EP1606410A2 - Acide nucleique dirigeant l'expression d'un polypeptide d'interet dans les glandes sericigenes posterieures d'un lepidoptere, et ses applications - Google Patents

Acide nucleique dirigeant l'expression d'un polypeptide d'interet dans les glandes sericigenes posterieures d'un lepidoptere, et ses applications

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Publication number
EP1606410A2
EP1606410A2 EP04720052A EP04720052A EP1606410A2 EP 1606410 A2 EP1606410 A2 EP 1606410A2 EP 04720052 A EP04720052 A EP 04720052A EP 04720052 A EP04720052 A EP 04720052A EP 1606410 A2 EP1606410 A2 EP 1606410A2
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
interest
nucleotide
polynucleotide
expression
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Withdrawn
Application number
EP04720052A
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German (de)
English (en)
Inventor
Gérard CHAVANCY
Pierre Couble
Bénédicte DURAND
Anne-Marie Grenier
Béatrice HORARD
Eric Julien
Bernard Mauchamp
Pascale Nony
Jean-Claude Prudhomme
Corinne Royer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the invention relates to the field of synthesis and secretion of proteins of industrial interest, such as fibrous proteins for textile use, in particular new bristles or proteins for biomedical use. It relates to the targeted expression of polynucleotides and / or polypeptides of interest specifically in certain tissues of an animal and more specifically in the seric gland of Bombyx mori. According to the invention, the seric gland of the silkworm is used as a "bioreactor" capable of producing proteins in large quantities and of exporting them to the silk cocoon from where they can be purified.
  • fibrous proteins for textile use such as the method of producing spider silk thread proteins by the mammary glands of transgenic goats (Nexia Biotechnologies Inc. 1000 St-Charles Avenue, Bloc B, Vaudreuil-Dorion , QC, J7V 8P5, Canada).
  • these methods do not allow the fibrous protein to be organized in the form of a wire.
  • the known methods use bacterial cultures, cultures of cell lines or vertebrate organisms such as cows, goats or even transgenic rabbits. This type of production of recombinant proteins is very expensive.
  • the protein For production to be significant, the protein must be synthesized specifically from a tissue, and exported to the outside of the animal, preferably an invertebrate.
  • the invention relates to a nucleic acid directing the expression of a protein of interest specifically in the cells of the posterior seric glands of Bombyx mori, characterized in that said nucleic acid comprises, from the 5 ′ end to the 3 end ', (i) a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells and (ii) a region coding for a modified signal peptide, placed under the control of said regulatory region , said nucleic acid having at least 90% nucleotide identity with the polynucleotide ranging from nucleotide 1150 to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No.
  • the invention also relates to an expression cassette comprising a polynucleotide of interest placed under the control of a nucleic acid as defined above, the polynucleotide of interest being a sense polynucleotide, coding for a polypeptide.
  • the invention also relates to a recombinant integration vector comprising a nucleic acid or an expression cassette as defined above, as well as to a host cell, modified by the integration of this nucleic acid or of this expression cassette in its genome.
  • Another subject of the invention is the use of a nucleic acid, an expression cassette, a recombinant vector or a recombinant host cell as defined above for obtaining an animal. non-human transgenic.
  • the invention also relates to methods for obtaining a non-human transgenic animal modified by integration into its genome of a nucleic acid, an expression cassette, a recombinant vector or a host cell. recombinant as defined above.
  • the invention also relates to a nucleic acid directing the expression of an RNA of interest decreasing the synthesis of fibroin H, specifically in the cells of the posterior seric glands of Bombyx mori, said nucleic acid comprising a regulatory region comprising regulatory signals.
  • a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells, said nucleic acid having at least 90% nucleotide identity with the polynucleotide ranging from nucleotide 1150 to nucleotide 1451 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • nucleic acid as mentioned above will be described in more detail in the section entitled “additional nucleic acids according to the invention”.
  • a nucleic acid which comprises both (i) a regulatory region comprising at least one copy of the target nucleotide motif of the transcription factor of the SGF1 type “forkhead”, a promoter site of the appropriate transcription and (ii) a region encoding a modified signal peptide, said region being placed under the control of said regulatory region, is capable of directing the synthesis of a protein of interest specifically in the posterior sericogenic cells of the Bombyx mori lepidoptera, when the nucleotide sequence encoding said protein of interest is fused “in phase” with the nucleotide sequence encoding said modified signal peptide.
  • the nucleotide sequence coding for the protein of interest is fused “in phase” with the nucleotide sequence coding for said modified signal peptide when the nucleotide located at the 3 'end of the last codon of the sequence coding for the modified signal peptide precedes the nucleotide located at the 5' end of the first codon of the sequence coding for the protein of interest .
  • the applicant has shown that the replacement of the codon for the cysteine of the signal peptide included in the preproprotein fibrohexamerine of the fiber of the silk thread by a hydrophobic amino acid such as alanine, isoleucine or else leucine, allowed a protein fused with said modified signal peptide to be exported outside the seric glands of Bombyx mori, like the proteins constituting the silk thread.
  • a hydrophobic amino acid such as alanine, isoleucine or else leucine
  • the subject of the invention is a nucleic acid directing the expression of a protein of interest specifically in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori, characterized in that said nucleic acid comprises, from the 5 ′ end towards the 3 'end, (i) a regulatory region comprising signals regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells and (ii) a region coding for a modified signal peptide, placed under the control of said region regulatory, said nucleic acid having at least 90% nucleotide identity with the polynucleotide ranging from nucleotide 1150 to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No.
  • any nucleic acid and any polypeptide according to the invention is in an isolated or purified form.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide found naturally in an organism is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids in which it is naturally inserted into the genome of the organism is isolated.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • the same reasoning also applies to a polypeptide extracted from its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide or a polypeptide is in the purified state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably two or three and preferably four or five orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single strand form or in duplex form.
  • nucleotide designates natural nucleotides (A, T, G, C and U).
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary “bases” are A and T (or A and U), and C and G.
  • a first nucleic acid having at least 90% identity with a second reference nucleic acid will have at least 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98, 3% 98.6%, 99%, 99.6% of amino acid identity with said second reference nucleic acid.
  • the “percentage of identity” between two nucleic acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example “gaps”) with respect to the reference sequence (which i do not include these additions or these deletions) so as to obtain optimal alignment between the two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base is observed for the two sequences compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleic bases by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by a hundred in order to obtain the percentage of nucleotide identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
  • a nucleic acid having at least 90% nucleotide identity with a nucleic acid according to the invention includes the "variants" of a nucleic acid according to the invention.
  • variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs from the reference nucleic acid by one or more substitutions, additions or deletions of a nucleotide, relative to the nucleic acid of reference.
  • a variant of a nucleic acid according to the invention can be of natural origin, such as an allelic variant which exists naturally. Such a variant nucleic acid can also be an unnatural nucleic acid obtained, for example by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are reduced so that the reference nucleic acid and the variant nucleic acid have very similar nucleotide sequences and in many identical regions.
  • the variants of the regulatory nucleic acid according to the invention all comprise 100% of nucleotides identity with the region going from nucleotide 1379 to nucleotide 1390 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the trinucleotide of the variants of the regulatory nucleic acid according to the invention corresponding to the trinucleotide ranging from nucleotide 1486 to nucleotide 1488 of the sequence SEQ ID No. 1 always codes for an amino acid chosen from the group comprising alanine, isoleucine, and leucine.
  • the trinucleotide ranging from nucleotide 1486 to nucleotide 1488 of the sequence SEQ ID No. 1 is chosen from the following trinucleotides: (i) the following trinucleotides coding for the amino acid alanine : GCU, GCT, GCC, GCA and GCG; (ii) the following trinucleotides encoding the amino acid isoleucine: AUU, ATT, AUC, ATC, AUA and ATA; and (iii) the following trinucleotides encoding the amino acid leucine:
  • a variant of a regulatory nucleic acid according to the invention retains the ability to direct the expression of a polynucleotide of interest specifically in the cells of the posterior seric glands of a lepidoptera.
  • a “variant” of a nucleic acid according to the invention including a nucleic acid comprising 90% nucleotide identity with the sequence SEQ ID No. 1, a person skilled in the art can implement the specific expression tests for a reporter or marker gene described in the examples.
  • polynucleotide of interest within the meaning of the invention, is meant a polynucleotide capable of directing the synthesis of a fusion polypeptide between a modified signal peptide and a polypeptide of interest.
  • a nucleic acid according to the invention comprises a sequence with a promoter function, said promoter constituting a regulatory signal making it possible to direct the expression of a polynucleotide of interest, specifically in the cells of the posterior seric gland of a lepidoptera.
  • a nucleic acid with a “promoter” function also designated “promoter” or even “promoter sequence”, consists of a nucleic acid which has the patterns of recognition of RNA polymerase, and more specifically of a “TATA” box and a “CAAT” box, the structure of which is well known to those skilled in the art. It has been shown according to the invention that the nucleic acid of sequence SEQ I D No. 1 comprises the regulatory signals necessary for the expression of a polynucleotide of interest, specifically in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori. Such specificity had not been observed with the regulatory sequences described by Tamura (Tamura et al.
  • nucleic acid comprising, from the 5 ′ to the 3 ′ end, the polynucleotide ranging from nucleotide 1150, to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No. 1, is capable of directing the expression of a polynucleotide of interest specifically in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori.
  • sequence SEQ ID No. 1 comprises, from the 5 ′ to the 3 ′ end, the promoter of the fibrohexamerin gene between nucleotide 1 and nucleotide 1451.
  • This promoter comprises a localized “TATA” box of the nucleotide in position 1420 to the nucleotide in position 1423 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • This promoter sequence also contains a "CAAT” box located from the nucleotide at position 1362 to the nucleotide at position 1365 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • This promoter sequence contains finally a “TATTTATTTAA” sequence located from the nucleotide at position 1379 to the nucleotide at position 1390 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the TATA box constitutes the promoter element proper, which is generally located at a distance of about 30 bases from the site of initiation of transcription.
  • the CAAT box is a cis-acting element which is commonly found in the promoter and activator region ("enhancer").
  • the sequence SEQ ID No. 1 comprises exon 1 of fibrohexamerine between the nucleotide at position 1452 and the nucleotide at position 1525, which codes for the modified signal peptide.
  • the sequence SEQ ID No 1 comprises the intron 1 of fibrohexamerine between the nucleotide at position 1526 and the nucleotide at position 2026.
  • the sequence SEQ ID No 1 comprises a polynucleotide between the nucleotide at position 2027 and the nucleotide at position 2040
  • the latter polynucleotide is not essential to the invention and has only facilitated the construction of the sequence SEQ ID No. 1 which further comprises a polynucleotide coding for a reporter protein "Ds-Red" between the nucleotide at position 2041 and the nucleotide at position 2721.
  • a nucleic acid comprising (i) the regulatory region extending from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 1451 of the sequence SEQ ID No. 1 or any biologically active fragment of this nucleic acid containing the TATA, CAAT boxes and at least one “CTATTTATTTAA” sequence as defined above and (ii) a region coding for a modified signal peptide placed under the control of such a nucleic acid constitutes another object of the present invention.
  • exon 1 of the fibrohexamerine gene as defined above must carry a modification of the trinucleotide in position 1486 to 1488 of the sequence SEQ ID No. 1, so that the addressing of the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest is correct, i.e. so that the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest is secreted with the silk thread.
  • the trinucleotide at position 1486 to 1488 of the sequence SEQ ID No. 1 coding for cysteine must be modified into a trinucleotide coding for an amino acid chosen from the group comprising alanine, isoleucine and leucine.
  • nucleic acid of the invention makes it possible to specifically direct expression of a polynucleotide of interest in the cells of the posterior seric glands of Bombyx mori.
  • the presence of the reporter gene Ds-Red also made it possible to show that the modification of exon 1 of the fibrohexamerin gene makes it possible to obtain correct secretion of the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest.
  • Expression cassettes comprising a polynucleotide of interest coding for a reporter gene, the gene for the protein Ds-Red, which was placed under the control of a regulatory nucleic acid as defined above, were produced. both tissue specific regulatory signals, modified fibrohexamerin exon 1, all fibrohexamerin intron 1, and a promoter-serving nucleic acid. These expression cassettes were used to transform Bombyx mori cells, and more precisely gametic precursors, at the origin of a transgenic animal, after which the expression of the reporter gene was followed in the various tissues of the 'animal.
  • CTATTTATTTAA constitutes an important structural characteristic of the nucleic acid of the invention having a function of sequence of activating transcription (“enhancer”) and regulator of specific tissue expression.
  • the insertion of new “CTATTTATTTAA” motifs upstream of the motif naturally contained in the fibrohexamerin promoter makes it possible to increase the expression rate of the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest, without altering the specificity.
  • SEQ ID No. 1 0 or SEQ ID No. 1 1 can be integrated into the fibrohexamerine promoter, so as to dimerize the motif “CTATTTATTTAA” and thus increase the expression rate of the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest, without altering the specificity.
  • the sequences SEQ ID No. 1 0 and SEQ ID No. 1 1 each comprise a motif "CTATTTATTTAA", already mentioned above, surrounded by its natural nucleotide environment.
  • Other expression activating sequences, homologous or heterologous can be integrated into the fibrohexamerin promoter.
  • the subject of the invention is a nucleic acid directing the expression of a protein of interest specifically in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori, characterized in that said nucleic acid comprises, from the 5 ′ end towards the 3 'end, (i) a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells and (ii) a region coding for a modified signal peptide, placed under the control of said regulatory region, said nucleic acid having at least 90 % identity in nucleotides with the polynucleotide ranging from nucleotide 1150 to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No.
  • trinucleotide ranging from nucleotide 1486 to nucleotide 1488 of the sequence SEQ ID No. 1 codes for an amino acid selected from the group comprising alanine, isoleucine, and leucine.
  • said nucleic acid is characterized in that it comprises, from the 5 ′ end towards the 3 ′ end, (i) a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells and (ii) a region coding for a modified signal peptide, placed under the control of said regulatory region, said nucleic acid comprising, from the 5 end 'at the 3' end, the polynucleotide going from nucleotide 1150 to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No 1 and in which the trinucleotide going from nucleotide 1486 to nucleotide 1488 of the sequence SEQ ID No 1 codes for an acid amino selected from the group consisting of alanine, isoleucine, and leucine.
  • said nucleic acid is characterized in that it comprises, from the 5 ′ end towards the 3 ′ end, (i) a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells and (ii) a region coding for a modified signal peptide, placed under the control of said regulatory region, said nucleic acid comprising, from the 5 'end at the 3 ′ end, the polynucleotide going from nucleotide 1 to nucleotide 2026 of the sequence SEQ ID No.
  • the nucleic acid according to the invention consists of a nucleic acid as described above which has been modified by the introduction of at least one and at most four copies of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2, between nucleotides 1 and 1379 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the present invention also relates to a nucleic acid whose sequence is complementary to the sequence of any of the nucleic acids as defined above.
  • one of the objectives pursued by the present invention is to obtain expression at a high level of a polypeptide in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori encoded by a polynucleotide of interest .
  • the subject of the invention is therefore also a nucleic acid comprising a polynucleotide of interest encoding a polypeptide of interest, fused with the regulatory nucleic acid directing the expression of the polypeptide of interest specifically in the posterior sericogenic cells of Bombyx mori, as defined in the present description.
  • Such a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of interest is also designated “expression cassette” for the purposes of the present description.
  • the invention therefore also relates to an expression cassette comprising a polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid as defined above.
  • an expression cassette according to the invention is characterized in that the polynucleotide of interest that it comprises codes for a polypeptide.
  • the polynucleotide of interest can encode a fusion polypeptide, comprising, from the N-terminal end to the C-terminal end:
  • the polypeptide of interest is chosen from proteins such as spider spidroin (genus Nephila), Galleria fibroin or more generally any other polypeptide which makes it possible to obtain a silk thread whose ductility resistance properties or elasticity, for example are changed.
  • proteins such as spider spidroin (genus Nephila), Galleria fibroin or more generally any other polypeptide which makes it possible to obtain a silk thread whose ductility resistance properties or elasticity, for example are changed.
  • the polynucleotide of interest can also code for a soluble polypeptide of biomedical interest such as, for example, hormones, antigens, enzymes, growth factors, or receptors.
  • polynucleotide of interest can code for human interleukin 2.
  • An expression cassette according to the invention can be surrounded by isolators at one or at each end, aimed at give the polynucleotide of interest, an expression independent of its integration site.
  • isolators By way of example of isolators, mention may be made of the gypsy isolator derived from Drosophila (Gerasimova T. l. And Corces VG: Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 1 998, 92: 51 1 -521), scs / scs' (Kellum R. and Schedl P. 1 991 A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains.
  • the invention relates to recombinant integration vectors comprising a regulatory nucleic acid or an expression cassette as defined above.
  • the invention therefore consists of recombinant vectors into which a regulatory nucleic acid according to the invention has been inserted, comprising regulatory signals allowing the expression of a polynucleotide of interest, specifically in the cells of the posterior sericogenic glands of Bombyx. mori, when this polynucleotide of interest is placed under its control.
  • Part of the invention thus forms recombinant integration vectors comprising: a) a regulatory nucleic acid as defined in the present description; and b) A polynucleotide of interest placed under the control of the regulatory nucleic acid defined in a).
  • the polynucleotide of interest may consist of a polynucleotide encoding a detectable polypeptide or marker polypeptide such as for example a polypeptide coding for the protein Ds-Red.
  • a recombinant integration vector according to the invention corresponding to the above definition is the vector Pig fhx (sp *) DsRed- (3xP3-GFP) deposited on February 20, 2003 at the
  • the invention also relates to recombinant cloning vectors comprising the nucleotide sequence of a recombinant integration vector as described above.
  • vector within the meaning of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in single strand or double strand form.
  • a vector according to the invention can be a cloning vector or an integration vector.
  • a recombinant vector according to the invention is an integrative vector allowing the insertion of copies of the DNA sequence inserted in this vector into the genome of the animal of the species Bombyx mori.
  • the recombinant vector, or in other cases the expression cassette contained in this vector can also contain 3 'untranslated sequences called "terminators".
  • terminators which can be used in the constructions of the invention, mention may be made of the polyadenylation sequence of SV40.
  • the preferred integration vector according to the invention is derived from the piggyBac transposon originating from Trichoplusia ni, existing in the natural state in this species (Cary, LC et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia nor transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology 172, 156-69 (1989))
  • the piggyBac transposon includes DNA fragments that can move from one location in the genome to another through transposition. It includes feet, left and right, composed of two short reverse repeated sequences framing the genes coding for its mobility functions.
  • the integration vector described according to the invention is a modified piggyBac transposon in which the nucleic acid of interest replaces part of the genes coding for the mobility functions of the transposon which have been deleted.
  • the integration vector is used in combination with an assistant vector allowing the expression of the deleted mobility genes in the integration vector.
  • the integration vector associated with the assistant vector allows the integration of the nucleic acid or of the expression casette according to the invention into the genome of the host cell by means of transposition.
  • the integration vector according to the invention can also be derived from the Hobo element of Drosophila or from the Minos transposon of Drosophila.
  • a recombinant cloning vector is used in order to amplify the nucleotide sequence of an integration vector such as described above.
  • the above recombinant integration vector is linearized prior to its insertion into a recipient vector at a site or a cloning polysite of said recipient vector, before ligation.
  • the cloning vectors used are of bacterial or viral origin. These are, for example, plasmids of the PUC, pBR or pSK type, known to those skilled in the art, which will not be described in detail.
  • the regulatory nucleic acids, the expression cassettes or also the recombinant vectors defined in the present description must be introduced. in a host cell.
  • the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • host cell comprising a nucleic acid is meant a cell having integrated into its genome one or more copies of a nucleic acid.
  • the invention further relates to a host cell comprising a regulatory nucleic acid, an expression cassette or also a recombinant vector as defined above.
  • Such a host cell is preferably a cell from an animal belonging to the Bombyx genus, more particularly to the Bombyx mori species, whatever the strain considered.
  • Such a host cell can also be a cell from an animal belonging to another species of lepidoptera such as Philosamia cynthia or more generally, to the genus Bombyx, Antheraea, Galleria, Philosamia, Spodoptera or Drosophila.
  • a host cell according to the invention consists of a cell of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori.
  • Another subject of the invention is the use of a nucleic acid, an expression cassette, a vector or a recombinant host cell as described above for obtaining a transgenic animal. producer of silk belonging to the Bombyx genus.
  • said transgenic animal belongs to the Bombyx mori species and secretes a protein of interest into the silk thread.
  • the invention also relates to a transgenic multicellular organism, comprising a host cell or a plurality of host cells, an expression cassette or also a recombinant vector as defined above.
  • the invention also relates to a non-human transgenic animal, comprising, in a form integrated into its genome, a nucleic acid or an expression cassette as defined in the present description.
  • the invention also relates to the use of a regulatory nucleic acid, an expression cassette, a recombinant vector or also a host cell as defined above for the obtaining a transgenic animal.
  • the invention also relates to a non-human transgenic animal, deficient in the secretion of fibroin L, comprising, in a form integrated into its genome, an expression cassette comprising a polynucleotide of interest coding for a fusion polypeptide, comprising, end
  • N-terminal at the C-terminal end at least the 172 N-terminal amino acids of the polypeptide sequence of fibroin L,
  • Silkworms deficient in fibroin L are known.
  • a person skilled in the art wishing to have an animal deficient in fibroin L can carry out mutagenesis on silkworms, followed by screening for animals deficient in fibroin L.
  • the mutagenesis can consist in mutagenesis conventional using UV or chemical mutagens or in a directed mutagenesis of the fibroin L gene.
  • the screening of animals deficient in fibroin L can be carried out by carrying out a Northern blot or a Western blot on cocoons.
  • RNA interference technique a person skilled in the art wishing to have an animal deficient in fibroin L can also have recourse to the RNA interference technique.
  • fibroin produced by the posterior cells of the serigenic gland is a complex of three different polypeptides: a heavy chain (Fibroin H), a light chain (Fibroin L) and fibrohexamerine.
  • the disulfide bond between Fibroin H and Fibroin L is essential for the secretion of fibroin into the lumen of the gland.
  • the fibroin L produced by the homozygous mutants Nd-s or Nd-sD has a C-terminal region different from that produced by savages and this mutated L fibroin cannot form a disulfide bridge with the fibroin H (due to the elimination by intronic recombination of the exon which contains the cysteine involved in the disulfide bond).
  • This deficiency of secretion does not affect the viability of the animals but is reflected in mutant silkworms by a delay in development of the secretor and a production of a very fine cocoon (less than 0.3% fibroin versus a normal cocoon) composed essentially of sericins.
  • the invention therefore relates to a non-human transgenic animal, deficient in the secretion of fibroin L, comprising, in a form integrated into its genome, an expression cassette comprising a polynucleotide of interest coding for a fusion polypeptide, comprising, N-terminal end to C-terminal end:
  • This particular embodiment of the invention makes it possible to have a transgenic animal in which the quantity of protein of interest produced is controlled thanks to the presence of part of the fibroin L within the fusion polypeptide and to the absence of fibroin L naturally produced by the animal.
  • the transgenic animals according to the invention preferably belong to the species and to the genus which have already been listed above concerning the origin of the animal host cells of the invention.
  • the subject of the invention is also a cocoon comprising a protein of interest whose expression is directed by a nucleic acid, an expression cassette or a vector as described above, and in which said protein of interest is present at a concentration greater than 5 ng per mg of cocoon and preferably greater than 70 ng per mg of cocoon.
  • a cocoon of 141 mg, comprising between 1 and 10 ⁇ g of human interleukin-2 was produced by a transgenic animal according to the invention by following the protocol described in example 7.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a transgenic animal belonging to the Bombyx mori species, characterized in that it comprises the following steps: a) Injection of a nucleic acid, of a cassette expression or a vector as defined above in Bombyx mori eggs between one and five hours after the eggs are laid, before the blastoderm forms; b) Selection of transgenic animals which have integrated into their genome a nucleic acid or an expression cassette as defined in the present description.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a transgenic animal belonging to the Bombyx mori species, characterized in that it also comprises the following steps: c) Crossing between them of two transgenic animals as obtained in step b; d) Selection of animals homozygous for the transgene.
  • the invention also relates to a process for obtaining a silk thread, characterized in that it comprises the following steps: a) breeding a transgenic animal as defined in the present description; b) Recover the silk produced by the transgenic animal.
  • Another subject of the invention is a process for obtaining a protein of interest characterized in that it comprises the following steps: a) breeding a transgenic animal as defined in the present description; b) Recover the silk produced by the transgenic animal; c) Recover the protein of interest within the silk thread.
  • the invention also relates to a nucleic acid directing the expression of an RNA of interest decreasing the synthesis of fibroin H, specifically in the cells of the posterior seric glands of Bombyx mori, characterized in that said nucleic acid comprises a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells, said nucleic acid having at least 90% nucleotide identity with the polynucleotide alant from nucleotide 1150 to nucleotide 1451 of the sequence SEQ ID # 1.
  • nucleic acid meets all of the general definitions which have been given in the first part of the description, and in particular the definition of the percentage of identity between two sequences.
  • fibroin H alone represents 80% of the proteins produced by seric gland and is the majority polypeptide of silk. Due to its structure, it is responsible for the physico-chemical and mechanical properties of the silk thread: rigidity, elasticity, insolubility.
  • RNA interference To stably inhibit (therefore transmissible to the offspring) the gene of fi bro ⁇ ne H in the posterior part of the serigenic gland, an approach by RNA interference (RNAi), was favored.
  • RNAi RNA interference
  • the RNA of interest used can be a siRNA (small interference RNA) type RNA capable of pairing with the messenger RNA of fibroin H to form a double strand RNA or a shRNA type RNA (small hairpin RNA) capable of forming a double-stranded RNA structure without pairing with the messenger RNA of fibroin H.
  • siRNA small interference RNA
  • shRNA type RNA small hairpin RNA
  • the nucleotide sequence coding for the RNA of interest is the sequence SEQ ID No. 12.
  • sequence SEQ ID No. 12 is composed of an inverted and repeated nucleotide sequence, derived from the fibroin H gene, and will be described in more detail in Example 9.
  • the inventors have found that the transformation of Bombyx mori with a nucleic acid as described above makes it possible to significantly reduce the production of H fibroin as can be seen from Example 9 and FIG. 13.
  • This reduction in protein synthesis is based on the principle RNA interference, a post-transcriptional process, triggered by the introduction of double-stranded RNA into a cell, which leads to the inactivation or "invalidation" of a gene in a sequence-specific manner.
  • the use of such a nucleic acid makes it possible to specifically decrease the production of H fibroin, without affecting the production of the other proteins used in the composition of the silk thread.
  • RNA of interest forms a hairpin structure, capable of destabilizing the RNA polymerase and thus of decreasing the synthesis of H fibroin.
  • the nucleic acid according to the invention comprises a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said sericogenic cells, said nucleic acid comprising, from the 5 ′ end to the 'end 3' means the polynucleotide ranging from nucleotide 1150 to nucleotide 1451 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the nucleic acid according to the invention comprises a regulatory region comprising signals for regulating the expression of a polynucleotide of interest specifically in said serigenic cells, said nucleic acid comprising, from the 5 ′ to the 3 ′ end, the polynucleotide ranging from nucleotide 1 to nucleotide 1451 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • Another subject of the invention is a nucleic acid consisting of a nucleic acid as defined above which has been modified by the introduction of at least one and at most four copies of a polynucleotide of sequence SEQ IDN ° 2, between nucleotides 1 and 1379 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to a nucleic acid of sequence complementary to a nucleic acid as described above.
  • the invention also relates to an expression cassette comprising a nucleic acid coding for an RNA of interest, placed under the control of a nucleic acid as defined above.
  • the RNA of interest is encoded by a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 12.
  • An expression cassette according to the invention can be surrounded by isolators at one or at each end, aiming to confer on the polynucleotide of interest, an expression independent of its integration site.
  • isolators By way of example of isolators, mention may be made of the gypsy isolator derived from Drosophila (Gerasimova T. l. And Corces VG: Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 1 998, 92: 51 1 -521), scs / scs' (Kellum R. and Schedl P. 1 991 A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains.
  • Another object of the invention is a recombinant integration vector comprising a nucleic acid or an expression cassette as described above.
  • the invention therefore consists of recombinant vectors into which a regulatory nucleic acid according to the invention has been inserted, comprising regulatory signals allowing the expression of an RNA of interest decreasing the synthesis of fibroin H, specifically in cells. posterior seric glands of Bombyx mori, when this RNA of interest is placed under its control.
  • Part of the invention thus forms recombinant integration vectors comprising: a) a regulatory nucleic acid as defined in above; and b) A nucleic acid coding for an RNA of interest placed under the control of the regulatory nucleic acid defined in a).
  • a recombinant integration vector according to the invention meets the general definitions of vectors which have been described in the section entitled "general characteristics of the recombinant vectors according to the invention".
  • the invention also relates to recombinant cloning vectors comprising the nucleotide sequence of a recombinant integration vector as described above.
  • the regulatory nucleic acids, the expression cassettes or also the recombinant vectors defined above. above must be introduced into a host cell.
  • host cell comprising a nucleic acid is meant a cell having integrated into its genome one or more copies of a nucleic acid.
  • the invention further relates to a host cell comprising a regulatory nucleic acid, an expression cassette or also a recombinant vector as defined above.
  • Such a host cell is preferably a cell from an animal belonging to the Bombyx genus, more particularly to the Bombyx mori species, whatever the strain considered.
  • Such a host cell can also be a cell from an animal belonging to another species of lepidoptera such as
  • Antheraea Galleria, Philosamia, Spodoptera or Drosophila.
  • a host cell according to the invention consists of a cell of the posterior sericogenic glands of Bombyx mori.
  • transgenic animals according to the invention also relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or a vector as described above for obtaining a transgenic animal belonging to the genus Bombyx.
  • said transgenic animal belongs to the Bombyx mori species and secretes a protein of interest into the silk thread.
  • the invention also relates to a non-human transgenic multicellular organism, comprising a host cell or a plurality of host cells, an expression cassette or also a recombinant vector as defined above.
  • the subject of the invention is also a non-human transgenic animal, comprising, in a form integrated into its genome: (i) a nucleic acid, an expression cassette or a vector as defined in the first part of the description, directing expression and secretion of a protein of interest; and (ii) a nucleic acid, an expression cassette or a vector as defined in the second part of the description, directing the synthesis of an RNA of interest decreasing the synthesis of H fibroin.
  • transgenic animal as described above is of significant industrial interest. Indeed, in such an animal, the decrease in the synthesis of fibroin H makes it possible to redirect the cellular resources towards the synthesis of the protein of interest, without however that the secretion of the silk thread is affected.
  • This embodiment of the invention fully meets the need for an industrial tool for producing large quantities of recombinant proteins.
  • the invention also relates to a non-human transgenic animal, (i) deficient in the secretion of fibroin L, (ii) comprising in an integrated form in its genome an expression cassette, directing the expression of a fusion protein between at least 172 N-terminal amino acids of the fibroin L polypeptide sequence and a polypeptide of interest, and
  • nucleic acid a nucleic acid, an expression cassette or a vector as defined in the second part of the description, directing the synthesis of an RNA of interest decreasing the synthesis of fibroin H.
  • This particular embodiment of the invention makes it possible to have a transgenic animal having all the advantages linked to the invention, that is to say, an animal whose quantity of protein of interest produced is controlled , and whose cellular resources are oriented towards the synthesis of a protein of interest.
  • the invention thus provides a directly operational industrial tool, intended for the production of recombinant proteins in large quantities, at low cost.
  • the invention also relates to the use of a regulatory nucleic acid, an expression cassette, a recombinant vector or also a host cell as defined above for the obtaining a non-human transgenic animal.
  • transgenic animals described above preferably belong to the species and to the genus which have already been listed concerning the origin of the animal host cells of the invention.
  • the transgenic animals described above can be obtained according to methods identical to those which have been described in the first part of the description.
  • the sense primers include at their 5 ′ end three nucleotides corresponding to the nucleotides coding for alanine, isoleucine or leucine.
  • the antisense primer is chosen in any way, as long as it hybridizes on the complementary strand, 3 'to the sense primer.
  • transgenic animals can be characterized by the presence of a band when performing a Southern blot, which is not present for wild animals.
  • primers of sequence SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14 to amplify a nucleotide sequence, then detect the presence of a cysteine residue, mutated or not, in the product of this amplification using a probe such as defined above.
  • FIG. 1 illustrates a protocol for constructing a vector according to the invention.
  • FIG. 2 illustrates a protocol for substituting the codon cysteine for an isoleucine codon in the signal peptide of the gene coding for fibrohexamerine
  • FIG. 3 illustrates a protocol for modifying the fibrohexamerin promoter by the addition of three copies of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2.
  • Figure 4 is a schematic representation of the sequence SEQ ID No. 3.
  • FIG. 5 illustrates the tissue-specific accumulation of the Ds-Red protein placed under the control of a nucleic acid according to the invention.
  • FIG. 6 illustrates the detection of the protein Ds-Red, placed under the control of a nucleic acid according to the invention, in the sericogenic glands of silkworms.
  • FIG. 7 illustrates the accumulation, in the silk thread, of the Ds-Red protein placed under the control of a nucleic acid according to the invention.
  • FIG. 8 illustrates the detection of the protein Ds-Red, placed under the control of a nucleic acid according to the invention, in the cocoons of silkworms.
  • FIG. 9 illustrates the presence of the protein Ds-Red on the surface of the wire after observation of the wire by the technique of scanning electron microscopy. The protein is in the form of globular particles of variable size (depending on the number of aggregates) coating the fiber.
  • FIG. 10 illustrates the detection of the protein I L2, placed under the control of a nucleic acid according to the invention in the cocoons of heterozygous transgenic silkworms.
  • Figure 1 1 illustrates the detection of fibroin protein
  • H of Galleria mellonella placed under the control of a nucleic acid according to the invention in the sericogenic glands (A) and the cocoons (B) of heterozygous transgenic silkworms.
  • FIG. 12 illustrates a protocol for constructing a vector comprising a nucleic acid directing the expression of an RNA decreasing the synthesis of H fibroin.
  • FIG. 13 illustrates the decrease in the synthesis of fibroin H from animals transformed with the vector represented in FIG. 12.
  • the animals used belong to the Bombyx mori species, to the Nistari breed from the National Sericultural Unit (25, quai Jean-Jacques Rousseau 69350 La Mulatière, France) It is a multivoltine breed, with development without diapause embryonic.
  • the bacteria used for cloning are the E.coli DH5alpha -TI Max strains. Efficiency available from I NVITROGEN (reference 440097).
  • Animal husbandry conditions The silkworms are reared under controlled conditions in an animal house of type “Animalerie A1” at temperatures varying according to the age of the larvae (between 22 ° C and 25 ° C), and at a humidity of 75%. They are fed on an artificial medium prepared from ground mulberry leaves.
  • the DNA of the plasmid constructs was extracted from the bacteria by the Qiaprep Spin Miniprep kit from the company Qiagen (reference 271 06).
  • the genomic DNA of the silkworms was extracted by phenol-chloroform-isoamyl alcohol.
  • the injection of the integration vector into the animal's eggs is carried out 2 to 5 hours after laying, before the blastoderm forms.
  • a solution comprising the integration vector and the "assistant" vector in equal amounts is prepared in a 0.5 mM phosphate buffer. (pH 7.0) containing 5mM KCI.
  • One to 5 nL of this solution is injected using an Eppendorf microinjector (Transjector 5246).
  • the hole formed by the injection is then covered with glue (Loctite Superglue 3 from Henkel France SA) and the eggs are kept at 25 ° C to continue their development.
  • the selection of animals made transgenic with the vector Pigfhx (sp *) DsRed- (3xP3-GFP) is carried out by means of the early expression of the 3xP3-GFP gene in the eyes of the animal.
  • the Ds-Red protein is visualized in situ (in the cells of the seric gland) and in the cocoon, under a Leica fluorescence magnifier (MZFL2) equipped with an excitation light emission system (558 nm) and a 583 nm emission light filter and a digital camera. Analysis of the fluorescence of the cocoons is carried out dry. The dissected seric glands are observed under a magnifying glass in PBS. The detection of the Ds-Red protein was carried out at different stages of development and, in particular, at the 5th larval stage at the time of the massive synthesis of silk proteins.
  • MZFL2 Leica fluorescence magnifier
  • Blot includes several stages:
  • the outer envelope of the cocoon or blaze is transferred to a microtube to which 150 ⁇ L of H 2 O are added to rinse the blaze.
  • the soluble DsRed protein is recovered by passing the sample to ultrasound for 10 minutes.
  • the samples are prepared before deposition by denaturing the protein extracts in the Laemmli 5X buffer, 5 min. at 100 ° C.
  • the protein extracts are deposited on precast gels (In Vitrogen Novex TrisGlycine, 10 wells, 1.0 mm). Protein migration is carried out at 120 Volts, 40 mA for 2 h 30 min with a migration buffer (In Vitrogen Novex SDS Running buffer (1 0X)).
  • the proteins are transferred to nitrocellulose membranes 9 cm by 6 cm (Hybond ECL Amersham Pharmacia) The size of the whatman paper used is 10 cm about 7.5 cm. Protein transfer is carried out at 120 Volts, 350 mA for 1 h 15 min with transfer buffer (InVitrogen Novex Tris Glycine Transfer Buffer (25X)).
  • nitrocellulose membrane is incubated with Ponceau red (Sigma) for 1 minute to reveal the proteins which have been transferred. If necessary, the strips of the size marker are marked with a pen.
  • the membrane is incubated in PLT (PBS-Tween 0.2% - 2% milk) overnight at 4 ° C.
  • the primary anti-DsRed antibody (Living Color) is diluted
  • DsPeptide Clontech in the PLT at 1/500 th , and incubate for 2 hours at room temperature. The incubation is followed by rinsing twice for 5 minutes in 0.02% PBS-tween.
  • the secondary antibody was diluted (Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) Horseradish Peroxidase Conjugate Biorad) in the PLT th to 1/3000 and incubated 1 hour at room temperature. The incubation is followed by rinsing 4 times 10 minutes in 0.02% PBS-tween.
  • solution A (5 mL of 100 mM Tris, pH 8.5, 22 ⁇ L of coumaric acid and 50 ⁇ l of Luminol to add in the dark) and solution B (5 mL of 100 mM Tris, pH 8.5, 3 ⁇ L of H 2 O 2 ).
  • a mixture of solutions A and B is prepared extemporaneously in the dark, then the membrane is incubated to reveal 1 minute in the mixture of solution A and B. The membrane is exposed on an autoradiographic film for approximately 3 minutes and the film is revealed after exposure.
  • Example 1 Construction of the integration vector comprising an expression cassette comprising a polynucleotide coding for the Ds-Red polypeptide, placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention and, in particular, construction of the cassette d expression comprising part of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the first stage of construction is shown in FIG. 1 A. Two plasmids are required for this first stage.
  • the Ds-Red protein gene is delimited at its ends by the nucleotide sequence of the restriction enzymes Age I and Not I.
  • the second plasmid used comprises, from the 5 ′ end, towards the 3 ′ end: -
  • the plasmid pfhx (sp *) GFP also comprises a nucleotide sequence delimited by the nucleotide sequence of two restriction enzymes, Age I and Not I , placed downstream of the fibrohexamerin gene promoter sequence.
  • Age I and Not I placed downstream of the fibrohexamerin gene promoter sequence.
  • the Age l-Not I fragment originating from the plasmid pDSredl-N1 and comprising the sequence coding for the protein Ds-Red, is cloned in the plasmid pfhx (sp *) GFP, in place of the sequence Age l-Not I.
  • plasmid resulting from this cloning, named pfhx (sp *) DsRed is represented in FIG. 1B, and comprises from the 5 ′ end, towards the 3 ′ end:
  • the modified fibrohexamerin promoter and the Ds-Red gene are included in a fragment delimited by the sequences Bgl II and Nae I.
  • This fragment is cloned in the vector pPigA3cyp6a2- (3xP3- GFP) 2 derived from the piggyBac transposon, the structure of which is shown in FIG. 1B, in place of the Bgl II-Stu I fragment included in the latter, according to a method identical to that described above.
  • the vector pPigA3cyp6a2- (3xP3-GFP) 2 comprises a left foot (L), and a right foot (R) shown in FIG. 1 B.
  • Pigfhx (sp *) DsRed- (3xP3-GFP) meets the definition of a vector according to the invention.
  • Example 2 Method of substitution of the codon cysteine in an isoleucine codon in the gene coding the signal peptide of fibrohexamerine.
  • the method used is shown in Figure 2 and includes several steps. First of all, a fragment of the fibrohexamerin promoter is isolated by digestion with the restriction enzymes Hind III and Pst I.
  • the second step, designated PCR1 in FIG. 2A consists in carrying out a chain amplification by polymerase using the primers of sequence SEQ ID N ° 4 and SEQ ID N ° 5 shown in Figure 2A.
  • the third step, designated PCR2 in FIG. 2A consists in carrying out a polymerase chain reaction using the primers of sequence SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7.
  • the primers of sequence SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 comprise an isoleucine codon, intended to replace the cysteine codon of the natural signal peptide of fibrohexamerine.
  • the amplified nucleic acids are then ligated, and the nucleic acid shown in FIG. 2B is obtained, delimited by the sequences of the restriction enzymes Sac11 and Pst1.
  • This nucleic acid comprises an isoleucine codon, shown in bold in FIG. 1B, replacing the natural codon cysteine.
  • This fragment is then cloned in place of the corresponding natural sequence in the plasmid pfhx (sp *) GFP.
  • a polymerase chain reaction of the fibrohexamerin promoter sequence is carried out. This amplification is carried out using primers A, B, C and D, shown in FIG. 3, of sequence SEQ ID No. 8 for primer B, and of sequence SEQ ID No. 9 for primer C.
  • the nucleic acids obtained are subjected to a ligation, in order to obtain the nucleic acid whose coding strand is represented in FIG. 3.
  • the nucleic acid obtained comprises part of the sequence of the fibrohexamerine promoter modified by the addition of three copies of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2.
  • This nucleic acid is then cloned into the plasmid pfhx (sp *) GFP, in place of the natural sequence of the fibrohexamerine promoter, delimited by the Hind III and Pst I restriction sites.
  • the diagram of the sequence SEQ ID No. 3 is shown in FIG. 4.
  • the sequence SEQ ID No. 3 comprises, from the 5 ′ end to the 3 ′ end:
  • Example 4 Accumulation of the Ds-Red Protein in the Sericigenic Glands of Silkworms Transgenic with the Vector pPigFbx (sp *) DsRed- (3xP3-GFP) Derived from the PiggyBac Transposon Comprising the Sequence ID No. 1 Photographs a, b, c, d, e and f presented in FIG. 5 illustrate the tissue-specific expression of the Ds-Red protein in a silkworm rendered transgenic with the vector derived from the piggyBac transposon comprising the sequence SEQ ID No. 3. Photographs a, b and c were taken in daylight at three magnifications.
  • the test for detecting the presence of the protein Ds-Red was carried out according to the protocol described above.
  • the photographs d, e and f are shots corresponding to the photographs a, b and c but taken in the fluorescence spectrum of the protein Ds-Red.
  • FIG. 6 This Western Blot produced under the conditions described above, makes it possible to detect the presence of the protein Ds-Red in the sericogenic glands of silkworms.
  • An SDS-PAGE gel (14%; Tris-glycine; 0.1% SDS) was transferred to a nitrocellulose filter and stained with Coomassie blue.
  • the nitrocellulose filter is presented in FIG. 6A.
  • This same filter was then incubated with a primary polyclonal antibody against the Ds-Red protein, then with a secondary anti-rabbit goat antibody conjugated to horseradish peroxidase. The result is shown in Figure 6B. Bands detected by chemiluminescence are observed, corresponding to the presence of the protein Ds-Red.
  • FIGS. 6A and 6B Four protein deposits from the seric glands of a silkworm are visible on the filter presented in FIGS. 6A and 6B.
  • the proteins were extracted from the seric glands according to the protocol described above.
  • the four deposits are:
  • Lane 1 proteins from the median seric glands of a non-transgenic silkworm.
  • Lane 2 proteins from the median seric glands of a transgenic silkworm, heterozygous for the transgene contained in the sequence SEQ ID N ° 1.
  • Lane 3 proteins from the posterior seric glands of a non-transgenic silkworm.
  • Lane 4 proteins from the posterior seric glands of a transgenic silkworm, heterozygous for the transgene contained in the sequence SEQ ID No. 1.
  • the filter shown in FIG. 6A has bands of comparable intensity, from one track to another. This allows to conclude that equivalent amounts of proteins were deposited on the SDS-PAGE gel.
  • the filter presented also includes a size marker visible on the left side of the filter.
  • the same filter, subjected to antibody treatment, as described above is shown in Figure 6B. It is observed that the protein Ds-Red is present in large quantities in the posterior seric glands. The protein Ds-Red is also present in the median seric glands, but to a lesser extent. The inventors believe that this presence is due to the migration of the Ds-Red protein secreted by the posterior sericogenic cells into the median sericogenic glands, and not to a synthesis of the Ds-Red protein by the median sericogenic glands.
  • Example 5 Accumulation of the Ds-Red Protein in Silk in Silk Worms Made Transgenic with the Pigfhx (sp * ) DsRed- (3xP3-GFP) Vector Derived from the PiggyBac Transposon Comprising the Sequence IDN No. 1 The test for the presence of the protein Ds-
  • the silk threads exhibit a fluorescence corresponding to the presence of the protein Ds-Red. It can be deduced therefrom that the nucleic acids according to the invention make it possible to direct the secretion of a polypeptide of interest in the silk of a lepidoptera.
  • FIG. 8 This Western Blot, carried out under the conditions described above makes it possible to detect the presence of the protein Ds-Red, in the cocoons of silkworms.
  • a SDS-PAGE gel (14%; Tris-glycine; 0.1% SDS) was transferred to a nitrocellulose filter and stained with Ponceau red.
  • the nitrocellulose filter is presented in FIG. 8A.
  • This same filter was then incubated with a primary polyclonal antibody against the Ds-Red protein, then with a secondary anti-rabbit goat antibody conjugated to horseradish peroxidase. The result is shown in Figure 6B. Bands detected by chemiluminescence are observed, corresponding to the presence of the protein Ds-Red.
  • FIGS. 8A and 8B Nine protein deposits from silkworm cocoons are visible on the filter presented in FIGS. 8A and 8B.
  • the proteins were extracted according to the protocol described above. These are: - Tracks C1 and C2: proteins from a non-transgenic silkworm cocoon.
  • - Tracks T1 and T2 proteins from a transgenic silkworm cocoon, heterozygous for the transgene described in the sequence SEQ I D N ° 1.
  • the last three deposits correspond to proteins from rinsing the blaze of the cocoon of a silkworm with water.
  • the filter shown in FIG. 8A makes it possible to observe that the quantities of proteins initially deposited on the SDS-PAGE gel are equivalent.
  • the same filter, subjected to the processing described above is represented in FIG. 8B. It is observed that the protein Ds-Red is present in large quantity in the fraction resulting from the rinsing of the blaze of the transgenic silkworm cocoon. It can be deduced therefrom that the nucleic acids according to the invention make it possible to direct the secretion of a polypeptide of interest in the silk of a lepidoptera.
  • Example 6 Accumulation of the Ds-Red protein on the surface of the silk thread of worms rendered transgenic with the construction described in Example 1.
  • FIG. 9 illustrates the presence of the Ds-Red protein on the surface of the wire after observation by the scanning electron microscopy technique.
  • the protein is in the form of globular particles of variable size
  • IL-2 human interleukin 2
  • the gene coding for IL-2 was substituted for the gene coding for the protein DS-red within the integration vector described in example 1.
  • FIG. 10 illustrates the detection of the protein I L2, placed under the control of a nucleic acid according to the invention in the cocoons of heterozygous transgenic silkworms.
  • the detection is carried out by the Western blot technique using a double antibody: a polyclonal anti-human IL2 antibody and an anti-goat rabbit antibody coupled to peroxidase (company Biorad, reference 170-6515).
  • the test for detection of exogenous proteins by Western blot comprises steps of electrophoresis, transfer and staining of proteins, revelation of the membranes, identical to those described in the material and method part as regards the protein Ds-Red.
  • LiSCN 10M (250 ⁇ l) then, after dilution in 4/5 of 10 mM Tris buffer - 2% SDS - beta -mercaptoethanol 5%, is incubated overnight at T amb. and 30 min at 37 ° C.
  • the samples containing the protein extracts are denatured in Laemmli buffer 5x, 5 min; at 100 ° C.
  • the Western blot represented in FIG. 10 makes it possible to detect the presence of the IL2 protein regardless of the type of sample considered:
  • lane S deposit of 10 ng of a standard human IL2 solution:
  • FIG. 1 1 illustrates the detection of fibroin protein
  • the detection is carried out by the Western blot technique using a double antibody: a polyclonal anti-FibHGm antibody and a goat anti-rabbit antibody coupled to peroxidase (Biorad company, reference 170-651 5).
  • the test for detection of exogenous proteins by Western blot comprises steps of electrophoresis, transfer and staining of proteins, revelation of the membranes, identical to those described in the material and method part as regards the protein Ds-Red.
  • the pair of seric glands (secretor separated from the reservoir) taken from transgenic animals at the fifth larval stage is transferred to a microtube, crushed and incubated in 500 ⁇ l of LiSCN 1 0M 20 min. at T amb. then 1 hour at 60 ° C.
  • the sample is then diluted in 4/5 of 10 mM Tris buffer 2% SDS - 5% beta-mercaptoethanol.
  • the samples containing the protein extracts are denatured in Laemmli buffer 5x, 5 min; at 1,00 ° C. The following steps are identical to those described for the Ds-Red.
  • the Western blot represented in FIG. 11 makes it possible to detect the presence of the FibHGm protein (size 115 KDa) in the serigenic gland (reservoir and secretor) and the cocoon of the transgenic individual while this protein is absent in the control samples.
  • - lane 1 proteins resulting from the extraction of the secretory part of the seric gland from a transgenic animal.
  • proteins from the extraction of the reservoir part of the seric gland from a transgenic animal proteins from the extraction of the reservoir part of the seric gland from a transgenic animal.
  • - track 1 * proteins from the extraction of the secretory part of the seric gland from a control animal.
  • - track 2 * proteins from the extraction of the reservoir part of the seric gland from a control animal.
  • Example 9 Protocol for constructing a vector comprising a nucleic acid directing the expression of an RNA decreasing the synthesis of H fibroin.
  • a piggyBac transgenesis vector as described in Example 1, comprising two fragments of the gene of interest placed in the reverse direction- repeated has been achieved.
  • the sense-antisense sequences derived from the fibroin H gene are spaced apart by a neutral stabilizing sequence, and under the control of the fibrohexamerine promoter (FIG. 1 2).
  • This vector allows the production of double-stranded RNAs consisting of a single chain which folds back to form a secondary structure called a “hairpin” which targets a motif of 465 bp of repeated sequences located in exon 2 of the gene.
  • fibroin -H (Fig. 12). These sequences are made up of alternating repeating and amorphous domains.
  • the size of the Fibroin H gene is 17 kbp.
  • the coding sequences consist of two exons, one of 67 bp and the other of 15,750 bp. This gene is characterized by extremely repeated sequences in exon 2. Each repeated region consists of sub-domains of 208 bp organized in repeated patterns Ua and Ub. The position of the 465 bp fragment used to ciber the mRNA is represented by arrows. The repeating sequences of the mRNA produced after transcription are shown in gray. (Zhou et al., 2000 Fine organization of Bombyx mori fibroin heavy chain gene. Nucleic Acids Res 28, 241 3-2419).
  • RNAi mechanism produces a measurable effect, which varies according to the transgenic lines on the secretion of H fibroin.
  • the cocoons spun by transgenic silkworms contain up to 20% less fibroin H compared to control cocoons.

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Abstract

L'invention concerne un acide nucléique dirigeant l'expression d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori. L'invention concerne également une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus. L'invention est également relative à un vecteur recombinant d'intégration comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression tels que définis ci-dessus, ainsi qu'à une cellule hôte, modifiée par l'intégration de cet acide nucléique ou de cette cassette d'expression dans son génome.

Description

Acide nucléique dirigeant l'expression d'un polypeptide d'intérêt dans les glandes séricigènes postérieures d'un lépidoptère, et ses applications
L'invention se rapporte au domaine de la synthèse et de la sécrétion de protéines d'intérêt industriel, telles que des protéines fibreuses à usage textile, en particulier de nouvelles soies ou des protéines à destination biomédicale. Elle est relative à l'expression ciblée de polynucléotides et/ou de polypeptides d'intérêt spécifiquement dans certains tissus d'un animal et plus précisément dans la glande séricigène de Bombyx mori. Selon l'invention, on utilise la glande séricigène du ver à soie comme "bioréacteur" capable de produire des protéines en grande quantité et de les exporter dans le cocon de soie d'où el les peuvent être purifiées.
Etat de la technique :
II existe des méthodes de production de protéines fibreuses à usage textile comme la méthode de production de protéines de fil de soie d'araignée par les glandes mammaires de chèvres transgéniques (Nexia Biotechnologies Inc. 1000 St-Charles Avenue, Bloc B, Vaudreuil-Dorion, QC, J7V 8P5, Canada). Cependant, ces méthodes ne permettent pas d'organiser la protéine fibreuse sous forme de fil. En ce qui concerne la production de protéines solubles à destination biomédicale, les méthodes connues mettent en œuvre des cultures bactériennes, des cultures de lignées cellulaires ou des organismes vertébrés comme les vaches, chèvres ou encore lapines transgéniques. Ce type de production de protéines recombinantes est très coûteux. D'autre part, lorsque les protéines recombinantes sont synthétisées à partir de systèmes vertébrés, leur utilisation industrielle, notamment leur utilisation alimentaire ou médicale, implique obligatoirement de vérifier au préalable que ces protéines ou les compositions qui les contiennent, sont exemptes de contaminants pathogènes transmissibles à l'homme. Etant donné le rôle important, au niveau économique, de la production de protéines recombinantes, il existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux moyens de production de protéines recombinantes, en grande quantité, à faible coût, et à partir d'un organisme suffisamment éloigné de l'espèce humaine pour éviter les problèmes de contamination, surtout lorsque la protéine produite a un intérêt biomédical. Il existe aussi un besoin pour de nouveaux moyens de production de protéines recombinantes lesquelles permettent d'organiser la protéine sous forme de fil lorsque ladite protéine recombinante est fibreuse.
Pour que la production puisse être importante, la protéine doit être synthétisée de manière spécifique d'un tissu, et exportée à l'extérieur de l'animal, de préférence un invertébré.
Cependant, à la connaissance du demandeur, aucun organisme invertébré n'est susceptible de répondre aux exigences précédemment formulées. La transgénèse de Bombyx mori par exemple est connue (Tamura et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon derived vector. Nature Biotechnology Vol 18, 2000), mais l 'utilisation de cette méthode n'a pas encore permis de conduire à la production de protéines recombinantes en grande quantité. Le demandeur s'est donc attaché à la mise au point d'un système d'expression permettant notamment de supprimer les problèmes d'innocuité et de coût élevé des systèmes précédemment connus.
Sommaire de l'invention : Un tel système d'expression de protéines recombinantes est désormais fourni selon l'invention.
L'invention concerne un acide nucléique dirigeant l'expression d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régu lation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d 'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N° 1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine. L'invention est également relative à une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, le polynucléotide d'intérêt étant un polynucléotide sens, codant pour un polypeptide. L'invention est également relative à un vecteur recombinant d'intégration comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression tels que définis ci -dessus, ainsi qu'à une cellule hôte, modifiée par l'intégration de cet acide nucléique ou de cette cassette d'expression dans son génome.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression , d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte recombinante tels que définis ci-dessus pour l'obtention d'un animal transgénique non humain . L'invention a aussi trait à des procédés d'obtention d'un animal transgénique non humain modifié par intégration dans son génome d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression, d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte recombinante tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne également un acide nucléique dirigeant l'expression d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H, spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, ledit acide nucléique comprenant une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 1451 de la séquence SEQ ID N° 1 .
Un acide nucléique tel que mentionné ci-dessus, sera décrit plus en détail dans la partie intitulée « acides nucléiques supplémentaires selon l'invention ».
Description détaillée de l'invention :
On a montré, selon l'invention, qu'un acide nucléique qui comprend à la fois (i) une région régulatrice comprenant au moins une copie du motif nucléotidique cible du facteur de transcription du type SGF1 « forkhead », un site promoteur de la transcription approprié et (ii) une région codant un peptide signal modifié, ladite région étant placée sous le contrôle de ladite région régulatrice, est capable de diriger la synthèse d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules séricigènes postérieures du lépidoptère Bombyx mori, lorsque la séquence nucléotidique codant ladite protéine d'intérêt est fusionnée « en phase » avec la séquence nucléotidiqu.e codant ledit peptide signal modifié.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique codant la protéine d'intérêt est fusionnée « en phase » avec la séquence nucléotidique codant ledit peptide signal modifié lorsque le nucléotide localisé à l'extrémité 3' du dernier codon de la séquence codant le peptide signal modifié précède le nucléotide localisé à l'extrémité 5' du premier codon de la séquence codant la protéine d'intérêt.
De manière surprenante, le demandeur a montré que le remplacement du codon pour la cystéine du peptide signal inclus dans la pré-pro-protéine fibrohexamérine de la fibre du fil de soie par un acide aminé hydrophobe comme l'alanine, l'isoleucine ou encore la leucine, permettait à une protéine fusionnée avec ledit peptide signal modifié d'être exportée en dehors des glandes séricigènes de Bombyx mori, comme les protéines constitutives du fil de soie.
L'invention a pour objet un acide nucléique dirigeant l'expression d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 1 50 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine. De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans un organisme n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'organisme est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Le même raisonnement vaut aussi pour un polypeptide extrait de son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence deux ou trois et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels (A, T, G, C et U). Aux fins de la présente invention , un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les « bases », complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 90 % , de préférence au moins 91 %, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 97,5%, 98%, 98 ,3% 98,6% , 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second acide nucléique de référence.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qu i ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pource ntage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».
Un acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotide avec un acide nucléique selon l'invention englobe les « variants » d'un acide nucléique selon l'invention.
Par « variant » d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucleotidiques très similaires et dans de nombreuses régions identiques.
Les variants de l'acide nucléique régulateur selon l'invention comprennent tous 100 % d'identité en nucléotides avec la région allant du nucléotide 1379 jusqu'au nucléotide 1390 de la séquence SEQ ID N° 1 . Par ailleurs, le trinucléotide des variants de l'acide nucléique régulateur selon l'invention correspondant au trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N° 1 code toujours pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine, et la leucine.
Ainsi, dans l'acide nucléique régulateur selon l'invention, le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 est choisi parmi les trinucléotides suivants : (i) les trinucléotides suivants codant pour l'acide aminé alanine : GCU, GCT, GCC, GCA et GCG ; (ii) les trinucléotides suivants codant pour l'acide aminé isoleucine : AUU, ATT, AUC, ATC, AUA et ATA ; et (iii) les trinucléotides suivants codant pour l'acide aminé leucine :
CUU, CTT, CUC, CTC, CUA, CTA, CUG, et CTG.
Un variant d'un acide nucléique régulateur selon l'invention conserve la capacité à diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures d'un lépidoptère. Pour vérifier le caractère fonctionnel d'un « variant » d'un acide nucléique selon l'invention, y compris d'un acide nucléique comprenant 90% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N°1 , l'homme du métier peut mettre en œuvre les tests d'expression spécifique d'un gène rapporteur ou marqueur décrits dans les exemples.
Par « polynucléotide d'intérêt » au sens de l'invention, on entend un polynucléotide capable de diriger la synthèse d'un polypeptide fusion entre un peptide signal modifié et un polypeptide d'intérêt.
Un acide nucléique selon l'invention comprend une séquence à fonction de promoteur, ledit promoteur constituant un signal de régulation permettant de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans les cellules de la glande séricigène postérieure d'un lépidoptère.
Aux fins de la présente description, un acide nucléique à fonction de « promoteur » aussi désigné « promoteur » ou encore « séquence promotrice », consiste en un acide nucléique qui possède les motifs de reconnaissance de l'ARN polymérase, et plus spécifiquement d'une boite « TATA » et d'une boite « CAAT », dont la structure est bien connue de l'homme du métier. II a été montré selon l'invention que l'acide nucléique de séquence SEQ I D N°1 comprend les signaux de régulation nécessaires à l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori. Une telle spécificité n'avait pas été observée avec les séquences régulatrices décrites par Tamura (Tamura et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon derived vector. Nature Biotechnology Vol 1 8, 2000) dont l'expression n'était pas limitée aux cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori. Il a aussi été montré selon l'invention que l'acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 150, au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N° 1 , est capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori.
La séquence SEQ ID N° 1 comprend, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le promoteur du gène de la fibrohexamérine entre le nucléotide 1 et le nucléotide 1451. Ce promoteur comprend une boite « TATA » localisée du nucléotide en position 1420 jusqu'au nucléotide en position 1423 de la séquence SEQ ID N°1. Cette séquence promotrice contient également une boite « CAAT » localisée du nucléotide en position 1362 jusqu'au nucléotide en position 1365 de la séquence SEQ ID N°1 . Cette séquence promotrice contient enfin une séquence « TATTTATTTAA » localisée du nucléotide en position 1379 jusqu'au nucléotide en position 1390 de la séquence SEQ ID N°1. La boite TATA constitue l'élément promoteur proprement dit, qui est localisé en général à une distance d'environ 30 bases du site d'initiation de la transcription. La boite CAAT est un élément agissant en cis qui est retrouvé communément dans la région promotrice et activatrice (« enhancer »).
La séquence SEQ ID N°1 comprend l'exon 1 de la fibrohexamérine entre le nucléotide en position 1452 et le nucléotide en position 1525, qui code le peptide signal modifié. La séquence SEQ ID N° 1 comprend l'intron 1 de la fibrohexamérine entre le nucléotide en position 1526 et le nucléotide en position 2026. La séquence SEQ ID N°1 comprend un polynucléotide entre le nucléotide en position 2027 et le nucléotide en position 2040. Ce dernier polynucléotide n'est pas essentiel à l'invention et a seulement facilité la construction de la séquence SEQ ID N°1 qui comprend en outre un polynucléotide codant pour une protéine rapporteur « Ds-Red » entre le nucléotide en position 2041 et le nucléotide en position 2721.
Un acide nucléique comprenant (i) la région régulatrice allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1451 de la séquence SEQ ID N°1 ou tout fragment biologiquement actif de cet acide nucléique contenant les boites TATA, CAAT et au moins une séquence « CTATTTATTTAA » telles que définies ci-dessus et (ii) une région codant un peptide signal modifié placé sous le contrôle d'un tel acide nucléique constitue un autre objet de la présente invention.
Il a été montré selon l'invention que l'exon 1 du gène de la fibrohexamérine tel que défini ci-dessus doit porter une modification du trinucléotide en position 1486 à 1488 de la séquence SEQ ID N°1 , pour que l'adressage du polypeptide codé par le polynucléotide d'intérêt soit correct, c'est à dire pour que le polypeptide codé par le polynucléotide d'intérêt soit sécrété avec le fil de soie. Le trinucléotide en position 1486 à 1488 de la séquence SEQ ID N° 1 codant pour la cystéine doit être modifié en un trinucléotide codant un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine. Grâce à la réalisation de constructions d'ADN comprenant la totalité ou des parties plus restreintes de la séquence SEQ ID N°1 , il a été montré selon l'invention que l'acide nucléique de l'invention permet de diriger spécifiquement l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori. La présence du gène rapporteur Ds-Red a également permis de montrer que la modification de l'exon 1 du gène de la fibrohexamérine permet d'obtenir une sécrétion correcte du polypeptide codé par le polynucléotide d'intérêt.
Il a été réalisé des cassettes d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt codant pour un gène rapporteur, le gène de la protéine Ds-Red, qui a été placé sous contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini ci dessus, comprenant à la fois les signaux de régulation spécifiques de tissu, l'exon 1 de la fibrohexamérine modifié, l'intégralité de l'intron 1 de la fibrohexamérine et un acide nucléique à fonction de promoteur. Ces cassettes d'expression ont été utilisées pour transformer des cellules de Bombyx mori, et plus précisément des précurseurs gamétiques, à l'origine d'un animal transgénique, après quoi l'expression du gène rapporteur a été suivie dans les différents tissus de l'animal. Les résultats montrent que les signaux de régulation nécessaires à l'activité de transcription tissu spécifique et à une forte expression dans les cellules de la glande séricigène postérieure de Bombyx mori sont compris notamment dans la région allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 . Plus précisément, Il a été montré selon l'invention que cette région contenait un motif : « CTATTTATTTAA » (séquence SEQ ID N°2) localisée du nucléotide en position 1379 jusqu'au nucléotide en position 1390 de la séquence SEQ ID N°1. Ce motif constitue un site de liaison à des facteurs de transcription du type SGF1 forkhead (Julien, E., Bordeaux, M.C., Garel, A. & Couble, P. (2002). Fork head alternative binding drives stage spécifie expression in the silk gland of Bombyx mori. Insect Biochem Molecul. Biol. 32, 377- 387.)
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que le motif «CTATTTATTTAA » constitue une caractéristique structurelle importante de l'acide nucléique de l'invention ayant une fonction de séquence activatrice de la transcription (« enhancer ») et de régulateur d'expression spécifique de tissu.
Selon l'invention, l'insertion de nouveaux motifs « CTATTTATTTAA » en amont du motif naturellement contenu dans le promoteur de la fibrohexamérine permet d'augmenter le taux d'expression du polypeptide codé par le polynucléotide d'intérêt, sans altérer la spécificité.
L'introduction d'ADN véhiculé par le vecteur d'intégration piggyBac dans le génome de Bombyx mori, obtenue après microinjection dans les œufs de l'animal, a également permis de montrer de façon surprenante que la modification de l'exon 1 du gène de la fibrohexamérine permet d'obtenir un adressage de la protéine d'intérêt compatible avec une sécrétion de celle-ci dans le fil de soie. En d'autres termes, lorsqu'un polynucléotide d'intérêt est fusionné en phase à l'extrémité 3' de l'exon 1 du gène de la fibrohexamérine, la modification de l'exon 1 de ce gène, qui code le peptide signal modifié permet de conserver la sécrétion de la protéine d'intérêt identique à celle de la fibrohexamérine. Selon l'invention, un motif de séquence SEQ ID N° 1 0 ou SEQ ID N° 1 1 peut être intégré dans le promoteur de la fibrohexamérine, de sorte à dimériser le motif «CTATTTATTTAA » et augmenter ainsi le taux d'expression du polypeptide codé par le polynucléotide d'intérêt, sans altérer la spécificité. Les séquences SEQ ID N° 1 0 et SEQ ID N° 1 1 comprennent chacune un motif «CTATTTATTTAA » , déjà évoqué ci-dessus, entouré de son environnement nucléotidique naturel. D'autres séquences activatrices d'expression, homologues ou hétérologues, peuvent être intégrées dans le promoteur de la fibrohexamérine. On peut citer à titre d'exemple, les séquences correspondant au système Gal4/UAS de levure, connu de l'homme du métier, et qui ne sera pas décrit en détail . On peut également citer, les séquences correspondant à l'amplificateur du gène d'actine cytoplasmique du ver à soie (Mange A. Julien E. Prudhomme JC. And Couble P. A strong inhibitory élément down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3 cytoplasmic actin gène of Bombyx mori. J Mol Biol. 1997 Jan 24;265(3):266-74. Fatyol K. , Illes K. and Szalay A. A. An alternative intronic promoter of the Bombyx A3 cytoplasmic actin gène exhibits a high level of transcriptional activity in mammalian cells; Mol Gen Genêt. 1 999 Mar. 261 (2): 337-45). On peut enfin citer les séquences correspondant au système amplificateur du baculovirus IE 1 /Hr5 ou Hr3 (Lu M. , Farrell P.J. , Johnson R. and latrou K. J Biol Chem. 1 997 Dec 5; 272 (49): 30724-8).
Acides nucléiq ues régulateurs selon l'invention
L'invention a pour objet un acide nucléique dirigeant l'expression d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite rég ion régulatrice, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine, et la leucine.
Selon un premier mode de réalisation, particulier à l'acide nucléique ci-dessus, ledit acide nucléique est caractérisé en ce qu'il comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N° 1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine, et la leucine.
Selon un second mode de réalisation particulier de l'acide nucléique ci-dessus, ledit acide nucléique est caractérisé en ce qu'il comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii ) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N° 1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N° 1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine, et la leucine. Selon un troisième mode de réalisation particulier, l'acide nucléique selon l'invention consiste en un acide nucléique tel que décrit ci-dessus qui a été modifié par l'introduction d'au moins une et d'au plus quatre copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2, entre les nucléotides 1 et 1379 de la séquence SEQ ID N° 1 .
Pour introduire une copie d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2, on peut insérer, entre les nucléotides 1 et 1 379, et notamment entre les nucléotides 1378 et 1379, de la séquence SEQ ID N° 1 , une séquence SEQ ID N° 10 ou SEQ ID N° 1 1 .
La présente invention est également relative à un acide nucléique dont la séquence est complémentaire à la séquence de l'un quelconque des acides nucléiques tels que définis ci-dessus. Comme cela a déjà été précisé, l'un des objectifs poursuivis par la présente invention est l'obtention d'une expression à un taux important d'un polypeptide dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori codé par un polynucléotide d'intérêt. L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt codant un polypeptide d'intérêt, fusionné avec l'acide nucléique régulateur dirigeant l'expression du polypeptide d'intérêt spécifiquement dans les cellules séricigènes postérieures de Bombyx mori, tel que défini dans la présente description. Un tel acide nucléique comprenant un polynucléotide codant un polypeptide d'intérêt est aussi désigné « cassette d'expression » aux fins de la présente description.
L'invention a donc encore pour objet une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini précédemment.
Cassettes d'expression selon l'invention :
Selon un premier mode de réalisation, une cassette d'expression selon l'invention est caractéri sée en ce que le polynucléotide d'intérêt qu'elle comprend code pour un polypeptide. Alternativement, le polynucléotide d'intérêt peut coder un polypeptide fusion, comprenant, de l'extrémité N -terminale à l'extrémité C-terminale :
- au moins les 172 acides aminés N-terminaux de la séquence polypeptidique de la fibroïne L, (Tanaka K. , Kajiyama N . , Ishikura K. , Waga S. , Kikuchi A, Ohtomo K. ,
Takagi T. and Mizuno S. Détermination of the site of disulfide linkage between heavy and light chains of silk fibroin produced by Bombyx mori. Biochimica et Biophysica Acta 1432 (1999) 92-1 03), et - un polypeptide d'intérêt.
Préférentiellement, le polypeptide d'intérêt est choisi parmi les protéines comme la spidroïne d'araignée (genre Nephila), la fibroïne de Galleria ou plus généralement tout autre polypeptide qui permet d'obtenir un fil de soie dont les propriétés de résistance de ductilité ou d'élasticité, par exemple sont modifiées.
Le polynucléotide d'intérêt peut également coder pour un polypeptide soluble d'intérêt biomédical comme par exemple les hormones, les antigènes, les enzymes, Tes facteurs de croissance, ou encore les récepteurs.
En particulier, le polynucléotide d'intérêt peut coder pour l'interleukine 2 humaine.
Une cassette d'expression selon l'invention peut être entourée d'isolateurs à une ou à chaque extrémité, visant à conférer au polynucléotide d'intérêt, une expression indépendante de son site d'intégration. A titre d'exemple d'isolateurs, on peut citer l'isolateur gypsy issu de la drosophile (Gerasimova T. l . and Corces V.G. : Polycomb and trithorax group proteins médiate the function of a chromatin insulator. Cell 1 998, 92: 51 1 -521 ), scs/scs'(Kellum R. and Schedl P. 1 991 A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941 -950) ou encore l'isolateur 5ΗS4 du gène de beta globine du poulet (Chung J . H. , Bell A. c. and Felsenfeld G. (1997) Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc. Nat. Acad . Sci. USA 94: 575-580).
Vecteurs recombinants selon l'invention :
L'invention concerne des vecteurs recombinants d'intégration comprenant un acide nucléique régulateur ou une cassette d'expression tels que définis ci-dessus. L'invention consiste donc en des vecteurs recombinants dans lesquels a été inséré un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt, spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, lorsque ce polynucléotide d'intérêt est placé sous son contrôle.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants d'intégration comprenant : a) Un acide nucléique régulateur tel que défini dans la présente description ; et b) Un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
Le polynucléotide d'intérêt peut consister en un polynucléotide codant pour un polypeptide détectable ou polypeptide marqueur tel que par exemple un polypeptide codant pour la protéine Ds-Red.
U n vecteur recombinant d'intégration selon l'invention répondant à la définition ci-dessus est le vecteur Pig fhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) déposé le 20 février 2003 à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l' Institut Pasteur sous le numéro d'enregistrement CN CM
1-2975.
L'invention concerne également des vecteurs recombinants de clonage comprenant la séquence nucléotidique d'un vecteur recombinant d'intégration tel que décrit ci-dessus.
Pour l'obtention de l'une quelconque des séquences régulatrices selon l'i nvention, il est possible d'utiliser les techniques et amorces décrites dans les exemples. L'homme du métier peut également utiliser le vecteur Pig fhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) déposé le 20 février 2003 à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous le numéro d'enregistrement CNCM I-2975.
Caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention :
Par « vecteur » au sens de la présente invention, on entend une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin. Un vecteur selon l'invention peut être un vecteur de clonage ou un vecteur d'intégration. Selon un mode de réalisation préféré, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de copies de la séquence d'ADN insérée dans ce vecteur dans le génome de l'animal de l'espèce Bombyx mori. De manière avantageuse, le vecteur recombinant, ou dans d'autres cas la cassette d'expression contenue dans ce vecteur peut aussi contenir des séquences 3' non traduites dites « terminateurs » . Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer la séquence de polyadénylation de SV40.
Le vecteur d'intégration préféré selon l'invention est dérivé du transposon piggyBac issu de Trichoplusia ni, existant à l'état naturel dans cette espèce (Cary, L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology 172, 156-69 (1989))
Le transposon piggyBac comprend des fragments d'ADN susceptibles de se déplacer d'un endroit du génome dans un autre par le biais de la transposition. Il comprend des pieds, gauche et droit, composés de deux courtes séquences répétées inverses encadrant les gènes codant pour ses fonctions de mobilité.
Le vecteur d'intégration décrit selon l'invention est un transposon piggyBac modifié dans lequel l'acide nucléique d'intérêt remplace une partie des gènes codant pour les fonctions de mobilité du transposon qui ont été supprimées.
Le vecteur d'intégration est utilisé en combinaison avec un vecteur assistant permettant l'expression des gènes de mobilité supprimés dans le vecteur d'intégration.
Le vecteur d'intégration associé au vecteur assistant permet l'intégration de l'acide nucléique ou de la casette d'expression selon l'invention dans le génome de la cellule hôte par le biais de la transposition. Le vecteur d'intégration selon l'invention peut également être dérivé de l'élément Hobo de la drosophile ou du transposon minos de la drosophile.
Selon un autre mode de réalisation, un vecteur recombinant de clonage est utilisé afin d'amplifier la séquence nucléotidique d'un vecteur d'intégration tel que décrit ci-dessus. Selon cet autre mode de réalisation, le vecteur recombinant d'intégration ci-dessus est linéarisé préalablement à son insertion dans un vecteur receveur au niveau d'un site ou d'un polysite de clonage dudit vecteur receveur, avant ligation. Les vecteu rs de clonage utilisés sont d'origine bactérienne ou virale. Il s'agit par exemple des plasmides du type PUC, pBR ou pSK, connus de l'homme du métier, qui ne seront pas décrits en détail.
Cellules hôtes recombinantes selon l'invention :
Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, les acides nucléiques régulateurs, les cassettes d'expression ou encore les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Par « cellule hôte comprenant un acide nucléique » on entend, une cellule ayant intégré dans son génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte comprenant un acide nucléique régulateur, une cassette d'expression ou encore un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.
Une telle cellule hôte est de préférence une cellule d'un animal appartenant au genre Bombyx plus particulièrement à l'espèce Bombyx mori, quelle que soit la souche considérée. Une telle cellule hôte peut également être une cellule d'un animal appartenant à une autre espèce de lépidoptère comme Philosamia cynthia ou plus généralement, au genre Bombyx, Antheraea, Galleria, Philosamia, Spodoptera ou Drosophila.
De manière tout à fait préférée, une cellule hôte selon l'invention consiste en une cellule des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori. Animaux transgéniques selon l'invention :
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule hôte recombinante tels que décrits ci-dessus pour l'obtention d'un animal transgénique producteur de soie appartenant au genre Bombyx.
De manière préférée, ledit animal transgénique appartient à l'espèce Bombyx mori et sécrète une protéine d'intérêt dans le fil de soie. L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire transgénique, comprenant une cellule hôte ou une pluralité de cellules hôtes, une cassette d'expression ou encore un vecteur recombinant tel que définis ci-dessus. L'invention a encore pour objet un animal transgénique non humain, comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique ou une cassette d'expression tels que définis dans la présente description.
De manière générale, l'invention est aussi relative à l'utilisation d'un acide nucléique régulateur, d'une cassette d'expression, d'un vecteur recombinant ou encore d'une cellule hôte tels que définis ci-dessus pour l'obtention d'un animal transgénique.
L'invention concerne également un animal transgénique non humain, déficient pour la sécrétion de fibroïne L, comprenant sous une forme intégrée dans son génome, une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide fusion, comprenant, de l'extrémité
N-terminale à l'extrémité C-terminale : - au moins les 172 acides aminés N-terminaux de la séquence polypeptidique de la fibroïne L,
- et
- un polypeptide d'intérêt.
Des vers à soie déficients en fibroïne L sont connus. On peut citer à titre d'exemple les mutants Nd-s ou Nd-sD (Kazuyuki Mori, Kazunori Tanaka, Yoshimi Kikuchi, Miho Waga, Shou Waga and Shigeki Mizuno : production of a chimeric fibroin light-chain polypeptide in a fibroin secretion- deficient naked pupa mutant of the silkworm Bombyx mori. J. Mol. Biol. (1995) 251 , 217-228.)
Néanmoins, l'homme du métier peut avoir recours à des techniques classiques de génie génétique pour disposer d'un animal déficient en fibroïne L.
A titre d'exemple, l'homme du métier souhaitant disposer d'un animal déficient en fibroïne L peut réaliser une mutagénèse sur des vers à soie, suivie d'un criblage des animaux déficients en fibroïne L. La mutagénèse peut consister en une mutagénèse classique en utilisant les UV ou des mutagènes chimiques ou encore en une mutagénèse dirigée du gène de la fibroïne L.
Le criblage des animaux déficients en fibroïne L peut s'effectuer en réalisant un Northern blot ou un Western blot sur des cocons.
Alternativement, l'homme du métier souhaitant disposer d'un animal déficient en fibroïne L peut également avoir recours à la technique d'interférence ARN.
D'une manière générale, la fibroïne produite par les cellules postérieures de la glande séricigène (sécréteur) est un complexe de trois polypeptides différents : une chaîne lourde (Fibroïne H), une chaîne légère (Fibroïne L) et la fibrohexamérine. La liaison par un pont disulfure de la Fibroïne H et de la Fibroïne L est essentielle à la sécrétion de la fibroïne dans la lumière de la glande. La fibroïne L produite par les mutants homozygotes Nd-s ou Nd-sD possède une région C-terminale différente de celle produite par des sauvages et cette fibroïne L mutée ne peut former de pont disulfure avec la fibroïne H (du fait de l'élimination par recombinaison intronique de l'exon qui contient la cystéine impliquée dans la liaison disulfure). Cette déficience de la sécrétion n'altère pas la viabilité des animaux mais se traduit chez les vers à soie mutants par un retard de développement du sécréteur et une prod uction d'un cocon très fin (moins de 0.3% de fibroine versus un cocon normal) composé essentiellement de séricines. Un croisement d'un mutant Nd-s avec un animal sauvage permet, par complémentation d'un allèle muté par un allèle sauvage pour la fibroïne L, l'obtention d'un hybride hétérozygote possédant un sécréteur régénéré et capable de filer un cocon normal. (Tamura T ; Quan X. , Imamura M. , Inoue S. , Kanda T and Kuwabara N.Transgenic silkworms as a tool for analysis of gène function. First International Workshop on Lepidoptera Genomics : 30 septembre au 3 octobre 2002 ; Inoue et al. , Eur J Biochem. 2004 Jan;271 (2):356-66). L'invention concerne donc un animal transgénique non humain, déficient pour la sécrétion de fibroïne L, comprenant sous une forme intégrée dans son génome, une cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide fusion, comprenant, de l'extrémité N- terminale à l'extrémité C-terminale :
- au moins les 1 72 acides aminés N -terminaux de la séquence polypeptidique de la fibroïne L, et
- un polypeptide d'intérêt.
Ce mode de réalisation particul ier de l'invention permet de disposer d'un animal transgénique dans lequel la quantité de protéine d'intérêt produite est maîtrisée grâce à la présence d'une partie de la fibroïne L au sein du polypeptide fusion et à l'absence de fibroïne L naturellement p roduite par l'animal. Les animaux transgéniques selon l'invention appartiennent préférentiellement aux espèces et au genre qui ont déjà été listés ci -dessus concernant l'origine des cellules hôtes animales de l'invention.
L'invention a également pour objet un cocon comprenant une protéine d'intérêt dont l'expression est dirigée par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que décrits ci -dessus, et dans lequel ladite protéine d'intérêt est présente à une concentration supérieure à 5 ng par mg de cocon et de préférence supérieure à 70 ng par mg de cocon.
Un cocon de 141 mg, comprenant entre 1 et 10 μg d'interleukine-2 humaine a été produit par un animal transgénique selon l'invention en suivant le protocole décrit dans l'exemple 7.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'un animal transgénique appartenant à l'espèce Bombyx mori caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Injection d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur tels que définis ci-dessus dans des œufs de Bombyx mori entre une et cinq heures après la ponte des œufs, avant la formation du blastoderme ; b) Sélection des animaux transgéniques ayant intégré dans leur génome un acide nucléique ou une cassette d'expression tels qu e définis dans la présente description. L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'un animal transgénique appartenant à l'espèce Bombyx mori caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : c) Croisement entre eux de deux animaux transgéniques tels qu'obtenus à l'étape b ; d) Sélection des animaux homozygotes pour le transgène.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'un fil de soie caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Elever un animal transgénique tel que défini dans la présente description ; b) Récupérer la soie produite par l'animal transgénique.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une protéine d'intérêt caractérisé en ce qu 'il comprend les étapes suivantes : a) Elever un animal transgénique tel que défini dans la présente description ; b) Récupérer la soie produite par l'animal transgénique ; c) Récupérer la protéine d'intérêt au sein du fil de soie.
acides nucléigues supplémentaires selon l'invention
L'invention concerne également un acide nucléique dirigeant l'expression d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H, spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide al lant du nucléotide 1 150 au nucléotide 1451 de la séquence SEQ ID N°1.
Un tel acide nucléique répond à l'ensemble des définitions générales qui ont été données dans la première partie de la description, et en particulier à la définition du pourcentage d'identité entre deux séquences.
Le succès de la production d'une protéine exogène par les cellules des glandes séricigènes est lié, entre autres, au niveau de protéosynthèse que cette protéine mobilisera pour sa synthèse.
Une manière d'optimiser le taux d'e>pression de la protéine étrangère peut consister à diminuer l'expression d'une des protéines de la soie. Parmi celles-ci la fibroïne H représente à elle seule 80% des protéines produites par la glande séricigène et est le polypeptide majoritaire de la soie . De par sa structure, elle est responsable des propriétés physico-chimiques et mécaniques du fil de soie : rigidité, élasticité, insolubilité. L'élimination- de cette protéine et son remplacement par une protéine d'intérêt comme la spidroine, la fibroïne H de Galleria ou d'autres protéines d'intérêt déjà évoquées, permet notamment la modification des propriétés du fil de soie et ainsi la création de nouveaux biomatériaux. Pour inhiber de façon stable (donc transmissible à la descendance) le gène de la fi broïne H dans la partie postérieure de la glande séricigène, une approche par RNA interférence (RNAi), a été privilégiée. Ce phénomène apparemment universel puisque mis en évidence aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes consiste en une inhibition spécifique et efficace de l'expression d'un gène par dégradation de son ARNm en réponse à des ARNs double-brins exogènes.
L'ARN d'intérêt utilisé peut être un ARN de type siRNA (small interférence RNA) capable de s'apparier à l'ARN messager de la fibroïne H pour former un ARN double brin ou un ARN de type shRNA (small hairpin RNA) capable de former une structure ARN double brin sans s'apparier à l'ARN messager de la fibroïne H . De préférence la séquence nucléotidique codant l'ARN d'intérêt est la séquence SEQ ID N° 12.
La séquence SEQ ID N° 12, est composée d'une séquence nucléotidique inversée et répétée, dérivée du gène de la fibroïne H , et sera décrite plus en détail dans l'exemple 9.
Les inventeurs ont constaté que la transformation de Bombyx mori avec un acide nucléique tel que décrit ci -dessus permet de diminuer significativement la production de fibroïne H comme cela ressort de l'exemple 9 et de la figure 13. Cette diminution de la synthèse protéique est fondée sur le principe de l'interférence ARN, un processus post-transcriptionnel, déclenché par l'introduction d'ARN double-brin dans une cellule, qui mène à l'inactivation ou "invalidation" d'un gène d'une manière séquence-spécifique. Le recours à un tel acide nucléique permet de diminuer spécifiquement la production de fibroïne H, sans que la production des autres protéines entrant dans la composition du fil de soie n'en soit affectée.
Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs pensent que l'ARN d'intérêt, forme une structure en épingle à cheveux, capable de déstabiliser l'ARN polymérase et de diminuer ainsi la synthèse de fibroïne H.
La diminution du taux de fibroïne H synthétisé par Bombyx mori revêt un intérêt appréciable dans le cadre de la présente invention. Le recours aux acides nucléiques décrits immédiatement ci-dessus, en combinaison avec ceux dirigeant l'expression d'un polypeptide d'intérêt, permet de disposer d'animaux dans lesquels les ressources cellulaires sont redirigées vers la production de la protéine d'intérêt. Ce mode de réalisation de l'invention répond pleinement au besoin de disposer d'un outil industriel de production de protéines recombinantes en grande quantité.
Des animaux transgéniques comprenant plusieurs types d'acides nucléiques tel qu'évoqué ci-dessus, seront décrits plus en détail dans la suite de la description.
De préférence, l'acide nucléique selon l'invention comprend une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 1451 de la séquence SEQ ID N°1.
Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention comprend une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 au nucléotide 1451 de la séquence SEQ ID N° 1 . Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un acide nucléique tel que défini ci -dessus qui a été modifié par l'introduction d'au moins une et d'au plus quatre copies d'un polynucléotide de séquence SEQ I D N°2, entre les nucléotides 1 et 1 379 de la séquence SEQ ID N ° 1 . L'invention concerne également un acide nucléique de séquence complémentaire à un acide nucléique tel que décrit ci-dessus.
Cassettes d'expression supplémentaires selon l'invention :
L'invention concerne également une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un ARN d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Préférentiellement, l'ARN d 'intérêt est codé par un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 12.
Une cassette d'expression selon l'invention peut être entourée d'isolateurs à une ou à chaque extrémité, visant à conférer au polynucléotide d'intérêt, une expression indépendante de son site d'intégration. A titre d'exemple d'isolateurs, on peut citer l'isolateur gypsy issu de la drosophile (Gerasimova T. l. and Corces V.G. : Polycomb and trithorax group proteins médiate the function of a chromatin insulator. Cell 1 998, 92: 51 1 -521 ), scs/scs'(Kellum R. and Schedl P. 1 991 A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941 -950) ou encore l'isolateur 5ΗS4 du gène de beta globine du poulet (Chung J . H. , Bell A. c. and Felsenfeld G. ( 1 997) Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc. Nat. Acad . Sci . USA 94: 575-580).
vecteurs supplémentaires selon l'invention :
Un autre objet de l'invention est un vecteur recombinant d'intégration comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression tel que décrits ci-dessus.
L'invention consiste donc en des vecteurs recombinants dans lesquels a été inséré un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant des signaux de régulation permettant l'expression d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H, spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, lorsque cet ARN d'intérêt est placé sous son contrôle.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants d'intégration comprenant : a) Un acide nucl éique régulateur tel que défini dans ci - dessus ; et b) Un acide nucléique codant pour un ARN d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
Un vecteur recombinant d'intégration selon l'invention répond aux définitions générales des vecteurs qui ont été décrites dans la partie intitulée « caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention ».
L'invention concerne également des vecteurs recombinants de clonage comprenant la séquence nucléotidique d'un vecteur recombinant d'intégration tel que décrit ci-dessus.
Pour l'obtention de l'une quelconque des séquences régulatrices selon l'invention, il est possible d'utiliser les techniques et amorces décrites dans les exemples. L'homme du métier remplaçant seulement la séquence d'acide nucléique dirigeant la synthèse de la protéine DS-red , par une séquence dirigeant la synthèse d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H.
Cellules hôtes recombinantes supplémentaires selon l'invention
Pour permettre l'expression d'un ARN diminuant la synthèse de fibroïne H placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que décrit ci-dessus, les acides nucléiques régulateurs, les cassettes d'expression ou encore les vecteurs recombinants définis ci-dessus doivent être introduits dans une cellule hôte.
L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Par « cellule hôte comprenant un acide nucléique » on entend, une cellule ayant intégré dans son génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte comprenant un acide nucléique régulateur, une cassette d'expression ou encore un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.
Une telle cellule hôte est de préférence une cellule d'un animal appartenant au genre Bombyx plus particulièrement à l'espèce Bombyx mori, quelle que soit la souche considérée. Une telle cellule hôte peut également être une cellule d'un animal appartenant à une autre espèce de lépidoptère comme
Philosamia cynthia ou plus généralement, au genre Bombyx,
Antheraea, Galleria, Philosamia, Spodoptera ou Drosophila.
De manière tout à fait préférée, une cellule hôte selon l'invention consiste en une cellule des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori.
Animaux transgéniques supplémentaires selon l'invention L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur tels que décrits ci-dessus pour l'obtention d'un animal transgénique appartenant au genre Bombyx. De manière préférée, ledit animal transgénique appartient à l'espèce Bombyx mori et sécrète une protéine d'intérêt dans le fil de soie.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire transgénique non humain, comprenant une cellule hôte ou une pluralité de cellules hôtes, une cassette d'expression ou encore un vecteur recombinant tel que définis ci-dessus.
L'invention a encore pour objet un animal transgénique non humain, comprenant, sous une forme intégrée dans son génome : (i) un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que définis dans la première partie de la description, dirigeant l'expression et la sécrétion d'une protéine d'intérêt ; et (ii) un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que définis dans la seconde partie de la description, dirigeant la synthèse d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H.
La disposition d'un animal transgénique tel que décrit ci-dessus revêt un intérêt industriel important. En effet, dans un tel animal, la diminution de la synthèse de la fibroïne H permet de rediriger les ressources cellulaires vers la synthèse de la protéine d'intérêt, sans pour autant que la sécrétion du fil de soie ne soit affectée. Ce mode de réalisation de l'invention répond pleinement au besoin de disposer d'un outil industriel de production de protéines recombinantes en grande quantité.
L'invention concerne également un animal transgénique non humain, (i) déficient pour la sécrétion de fibroïne L, (ii) comprenant sous une forme intégrée dans son génome une cassette d'expression, dirigeant l'expression d'une protéine de fusion entre au moins les 172 acides aminés N-terminaux de la séquence polypeptidique de la fibroïne L et un polypeptide d'intérêt, et
(iii) un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que définis dans la seconde partie de la description, dirigeant la synthèse d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H.
Ce mode de réalisation particulier de l'invention permet de disposer d'un animal transgénique possédant l'ensemble des avantages liés à l'invention, c'est-à-dire, un animal dont la quantité de protéine d'intérêt produite est contrôlée, et dont les ressources cellulaires sont orientées en direction de la synthèse d'une protéine d'intérêt. L'invention permet ainsi de disposer d'un outil industriel directement opérationnel, destiné à la production de protéines recombinantes en grande quantité, à moindre coût.
De manière générale, l'invention est aussi relative à l'utilisation d'un acide nucléique régulateur, d'une cassette d'expression, d'un vecteur recombinant ou encore d'une cellule hôte tels que définis ci-dessus pour l'obtention d'un animal transgénique non humain.
Les animaux transgéniques décrits ci-dessus appartiennent préférentiellement aux espèces et au genre qui ont déjà été listés concernant l'origine des cellules hôtes animales de l'invention. Les animaux transgéniques décrits ci-dessus peuvent être obtenus selon des procédés identiques à ceux qui ont été décrits dans la première partie de la description.
De manière à pouvoir aisément discriminer des animaux comprenant au moins un acide nucléique tel que décrit dans la présente demande, les inventeurs ont également mis au point un groupe d'amorce décrit ci-après.
Les amorces sens, comprennent à leur extrémité 5' trois nucléotides correspondant aux nucléotides codant pour l'alanine, l'isoleucine ou la leucine.
L'amorce antisens est choisie de manière quelconque, dès lors qu'elle s'hybride sur le brin complémentaire, en 3' de l'amorce sens.
Le recours à ces amorces au cours d'une amplification en chaîne par polymérase (PCR), réalisée dans des conditions de forte stringence permet d'amplifier seulement les séquences d'AD N comprenant une mutation de l'acide aminé cystéine en alanine, isoleucine ou leucine.
Ainsi, les animaux transgéniques peuvent être caractérisés par la présence d'une bande lors de la réalisation d'un Southern blot, qui n'est pas présente pour les animaux sauvages.
On peut également avoir recours aux amorces de séquence SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14 pour amplifier une séquence nucléotidique, puis détecter la présence d'un résidu cystéine muté ou non dans le produit de cette amplification en utilisant une sonde telle que définie ci- dessus.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants, dans lesquels :
La figure 1 illustre un protocole de construction d'un vecteur selon l'invention.
La figure 2 ill ustre un protocole substitution du codon cystéine en un codon isoleucine dans le peptide signal du gène codant la fibrohexamérine
La figure 3 illustre un protocole de modification du promoteur de la fibrohexamérine par l'adjonction de trois copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2. La figure 4 est une représentation schématique de la séquence SEQ ID N°3.
La figure 5 illustre l'accumulation, spécifique de tissu, de la protéine Ds-Red placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention.
La figure 6 illustre la détection de la protéine Ds-Red, placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention , dans les glandes séricigènes de vers à soie.
La figure 7 illustre l'accumulation, dans le fil de soie, de la protéine Ds-Red placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention.
La figure 8 illustre la détection de la protéine Ds-Red , placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention, dans les cocons de vers à soie. La figure 9 illustre la présence de la protéine Ds-Red à la surface du fil après observation du fil par la technique de microscopie électronique à balayage. La protéine se présente sous forme de particules globulaires de taille variable (dépendante du nombre d'agrégats) enrobant la fibre. La figure 10 illustre la détection de la protéine I L2, placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention dans les cocons de vers à soie transgéniques hétérozygotes.
La figure 1 1 illustre la détection de la protéine fibroïne
H de Galleria mellonella, placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention dans les glandes séricigènes (A) et les cocons (B) de vers à soie transgéniques hétérozygotes.
La figure 12 illustre un protocole de construction d'un vecteur comprenant un acide nucléique dirigeant l 'expression d'un ARN diminuant la synthèse de fibroine H . La figure 13 illustre la diminution dé la synthèse de fibroïne H des animaux transformés avec le vecteur représenté figure 12.
EXEMPLES : Matériel et méthodes généraux utilisés dans les exemples.
A) Matériel :
Les animaux utilisés appartiennent à l'espèce Bombyx mori, à la race Nistari provenant de l'Unité Nationale Séricicole (25, quai Jean-Jacques Rousseau 69350 La Mulatière, France) Il s'agit d'une race multivoltine, à développement sans diapause embryonnaire. Les bactéries utilisées pour les clonages sont les souches E.coli DH5alpha -TI Max. Efficiency disponibles auprès de la société I NVITROGEN (référence 440097).
B) Méthodes
• Conditions d'élevage des animaux : Les vers à soie sont élevés dans des conditions contrôlées dans une animalerie de type « Animalerie A1 » à des températures variables selon l'âge des larves (entre 22°C et 25°C), et à une hygrométrie de 75%. Ils sont nourris sur milieu artificiel préparé à base de broyats de feuilles d e mûrier.
• Extraction des acides nucléiques :
L'ADN des constructions plasmidiques a été extrait des bactéries par le kit Qiaprep Spin Miniprep de la société Qiagen (référence 271 06). L'ADN génomique des vers à soie a été extrait par phénol-chloroforme-alcool isoamylique.
• Production d'animaux transgéniques
L'injection du vecteur d'intégration dans les œufs de l'animal est effectuée 2 à 5 heures après la ponte, avant la formation du blastoderme. Une solution comprenant le vecteur d'intégration et le vecteur "assistant" en quantités égales est préparée dans un tampon phosphate à 0,5 mM (pH 7,0) contenant 5mM KCI. Un à 5 nL de cette solution sont injectés à l'aide d'un microinjecteur Eppendorf (Transjector 5246). Le trou formé par l'injection est ensuite recouvert par de la glu (Loctite Superglue 3 de Henkel France S.A.) et les oeufs sont maintenus à 25°C pour poursuivre leur développement.
• Sélection des animaux trangéniques :
La sélection des animaux rendus transgéniques avec le vecteur Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) est effectuée grâce à l'expression précoce du gène 3xP3-GFP dans les yeux de l'animal.
• Test de détection de la présence de la protéine Ds-Red dans l'animal transgénique :
La protéine Ds-Red est visualisée in situ (dans les cellules de la glande séricigène) et dans le cocon, sous une loupe Leica à fluorescence (MZFL2) équipée d'un système d'émission de lumière d'excitation (558 nm) et d'un filtre de lumière d'émission à 583 nm et d'un appareil de prise de vue numérique. L'analyse de la fluorescence des cocons est réalisée à sec. Les glandes séricigènes disséquées sont observées sous la loupe dans du PBS. La détection de la protéine Ds-Red a été effectuée à différents stades du développement et, en particulier, au 5ème stade larvaire au moment de la synthèse massive des protéines de la soie.
Sur les extraits protéiques provenant de glandes séricigènes bu de cocons de soie", là détection est effectuée par Western Blot en utilisant un double anticorps : un anticorps anti-Ds-Red de Lapin (Société Clonetech , référence 8370-1 ) et un anticorps anti-Lapin de Chèvre couplé à la peroxydase (Société Biorad, référence 1 70-6515 ). • Test de détection de la protéine DS-red par Western Blot réalisé avec des échantillons de glandes séricigènes, de cocon et de blaze de ver à soie :
Le test de détection de la protéine DS-red par Western
Blot comprend plusieurs étapes :
- Extraction des échantillons protéiques :
On prend un tiers du cocon ou la paire de glandes séricigènes (sécréteur séparé du réservoir) que l'on transfère dans un microtube. On fragmente ensuite le cocon en petits morceaux ou on broie la glande dans 1 mL de LiSCN 10M puis on incube les extraits protéiques au moins 1 heure à température ambiante en agitant périodiquement à l'aide d'un vortex. On dilue enfin les échantillons protéiques dans 4/5 de tampon tris 10 mM- SDS 2%- β-mercaptoéthanol 5%.
On transfert l'enveloppe extérieure du cocon ou blaze dans un microtube auquel on ajoute 150 μL d'H2O pour rincer la blaze. On récupère la protéine DsRed soluble par passage de l'échantillon aux ultrasons pendant 10 minutes.
On prépare les échantillons avant dépôt en dénaturant les extraits protéiques dans le tampon Laemmli 5X, 5 min. à 100°C.
- Electrophorèse :
On dépose les extraits protéiques sur des gels précoulés (In Vitrogen Novex TrisGlycine , 10 puits, 1 .0 mm). On effectue la migration des protéines à 120Volts, 40 mA pendant 2h30 avec un tampon de migration (In Vitrogen Novex SDS Running buffer (1 0X)).
- Transfert des protéines :
On transfert les protéines sur des membranes de nitrocellulose de 9 cm sur 6 cm (Hybond ECL Amersham Pharmacia) La taille du papier whatman utilisé est de 1 0 cm sur 7.5 cm. Le transfert des protéines est effectué à 120 Volts, 350 mA pendant 1 h15 avec un tampon de transfert (InVitrogen Novex Tris Glycine Transfert Buffer (25X)).
- Coloration des protéines au Rouge Ponceau :
On Incube la membrane de nitrocellulose avec du rouge Ponceau {Sigma) pendant 1 minute pour faire apparaître les protéines qui ont été transférées. Si nécessaire, on marque au stylo les bandes du marqueur de taille.
- Blocage de la membrane :
On Incube la membrane dans du PLT ( PBS- Tween 0.2%- lait 2%) sur la nuit à 4°C.
- Incubation avec le premier anticorps : On dilue l'anticorps primaire anti-DsRed (Living Color
DsPeptide Clontech) dans le PLT au 1 /500ème, et on incube 2 heures à température ambiante. L'incubation est suivie d'un rinçage de deux fois 5 minutes dans du PBS- tween 0.02%.
- Incubation avec le deuxième anticorps :
On dilue l'anticorps secondaire (Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish Peroxidase Conjugate Biorad) dans le PLT au 1/3000eme, et on incube 1 heure à température ambiante. L'incubation est suivie d'un rinçage de 4 fois 10 minutes dans du PBS- tween 0.02%.
- Révélation des membranes :
On utilise une solution A (5 mL de Tris 100 mM, pH 8.5, 22 μL d'acide coumarique et 50 μl de Luminol à rajouter à l'obscurité) et une solution B (5 mL de Tris 100 mM, pH 8.5, 3 μL de H2O2). On prépare extemporanément un mélange des solutions A et B à l 'obscurité, puis on incube la membrane à révéler 1 minute dans le mélange de solution A et B. On expose la membrane sur un film autoradiographique pendant 3 minutes environ et on révèle le film après exposition. Exemple 1 : Construction du vecteur d'intégration comprenant une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide Ds-Red, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention et, en particulier, construction de la cassette d'expression comprenant une partie de la séquence SEQ ID N° 1 .
La première étape de la construction est représentée sur la figure 1 A. Deux plasmides sont nécessaires à cette première étape.
Il s'agit du plasmide pDsRed 1 -N 1 commercialisé par la société Clonetech (référence 6921 -1 ), comprenant, de l'extrémité 5', vers l'extrémité 3' :
- Le promoteur CMV I E, - Le gène Ds-Red,
- Le signal de polyadénylation SV40,
- Le gène de résistance à la kanamycine,
- L'origine de réplication du plasmide pUC.
Le gène de la protéine Ds-Red est délimité à ses extrémités par la séquence nucléotidique des enzymes de restriction Age I et Not I.
Le second plasmide utilisé, nommé pfhx(sp*)GFP, comprend , de l'extrémité 5', vers l'extrémité 3' : - Le promoteur de la fibrohexamérine modifié
- Le gène codant pour la green fluorescent protein (GFP)
- Le signal de polyadénylation SV40
- Le gène de résistance à la kanamycine
- L'origine de réplication du plasmide pUC Comme cela est représenté sur la figure 1 A, le plasmide pfhx(sp*)GFP, comprend également une séquence nucléotidique délimitée par la séq uence nucléotidique de deux enzymes de restriction, Age I et Not I , placée en aval de la séquence du promoteur du gène de la fibrohexamérine. Le fragment Age l-Not I, provenant du plasmide pDSredl - N1 et comprenant la séquence codant pour la protéine Ds- Red est clone dans le plasmide pfhx(sp*)GFP, à la place de la séquence Age l-Not I. Le plasmide résultant de ce clonage, nommé pfhx(sp*)DsRed est représenté sur la figure 1 B, et comprend de l'extrémité 5', vers l'extrémité 3' :
- Le promoteur de la fibrohexamérine modifié,
- Le gène Ds-Red, - Le signal de polyadénylation SV40,
- Le gène de résistance à la kanamycine,
- L'origine de réplication du plasmide pUC.
Comme cela est représenté sur la figure 1 B, le promoteur de la fibrohexamérine modifié, et le gène Ds-Red sont compris dans un fragment délimité par les séquences Bgl II et Nae I. Ce fragment est clone dans le vecteur pPigA3cyp6a2- (3xP3-GFP)2 dérivé du transposon piggyBac dont la structure est représentée sur la figure 1 B, à la place du fragment Bgl II- Stu I compris dans ce dernier, selon une méthode identique à celle décrite ci-dessus. Le vecteur pPigA3cyp6a2- (3xP3-GFP)2 comprend un pied gauche (L), et un pied droit (R) représentés figure 1 B.
Le vecteur obtenu à l'issue de ce deuxième clonage, représenté figure 1 C, nommé Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) répond à la définition d'un vecteur selon l'invention.
Exemple 2 : Méthode de substitution du codon cystéine en un codon isoleucine dans le gène codant le peptide signal de la fibrohexamérine. La méthode utilisée est représentée sur la figure 2 et comprend plusieurs étapes. Tout d'abord, un fragment du promoteur de la fibrohexamérine est isolé par digestion par les enzymes de restriction Hind III et Pst I. La deuxième étape, désignée PCR1 sur la figure 2A, consiste à réaliser une amplification en chaîne par polymérase en utilisant les amorces de séquence SEQ ID N°4 et SEQ ID N°5 représentées sur la figure 2A. La troisième étape désignée PCR2 sur la figure 2A, consiste à réaliser une amplification en chaîne par polymérase en utilisant les amorces de séquence SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7. Les amorces de séquence SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 comprennent un codon isoleucine, destiné à remplacer le codon cystéine du peptide signal naturel de la fibrohexamérine. Les acides nucléiques amplifiés sont ensuite ligaturés, et on obtient l'acide nucléique représenté sur la figure 2B, délimité par les séquences des enzymes de restriction Sacl l et Pstl. Cet acide nucléique comprend un codon isoleucine, représenté en gras sur la figure 1 B, remplaçant le codon naturel cystéine. Ce fragment est ensuite clone à la place de la séquence naturelle correspondante dans le plasmide pfhx(sp*)GFP.
Exemple 3 : Protocole de modification du promoteur de la fibrohexamérine par l'adjonction de trois copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2, permettant la fixation du facteur de transcription SGF-1/forkhead, entre les nucléotides 1 et 1379 de la séquence SEQ ID N°1. Ce protocole est illustré sur la figure 3.
Dans une première étape, une amplification en chaîne par polymérase de la séquence du promoteur de la fibrohexamérine est effectuée. Cette amplification est réalisée en utilisant des amorces A, B, C et D, représentées sur la figure 3, de séquence SEQ ID N°8 pour l'amorce B, et de séquence SEQ ID N°9 pour l'amorce C.
Dans une deuxième étape, les acides nucléiques obtenus sont soumis à une ligature, afin d'obtenir l'acide nucléique dont le brin codant est représenté sur la figure 3. L'acide nucléique obtenu comprend une partie de la séquence du promoteur de la fibrohexamérine modifié par l'adjonction de trois copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2. Cet acide nucléique est ensuite clone dans le plasmide pfhx(sp*)GFP, à la place de la séquence naturelle du promoteur de la fibrohexamérine, délimitée par les sites de restriction Hind III et Pst I.
Le schéma de la séquence SEQ ID N°3 est représenté sur la figure 4. La séquence SEQ ID N°3 comprend, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' :
• Le promoteur (1 ) du gène de la fibrohexamérine.
• Trois séquences (2) de fixation de l'élément SGF1 /Forkhead (3), en plus de la séquence naturelle. • L'exon 1 (4) de la fibrohexamérine, dont le codon cystéine est modifié.
• L'intron 1 (5) de la fibrohexamérine.
• Un polynucléotide (6) ayant facilité la construction de la séquence SEQ ID N° 1 • Un polynucléotide (7) codant pour la protéine rapporteur « Ds-Red ».
Exemple 4 : A ccumulation de la protéine Ds-Red dans les glandes séricigènes de vers à soie rendus transgéniques avec le vecteur pPigFbx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) dérivé du transposon piggyBac comprenant la séquence SEQ ID N°1. Les photographies a, b, c, d, e et f présentées figure 5 illustrent l'expression spécifique de tissu de la protéine Ds- Red dans un ver à soie rendu transgénique avec le vecteur dérivé du transposon piggyBac comprenant la séquence SEQ ID N°3. Les photographies a, b et c ont été effectuées en lumière du jour selon trois grossissements. Le test de détection de la présence de la protéine Ds-Red a été effectué selon le protocole décrit ci-dessus. Les photographies d, e et f sont des prises de vues correspondant aux photographies a, b et c mais effectuées dans le spectre de fluorescence de la protéine Ds-Red.
Ces photographies permettent de constater que la fluorescence de la protéine Ds-Red, et donc son expression est limitée aux cellules séricigènes postérieures (PSG, 2) de Bombyx mori.
Aucune fluorescence correspondant à la présence de la protéine Ds-Red n'est observée dans les cellules séricigènes médianes (MSG, 1 ). On peut en déduire que les acides nucléiques selon l'invention permettent de diriger l'expression d'un polypeptide d'intérêt spécifiquement dans les glandes séricigènes postérieures d'un lépidoptère.
Ce résultat est confirmé par le Western Blot représenté sur la figure 6. Ce Western Blot réalisé dans les conditions décrites ci-dessus, permet de détecter la présence de la protéine Ds-Red dans les glandes séricigènes de vers à soie. Un gel SDS-PAGE (14% ; Tris-glycine ; 0.1 % SDS) a été transféré sur un filtre de nitrocellulose et coloré au bleu de Coomassie. Le filtre de nitrocellulose est présenté figure 6A. Ce même filtre a ensuite été incubé avec un anticorps primaire polyclonal anti-protéine Ds-Red, puis par un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort. Le résultat est présenté sur la figure 6B. On observe des bandes détectées par chimioluminescence, correspondant à la présence de la protéine Ds-Red.
Quatre dépôts de protéines des glandes séricigènes d'un ver à soie sont visibles sur le filtre présenté figure 6A et 6B. Les protéines ont été extraites des glandes séricigènes selon le protocole décrit ci-dessus. Les quatre dépôts sont les suivants :
- Piste 1 : protéines issues des glandes séricigènes médianes d'un ver à soie non transgénique. - Piste 2 : protéines issues des glandes séricigènes médianes d'un ver à soie transgénique, hétérozygote pour le transgène contenu dans la séquence SEQ ID N°1 .
- Piste 3 : protéines issues des glandes séricigènes postérieures d'un ver à soie non transgénique. - Piste 4 : protéines issues des glandes séricigènes postérieures d'un ver à soie transgénique, hétérozygote pour le transgène contenu dans la séquence SEQ ID N° 1 .
Le filtre représenté figure 6A présente des bandes d'intensité comparable, d 'une piste à l'autre. Cela permet de conclure que des quantités équivalentes de protéines ont été déposées sur le gel SDS-PAGE. Le filtre présenté comprend également un marqueur de taille visible dans la partie gauche du filtre. Le même filtre, soumis à u n traitement par des anticorps, comme cela est décrit ci-dessus est représenté sur la figure 6B. On observe que la protéine Ds-Red est présente en grande quantité dans les glandes séricigènes postérieures. La protéine Ds-Red est également présente dans les glandes séricigènes médianes, mais dans une moindre mesure. Les inventeurs pensent que cette présence est due à la migration de la protéine Ds-Red sécrétée par les cellules séricigènes postérieures dans les glandes séricigènes médianes, et non à une synthèse de la protéine Ds-Red par les glandes séricigènes médianes.
Exemple 5 : Accumulation de la protéine Ds-Red dans la soie chez les vers à soie rendus transgéniques avec le vecteur Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) dérivé du transposon piggyBac comprenant la séquence SEQ I D N° 1 . Le test de détection de la présence de la protéine Ds-
Red a été effectué selon le protocole décrit ci-dessus. Comme on l'observe sur la figure 7, les fils de soie présentent une fluorescence correspondant à la présence de la protéine Ds-Red . On peut en déduire que les acides nucléiques selon l'invention permettent de diriger la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt dans la soie d'un lépidoptère.
Ce résultat est confirmé par le Western Blot représenté sur la figure 8. Ce Western Blot, réalisé dans les conditions décrites ci-dessus permet de détecter la présence de la protéine Ds-Red, dans les cocons de vers à soie. Un gel SDS-PAGE (14% ; Tris-glycine ; 0.1 % SDS) a été transféré sur un filtre de nitrocellulose et coloré au rouge Ponceau. Le filtre de nitrocellulose est présenté figure 8A. Ce même filtre a ensuite été incubé avec un anticorps primaire polyclonal anti-protéine Ds-Red , puis par un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort. Le résultat est présenté sur la figure 6B. On observe des bandes détectées par chimioluminescence, correspondant à la présence de la protéine Ds-Red.
Neuf dépôts de protéines de cocons de vers à soie sont visibles sur le filtre présenté figure 8A et 8B. Les protéines ont été extraites selon le protocole décrit ci-dessus. Il s'agit de : - Pistes C1 et C2 : protéines issues d'un cocon de ver à soie non transgénique. - Pistes T1 et T2 : protéines issues d'un cocon de ver à soie transgénique, hétérozygote pour le transgène décrit dans la séquence SEQ I D N° 1 . Les six premiers dépôts, en partant du marqueur de taille, présent sur la gauche du filtre, correspondent à des protéines issues du cocon d'un ver à soie débarrassé de l'enveloppe extérieure appelée blaze. Les trois derniers dépôts correspondent à des protéines issues du rinçage de la blaze du cocon d'un ver à soie avec de l'eau .
Le filtre représenté figure 8A permet d'observer que les quantités de protéines déposées initialement sur le gel SDS- PAGE sont équivalentes. Le même filtre, soumis au traitement décrit ci-dessus est représenté sur la figure 8B. On observe que la protéine Ds-Red est présente en grande quantité dans la fraction issue du rinçage de la blaze du cocon de ver à soie transgénique. On peut en déduire que les acides nucléiques selon l'invention permettent de diriger la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt dans la soie d'un lépidoptère. Exemple 6 Accumulation de la protéine Ds-Red à la surface du fil de soie de vers rendus transgéniques avec la construction décrite dans l'exemple 1.
La figure 9 illustre la présence de la protéine Ds-Red à la surface du fil après observation par la technique de microscopie électronique à balayage. La protéine se présente sous forme de particules globulaires de taille variable
(dépendante du nombre d'agrégats) enrobant la fibre.
Après trempage d'un cocon transgénique dans une solution aqueuse, un dosage des protéines (par la technique classique de Bradford) du surnageant correspondant a révélé la présence d'environ 100 microgrammes de Ds-Red par cocon.
On observe sur la figure 9 que la protéine non fibrillaire DS-red est rejetée vers l'extérieur du fil de soie au cours de la sécrétion. Ce phénomène permet une extraction aisée des protéines d'intérêt, non fibrillaires. Une conclusion identique peut être tirée dans le cas par exemple de la production d'interleukine-2 humaine, comme cela sera décrit dans l'exemple 7.
Exemple 7 Production d'IL2 humaine
Réalisation d'un ver à soie transgénigue sécrétant l'interleukine 2 humaine (IL-2).
Le gène codant pour IL-2 a été substitué au gène codant pour la protéine DS-red au sein du vecteur d'intégration décrit dans l'exemple 1 .
Sélection des animaux transgénigues:
La sélection des animaux rendus transgéniques est effectuée grâce à l'expression précoce du gène 3xP3-GFP dans les yeux de l'animal. La figure 1 0 illustre la détection de la protéine I L2, placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention dans les cocons de vers à soie transgéniques hétérozygotes.
Tests de détection de l'I L-2 dans les glandes séricigènes ou les cocons des animaux transgénigues :
A partir d'extraits protéiques provenant de glandes séricigènes ou de cocons, la détection est effectuée par la technique de Western blot en utilisant un double anticorps: un anticorps polyclonal anti-IL2 humaine et un anticorps anti lapin de chèvre couplé à la peroxydase (société Biorad, référence 170-6515). Le test de détection des protéines exogènes par Western blot comprend des étapes d'électrophorèse, de transfert et coloration des protéines, de révélation des membranes, identiques à celles décrites dans la partie matériel et méthode en ce qui concerne la protéine Ds-Red.
Seule l'étape correspondant à l'extraction des échantillons protéiques est différente de celle décrite en ce qui concerne la protéine DS-red et sera donc décrite de manière spécifique ci-après.
Extraction des échantillons protéiques
On part d'un cocon de 141 mg :
- 46 mg du cocon sont soumis à une extraction totale (échantillon N° 1 )
- 19 mg constituent la blaze (enveloppe extérieure du cocon) (échantillon N°2)
- 76 mg du cocon subissent un décreusage (élimination des séricines, protéines enrobant la fibre) conduisant à deux fractions:
• l'une insoluble (échantillon N°3) • l'autre soluble (échantillon N °4) Traitement des échantillons:
- Echantillon N°1 : le cocon après fragmentation en petits morceaux est dissous 1 H à température ambiante dans du
LiSCN 10M (250μl) puis, après dilution dans 4/5 de tampon Tris 10 mM- SDS 2%- béta -mercaptoéthanol 5%, est incubé la nuit à T amb. et 30 min à 37°C.
- Echantillon N° 2: la blaze est dissoute 1 H à température ambiante dans du LiSCN 10M (200μl) et incubée la nuit à T amb. et 30 min à 37°C puis l'échantillon est dilué dans 4/5 de tampon Tris 10 mM- SDS 2%- béta-mercaptoéthanol 5%.
- Echantillons N° 3 et 4: le cocon est incubé 1 H à 100°C dans 2 ml d'eau savonneuse (7g/l) (élimination des séricines). La fraction soluble (surnageant contenant les séricines) est incubée la nuit à T amb (échantillon N°4). La fraction insoluble (contenant la fibroïne) est dissoute la nuit à température ambiante dans du LiSCN 10M (500μl) puis l'échantillon est dilué dans 4/5 de tampon Tris 10 mM- SDS 2%- béta-mercaptoéthanol 5% (échantillon N°3).
Avant dépôt, les échantillons contenant les extraits protéiques sont dénaturés dans du tampon Laemmli 5x, 5 min; à 100°C.
Les étapes suivantes sont identiques à celles décrites pour la Ds-Red.
Le Western blot représenté sur la figure 10 permet de détecter la présence de la protéine IL2 quel que soit le type d'échantillon considéré:
- piste 1 : protéines issues de l'extraction totale du cocon (échantillon N°1 ).
- piste 3: protéines issues de l'extraction de la blaze (échantillon N°2). piste 4: protéines issues de la fraction insoluble (fibroïne) du cocon (échanti llon N°3). piste 5: protéines issues de la fraction soluble (séricines) du cocon (échantillon N°4). piste 2: protéines issues de l'extraction totale d'un cocon témoin (contrôle négatif) traité dans les mêmes conditions que l'échantillon N°1. piste S: dépôt de 10 ng d'une solution standard d'IL2 humaine:
Par référence à la piste S il est possible d'avoir une estimation semi-quantitative de la quantité d'IL2 produite par cocon. Cette dernière selon la lignée transgénique analysée varie de 1 à 10 μg d'IL2 produite par cocon. Cet exemple démontre clairement la validité de l'invention lorsqu'une molécule d'intérêt médical, l'interleuine 2 humaine, est produite. De plus, la protéine d'intérêt biomédical, non fibrillaire sera aisément purifiée car rejetée vers l 'extérieur du fil de soie lors de sa synthèse, comme cela a été montré dans l'exemple 6, dans le cas de la protéine DS-red.
Exemple 8 Production de fibroïne H de Galleria mellonella
Réalisation d'un ver à soie transgénique sécrétant la fibroïne H de Galleria mellonella.
Le gène codant pour la fibroïne H de Galleria mellonella a été substitué au gène codant pour la protéine DS-red au sein du vecteur d'intégration décrit dans l'exemple 1 . La figure 1 1 illustre la détection de la protéine fibroïne
H de Galleria mellonella, placée sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'invention dans les glandes séricigènes (A) et les cocons (B) de vers à soie transgéniques hétérozygotes. Tests de détection de la fibroïne H de Galleria mellonella dans les glandes séri cigènes ou les cocons des animaux transgéniques:
A partir d'extraits protéiques provenant de glandes séricigènes ou de cocons, la détection est effectuée par la technique de Western blot en utilisant un double anticorps: un anticorps polyclonal anti-FibHGm et un anticorps antilapin de chèvre couplé à la peroxydase (société Biorad, référence 170-651 5). Le test de détection des protéines exogènes par Western blot comprend des étapes d'électrophorèse, de transfert et coloration des protéines, de révélation des membranes, identiques à celles décrites dans la partie matériel et méthode en ce qui concerne la protéine Ds-Red .
Seule l'étape correspondant à l'extraction des échantillons protéiques est différente de celle décrite en ce qui concerne la protéine DS-red et sera donc décrite de manière spécifique ci-après.
Extraction et traitement des échantillons protéiques
La paire de glandes séricigènes (sécréteur séparé du réservoir) prélevée sur des animaux transgéniques au cinquième stade larvaire est transférée dans un microtube, broyée et incubée dans 500 μl de LiSCN 1 0M 20 min. à T amb. puis 1 H à 60°C. L'échantillon est ensuite dilué dans 4/5 de tampon Tris 1 0 mM- SDS 2%- béta-mercaptoéthanol 5% .
Le cocon (20 mg) après fragmentation en petits morceaux est dissous 30 min. à 65°C dans du LiSCN 1 0M
(250μl) puis dilué dans 4/5 de tampon Tris 10 mM- SDS 2%- béta-mercaptoéthanol 5% .
Avant dépôt, les échantillons contenant les extraits protéiques sont dénaturés dans du tampon Laemmli 5x, 5 min; à 1 00°C. Les étapes suivantes sont identiques à celles décrites pour la Ds-Red.
Le Western blot représenté sur la figure 1 1 permet de détecter la présence de la protéine FibHGm (taille 115 KDa) dans la glande séricigène (réservoir et sécréteur) et le cocon de l'individu transgénique alors que cette protéine est absente dans les échantillons témoins issus d'animaux non- transgéniques, échantillons traités dans des conditions identiques à celles décrites çi-dessus: - piste 1 : protéines issues de l'extraction de la partie sécréteur de la glande séricigène d'un animal transgénique.
- piste 2: protéines issues de l'extraction de la partie réservoir de la glande séricigène d'un animal transgénique.
- piste 3: protéines issues de l'extraction totale d'un cocon issu d'un animal transgénique.
- piste 1 *: protéines issues de l'extraction de la partie sécréteur de la glande séricigène d'un animal témoin. - piste 2*: protéines issues de l'extraction de la partie réservoir de la glande séricigène d'un animal témoin.
- piste 3*: protéines issues de l'extraction totale d'un cocon issu d'un animal témoin.
Cet exemple démontre clairement la validité de l'invention pour la production de nouveaux biomatériaux, comme des mélanges de soies présentant des propriétés mécaniques de résistance ou d'élasticité nouvelles.
Exemple 9 Protocole de construction d'un vecteur comprenant un acide nucléique dirigeant l'expression d'un ARN diminuant la synthèse de fibroine H .
Pour inhiber la Fibroine H un vecteur de transgenèse piggyBac tel que décrit dans l'exemple 1 , comportant deux fragments du gène d'intérêt placés en direction inversée- répétée a été réalisé. Les séquences sens-antisens dérivées du gène de la fibroïne H sont espacées par une séquence neutre stabilisatrice, et sous le contrôle du promoteur fibrohexamérine (fi gure 1 2). Ce vecteur permet la production d' ARNs double-brins constitués d'une seule chaîne qui se replie pour former une structure secondaire dite en « épingle à cheveux » qui ciblent un motif de 465 pbs de séquences répétées situées dans l'exon 2 du gène de la fibroïne -H (Fig .12). Ces séquences sont formées de l'alternance de domaines répétés et amorphes.
Comme on l'obsreve sur la figure 12, la taille du gène de la Fibroïne H est de 1 7 kpb. Les séquences codantes sont constituées de deux exons, l'un de 67 pbs et l'autre de 1 5750 pb. Ce gène est caractérisé par des séquences extrêmement répétées dans l'exon 2. Chaque région répétée est constituée de sous-domaines de 208 pb organisés en motifs répétés Ua et Ub. La position du fragment 465 pbs utilise pour ciber l'ARNm est représenté par des flèches. Les répétitions de séquences de l'ARNm produit après transcription sont schématisées en gris. (Zhou et al . , 2000 Fine organization of Bombyx mori fibroin heavy chain gène. Nucleic Acids Res 28, 241 3-2419).
Coinjecté avec le vecteur assistant (helper), décrit dans la partie "matériels et méthode généraux" cette construction a permis l'établissement de lignées de vers à soie transgéniques pour lesquelles la quantité de Fibroïne H produite dans les cocons a été mesurée.
Comme le montre la figure 1 3 (histogramme), le mécanisme RNAi produit ϋn effet mesurable, variable suivant les lignées transgéniques sur la sécrétion de fibroïne H . Les cocons filés par les vers à soie transgéniques contiennent jusqu'à 20% de Fibroïne H en moins par rapport à des cocons témoins.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique dirigeant l'expression d'une protéine d'intérêt spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide
1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal modifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID N°1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide
1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes et (ii) une région codant un peptide signal mod ifié, placé sous le contrôle de ladite région régulatrice, ledit acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', le polynucléotide allant du nucléotide 1 au nucléotide 2026 de la séquence SEQ ID
N° 1 et dans lequel le trinucléotide allant du nucléotide 1486 au nucléotide 1488 de la séquence SEQ ID N°1 code pour un acide aminé choisi dans le groupe comprenant l'alanine, l'isoleucine et la leucine.
4. Acide nucléique consistant en un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 qui a été modifié par l'introduction d'au moins une et d'au plus quatre copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2, entre les nucléotides 1 et 1379 de la séquence SEQ ID N° 1.
5. Acide nucléique de séquence complémentaire à un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Cassette d'expression comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que lé polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide.
8. Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que le polynucléotide d'intérêt code pour un polypeptide fusion, comprenant, de l'extrémité N- terminale à l'extrémité C-terminale :
- au moins les 172 acides aminés N-terminaux de la séquence polypeptidique de la fibroïne L, et - un polypeptide d'intérêt.
9. Cassette d'expression selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que le polypeptide d'intérêt est choisi parmi les protéines suivantes : - la spidroïne d'araignée ;
- la fibroïne des animaux appartenant au genre Galleria ; et
- l'interleukine 2 humaine.
1 0. Vecteur recombinant d'intégration comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 ou une cassette d'expression selon l'une des reven dications 6 à 9.
1 1 . Vecteur recombinant de clonage comprenant la séquence nucléotidique d'un vecteur recombinant d'intégration selon la revendication 1 0.
12. Vecteur recombinant d'intégration selon la revendication 1 0, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur Pigfhx(sp*)DsRed-(3xP3-GFP) déposé le 20 février 2003 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous le numéro d'enregistrement CNCM I-2975.
1 3. Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12.
14. Cellule hôte recombinante selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'un animal producteur de soie appartenant à un genre choisi parmi Bombyx, Antheraea, Galleria, Philasomia, Spodoptera ou Drosophila.
15. Cellule hôte recombinante selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de Bombyx mori.
16. Cellule hôte recombinante selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori.
17. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9, d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12 ou d'une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 13 à 16 pour l'obtention d'un animal transgénique appartenant au genre
Bombyx.
18. Utilisation selon la revendication 17, ca ractérisée en ce que l'animal transgénique appartenant à l'espèce Bombyx mori sécrète une protéine d'intérêt dans le fil de soie.
19. Animal transgénique non humain comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'une des revend ications 1 à 5, une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12.
20. Animal transgénique non humain, déficient pour la sécrétion de fibroïne L, comprenant sous une forme intégrée dans son génome, une cassette d'expression selon la revendication 8 ou 9.
21 . Cocon comprenant une protéine d'intérêt dont l'expression est dirigée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12, et dans lequel ladite protéine d'intérêt est présente à une concentration supérieure à 5ng par mg de cocon et de préférence supérieure à 70 ng par mg de cocon.
22. Procédé d'obtention d'un animal transgénique appartenant à l'espèce Bombyx mori caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Injection d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12 dans des œufs de Bombyx mori entre une et cinq heures après la ponte des œufs, avant la formation du blastoderme ; b) Sélection des animaux transgéniques ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 9.
23. Procédé d'obtention d'un animal selon la revendication 21 caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : c) Croisement entre eux de deux animaux transgéniques tels qu'obtenus à l'étape b) ; d) Sélection des animaux homozygotes pour le transgène.
24. Procédé d'obtention d'un fil de soie caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Elever un animal transgénique selon la revendication 1 9 b) Récupérer la soie produite par l'animal transgénique.
25. Procédé d'obtention d'une protéine d'intérêt caractérisé en ce qu 'il comprend les étapes suivantes : a) Elever un animal transgénique selon la revendication 19 b) Récupérer la soie produite par l'animal transgénique c) Récupérer la protéine d'intérêt au sein du fil de soie.
26. Acide nucléique dirigeant l'expression d'un ARN d'intérêt diminuant la synthèse de fibroïne H , spécifiquement dans les cellules des glandes séricigènes postérieures de Bombyx mori, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend une région régulatrice comprenant des signaux de régulation de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans lesdites cellules séricigènes, ledit acide nucléique possédant au moins 90 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide allant du nucléotide 1 150 au nucléotide 1451 de la séquence SEQ ID N° 1 .
27. Acide nucléique consistant en un acide nucléique selon la revendication 26 qui a été modifié par l'introduction d'au moins une et d'au plus quatre copies d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2, entre les nucléotides 1 et 1 379 de la séquence SEQ ID N° 1 .
28. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un ARN d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27.
29. Vecteur recombinant d'intégration comprenant un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27, ou une cassette d'expression selon la revendication 28.
30. Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27 ou une cassette d'expression selon la revendication 28 ou un vecteur selon la revendication 29.
31 . Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27 ou d'une cassette d'expression selon la revendication 28 ou d'un vecteur selon la revendication 29, pour l'obtention d'un animal transgénique appartenant au genre Bombyx.
32. Animal transgénique non humain comprenant, sous une forme intégrée dans son génome,
(i) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à
5, une cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 8 ou un vecteur selon l'une des revendications 9 à 1 1 ; et
(ii) un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27 ou une cassette d'expression selon la revendication 28 ou un vecteur selon la revendication 29.
33. Animal transgénique non humain sel on la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon la revendication 26 ou 27 ou une cassette d'expression selon la revendication 28 ou un vecteur selon la revendication 29.
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