefokuseinheit (11) schreibend und/oder lesend zugreifen kann.
Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Speicher des Objektivs weitere Komponenten des Mikroskops zugreifen können.
Mikroskopierverfahren, bei dem unter Steuerung einer Steuereinheit zeitlich zueinander beabstandete Aufnahmen einer zu untersuchenden Probe über eine Abbildungsoptik, die die Probe auf einen Aufnahmesensor abbildet, aufgenommen werden, wobei eine Haltefokuseinheit, die zumindest ein Hardwareelement und ein Softwaremodul enthält, zum Beibehalten einer vorbestimmten Fokuslage für die zeitlich zueinander beabstandeten Bildaufnahmen der Probe vorgesehen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltefokuseinheit sowohl software- als auch hardwareseitig vollständig in die Steuereinheit integriert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mittels der Haltefokuseinheit die Dicke eines Deckglases, unter dem die Probe liegt, oder der Dicke des Bodens eines Gefäßes, in dem die Probe angeordnet ist, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Dickenbestimmung die Haltefokuseinheit das Deckglas bzw. den Gefäßboden beleuchtet und die dabei an Ober- und Unterseite des Deckglases bzw. des Gefäßbodens erzeugten unter gleichen Abbildungsbedingungen Reflexe detektiert und daraus die zu bestimmende Dicke ableitet.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Dickenbestimmung die Haltefokuseinheit das Deckglas bzw. den Gefäßboden beleuchtet, den Abstand zwischen Abbildungsoptik und Deckglas bzw. Gefäßboden so ändert, daß zeitlich nacheinander der an Ober- und Unterseite des Deckglases bzw. des Gefäßbodens erzeugte Reflex detektiert und daraus unter Berücksichtigung der Abstandsänderung die zu bestimmende Dicke abgeleitet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß mittels der Haltefokuseinheit die vorbestimmte Fokusebene für die Bildaufnahme eingestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß mittels der Haltefokuseinheit die Vergrößerung der Abbildungsoptik bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik – die Haltefokuseinheit die zu untersuchende Probe über die Abbildungsoptik detektiert, – den Abstand zwischen Abbildungsoptik und Probe variiert – und die sich dabei ergebende Änderung des detektierten Signals in Bezug zur Änderung des Abstandes von Abbildungsoptik und Probe zur Bestimmung der Vergrößerung der Abbildungsoptik verwendet.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die sich ergebende Änderung eine Verschiebung des detektierten Signals in einer Ebene eines Fokusmeßsensors der Haltefokuseinheit ist.