DE3936646A1 - Konfokales laserrastermikroskop - Google Patents

Description

Die Erfindung ist für die Anwendung in Laserraster­ mikroskopen vorgesehen. Im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie wird bei der Laser-Raster-Mikroskopie das Objekt mit einem fokussierten Laserstrahl beleuchtet. Jede durch die punktförmige Bestrahlung des Objekts ausgelöste physikalische Wechselwirkung kann mit einem geeignetem Em­ pfänger erfaßt und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenz, ausgelöster Photostrom) verwendet werden.

Laserrastermikroskope können in ihrer allgemeinen Form als optische Systeme aufgefaßt werden, die eine punktförmige Lichtquelle auf das Objekt abbilden. Das vom Objektpunkt ausgehende Signal wird durch einen geeigneten Detektor er­ faßt. Ein entsprechendes Bild wird durch rasterförmige Ab­ tastung des Objektes (Relativbewegung zwischen Objekt und Beleuchtungsstrahl) aufgenommen (Wilson, Sheppard: "Theory and Practice of Scanning optical Microscopy", Academic Press 1984).

Ein hervorstechendes Merkmal sogenannter konfokaler An­ ordnungen ist die hohe Tiefenauflösung. Bei diesen Anord­ nungen wird die wirksame Empfängerfläche kleiner als der Durchmesser des bei Abbildung eines punktförmigen Objektes entstehenden Beugungsscheibchens gehalten. Man kann von einem Punktdetektor sprechen. Damit wird eine kohärente Übertragung gewährleistet.

Anordnungen dieser Art werden auch als Laserrastermikroskope vom Typ II bezeichnet.

Der grundlegende Aufbau einer solchen Anordnung ist in dem US-Patent 30 13 467 beschrieben. Nachteilig bei allen der­ artigen Einrichtungen ist die hohe Empfindlichkeit der Justierung der drei ineinander abzubildenden Punkte: Punktlichtquelle - Objektpunkt - Punktdetektor. Bereits geringste laterale Verlagerungen besonders der Punktlicht­ quelle gegenüber dem Punktdetektor verändern einschneidend die Bildinformation. Das dabei angewandte Objektscanning ist relativ langsam und erfordert an die Scanningeinrichtung und deren Parameter angepaßte Objekte.

In einer weiteren bekannten Anordnung (DE OS 34 22 143) sind bereits erste praktische Ansätze erkennbar, durch geeignete Strahlführung das sog. Strahlscanning durchzuführen und dabei die Empfindlichkeit des Mikroskopaufbaues gegenüber Instabilitäten zu reduzieren. In dieser Anordnung wird das zu untersuchende Licht erst kurz vor der Ebene, in der der Punktdetektor angeordnet ist, vom beleuchtenden getrennt, so daß Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang die gleichen Elemente durchlaufen und aufgrund der Umkehrbar­ keit des Lichtweges sich Auswirkungen geringer Instabilität wieder kompensieren. Erst nach einem Teilungselement (in Untersuchungsrichtung gesehen) werden unterschiedliche Wege durchlaufen, in denen Abweichungen von der exakten Zen­ trierung auftreten.

Die genannte Anordnung verwendet beleuchtungsseitig eine Punktlichtquelle (Punktblende, Lasertaille), die als "Sonde" in das Objekt und von dort auf dem Abbildungsweg in eine Punktblende abgebildet wird. Das Bild der beleuchtungssei­ tigen Blende, dessen Durchmesser wenige µm beträgt, muß konstant auf Bruchteile seines Durchmessers zur abbildungs­ seitigen Blende justiert bleiben. Dabei ist der Justiervor­ gang recht aufwendig und die Sicherung der exakten Justie­ rung über längere Zeiträume, auch aufgrund von Umweltein­ flüssen, äußerst schwierig, da die beiden von der Strahlen­ teilung aus getrennt laufenden Strahlengänge durch Alterung von Bauteilen, thermische Veränderungen, Luftschlieren zeitweilig oder ständig dejustiert werden.

Weiterhin wirkt sich ein anderer Umstand ebenfalls nach­ teilig aus. Verändert sich z. B. durch Höhenunterschiede im Objekt die Lage der Objektebene, so entsteht auf dem Objekt ein Zerstreuungskreis des Bildpunktes der beleuch­ tungsseitigen Punktblende. In die beobachtungsseitige Blende fällt dann ein geringerer Lichtstrom, woraus eine hohe Tiefenauflösung resultiert. Um wieder optimale Ab­ bildungsverhältnisse zu erzeugen, muß das Objekt selbst axial so verschoben werden, bis es seine alte Lage wieder einnimmt. Die dazu erforderlichen Feinbewegungen um 0,1 µm-Bereich sind mit hohem technischen Aufwand ver­ bunden. Mit Hilfe eines aktiven Spiegels wird die Aus­ wirkung der Defokussierung bezüglich der Intensität kom­ pensiert. Es wird ein Fokus der beleuchtungsseitigen Blende in der beobachtungsseitigen Punktblende bzw. auf dem Punktdetektor erzeugt. Das Objekt liegt dabei aber nicht mehr im Fokus, so daß die laterale Auflösung reduziert wird.

Ziel der Erfindung ist ein konfokales Laserrastermikroskop, bei dem die Nachteile der bisher bekannten Lösungen nicht auftreten, insbesondere soll die Stabilität der Abbildungs­ güte quantitativ und qualitativ erhöht werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konfokales Laserrastermikroskop zu schaffen, bei dem die Zentrierung der beleuchtungs- und abbildungsseitigen Blenden zueinander invariant gegen äußere Einflüsse und Alterung ist und bei geringem zusätzlichen Aufwand eine automatische Scharf­ einstellung der Objektebene ermöglicht wird. Die Aufgabe wird durch ein konfokales Laserrastermikroskop für Auf­ lichtmikroskopie mindestens eine Laserlichtquelle, eine Strahlablenkeinrichtung mit mindestens einem Objektiv, sowie Umlenkelemente und mindestens einen fotoelektrischen Empfänger aufweisend, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Blende im Strahlaufweitungssystem des Beleuchtungs­ strahlenganges derart angeordnet ist, daß die Blende Modus­ blende des Beleuchtungsstrahlenganges und gleichzeitig Detektorblende eines Abbildungsstrahlenganges ist, wobei das Strahlaufweitungssystem mindestens aus einer ersten Linse und einer zweiten verschiebbaren Linse besteht. Vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen bestehen darin, daß Mittel, wie Polarisatoren, ein Chopper, min­ destens ein Sperrfilter, zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind, und daß eine axiale Verschiebung einer zweiten verschiebbaren Linse des Strahl­ aufweitungssystemes zur Aufnahme des Höhenprofils eines Objektes durchführbar ist. Durch die erfindungsgemäße Tren­ nung von beleuchtender und abbildender Strahlung, in Ab­ bildungsrichtung gesehen hinter der Blende, sind Moden­ blende und Empfängerblende identisch. Lageveränderung der Blende gegenüber der Optik führt das Blendenbild in gleicher Größe und Richtung mit aus, so daß das Bild der Modenblende zwangsläufig zur Punktblende zentriert bleibt. Dadurch ist stets eine exakte räumliche Zuordnung von Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor gegeben.

Zur erforderlichen Trennung der Signalstrahlung von Strah­ lungskomponenten, die durch Reflexion an der Blende oder Streuung an Elementen im Strahlengang entstehen, werden

• · polarisationsoptische Elemente (Pol-Filter λ/4-Platten),
• · interferenzoptische Methoden,
• · ein Choppern des Signalstrahlenganges,
• · zeitempfindliche Signaldetektoren (gating, Laufzeit) oder
• · spektrale Filter bei Fluoreszenzverfahren

vorgesehen.

Die axiale Verstellung einer zweiten verschiebbaren Linse im Strahlengang wird zur Fokussierung auf die Objektebene bzw. zur Aufnahme des Höhenprofils des Objektes verwendet. Das konfokale Laserrastermikroskop wird im folgenden näher erläutert, es ist zur Aufnahme von Auflicht- oder Fluoreszenzbildern geeignet. Beleuchtungsseitig ist eine körperliche Blende angeordnet, die gegebenenfalls im Fokus eines Teleskopsystems steht und als Mittel zur K-Raum- Filterung dient. Diese Blende entspricht der punktförmigen Lichtquelle, die über eine entsprechende Optik auf das Objekt abgebildet wird. Ein in der Erfindung wahlweise vor­ gesehener Referenzdetektor ermittelt die Intensität des beleuchtenden Laserlichtes. Das bei Beleuchtung des Ob­ jektes vom Objekt ausgehende Signallicht (Reflexion, Streuung, Fluoreszenz) durchläuft alle optischen Elemente des Beleuchtungsstrahlenganges in entgegengesetzter Rich­ tung wie der Beleuchtungsstrahl selbst. Im Unterschied zu bekannten konfokalen Anordnungen trifft das Signallicht auf die erwähnte, im Beleuchtungsstrahlengang stehende Blende, die aufgrund der Anordnung stets zentriert bleibt. Nur das Zentrum des Beugungsscheibchens des Signallichts kann die Blende passieren. Das durch die Blende tretende Signallicht wird durch geeignete Mittel vom Beleuchtungs­ strahlengang separiert (Strahlteiler) und auf den Signal­ detektor gerichtet.

Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses wird durch die in der Erfindung wahlweise vorgesehene Unterdrückung ungewünschter Polarisationskomponenten, durch Intensitäts­ modulation und damit Lock-in-Nachweis, durch langzeitem­ pfindliche Signaldetektoren (gating), oder durch Wellen­ längenselektion bei Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Zur automatischen Fokussierung auf die Objektebene kann in der erfindungsgemäßen Lösung eine der zwischen Blende und Objekt stehenden Linsen, im einfachsten Fall die der Blende am nächsten stehende, eingesetzt werden. Hierfür ist in der Erfindung eine Lösung zur axialen Translation der entsprechenden Linsen vorgesehen. Der Abstand Linse - Blende wird damit so eingestellt, daß die jeweils am Signaldetektor ankommende Lichtintensität maximal ist, womit eine Scharfstellung auf die Objektebene automatisch gewährleistet ist. Wird zusätzlich der Abstand zwischen Blende und der zweiten verschiebbaren Linse bei der Ab­ tastung des Objektes an jedem Punkt ermittelt, erhält man das Höhenprofil des Objektes.

Im Gegensatz zu bisher bekannten konfokalen Anordnungen tritt bei der erfindungsgemäßen Lösung bei dieser Vor­ gehensweise der Ermittlung von Höhenprofilen des Objektes kein lateraler Auflösungsverlust ein, da Punktlichtquelle und Punktempfänger identisch sind und, sobald die Licht­ quelle in die Objektebene abgebildet wird, der Punktem­ pfänger automatisch in der konjugierten Ebene liegt.

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der Zeichnung ist schematisch das konfokale Laserrastermikroskop dargestellt.

Ein Laser 1 wird über einen ersten Polarisator 2, einen ersten Strahlteiler 3 und die erste λ/4-Platte 4 mit Hilfe der ersten Linse 5 auf eine körperliche Blende 6 fokussiert. Diese Blende dient in der erfindungsgemäßen Lösung gleichzeitig als K-Raum-Filter und als Modenblende. Mit der zweiten verschiebbaren Linse 7 wird die Strahlung kollimiert und durch das Laserrastermikroskop 10 auf die Objektebene 11 fokussiert. Um die vom Objekt den gleichen Lichtweg zurückkommende Signalstrahlung, die über den ersten Strahlenteiler 3 auf den Signaldetektor 13 gelangt, von der an der K-Raumblende zurückgestreuten Störstrah­ lung zu unterscheiden, sind aufgabenabhängig verschiedene Mittel vorgesehen:

• - Die Polarisationsrichtung der Signalstrahlung wird mit der λ/4-Platte 4 so gedreht, daß sie den zweiten Polarisator 14 passieren kann. Da sich die λ/4-Platte 4 unmittelbar über dem Objektiv 8 befindet, erfolgt für die Störstrahlung zwischen erstem Strahlteiler 3 und g/4-Platte 4 keine Drehung der Polarisationsrichtung, so daß diese Störstrahlung am Polarisator 14 unterdrückt wird.
• - Ein Chopper 15 im Abbildungsstrahlengang A ermöglicht einen Lock-in-Nachweis des Signales.
• - Bei Fluoreszenz der Probe wird das Fluoreszenzsignal durch ein Sperrfilter 17, das die Laserwellenlänge sperrt, vor dem Signaldetektor 13 unterdrückt. Zur Korrektur von Schwankungen der Laser-Leistung im Laserrastermikroskop ist der zweite Strahlteiler 9 und der Referenzdetektor 12 vorgesehen. Eine automatische Fokussierung des Laser­ rastermikroskopes läßt sich durch Registrieren der maxi­ malen Signalintensität bei axialer Verschiebung beispiels­ weise der zweiten verschiebbaren Linse 7 erreichen. Damit ist auch eine Betriebsart zur Vermessung der Höhenstruktur der Proben möglich, indem die Lage der zweiten verschieb­ baren Linse 7 bei maximaler Signalintensität in Abhängig­ keit vom Objektort aufgetragen wird.

Claims (3)

1. Konfokales Laserrastermikroskop für Auflichtmikroskopie mindestens eine Laserlichtquelle, eine Strahlablenkein­ richtung mit mindestens einem Objektiv, sowie Umlenk­ elemente und mindestens einen fotoelektrischen Empfänger aufweisend, gekennzeichnet dadurch, daß eine Blende (6) im Strahlaufweitungssystem, bestehend aus den Elementen (5, 7) des Beleuchtungsstrahlenganges (B) derart ange­ ordnet ist, daß die Blende (6) Modenblende des Beleuch­ tungsstrahlenganges (B) und gleichzeitig Detektorblende eines Abbildungsstrahlenganges (A) ist.

2. Konfokales Laserrastermikroskop nach Anspruch 1, gekenn­ zeichnet dadurch, daß Mittel, wie Polarisatoren (2, 14), ein Chopper (15), mindestens ein Sperrfilter (17), zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vor­ gesehen sind.

3. Konfokales Laserrastermikroskop nach Anspruch 1, gekenn­ zeichnet dadurch, daß eine axiale Verschiebung einer zweiten verschiebbaren Linse (7) des Strahlaufweitungs­ systems (5, 7) zur Aufnahme des Höhenprofils eines Objektes durchführbar ist.