TWI791046B - 減少顯微鏡成像中之暈影的設備及方法 - Google Patents

Abstract

一種用於變更在顯微鏡設備中的影像感測器之整個視域的光強度之方法，該顯微鏡設備包括一光源、一具有像素之影像感測器以及一檢體台，其中來自光源的光係沿一光路徑行進至該檢體台，接著至該影像感測器，該方法包含下列步驟：在該光源與該影像感測器之間的光路徑中插置一可編程空間光調變器（pSLM），pSLM具有複數個像素；以及調變通過pSLM之複數個像素中的一或多個像素的光強度，以在影像感測器的視域產生經變更的照明樣貌，其不同於在影像感測器否則所會產生之未經變更的照明樣貌。暈影可具體地被改善。

Description

減少顯微鏡成像中之暈影的設備及方法

本發明係有關於一種顯微鏡，尤其係有關於一種減少顯微鏡成像中之暈影的設備及方法。

為了在顯微鏡中獲得清晰的影像，均勻的照明域至關重要。然而，一般皆知，照明域在檢體中央附近照明較亮，且光強度朝照明域周邊沿徑向逐漸減少。這種照明改變，稱為暈影（vignetting），會造成照明域中所取得之檢體影像之分析上的困難。

不幸地，暈影問題影響幾乎各種顯微鏡。暈影最常為陰影效果所造成，這是由照明及成像光學路徑內之光學元件及孔徑的有限寬度所致。暈影也受到每一組透鏡內之像差影響。所有這些暈影源通常結合在一起，產生整個影像平面上無法被忽略的背景強度變異。

已通過在照明源之後與檢體之前設置一柔光器來嘗試校正暈影。此柔光器可為毛玻璃、非涅爾（Fresnel）透鏡、或蒼蠅眼透鏡等。除了改變照明源外，另一種校正暈影的方法包括對以遭受暈影之光所產生的影像施加一演算法，以人工校正影像來解決暈影。此方法涉及修改在遭受暈影的照明下取得之影像—其並不校正暈影本身。在這兩種情況中，難以消滅所有導致暈影之照明變異的影響。

本領域中需要得以在成像平面提供顯微鏡的整個視域之更均勻的照明光強度之設備及方法。

在第一實施例中，本發明提供一種用於校正一顯微鏡設備中的一影像感測器之整個視域的光強度之方法，以校正來自該顯微鏡設備的一光源之暈影，該顯微鏡設備包括具有像素的一影像感測器，以及一檢體台，其中來自該光源的光沿一光路徑行進至該檢體台，接著至該影像感測器，該方法包含下列步驟：在該光源與該影像感測器之間的該光路徑中插置一可編程空間光調變器（pSLM），該pSLM具有複數個像素；以及調變通過該pSLM之該等複數個像素的一或多個像素的光強度，以在該影像感測器的該視域產生一經變更的照明樣貌，其減少所會在該影像感測器產生的光暈影效果。

在第二實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該pSLM係選自由液晶顯示器、矽上液晶、數位微鏡裝置以及懸浮粒子裝置所組成之群組。

在第三實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該經變更的照明樣貌具有均勻的光強度，其中在該整個視域的光強度在該整個視域的平均強度之+/- 5%之內。

在第四實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中由來自一處理器的輸入以控制在該調變步驟中通過該一或多個像素的光強度。

在第五實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中，在該調變光強度步驟中，該處理器藉由至該一或多個像素的電信號控制通過該pSLM之該一或多個像素的光強度。

在第六實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中，在該調變步驟前，該方法更包括下列步驟：評估該顯微鏡設備的一參考照明樣貌，該評估步驟包括：將一參考檢體置於該影像感測器的該視域中，界定該pSLM的複數個區段，每一個區段具有一或多個像素，以在一功率位準P₁ 之該光源照明該參考檢體，以及藉由分別允許各個區段透射光線，同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，來分別測量在功率位準P₁ 通過該pSLM的各個區段到達該影像感測器的光強度。

在第七實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中在該分別允許各個區段透射光線且同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分的步驟中，阻擋光線至少一部分的該等區段係以該pSLM可允許的最低強度透射光線。

在第八實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中在該界定該pSLM的複數個區段之步驟中所界定的該等區段包括環狀區段及一中心區段。

在第九實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該調變通過該pSLM的光強度之步驟包括：識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min ，具有強度IS_min ；以及減少通過在功率位準P₁ 大於IS_min 的該pSLM之該等區段的各個像素之光的強度以更趨近IS_min 。

在第十實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該調變通過該pSLM的光強度之步驟包括：識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min ，具有強度IS_min ；以及分別減少通過在功率位準P₁ 大於IS_min 的該pSLM之該等區段到達該影像感測器之光的強度，此是藉由分別允許各個區段透射光線且同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，並且，對於每一個此種區段，以一第一增量值逐步增加該pSLM的吸收度直到該區段呈現IS_min 或更低的強度，其中若該強度低於IS_min ，則該方法進一步包括以小於該第一增量值之一第二增量值逐步減少在那個區段之該pSLM的吸收度。

在第十一實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中在該分別減少光強度的步驟中，阻擋光線的至少一部分之該等其餘的區段係以該pSLM可允許的最低強度透射光線。

在第十二實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該調變通過該pSLM的光強度之步驟包括：識別該參考照明樣貌中的最大光強度，在此為IT_max ；以及識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min ，具有強度IS_min ；監視S_min 的該強度同時增加該光源的功率至一功率位準P₂ ，其中S_min 的該強度被提升至IT_max ；減少通過在功率位準P₂ 大於IT_max 的該pSLM之該等區段的各個像素之光的強度以在功率位準P₂ 更趨近IT_max 。

在第十三實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該調變通過該pSLM的光強度之步驟包括：識別該參考照明樣貌中的最大光強度，在此為IT_max ；以及識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min ，具有強度IS_min ；監視S_min 的該強度I同時增加該光源的功率至一功率位準P₂ ，其中S_min 的該強度被提升至IT_max ；分別減少通過在功率位準P₂ 大於IT_max 的該pSLM之該等區段到達該影像感測器之光的強度，此是藉由分別允許各個區段透射光線且同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，並且，對於每一此種區段，以一第一增量值逐步增加該pSLM的吸收度直到該區段呈現IT_max 或更低的強度，其中若該強度低於IT_max ，則該方法進一步包括以小於該第一增量值之一第二增量值逐步減少在那個區段之該pSLM的吸收度。

在第十四實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中在該分別減少光強度的步驟中，阻擋光線的至少一部分之該等其餘的區段係以該pSLM可允許的最低強度透射光線。

在第十五實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該參考檢體為提供基於反射率的一實質上均勻背景的一參考材料，其中反射率在該影像感測器的該整個視域之變化不超過5%。

在第十六實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該參考檢體不呈現均勻的背景，並使該顯微鏡散焦以模糊該參考檢體，而提供基於反射率的一實質上均勻背景，其中反射率在該影像感測器的該整個視域之變化不超過5%。

在第十七實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其在該評估一參考照明樣貌的步驟之前更包括一對齊步驟，該對齊步驟係選自下列： a. 一主動區域界定步驟，包括： i 接續地啟動該pSLM的各個像素以透射光線，同時所有其他像素阻擋光的至少一部分， ii 針對各個接續被啟動的像素，以該影像感測器捕捉一影像， iii 將該pSLM的各個像素與該影像感測器受到該等像素啟動影響的那些像素相互關聯；以及 b. 一中心對齊步驟，包括： i 啟動涵蓋該pSLM的中心的複數個像素， ii 針對步驟b.i.的該等被啟動的複數個像素，以該影像感測器捕捉一影像， iii 比較步驟b.ii.之該影像感測器的受影響區域與該影像感測器的中心，以及若該受影響區域並未置中於該影像感測器， iv 以一中心方向移動該pSLM；以及 c. 一像素對齊步驟，包括： i 旋轉該pSLM，使得該pSLM像素的x及y方向分別與該影像感測器的x及y方向對齊；以及 d. 上述的組合。

在第十八實施例中，本發明提供一種用於變更在一顯微鏡設備中的一影像感測器之整個視域的光強度之方法，該顯微鏡設備包括一光源、一具有像素之影像感測器以及一檢體台，其中來自該光源的光沿一光路徑行進至該檢體台，接著至該影像感測器，該方法包括下列步驟：在該光源與該影像感測器之間的該光路徑中插置一可編程空間光調變器（pSLM），該pSLM具有複數個像素；以及調變通過該pSLM之該等複數個像素的一或多個像素的光強度，以在該影像感測器的該視域產生一經變更的照明樣貌，其不同於在該影像感測器否則所會產生之未經變更的照明樣貌。

在第十九實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中該調變該光強度的步驟，該處理器藉由至該一或多個像素的電信號以控制通過該pSLM之該一或多個像素的光強度。

在第二十實施例中，本發明提供如上述實施例中任一者所述之方法，其中，在該調變步驟之前，該方法進一步包括下列步驟：評估該顯微鏡設備的一參考照明樣貌，該評估步驟包括：將一參考檢體置於該影像感測器的該視域中，界定該pSLM的複數個區段，各個區段具有一或多個像素，以在一功率位準P₁ 之該光源照明該參考檢體，以及藉由分別允許各個區段透射光線，同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，來分別測量功率位準P₁ 通過該pSLM的各個區段到達該影像感測器的光強度。

圖1顯示一典型的顯微鏡系統並以符號10標示。顯微鏡系統10包括用於成像檢體之光學系統12，以及用於自動校正整個視域之光強度的暈影校正系統14，由光學系統12的光學件及成像構件界定視域。此特定系統10採用修改過的反射光顯微鏡作為光學系統12，但應注意到在此揭露之概念可輕易應用至各種類型的顯微鏡，包括但不限於，透射光顯微鏡、倒置顯微鏡、及立體顯微鏡。也應注意到照明域亦可稱為視域，且在實作上，待成像之檢體位在此域內。

光學系統12包括在物鏡18下承載檢體8之檢體台16。光學系統12進一步包括照明源20及垂直照明器36，其用於引導照明源20的光以照射在持定於視域中的檢體8。光學系統12亦包括可調整F光闌42及孔徑光闌40（A光闌）。影像感測器26接收透過物鏡18傳送之檢體的影像。影像感測器26可視為暈影校正系統14的一部分。在一些實施例中，其亦可設置為相機27的一部分。暈影校正系統14亦包括處理器28及可編程光間光調變器30（在此稱為pSLM），處理器28在影像感測器26與pSLM 30之間通訊（由符號38表示）以處理由影像感測器26所提供的影像資訊並透過使用pSLM 30來變更照明樣貌（landscape）。

可由圖1的路徑33及35來描述顯微鏡系統的光學路徑及光學元件串。路徑35為照明樣本之照明光束的路徑，且在此實施例中，透過在光線路徑35中的對角線之稜鏡（圖示但未標號）重定向光線，如反射光顯微鏡中已知者。其他顯微鏡，如透射光顯微鏡，則無需這種稜鏡。路徑33為（如在反射光顯微鏡的情況中）由在樣本平面的樣本反射或（如在透射光顯微鏡的情況中）透射穿過在樣本平面的樣本之照明光束的路徑。由路徑33及35所表示的每一條照明路徑提供其自己的照明樣貌。照明樣貌應理解為在一整個照明區域中的光強度分佈。照明樣貌的最終來源為照明源，但其可能受到各種光學構件的影響，且根據本發明，受到pSLM的影響。照明樣貌影響影像感測器26得到的影像，而在影像感測器的照明樣貌才是最重要的，因為是影像感測器記錄成像檢體台上之所要的檢體所需之資料。因此，pSLM可位在照明源20與影像感測器26之間的任何位置。位在照明源與在檢體平面之檢體之間—亦即在路徑35中—的pSLM用來變更傳遞至檢體（且因此影像感測器）之照明樣貌，而位在檢體與影像感測器之間—亦即在路徑33中—的pSLM用來變更來自檢體至影像感測器的之照明樣貌。在任一情況下，可校正照明樣貌之非所需的態樣（如暈影）或可引進所需的照明樣貌。如上述，顯微鏡之未變更過的照明樣貌通常會因暈影及各種來源所致的其他照明不勻而不均勻。在一些實施例中，pSLM將用來等化光強度以解決暈影，但在其他實施例中，其可用來故意創造出不均勻的照明樣貌。

光束34代表在被pSLM 30衰減之前來自照明源20之光線的光學路徑。光束32代表在被pSLM 30衰減之後之光線的光學路徑。在一些實施例中，處理器28及適當的硬體可用來控制檢體台16、照明源20、相機27及在此未指出的其他顯微鏡構件。

在圖1中，且為了此說明之目的，pSLM 30外部顯示為在照明源20與垂直照明器36的本體之間。可理解其亦可位在照明源20與影像感測器26之間的任何位置（如在一替代位置30a所示），並且設置在照明源20與檢體S之間最有效。舉另一例來說，亦可將pSLM 30置於垂直照明器36內A光闌40的位置處。

可編程空間光調變器（pSLMs）為以空間形態調變入射光的轉換器，該調變基於電性或光學輸入。可調變入射光之相位、強度、偏振、或方向，並可透過呈現各種光電或光磁效果的各種材料以及透過表面變形調變光線的材料來實現光調變。在本發明中，集中在透過可編程空間光調變器調變光強度來校正暈影，「可編程」一詞意指pSLM可受電性或光學輸入影響來改變在pSLM的不同位置通過pSLM之光強度。至pSLM的輸入是基於由影像感測器26獲得並經處理器28處理過之暈影資訊，且該輸入用來抵銷暈影，以在視域實現更均勻的照明。以單數概稱處理器28，但可理解到亦涵蓋複數個處理器。處理器28可透過電線或其他適當的手段，如無線通訊，與影像感測器26及空間光調變器通訊，所有這種通訊皆以符號38概略表示。可有操作人員輸入單元，如鍵盤、觸碰式螢幕或其他標準手段（以符號39概略表示）以令操作人員得以輸入所需要的控制及資料。

pSLM的範例包括透射型液晶顯示器（LCD）、矽上液晶（LCOS）、數位微鏡裝置（DMD）及懸浮粒子裝置（SPD）等。所有都有在眾多獨特的空間位置（亦即像素），通常在正方形陣列中，調變光的振幅及/或相位的能力。在諸如LCD、LCOS及DMD的一些pSLM中，可經由可連接的處理器，如處理器28，數位定址每一個像素。在諸如SPD的其他pSLM中，裝置可編程為單一單元而非多個像素。

如已知，pSLM的尺寸可變。諸如LCD、LCOS及DMD的pSLM的實際尺寸可介於1平方公分至大約10平方公分。pSLM中的像素數量，k，可介於2,000至2,000,000或更多。這些尺寸不應視為限制性，因在本發明中可使用許多不同的組態。SPD型pSLM可大如數平方公尺，但僅有一個可編程元件。

在此使用的pSLM包括複數個個別可定址的像素或像素群，意指每一個像素或像素群，適當時可受來自處理器28的信號輸入影響，而改變通過那個像素或像素群位置的光強度。個別像素強度可為可變或二元。可變的意思是透射過像素的光強度可在完全阻擋及完全透射之間變化。二元的意思是透射過像素的光可為完全透射或完全阻擋，而沒有在這兩個極端之間變化強度的能力。定址pSLM的像素或像素群並變化其光透射之能力允許改變朝在檢體台之視域及影像感測器發送的光束整個剖面之照明樣貌，並因此可藉由在遭受暈影所致之暗淡的那些空間位置傳遞較高強度的光或藉由使因暈影而有較高強度的那些空間位置變暗來校正暈影。

在一些實施例中，pSLM 30用作為振福調變器，其改變通過每一個像素的光之區域振福（亦即強度）。這顯示在圖2中，其中在pSLM 30之前，來自照明源20的光線34在像素位置x_i 會有以L(x_i )標示的強度。將從以下進一步說明更清楚，在必要時，採用處理器來透過電性輸入操縱在各個像素（如像素x_i ）的吸收度，以提供以t(x_i )標示的所得強度。在振幅調變模式中，處理器28分配值給在位置x_i 的像素，進而以因子g(x_i )衰減在像素x_i 通過pSLM之光強度。該g(x_i )之值是為處理器28所控制。若g(x_i ) = 0，停用，則透射過像素x_i 的光最小量。若g(x_i ) = 1，啟動，則透射過像素x_i 的光最大量。對於熟悉pSLM特性者，已知在g(x_i ) = 0，某程度的光仍會透射過像素x_i ，且在g(x_i ) = 1，在像素仍會衰減某程度的光。這些差異對本發明之應用微不足道。接下來使用到啟動一詞將指像素的完全啟動，而停用一詞將指像素的完全停用。

在本方法中，由pSLM進行任何變更前的照明樣貌的評估可如下：藉由在視域中放置一參考檢體，經由光源20照明參考檢體並以影像感測器26取得有關整個樣貌的光強度之一或多個影像，T。在一些實施例中，首先設定照明源之功率位準，P，以在光源能力的中等範圍之強度照射檢體。在其他實施例中，強度設定在多個位準，代表可得自光源的強度範圍。在其他實施例中，強度設定成複製在根據本發明的暈影校正後檢體成像將採用的強度。

參考檢體可為呈現出由反射率標準測量而定之均勻反射背景的參考材料。在一些實施例中，若反射率在檢體的整個視域不變化超過5%並較佳少於2%，則背景可視為均勻的。

在一些例子中，可使用無均勻反射背景的真實檢體。在這些例子中，表面不規則及顯微鏡外來物等等會造成不均勻的影像，但散焦可用來模糊這些不規則/外來物並產生適合本發明之更均勻的影像。

無論在這兩種情況的哪一種中－其中光入射在具有均勻反射背景的參考材料上或其中光入射在具有均勻背景的散焦檢體上－暈影會很明顯，如第3A圖中所例示。在一些情況中，照明可如圖3B中所示般偏離中心，並可調整顯微鏡以將照明帶到中心，如圖3A中所示。這對於當採用以暈影的暗淡效果自視域中心沿輻射狀線逐漸增加的假設為基礎之技術時特別有用。尤其，此假設是根據總體趨勢，當光源照明在中心時，但有可能照明域會有亮點及透徑或照明源所導致的其他不規則。因此，本發明的某些實施例不基於假定的輻射狀暗淡形態。由處理器28處理從（諸）暈影影像所獲得的資料以控制pSLM並用來繼續用於校正暈影的程序，以產生光強度較接近均勻的影像，如圖3D中所示。光強度的此均勻性常稱為均勻或平坦的照明域。在一些實施例中，均勻影像是其中影像的每一個像素是在平均像素強度的+/- 20%內（包含20%）者。在其他實施例中，均勻影像是其中影像的每一個像素是在平均像素強度的+/- 10%內（包含10%）者。在其他實施例中，均勻影像是其中影像的每一個像素是在平均像素強度的+/- 5%內（包含5%）者。在其他實施例中，均勻影像是其中影像的每一個像素是在平均像素強度的+/- 2%內（包含2%）者。誇大圖3的影像強度以例示暈影效果。在實作中，強度差的程度更為微妙。應理解到亦可採用pSLM來故意產生不均勻的影像，在某些成像實行或應用中可能會希望或需要如此。這已於上文中提過，因此，本發明更大致上提供用於變更整個視域之光強度（照明樣貌）的方法及設備，雖然變更以特別解決暈影係此示例的重點。

在本發明中，採用從處理器28至pSLM 30之適當的輸入來抵銷暈影效果並在視域（亦即，在持定在視域之檢體上）提供具有更均勻的強度之照明域。這涉及減少在對應於視域處有過高強度的區域之位置或增加在對應於視域處有過低強度的區域之位置穿過pSLM的光強度，或這些技術的組合。

在一些實施例中，假設暈影的暗淡效果從視域中心沿輻射狀線往外逐漸增加，如圖3A所見。藉由在檢體中心限制光線至某程度，並自中心沿同心圓往外放鬆此限制來編程pSLM以抵銷暈影。pSLM作用成將光線限制在至少約為圖3A的反相或負形態，且將有如圖3C所示。於圖3C中呈現在視域所得之經暈影減少的照明。透過多種技術可估計暈影形態並將之納入考量。應注意到圖3A的暈影形態為典型的，而非限制於此。可能從任何方向或從許多方向發生不均勻照明。本發明的實施例可校正所有類型的不均勻照明。

本發明之一較佳第一步驟為將pSLM與影像感測器26對準。一個方法是去決定pSLM 30的主動區域。主動區域是為光線所穿過而被直接成像在影像感測器26的pSLM區域。應可理解到，為了有效，放置在系統中的實際pSLM不應小於照明源的光束。但即使pSLM大於照明源的光束亦無害處。因此，pSLM的所有像素不需要都對影像感測器26所捕捉到的影像產生影像。雖此步驟非必須，其促進本發明在指定實施例中的應用。決定主動區域可基於pSLM在系統光學路徑的精準置中以及已知的系統光學特性。例如，如果已知系統的光學構件且將pSLM置中於系統的共軛焦平面之一中，可計算主動區域。

然而，本發明不需要將pSLM置於共軛平面中，且可能需要實驗上決定主動區域。欲實驗上決定主動區域，顯微鏡係聚焦於一檢體上，較佳如前述的參考檢體。pSLM的每一個像素x_i 一開始為停用。接著接續啟動每一個像素，x_i 。當每一個像素啟動時，捕捉一個影像。在啟動像素x_i+1 前，停用像素x_i 。啟動在pSLM的主動區域外的像素不會對捕捉到的影像有影響，而啟動在pSLM的主動區域內的像素會造成捕捉影像的改變。啟動pSLM的單一像素可能導致多個影像感測器像素的強度改變，因為（a）光線擴散；（b）pSLM的像素大於影像感測器的像素；或（c）影像感測器的像素沒有與pSLM的像素對齊；或（d）pSLM上一群像素被啟動，因而變更影像感測器上的多個像素。當所有pSLM像素接續啟動及停用並捕捉每一個像素啟動的影像時，pSLM像素可映射置影像感測器像素。映射意指每一個pSLM像素x_i 與給定pSLM像素啟動而產生的一或多個影像感測器像素y_i 相互關聯。更準確地說，pSLM的每一個像素，當選擇性被啟動時，照射影像感測器26的一組像素。這些像素組可具有重疊像素，但每一組映射至一特定的pSLM像素。

可藉由啟動像素群並同時停用剩餘像素來實行上述界定主動像素的步驟。像素群會與關於圖4及5所揭露的區段類似（雖本發明不限於聚集成在此所示之形狀）。

另一個對齊pSLM的方法是調整pSLM，使得pSLM的最中心像素映射至影像感測器之最中心像素。取代編程式映射pSLM像素至影像感測器像素，此方法在與影像感測器平面平行的X/Y平面中實際移動pSLM以達成置中。此方法要求pSLM安裝成使得其之位置可在X及Y方向中移動。於圖1中，藉由將x/y平移台43顯示成與pSLM 30互動來概略表示此概念的一個範例。欲置中pSLM，啟動在pSLM中心的一組pSLM像素，同時停用pSLM的所有其他像素。該組啟動的pSLM像素可位在pSLM中心或附近。可理解到一確切中心像素可能不存在，但針對置中的目的而言，在一些實施例中pSLM的中心像素可偏離中心+/- 1個像素是可被接受的。在一些應用中，pSLM的中心像素可偏離中心+/- 2個像素；在其他應用中，+/- 5個像素；在又其他應用中，+/- 10個像素；在其他應用中，+/- 15個像素；在另外其他應用中，中心像素可偏離中心多達+/- 20個像素或更多。離中心所需的接近度取決於pSLM像素的總數量。具有小量像素（例如少於500像素）的pSLM中的單一像素比較大pSLM（例如兩百萬像素）的單一像素代表相較於pSLM的總面積大上許多的面積。並且，具有小量像素的pSLM一般比具有大量像素的pSLM有更大的像素。因此，在具有較小量像素的pSLM中之單一像素在啟動時會比具有較大量像素的pSLM透射更多光線。故具有較大量像素pSLM可能需要啟動較大組的「置中」像素。啟動的像素組可能圍繞中心像素以正方形或環形態樣相等間隔。該組中的像素數量可為單一像素。在其他情況中，該組可為2至5個像素。在其他情況中，該組中的像素數量可為5至10個像素，且在其他情況中，該組中的像素數量可為10至100個像素。該組中的像素總量不可過大而使影像感測器完全被透射過pSLM的光線飽和。飽和的意思是8位元的影像感測器之每一個像素，例如，具有大於0的強度值，在一些情況中，介於50及150之間，以及在其他情況中，大於200但少於256。一旦啟動pSLM的中心組像素，捕捉影像並比較區域的照明區域與影像感測器的中心。若照明區域並未置中，則在與影像感測器平行之X及/或Y方向中移動pSLM直到照明區域置中為止。

另一種對齊方法為安裝pSLM使其在與影像感測器平行的平面中旋轉。在此方法中，啟動pSLM的單一行或多個相鄰行中的一組像素，使其通過pSLM的中心像素或pSLM的中心像素附近。除了啟動行外，啟動單一或多個相鄰列，使其通過pSLM的中心像素或pSLM的中心像素附近。啟動行與列的相鄰像素數量以及離中心的接近度也受制於前述對齊方法中所述的相同條件。當啟動行與列時，捕捉一影像。pSLM正交投射照射一正交影像於感測器上。此投射可或可不與影像感測器的像素列與行平行。若投射不平行，則旋轉pSLM直到投射與像感測器的像素列與行平行。可透過適當驅動器達成旋轉，如圖1中以44所示。

可使用將pSLM映射與對齊至影像感測器的其他方法，並可理解到可結合使用上述三種方法。還可理解到本發明無須映射及對齊，但映射及對齊可促進本發明之應用。於下詳述本發明。

欲實施本發明之方法，將pSLM離散成個別可控區段S_n 。在一些實施例中，區段僅包括一個像素，因此區段數量等於像素數量。在其他實施例中，區段數量n通常大於4（例如將影像感測器（如電荷耦合裝置（CCD）及互補金屬氧化物半導體（CMOS）分成四個象限）。在其他實施例中，區段數量大於9；在其他實施例中，大於16；在其他實施例中，大於25；且在其他實施例中，大於36。在又其他實施例中，區段數量小於400；在其他實施例中，小於225；且在其他實施例中，小於100。通常，區段數量介於16與25之間並提供優異的結果。在其他實施例中，採用介於26與100之間。

區段數量n越大，本發明減少暈影效應越有效。每一個區段S_n 由j個像素構成。在一些實施例中，一區段中的像素數量大於2並小於0.25k，其中k為影像感測器26的主動區域中之總像素量。pSLM的每一個區段由一組像素PS_n 構成。pSLM的一個範例有16個區段Sn，其中n = 1至16，如圖4A中所示。針對此範例的目的，區段以正方形顯示，但在其他例子中可具有不同的幾何形狀。

為了示例及簡單性，使用首先敘述的用以界定pSLM的主動區域之對齊方法。因此，pSLM的非主動區域由圖4A中標為Q的像素所示。此實施例的第一步驟為評估顯微鏡設備的參考照明樣貌，以透過pSLM實施更希望的照明樣貌。如上述及圖解，此公開著重在產生較均勻的照明樣貌以抵銷暈影效應，但亦可以根據本發明的pSLM實施非均勻樣貌。欲評估參考照明樣貌，照明設定在P₁ 的固定功率並如圖4B中般在所有區段啟動下捕捉影像T。藉由熟悉本領域之技藝者已知的方法，可決定影像T的最大強度與最小強度，並分別在此稱為IT_max 及IT_min 。

使P₁ 維持不變，停用pSLM的全部像素。接著輪流啟動並停用每一個區段，在每一次區段啟動時捕捉一影像。在圖4D及圖4F中顯示頭兩次啟動順序（啟動S₁ 及S₂ ）的捕捉到之影像範例。在此實施例中，停用的區段為黑色，亦即光線完全阻擋，但可理解到，由於某些pSLM的特性，在完全停用一區段時仍可能會有一些光線透射過那個給定區段。這不影響本發明的操作。在一些實施例中，停用區段阻擋光線的至少一部分，在其他實施例中，以pSLM允許的最低強度透射光線。在每一次區段啟動時，計算並記錄啟動區段的平均強度值，且這些值在此標示為I(PS₁ )、I(PS₂ )、...、I(PS_n )。本發明的目的在於評估不同區段的強度，並藉由變更（有必要的話）通過每一個區段的像素PS_n 之光強度來產生平坦的照明域，因此此平坦的照明域之平均強度將標為目標強度C。

欲得到C，必須針對PS_n 之每一個像素決定一衰減因子f_n 。此因子用來設定組PS_n 之每一個像素的衰減值g(x)，使得g(PS_n )= f_n 。可由下決定因子f_n ： f_n = (I(PS_n ) - C) / I(PS_n ) 其中: (1) f_n = 區段S_n 的衰減因子 C = 平坦照明域的目標強度 I(PS_n ) = 區段n的無衰減強度值

藉由結合照明功率的改變及pSLM的編程來實現此實施例之用於獲得平坦照明域的一個方法。根據參考照明樣貌的評估，已知IT_max 。可替代地藉由在上述分區段程序期間識別提供最高光強度的像素區段來決定IT_max 。在此實施例中，將照明功率增加到P₂ ，使得呈現最低強度的區段S_min 的影像強度等於IT_max 。欲決定P₂ ，啟動區段S_min 並停用pSLM的所有其他像素。當啟動S_min 的同時，逐步增加照明功率位準直到I(PS_min )= IT_max 。在每一次增量功率位準捕捉一個影像並測量強度。當I(PS_min )= IT_max 時，照明功率位準設定成P₂ 。以下列方式獲得此實施例的平坦照明域：藉由施加衰減因子f_n 至每一個區段的每一個像素，使得當施加因子時，所得的影像在功率位準P₂ 會有恆定值C = IT_max 。

欲決定f_n ，所有pSLM區段一開始皆停用。啟動第一個區段S₁ 並捕捉影像。由於已設定功率位準P₂ 使得最低強度區段S_min 的強度等於IT_max ，所有其他區段在啟動時會有大於IT_max 的強度。因此，可衰減除了S_min 的所有其他區段以實現等於IT_max 的影像強度。在此範例中C = IT_max 。欲計算每一個區段達到IT_max 所需的強度之因子f_n ，以IT_max 取代式子（1）中的C： f_n = (I(PS_n ) -IT_max ) / I(PS_n ) 其中: (2) f_n = 區段S_n 的衰減因子 I(PS_n ) = 在功率位準P₂ 區段n的無衰減強度值

藉由調整pSLM的每一個區段之每一個像素來獲得校正的照明域如下： g(p₁ S₁ ) = f₁ ; g(p₂ S₁ ) = f₁ ; …; g(p_j S₁ ) = f₁ g(p₁ S₂ ) = f₂ ; g(p₂ S₂ ) = f₂ ; …; g(p_j S₂ ) = f₂ g(p₁ S_n ) = f_n ; g(p₂ S_n ) = f_n ; …; g(p_j S_n ) = f_n

分配給區段的每一個像素之吸收度值將標示為：(PS_n ) = f_n ，其中PS_n 是包含在區段S_n 中的每一個像素。應注意到每一個區段可含有不同數量的像素，但為了在此範例的目的，所有區段都具有相等數量的像素。在無需衰減之像素區段，亦即那些已經以希望的目標強度C透射的區段，g(x)為1，使得那些區段的像素無任何衰減地透射（除了因pSLM本身性值而造成的任何固有衰減外），且在需要衰減之像素區段，亦即那些已經以高於希望的目標強度C透射的區段，g(x)設定在從0至小於1，以因此僅透射強度的某個百分比。採用處理器28來透過電性輸入操縱pSLM在給定區段之像素的吸收度。

可能需要重複分區段步驟（依據圖4C至4E），並決定及施加衰減因子直到達成暈影的可接受改善。雖在一些實施例中，可接受的改善會基於操作人員的主觀判斷，在一些實施例中，可接受的改善將基於根據先前關於「均勻影像」所揭露者、依據平均像素強度提供均勻的影像。

取代計算因子f_n ，亦可以實驗決定g(PS₁ )。如上述，增加照明功率至P₂ 直到呈現最低強度的區段S_min 的影像強度等於IT_max 。啟動區段S₁ 的像素並停用pSLM的所有其他像素。可逐步增加區段S₁ 中的像素組之吸收度因子g(PS₁ )並在每一次增量捕捉一個影像，直至IS₁ = IT_max 。例如，自g(PS₁ ) = 0開始，可以0.1逐量增加g(PS₁ )，直到IS₁ ≥ IT_max 。若IS₁ ＞ IT_max ，則以0.01（相對較小的增量）逐量減少g(PS₁ )，直到IS₁ = IT_max 。針對每一個區段S_n 重複此程序直到評估所有n個區段，並且所有區段的強度IS_n = IT_max 。

此實施例獲得平坦照明域的另一種方法為保持原始照明功率位準P₁ 並將pSLM的區段編程為相等。在此方法中，需將所有區段衰減至具有最小強度IS_min 的區段。在此範例中，所有區段於是具有強度≥ IS_min 。如下般獲得此實施例中的平坦照明域：藉由施加衰減因子f_n 至每一個區段的每一個像素，使得當施加衰減因子時，所得影像在功率位準P₁ 會有恆定值C = IS_min 。

欲決定在P₁ 的f_n ，所有pSLM區段一開始皆停用。啟動第一個區段S₁ 並捕捉影像。已知所有區段的強度都等於或大於IS_min 。因此，可衰減除了在S_min 的所有其它區段以實現等於IS_min 的影像強度。每一個區段根據式子（1）達到C = IS_min 所需的強度之因子為： f_n = (I(PS_n ) - IS_min ) / I(PS_n ) (3)

如上述，一區段的每一個像素之吸收度值將標示為：g(PS_n ) = f_n ，其中PS_n 是包含在區段S_n 中的每一個像素。

如上述，亦可實驗決定因子f_n 。

本發明的另一個實施例尤其校正呈現如圖4A中所示之輻射狀暈影的暈影。圖5A顯示此暈影具有中心區域（A₁ ）及離散的環狀區域（A₂ 至A_n ）。中心區域及環狀區域統稱為環狀區域（A₁ 至A_n ）的部分，雖然中心區域並非環形。中心區域A₁ 具有可以像素為單位測量之半徑。在一些實施例中，中心區域的半徑為2個像素或更多，在其他實施例中，5個像素或更多，在其他實施例中，10個像素或更多，在其他實施例中，25個像素或更多，以及在其他實施例中，50個像素或更多。每一個環具有內及外半徑ri及ro，其可以像素為單位測量。每一個環的寬度w為（ro - ri）。在一些實施例中，環的數量為2或更多個，在其他實施例中，5或更多個，在其他實施例中，10或更多個，在其他實施例中，25或更多個，以及在其他實施例中，50或更多個。在一些實施例中，環的寬度可為2個像素或更多，在其他實施例中，5個像素或更多，在其他實施例中，10個像素或更多，在其他實施例中，25個像素或更多，以及在其他實施例中，50個像素或更多。最佳地，環的數量可視為pSLM中像素數量k及環的寬度w之函數。例如，若pSLM具有k個像素並選擇10個環，則每一個環為k/10寬。環的確切數量及環的寬度不影響本發明之上位概念。亦應注意到每一個環的寬度可不同—例如，環A2具有大於A3的寬度—但針對此範例的目的，所有環的w皆為相同。如同前面的實施例般，可藉由各種方法決定因子f_n ，包括那些已敘述者。在圖5A至圖5F中，顯示完美的圓環以幫助視覺上理解方法，但可理解到透射光會被根據透射光線的那些像素像素化。

應注意到上述方法使用pSLM，其具有介於0與1（包括0及1）之間的連續可變吸收度值g(x)。注意到某些pSLM為二元化，所以g(x) = 0或g(x) = 1。在這些情況中，區段的像素選擇性設定成g(x) = 0或g(x) = 1，所以區段的像素密度設定成等於吸收度因子f。一區段的像素密度為 D_n = K_n / R_n 其中: (4) D_n = 第n個區段的像素密度 K_n = 第n個pSLM區段的被啟動像素數量(亦即g(x) = 1) R_n = 第n個pSLM區段的總像素數量 可注意到如先前決定D_n = f_n 。在一些實施例中，啟動的像素形成一個樣態，較佳均等分散於整個區段中。

這些所述的實施例示例本發明的應用，但這些方法並不應視為限制性。區段可為任何尺寸或形狀，並可採用其他數學、統計及實驗方式來實現平坦照明域的希望效果。

有鑑於前述，應理解到本發明藉由提供用於減少顯微鏡成像中的暈影之設備及方法來明顯改善先前技術，該設備及方法在結構及功能上有若干改良。雖已在此詳細揭露本發明的特定實施例，應理解到本發明不限於此，且由此本領域具有通常知識者將容易理解到本發明之變化。將從下面的申請專利範圍理解到本發明的範疇。 術語： d 影像感測器之像素數量 y_i 影像感測器的第i個像素 k pSLM中的像素數量 x_i pSLM陣列的第i個像素，1≤ i ≤ k I pSLM或影像感測器的像素、區段、或整個陣列的強度 L(x_i ) 在進入pSLM陣列的第i個像素前的光強度 g(x_i ) pSLM陣列的第i個像素之衰減值，其中g(x_i )為0 ≤ g(x) ≤ 1 t(x_i ) 透射過pSLM陣列的第i個像素之光強度 n pSLM的離散區段數量 S_n pSLM的第n個區段。1 ＜ n ＜ pSLM中的像素數量 p_j S_n 區段S_n 的第j個像素 PS_n 組成區段S_n 的像素組 I(PS_n ) 組成pSLM的第n個區段之像素平均強度。此強度是在pSLM衰減前在影像感測器上測量而得 g(PS_n ) 施加至pSLM的區段S_n 中所含的每個像素之吸收度值 P 照明源的功率位準 C 代表平坦照明域的捕捉影像之目標強度值 f_n 第n個區段中的像素之乘數的吸收度值，使得f_n x IPS_n = C T 影像感測器捕捉到的影像 IT_max 影像T的最大強度 S_min 呈現最小強度之pSLM區段 IS_min 區段S_min 的最小強度 g(PS_n ) 第n個pSLM區段之衰減值 A_n pSLM的第n個環狀區段 D_n 第n個pSLM區段之像素密度 K_n 第n個pSLM區段之被啟動像素的數量 R_n 第n個pSLM區段之像素的總數

8‧‧‧檢體 10‧‧‧顯微鏡系統 12‧‧‧光學系統 14‧‧‧暈影校正系統 16‧‧‧檢體台 18‧‧‧物鏡 20‧‧‧照明源 26‧‧‧影像感測器 27‧‧‧相機 28‧‧‧處理器 30‧‧‧可編程光間光調變器 30a‧‧‧pSLM替代位置 32‧‧‧光束 33‧‧‧路徑 34‧‧‧光束 35‧‧‧路徑 36‧‧‧垂直照明器 38‧‧‧通訊 39‧‧‧操作人員輸入單元 40‧‧‧A光闌 42‧‧‧F光闌 43‧‧‧x/y平移台 44‧‧‧驅動器

圖1為根據本發明的顯微鏡設備之一概略示意圖；

圖2為根據本發明的可編程空間光調變器（pSLM）的一部分之一概略示意圖；

圖3A為顯示輻射狀暈影光線的概略示意圖，其可能出現在顯微鏡的樣本平面；

圖3B為顯示離軸暈影光線的概略示意圖，其可能出現在顯微鏡的樣本平面；

圖3C為顯示透過使用pSLM來產生圖3A之輻射狀暈影形態之所預期之反相；

圖3D顯示當使用具有圖3C的倒暈影形態的pSLM來調變產生圖3A之暈影形態的光時在樣本平面的所得之照明域；

圖4A為分成n個離散矩形區段（S₁ 、S₂ 、…S_n ）的pSLM，其中所有像素皆被啟動；

圖4B為在圖4A中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像；

圖4C為顯示區段S₁ 被啟動及所有其他區段被停用的pSLM；

圖4D為在圖4C中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像；

圖4E為顯示區段S₁ 被啟動及所有其他區段被停用的pSLM；

圖4F為在圖4E中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像；

圖5A為分成n個離散環形區段（A₁ 、A₂ 、…A_n ）的pSLM，其中所有像素皆被啟動；

圖5B為在圖5A中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像；

圖5C為顯示區段A₁ 被啟動及所有其他區段被停用的pSLM；

圖5D為在圖5C中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像；

圖5E為顯示區段A₃ 被啟動及所有其他區段被停用的pSLM；以及

圖5F為在圖5E中所示的pSLM之情況下由影像感測器捕捉到的影像。

8‧‧‧檢體

10‧‧‧顯微鏡系統

12‧‧‧光學系統

14‧‧‧暈影校正系統

16‧‧‧檢體台

18‧‧‧物鏡

20‧‧‧照明源

26‧‧‧影像感測器

27‧‧‧相機

28‧‧‧處理器

30‧‧‧可編程光間光調變器

30a‧‧‧pSLM替代位置

32‧‧‧光束

33‧‧‧路徑

34‧‧‧光束

35‧‧‧路徑

36‧‧‧垂直照明器

38‧‧‧通訊

39‧‧‧操作人員輸入單元

40‧‧‧A光闌

42‧‧‧F光闌

43‧‧‧x/y平移台

Claims (18)

1. 一種用於校正一顯微鏡設備中的一影像感測器之整個視域的光強度之方法，以校正來自該顯微鏡設備的一光源之暈影，該顯微鏡設備包括具有像素的該影像感測器，以及一檢體台，其中來自該光源的光沿一光路徑行進至該檢體台，接著至該影像感測器，該方法包括：在該光源與該影像感測器之間的該光路徑中插置一可編程空間光調變器(pSLM)，該pSLM具有複數個像素；以及藉由向一或多個像素施加電信號以控制通過該pSLM之該一或多個像素的光強度來調變通過該pSLM之該等複數個像素中的該一或多個像素的光強度，以在該影像感測器的該視域產生一經變更的照明樣貌，其中通過該一或多個像素的光強度在完全被阻擋及完全被傳送之間變化。
2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該pSLM係選自由液晶顯示器、矽上液晶、數位微鏡裝置以及懸浮粒子裝置所組成之群組。
3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該經變更的照明樣貌具有均勻的光強度，其中在該整個視域的該光強度在該整個視域的平均強度之+/- 5%之內。
4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中由來自一處理器的輸入控制通過該一或多個像素的該光強度。
5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中，在調變前，該方法進一步包括：評估該顯微鏡設備的一參考照明樣貌藉由：將一參考檢體置於該影像感測器的該視域中，界定該pSLM的複數個區段，每一個區段具有一或多個像素的像素，以在一功率位準P₁之該光源照明該參考檢體，以及藉由分別允許各個區段透射光線，同時其餘的區段阻擋光線的至少一部分，來分別測量在功率位準P₁之通過該pSLM的各個區段到達該影像感測器的光強度。
6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，阻擋光線至少一部分的該其餘的區段係以該pSLM可允許的最低強度透射光線。
7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該pSLM的複數個區段中所界定的區段包括環狀區段及一中心區段。
8. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中調變通過該pSLM的光強度包括： 識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min，具有強度IS_min；以及減少通過在該功率位準P₁大於IS_min的該pSLM之該等區段的各個像素之光的強度以更趨近該IS_min。
9. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該調變通過該pSLM的光強度之步驟包括：識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min，具有強度IS_min；以及分別減少通過在該功率位準P₁大於該IS_min的該pSLM之該等區段到達該影像感測器之光的強度，此是藉由分別允許各個區段透射光線同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，並且，對於每一此種區段，以一第一增量值逐步增加該pSLM的吸收度直到每一區段呈現IS_min或更低的強度，其中若該強度低於該IS_min，則該方法進一步包括以小於該第一增量值之一第二增量值逐步減少在那個區段之該pSLM的吸收度。
10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中，阻擋光線的該至少一部分之該等其餘的區段以該pSLM可允許的最低強度透射光線。
11. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中調變通過該pSLM的光強度包括： 識別該參考照明樣貌中的最大光強度，在此為IT_max；識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min，具有強度IS_min；監視S_min之強度且同時增加該光源的功率至一功率位準P₂，其中S_min之強度提升至IT_max；以及減少通過在該功率位準P₂大於該IT_max之該pSLM之該等區段的各個像素之光的強度，以在該功率位準P₂更趨近該IT_max。
12. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中調變通過該pSLM的光強度包括：識別該參考照明樣貌中的最大光強度，在此為IT_max；識別具有該參考照明樣貌的最低強度之區段，在此為S_min，具有強度IS_min；監視S_min之強度且同時增加該光源的功率至一功率位準P₂，其中S_min之強度提升至IT_max；以及分別減少通過在功率位準P₂大於IT_max之該pSLM之該等區段到達該影像感測器之光的強度，此是藉由分別允許各個區段透射光線且同時其餘的區段阻擋光線的至少一部分，並且，對每一此種區段，以一第一增量值逐步增加該pSLM的吸收度直到每一區段呈現該IT_max或更低的強度，其中若該強度低於該IT_max，則該方法進一步包含以小於該第一增量值之一第二增量值逐步減少在那個區段該pSLM的吸收度。
13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中阻擋光線的至少一部分之該等其餘的區段係以該pSLM可允許的最低強度透射光線。
14. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該參考檢體為提供基於反射率的一實質上均勻背景之一參考材料，其中該反射率在該影像感測器的整個視域不超過5%的變化。
15. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該參考檢體不呈現均勻的背景，並使該顯微鏡設備散焦以模糊該參考檢體，提供基於反射率的一實質上均勻之背景，其中該反射率在該影像感測器的整個視域不超過5%的變化。
16. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其在該評估該參考照明樣貌之前更包括一對齊步驟，該對齊步驟係選自下列：a.一主動區域界定步驟，包括：i 接續地啟動該pSLM的各個像素以透射光線，同時使所有其餘像素阻擋光的至少一部分，ii 針對各個接續啟動的像素，以該影像感測器捕捉一影像，以及iii 將該pSLM的各個像素與該影像感測器受到該 等像素啟動影響的那些像素相互關聯；以及b.一中心對齊步驟，包括：i 啟動涵蓋該pSLM的中心的複數個像素，ii 針對步驟b.i.的該等被啟動的複數個像素，以該影像感測器捕捉一影像，iii 比較步驟b.ii.之該影像感測器的受影響區域與該影像感測器的中心，以及若該受影響區域並未置中於該影像感測器，iv 以一中心方向移動該pSLM；c.一像素對齊步驟，包括：i 旋轉該pSLM，使該pSLM的一或多個像素的x及y方向分別與該影像感測器的x及y方向對齊；以及d.上述的組合。
17. 一種用於變更在一顯微鏡設備中的一影像感測器之整個視域的光強度之方法，該顯微鏡設備具有一光源、該具有像素之影像感測器以及一檢體台，其中來自該光源的光係沿一光路徑行進至該檢體台，接著至該影像感測器，該方法包括：在該光源與該影像感測器之間的該光路徑中插置一可編程空間光調變器(pSLM)，該pSLM具有複數個像素；以及藉由向一或多個像素施加電信號以控制通過該pSLM之該一或多個像素的光強度來調變通過該pSLM之該等複 數個像素中的該一或多個像素的光強度，以在該影像感測器的該視域產生一經變更的照明樣貌，其不同於未經變更的照明樣貌，其中通過該一或多個像素的光強度在完全被阻擋及完全被傳送之間變化。
18. 如申請專利範圍第17項所述的方法，其中，在調變之前，該方法包括：評估該顯微鏡設備的一參考照明樣貌，藉由：將一參考檢體置於該影像感測器的該視域中，界定該pSLM的複數個區段，各個區段具有一或多個像素，以在一功率位準P₁之該光源照明該參考檢體，以及藉由分別允許各個區段透射光線，同時使其餘的區段阻擋光線的至少一部分，來分別測量在該功率位準P₁通過該pSLM的各個區段到達該影像感測器的光強度。

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