JP2003026599A - Ｉｌ−１５遺伝子を応用したワクチンアジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、IL-15遺伝子を含むことを特徴と
するワクチンアジュバントを提供する。 【解決手段】 IL-15は早期誘導反応を担うNK細胞、NKT
細胞およびγδ型腸管上皮間リンパ球増殖因子と働くの
みならず、メモリー型CD8+T細胞の維持に重要な役割を
担うと考えられる。キラーCD8+記憶T細胞は、結核感染
防御に重要な役割を担っており、結核症の感染防御機構
には、CD8+キラー細胞の増殖、維持が最も重要とされ
る。これらの背景を基にして、BCGワクチンとIL-15を組
み合わせることによって長期間維持される、強い結核菌
特異的CD8+T細胞を誘導することを目的とする。本発明
は、ワクチンの効率を高めるための効果的なワクチンア
ジュバントを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、IL-15遺伝子を応
用したワクチンアジュバントに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】BCG
ワクチンと抗結核剤の普及によって、いったん制圧され
たかに見えた結核が再び広がり始めている。近年では、
高齢者のみならず、BCG接種を受けた若齢者にも結核の
集団感染が見られる。その原因の一つとしては、BCGワ
クチンの有効期間に限界があり、BCGワクチンによって
誘導される免疫記憶が長続きしないことが考えられる。
この免疫記憶を延長させるために、BCGワクチンとサイ
トカイン遺伝子の併用接種が行われている。BCGワクチ
ンとサイトカイン遺伝子の組み合わせには、IFN−γ遺
伝子、IL-12、IL-2遺伝子の組み合わせの報告が見られ
る（Scott，P．Science 260:496-497(1993)； Trichier
i，G．Immunology Today14:335-338(1993)）。

【０００３】しかし、上記のようなサイトカイン遺伝子
は、いずれも有効性が顕著ではなく、また副作用も強
い。したがって、効果的な抗結核ワクチン組成物の開発
が求められている。

【０００４】そこで、本発明は、ワクチンの効率を高め
るための効果的なワクチンアジュバントを提供すること
を目的とする。

【０００５】

【課題を解決する手段】本発明者らは、IL-15がメモリ
ー型CD8+T細胞の増殖、維持因子であることを見出し、B
CGワクチンとIL-15を組み合わせることによって、長期
間維持される強い結核菌特異的CD8+T細胞を誘導するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明ではIL-15遺伝子を含む
ことを特徴とするワクチンアジュバントが提供される。

【０００７】本発明のもう一つの態様に従えば、前記IL
-15がヒトIL-15であるワクチンアジュバントが提供され
る。

【０００８】本発明の他の態様に従えば、前記アジュバ
ントとBCGワクチンとを組み合わせた抗結核ワクチンが
提供される。

【０００９】以下本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【好ましい態様の詳細な記載】インターロイキン15（IL
-15）は、T細胞増殖因子として、サルの腎臓上皮細胞株
から遺伝子クローニングされた公知のサイトカインであ
り、そのアミノ酸配列および遺伝子のＤＮＡ配列は既に
明らかにされている（Grabstein K.H. Science264: 965
-968, 1994）。このIL-15は、ヒトでは4q31に、マウス
では第8染色体に位置することが知られている。また、
ヒトIL-15およびマウスIL-15の両者ともにアミノ酸114
個の糖蛋白質であり、オルタナティブスプライシングに
よるシグナルペプチドの変異によって、翻訳および分泌
が調整されることも既に知られている。更に、IL-15は
活性化マクロファージ、樹状細胞および上皮系細胞から
産生されること、並びにIL-15RαおよびIL-2Rβ/γcを
受容体として作用し、その生物活性はIL-2と類似してい
ることも知られている。

【００１１】発明者等は、上記のIL-15について研究を
重ねた結果、このインターロイキンはメモリー型CD8+T
細胞の増殖、維持因子であることを新たに見いだした。
即ち、IL-15遺伝子トランスジェニックマウスでは、NK
（ナチュラルキラー）細胞、NKT細胞、およびγδ型腸
管上皮間リンパ球に加え、メモリー型CD8+T細胞の増加
が認められた。従って、IL-15は早期誘導反応を担うNK
細胞、NKT細胞およびγδ型腸管上皮間リンパ球増殖因
子として働くのみならず、メモリー型CD8+T細胞の維持
に重要な役割を担うと考えられる。なお、キラーCD8+T
細胞は、結核感染防御に重要な役割を担っており、結核
症の感染防御機構には、キラーCD8+T細胞の増殖、維持
が最も重要とされる。本発明は、この新規な知見に基づ
いて、免疫アジュバントとしてのIL-15の新たな用途を
見出したものとして評価されるべきものである。

【００１２】本明細書で使用する場合、「インターロイ
キン−15」および「IL-15」という用語は、インターロ
イキン−15、並びにアジュバント活性を示すそのサブユ
ニット、断片、および「IL-15」の機能的同等物をい
う。「IL-15」の機能的同等物としては、生じるIL-15産
物が本明細書で説明するIL-15と同じアジュバント活性
を有するような修飾IL-15タンパク質などが挙げられ
る。たとえば、「インターロイキン-15」の機能的同等
物には、一つまたは数個のアミノ酸が置換（たとえば１
つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸に置換したも
の）、欠失、または付加されたものを含むことができ
る。

【００１３】ここで、アジュバント活性とは、ワクチ
ン、好ましくはBCGワクチンを単独で投与した場合と比
較して、アジュバントを併用投与した場合に、誘導され
る免疫記憶を長続きさせることができる活性である。具
体的には、メモリーCD8+T細胞、好ましくはPPD特異的CD
8+T細胞の増加および維持を増大させる活性である。

【００１４】本発明において、IL-15遺伝子とは、上記
で定義したIL-15をコードする核酸を意味する。即ち、
そのヌクレオチド配列は、IL-15タンパク質全体をコー
ドしてもよく、又は、抗原反応を開始させることが可能
な、より短いペプチド配列だけをコードしてもよい。ま
た、遺伝子コードの縮重によってIL-15と同じペプチド
遺伝子産物をコードする核酸配列であってもよい。ま
た、上記のヌクレオチド配列は、DNA配列、ならびにそ
のDNA配列によってコードされるＲＮＡなどが挙げられ
る。本発明の一つの好ましい態様において、IL-15遺伝
子は、IL-15 cDNAである。

【００１５】本発明において、IL-15をコードするDNAを
取得する方法は特に限定されない。即ち、本発明のIL-1
5遺伝子は、本発明での使用に適した方法によって得る
ことができる。天然に存在するIL-15遺伝子を単離して
もよく、既知の塩基配列に基づいて化学的に合成しても
よい。例えば、本発明のIL-15 cDNAは、以下のように、
通常の手法を使用して調製することができる。

【００１６】マウスIL-15 cDNAの場合、マクロファージ
細胞株J774A.1（ATCC）由来のmRNAを抽出、精製する。m
RNAの抽出および精製は通常の手法によって行うことが
できる。次に、20pmolのランダムプライマー（BRL）を
使用し、RT-PCRにより一本鎖cDNAを合成する。次に、以
下のIL-15特異的プライマー［センス, 5’- GCTGTTTGGA
AGGCTGAGTT -3’ (position 203-224); アンチセンス,
5’- ATGGAGCTGTGCTGCCTCT -3’ (position 1010-102
8)］を使用して、PCRにより、該一本鎖cDNAから二本鎖c
DNAを増幅させる。次いで、得られた二本鎖cDNAを低融
点アガロースゲルを使用して抽出し、適当なクローニン
グベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。

【００１７】本発明のIL-15遺伝子を使用して、哺乳動
物細胞の中でIL-15のアジュバント作用を得るために
は、IL-15をコードするヌクレオチド配列が適切な発現
ベクター系の中に挿入されることが必要である。例え
ば、選択したベクターは、IL-15の発現を得るために正
しい順序で配置された細菌のプラスミド、及び強力なウ
イルスプロモーター、及びポリアデニル化／転写終結配
列を含み得る。これらの成分に加え、必要に応じて、エ
ンハンサー、制限酵素部位、及び抗生物質耐性遺伝子の
ような選別遺伝子のような他の成分を含むベクターを構
築する方法は、当業者に周知である。

【００１８】上記の発現ベクターは、抗生物質耐性のよ
うな選択マーカーを含んでいてもよい。なお、プラスミ
ドが哺乳動物宿主の中で複製し、動物の染色体ＤＮＡ中
に組み込まれるのを防ぐことが重要であれば、前記プラ
スミドは、真核細胞中で機能する複製起点を持たないよ
うに作成することが好ましいであろう。

【００１９】一つの態様において、本発明のアジュバン
トは、結核菌に対して持続的で強力な免疫応答を誘導す
る目的で使用され、BCGワクチンと併用することを特徴
とする。また、さらなる好ましい態様としては、BCGワ
クチンと併用することを特徴とする。。

【００２０】本発明において、IL-15をコードするヌク
レオチド配列を含むベクターは、様々な態様で投与する
ことができる。ベクターは、裸の形態で（すなわち、リ
ポソーム製剤、ウイルスベクター、又はトランスフェク
ション促進タンパク質を伴わない裸のＤＮＡとして）、
適切な溶媒、例えば、ＰＢＳのような緩衝化した生理的
食塩水溶液中に懸濁して投与できる。

【００２１】本発明の発現ベクターは、物理的方法によ
って、直接導入してもよい。これらの例には、適切な賦
形剤を含むIL-15遺伝子ベクターを局所的に適用するこ
とを含む。たとえば、リン酸緩衝溶液（PBS）のような
薬学的に許容可能な溶液中の、「裸の」IL-15遺伝子ベ
クターを局部的に適用することが含まれる。或いは当該
技術において公知の方法、例えばベクターでコートされ
た金ビーズのような不活性粒子を噴出装置から高圧下で
放出することにより、創傷部位（例えば皮膚細胞）の表
面を通過させるのに十分な速度に加速する米国特許第53
71015号の記載の方法にしたがって、「遺伝子銃」技術
としても知られる粒子砲撃のような物理的方法によりベ
クターを投与することが含まれる。

【００２２】本発明のIL-15遺伝子を直接患者に投薬す
るための他の物理的な方法には、超音波、電気刺激、エ
レクトロポレーションが含まれるが、これに限定されな
い。

【００２３】

【発明の効果】本発明を基に、BCGワクチンとIL-15遺伝
子を組合わせて、長期間維持される強い結核菌特異的CD
8+T細胞を誘導することに成功した。本発明により、IL-
１５遺伝子を応用したBCGワクチンアジュバントの開発
が期待できる。また、IL-15遺伝子を組み合わせた免疫
療法は、抗結核ワクチンのみならず、他の感染症の治療
に対しても応用が可能であろう。

【００２４】

【実施例】以下、実施例をもって本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００２５】例1 IL-15 cDNA投与によるBCGに対する感
染防御の増強 方法 IL-15cDNAのクローニング マウスIL-15 cDNAの場合、マクロファージ細胞株J774A.
1（ATCC）由来のmRNAを抽出、精製する。mRNAの抽出お
よび精製は通常の手法によって行った。次に、20pmolの
ランダムプライマー（BRL）を使用し、RT-PCRにより一
本鎖cDNAを合成した。次に、以下のIL-15特異的プライ
マー［センス, 5’- GCTGTTTGGAAGGCTGAGTT -3’ (posi
tion 203-224); アンチセンス, 5’- ATGGAGCTGTGCTGCC
TCT -3’(position 1010-1028)］を使用したPCRによ
り、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを増幅させる。次い
で、得られた二本鎖cDNAを低融点アガロースゲルを使用
して抽出し、pCR3.1ベクターに組み込んで組換えベクタ
ーを作製した。

【００２６】PPD特異的Tc1細胞の検出 腹腔滲出細胞2〜5×10⁵細胞／ウェルをPPD（5μg/ml）
と100pg/mlのｒIL-2(Takeda Cemical)で6時間培養し
た。細胞内のサイトカインは10μg/mlのブレフェルジン
A (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO)で処理して、
固定した後、FITC結合IFN−γmAbまたはFITC結合アイソ
タイプコントロール・ラットIgG（PharMingen）で染色
して、フローサイトメータで測定した。

【００２７】BCG感染後の臓器内菌数 1×10⁶のBCGをc57BL/6マウスの腹腔内に投与した。さら
にIL-15 cDNAをpCR3.1に組み込んだpCR3.1：IL-15プラ
スミドを作製し、4μgのpCR3.1：IL-15を遺伝子銃でBCG
を投与後3日毎に3回投与した、次に、腹腔内、脾臓、肝
臓をホモジナイズした後、OADC enrichment(Difco)を含
む7H10プレートで培養して、コロニー数を測定した。

【００２８】結果 （1）IL-15cDNAアイソフォームのクローニングと塩基配
列の決定 マウスマクロファージ細胞株であるJ774A.1由来mRNAか
らIL-15 cDNAをクローニングした。塩基配列を決定した
結果、エクソン1〜8まで全てのエクソンを含むcDNAに加
えて、エクソン2を欠損するアイソフォームが存在する
ことを見いだした（図1）。

【００２９】塩基配列より予想されるアミノ酸配列を比
較したところ、エクソン2は非翻訳領域であり、エクソ
ン2の有無はIL-15タンパク質の構造には影響がなく、エ
クソン2を含むアイソフォームも正常IL-15をコードして
いる。

【００３０】（2）IL-15 cDNA投与によるBCGに対する感
染防御 IL-15は、ワクチンによって誘導されたメモリーCD8+T細
胞の維持に重要な役割を担っていると推定される。そこ
で結核ワクチンとして現在日本で使用されている、Myco
bacterium bobis BCG（東京株）に対する感染防御免疫
についてIL-15cDNAを用いて検討した。

【００３１】（2.1）BCG感染後の臓器内菌数と血清中の
IL-15の動態 1×10⁶のBCG（東京株）をC57BL/6マウスの腹腔内に投与
して、さらにIL-15 cDNAを遺伝子銃で3日毎に3回投与し
た後、腹腔内、肝臓の菌数を測定した。コントロール遺
伝子投与群に比べて、IL-15遺伝子マウスで感染28日目
の肝臓で有意に菌数の減少が見られた（図2）。BCG感染
後の血清中のIL-15を測定したところ、IL-15遺伝子投与
マウスで、感染後に高いレベルのIL-15が検出された
（図2）。

【００３２】同様にIL-15cDNAを遺伝子銃で3日毎に3回
投与した後、肺、肝臓、脾臓の菌数を測定した。コント
ロール遺伝子投与群に比べてIL-15遺伝子投与マウスで
は感染28日目の肝臓において有意に菌数が減少していた
（図3）。

【００３３】（2.2）BCG感染後の腹腔内細胞の動態 BCG感染後の腹腔内リンパ球の動態をフローサイトメー
ターで解析した。感染7日目では、コントロール群に比
べてIL-15遺伝子投与マウスでNK、NKT細胞およびメモリ
ータイプCD8+T細胞数が有意に高く、感染28日でも高い
レベルを維持していた。

【００３４】（2.3）PPD特異的T細胞 感染14日目のリンパ球を分離して、PPDに対する反応性
を増殖反応、サイトカイン産生で検討した。その結果IL
-15遺伝子投与マウスで高いIFN−γの産生が認められた
が、IL-4の産生は認められなかった。

【００３５】どの細胞がIFN−γを産生しているか探る
ために、細胞内サイトカインをフローサイトメーターで
調べた。PPDとIL-2の刺激では、コントロール細胞群のI
FN-γ産生細胞はCD4+T細胞であったが、IL-15遺伝子投
与マウスで、CD8+T細胞にIFN−γ産生細胞が認められた
（図4）。

【００３６】結論 本発明において、マウスのIL-15 cDNAの3種類のアイソ
フォームをクローニングした。そのなかで、IL-15をコ
ードするcDNAをCMVプロモーターに発現可能に結合した
発現ベクターを作製した。これをBCGワクチンが投与さ
れたマウスに投与して、IL-15遺伝子とワクチン併用に
よる免疫アジュバントとしての可能性を検討した。この
IL-15遺伝子とBCGを組み合わせることによって、長期間
持続する強力な抗結核免疫をマウスに誘導することに成
功した。これらの結果から、IL-15遺伝子はBCGワクチン
アジュバントとして有効であることが示される。

【００３７】例2 インビボにおけるIL-15の過剰発現に
よる、BCGに対する感染防御の増強 方法 IL-15発現ベクターの構築 マウスIL-15をコードするcDNAは、LPS(1μg/ml)で6時間
活性化したRaw細胞のRNAから調製した。RNAは、RNAzol
(Bioprobe、Montreuil、France)を使用して抽出した。
抽出したRNAは、GeneAnp Thermostable rTth Revers
e TranscriptaseRNA PCRキット(Perkin-Elmer、Roisy
CGD、France)を使用してRT-PCRを行った。プライマー
には、BamHIおよびKpnI部位を含む、5’-GCGGATCCCATGT
CTTCATTTTGGGCTGT-3’ (P1)、および5’-GGGGTACCTCAGG
ACGTGTTGATGAACAT-3’ (P2)を使用した。大腸菌におけ
る発現のため、最初のPCRで増幅されたマウスIL-15のcD
NAを、pCR2に挿入した。411bpのPCR産物をBamHIおよ
び、KpnIで切断し、BamHI/KpnIで限定切断されたpCR2に
クローン化した(pCR:IL-15)。真核細胞における発現の
ために、P2およびP3プライマーを使用したRT-PCRによっ
て全長IL-15を増幅した。プライマーの配列は、XhoIお
よびBamHI部位を含む、5’- CCTCGAGACATGGAAGCTCTTACC
TGGG -3’ (P3)、および5’- CGGATCCCGGGACGTGTTGATGA
ACATTTG -3’ (P4)である。pCR3.1::IL-15およびGFP:IL
-15の作成には、Eucariotic TA cloningKit - unider
ectional (Invitrogen) を使用し、535bpのPCR産物を
pCR3.1-Uni、またはpEGFP-N1 (Clontech)内のCMVプロモ
ーターの下流に挿入した。pCR3.1は、pCR3.1 -Uniの3’
突出末端をT4DNAポリメラーゼによって取り除き、再び
ライゲーションすることによって作成した。マウスに接
種するためのpCR3.1、およびpCR3.1::IL-15は、菌培養
液をアルカリ溶解することによって調製し、塩化セシウ
ム濃度勾配によって精製し、アピロジェニック接種可能
（apyrogenic injectable）塩溶液に懸濁した。

【００３８】微生物 凍結乾燥したウシ結核菌BCGは、共和医薬(Tokyo, Japa
n)から購入した。BCGは、ADC特殊添加(Difco, Detroit,
MI)の7H9培地(Difco)に溶解した。生存細菌数は、OADC
特殊培地を補った7H10培地によって測定した。10%グリ
セロールを含む7H9培地に懸濁したBCGは分注し、使用す
るまで-80℃で保存した。細菌の濃度は、プレートカウ
ントによって定量した。使用前、細菌をPBSで3回洗い、
PBSに懸濁した。

【００３９】プラスミドの投与、および接種プロトコー
ル Bio-Rad hand-held helium-puosed gen gun(Biorad)を
使用して、100μlのDNA溶液を腹部に接種した。組織化
学的研究のために、マウスには、4μgのpCR3.1、pCR3.
1::IL-15、またはIL-15GFPを一回接種した。接種の1、
3、10日後、マウスの接種部位の皮膚を慎重に取り除い
た。BCGの感染実験では、0日目のマウスに5×10⁶の生き
ているBCGを感染させ、4〜6匹のマウス群に対し、1、
3、6日目において3回投与し、4μgのpCR3.1、pCR3.1::I
L-15を接種した。

【００４０】抗体および試薬 FITC結合―抗CD-3ε mAb (145-2C11)、PE結合―抗TCRα
β mAb (H57-597)、PE結合―抗NK1.1 mAb (PK136)、PE
結合―抗CD8+ mAb (53-6.7)、ビオチン結合―抗TCRγδ
mAb (GL3)、Cy―クロム結合―抗CD4 mAb(GK1.5)、FITC
結合抗IFN-γ mAb (XMG1.2)、FITC結合―抗IL-4 mAb(BV
D4-1D11)、FITC結合―抗ラットIgG1 アイソタイプコン
トロールIg、およびFITC結合―ラットIgG2b アイソタ
イプコントロールIg、はファーミンジェン(San Diego、
CA)から購入した。ビオチン結合mAbで染色後、ストレプ
トアビジン−CyクロムTM(Permingen)で処理した。2.4G2
(抗FcγRII/III特異的 mAb、ラットIgG1、産生ハイブリ
ドーマ)は、アメリカンタイプ カルチャー コレクシ
ョン(Rockville、MD)から、譲渡された。抗マウスIL-15
血清は、大腸菌で発現させたマウスIL-15タンパク質を
0.5mg含むエマルジョンを免役した日本白ウサギ(Japan
SLC Inc., Hamamatsu, Japan)から調製した。エマルジ
ョンは、モノフォスフォリルリピッドA、合成トレハロ
ースジコリノマイコレート、および細胞壁骨格エマルジ
ョン(Corixa、Hamilton、MT)より調製した。最初の接種
から三週間おきに、全部で3回のブースターの接種を行
った。最終免疫の日から一週間後、心臓採決により血液
を回収した。各血清におけるELISA解析は、精製した抗
マウスIL-15mAb(G277-3588、Permingen)、抗マウスIL-1
5ウサギ抗血清、および抗ウサギIg、HRP結合F(ab’)2断
片(Amersham PharmaciaBiotech、Uppsela、Sweden)、ま
たはビオチン結合―抗マウスIL-15 mAb(Genzyme Diagno
stics、Cambridge 、MA9)を使用して3回行った。組換え
マウスIL-15は、Research Diagnostics、Inc.(Flander
s,NJ)から得た。

【００４１】臓器内菌数 BCGを感染させてから7日、14日、および28日後に、腹腔
および肝臓の細菌を計測した。4mlのHBSS(Nissui、Toky
o、Japan)で洗浄することにより、腹膜滲出物を腹腔か
ら回収し、HBSSで厳密に稀釈した。滲出物の稀釈液を、
OADCおよび20%グリセロール(vol/vol)を含む、Middbleb
rook 7H10倍地の上に静置した。肝臓における計測では
マウスの血を抜いた後、血管壁の細菌を洗い出すために
20mlの滅菌HBSSで肝臓を灌流した。細菌の計測は上記の
方法で行った。コロニー数の計測は3週間培養後に行っ
た。

【００４２】細胞の調製 2〜10×10⁶CFUでBCG（100μlのPBS中）を、マウスに接
種した。接種から7日、14日、および28日後、腹腔をHBS
Sで洗浄することにより、腹腔滲出細胞(PEC)を回収し
た。PECは、遠心し、10%FBS、100U/mlのペニシリン、10
0μg/mlのストレプトマイシン、および10mM HEPESを含
む、RPMI1640培地に懸濁することにより調製した。95%
空気、5%CO₂の湿潤な状態で、細胞を37℃で2時間静置し
て付着させた。非付着細胞は、単核球細胞(MNC)として
使用し、付着した細胞をHBSSで数回洗った。付着した細
胞は、ゴムのポリスマンでこすって回収し、洗った後に
計測した。この手順によって回収された細胞の95%以上
は、マクロファージであった。

【００４３】インビトロ培養 プラスチックに非付着性のPECは、サイトカイン産生の
ための抗原刺激試験に使用した。BCGに感染した非Tg
（トランスジェニック）マウス、またはIL-15Tgマウス
の0、7、14、28日目の細胞を回収し、プラスチックに非
接着性のPECを、ナイロンウールを通した後、RPMI1640
に再懸濁し、96穴プレートに2×10⁵細胞/穴となるよう
にまいた。細胞を、刺激なし、または5μg/mlのPPD(Jap
anBCG association, tokyo, Japan)、または100μg/ml
の抗TCRαγ mAbと共に、マウスの肝細胞(2×10⁵)の存
在下で、37℃で48時間培養した。上清を回収し、サイト
カインアッセイを行うまでは-80℃に保存した。細胞を
回収する6時間前に[³H]TdRでパルスし、[³H]TdRの取り
込みを、液体シンチレーションカウンターにより測定し
た。

【００４４】サイトカインのELISA 培養上清または血清のサイトカインレベルは、ELISA法
によって測定した。培養上清中のIL-1α、IL-5、IL-1
0、IL-12(p40)、およびTNFα、並びに血清および培養上
清中のIFN-γ、およびIL-4は、ELISAディベロプメント
キット(Genzyme Diagnostics, cambridge, MA)を使用し
て測定した。簡単には、接着したPECを回収し、4.8×10
⁶細胞/mlの完全培地に懸濁した。100μlの細胞懸濁液を
マイクロプレートの各穴に分注し、37℃で24時間培養し
た。上清を試験に使用した。個々の血清のIL-15に対す
るELISAは、精製したマウスIL-15 mAb(G277-3588, Phar
mingen)、抗IL-15ウサギ抗血清、および抗ウサギIg、HR
P結合F(ab’)₂断片、またはビオチン結合抗マウスIL-15
mAb (G277-3960, Pharmingen)およびペルオキシダーゼ
結合ストレプトアビジンを使用して3回ずつ行った。

【００４５】フローサイトメトリー解析 プラスチックに非付着性のPECは、非特異的染色を防ぐ
ために、2.4G2の培養上清と共に前培養した。細胞を洗
った後、様々なmAbを組み合わせて細胞を染色した。ビ
オチン結合 mAbで染色した後に、ストレプトアビジン-C
y-クロムTM処理をした。T細胞サブセットの3色解析に
は、単一細胞の懸濁液を、FITC結合CD３ε、PE結合TCR
αβ、NK1.1 mAb、またはビオチン結合TCRγδで染色
し、FACS Calibur フローサイトメーター(Becton Dicki
nson, San Jose, CA)によって解析した。肝臓リンパ球
は、前方および側方散乱のゲートで、注意深く囲った。
データは、CELLQuestTMソフト(Becton Dickinson)を使
用して解析した。

【００４６】統計的解析 データの統計的解析は、t-test AP valueが0.05以下を
有意と考えて測定した。

【００４７】結果 （1）BCG感染後のIL-15Tg(トランスジェニック)マウス
における細菌の増殖 IL-15Tgマウスが、細菌の増殖を阻害する能力を明白に
するために、我々は、4.8×10⁶ CFUのBCGを感染させた
後、IL-15Tgマウスの腹膜腔、肝臓、肺、脾臓における
細菌の増殖速度を調べた。図5に示したように、非Tgマ
ウスおよびIL-15Tgマウスの両者の各組織において細菌
数は、時間とともに減少した。しかし、28日目の腹腔
内、並びに14日目、および28日目の肝臓または肺では、
IL-15Tgマウスの細菌数が非Tgマウスよりも有意に少な
かった。従って、IL-15Tgマウスは、BCG感染に対して耐
性であった。

【００４８】IL-15Tgマウスおよび非TgマウスにおけるI
L-15mRNAおよびタンパク質の発現レベルを調べた。（図
6A、C）感染前のIL-15Tgマウスにおいて、腹腔マクロフ
ァージでIL-15mRNAの発現され、および血清中でIL-15の
産生が検出された。BCG感染後のIL-15の発現レベルは、
非TgマウスよりもIL-15Tgマウスの方がより高かった
（図6A、C）。

【００４９】我々は次に、BCG感染後のIFN−γおよびIL
-4の血清中レベルを調査した。図6Bに示したように、14
日目、および28日目におけるIL-15Tgマウスの血清中IFN
−γレベルは、非Tgマウスよりも有意に高かった。IL-4
の発現は、IL-15Tgマウスおよび非Tgマウスの度虎にお
いても、BCG感染後のいずれの段階にでも検出されなか
った。

【００５０】iNOSによって誘導されるNO産生は、主要な
抗殺菌機構である。iNOSのmRNAはIFN−γおよびTNF−α
によって調節されることが知られている。我々は、BCG
感染後14日目のIL-15Tgマウスと非Tgマウス由来のマク
ロファージ内のiNOS mRNAを比較した。図6Cに示したよ
うに、非TgマウスのiNOS mRNAよりもIL-15Tgマウスの発
現の方が高レベルであった。

【００５１】以上のように、インビボにおいてIL-15の
発現を増大するとBCGに対する抗結核免疫誘導が高まる
ことが確かめられた。従って、IL-15の発現が、高い効
率の抗結核ワクチン療法に応用可能なことが示された。

【００５２】結論 インターロイキン15（IL-15）はナチュラルキラー（N
K）、NKT、γδ型T細胞およびメモリータイプCD8+T細胞
の増殖因子として働くサイトカインである。IL-15がワ
クチンワジュバントとして細菌感染症において応用され
る可能性を探索した。IL-15 cDNAを発現ベクターに組み
込み、マウスに投与することによって、Mycobacterium
bovis BCG（牛型結核菌）に対する免疫応答を解析し
た。BCG感染後、IL-15遺伝子を投与したマウスでは、NK
細胞に加えてメモリータイプCD8+T細胞が増加してお
り、マイコバクテリア特異的CD8+Tc1細胞の増加が認め
られ、IL-15cDNAのワクチンアジュバントとしての有効
性が示唆された。

【図面の簡単な説明】

【図１】IL-1５cDNAのクローニングと発現ベクターへの
組み込みを示した図。マウスIL-１５cDNAを、ほ乳動物
細胞発現ベクター（pCR3.1）に組み込んでプラスミドを
作製した。黒い部分はコード領域を示す。

【図２】BCGワクチンとIL-１５遺伝子投与によるBCG増
殖曲線を示した図。Mycobacterium bovis BCG（東京
株）1×10⁶を腹腔内に投与した直後および1週間ごとに
総数3回遺伝子銃を使用して、5μg/回のIL-１５遺伝子
を投与して経時的に臓器内菌数を測定した。

【図３】IL-15 cDNAの in vivo投与によるBCG臓器内菌
数の変化を示した図。

【図４】CD8+T細胞の細胞内IFN-γをフローサイトメー
ターで解析した図。Mycobacterium bovis BCG（東京
株）1×10⁶を腹腔内に投与し、遺伝子銃を使用して5μg
/回のIL-１５遺伝子を1週間ごとに3回投与して14日目の
腹腔T細胞PPD+IL-２で培養した。

【図５】IL-15Tgマウス、および非Tgマウスの腹膜腔、
肝臓、肺、脾臓における細菌の増殖速度を示した図。4.
8×10⁶ CFUのBCGを感染させた後、IL-15Tgマウスの腹膜
腔、肝臓、肺、脾臓における細菌の増殖速度を調べた。

【図６】BCG感染後のIL-15、またはIFN−γの血清中お
よび発現レベルを示した図。 A、血清中のIL-15レベル。 B、血清中のIFN−γレベル。 C、腹腔マクロファージにおけるIL-15 mRNAおよびiNOS
mRNAの発現。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 IL-15遺伝子を含むことを特徴とするワ
   クチンアジュバント。
2. 【請求項２】 IL-15遺伝子がヒトIL-15遺伝子である請
   求項1に記載のアジュバント。
3. 【請求項３】 請求項1または2に記載のアジュバントと
   BCGワクチンとを組み合わせた抗結核ワクチン。