DD279962A1 - Konfokales laserrastermikroskop - Google Patents

Abstract

Konfokales Laserrastermikroskop, bei dem die durch die punktförmige Bestrahlung einer Probe ausgelöste physikalische Wechselwirkung mit einem geeigneten Empfänger erfasst und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften verwandt wird. Seine Abbildungsqualität (Auflösung) ist weitgehend unabhängig von äußeren mechanischen oder thermischen Störeinflüssen bei vergleichsweise geringem Aufwand. Dieses wird erreicht, indem eine Blende im Strahlaufweitungssystem des Beleuchtungsstrahlenganges derart angeordnet ist, dass diese Blende Modenblende des Beleuchtungsstrahlenganges und gleichzeitig Detektorblende des Abbildungsstrahlenganges ist. Figur{konfokales Laserrastermikroskop; Strahlablenkung; fotoelektrischer Empfänger; Modenblende; Detektorblende; gemeinsame Blende}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung ist für die Anwendung in Laserrastermikroskopen vorgesehen. Im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie wird bei der Laser-Raster-Mikroskopie das Objekt mit einem fokussieren Laserstrahl beleuchtet. Jede durch punktförmige Bestrahlung des Objektes ausgelöste physikalische Wechsf !wirkung kann mit einem geeigneten Empfänger erfaßt und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenz, ausgelöster Photostrom) verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Laserrastermikroskope können in ihrer allgemeinen Form als optische Systeme aufgefaßt werden, die eine punktförmige Lichtquelle auf das Objekt abbilden. Das vom Objektpunkt ausgehende Signal wird durch einen geeigneten Detektor erfaßt. Ein entsprechendes Bild wird durch rasterförmige Abtastung des Objektes (Relativbewegung zwischen Objekt und Beleuchtungsstrahl) aufgenommen (Wilson, Sheppard: „Theory and Practice of Scanning optical Microscopy", Academic Press

Ein hervorstechendes Merkmal sogenannter konfokaler Anordnungen ist die hohe Tiefenauflösung. Bei diesen Anordnungen wird die wirksame Empfängerfläche kleiner als der Durchmesser des bei Abbildung eines punktförmigen Objektes entstehenden Beugungsscheibchens gehalten. Man kann von einem P jnktdetektor sprechen. Damit wird eine kohärente Übertragung gewährleistet.

Anordnungen dieser Art werden auch als Laserrastermil.roskope vom Typ Il bezeichnet.

Der grundlegende Aufbau einer solchen Anordnung ist in dem US-Patent 3013467 beschrieben. Nachteilig bei allen derartigen Einrichtungen ist die hohe Empfindlichkeit der Justierung der drei ineinander abzubildenden Punkte: Punktlichtquelle Objektpunkt - Punktdetektor. Bereits geringste laterale Verlagerungen besonders der Pi nktlichtquelle gegenüber dem Punktde- ;Ktor verändern einschneidend oie Bildinformation. Das dabei angewandte Ob: jktscanning ist relativ langsam und erfordert jn die Scanniiigeinrichtung und deren Parameter angepaßte Objekte.

in einer weiteren bekannten Anordung (DE OS 3422143) sind bereits erste praktische Ansätze erkennbar, durch geeignete Strahlführung das sog. Strahlscanning durchzuführen und dabei die Empfindlichkeit des Mikroskopaufbaues gegenüber Instabilitäten zu reduzieren. In dieser Anordnung wird das zu untersuchende Licht erst kurz vor der Ebene, in der der Punktdetektor angeordnet ist, vom beleuchtenden getrennt, so daß Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang die gleichen Elemente durchlaufen und aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtweges sich Auswirkungen geringer Instabilität wieder kompensieren. Erst nach einem Teilungselement (in Untersuchungsrichtung gesehen) werden unterschiedliche Wege durchlaufen, in denen Abweichungen von der exakten Zentrierung auftreten.

Die genannte Anordnung verwendet beleuchtungsseitig eine Punktlichtquelle (Punktblende, Lasertaille), die als „Sonde" in das Objekt und von dort auf dem Abbildungsweg in eine Punktblende abgebildet wird. Das Bild der beleuchtungsseitigen Blende, dessen Durchmesser wenige pm beträgt, muß konstant auf Bruchteile seines Durchmessers zur abbildungsseitigen Blende justiert bleiben. Dabei ist der Justiervorgang recht aufwendig und die Sicherung der exakten Justierung über längere Zeiträume, auch aufgrund von Umwelteinflüssen, äußerst schwierig, da die beiden von der Strahlentei'ung aus getrennt laufenden Strahlengange durch Alterung von Bauteilen, thermische Veränderungen, Luftschlieren zeitweilig oder ständig dejustiert werden.

Weiterhin wirkt sich ein anderer Umstand ebenfalls nachteilig aus. Verändert sich z.B. durch Höhenunterschiede im Objekt die Lage der Objektebene, so entsteht auf dem Objekt ein Zerstreuungskreis des Bildpunktes der beleuchtungsseitigen Punktblende.

In die beobachtungsseitige Blende fällt dann sin geringerer Lichtstrom, woraus eine hohe Tiefenauflösung resultier'. 'Jm wieder optimale Abbildungsverhältnisse zu erzeugen, muß das Objekt selbst axial so verschoben werden, bis es seine alte Lage wieder

einnimmt. Die dazu erforderlichen Feinbewegungen im O,1-pm-Bereich sind mit hohem technischen Aufwand verbunden. Mit Hilfe eines aktiven Spiegels wird die Auswirkung der Defokussierung bezüglich der Intensität kompensiert. Es wird ein Fokus der beleuchtungsseitigen Blende in der beobachtungsseitigen Punktblende bzw. auf dem Punktdetektor erzeugt. Das Objekt liegt dabei aber nicht mehr im Fokus, so daß die laterale Auflösung reduziert wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein konfokales Laserrastermikroskop, bei dem die Nachteile der bisher bekannten Lösungen nicht auftreten, insbesondere soll d>e Stabilität der Abbildungsgüte quantitativ und qualitativ erhöht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konfokales Laserrastermikroskop zu schaffen, bei dem die Zentrierung der beleuchtungs- und abbildungsseitigen Blenden zueinander invariant gegen äußere Einflüsse und Alterung ist und bei geringem zusätzlichen Aufwand eine automatische Scharfeinstellung der Objektebene ermöglicht wird. Die Aufgabe wird durch ein konfokales Laserrastermikroskop für Auflichtmikroskopie, mindestens eine Laserlichtquelle, eine Strahlablenkeinrichtung mit mindestens einem Objektiv, sowie Umlenkelemente und mindestens einen fotoelektrischen Empfänger aufweisend, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Blende im Strahlaufweitungssystem des Beleuchtungsstrahlenganges derart angeordnet ist, daß die Blende Modusblende des Beleuchtungsstrahlenganges und gleichzeitig Detektorblende eines Abbildungsstrahlenganges ist, wobei das Strahlaufweitungssystem mindestens aus einer ersten Linse und einer zweiten verschiebbaren Linse besteht.

Vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen bestehen darin, daß Mittel, wie Polarisatoren, ein Chopper, mindestens ein Sperrfilter, zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind, und daß eine axiale Verschiebung einer zweiten verschiebbaren Linse des Strahlaufweitungssystemes zur Aufnahme des Höhenprofils eines Objektes durchführbar ist. Durch die erfindungsgemäße Trennung von beleuchtender und abbildender Strahlung, in Abbildungsrichtung gesehen hinter der Blende, sind Modenblende und Empfängerblende identisch. Lageveränderungen der Blende gegenüber der Optik führt das Blendenbild in gleicher Größe und Richtung mit aus, so daß das Bild der Modenblende zwangsläufig zur Punktblende zentriert bleibt. Dadurch ist stets eine exakte räumliche Zuordnung von Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor gegeben. Zur erforderlichen Trennung der Signalstrahlung von Strahlungskomponenten, die durch Reflexion an der Blende oder Streuung an Elementen im Strahlengang entstehen, werden

• polarisationsoptische Elemente (Pol-Filter λ/4-PlaUdn),

• interferenzoptische Methoden,

• ein Choppern des Signalstrahlenganges,

• zeitempfindliche Signaldetektoren (gating, Laufzeit) oder

• spektrale Filter bei Fluoieszenzverfahren vorgesehen.

Die axiale Verstellung einer zweiten verschiebbaren Linse im Strahlengang wird zur Fokussierung auf die Objektebene bzw. zur Aufnahme des Höhenprofils des Objektes verwendet. Das konfokale Laserrastermikroskop wird im folgenden näher erläutert, es ist zur Aufnahme von Auflicht- oder Fluoreszenzbildern geeignet. Beleuchtungsseitig ist eine körperliche Blende angeordnet, die gegebenenfalls im Fokus eines Teleskopsystems steht und als Mittel zur K-Raum-Filterung dient. Diese Blende entspricht der punktförmigsn Lichtquelle, die üb jr eine entsprechende Optik auf das Objekt abgebildet wird. Ein in der Erfindung wahlweise vorgesehener Referenzdetektor bi mittelt die Intensität des beleuchtenden Laserlichtes. Das bei der Beleuchtung des Objektes vom Objekt ausgehende Signallich'. (Reflexion, Streuung Fluoreszenz) durchläuft alle optischen Elemente des Beleuchtungsstrahlenganges in entgegengesetzter Richtung wie der Beleuchtungsstrahl selbst. Im Unterschied zu bekannten konfokalen Anordnungen trifft das Signallicht auf die erwähnte, im Beleuchtungsstrahlengang stehende Blende, die aufgrund der Anordnung stets zentriert bleibt. Nur das Zentrum des Beugungsscheibchens des Signallichts kann die Jlende passieren. Das durch die Blende tretende Signallicht wird durch geeignete Mittel vom Beleuchtungsstrahlengang separiert (Strahlteiler) und tfuf den Signaldetektor gerichtet.

Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses wird durch die in der Erfindung wahlweise vorgesehene Unterdrückung ungewünschter Polarisationskomponenten, durch Intensitätsmodulations und damit Lock-in-Nachweis, durch langzeitempfindliche Signaldetektoren (gating), oder durch Wellenlängsenelektion bei Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Zur automatischen Fokussierung auf die Objektebene kann in der erfindungsgemäßen Lösung eine der zwischen Blende und Objekt stehenden Linsen, im einfachsten Fall die der Blende am nächsten stehende, eingesetzt werden. Hierfür ist in der Erfindung eine Lösung zur axialen Translation der entsprechenden Linsen vorgesehen. Der Abstand Linse - Blende wird damit so eingestellt, daß die jeweils am Signaldetektor ankommende Lichtintensität maximal ist, womit eine Scharfstellung auf die Objektebene automatisch gewährleistet ist. Wird zusätzlich der Abstand zwischen Blende und der zweiten verschiebbaren Linse bei der Abtastung des Objektes an jedem Punkt ermittelt, erhält man das Höhenprofil des Objektes.

Im Gegensatz zu bisher bekannten konfokalen Anordnungen tritt bei der erfindungsgemäßen Lösung bei dieser Vorgehensweise der Ermittlung von Höhenprofilen des Objektes kein lateraler Auflösungsverlust ein, da Punktlichtquelle und Punktempfänger identisch sind und, sobald die Lichtquelle in die Objektebene abgebildet wird, der Punktempfänger automatisch in der konjugierten Ebene liegt.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert. In der Zeichnung ist schematisch das konfokale Laserrastermikroskop dargestellt.

Ein Laser 1 wird über einen ersten Polarisator 2, einen ersten Strahlteiler 3 und die erste λ/4-Platte 4 mit Hilfe der ersten Lins« 5

auf eine körperliche Blende 6 fokussiert. Diese Blende dient in der erfindungsgemäßen Lösung gleichzeitig als K-Raum-Filter und als Modenblende. Mit der zweiten verschiebbaren Linse 7 wird die Strahlung kollimiert und durch das Laserrastermikroskop 10 auf die Objektebene 11 fokussiert. Um die vom Objekt den gleichen Lichtweg zurückkommende Signalstrahlung, die über den ersten Strahlenteiler 3 auf den Signaldetektor 13 gelangt, von der an der K-Raumblende zurückgesteuerten Störstrahlung zu unterscheiden, sind auffiabenabhängig verschiedene Mittel vorgesehen:

- Die Polarisationsrichtung der Signalstrahlung wird mit der λ/4-Platte 4 so gedreht, daß sie den zweiten Polarisator 14 passieren kann. Da sich die λ/4-Platte 4 unmittelbar über dem Objektiv 8 befindet, erfolgt für die Störstrahlung zwischen erstem Strahlteiler 3 und λ/4-Platte 4 keine Drehung der Polarisationsrichtung, so daß diese Störstrahlung am Polarisator 14 unterdrückt wird.

- Ein Chopper 15 im Abbildungsstrahlengang A ermöglicht einen Lock-in-Nachweis des Signales.

- Bei Fluoreszenz der Probe wird das Fluoreszenzsignal durch ein Sperrfilter 17, das die Laserwellenlänge sperrt, vor dem Signaldetektor 13 unterdrückt. Zur Korrektur von Schwankungen der Laserleistung im Laserrastermikroskop ist der zweite Strahlteiler 9 und der Referenzdetekor 12 vorgesehen. Eine automatische Fokussierung des Laserrastermikroskopes läßt sich durch Registrieren der maximalen Signalintensität bei axialer Verschiebung beispielsweise der zweiten verschiebbaren Linse 7 erreichen. Damit ist auch eine Betriebsart zur Vermessung der Höhenstruktur der Proben möglich, indem die Lage der zweiten verschiebbaren Linse 7 bei maximaler Signalintensität in Abhängigkeit vom Objektort aufgetragen wird.

Claims (3)

1. Konfokales Laserrastermikroskop für Auflichtmikroskopie, mindestens eine Laserlichtquelle, eine Strahlablenkeinrichtung mit mindestens einem Objektiv, sowie Umlenkelemente und mindestens einem fotoelektrischen Empfänger aufweisend, gekennzeichnet dadurch, daß eine Blende (6) im Strahlaufweitungssystem, bestehend aus den Elementen (5,7) des Beleuchtungsstrahlenganges (B) derart angeordnet ist, daß die Blende (6) Modenblende des Beleuchtungsstrahlenganges (B) jnd gleichzeitig Detektorblende eines Ausbildungsstrahlenganges (A) i&t.

2. Konfokales Laserrastermikroskop nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Mittel, wie Polarisatoren (2,14), ein Chopper (15), mindestens ein Sperrfilter (17), zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind.

3. Konfokales Lasermikroskop nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine axiale Verschiebung einer zweiten verschiebbaren Linse (7) des Strahlaufweitungssystems (5,7) zur Aufnahme des Höhenprofils eines Objektes durchführbar ist.