EP1948811A2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen

Info

Publication number
EP1948811A2
EP1948811A2 EP06806854A EP06806854A EP1948811A2 EP 1948811 A2 EP1948811 A2 EP 1948811A2 EP 06806854 A EP06806854 A EP 06806854A EP 06806854 A EP06806854 A EP 06806854A EP 1948811 A2 EP1948811 A2 EP 1948811A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
glycerol
coryneform bacteria
amino acid
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06806854A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker F. Wendisch
Doris Rittmann
Hermann Sahm
Caroline Kreutzer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH, Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Priority to EP11152912.9A priority Critical patent/EP2354235B1/de
Priority to DK11152912.9T priority patent/DK2354235T3/en
Priority to PL11152912T priority patent/PL2354235T3/pl
Publication of EP1948811A2 publication Critical patent/EP1948811A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan

Definitions

  • the invention relates to recombinant coryneform bacteria in which at least one or more of the heterologous genes of the glycerol metabolism (glycerol metabolism) selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT , glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC are expressed as well as a process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan, wherein the medium contains glycerol as a carbon source under Use of these bacteria.
  • These bacteria show the ability to use glycerol and thus to efficiently form and accumulate the L-amino acids.
  • Chemical compounds in particular L-amino acids, vitamins, nucleosides and nucleotides and D-amino acids, are used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in cosmetics, in the food industry and in animal nutrition.
  • Process improvements may include fermentation measures such as stirring and oxygen supply, or composition of nutrient media such as sugar concentration during fermentation, or work up to product form by, for example
  • Amino acid-producing strains of Corynebacterium glutamicum are used by amplifying individual amino acid biosynthesis genes and investigating the effect on L-amino acid production.
  • a summary of various aspects of Corynebacterium glutamicum genetics, metabolism and biotechnology can be found in Puhler ((chief ed.) Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338 (2003)) and Eggeling and Bott (( editors) Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005)).
  • L-amino acids preferably L-lysine and L-tryptophan
  • a technologically feasible alternative for producing the L-amino acids is to use a less expensive material as an alternative raw material for fermentation.
  • Glycerin (Propantriol) is a natural constituent of oils and fats and connects the fatty acid molecules in the triglycerides as a "bridge."
  • the glycerine molecule is highly polar and therefore readily soluble in water. RME) and is used in cosmetics, pharmaceuticals, food and technical applications. Decisive for the use of glycerine as raw material for the production of feed components is the value for money. It can be assumed that as biodiesel production increases, glycerol becomes more interesting for the production of feed additives.
  • Corynebacterium glutamicum wild-type uses a variety of monomeric and oligomeric sugars such as glucose, sucrose or maltose as the carbon source (Vahjen et al., FEMS
  • Corynebacterium glutamicum wild-type has some genes with homology to known genes of glycerol metabolism, but so far it has not been possible to explain why growth on glycerol is still not possible.
  • the inventors have set themselves the task of providing new coryneform bacteria, which are able to use glycerol as possible as sole carbon source.
  • Another directly related object was to provide an improved process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan, with the aid of such coryneform bacteria. In particular, it should
  • Glycerol be made useful for the fermentative production of L-amino acids in the most economical manner.
  • the invention relates to recombinant coryneform bacteria which in particular already excrete L-amino acids, and in which at least one or more of the nucleotide sequence (s) coding for the heterologous gene products of the glycerol metabolism (glycerol metabolism), selected from the group glpA , glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC.
  • These bacteria show the ability to use glycerin.
  • the bacteria used include in particular coryneform bacteria in which at least one heterologous polynucleotide is encoded which codes for a polypeptide whose amino acid sequence is at least 80% or at least 90%, in particular at least 95%, preferably at least 98%, particularly preferred is at least 99% and most preferably 100% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID no. 8, SEQ ID no. 10, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 18, SEQ ID no. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID no. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34 and SEQ ID NO. 36.
  • the said bacteria preferably contain at least one heterologous polynucleotide selected from the group consisting of:
  • polynucleotide having the nucleotide sequence SEQ ID no. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no. 13, SEQ ID no. 15, SEQ ID no. 17, SEQ ID no. 19, SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35 and complementary nucleotide sequences
  • SEQ ID no. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no. 13, SEQ ID no. 15, SEQ ID no. 17, SEQ ID no. 19, SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35 corresponds to the degeneration of the genetic code;
  • the stringent conditions are preferably achieved by a washing step in which the temperature extends over a range of 64 ° C to 68 ° C and the salt concentration of the buffer over a range of 2xSSC to 0, IxSSC ;
  • SEQ ID no. 3 SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no. 13, SEQ ID no. 15, SEQ ID no. 17, SEQ ID no. 19, SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35, which contains functionally neutral sense mutations,
  • polynucleotides encode enzymes of glycerol metabolism (glycerol metabolism).
  • the invention likewise provides a process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan, the medium containing glycerol as carbon source, using recombinant coryneform bacteria, which in particular already produce L-amino acids, and in which at least one or more of the heterologous genes of glycerol metabolism (glycerol metabolism), selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC or nucleotide sequences coding for their gene products ,
  • the bacteria according to the invention are preferably used.
  • L-amino acids or amino acids are one or more of the proteinogenic amino acids, including their salts, selected from the group L-aspartic acid, L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L- Arginine and L-proline meant. Particularly preferred is L-lysine and L-tryptophan.
  • the L-amino acids also include L-homoserine.
  • Proteinogenic amino acids are the amino acids found in natural proteins, that is, in proteins of microorganisms, plants, animals and humans.
  • amino acids are mentioned below, the term also includes their salts, for example the lysine monohydrochloride or lysine sulfate in the case of the amino acid L-lysine.
  • heterologous genes or “heterologous nucleotide sequences” of the invention may be derived from any prokaryotic donor organism other than members of the genus Corynebacterium originate.
  • the genes from Escherichia coli are preferably used.
  • heterologous genes in this context describes the cloning of corresponding genes and their expression in the heterologous system, which leads to an establishment of the intracellular activity or concentration of one or more enzymes or proteins in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example, by generating a vector which contains the desired gene or an allele of this gene and a promoter enabling the expression of the gene and transmits by transformation, transduction or conjugation in the microorganism and optionally combines these measures.
  • alleles is meant alternative forms of a given gene.
  • the forms are characterized by differences in the nucleotide sequence.
  • Nucleotide sequence i. a gene or allele encoded protein or the encoded ribonucleic acid.
  • the subject matter of this invention is also a process for the fermentative production of L-amino acids, characterized in that the following steps are carried out:
  • the heterologous genes of the glycerol metabolism selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA,
  • Gene products encoding nucleotide sequences or alleles is or are, in a glycerol or optionally additionally one or more further C- Sources containing medium under conditions in which the desired L-amino acid is enriched in the medium or in the cells, and optionally
  • coryneform bacteria used preferably already produce the conventional one prior to the expression of one or more of the genes of the glycerol metabolism
  • Carbon sources such as glucose or sucrose L-amino acids, especially L-lysine and L-tryptophan.
  • the glycerol used can be used individually or as a mixture, wherein the proportion of glycerol should preferably be> 10 to 100%.
  • coryneform bacteria after heterologous expression of one or more of the genes of the glycerol metabolism, produce L-amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan, from glycerol as sole carbon source.
  • Recombinant bacteria according to the invention are produced, for example, by transformation, transduction or conjugation, or a combination of these methods, with a vector which contains the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and a promoter which enables the expression of the gene.
  • Heterologous expression is achieved in particular by integration of the gene or alleles into the chromosome of the microorganisms or an extrachromosomally replicating vector.
  • the promoter may be its own regulatory sequence upstream of the gene, or a promoter from coryneform bacteria may be fused to the gene.
  • a promoter from coryneform bacteria may be fused to the gene.
  • Glucose sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or ethanol. These are representatives of coryneform bacteria.
  • the genus Corynebacterium is preferred. Particularly preferred
  • Amino acid-secreting strains based on the following types:
  • Corynebacterium efficiens such as the strain DSM44549,
  • Corynebacterium glutamicum such as strain ATCC13032,
  • thermoaminogenes such as strain FERM BP-1539, and
  • Corynebacterium ammoniagenes such as strain ATCC6871,
  • Corynebacterium glutamicum Some representatives of the species Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other species names. These include, for example:
  • Corynebacterium glutamicum AHP-3 FermBP-7382
  • Strains designated "ATCC” can be purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.) Strains designated “DSM” can be obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). "FERM” strains are available from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) become. The cited strain of Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) is described in US-A-5,250,434.
  • the nucleotide sequences of the genes or open reading frames (ORF) of Escherichia coli are known in the art and may be that described by Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) published genome sequence of Escherichia coli.
  • Salmonella typhimurium (Accession No .: NC 003197 (sequence of the entire genome)) and Shigella flexneri (Accession No .: NC 004337 (sequence of the entire genome)), which likewise belongs to the family Enterobacteriaceae, have the nucleotide sequence for the genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT and glpX are also known by way of example. Furthermore, Salmonella typhimurium
  • glycerol metabolism The genes and activities of glycerol metabolism (glycerol metabolism) are also summarized in Lin (In: Neidhardt (ed), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C, USA: 307-342 (1996)) described.
  • the glycerol transport and metabolism-containing glycerophosphate regulone (glp) gene consists of five operons located at three different loci on the E. coli chromosome (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)). ,
  • a regulon is a unit of genes that are localized at different sites of a genome, but expressed by the same regulatory proteins is controlled.
  • An operon is a unit of co-regulated genes at a locus.
  • glpT glycerol-3-phosphate permease
  • glpQ periplasmic glycerol phosphodiesterase
  • the glpDEG operon responsible for glycerol-3-phosphate dehydrogenase GIpD is active in the presence of atmospheric oxygen (aerobic) (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)). ), the sulfur transferase GIpE (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)) and the glpG gene of unknown function (Zeng et al., Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996)). coded.
  • Phosphate dehydrogenase (anaerobic) Function In the anaerobic environment, glycerol-3
  • Phosphate for energy production from a FAD-dependent glycerol-3-phosphate Dehydrogenase oxidized to dihydroxyacetone phosphate, which can enter as an intermediate in glycolysis.
  • the reduction equivalents released in this oxidation reaction are transferred from the flavoenzyme to a membrane-associated cytochrome complex, with fumarate or nitrate serving as the terminal electron acceptor (Lin, in: Neidhardt (ed), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C. , USA: 307-342 (1996)).
  • the released energy is used to pump protons across the membrane from the cytoplasmic to the periplasmic side.
  • the proton gradient produced on the membrane changes both the electrical and the chemical potential, which drives the membrane-bound ATPase and thereby generates ATP.
  • glpB gene Name: membrane anchor subunit of sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase (anaerobic) Function: see glpA
  • glpC gene name: small subunit of sn-glycerol-3
  • glycerol-3-phosphate is used to generate energy from this FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GIpD)
  • Flavoenzym on a membrane-associated cytochrome complex with molecular oxygen or nitrate serving as the terminal electron acceptor (Lin, in: Neidhardt (ed), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA: 307-342 (1996)).
  • the released energy is used to pump protons across the membrane from the cytoplasmic to the periplasmic side.
  • the proton gradient produced on the membrane changes both the electrical and the chemical potential, which drives the membrane-bound ATPase and thereby generates ATP.
  • the open reading frame of the glpD gene consists of 501 codons and the translated sequence encodes a protein of molecular weight 57 kDa (Austin and Larson, Journal of Bacteriology 173: 101-107 (1991)).
  • glpE gene name: sulfur transferase; acidic, cytoplasmic rhodanese
  • GIpE has been identified as a sulfur transferase (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)).
  • the glpE gene Encoded acidic, cytoplasmic rhodanese with a molecular weight of 12 kDa catalyzes as a dimer the transfer of sulfur to the sulfur acceptor thioredoxin 1 (Ray et al., Journal of Bacteriology 182: 2277-2284 (2000)).
  • Glycerol facilitator GIpF Function Facilitated diffusion of glycerol from the nutrient medium is catalyzed by the glycerol facilitator GIpF (Borgnia and Agre, Proc. Natl. Acad.
  • gene of the glp regulons Function The physiological function of glpG is still unknown.
  • the glpG gene product is a basic, cytoplasmic or membrane-associated protein having a molecular weight of 28 kDa (Zeng et al., Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996)).
  • Cytoplasmic glycerol is immediately phosphorylated by the ATP-dependent glycerol kinase K, which in its enzymatically active form is associated with the glycerol fibril promoter GIpF (Voegele et al., Journal of Bacteriology 175: 1087-1094 (1993)).
  • Glycerophosphodiesterase Function Glycerophosphate diesters, the deacetylated degradation products of phospholipids (Lin, in: Neidhardt (ed), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C, USA: 307-342 (1996)), are incorporated herein by reference Periplasm of the localized phosphodiesterase GIpQ too Alcohol and glycerol-3-phosphate hydrolyzed (Larson et al., Journal of Biological Chemistry 258: 5428-5432
  • the gene product derived from the heterologous glpQ gene in the claimed bacteria must comprise a leader peptide, as is typical of excreted Gram-positive bacteria
  • glpT gene name: glycerol-3-phosphate permease function: glycerol-3-phosphate is produced by the permease GIpT (Eiglmeier et al., Molecular Microbiology 1: 251-258 (1987); Larson et al., Journal of Bacteriology 152: 1008-1021 (1982)) into the cell interior in exchange for inorganic phosphate (Auer et al., Biochemistry 40: 6628-6635 (2001)). The energy needed for transport is provided by this antiport and at the same time accumulation of the toxic phosphate is prevented (Xavier et al., Journal of Bacteriology
  • glpX gene name: fructose-1, 6-bisphosphatase II
  • GIpX Role of the enzyme GIpX can be found.
  • gldA gene name: glycerol dehydrogenase (NAD)
  • Glycerol dehydrogenase catalyzes the reversible NAD-dependent reaction of glycerol to dihydroxyacetone (Truniger and Boos, Journal of Bacteriology 176 (6): 1796-1800 (1994))
  • Dihydroxyacetone kinase catalyzes the reaction of dihydroxyacetone as a phosphoenolpyruvate (PEP) -dependent dihydroxyacetone phosphotransferase
  • the dihydroxyacetone kinase catalyzes the function of the PEP-dependent dihydroxyacetone phosphotransferase
  • DhaL carries ADP as a cofactor for the transfer of DhaM phosphate to dihydroxyacetone.
  • dhaM gene name: PTS protein subunit of
  • Dihydroxyacetone kinase catalyzes the function of PEP-dependent dihydroxyacetone phosphotransferase
  • DhaM consists of three domains with similarity to the three domains of the
  • Phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system Phosphorylated DhaM transfers the phosphate to the DhaL bound ADP.
  • Activator of the dha operon (dhaKLM) Function transcriptional activator, stimulates transcription of the dha operon from a sigma70 promoter (Bachler et al., The EMBO Journal
  • fsa gene name: fructose 6-phosphate aldolase I
  • Fructose-6-phosphate aldolase I catalyzes aldol cleavage of fructose-6-phosphate, substrates of the enzyme are dihydroxyacetone and fructose-6-phosphate and
  • Glyceraldehyde-3-phosphate not used are fructose, fructose-1-phosphate, fructose-1, 6-bisphosphate or dihydroxyacetone-phosphate (Schurmann and Sprenger, Journal of Biological
  • Fructose 6-phosphate aldolase II catalyzes aldol cleavage of the
  • the talC gene is located next to the gldA gene.
  • NCBI National Library of Biotechnology Information
  • the open reading frames described in the specified text can be used according to the invention. Furthermore, alleles of the genes or open reading frames can be used, which result from the degeneracy of the genetic code or by function-neutral sense mutations ("sense mutations").
  • the alleles of the treated genes which contain function-neutral sense mutations include, among others, those which have no more than 13 or no more than 10, preferably no more than 7 or no more than 5, very preferably no more than 3 or no more than 2 or at least conservative Amino acid exchange in the protein they encode lead.
  • the aromatic amino acids are called conservative exchanges when phenylalanine, tryptophan and tyrosine are exchanged.
  • the hydrophobic amino acids are called conservative exchanges when leucine, isoleucine and valine are exchanged.
  • the polar amino acids are called conservative exchanges when glutamine and asparagine are exchanged.
  • the basic amino acids are called conservative exchanges when arginine, lysine and histidine are exchanged.
  • the acidic amino acids are called conservative exchanges when aspartic acid and glutamic acid are exchanged.
  • the hydroxyl-containing amino acids are called conservative exchanges when serine and threonine are interchanged.
  • nucleotide sequences which code for variants of the proteins mentioned which additionally have an N- or C-terminus Lengthening or shortening by at least one (1) amino acid included.
  • This extension or truncation is not more than 13, 10, 7, 5, 3 or 2 amino acids or amino acid residues.
  • aminopeptidases the terminal methionine is removed during protein synthesis.
  • Suitable alleles include those that encode proteins in which at least one (1) amino acid is inserted (insertion) or deleted (deletion).
  • the maximum number of such changes referred to as indices, may be 2, 3, 4, 5 but in no case more than 6 amino acids.
  • suitable alleles include those obtained by hybridization, in particular under stringent conditions using SEQ ID NO. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no.
  • SEQ ID no. 23 SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35 or
  • Hybridization "by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) and by Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Hybridization takes place under stringent conditions, that is to say, only Hybrids are formed in which the probe and target sequence, ie the polynucleotides treated with the probe, are at least 70% identical It is known that the stringency of the hybridization including the washing steps by Varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration is influenced or determined. The hybridization reaction is generally performed at relatively low stringency compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • probes can also hybridize with polynucleotides that are less than 70%
  • Hybridization temperature in steps of about 1 - 2 0 C from 50 ° C to 68 ° C polynucleotide fragments can be isolated, for example, at least 70% or at least 80% or at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, At least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% identity to the sequence of the probe used or to the in SEQ ID NO. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no. 13, SEQ ID no. 15, SEQ ID no. 17, SEQ ID no. 19, SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no.
  • SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31 SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35 have shown nucleotide sequences. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558).
  • polynucleotides of Bacillus subtilis (Accession No .: NC 000964 (sequence of the entire genome)) and Streptomyces coelicolor (Accession No .: NC 003888 (sequence of the entire genome)), for example, at least 70% or at least 80% or at least 90% , at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% Identity to the in SEQ ID NO. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no.
  • SEQ ID no. 15 SEQ ID no. 17, SEQ ID no. 19, SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO.
  • NCBI National Library of Medicine National Database
  • the expression of the glycerol metabolism genes can be detected in the gel with the aid of 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software.
  • a common method for preparing the protein gels in coryneform bacteria and for identifying the proteins is that described by Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)).
  • the protein concentration can also and subsequent optical evaluation with: by western blot hybridization with an antibody specific for the protein to antibody (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 A Laboratory Manual 2 nd Ed Sambrook et al., Molecular Cloning.). corresponding software for concentration determination (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich
  • DNA-binding proteins can be measured by DNA band-shift assays (also referred to as gel retardation) (Wilson et al., (2001) Journal of Bacteriology 183: 2151-2155).
  • DNA band-shift assays also referred to as gel retardation
  • the effect of DNA-binding proteins on the expression of other genes can be prepared by various well-described methods of reporter gene assays are detected (Sambrook et al, Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.. , NY, 1989).
  • the intracellular enzymatic activities can be determined by various methods described (Donahue et al., (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627, Ray et al.
  • the heterologous genes are expressed, for example, using episomal plasmids.
  • Suitable plasmids are those which are replicated in coryneform bacteria.
  • Numerous known plasmid vectors such as pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) or pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) are based on the cryptic plasmids pHM1519, pBLI or pGAl.
  • plasmid vectors such as those based on pCG4 (US-A 4,489,160), or pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), or pAG1 (US-A 5,158,891) can be used be used in the same way.
  • pCG4 US-A 4,489,160
  • pNG2 Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)
  • pAG1 US-A 5,158,891
  • plasmid vectors by means of which one can apply the method of gene amplification by integration into the chromosome, as described for example by Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) for duplication or amplification of the hom-thrB operon or in WO03 / 040373.
  • the gene is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum.
  • vectors examples include pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation , Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84, US-A 5, 487, 993), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMI (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) or pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in question.
  • pSUP301 Synmon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)
  • the plasmid vector containing the heterologous gene to be amplified, optionally including the expression and / or regulatory signals, and the peripheral regions of a nonessential homologous gene is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum.
  • the method of conjugation is described by Shufer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Methods for transformation are described by Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiology Letters 123, 343-347 (1994)).
  • the resulting strain contains a copy of the heterologous gene, including the plasmid vector, at the desired locus of the C. glutamicum chromosome, which was predetermined via the homologous nucleotide sequences on the plasmid.
  • a suitable second excision-causing cross-over event in the target gene or in the target sequence the incorporation of only the heterologous gene is achieved, leaving no nucleotide sequence capable of episomal replication in microorganisms at the respective natural gene locus, not capable of transposing Nucleotide sequence and no resistance to antibiotics mediating nucleotide sequence.
  • L-amino acids in addition to the functional expression of one or more of the heterologous genes of glycerol metabolism (glycerol metabolism) selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC, one or more metabolic pathway enzymes that increase or decrease the formation of the desired amino acid, such as the biosynthetic pathway, the glycolysis, the anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate cycle, the amino acid export and optionally regulatory proteins either to express, in particular overexpress, or mitigate, in particular to reduce expression.
  • the heterologous genes of glycerol metabolism glycerol metabolism
  • amplification or “amplification” in this context describes the increase in the intracellular activity or concentration of one or more enzymes or proteins in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by the copy number of the gene or the Gene increases, a strong promoter or a gene or allele used for that corresponding enzyme or protein with a high activity and optionally combines these measures.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally increased by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%. , Up to 1000% or 2000% based on that of the wild-type protein or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism increased.
  • the copy number of the respective genes may be increased, or the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene may be mutated.
  • expression cassettes act, which are installed upstream of the structural gene.
  • inducible promoters it is additionally possible to increase expression in the course of fermentative amino acid production. Measures to extend the lifetime of m-RNA also improve expression.
  • enzyme activity is also enhanced.
  • the genes or gene constructs may either be present in different copy number plasmids or be integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by altering the composition of the medium and culture.
  • JP-A-10-229891 to Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), to Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) and to known textbooks of genetics and molecular biology.
  • genes are overexpressed, for example with the aid of episomal plasmids.
  • Suitable plasmids are those which are replicated in coryneform bacteria.
  • Numerous known plasmid vectors e.g. pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) or pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107 : 69-74 (1991)) are based on the cryptic plasmids pHM1519, pBLI or pGAl.
  • Other plasmid vectors e.g.
  • plasmid vectors by means of which one can apply the method of gene amplification by integration into the chromosome, as described for example by Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) for duplication or amplification of the hom-thrB operon.
  • the complete gene is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum.
  • vectors examples include PSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation , Madison, WI, USA), pCR2.1-T0P0 (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84, US-A 5,487,993), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMI (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) or pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342).
  • the plasmid vector containing the gene to be amplified is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of C
  • WO03 / 040373 isolates the nucleotide sequence of the desired ORF, gene or allele, optionally including the expression and / or regulatory signals, and two copies, preferably in tandem, into a non-replicative vector for C. glutamicum such as pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
  • the vector is then converted by transformation or conjugation into the desired coryneform bacterium. After homologous recombination by means of a first integration-causing cross-over event and a suitable second excision-causing cross-over event in the target gene or in the target sequence to achieve the incorporation of the additional gene copy. Thereafter, those bacteria are isolated in which two copies of the ORF, gene or allele are present at the respective natural location in place of the original single copy present. At the respective natural gene locus, no nucleotide sequence capable of episomal replication in microorganisms remains, no nucleotide sequence capable of transposing it, and no nucleotide sequence conferring resistance to antibiotics.
  • the term "attenuation” in this context describes the reduction or elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (proteins) in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by using a weak promoter or by using a gene or allele, which codes for a corresponding enzyme or protein with a low activity or inactivates the corresponding gene or enzyme (protein) and optionally combines these measures.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type protein, respectively the activity or concentration of the protein in the initial microorganism lowered.
  • the increase or decrease in the protein concentration can be detected by the previously mentioned methods (Hermann et al., Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001); Lohaus and Meyer, Biospektrum 5: 32-39 (1998); Lottspeich,
  • endogenous genes refers to the genes or nucleotide sequences present in the population of a species.
  • the heterologous genes of the glycerol metabolism selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC
  • the genes selected from the group of genes or alleles of lysine production amplified, in particular overexpressed.
  • “Genes or alleles of lysine production are understood as meaning all, preferably endogenous, open reading frames, genes or alleles whose amplification / overexpression can bring about an improvement in lysine production.
  • genes or alleles include, but are not limited to, the following genes or alleles: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh , gnd, lysC, lysC FBR , lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc FBR , pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pycP458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM,
  • L-lysine in addition to the functional expression of one or more of the heterologous genes of glycerol metabolism (glycerol metabolism), selected from the group glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC, simultaneously one or more of the genes selected from the group of genes or alleles that are not essential for growth or lysine production , attenuates, in particular, turns off or reduces its expression.
  • the heterologous genes of glycerol metabolism glycerol metabolism
  • genes or alleles include, among others, the following open reading frames, genes or alleles: aecD, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRI, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB and zwa2, which are summarized and explained in Table 2.
  • Endogenous polynucleotides of Corynebacterium glutamicum (Accession No .: NC 006958 or NC 003450 (sequence of the entire genome)), for example, at least 45% or at least 50% or at least 60% or at least 70% or at least 80% or at least 90% , at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% Identity to the in SEQ ID NO. 1, SEQ ID no. 3, SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 7, SEQ ID no. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID no. 13, SEQ ID no. 15, SEQ ID no. 17, SEQ ID no.
  • SEQ ID no. 21, SEQ ID no. 23, SEQ ID no. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID no. 33 or SEQ ID NO. 35 have nucleotide sequences shown and have the functions described, can be amplified. Those known from genome projects
  • NCBI National Library of Medicine National Database
  • Coryneform bacteria were also found to be common upon overexpression of the endogenous polynucleotides glpK (58% identity to SEQ ID No 15) encoding the
  • the bacteria according to the invention can be used continuously - as described, for example, in PCT / EP2004 / 008882 - or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing L-amino acids be cultivated.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strain. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology, of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981).
  • the carbon source used is glycerol. This can be used singly or as a mixture.
  • Sugar and carbohydrates e.g. Glucose,
  • oils and fats such as soya oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as ethanol and methanol and organic acids such as acetic acid, wherein the proportion of glycerol at least greater than or equal to ( ⁇ ) 10%, or
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate,
  • Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium must further contain salts of metals, e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth factors such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used.
  • anti-foaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used.
  • suitable selective substances such as antibiotics may be added to the medium.
  • oxygen or oxygen containing gas mixtures such as air in the culture.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 ° C and preferably at 25 ° C to 40 0 C. The culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours. In continuous processes longer cultivation times are possible.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L- L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt: a) Kultivierung der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden rekombinanten coryneformen Bakterien, in denen mindestens eines oder mehrere der heterologen Polynukleotide des Glycerin- Stof fwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, exprimiert wird (werden) , in einem Glycerin oder gegebenenfalls zusätzlich eine oder mehrere weitere C- Quellen enthaltenden Medium unter Bedingungen, bei denen die gewünschte L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen angereichert wird, und gegebenenfalls b) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100%) im Endprodukt verbleiben. sowie Bakterien, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L- Aminosäure verringern, einsetzt.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
Gegenstand der Erfindung ist sind rekombinante coryneforme Bakterien, in denen mindestens eines oder mehrere der heterologen Gene des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC exprimiert wird (werden) sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, wobei das Medium Glycerin als Kohlenstoffquelle enthält, unter Verwendung dieser Bakterien. Diese Bakterien zeigen die Fähigkeit zur Nutzung von Glycerin und somit zur wirkungsvollen Bildung und Anreicherung der L-Aminosäuren .
Stand der Technik
Chemische Verbindungen, mit denen insbesondere L- Aminosäuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide und D- Aminosäuren gemeint sind, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik, in der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Zahlreiche dieser Verbindungen werden durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen . Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Bakterien werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhalt man Stamme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Lysin-Analogon S- (2-Aminoethyl) -Cystein oder das
Tryptophan-Analogon 5-Fluorotryptophan oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die L- Aminosauren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-
Aminosaure produzierender Stamme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosaure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosaure-Produktion untersucht. Eine zusammenfassende Darstellung über verschiedenste Aspekte der Genetik, des Stoffwechsels und der Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum findet sich bei Puhler ( (chief ed.) Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338 (2003)) und Eggeling und Bott ( (editors) Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005)).
Die gesamte Fermentationsindustrie zur Herstellung von L- Aminosauren verwendet heute zumeist Glukose oder Saccharose als Kohlenstoffquelle, die bei der Verarbeitung von Agrarerzeugnissen erhalten werden. Da jedoch der Preis dieser Kohlenstoffquellen steigt, ist eine technologisch durchfuhrbare Alternative für das Produzieren der L- Aminosauren, bevorzugt L-Lysin und L-Tryptophan, die Nutzung eines preiswerteren Materials als alternativer Rohstoff zur Fermentation, wünschenswert.
Glycerin (Propantriol) ist ein naturlicher Bestandteil von Ölen und Fetten und verbindet als „Brücke" die Fettsauremolekule in den Triglyceriden. Das Glycerin- Molekul ist stark polar und daher gut wasserlöslich. Als Kuppelprodukt entsteht dieser wertvolle Rohstoff bei der Biodieselherstellung (z.B. für Rapsolmethylester, RME) und wird in Kosmetika, pharmazeutischen Produkten, Lebensmitteln und für technische Anwendungen eingesetzt. Entscheidend für den Einsatz von Glycerin als Rohstoff zur Herstellung von Futtermittelkomponenten ist die Preiswürdigkeit. Es ist davon auszugehen, dass mit zunehmender Biodieselproduktion Glycerin für die Herstellung von Futtermitteladditiven interessanter wird.
Corynebacterium glutamicum Wildtyp verwendet eine Vielzahl an monomeren und oligomeren Zuckern wie Glukose, Saccharose oder Maltose als Kohlenstoffquelle (Vahjen et al . , FEMS
Microbiology Ecology 18: 317-328 (1995)), wächst aber nicht auf Glycerin als alleiniger Kohlenstoffquelle .
Corynebacterium glutamicum Wildtyp verfügt über einige Gene mit Homologie zu bekannten Genen des Glycerin- Stoffwechsels, bisher konnte aber nicht geklärt werden, warum das Wachstum auf Glycerin trotzdem nicht möglich ist.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue coryneformen Bakterien bereitzustellen, die in der Lage sind Glycerin möglichst als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Eine weitere damit in unmittelbarem Zusammenhang stehende Aufgabe war es, ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, mit Hilfe solcher coryneformen Bakterien bereitzustellen. Insbesondere sollte dadurch
Glycerin für die fermentative Herstellung von L-Aminosäuren in möglichst wirtschaftlicher Weise nutzbar gemacht werden.
Beschreibung der Erfindung
Gelöst werden diese sowie weitere nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin diskutierten
Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind durch die Bereitstellung von coryneformen Bakterien gemäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren nach Anspruch 18. Zweckmäßige Abwandlungen und Ausformungen der Erfindung werden in den auf Anspruch 1 bzw. Anspruch 18 rückbezogenen Unteransprüchen unter Schutz gestellt.
Gegenstand der Erfindung sind rekombinante coryneforme Bakterien, die insbesondere bereits L-Aminosäuren ausscheiden, und in denen mindestens eine oder mehrere der für die heterologen Genprodukte des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) kodierende (n) Nukleotidsequenz (en) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, exprimiert wird (werden) . Diese Bakterien zeigen die Fähigkeit zur Nutzung von Glycerin.
Zu den verwendeten Bakterien gehören insbesondere coryneforme Bakterien, in denen mindestens ein heterologes Polynukleotid exprimiert wird, das für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% oder zu mindestens 90%, insbesondere zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 98%, besonders bevorzugt zu mindestens 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34 und SEQ ID No. 36 .
Die genannten Bakterien enthalten bevorzugt mindestens ein hetereologes Polynukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
a) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 und dazu komplementäre Nukleotidsequenzen
b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der
SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht;
c) Polynukleotidsequenz mit einer Sequenz, die mit der zur Sequenz SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5,
SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen bevorzugt durch einen Waschschritt erreicht werden, in dem sich die Temperatur über einen Bereich von 64°C bis 68°C und die Salzkonzentration des Puffers über einen Bereich von 2xSSC bis 0,IxSSC erstrecken;
d) Polynukleotid mit einer Sequenz SEQ ID No. 1,
SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35, die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält,
wobei die Polynukleotide für Enzyme des Glycerin- Stoffwechsels (glycerol metabolism) kodieren.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, wobei das Medium Glycerin als Kohlenstoffquelle enthält, unter Verwendung von rekombinanten coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, und in denen mindestens eines oder mehrere der heterologen Gene des Glycerin- Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC oder für deren Genprodukte kodierende Nukleotidsequenzen exprimiert wird bzw. werden.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Bakterien eingesetzt .
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere der proteinogenen Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L- Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L- Glutaminsäure, L-Glutamin, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin und L-Tryptophan. Zu den L-Aminosäuren zählt auch das L- Homoserin .
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen.
Werden im Folgenden Aminosäuren erwähnt, umfasst der Begriff auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin- Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat im Falle der Aminosäure L-Lysin.
Die erfindungsgemäßen „heterologen Gene" oder „heterologen Nukleotidsequenzen" können aus jedem prokaryontischen Spenderorganismus außer aus Vertretern der Gattung Corynebacterium stammen. Bevorzugt werden die Gene aus Escherichia coli eingesetzt.
Der Begriff "Expression heterologer Gene" beschreibt in diesem Zusammenhang die Klonierung entsprechender Gene und ihre Expression im heterologen System, was zu einer Etablierung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus führt, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen oder ein Allel dieses Gens und einen die Exprimierung des Gens ermöglichenden Promotor enthält und durch Transformation, Transduktion oder Konjugation in den Mikroorganismus überträgt und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Unter Allelen versteht man alternative Formen eines gegebenen Gens. Die Formen zeichnen sich durch Unterschiede in der Nukleotidsequenz aus.
Als Genprodukt bezeichnet man das von einer
Nukleotidsequenz, d.h. einem Gen oder einem Allel kodierte Protein oder die kodierte Ribonukleinsäure.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
a) Kultivierung der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden rekombinanten coryneformen Bakterien, in denen mindestens eines oder mehrere der heterologen Gene des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC oder für deren
Genprodukte kodierende Nukleotidsequenzen oder Allele exprimiert wird bzw. werden, in einem Glycerin oder gegebenenfalls zusätzlich eine oder mehrere weitere C- Quellen enthaltenden Medium unter Bedingungen, bei denen die gewünschte L-Aminosaure im Medium oder in den Zellen angereichert wird, und gegebenenfalls
b) Isolierung der gewünschten L-Aminosaure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbruhe und/oder der Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100%) im Endprodukt verbleiben.
Die eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Expression eines oder mehrerer der Gene des Glycerin-Stoffwechsels auf den herkömmlichen
Kohlenstoffquellen wie zum Beispiel Glukose oder Saccharose L-Aminosauren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan . Das eingesetzte Glycerin kann einzeln oder als Mischung verwendet werden, wobei der Anteil des Glycerins bevorzugt > 10 bis 100% betragen soll.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach heterologer Expression eines oder mehrerer der Gene des Glycerin-Stoffwechsels L-Aminosauren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, aus Glycerin als alleiniger Kohlenstoffquelle produzieren.
Erfindungsgemaße rekombinante Bakterien werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion oder Konjugation, oder einer Kombination dieser Methoden, mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Exprimierung des Gens ermöglichenden Promotor enthalt. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Mikroorganismen oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Bei dem Promotor kann es sich um die eigene, upstream des Gens befindliche regulatorische Sequenz handeln, oder es wird ein Promotor aus coryneformen Bakterien mit dem Gen fusioniert. Eine Übersicht über bekannte Promotoren aus Corynebacterium glutamicum ist von Pätek et al . (Journal of Biotechnology 104, 311-323 (2003)) beschrieben.
Die Bakterien, an denen die Maßnahmen der Erfindung durchgeführt werden und die somit Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien.
Bei den coryneformen Bakterien wird die Gattung Corynebacterium bevorzugt. Besonders bevorzugt sind
Aminosäure-ausscheidende Stämme, die auf folgenden Arten beruhen :
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium lilium DSM20137 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020 Bekannte Vertreter Aminosäure ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien sind beispielsweise
die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DM58-l/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940
Corynebacterium glutamicum MH20 (= DSM5714) beschrieben in EP 0 435 132
Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in EP 1 108 790 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP- 3304) beschrieben in US 5,250,423
oder die L-Tryptophan produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) beschrieben in US 5,563,052 Corynebacterium glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) beschrieben in US 5,605,818
Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 beschrieben in US 5,235,940
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) und in der US- A-5,250,434.
Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben .
Die Nukleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können der von Blattner et al . (Science 277: 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
Aus den ebenfalls zur Familie Enterobacteriaceae gehörenden Salmonella typhimurium (Accession No.: NC 003197 (Sequenz des gesamten Genoms)) und Shigella flexneri (Accession No.: NC 004337 (Sequenz des gesamten Genoms) ) ist die Nukleotidsequenz für die Gene glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT und glpX beispielhaft ebenso bekannt. Desweiteren ist aus Salmonella typhimurium
(Accession No.: NC 003197 (Sequenz des gesamten Genoms)) die Nukleotidsequenz für die Gene gldA und talC und aus Shigella flexneri (Accession No.: NC 004337 (Sequenz des gesamten Genoms)) die Nukleotidsequenz für die Gene dhaK, dhaL, dhaM, dhaR und fsa bekannt.
Die Gene und Aktivitäten des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) sind zusammenfassend auch bei Lin (In: Neidhardt (ed) , Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C, USA: 307-342 (1996)) beschrieben.
Das die Gene des Glycerintransport und -metabolismus enthaltende Glycerophosphatregulon (glp) besteht aus fünf Operons, die an drei verschiedenen Genorten auf dem E. coli-Chromosom liegen (Cozzarelli et al . , Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)).
Ein Regulon ist eine Einheit von Genen, die zwar an verschiedenen Orten eines Genoms lokalisiert sind, deren Expression aber durch die gleichen Regulatorproteine gesteuert wird. Ein Operon ist eine Einheit von gemeinsam regulierten Genen an einem Genort.
Bei 88 min findet man das Operon glpFKX (Cozzarelli und Lin, Journal of Bacteriology 91: 1763-1766 (1966); Weissenborn et al . , Journal of Biological Chemistry 267: 6122-6131 (1992)), das für den Glycerinfascilitator GIpF und die Glycerinkinase GIpK und eine Fructose-1, 6- Bisphosphatase II GIpX (Donahue et al . , N"! ϊl *. ; ' wvC>M) kodiert. In dem bei 49 min kartierten Operon sind die Gene glpT (Glycerin-3- Phosphat-Permease) und glpQ (periplasmatische Glycerinphosphodiesterase) zusammengefasst, die im Gegenuhrzeigersinn transkribiert werden. Gegenläufig dazu ist das glpABC-Operon angeordnet, dessen Gene für die drei Untereinheiten der heterotrimeren sn-Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase, wirksam unter Ausschluß von Luftsauerstoff (anaerob), kodieren (CoIe et al . , Journal of Bacteriology 170: 2448-2456 (1988); Ehrmann et al . , Journal of Bacteriology 169: 526-532 (1987)). Bei 75 min auf dem Chromosom liegt das glpDEG-Operon, das für die Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenase GIpD, wirksam in Gegenwart von Luftsauerstoff (aerob) (Cozzarelli et al . , Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)), die Schwefeltransferase GIpE (Cozzarelli et al . , Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)) und das glpG-Gen mit unbekannter Funktion (Zeng et al . , Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996)) kodiert.
Eine kurze Zusammenfassung der Gene und Aktivitäten des Glycerin-Stoffwechsels gibt die folgende Auflistung:
glpA-Gen:
Bezeichnung: große Untereinheit der sn-Glycerin-3-
Phosphat-Dehydrogenase (anaerob) Funktion: Im anaeroben Milieu wird Glycerin-3-
Phosphat zur Energiegewinnung von einer FAD-abhängigen Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase (GIpABC) zu Dihydroxyaceton-Phosphat oxidiert, welches als Intermediat in die Glykolyse eingehen kann. Die bei dieser Oxidationsreaktion frei werdenden Reduktionsäquivalente werden von dem Flavoenzym auf einen membranassoziierten Cytochromkomplex übertragen, wobei Fumarat oder Nitrat als terminaler Elektronenakzeptor dient (Lin, in: Neidhardt (ed) , Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C, USA: 307-342 (1996)). Während die Elektronen durch den Cytochromkomplex geschleust werden, wird die frei werdende Energie dazu genutzt, Protonen durch die Membran von der cytoplasmatischen auf die periplasmatische Seite zu pumpen. Mit dem an der Membran erzeugten Protonengradienten ändert sich sowohl das elektrische als auch das chemische Potential, womit die membrangebundene ATPase angetrieben wird und dadurch ATP erzeugen kann.
EC-Nr. : 1.1.99.5 Referenz : Blattner et al . ; Science 277(5331): 1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 1 Accession No U00096 (Region: 2350669-2352297)
Alternativer Genname: b2241
glpB-Gen : Bezeichnung : Untereinheit zur Membranverankerung (membrane anchor) der sn-Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenase (anaerob) Funktion: siehe glpA
EC-Nr. : 1.1.99.5
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 3
Accession No. : U00096 (Region: 2352287-2353546) Alternativer Genname: b2242
glpC-Gen : Bezeichnung: kleine Untereinheit der sn-Glycerin-3-
Phosphat-Dehydrogenase (anaerob)
Funktion: siehe glpA
EC-Nr. : 1.1.99.5
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331): 1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 5
Accession No. : U00096 (Region: 2353543-2354733)
Alternativer Genname: b2243
glpD-Gen:
Bezeichnung: Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase
(aerob) Funktion: GIpD wurde als aerobe Glycerin-3-
Phosphat-Dehydrogenase (Cozzarelli et al . , Journal of Molecular Biology 31:
371-387 (1968)) identifiziert. Im aeroben Milieu wird Glycerin-3-Phosphat zur Energiegewinnung von dieser FAD- abhängigen Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase (GIpD) zu
Dihydroxyaceton-Phosphat oxidiert, welches als Intermediat in die Glykolyse eingehen kann. Die bei dieser Oxidationsreaktion frei werdenden Reduktionsäquivalente werden von dem
Flavoenzym auf einen membranassoziierten Cytochromkomplex übertragen, wobei molekularer Sauerstoff bzw. Nitrat als terminaler Elektronenakzeptor dient (Lin, in: Neidhardt (ed) , Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C, USA: 307-342 (1996)). Während die Elektronen durch den Cytochromkomplex geschleust werden, wird die frei werdende Energie dazu genutzt, Protonen durch die Membran von der cytoplasmatischen auf die periplasmatische Seite zu pumpen. Mit dem an der Membran erzeugten Protonengradienten ändert sich sowohl das elektrische als auch das chemische Potential, womit die membrangebundene ATPase angetrieben wird und dadurch ATP erzeugen kann. Das offene Leseraster des glpD-Gens besteht aus 501 Codons und die translatierte Sequenz kodiert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 57 kDa (Austin und Larson, Journal of Bacteriology 173: 101-107 (1991)).
EC-Nr. : 1.1.99.5 Referenz : Blattner et al . ; Science 277(5331): 1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 7 Accession No U00096 (Region: 3560036-3561541)
Alternativer Genname: b3426, glyD
glpE-Gen : Bezeichnung: Schwefeltransferase; saure, cytoplasmatische Rhodanese
Funktion : GIpE wurde als Schwefeltransferase (Cozzarelli et al . , Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)) identifiziert. Die vom glpE-Gen kodierte saure, cytoplasmatische Rhodanese mit einem Molekulargewicht von 12 kDa katalysiert als Dimer die Übertragung von Schwefel auf den Schwefelakzeptor Thioredoxin 1 (Ray et al., Journal of Bacteriology 182: 2277- 2284 (2000) ) .
EC-Nr. : 2.8.1.1
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331): 1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 9
Accession No. : U00096 (Region: 3559520-3559846)
Alternativer Genname: b3425
glpF-Gen:
Bezeichnung: Glycerinfascilitator GIpF Funktion: Die erleichterte Diffusion von Glycerin aus dem Nahrmedium wird von dem Glycerinfascilitator GIpF katalysiert (Borgnia und Agre, Proc. Natl. Acad.
Sei. U. S. A. 98: 2888-2893 (2001)), der einen substratspezifischen Kanal mit einer Porengroße von 0.4 nm bildet (Heller et al . , Journal of Bacteriology 144: 274-278 (1980) ) .
EC-Nr. : Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 11 Accession No.: U00096 (Region: 4115268-4116113) Alternativer Genname: b3927
glpG-Gen :
Bezeichnung: Gen des glp Regulons Funktion: Die physiologische Funktion von glpG ist noch unbekannt. Das glpG-Genprodukt ist ein basisches, cytoplasmatisches oder membranassoziiertes Protein mit einem Molekulargewicht von 28 kDa (Zeng et al . , Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996) ) . EC-Nr.:
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 13
Accession No. : U00096 (Region: 3558645-3559475) Alternativer Genname: b3424
glpK-Gen :
Bezeichnung: Glycerinkinase GIpK (ATP-abhängig)
Funktion: Cytoplasmatisches Glycerin wird sofort von der ATP-abhängigen Glycerinkinase K phosphoryliert, die in ihrer enzymatisch aktiven Form mit dem Glycerinfascilitator GIpF assoziiert vorliegt (Voegele et al . , Journal of Bacteriology 175: 1087-1094 (1993)).
EC-Nr. : 2.7.1.30
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 15 Accession No.: U00096 (Region: 4113737-4115245)
Alternativer Genname: b3926
glpQ-Gen :
Bezeichnung : Glycerinphosphodiesterase Funktion: Glycerophosphatdiester, die deacetylierten Abbauprodukte der Phospholipide (Lin, in: Neidhardt (ed) , Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C, USA: 307-342 (1996)), werden im Periplasma von der dort lokalisierten Phosphodiesterase GIpQ zu Alkohol und Glycerin-3-Phosphat hydrolysiert (Larson et al . , Journal of Biological Chemistry 258: 5428-5432
(1983) ) . Da der
Glycerinphosphodiesterase somit eine extracytoplasmatische Wirkweise zugeschrieben wird, muss das von dem heterologen glpQ-Gen abgeleitete Genprodukt in den beanspruchten Bakterien ein Leaderpeptid umfassen, wie es für exkretierte Proteine Grampositiver Bakterien typisch ist
(Nielsen et al . , Protein Engineering Design and Selection 10:1-6 (1997)). Diese charakteristische Signalsequenz ermöglicht einen durch den allgemeinen Sekretionsapparat (See-System) vermittelten Export des GlpQ-Proteins über die Cytoplasmamembran (Kell und Young, Current opinion in microbiology 3:238-243 (2000); Mukamolova et al., Molecular Microbiology 46:611-621
(2002a); Molecular Microbiology 46:613-
635 (2002b) ) .
EC-Nr. : 3.1.4.46 Referenz : Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 17 Accession No U00096 (Region: 2347957-2349033) Alternativer Genname: b2239
glpT-Gen: Bezeichnung : Glycerin-3-Phosphat-Permease Funktion : Glycerin-3-Phosphat wird durch die Permease GIpT (Eiglmeier et al . , Molecular Microbiology 1: 251-258 (1987); Larson et al . , Journal of Bacteriology 152: 1008-1021 (1982)) im Austausch gegen anorganisches Phosphat ins Zellinnere transportiert (Auer et al., Biochemistry 40: 6628-6635 (2001)). Die für den Transport benötigte Energie wird durch diesen Antiport bereitgestellt und gleichzeitig wird eine Akkumulation des toxisch wirkenden Phosphats verhindert (Xavier et al . , Journal of Bacteriology
177: 699-704 (1995) ) . EC-Nr. : Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 19
Accession No. : U00096 (Region: 2349038-2350396) Alternativer Genname: b2240
glpX-Gen : Bezeichnung: Fructose-1, 6-Bisphosphatase II
Funktion: Bisher konnte keine physiologische
Rolle des Enzyms GIpX gefunden werden. Eine Mutation in fbp, dem Gen für die Fructose-1, 6-Bisphosphatase I, konnte durch GIpX nicht komplementiert werden.
Doch scheint eine funktionelle Bedeutung trotzdem sicher, da Mutanten, die in der Glykolyse aufgrund einer pfkA (Phosphofructokinase A) Mutation gestört sind, ohne GIpX sehr viel langsamer wachsen (Donahue et al . ;
EC-Nr. : 3.1.3.11 Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331)
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 21 Accession No. : U00096 (Region: 4112592-4113602) Alternativer Genname: 3925
Neben den Genen des Glycerin-Transports und -Stoffwechsels (glycerol metabolism) können die folgenden Gene des Abbaus verschiedener Zwischen- und Endprodukte des besagten Stoffwechsels heterolog exprimiert werden:
gldA-Gen: Bezeichnung: Glycerin-Dehydrogenase (NAD)
Funktion: Die Glycerin-Dehydrogenase katalysiert die reversible NAD-abhängige Reaktion von Glycerin zu Dihydroxyaceton (Truniger und Boos, Journal of Bacteriology 176(6): 1796-1800 (1994))
EC-Nr. : 1.1.1.6
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 23 Accession No.: U00096 (Region: 4135955-4137097) Alternativer Genname: b3945
dhaK-Gen:
Bezeichnung: Untereinheit der Dihydroxyaceton- Kinase, N-terminale Domäne
Funktion: Die Dihydroxyaceton-Kinase katalysiert in ihrer Funktion als Phosphoenolpyruvat (PEP) -abhängige Dihydroxyaceton-Phosphotransferase die Reaktion von Dihydroxyaceton zu
Dihydroxyaceton-Phosphat (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001) ) . DhaK trägt die Dihydroxyaceton-Bindestelle . EC-Nr.: 2.7.1.29
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ I D No . : 25
Accession No. : U00096 (Region: 1248991-1250091)
Alternativer Genname: dhaKl, ycgT, bl200
dhaL-Gen:
Bezeichnung: Untereinheit der Dihydroxyaceton-
Kinase, C-terminale Domäne Funktion: Die Dihydroxyaceton-Kinase katalysiert in ihrer Funktion als PEP-abhangige Dihydroxyaceton-Phosphotransferase die
Reaktion von Dihydroxyaceton zu Dihydroxyaceton-Phosphat (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)). DhaL tragt ADP als Cofaktor für den Transfer von Phosphat von DhaM auf Dihydroxyaceton. EC-Nr. : 2.7.1.29
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 27
Accession No. : U00096 (Region: 1248348-1248980) Alternativer Genname: dhaK2, ycgS, bll99
dhaM-Gen: Bezeichnung: PTS-Protein-Untereinheit der
Dihydroxyaceton-Kinase, Multi- Phosphoryl-Transferprotein
Funktion: Die Dihydroxyaceton-Kinase katalysiert in ihrer Funktion als PEP-abhangige Dihydroxyaceton-Phosphotransferase die
Reaktion von Dihydroxyaceton zu Dihydroxyaceton-Phosphat (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)) . DhaM besteht aus drei Domänen mit Ähnlichkeit zu den drei Domänen des
Phosphoenolpyruvat-abhangigen Phosphotransferase-Systems . Phosphoryliertes DhaM überträgt das Phosphat auf das am DhaL gebundene ADP.
EC-Nr. : 2.7.1.29
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331): 1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 29
Accession No.: U00096 (Region: 1246919-1248340)
Alternativer Genname: dhaH, ycgC, bll98
dhaR-Gen:
Bezeichnung: Aktivator des dha-Operons (dhaKLM) Funktion: transkriptioneller Aktivator, stimuliert die Transkription des dha- Operons von einem sigma70-Promotor (Bachler et al . , The EMBO Journal
24 (2) : 283-293 (2005) ) EC-Nr.: Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 31
Accession No. : U00096 (Region: 1250280-1252208) Alternativer Genname: ycgU, bl201
fsa-Gen : Bezeichnung: Fruktose-6-Phosphat-Aldolase I
Funktion: Die Fruktose-6-Phosphat-Aldolase I katalysiert eine Aldolspaltung des Fruktose-6-Phosphats, Substrate des Enzyms sind Dihydroxyaceton sowie Fruktose-6-Phosphat und
Glycerinaldehyd-3-Phosphat, nicht genutzt werden Fruktose, Fruktose-1- Phosphat, Fruktose-1, 6-bisphosphat oder Dihydroxyaceton-Phosphat (Schurmann und Sprenger, Journal of Biological
Chemistry 276 (14) : 11055-11061 (2001)) EC-Nr. : 4.1.2.- Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997) SEQ ID No. : 33
Accession No.: U00096 (Region: 862793-863527) Alternativer Genname: mipB, ybiZ, B0825
talC-Gen:
Bezeichnung: Fruktose-6-Phosphat-Aldolase II
Funktion: Die Fruktose-6-Phosphat-Aldolase II katalysiert eine Aldolspaltung des
Fruktose-6-Phosphats (Schurmann und Sprenger, Journal of Biological Chemistry 276 (14) : 11055-11061 (2001)). Das talC-Gen liegt direkt neben dem gldA-Gen.
EC-Nr. : 4.1.2.-
Referenz: Blattner et al . ; Science 277(5331):
1453-1474 (1997)
SEQ ID No. : 35 Accession No.: U00096 (Region: 4137069-4137731)
Alternativer Genname: fsaB, yijG, b3946
Die Nukleinsauresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) , der
Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
Der besseren Übersichtlichkeit halber sind die bekannten Sequenzen zu den behandelten Genen von Escherichia coli unter den SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 und SEQ ID No. 35 dargestellt.
Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen offenen Leserahmen können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen („sense mutations") ergeben.
Zu den Allelen der behandelten Gene, welche funktionsneutrale Sinnmutationen enthalten, zählen unter anderem solche, die zu höchstens 13 oder zu höchstens 10, bevorzugt zu höchstens 7 oder zu höchstens 5, ganz besonders bevorzugt zu höchstens 3 oder zu höchstens 2 oder zu mindestens einem konservativen Aminosäureaustausch in dem von ihnen kodierten Protein führen.
Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.
In gleicher Weise können auch solche Nukleotidsequenzen verwendet werden, die für Varianten der genannten Proteine kodieren, die zusätzlich am N- oder C-Terminus eine Verlängerung oder Verkürzung um mindestens eine (1) Aminosäure enthalten. Diese Verlängerung oder Verkürzung beträgt nicht mehr als 13, 10, 7, 5, 3 oder 2 Aminosäuren oder Aminosäurereste.
Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, das endständige Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.
Zu den geeigneten Allelen zählen auch solche, die für Proteine kodieren, in denen mindestens eine (1) Aminosäure eingefügt (Insertion) oder entfernt (Deletion) ist. Die maximale Anzahl derartige als Indels bezeichneter Veränderungen kann 2, 3, 4, 5 in keinem Falle aber mehr als 6 Aminosäuren betreffen.
Zu den geeigneten Allelen gehören ferner solche die durch Hybridisierung, insbesondere unter stringenten Bedingungen unter Verwendung von SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No.
5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No.
13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No.
21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 oder
Teilen davon insbesondere der Kodierregionen bzw. der dazu komplementären Sequenzen, erhältlich sind.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991)) . Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) .
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 500C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 500C - 68°C, ca. 52°C - 68°C, ca. 54°C - 68°C, ca. 56°C - 68°C, ca. 58°C - 68°C, ca. 600C - 68°C, ca. 62°C - 68°C, ca. 64°C - 68°C, ca. 66°C - 68°C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64°C - 68°C oder ca. 66°C - 68°C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2x SSC oder 0,Ix SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 20C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde bzw. zu den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 dargestellten Nukleotidsequenzen besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558) .
Auch Polynukleotide von Bacillus subtilis (Accession No.: NC 000964 (Sequenz des gesamten Genoms) ) und Streptomyces coelicolor (Accession No.: NC 003888 (Sequenz des gesamten Genoms) ) , die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zu den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No.
13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 dargestellten Nukleotidsequenzen besitzen und die beschriebenen Funktionen aufweisen, können eingesetzt werden. Die aus den Genomprojekten bekannten
Nukleotidsequenzen der Gene und ORF's gehören zum Stand der Technik und können verschiedenen Veröffentlichungen, Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) entnommen werden.
Die Expression der Gene des Glycerinstoffwechsels ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y., 1989) und anschließende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich
(1999) Angewandte Chemie 111:2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al . (2001) Journal of Bacteriology 183:2151-2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen- Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y., 1989). Die intrazellularen enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (19) : 5624-5627 ; Ray et al .
(2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284 ; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823) bestimmt werden.
Die heterologen Gene werden zum Beispiel mit Hilfe von episomalen Plasmiden exprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z.B. pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549- 554), pEKExl (Eikmanns et al . , Gene 102:93-98 (1991)) oder pHS2-l (Sonnen et al . , Gene 107:69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl . Andere Plasmidvektoren wie z.B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAGl (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden. Ein Überblick über native Plasmide aus Aminosäure-produzierenden coryneformen Bakterien ist im Handbook of Corynebacterium glutamicum (Tauch, Chapter 4, 57-80, editors: Eggeling und Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005)) verfügbar.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons oder in der WO03/040373 beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al . , Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5, 487, 993) , pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al.,1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende heterologe Gen, gegebenenfalls einschließlich der Expressions- und/oder Regulationssignale, und die Randbereiche eines nicht essentiellen homologen Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al . (FEMS Microbiology Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"- Ereignisses enthält der resultierende Stamm eine Kopie des heterologen Gens einschließlich des Plasmidvektors an dem gewünschten Genort des C. glutamicum Chromosoms, der über die homologen Nukleotidsequenzen auf dem Plasmid vorbestimmt war. Mittels eines geeigneten zweiten, eine Excision bewirkenden „cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau nur des heterologen Gens. Dabei verbleibt am jeweiligen natürlichen Genort keine zur episomalen Replikation in Mikroorganismen befähigende Nukleotidsequenz, keine zur Transposition befähigende Nukleotidsequenz und keine Resistenz gegen Antibiotika vermittelnde Nukleotidsequenz.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur funktionellen Expression eines oder mehrerer der heterologen Gene des Glycerin- Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, eines oder mehrere Enzyme der Stoffwechselwege, welche die Bildung der gewünschten Aminosäure erhöhen oder verringern, wie z.B. des Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine entweder zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren, oder abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Der Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Uberexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Zur Erzielung einer Uberexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusatzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivitat verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Uberexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturfuhrung erreicht werden .
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europaischen Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al . (Gene 134, 15 - 24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift
JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Verstärkung werden Gene zum Beispiel mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert . Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z.B. pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al . , Gene 102:93- 98 (1991)) oder pHS2-l (Sonnen et al . , Gene 107:69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl . Andere Plasmidvektoren wie z.B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAGl (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise PSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al . , Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-T0P0 (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al.,1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al .
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al . (FEMS Microbiology Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"- Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Eine gebräuchliche Methode, eine oder mehrere zusätzliche Kopien eines Gens von C. glutamicum in das Chromosom des gewünschten coryneformen Bakteriums einzubauen, ist die in der WO03/014330 und der WO03/040373 beschriebene Methode der Gen-Verdopplung. Dazu wird in der WO03/040373 die Nukleotidsequenz des gewünschten ORF's, Gens oder Allels, gegebenenfalls einschließlich der Expressions- und/oder Regulationssignale isoliert und zwei Kopien, bevorzugt in Tandem-Anordnung, in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie beispielsweise pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al . , Journal of Bacteriology 174:
5462-65 ( 1992 ) ) kloniert . Der Vektor wird anschließend durch Transformation oder Konjugation in das gewünschte coryneforme Bakterium überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden „cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Excision bewirkenden „cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der zusätzlichen Gen-Kopie. Danach werden solche Bakterien isoliert, bei denen zwei Kopien des ORF's, Gens oder Allels am jeweiligen natürlichen Ort anstelle der ursprünglich vorhandenen singulären Kopie vorliegen. Dabei verbleibt am jeweiligen natürlichen Genort keine zur episomalen Replikation in Mikroorganismen befähigende Nukleotidsequenz, keine zur Transposition befähigende Nukleotidsequenz und keine Resistenz gegen Antibiotika vermittelnde Nukleotidsequenz.
Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
Die Erhöhung bzw. Erniedrigung der Proteinkonzentration ist über die bereits vorher genannten Methoden nachweisbar (Hermann et al . , Electrophoresis, 22:1712-23 (2001); Lohaus und Meyer, Biospektrum 5:32-39 (1998); Lottspeich,
Angewandte Chemie 111:2630-2647 (1999); Wilson et al . , Journal of Bacteriology 183:2151-2155 (2001)).
Die Verwendung endogener Gene wird im Allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen .
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin neben der Expression eines oder mehrerer der heterologen Gene des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele der Lysinproduktion verstärkt, insbesondere uberexprimiert werden. Unter „Gene oder Allele der Lysinproduktion sind samtliche, bevorzugt endogene, offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren Verstarkung/Uberexpression eine Verbesserung der Lysinproduktion bewirken kann.
Hierzu gehören unter anderem folgende Gene oder Allele: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsl, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwal, zwf und zwf A243T. Diese sind in Tabelle 1 zusammengefasst und erläutert.
Tabelle 1
Gene und Allele der Lysinproduktion
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, wenn man zusatzlich zur funktionellen Expression eines oder mehrerer der heterologen Gene des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Lysinproduktion nicht essentiell sind, abschwächt, insbesondere ausschaltet oder deren Expression verringert .
Hierzu gehören unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: aecD, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRl, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB und zwa2, welche in Tabelle 2 zusammengefasst und erläutert sind.
Tabelle 2:
Gene und Allele, die für die Lysinproduktion nicht essentiell sind
Auch endogene Polynukleotide von Corynebacterium glutamicum (Accession No.: NC 006958 bzw. NC 003450 (Sequenz des gesamten Genoms) ) , die beispielsweise mindestens 45% oder mindestens 50% oder mindestens 60% oder mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zu den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 dargestellten Nukleotidsequenzen besitzen und die beschriebenen Funktionen aufweisen, können verstärkt werden. Die aus den Genomprojekten bekannten
Nukleotidsequenzen der Gene und ORF's gehören zum Stand der Technik und können verschiedenen Veröffentlichungen, Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) entnommen werden.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien auch nach gemeinsamer Uberexpression der endogenen Polynukleotide glpK (58% Identität zu SEQ ID No. 15), kodierend für die
ATP-abhangigen Glycerinkinase K, und glpD (47% Identität zu SEQ ID No. 7), kodierend für die Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) L-Aminosauren, insbesondere L-Lysin und L- Tryptophan, aus Glycerin als alleiniger Kohlenstoffquelle produzieren.
Der besseren Übersichtlichkeit halber sind die bekannten Sequenzen zu den behandelten Genen von Corynebacterium glutamicum unter den SEQ ID No. 37 und SEQ ID No. 39 dargestellt .
Die erfindungsgemaßen Bakterien können kontinuierlich - wie beispielsweise in der PCT/EP2004/008882 beschrieben - oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosauren kultiviert werden. Eine
Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfugbar.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stamme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle wird Glycerin eingesetzt. Dieses kann einzeln oder als Mischung verwendet werden. Zugesetzt werden können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose,
Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Starke und gegebenenfalls Cellulose, Ole und Fette wie z.B. Sojaol, Sonnenblumenöl, Erdnussol und Kokosfett, Fettsauren wie z.B. Palmitinsaure, Stearinsaure und Linolsaure, Alkohole wie z.B. Ethanol und Methanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure, wobei der Anteil des Glycerins mindestens größer gleich (≥) 10%, oder mindestens ≥ 25%, oder mindestens ≥ 50%, oder mindestens ≥ 75%, oder mindestens ≥ 90%, oder mindestens ≥ 95%, mindestens ≥ 99%, bevorzugt 100% betragen soll.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei
Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben .

Claims

Patentansprüche
1. Rekombinante coryneforme Bakterien, in denen mindestens eines oder mehrere der heterologen Polynukleotide des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) , ausgewählt aus der Gruppe glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa und talC, exprimiert wird (werden) .
2. Rekombinante coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 1, in denen mindestens ein heterologes Polynukleotid exprimiert wird, das für jeweils ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
a) SEQ ID NO: 2, wobei das Polypeptid die Funktion der großen Untereinheit der sn-Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase (anaerob) erfüllt,
b) SEQ ID NO: 4, wobei das Polypeptid die Funktion der Untereinheit zur Membranverankerung der sn-Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenase (anaerob) erfüllt,
c) SEQ ID NO: 6, wobei das Polypeptid die Funktion der kleinen Untereinheit der sn-Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase (anaerob) erfüllt,
d) SEQ ID NO: 8, wobei das Polypeptid die Aktivität der Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (aerob) aufweist,
e) SEQ ID NO: 10, wobei das Polypeptid die Aktivität der Schwefeltransferase aufweist,
f) SEQ ID NO: 12, wobei das Polypeptid die Aktivität des Glycerinfascilitator GIpF aufweist,
g) SEQ ID NO: 14, h) SEQ ID NO: 16, wobei das Polypeptid die Aktivität der Glycerinkinase GIpK (ATP-abhängig) aufweist,
i) SEQ ID NO: 18, wobei das Polypeptid die Aktivität der periplasmatische Glycerinphosphodiesterase aufweist,
j) SEQ ID NO: 20, wobei das Polypeptid die Aktivität der Glycerin-3-Phosphat-Permease aufweist,
k) SEQ ID NO: 22, wobei das Polypeptid die Aktivität der Fructose-1, 6-Bisphosphatase II aufweist,
1) SEQ ID NO: 24, wobei das Polypeptid die Aktivität der Glycerin-Dehydrogenase (NAD-abhängig) aufweist,
m) SEQ ID NO: 26, wobei das Polypeptid die Funktion der N-terminalen Domäne der Dihydroxyaceton-Kinase erfüllt,
n) SEQ ID NO: 28, wobei das Polypeptid die Funktion der C-terminalen Domäne der Dihydroxyaceton-Kinase erfüllt,
o) SEQ ID NO: 30, wobei das Polypeptid die Funktion der PTS-Protein-Untereinheit der Dihydroxyaceton-Kinase erfüllt,
p) SEQ ID NO: 32, wobei das Polypeptid die Funktion des Aktivators des dha-Operons erfüllt,
q) SEQ ID NO: 34, wobei das Polypeptid die Aktivität der Fruktose-6-Phosphat-Aldolase I aufweist, und
r) SEQ ID NO: 36, wobei das Polypeptid die Aktivität der Fruktose-6-Phosphat-Aldolase II aufweist.
3. Coryneforme Bakterien gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide Aminosäuresequenzen besitzen, die zu wenigstens 95% identisch sind mit einer der Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe a) bis r) .
4. Coryneforme Bakterien gemäss den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide Aminosäuresequenzen aufweisen, die zu 100% identisch sind mit einer der Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe a) bis r) .
5. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein heterologes Polynukleotid enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
a) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 und dazu komplementäre Nukleotidsequenzen;
b) Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die der SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht;
c) Polynukleotidsequenz mit einer Sequenz, die mit der zur Sequenz SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder SEQ ID No. 35 komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen durch einen Waschschritt erreicht werden, in dem sich die Temperatur über einen Bereich von 64°C bis 680C und die Salzkonzentration des Puffers über einen Bereich von 2xSSC bis 0,IxSSC erstrecken;
d) Polynukleotid mit einer Sequenz SEQ ID No. 1,
SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 oder
SEQ ID No. 35, die funktionsneutrale Sinnmutationen enthält .
6. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Transformation, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden hergestellt werden, mit einem Vektor, der mindestens eines oder mehrere der genannten Polynukleotide, oder deren Allele und gegebenenfalls einen Promotor enthält.
7. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 6, in denen die heterologe Expression durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Bakterien bewirkt wird.
8. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Expression durch einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt wird.
9. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression mindestens eines der genannten
Polynukleotide unter der Kontrolle eines die Expression des Gens verstärkenden Promotors steht.
10. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den coryneformen Bakterien um ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes und Corynebacterium aminogenes handelt .
11. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Corynebacterium glutamicum handelt.
12. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Aminosäure ausscheidende Bakterien handelt.
13. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Lysin oder um L-Tryptophan ausscheidende Bakterien handelt.
14. Coryneforme Bakterien gemäss Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, insbesondere überexprimiert vorliegen.
15. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, in denen das exprimierte heterologe Polynukleotid aus einem prokaryontischen Organismus stammt.
16. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1 bis 15, in denen das exprimierte heterologe Polynukleotid aus Enterobacteriaceae stammt.
17. Coryneforme Bakterien nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1 bis 16, in denen das exprimierte heterologe Polynukleotid aus Escherichia coli stammt.
18. Rekombinante coryneforme Bakterien, in denen mindestens die endogenen Polynukleotide des Glycerin-Stoffwechsels (glycerol metabolism) glpD und glpK überexprimiert werden .
19. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man folgende Schritte durchführt :
a) Kultivierung der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden rekombinanten coryneformen Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 in einem Glycerin oder gegebenenfalls zusätzlich eine oder mehrere weitere C- Quellen enthaltenden Medium unter Bedingungen, bei denen die gewünschte L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen angereichert wird, und gegebenenfalls
b) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100%) im Endprodukt verbleiben.
20. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man als C- Quelle zu > 10 bis 100% Glycerin einsetzt .
21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass man L- Lysin oder L- Tryptophan herstellt .
22. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise verstärkt sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure erhöhen.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.
24. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan, coryneforme Bakterien fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsl, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwal, zwf und zwf A243T verstärkt, insbesondere überexprimiert .
25. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität oder Konzentration des (der) Protein (e), für das das (die) verstärkte (n) Gen(e) kodiert (en) , um jeweils 10 bis 2000 % zunimmt, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs- Mikroorganismus .
26. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, coryneforme Bakterien fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe aecD, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRl, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB und zwa2 abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität oder Konzentration des (der) Protein (e), für das das (die) abgeschwächte Gen(e) kodiert (en) , auf jeweils 0 bis 75 % absinkt, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs- Mikroorganismus .
EP06806854A 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen Withdrawn EP1948811A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11152912.9A EP2354235B1 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DK11152912.9T DK2354235T3 (en) 2005-10-05 2006-09-27 Method for fermative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria
PL11152912T PL2354235T3 (pl) 2005-10-05 2006-09-27 Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem bakterii maczugowatych

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005047596A DE102005047596A1 (de) 2005-10-05 2005-10-05 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
PCT/EP2006/066813 WO2007039532A2 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP11152912.9A Division EP2354235B1 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1948811A2 true EP1948811A2 (de) 2008-07-30

Family

ID=37432247

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06806854A Withdrawn EP1948811A2 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen
EP11152912.9A Not-in-force EP2354235B1 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP11152912.9A Not-in-force EP2354235B1 (de) 2005-10-05 2006-09-27 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9150827B2 (de)
EP (2) EP1948811A2 (de)
DE (1) DE102005047596A1 (de)
DK (1) DK2354235T3 (de)
ES (1) ES2529107T3 (de)
PL (1) PL2354235T3 (de)
WO (1) WO2007039532A2 (de)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100838035B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838038B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
DE102007005072A1 (de) * 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
JP2010263790A (ja) 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2395579C2 (ru) 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
KR100964078B1 (ko) 2008-03-05 2010-06-16 씨제이제일제당 (주) 5'-이노신산 생산능이 향상된 코리네박테리움암모니아게네스 및 그를 이용한 5'-이노신산 생산 방법
KR101126041B1 (ko) * 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010147642A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Production of triacylglycerides, fatty acids, and their derivatives
JP2013511277A (ja) 2009-11-18 2013-04-04 ミリアント・コーポレイション 化学物質の効率的な生産のための微生物の改変
KR101221557B1 (ko) * 2010-08-30 2013-01-14 한국과학기술원 수크로오즈와 글리세롤을 동시에 이용하는 신규 숙신산 생성 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN113201535B (zh) * 2020-07-20 2022-02-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用
CN112080456A (zh) * 2020-09-15 2020-12-15 江南大学 一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法
KR20250161102A (ko) * 2024-05-07 2025-11-17 지에스칼텍스 주식회사 글리세롤 활용능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 글리세롤 활용 방법
CN119552790B (zh) * 2024-11-29 2026-03-17 江南大学 一种产n-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
GB2165546B (en) 1984-08-21 1989-05-17 Asahi Chemical Ind A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom
US5250434A (en) 1987-03-27 1993-10-05 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms for production of glutamic acid
JP2656300B2 (ja) 1988-04-18 1997-09-24 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−トリプトファンの製造法
GB2223754B (en) 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE3943117A1 (de) 1989-12-27 1991-07-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
JP2990735B2 (ja) 1990-04-20 1999-12-13 味の素株式会社 Ｌ―リジンの発酵的製造法
DE4027453A1 (de) 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
DE69133559T2 (de) 1990-09-27 2007-11-22 Invitrogen Corp., Carlsbad Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nucleinsäuren
JPH05195736A (ja) 1992-01-20 1993-08-03 Mazda Motor Corp エンジンのバルブ駆動装置
JP3369231B2 (ja) 1992-12-03 2003-01-20 協和醗酵工業株式会社 芳香族アミノ酸の製造法
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
DE19931317A1 (de) 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
DE19907347A1 (de) 1999-02-20 2000-08-24 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US6884614B1 (en) * 1999-07-01 2005-04-26 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins
US20020086371A1 (en) 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
US6861246B2 (en) 1999-07-07 2005-03-01 Degussa Ag L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
US20060014259A9 (en) 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
DE19959329A1 (de) 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US20050112733A1 (en) 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
EP1297149A2 (de) * 2000-07-01 2003-04-02 Degussa AG Gpsa gen aus corynebakterien und seine verwendung zur herstellung von l-aminosäuren
JP4304837B2 (ja) 2000-07-05 2009-07-29 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
EP1358337A1 (de) 2001-01-30 2003-11-05 Degussa AG Das otsa gen von corynebacterium glutamicum
CA2456416A1 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
CA2455878A1 (en) 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
DE10344739A1 (de) 2003-09-26 2005-04-14 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
WO2005042750A1 (en) 2003-10-31 2005-05-12 Novozymes A/S Method for stable gene-amplification in a bacterial host cell
EP1704241A2 (de) * 2003-12-18 2006-09-27 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur fermentativen herstellung einer feinchemikalie
WO2007013695A1 (ja) * 2005-07-29 2007-02-01 Nippon Shokubai Co., Ltd. 細菌にグリセリン資化能を付与する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2007039532A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2354235T3 (pl) 2015-04-30
US20080293100A1 (en) 2008-11-27
DK2354235T3 (en) 2015-02-16
DE102005047596A1 (de) 2007-04-12
WO2007039532A3 (de) 2007-08-02
ES2529107T3 (es) 2015-02-16
WO2007039532A2 (de) 2007-04-12
EP2354235A1 (de) 2011-08-10
EP2354235B1 (de) 2014-11-19
US9150827B2 (en) 2015-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2041276B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels mutanten des glta-gens kodierend für citratsynthase
EP2354235B1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
EP2061881B1 (de) Allele des rel-gens aus coryneformen bakterien
EP1824968B1 (de) Allele des gnd-gens aus coryneformen bakterien
DE102004013503A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
EP2078085B1 (de) Allele des prpd1-gens aus coryneformen bakterien
EP2089525B1 (de) Allele des oxyr-gens aus coryneformen bakterien
DE60218215T2 (de) Allele des siga gens aus coryneformen bakterien
DE10109690A1 (de) Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE102004009454A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen
DE10162387A1 (de) Für das rpoB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10162730A1 (de) Allele des glk-Gens aus coryneformen Bakterien
WO2006100211A1 (de) Mutierte allele des zwg-gens (g6pdh) aus coryneformen bakterien zur gesteigerten lysin produktion
EP1239040A2 (de) Mutationen im rpoB-Gen L-Lysin produzierender Corynebacterium glutamicum-Stämme und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
DE10210527A1 (de) Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
EP1902067B1 (de) Allele des opca-gens aus coryneformen bakterien
DE102005045301A1 (de) Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung coryneformer Bakterien
EP1841859B1 (de) Allele des mqo-gens aus coryneformen bakterien
DE10162386A1 (de) Für das rpsL-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10046623A1 (de) Neue für das dps-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10001101A1 (de) Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen
EP1659174A2 (de) Allele des metK-Gens aus coryneformen Bakterien
EP1861493B1 (de) Mutierte allele des zwg-gens (g6pdh) aus coryneformen bakterien zur gesteigerten lysin produktion
DE10220574A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren mit coryneformen Bakterien unter Verwendung von Phosphoglucose-Isomerasen aus coryneformen Bakterien
DE10109685A1 (de) Neue für das sahH-Gen kodierende Nukleotidsequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20080313

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR

17Q First examination report despatched

Effective date: 20090331

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20110209