DE102011084562A1

DE102011084562A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung und Korrektur von sphärischen Abbildungsfehlern in einem mikroskopischen Abbildungsstrahlengang

Info

Publication number: DE102011084562A1
Application number: DE102011084562A
Authority: DE
Inventors: Dr. Knebel Werner; Tobias Bauer; Peter Euteneuer
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2031-10-15
Also published as: JP6097516B2; DE102011084562B4; JP2013088809A; CN103048779B; US20130094016A1; US8724103B2; CN103048779A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung eines sphärischen Fehlers eines Mikroskop-Abbildungsstrahlengangs (7) bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe (9) mittels eines ein Objektiv (10) aufweisenden Mikroskops (1), wobei ein die Probe (9) tragendes oder bedeckendes Deckglas (2) im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist, wobei ein Messstrahl (130) dezentriert außerhalb der optischen Achse (8) des Objektivs (10) durch das Objektiv (10) auf die Probe (9) und der an der Grenzfläche (116) des Deckglases zur Probe (9) reflektierte Messstrahl (132) über das Objektiv (10) auf einen Detektor (128) geleitet wird, der das Intensitätsprofil des reflektierten Messstrahls (132) aufnimmt, und wobei aus diesem Intensitätsprofil das Vorliegen eines sphärischen Fehlers qualitativ und/oder quantitativ bestimmt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Feststellung und Korrektur eines sphärischen Fehlers bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe mittels eines ein Objektiv aufweisenden Mikroskops, wobei ein die Probe tragendes oder ein die Probe bedeckendes Deckglas im Abbildungsstrahlengang des Mikroskops angeordnet ist.
Stand der Technik
Für mikroskopische Untersuchungen werden die zu untersuchenden Proben meist auf oder unter Deckgläser oder in großflächige Probenkammern (Wellplates, Microtiter Platten, Laptek Platten) gebracht. Es existieren verschiedene Deckglasdicken, insbesondere kann die Deckglasdicke bei den genannten Probenkammern merklich schwanken. Unterschiedliche Deckglasdicken beeinträchtigen die optische Performance des Systems, wenn das Deckglas im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist. Bei einem Screening mit großflächiger Probenkammer führt eine Schwankung der Deckglasdicke zu verminderter Abbildungsgüte (insbesondere werden Kontrast und auch Auflösung negativ beeinflusst). Dieser auch als "sphärischer Fehler" bezeichnete Abbildungsfehler kann durch ein zusätzliches verstellbares Korrekturlinsenglied korrigiert werden. Dieses Linsenglied ist meist innerhalb des Objektivs angebracht, wobei die Einstellung meist manuell über einen sogenannten Korrekturring an der äußeren Hülse des Objektivs erfolgt. Das Korrekturlinsenglied lässt idealerweise den eingestellten Fokus unverändert.
Die DE 43 23 721 C2 behandelt ein solches Mikroskopobjektiv mit Korrekturvorrichtung zur Anpassung an unterschiedliche Deckglasdicken, wobei in dieser Schrift vorgeschlagen wird, dass die Korrekturfassung mit dem Korrekturlinsenglied sowohl entlang der optischen Achse axial verschiebbar als auch um die optische Achse radial drehbar ist. Insbesondere sollen zwei derartige Korrekturfassungen vorhanden sein. Durch die vorgeschlagene Maßnahme soll eine äußerst gleichmäßige und klemmfreie Verschiebung der Korrekturfassung innerhalb des Mikroskopobjektivs ermöglicht werden. Das dort vorgeschlagene Objektiv soll eine Korrektur der Deckglasdicke von 0 mm bis 2 mm ermöglichen.
Die DE 10 2007 002 863 B3 beschreibt ebenfalls eine zur Deckglasdickenkorrektur geeignete Verstellvorrichtung für Mikroskopobjektive, wobei die Verstellvorrichtung manuell betätigt wird. Werden Deckgläser unterschiedlicher Dicke bei der mikroskopischen Untersuchung verwendet, so muss die manuelle Korrektur für jede neue Deckglasdicke erneut durchgeführt werden. Dies ist zeitaufwendig und erschwert die Handhabung des Mikroskops.
Aus der US 7,593,173 B2 ist eine motorische Verstellvorrichtung zur Deckglasdickenkorrektur bekannt. Diese Verstellvorrichtung weist einen auf einem Objektivrevolver montierten Antriebsmotor auf, dessen Antriebswelle wahlweise mit einem von mehreren an dem Objektivrevolver gehaltenen Mikroskopobjektiven koppelbar ist. Jedes der Mikroskopobjektive besitzt einen mit besagter Antriebswelle in Eingriff zu bringenden Korrekturring der eingangs beschriebenen Art.
Es hat sich gezeigt, dass neben den oben angesprochenen unterschiedlichen Deckglasdicken und/oder Deckglasdickenschwankungen weitere Parameter bei der mikroskopischen Untersuchung zu sphärischen Fehlern des Objektivs beitragen können. Dies sind insbesondere Art und Temperatur eines eingesetzten Immersionsmediums sowie Material und Struktur des Deckglases. Deckgläser werden meist aus Floatglas, das insbesondere für LED-Abdeckungen weiter verwendet wird, gefertigt. Solches Floatglas weist unterschiedliche Ebenheit und Homogenität auf. Immersionsmedien (Immersionsöl, Wasser oder Glycerin) werden häufig zu verschiedenen Zwecken zwischen Mikroskopobjektiv und Deckglas gebracht, wobei dann das Mikroskopobjektiv als Immersionsobjektiv verwendet wird, welches mit der Frontlinse in das Immersionsmedium eintaucht. Öl-Immersionsobjektive dienen zur Steigerung der erzielbaren Auflösung. Wasserimmersion wird häufig zur Beobachtung von lebenden Zellen oder Gewebe eingesetzt, um ein Austrocknen des Präparats zu vermeiden. Allgemein können Immersionsmedien kontrastsenkende Reflexionen aufgrund starker Brechungsindexwechsel an den Grenzflächen verringern. Insbesondere bei lang dauernden Screenings von Präparaten ändert sich während der Untersuchung die Temperatur des jeweiligen Immersionsmediums. Dies hat entsprechende Änderungen der Abbildungsqualität zur Folge.
Aberrationen aufgrund der oben beschriebenen Effekte seien im Folgenden als "sphärische Fehler" definiert. Die bekannten Methoden der Deckglasdickenkompensation reichen nicht aus, um sämtliche sphärischen Fehler zu beseitigen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, die Abbildungsgüte bei der mikroskopischen Probenuntersuchung durch weitestgehend automatische Korrektur auftretender sphärischer Fehler zu steigern.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Feststellung eines sphärischen Fehlers bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe mittels eines ein Objektiv aufweisenden Mikroskops vorgeschlagen, wobei ein die Probe tragendes oder bedeckendes Deckglas im Abbildungsstrahlengang des Mikroskops angeordnet ist, wobei ein Messstrahl dezentriert außerhalb der optischen Achse des Objektivs durch das Objektiv auf die Probe geleitet und der an der Grenzfläche des Deckglases zur Probe reflektierte Messstrahl über das Objektiv auf einen Detektor geleitet wird, der das Intensitätsprofil des reflektierten Messstrahls aufnimmt. Durch qualitative und/oder quantitative Auswertung dieses Intensitätsprofils lässt sich das Vorliegen eines sphärischen Fehlers feststellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine entsprechende Vorrichtung zur Feststellung eines sphärischen Fehlers bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe mittels eines ein Objektiv aufweisenden Mikroskops, wobei ein die Probe tragendes oder bedeckendes Deckglas im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist. Diese Vorrichtung weist eine Einkoppelungseinrichtung zur Einkoppelung eines Messstrahls in den Abbildungsstrahlengang des Mikroskops derart, dass der Messstrahl dezentriert außerhalb der optischen Achse des Objektivs durch das Objektiv auf die Probe fällt, eine Auskoppeleinrichtung zur Auskoppelung des an der Grenzfläche des Deckglases zur Probe reflektierten Messstrahls nach Durchtritt durch das Objektiv aus dem Abbildungsstrahlengang des Mikroskops, einen Detektor, auf den der Messstrahl nach Auskoppelung aus dem Abbildungsstrahlengang fällt, und der ein (wellenlängenabhängiges) Intensitätsprofil dieses Messstrahls aufnimmt, und eine Auswerteeinheit zur Auswertung des Intensitätsprofils zur Feststellung eines sphärischen Fehlers auf.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung sowie der beiliegenden Zeichnung.
Vorteile der Erfindung
Es hat sich gezeigt, dass das Intensitätsprofil eines in besagter Weise an der Grenzfläche des Deckglases zur Probe reflektierten Messstrahls sensitiv für die in der Beschreibungseinleitung genannten Ursachen von sphärischen Fehlern ist. Das ideale, bei Abwesenheit von sphärischen Fehlern vorliegende Intensitätsprofil verändert seine Form, wenn sphärische Fehler beispielsweise aufgrund von Deckglasdickenänderungen, Temperaturschwankungen eines Immersionsmediums oder Strukturänderungen des Deckglases auftreten. Bestimmte Kenngrößen des idealen Intensitätsprofils können folglich als Regelgröße verwendet werden, um bei Abweichungen, also beim Auftreten sphärischer Fehler, diese zu kompensieren. Diese Kompensation kann somit in Echtzeit erfolgen, also (nahezu) verzögerungsfrei. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Deckglasdicke oder Änderungen in der Deckglasdicke nicht bekannt sein oder bestimmt werden müssen, damit auftretende sphärische Fehler korrigiert werden können. Die Erfindung kann zur Kompensation sphärischer Fehler eingesetzt werden, unabhängig davon, aufgrund welcher Ursache der sphärische Fehler auftritt.
Die Form des Intensitätsprofiles kann hinsichtlich verschiedener Kenngrößen ausgewertet werden. Dabei sind vor allem die Größen, die die Signalbreite, Signalhöhe oder die Flankensteigung beschreiben, besonders sinnvoll. Beispielsweise kann die Halbwertsbreite des Profils bestimmt werden. Diese nimmt bei vorhandenem sphärischem Fehler zu. Alternativ oder zusätzlich kann die Flankensteilheit des Intensitätsprofils bestimmt werden. In einfacher Form ist dies beispielsweise durch Bilden eines Differenzenquotienten möglich. Die Flankensteilheit nimmt mit dem sphärischen Fehler ab. Die Signalhöhe lässt sich in einfacher Weise mittels Bestimmung des Maximalwertes ermitteln. Umsetzungstechnisch anspruchsvoller aber numerisch stabiler erweisen sich modellbasierte Verfahren zur Auswertung des Signals, die auf einer Anpassung des Intensitätsverlaufs an eine das Profil beschreibende Funktion basieren. So ist es beispielsweise möglich das gesamte Signal oder Teile des Signales (die Flanken) durch eine Gauß-Funktion zu approximieren und aus den so ermittelten Parametern direkt Kenngrößen für Breite oder Flankensteigung zu erhalten. Auch abschnittsweise Anpassungen an andere Funktionen, wie beispielsweise Polynome verschiedener Ordnungen, ermöglichen Breiten- und Steigungsauswertungen.
Die Erfindung ist insbesondere sensitiv und somit praktisch einsetzbar beim Auftreten eines sphärischen Fehlers aufgrund einer Änderung der optischen Eigenschaften des Deckglases und/oder einer Änderung der optischen Eigenschaften eines Immersionsmediums. Hierunter fallen, wie bereits besprochen, Deckglasdickenänderungen und -schwankungen, Struktur- oder Materialänderungen im Deckglas sowie Temperaturänderungen des Immersionsmediums.
Der zur Feststellung eines sphärischen Fehlers eingesetzte Messstrahl kann beispielsweise in einfacher Weise durch Beleuchtung einer Spalt- oder Lochblende mit nachgeschalteter Beleuchtungsoptik erzeugt werden, so dass auf der Probe, genauer auf der Grenzfläche des Deckglases zur Probe, mittels des Mikroskopobjektivs ein Bild der Spalt- oder Lochblende erzeugt wird.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann der Messstrahl zur Feststellung eines sphärischen Fehlers zusätzlich als Autofokusmessstrahl einer triangulierenden Autofokuseinheit verwendet werden. Umgekehrt kann bei vorhandener triangulierender Autofokuseinheit zur Einstellung und/oder zum Halten des Fokus des Objektivs der Autofokusmessstrahl dieser Autofokuseinheit zusätzlich als Messstrahl zur Feststellung eines sphärischen Fehlers verwendet werden.
Eine triangulierende Autofokuseinrichtung ist beispielsweise aus der US 5,136,149 B1 bekannt. Die DE 195 37 376 A1 diskutiert diese US-Patentschrift und bezeichnet das dort beschriebene Autofokus-Prinzip als "triangulierendes" Autofokus-Prinzip. Dieses soll anhand der beigefügten 1 näher erläutert werden, die dem triangulierenden Autofokus-Prinzip aus der erwähnten US 5,136,149 B1 entspricht. Hier ist eine Autofokus-Lichtquelle 19 derart angeordnet, dass nach Umlenkung des Autofokusmessstrahls 30 und Durchtritt desselbigen durch das Mikroskopobjektiv 10 die Objektebene 16 schräg vom Autofokusmessstrahl 30 getroffen wird. Die Autofokussierungsabtasteinheit beinhaltet einen ortsauflösenden Autofokus-Detektor 28 zum Detektieren einer seitlichen Versetzung des Strahls (wie weiter unten beschrieben) sowie einen Motor 27 zum Bewegen des Objektivs 10. Alternativ kann zur Fokussierung die Objektebene 16 in Richtung der optischen Achse 8 (also in z-Richtung, wie in 1 dargestellt) verschoben werden.
Lediglich sehr schematisch sind in 1 als weitere Komponenten des Mikroskops eine Tubuslinse 12 und die Bildebene 14 dargestellt. Bei der Autofokuseinrichtung gemäß 1 wird der mit 30 bezeichnete Autofokusmessstrahl durch den Strahlteiler 20 an einem Punkt A in eine Hälfte des Strahlenquerschnitts (bezogen auf die optische Achse 8) abgelenkt. Der abgelenkte Strahl 30 wird durch das Objektiv 10 derart abgelenkt, um die Objektebene 16 an einem Reflexionspunkt C in einem Winkel α schräg bzw. schief zu treffen. Der Strahl 30 wird als reflektierter Autofokusmessstrahl 32 reflektiert bzw. remittiert und anschließend über das Objektiv 10 wiederum durch den Strahlteiler 20 an einem Punkt B auf der anderen Seite des Strahlengangs, bezogen auf die Lage des Punktes A relativ zur optischen Achse 8, abgelenkt. Der abgelenkte Strahl 32 fällt dann auf den Detektor 28, beispielsweise einen positionsempfindlichen Detektor (PSD). Dessen Ausgangssignal hängt von dem Ort, an welchem der Strahl 32 auftrifft, ab, so dass der Ort dadurch bestimmt ist.
Im Falle einer Defokussierung, im vorliegenden Beispiel gemäß 1 also einer Verschiebung der Objektebene 16 in die Ebene 16', wird der Autofokusmessstrahl 30 erst am Reflexionspunkt D reflektiert, der gegenüber Punkt C nicht nur in Richtung der optischen Achse 8, sondern auch lateral bzw. seitlich hierzu verschoben ist. Wie ersichtlich, erreicht der entsprechende reflektierte Strahl 32' den Detektor 28 an einem unterschiedlichen Ort und liefert somit ein verändertes Signal gegenüber der Fokuslage. Auf diese Weise kann der Grad der Defokussierung gemessen werden. Über eine entsprechende Regel- oder Steuereinheit kann die Defokussierung durch entsprechende Ansteuerung des Motors 27, der die Objektivlinse in z-Richtung (also in Richtung der optischen Achse 8) bewegt, kompensiert werden.
Eine ähnliche Autofokussierungsvorrichtung für Auflichtmikroskope, die nach dem oben beschriebenen Triangulationsprinzip arbeitet, ist aus der DE 32 19 503 A1 bekannt. Die US 2004/0113043 A1 beschreibt ein ähnliches Autofokussystem, das einen zur Hälfe ausgeblendeten Messstrahl zur Erzeugung eines Messspalts mittels infraroten Lichts auf ein mikroskopisch zu untersuchendes Objekt und als Detektor einen CCD-Zeilensensor einsetzt. Der Zusammenhang zwischen dem entsprechenden Detektionssignal und der tatsächlichen Fokuslage ist in dieser US-Schrift zeichnerisch dargestellt. Auch die WO 2007/144 197 A1 behandelt die Autofokussierung mittels Triangulationsverfahren. In der DE 10 2008 018 951 A1 wird ein hierauf basierendes Mikroskop mit Haltefokuseinheit behandelt.
Die Erfindung lässt sich somit in besonders vorteilhafter Weise in Mikroskopen umsetzen, die bereits über eine triangulierende Autofokuseinrichtung verfügen. Die Auswertung des Autofokusmessstrahls wird dahingehend erweitert, dass nicht nur seine Position, sondern auch sein Intensitätsprofil gemessen und analysiert wird. Eine aus dem Intensitätsprofil ermittelte Kenngröße lässt sich dann zur Behebung eines auftretenden sphärischen Fehlers verwenden.
Die Erfindung eignet sich insbesondere auch zur anschließenden Korrektur des festgestellten sphärischen Fehlers. Hierzu stehen im Wesentlichen zwei Methoden zur Verfügung:
Zum einen kann die Kompensation des sphärischen Fehlers mittels eines bereits oben beschriebenen im Objektiv vorhandenen Korrekturlinsenglieds erfolgen. Es ist vorteilhaft, die Ansteuerung dieses Korrekturlinsenglieds motorisch vorzunehmen und die Ansteuersignale über einen Regelkreis zur Verfügung zu stellen, der eine Abweichung von einem idealen Intensitätsprofil (Soll-Wert) beim Auftreten sphärischer Fehler beseitigt. Als Eingangsgröße des Regelkreises dient dann eine der erwähnten Kenngrößen des Intensitätsprofils, wie etwa die Flankensteilheit. Das Korrekturlinsenglied wird in geeigneter Weise so lange verstellt, bis die Flankensteilheit den Wert annimmt, den die Flankensteilheit des idealen Intensitätsprofils aufweist.
Zum anderen kann die Kompensation des sphärischen Fehlers durch Einsatz einer adaptiven Optik erfolgen, die in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet ist und zur Kompensation des sphärischen Fehlers angesteuert wird. In diesem Fall wird also die Korrektur außerhalb des Objektivs vorgenommen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Einkoppelungseinrichtung zur Einkoppelung des Messstrahls in den Abbildungsstrahlengang des Mikroskops derart auf, dass der Messstrahl dezentriert außerhalb der optischen Achse des Objektivs durch das Objektiv auf die Probe fällt. Zum Auskoppeln des an der Grenzfläche des Deckglases zur Probe reflektierten Messstrahls nach Durchtritt durch das Objektiv ist eine Auskoppeleinrichtung vorgesehen. Einkoppelungseinrichtung und Auskoppeleinrichtung umfassen vorteilhafterweise einen gemeinsamen dichroitischen Strahlteiler. Der dichroitische Strahlteiler ist derart ausgelegt, dass er für die Wellenlänge des verwendeten Messstrahls (z. B. im Infraroten) reflektierend ist, während er für das Spektrum des von der Probe im Übrigen reflektierten bzw. emittierten Lichts transparent ist. Soweit erforderlich, umfassen die Einkoppelungseinrichtung und die Auskoppeleinrichtung weitere optische Elemente, wie Linsen oder Strahlumlenker (Spiegel). Der gemeinsame dichroitische Strahlteiler ist vorteilhafterweise zwischen Mikroskoptubus und Mikroskopobjektiv im Abbildungsstrahlengang des Mikroskops angeordnet. Mittels der Auskoppeleinrichtung wird der von besagter Grenzfläche reflektierte Messstrahl nach Durchtritt durch das Objektiv auf einen Detektor gelenkt bzw. auf diesen abgebildet, der mit einer Detektorfläche ausgestattet ist, um ein Intensitätsprofil des Messstrahls aufnehmen zu können. Solche Detektoren sind beispielsweise in Form von CCD-Kameras hinlänglich bekannt. Eine im Detektor integrierte oder alternativ vom Detektor separate Auswerteeinheit ist zur Auswertung des Intensitätsprofils des vom Detektor aufgenommenen Messstrahls ausgelegt.
Bei Abwesenheit sphärischer Fehler besitzt das Intensitätsprofil eine "ursprüngliche Form", also im Vergleich zu Profilen, die bei Vorliegen sphärischer Fehler aufgenommen wurden, maximale Flankensteilheit, geringst mögliche Halbwertsbreite und maximale Signalhöhe der Intensität. Die Auswerteeinheit ist ausgelegt, eine Kenngröße des Intensitätsprofils zu bestimmen. Mögliche Kenngrößen sind eine oder mehrere der bereits erwähnten Kenngrößen, wie Halbwertsbreite, Flankensteilheit und Maximalwert der Intensität.
Gemäß der oben bereits angesprochenen ersten Ausführungsform zur Kompensation eines festgestellten sphärischen Fehlers ist im Objektiv des Mikroskops ein Korrekturlinsenglied zur Kompensation eines sphärischen Fehlers vorhanden, wobei zur Verstellung des Korrekturlinsenglieds eine Ansteuereinheit vorgesehen ist. Solche Korrekturlinsenglieder mit entsprechender Ansteuereinheit sind an sich zur Deckglasdickenkorrektur bekannt.
Zur Umsetzung einer automatischen Regelung zur Kompensation eines festgestellten sphärischen Fehlers ist eine Regeleinrichtung vorgesehen, die mit der Auswerteeinheit zur Zuführung eines Signals in Verbindung steht, das eine Kenngröße des Intensitätsprofils repräsentiert, wobei die Regeleinrichtung ihrerseits mit der besagten Ansteuereinheit des Korrekturglieds des Objektivs zur Zuführung eines Regelsignals in Verbindung steht, um eine Verstellung des Korrekturglieds so lange vorzunehmen, bis ein festgestellter sphärischer Fehler kompensiert ist.
Hierzu erzeugt die Auswerteeinheit beispielsweise ein Signal, das die Flankensteilheit des Intensitätsprofils repräsentiert. Weicht bei Anwesenheit eines sphärischen Fehlers diese Flankensteilheit (Ist-Wert) von dem optimalen Wert der Flankensteilheit (Soll-Wert) ab, so erzeugt in Abhängigkeit von dieser Abweichung die Regeleinrichtung ein Regel- bzw. Einstellsignal für die Ansteuereinheit zur Verstellung des Korrekturglieds des Mikroskopobjektivs. Diese Verstellung wird über die Regeleinrichtung solange vorgenommen, bis die Abweichung von Ist-Wert und Soll-Wert gleich Null beträgt, der festgestellte sphärische Fehler also kompensiert ist.
Gemäß einer weiteren oben angesprochenen Ausführungsform zur Kompensation eines festgestellten sphärischen Fehlers ist im Strahlengang eine adaptive Optik zur Kompensation des sphärischen Fehlers angeordnet. Als adaptive Optik lässt sich beispielsweise ein deformierbarer Spiegel einsetzen, dessen Spiegeloberseite durch entsprechend auf seiner Rückseite angeordnete Aktuatoren kontinuierlich verformt werden kann. Die Ansteuerung der Aktuatoren erfolgt durch eine entsprechende Ansteuereinheit. Solche deformierbaren Spiegel sind bekannt und sollen nicht weiter beschrieben werden. Der deformierbare Spiegel ist vorzugsweise in der Objektivpupille angeordnet. Wegen der Unzugänglichkeit der Objektivpupille selbst muss dies in einer zu ihr konjugierten Ebene außerhalb des Objektivs erfolgen, was mit einem optischen Übertragungssystem (sogenannte Transportoptik; englisch: relay optical system) realisiert werden kann. Durch die Korrektur des sphärischen Fehlers außerhalb des Objektivs muss der Ort der Einspiegelung des Autofokusses ebenfalls hinter die konjugierte Ebene der Objektivpupille verschoben werden. Die Anordnung des dichroitischen Strahlteilers und der Aufbau des Autofokus werden durch diese Maßnahmen nicht beeinflusst.
Wiederum kann ein festgestellter sphärischer Fehler automatisch mittels eines Regelkreises kompensiert werden, wenn eine Regeleinrichtung vorgesehen ist, die mit der Auswerteeinheit zur Zuführung eines Signals in Verbindung steht, das eine Kenngröße des Intensitätsprofils repräsentiert, und die mit der Ansteuereinheit der adaptiven Optik zur Zuführung eines Regel- oder Einstellsignals in Verbindung steht, um eine Ansteuerung der adaptiven Optik vorzunehmen, bis ein festgestellter sphärischer Fehler kompensiert ist.
Bezüglich Einzelheiten dieser Regelung sei auf die Ausführungen zu der Regeleinrichtung hingewiesen, die die Ansteuereinheit des Korrekturlinsenglieds des Objektivs ansteuert. Es sei außerdem betont, dass prinzipiell die beiden behandelten Ausführungsformen zur Kompensation eines festgestellten sphärischen Fehlers sich nicht gegenseitig ausschließen, das heißt, dass sowohl ein Korrekturlinsenglied als auch eine adaptive Optik vorgesehen sein können. Die entsprechenden Regeleinrichtungen können getrennt voneinander oder auch in einer gemeinsamen Regeleinrichtung zusammengefasst vorgesehen sein.
In einer bereits oben behandelten besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Auswerteeinheit dazu ausgelegt, zusätzlich zur Auswertung des Intensitätsprofils die örtliche Position des Intensitätsprofils und eine Änderung dieser örtlichen Position auf einer Detektorfläche des Detektors zu bestimmen.
Die Auswerteeinheit ist weiterhin insbesondere dazu ausgelegt, um bei einer Änderung der Position des Intensitätsprofils eine Autofokus-Kenngröße einer vorliegenden Defokussierung zu erzeugen. Wie bereits weiter oben ausgeführt, ist eine laterale Positionsverschiebung gemäß triangulierendem Autofokus-Prinzip mit einer Defokussierung korreliert. Eine entsprechend ausgelegte Auswerteeinheit ("kombinierte Auswerteeinheit") eignet sich folglich nicht nur zur Feststellung eines sphärischen Fehlers, sondern auch zur Feststellung einer Defokussierung.
Um eine Defokussierung rückgängig zu machen, also um einen Fokus einzustellen oder zu halten, ist es vorteilhaft, wenn zusätzlich eine Autofokus-Ansteuereinheit vorgesehen ist, um den Fokus des Mikroskops, beispielsweise durch entsprechende Bewegung von Linsengliedern im Objektiv oder des gesamten Objektivs oder der Objektebene, einzustellen, wobei weiterhin eine Autofokus-Regeleinrichtung vorgesehen sein sollte, die mit der Auswerteeinheit zur Zuführung eines Signals in Verbindung steht, das eine Autofokus-Kenngröße repräsentiert, und die mit der Autofokus-Ansteuereinheit zur Zuführung eines weiteren Signals in Verbindung steht, um eine Fokuseinstellung vorzunehmen, bis eine vorliegende Defokussierung rückgängig gemacht ist.
Selbstverständlich kann die besprochene Regeleinrichtung zur Kompensation eines sphärischen Fehlers mit der hier behandelten Autofokus-Regeleinrichtung eine gemeinsame Einheit bilden. In gleicher Weise kann die Ansteuereinheit zur Ansteuerung eine Korrekturglieds im Objektiv oder einer adaptiven Optik zur Kompensation eines sphärischen Fehlers mit der hier behandelten Autofokus-Ansteuereinheit zur Einstellung des Fokus des Mikroskops eine gemeinsame Einheit bilden. Schließlich kann die Auswerteeinheit zur Erzeugung einer Kenngröße des Intensitätsprofils (und optional zur Erzeugung einer Autofokus-Kenngröße) mit dem Detektor zur Aufnahme des Intensitätsprofils (und optional zur Positionsbestimmung des Intensitätsprofils) eine Einheit bilden.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Insbeseonder ist die Erfindung nicht auf eine spezielle Mikroskopiemethode beschränkt. D.h sie kann sowohl bei der Widefield-Mikroskopie (sogenannte „klassische“ Mikroskopie mit Abbildung eines Sichtfelds auf dem Objekt) eingesetzt werden als auch bei der Rastermikroskopie, welche ein Objekt mit einem Abbildungsstrahl abrastert und das Bild aus den einzelnen Bildpunkten zusammensetzt. So wird bei den bekannten Methoden der Rastermikroskopie (Confocal, Multiphoton, Second Harmonic, Third Harmonic und Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS) die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen, was mit dem ohnehin erforderlichen ortsauflösenden Detektor durchgeführt werden kann.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt ein schematisch dargestelltes Beispiel einer triangulierenden Autofokuseinrichtung gemäß Stand der Technik;
2 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Feststellung eines sphärischen Fehlers bei einer mikroskopischen Abbildung gemäß Erfindung;
3 zeigt schematisch die Vorrichtung gemäß 2 erweitert um eine triangulierende Autofokuseinrichtung;
4 zeigt ein typisches Intensitätsprofil bei vorliegendem sphärischen Fehler (4a) und ohne Vorliegen eines sphärischen Fehlers (4b); und
5 zeigt schematisch eine Vorrichtung gemäß 3 mit einer triangulierenden Autofokuseinrichtung und zusätzlich einer adaptiven Optik zur Kompensation des sphärischen Fehlers.
Die 1, die eine triangulierende Autofokuseinrichtung gemäß Stand der Technik US 5,136,149 B1 zeigt, wurde bereits in der Beschreibung im Zusammenhang mit einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung eingehend beschrieben.
2 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Feststellung eines sphärischen Fehlers bei einer mikroskopischen Abbildung mittels eines Mikroskops 1, von dem nur die nachstehend beschriebenen wesentlichen Komponenten gezeigt sind. Eine Probe 9 befindet sich auf einem die Probe 9 tragenden Deckglas 2. Dieses Deckglas 2 befindet sich im Abbildungsstrahlengang 7 des Mikroskops 1. Das Mikroskopobjektiv ist mit 10 bezeichnet. Lediglich schematisch ist eine Tubuslinse 12 dargestellt. Weitere Einzelheiten, wie Okular, Bildaufnahmedetektor, Zoomsystem etc., sind vorliegend nicht dargestellt, da sie für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich sind. Solche Einzelheiten sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Bei der Probe 9 kann es sich um lebende Zellen handeln, die über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Auch ein Scannen der Probe 9 entlang einer X-Y-Richtung, also in einer Ebene senkrecht zur Zeichenebene der 2, ist möglich. Bei solchen typischen mikroskopischen Untersuchungen kann es vorkommen, dass die Dicke des Deckglases 2 je nach Probenort der Untersuchung variiert; außerdem kann die Materialstruktur des Deckglases 2 im Verlauf der xy-Ebene inhomogen sein. Bei Verwendung eines Immersionsobjektivs (hier nicht dargestellt) befindet sich ein Immersionsmedium zwischen Deckglas 2 und Objektiv 10; während der mikroskopischen Untersuchung kann es zu Temperaturänderungen im Immersionsmedium kommen. Sämtliche der genannten Änderungen stellen Änderungen der optischen Eigenschaften von Deckglas bzw. Immersionsmedium dar und wirken sich nachteilig auf die optische Abbildungsgüte ("sphärischer Fehler") aus.
Zur Erkennung und Feststellung eines sphärischen Fehlers wird ein von einer Messlichtquelle 129 ausgehender Messstrahl 130 dezentriert, also außerhalb der optischen Achse 8 des Objektivs 10, durch das Objektiv 10 auf die Probe 9 geleitet. Der an der Grenzfläche 116 des Deckglases 2 zur Probe 9 reflektierte Messstrahl 132 wird seinerseits über das Objektiv 10 auf einen Detektor 128 geleitet. Der Messstrahl 130 wird hierzu beispielsweise von einer (nicht dargestellten) Spaltblende mit nachgeschalteter (nicht dargestellter) Beleuchtungsoptik erzeugt. Auf besagter Grenzfläche 116 entsteht ein Bild des Spaltes. Die Einkoppelung des Messstrahls 130 in den Strahlengang des Mikroskops 1 wird über eine Einkoppelungseinrichtung vorgenommen, die hier im Wesentlichen ein Umlenkelement 13 sowie einen dichroitischen Strahlteiler 120 umfasst. Auf der anderen Seite wird die Auskoppelung des reflektierten Messstrahls 132 über eine Auskoppeleinrichtung vorgenommen, die im Wesentlichen wiederum den besagten dichroitischen Strahlteiler 120 und eine schematisch dargestellte Linse 15 umfasst. Die Linse 15 bildet wiederum ein Spaltbild auf eine sensitive Detektorfläche des Detektors 128 ab. Der Detektor 128 nimmt ein Intensitätsprofil dieses Messstrahls auf, das von einer nachgeschalteten Auswerteeinheit 6 ausgewertet wird.
Es ist vorteilhaft, die Wellenlänge des Messstrahls 130 außerhalb desjenigen Spektralbereichs zu wählen, in dem die Probe 9 mikroskopisch betrachtet wird. Zweckmäßig ist beispielsweise eine Wellenlänge aus dem infraroten Bereich für den Messstrahl 130. Während der dichroitische Strahlteiler 120 für den Wellenlängenbereich des Messstrahls 130 sowie des reflektierten Messstrahls 132 reflektierend ist, ist er für das übrige Spektrum, insbesondere aber für das Spektrum, unter dem die Probe 9 mikroskopisch untersucht wird, transparent. Der auf diese Weise transmittierte Beobachtungsstrahlengang wird am Umlenkelement 11 in Richtung Tubuslinse 12 umgeleitet.
Typische Intensitätsprofile des vom Detektor 128 aufgenommenen reflektierten Messstrahls 132 sind in 4 dargestellt. 4a zeigt ein Intensitätsprofil (Intensität I aufgetragen gegen eine x-Richtung des Detektors) für den Fall eines vorliegenden sphärischen Fehlers, während 4b den optimalen Fall eines Intensitätsprofils ohne sphärischen Fehler darstellt. 4b zeigt folglich den Soll-Wert eines Intensitätsprofils, während 4a einen möglichen Ist-Wert eines Intensitätsprofils zeigt.
Zurückkommend auf 2 wertet die Auswerteeinheit 6 den Ist-Wert eines Intensitätsprofils (vgl. 4a) aus und stellt bei Abweichung von dem Soll-Wert des Intensitätsprofils (optimaler Fall gemäß 4b) einen sphärischen Fehler fest. Dieser sphärische Fehler kann die oben bereits beschriebenen Ursachen haben. Zur quantitativen Bewertung des vorliegenden sphärischen Fehlers wird die Signalform des Intensitätsprofils quantitativ und/oder qualitativ ausgewertet. Dazu bestimmt die Auswerteeinheit 6 eine Kenngröße des Intensitätsprofils, insbesondere eine Halbwertsbreite, eine Flankensteilheit und/oder ein Signalmaximum des aufgenommenen Intensitätsprofils. Als Flankensteilheit bezeichnet man die Steigung des Intensitätssignals an einer bestimmten Stelle des Profils, z.B. im Bereiche der Halbwertsbreite oder bei einem vorgebbaren Signalwert, z.B. die Steigung bei 30 Prozent des Maximalwerts der detektierten Intensität. Zweckmäßig ist beispielsweise die Verwendung der einseitigen Flankensteigung des Intensitätsprofils, wobei ein entsprechendes Ausgangssignal als Regelsignal von der Auswerteeinheit 6 an die Regeleinrichtung 5 gegeben wird.
In der Regeleinrichtung 5 ist nun beispielsweise als Soll-Wert die einseitige Flankensteigung des optimalen oder "ursprünglichen" Intensitätsprofils (beispielsweise Soll-Wert gemäß 4b) hinterlegt. Abhängig von der Abweichung des Ist-Werts zum Soll-Wert der einseitigen Flankensteigung gibt die Regeleinrichtung 5 ein Stellsignal an die Ansteuereinheit 4 für ein Korrekturlinsenglied 3 im Objektiv 10 ab, welches zur Deckglasdickenkorrektur als verschiebbares Linsenglied vorgesehen ist. Die Ansteuereinheit 4 nimmt eine entsprechende motorische Verstellung des Korrekturlinsenglieds 3 vor. Hierdurch wird der sphärische Fehler korrigiert, während der Fokus des Objektivs 10 unverändert bleibt. Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vorteil dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, dass sphärische Fehler beliebiger Ursache korrigiert werden. Insbesondere ist auch eine Deckglasdickenkorrektur möglich, ohne Schwankungen oder Änderungen der Deckglasdicke quantitativ erfassen zu müssen. In Form eines Regelkreises wird nach erfolgter Ansteuerung des Korrekturlinsenglieds 3 fortlaufend der neue Ist-Wert des Intensitätsprofils erfasst und ausgewertet. Bei Abweichungen vom Soll-Wert erfolgt eine weitere Ansteuerung des Korrekturlinsenglieds 3, bis der sphärische Fehler kompensiert ist.
3 zeigt schematisch eine um eine triangulierende Autofokuseinrichtung erweiterte Vorrichtung gemäß 2. Gleiche Komponenten sind mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Eine erneute Behandlung der Vorrichtung gemäß 2 soll zur Vermeidung von Redundanzen vermieden werden. Es sei insoweit auf die Erläuterungen zur 2 verwiesen.
Die Vorrichtung zur Feststellung und Kompensation eines sphärischen Fehlers gemäß 2 kann idealerweise auch als triangulierende Autofokuseinrichtung verwendet werden. Umgekehrt ist es auch bei vorhandener triangulierender Autofokuseinrichtung möglich, diese als Vorrichtung zur Feststellung und Behebung eines sphärischen Fehlers gemäß 2 zu verwenden.
Der Messstrahl 130 dient in diesem Fall gleichzeitig als Autofokusmessstrahl 30, wie er in 1 dargestellt ist. Der dichroitische Strahlteiler 120 entspricht dem Strahlteiler 20 aus 1. Die Grenzfläche 116 von Deckglas 2 zur Probe 9 entspricht der Objektebene 16 aus 1. Der Detektor 128, der gemäß 2 zur Aufnahme eines Intensitätsprofils des reflektierten Messstrahls 132 ausgelegt ist, ist im Falle der 3 zusätzlich ein ortsauflösender Detektor. Ein solcher ortsauflösender Detektor detektiert sowohl die Intensität des Lichts als auch die Position des Messstrahls. Dazu können beispielsweise CCD-Zeilenkameras oder CCD-Matrixkameras eingesetzt werden. Dem Detektor 128 ist eine kombinierte Auswerteeinheit 26 nachgeschaltet, die sowohl das vom Detektor aufgenommene Intensitätsprofil zur Feststellung eines sphärischen Fehlers auswertet als auch die örtliche Position des Intensitätsprofils bestimmt. Von dieser kombinierten Auswerteeinheit 26 können somit zwei Signale erzeugt werden, die entsprechende Kenngrößen repräsentieren, nämlich eine Kenngröße des Intensitätsprofils und eine Kenngröße einer Defokussierung. Die entsprechenden Signale werden in eine Regeleinrichtung 5 (vgl. 2) sowie in eine Autofokus-Regeleinrichtung 25 geleitet. Auf diese Weise kann, wie bereits im Zusammenhang mit 2 ausgeführt, ein sphärischer Fehler kompensiert werden. Weiterhin kann über die Autofokus-Regeleinrichtung eine während der mikroskopischen Untersuchung auftretende Defokussierung rückgängig gemacht werden. Hierzu gibt die Autofokus-Regeleinrichtung 25 ein Stellsignal abhängig von der Kenngröße der Defokussierung an die Autofokus-Ansteuereinheit 24 ab. Diese Autofokus-Ansteuereinheit 24 kann beispielsweise bereits der in 1 dargestellte Motor 27 sein oder einen solchen Motor ihrerseits ansteuern. Die Autofokus-Ansteuereinheit 24 bewirkt in dem dargestellten Ausführungsbeispiel gemäß 3 eine Verschiebung des Objektivs 10 in z-Richtung (also parallel zur optischen Achse 8), um einer Defokussierung entgegenzuwirken. Nach Art eines Regelkreises kann folglich eine automatische Fokussierung vorgenommen werden.
Selbstverständlich können die in 3 dargestellten Regeleinrichtungen 5 und 25 in einer gemeinsamen Regeleinrichtung kombiniert sein. Umgekehrt kann die in 3 dargestellt kombinierte Auswerteeinheit 26 aus zwei separaten Auswerteeinheiten bestehen.
5 zeigt schematisch eine Vorrichtung gemäß 3, die zur Kompensation des sphärischen Fehlers des Abbildungsstrahlengangs eine adaptive Optik 52 mit einer zugehörigen Ansteuereinheit 51 aufweist und die außerdem mit einer triangulierenden Autofokuseinrichtung ausgestattet ist. Gleiche Komponenten sind mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Eine erneute Behandlung der Vorrichtung gemäß 3 soll zur Vermeidung von Redundanzen vermieden werden. Es sei insoweit auf die Erläuterungen zur 3 verwiesen.
Der Messstrahl 130 zur Bestimmung des sphärischen Fehlers dient in diesem Ausführungsbeispiel gleichzeitig als Autofokusmessstrahl 30, wie er in 1 dargestellt ist. Der dichroitische Strahlteiler 120 entspricht dem Strahlteiler 20 aus 1. Die Grenzfläche 116 von Deckglas 2 zur Probe 9 entspricht der Objektebene 16 aus 1. Der Detektor 128, der gemäß 2 zur Aufnahme eines Intensitätsprofils des reflektierten Messstrahls 132 ausgelegt ist, ist im Falle der 5 zusätzlich ein ortsauflösender Detektor. Ein solcher ortsauflösender Detektor detektiert sowohl die Intensität des Lichts als auch die Position des Messstrahls. Dazu können beispielsweise CCD-Zeilenkameras oder CCD-Matrixkameras eingesetzt werden.
Als adaptive Optik wird hier ein deformierbarer Spiegel 52 eingesetzt, dessen Spiegeloberseite durch entsprechend auf seiner Rückseite angeordnete Aktuatoren kontinuierlich verformt werden kann. Die Ansteuerung der Aktuatoren (nicht dargestellt) erfolgt über eine entsprechende Ansteuereinheit 51. Der deformierbare Spiegel 52 ist in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet. Hierzu ist ein optisches Übertragungssystem 53 (auch als Transportoptik bezeichnet) vorgesehen. Das entsprechende Zwischenbild ist mit 54 bezeichnet. Mit 55 ist ein zusätzliches Umlenkelement bezeichnet. 120 bezeichnet wieder den dichroitischen Strahlteiler (vgl. 2).
Dem Detektor 128 ist eine kombinierte Auswerteeinheit 26 nachgeschaltet, die sowohl das vom Detektor aufgenommene Intensitätsprofil zur Feststellung eines sphärischen Fehlers auswertet als auch die örtliche Position des Intensitätsprofils bestimmt. Von dieser kombinierten Auswerteeinheit 26 können somit zwei Signale erzeugt werden, die entsprechende Kenngrößen repräsentieren, nämlich eine Kenngröße des Intensitätsprofils und eine Kenngröße einer Defokussierung. Die entsprechenden Signale werden in eine Regeleinrichtung 50 (vgl. 2) sowie in eine Autofokus-Regeleinrichtung 25 geleitet.
Zur quantitativen Bewertung des vorliegenden sphärischen Fehlers wird die Signalform des Intensitätsprofils quantitativ und/oder qualitativ ausgewertet. Dazu bestimmt die Auswerteeinheit 26 eine Kenngröße des Intensitätsprofils, insbesondere eine Halbwertsbreite, eine Flankensteilheit und/oder ein Signalmaximum des aufgenommenen Intensitätsprofils. Als Flankensteilheit bezeichnet man die Steigung des Intensitätssignals an einer bestimmten Stelle des Profils, z.B. im Bereiche der Halbwertsbreite oder bei einem vorgebbaren Signalwert, z.B. die Steigung bei einem bestimmten Prozentsatz des Maximalwerts der detektierten Intensität. Zweckmäßig ist beispielsweise die Verwendung der einseitigen Flankensteigung des Intensitätsprofils, wobei ein entsprechendes Ausgangssignal als Regelsignal von der Auswerteeinheit 26 an die Regeleinrichtung 50 gegeben wird.
In der Regeleinrichtung 50 ist nun beispielsweise als Soll-Wert die einseitige Flankensteigung des optimalen Intensitätsprofils (beispielsweise Soll-Wert gemäß 4b) hinterlegt. Abhängig von der Abweichung des Ist-Werts zum Soll-Wert der einseitigen Flankensteigung gibt die Regeleinrichtung 50 ein Stellsignal an die Ansteuereinheit 51 ab, welche dazu vorgesehen ist, die reflektierende Oberfläche der adaptiven Optik 52 gezielt zu verformen. Die Ansteuereinheit 51 nimmt eine dem Stellsignal entsprechende motorische Verstellung bzw. Verformung der adaptiven Optik 52 vor. Hierdurch wird der sphärische Fehler korrigiert, während der Fokus des Objektivs 10 unverändert bleibt. Es erweist sich hierbei als Vorteil der Erfindung, dass bei der hier behandelten Ausführungsform sphärische Fehler beliebiger Ursachen korrigiert werden.
In Form eines Regelkreises wird nach erfolgter Verstellung der adaptiven Optik 52 fortlaufend der neue Ist-Wert des Intensitätsprofils erfasst und ausgewertet. Bei Abweichungen vom Soll-Wert erfolgt eine weitere Ansteuerung der Ansteuereinheit 51, welche die reflektierende Oberfläche der adaptiven Optik 52 gezielt verformt, bis der sphärische Fehler erneut kompensiert ist. Auf diese Weise kann ein sphärischer Fehler fortlaufend kompensiert werden.
Weiterhin kann über die Autofokus-Regeleinrichtung eine während der mikroskopischen Untersuchung auftretende Defokussierung ausgeglichen und der Fokus dauerhaft konstant gehalten werden. Hierzu gibt die Autofokus-Regeleinrichtung 25 ein Stellsignal abhängig von der Kenngröße der Defokussierung an die Autofokus-Ansteuereinheit 24 ab. Diese Autofokus-Ansteuereinheit 24 kann beispielsweise bereits der in 1 dargestellte Motor 27 sein oder einen solchen Motor ihrerseits ansteuern. Die Autofokus-Ansteuereinheit 24 bewirkt in dem dargestellten Ausführungsbeispiel gemäß 3 eine Verschiebung des Objektivs 10 in z-Richtung (also parallel zur optischen Achse 8), um einer Defokussierung entgegenzuwirken. Nach Art eines Regelkreises kann folglich eine automatische Fokussierung vorgenommen werden.
Die in 5 dargestellte Vorrichtung ist hervorragend für die Beibehaltung optimaler Abbildungsqualitäten während langdauernden mikroskopischen Untersuchungen geeignet.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
2: Deckglas
3: Korrekturlinsenglied
4: Ansteuereinheit für 3
5: Regeleinrichtung
6: Auswerteeinheit
7: Abbildungsstrahlengang
8: optische Achse
9: Probe
10: Objektiv
11: Umlenkelement
12: Tubuslinse
13: Umlenkelement
14: Bildebene
15: Linse
16, 16': Objektebene
19: Autofokus-Lichtquelle
20: Strahlteiler, Dichroit
24: Autofokus-Ansteuereinheit
25: Autofokus-Regeleinrichtung
26: kombinierte Auswerteeinheit
27: Motor
28: Autofokus-Detektor
30: Autofokusmessstrahl
32, 32': remittierter Autofokusmessstrahl
50: Regeleinrichtung
51: Ansteuereinheit für 52
52: deformierbarer Spiegel, adaptive Optik
53: Optisches Übertragungssystem
54: Zwischenbild
55: Umlenkelement
116: Grenzfläche
120: Strahlteiler (Dichroit)
128: Detektor
129: Messlichtquelle
130: Messstrahl
132: reflektierter Messstrahl
α: Winkel
z: Richtung
C: Reflexionspunkt
D: Reflexionspunkt
A: Ablenkpunkt
B, B': Ablenkpunkt

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 4323721 C2 [0003]
DE 102007002863 B3 [0004]
US 7593173 B2 [0005]
US 5136149 B1 [0017, 0017, 0043]
DE 19537376 A1 [0017]
DE 3219503 A1 [0020]
US 2004/0113043 A1 [0020]
WO 2007/144197 A1 [0020]
DE 102008018951 A1 [0020]

Claims

Verfahren zur Feststellung eines sphärischen Fehlers eines Mikroskop-Abbildungsstrahlengangs (7) bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe (9) mittels eines ein Objektiv (10) aufweisenden Mikroskops (1), wobei ein die Probe (9) tragendes oder bedeckendes Deckglas (2) im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Messstrahl (130) dezentriert außerhalb der optischen Achse (8) des Objektivs (10) durch das Objektiv (10) auf die Probe (9) und der an der Grenzfläche (116) des Deckglases zur Probe (9) reflektierte Messstrahl (132) über das Objektiv (10) auf einen Detektor (128) geleitet wird, der das Intensitätsprofil des reflektierten Messstrahls (132) aufnimmt, und dass aus diesem Intensitätsprofil das Vorliegen eines sphärischen Fehlers qualitativ und/oder quantitativ bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Intensitätsprofil hinsichtlich der Signalform ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung des Intensitätsprofils umfasst, dass eine Halbwertsbreite des Intensitätsprofils und/oder eine Flankensteilheit des Intensitätsprofils und/oder das Maximum des Intensitätsprofils bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sphärische Fehler aufgrund einer Änderung der optischen Eigenschaften des Deckglases (2), insbesondere eine Deckglasdickenänderung und/oder eine Änderung von Struktur oder Material des Deckglases, und/oder aufgrund einer Änderung der optischen Eigenschaften eines Immersionsmediums, wie eine Temperaturänderung des Immersionsmediums, festgestellt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Messstrahl (130) zusätzlich als Autofokusmessstrahl (30) einer triangulierenden Autofokuseinheit, die dem Mikroskop (1) zugeordnet ist, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem zur Einstellung und/oder zum Halten des Fokus des Objektivs (10) eine triangulierende Autofokuseinheit verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Autofokusmessstrahl (30) der triangulierenden Autofokuseinheit zusätzlich als Messstrahl (130) zur Feststellung eines sphärischen Fehlers verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei festgestelltem sphärischen Fehler ein im Objektiv (10) vorhandenes Korrekturlinsenglied (3) zur Kompensation des sphärischen Fehlers entlang der optischen Achse verschoben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei festgestelltem sphärischen Fehler eine adaptive Optik (52), die in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet ist, zur Kompensation des sphärischen Fehlers angesteuert wird.
Vorrichtung zur Feststellung eines sphärischen Fehlers eines Mikroskop-Abbildungsstrahlengangs (7) bei einer mikroskopischen Abbildung einer Probe (9) mittels eines ein Objektiv (10) aufweisenden Mikroskops (1), wobei ein die Probe (9) tragendes oder bedeckendes Deckglas (2) im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist, gekennzeichnet durch eine Einkoppelungseinrichtung (13, 120) zur Einkoppelung eines Messstrahls (130) in den Mikroskop-Abbildungsstrahlengang (7) des Mikroskops (1) derart, dass der Messstrahl (130) dezentriert außerhalb der optischen Achse des Objektivs (10) durch das Objektiv (10) auf die Probe (9) fällt, eine Auskoppeleinrichtung (120, 15) zur Auskoppelung des an der Grenzfläche (116) des Deckglases (2) zur Probe (9) reflektierten Messstrahls (132) nach Durchtritt durch das Objektiv (10) aus dem Mikroskop-Abbildungsstrahlengang des Mikroskops (1), einen Detektor (128), auf den der ausgekoppelte Messstrahl (132) abgebildet wird, und der ein Intensitätsprofil dieses Messstrahls (132) aufnimmt, und eine Auswerteeinheit (6), die aus dem Intensitätsprofil den sphärischen Fehler qualitativ und/oder quantitativ bestimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkoppelungseinrichtung und die Auskoppeleinrichtung einen Strahlteiler (120) umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Auswerteeinheit (6) eine Kenngröße des Intensitätsprofils, insbesondere eine Halbwertsbreite des Intensitätsprofils und/oder eine Flankensteilheit des Intensitätsprofils und/oder die Signalhöhe, bestimmbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass im Objektiv (10) ein Korrekturlinsenglied (3) zur Kompensation eines sphärischen Fehlers vorhanden ist, wobei zur Verstellung des Korrekturlinsenglieds (3) eine Ansteuereinheit (4) vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11 und 12, gekennzeichnet durch eine Regeleinrichtung (5), der ein Ausgangssignal der Auswerteeinheit (6), das eine Kenngröße des Intensitätsprofils repräsentiert, zuführbar ist und deren Ausgangssignal als Regelsignal an der Ansteuereinheit (4) des Korrekturlinsenglieds (3) des Objektivs (10) anliegt, um durch diese eine Verstellung des Korrekturlinsenglieds (3) vorzunehmen, bis ein festgestellter sphärischer Fehler kompensiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene eine adaptive Optik zur Kompensation eines sphärischen Fehlers angeordnet ist, wobei zur Ansteuerung der adaptiven Optik (52) eine Ansteuereinheit vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 14, soweit auf Anspruch 11 zurückbezogen, gekennzeichnet durch eine Regeleinrichtung (50), die ein Ausgangssignal der Auswerteeinheit (26) erhält, das eine Kenngröße des Intensitätsprofils repräsentiert, und deren Ausgangssignal als Regelsignal an der Ansteuereinheit (51) der adaptiven Optik (52) anliegt, um durch diese eine Ansteuerung der adaptiven Optik (52) vorzunehmen, bis ein festgestellter sphärischer Fehler kompensiert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Auswerteeinheit (6, 26) die örtliche Position und deren Änderung des Intensitätsprofils auf einer Detektorfläche des Detektors (128) bestimmbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Auswerteeinheit (6, 26) bei einer Änderung der Position des Intensitätsprofils eine Autofokus-Kenngröße einer vorliegenden Defokussierung erzeugbar ist und daraus ein Regelsignal ableitbar ist, mit dem die Fokuseinstellung veränderbar ist, bis eine vorliegende Defokussierung rückgängig gemacht ist.