DD279962B5 - Konfokales Laserrastermikroskop - Google Patents

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung ist für die Anwendung in Laserrastermikroskopen vorgesehen. Im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie wird bei der Laser-Raster-Mikroskopie das Objekt mit einem fokussierten Laserstrahl beleuchtet. Jede durch punktförmige Bestrahlung des Objektes ausgelöste physikalische Wechselwirkung kann mit einem geeigneten Empfänger erfasst und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenz, ausgelöster Photostrom) verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Laserrastermikroskope können in ihrer allgemeinen Form als optische Systeme aufgefasst werden, die eine punktförmige Lichtquelle auf das Objekt abbilden. Das vom Objektpunkt ausgehende Signal wird durch einen geeigneten Detektor erfasst. Ein entsprechendes Bild wird durch rasterförmige Abtastung des Objektes (Relativbewegung zwischen Objekt und Beleuchtungsstrahl) aufgenommen (Wilson, Sheppard: „Theory and Practice of Scanning optical Microscopy", Academic Press 1984).

Ein hervorstechendes Merkmal sogenannter konfokaler Anordnungen ist die hohe Tiefenauflösung. Bei diesen Anordnungen wird die wirksame Empfängerfläche kleiner als der Durchmesser des bei Abbildung eines punktförmigen Objektes entstehenden Beugungsscheibchens gehalten. Man kann von einem Punktdetektor sprechen. Damit wird eine kohärente Übertragung gewährleistet.

Anordnungen dieser Art werden auch als Laserrastermikroskope vom Typ Il bezeichnet.

Der grundlegende Aufbau einer solchen Anordnung ist in dem US-Patent 3 013 467 beschrieben. Nachteilig bei allen derartigen Einrichtungen ist die hohe Empfindlichkeit der Justierung der drei ineinander abzubildenden Punkte: Punktlichtquelle - Objektpunkt - Punktdetektor. Bereits geringste laterale Verlagerungen besonders der Punktlichtquelle gegenüber dem Punktdetektor verändern einschneidend die Bildinformation. Das dabei angewandte Objektscanning ist relativ langsam und erfordert an die Scanningeinrichtung und deren Parameter angepasste Objekte.

In einer weiteren bekannten Anordnung (DE 3 422 143 A1) sind bereits erste praktische Ansätze erkennbar, durch geeignete Strahlführung das sog. Strahlscanning durchzufahren und dabei die Empfindlichkeit des Mikroskopaufbaues gegenüber Instabilitäten zu reduzieren. In dieser Anordnung wird das zu untersuchende Licht erst kurz vor der Ebene, in der der Punktdetektor angeordnet ist, vom beleuchtenden getrennt, so dass Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang die gleichen Elemente durchlaufen und aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtweges sich Auswirkungen geringer Instabilität wieder kompensieren. Erst nach einem Teilungselement (in Untersuchungsrichtung gesehen) werden unterschiedliche Wege durchlaufen, in denen Abweichungen von der exakten Zentrierung auftreten.

Die genannte Anordnung verwendet beleuchtungsseitig eine Punktlichtquelle (Punktblende, Lasertaille), die als „Sonde" in das Objekt und von dort auf dem Abbildungsweg in eine Punktblende abgebildet wird. Das Bild der beleuchtungsseitigen Blende, dessen Durchmesser wenige μιτι beträgt, muss konstant auf Bruchteile seines Durchmessers zur abbildungsseitigen Blende justiert bleiben. Dabei ist der Justiervorgang recht aufwendig und die Sicherung der exakten Justierung über längere Zeiträume auch aufgrund von Umwelteinflüssen, äußerst schwierig, da die beiden von der Strahlenteilung aus getrennt laufenden Strahlengänge durch Alterung von Bauteilen, thermische Veränderungen, Luftschlieren zeitweilig oder ständig dejustiert werden.

Weiterhin wirkt sich ein anderer Umstand ebenfalls nachteilig aus. Verändert sich z. B. durch Höhenunterschiede im Objekt die Lage der Objektebene, so entsteht auf dem Objekt ein Zerstreuungskreis des Bildpunktes der beleuchtungsseitigen Punktblende. In die beobachtungsseitige Blende fällt dann ein geringerer Lichtstrom, woraus eine hohe Tiefenauflösung resultiert. Um wieder optimale Abbildungsverhältnisse zu erzeugen, muss das Objekt selbst axial so verschoben werden, bis es seine alte Lage wieder einnimmt. Die dazu erforderlichen Feinbewegungen im Ο,Ι-μΓη-Bereich sind mit hohem technischen Aufwand verbunden. Mit Hilfe eines aktiven Spiegels wird die Auswirkung der Defokussierung bezüglich der Intensität kompensiert. Es wird ein Fokus der beleuchtungsseitigen Blende in der beobachtungsseitigen Punktblende bzw. auf dem Punktdetektor erzeugt. Das Objekt liegt dabei aber nicht mehr im Fokus, so dass die laterale Auflösung reduziert wird.

In US Re32660 ist ein konfokales Abbildungssystem mit einer Lochplatte beschrieben, wobei mit Polarisationsmitteln unerwünschte Reflexe unterdrückt werden.

US 3 013 467 beschreibt die Bilderzeugung über eine bewegte Rasterplatte.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit geringem Aufwand eine automatische Fokussierung zu erreichen, ohne dabei in das Mikroskopsystem einzugreifen.

Die Aufgabe wird bei einem konfokalen Laserrastermikroskop gemäß dem Oberbegriff des ersten Anspruchs durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen bestehen darin, dass Mittel, wie Polarisatoren, ein Chopper, mindestens ein Sperrfilter, zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind.

Durch die Trennung von beleuchtender und abbildender Strahlung in Abbildungsrichtung gesehen hinter der Blende, sind eine Modenblende im Beleuchtungsstrahlengang und die Empfängerblende identisch. Lageveränderungen der Blende gegenüber der Optik führt das Blendenbild in gleicher Größe und Richtung mit aus, so dass das Bild der Modenblende zwangsläufig zur Punktblende zentriert bleibt. Dadurch ist stets eine exakte räumliche Zuordnung von Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor gegeben. Zur erforderlichen Trennung der Signalstrahlung von Strahlungskomponenten, die durch Reflexion an der Blende oder Streuung an Elementen im Strahlengang entstehen, werden

• polarisationsoptische Elemente (Pol-Filter, λ/4-Platten),

• interferenzoptische Methoden,

• ein Choppern des Signalstrahlenganges, zeitempfindliche Signaldetektoren (gating, Laufzeit) oder

• spektrale Filter bei Fluoreszenzverfahren vorgesehen.

Die axiale Verstellung einer zweiten verschiebbaren Linse im Strahlengang wird zur Fokussierung auf die Objektebene bzw. zur Aufnahme des Höhenprofils des Objektes verwendet. Das konfokale Laserrastermikroskop wird im folgenden näher erläutert, es ist zur Aufnahme von Auflicht- oder Fluoreszenzbildern geeignet.

Beleuchtungsseitig ist eine körperliche Blende angeordnet, die gegebenenfalls im Fokus eines Teleskopsystems steht und als Mittel zur K-Raum-Filterung dient. Diese Blende entspricht der punktförmigen Lichtquelle, die über eine entsprechende Optik auf das Objekt abgebildet wird. Ein in der Erfindung wahlweise vorgesehener Referenzdetektor ermittelt die Intensität des beleuchtenden Laserlichtes. Das bei der Beleuchtung des Objektes vom Objekt ausgehende Signallicht (Reflexion, Streuung, Fluoreszenz) durchläuft alle optischen Elemente des Beleuchtungsstrahlenganges in entgegengesetzter Richtung wie der Beleuchtungsstrahl selbst. Im Unterschied zu bekannten konfokalen Anordnungen trifft das Signallicht auf die erwähnte, im Beleuchtungsstrahlengang stehende Blende, die aufgrund der Anordnung stets zentriert bleibt. Nur das Zentrum des Beugungsscheibchens des Signallichts kann die Blende passieren. Das durch die Blende tretende Signallicht wird durch geeignete Mittel vom Beleuchtungsstrahlengang separiert (Strahlteiler) und auf den Signaldetektor gerichtet. Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses wird durch die in der Erfindung wahlweise vorgesehene Unterdrückung ungewünschter Polarisationskomponenten, durch Intensitätsmodulation und damit Lock-in-Nachweis, durch langzeitempfindliche Signaldetektoren (gating), oder durch Wellenlängsenelektion bei Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Zur automatischen Fokussierung auf die Objektebene kann in der erfindungsgemäßen Lösung eine der zwischen Blende und Objekt stehenden Linsen, im einfachsten Fall die der Blende am nächsten stehende, eingesetzt werden. Hierfür ist in der Erfindung eine Lösung zur axialen Translation der entsprechenden Linsen vorgesehen. Der Abstand Linse - Blende wird damit so eingestellt, dass die jeweils am Signaldetektor ankommende Lichtintensität maximal ist, womit eine Scharfstellung auf die Objektebene automatisch gewährleistet ist. Wird zusätzlich der Abstand zwischen Blende und der zweiten verschiebbaren Linse bei der Abtastung des Objektes an jedem Punkt ermittelt, erhält man das Höhenprofil des Objektes. Im Gegensatz zu bisher bekannten konfokalen Anordnungen tritt bei der erfindungsgemäßen Lösung bei dieser Vorgehensweise der Ermittlung von Höhenprofilen des Objektes kein lateraler Auflösungsveriust ein, da Punktlichtquelle und Punktempfänger zusammen fallen und, sobald die Lichtquelle in die Objektebene abgebildet wird, der Punktempfänger automatisch in der konjugierten Ebene liegt.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der Zeichnung ist schematisch das konfokale Laserrastermikroskop dargestellt. Ein Laser 1 wird über einen ersten Polarisator 2, einen ersten Strahlteiler 3 und die erste λ/4-Platte 4 mit Hilfe der ersten Linse 5 auf eine körperliche Blende 6 fokussiert. Diese Blende dient in der erfindungsgemäßen Lösung gleichzeitig als K-Raum-Filter und als Modenblende. Mit der zweiten verschiebbaren Linse 7 wird die Strahlung kollimiert und durch das Laserrastermikroskop auf die Objektebene 11 fokussiert. Um die vom Objekt den gleichen Lichtweg zurückkommende Signalstrahlung, die über den ersten Strahlenteiler 3 auf den Signaldetektor 13 gelangt, von der an der K-Raumblende zurückgesteuerten Störstrahlung zu unterscheiden, sind aufgabenabhängig verschiedene Mittel vorgesehen: Die Polarisationsrichtung der Signalstrahlung wird mit der λ/4-Platte 4 so gedreht, dass sie den zweiten Polarisator 14 passieren kann. Da sich die λ/4-Platte 4 unmittelbar über dem Objektiv 8 befindet, erfolgt für die Störstrahlung zwischen erstem Strahlteiler 3 und λ/4-Platte 4 keine Drehung der Polarisationsrichtung, so dass diese Störstrahlung am Polarisator 14 unterdrückt wird.

Ein Chopper 15 im Abbildungsstrahlengang A ermöglicht einen Lock-in-Nachweis des Signales.

Bei Fluoreszenz der Probe wird das Fluoreszenzsignal durch ein Sperrfilter 17, das die Laserwellenlänge sperrt, vor dem Signaldetektor 13 unterdrückt. Zur Korrektur von Schwankungen der Laserleistung im Laserrastermikroskop ist der zweite Strahlteiler 9 und der Referenzdetektor 12 vorgesehen. Eine automatische Fokussierung des Laserrastermikroskopes lässt sich durch Registrieren der maximalen Signalintensität bei axialer Verschiebung beispielsweise der zweiten verschiebbaren Linse 7 erreichen. Damit ist auch eine Betriebsart zur Vermessung der Höhenstruktur der Proben möglich, indem die Lage der zweiten verschiebbaren Linse 7 bei maximaler Signalintensität in Abhängigkeit vom Objektort aufgetragen wird.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1. Konfokales Laserrastermikroskop mit einer Laserlichtquelle (1) zur punktförmigen Beleuchtung der Objektebene (11), mit einem Strahlaufweitungssystem (5, 7), bestehend aus einer ersten Linse (5) zur Fokussierung des Laserlichtes auf eine Lochblende (6) und einer dieser Lochblende (6) im Strahlengang nachgeordneten zweiten Linse (7) zur Erzeugung eines der Objektivlinse (8) zugeführten Parallellichtbündels und mit einem Strahlteiler (3) zwischen der Laserlichtquelle (1) und der ersten Linse (5), der das Objektlicht reflektierend zu einem Detektor (13) auskoppelt, dadurch gekennzeichnet, dass die der Lochblende (6) nachgeordnete zweite Linse (7) in Strahlrichtung verschiebbar ausgebildet ist und eine Einstellung der Lage des Laserfokus senkrecht zur Objektebene (11) gewährleistet.
2. 2. Kofokales Laserrastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Trennung des Objektlichtes von reflektiertem oder gestreutem Störlicht alternativ zwei Polarisatoren (2, 14) mit einer zugehörigen λ/4-Platte (4) oder ein Chopper (15) oder ein Sperrfilter (17) vorgesehen sind.